KR20220056928A - 수산화지방산 함량 증진에 관여하는 피마자 유래 lpat2와 gpat9 유전자 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명에서 수산화지방산 함량 증진용 재조합 벡터에 관한 것으로, 피마자 유래 LPAT2 및 GPAT9 유전자를 발현을 조절하여 식물체에서 수산화지방산 함량을 증진됨을 확인하였으며, DGAT2 유전자 형질전환체와 LPAT2 및 GPAT9 유전자 형질전환체를 교배한 후대에서 수산화지방산 함량 증진효과가 증가됨을 확인하였는바, 피마자 유래 LPAT2, GPAT9, 및 DGAT2 유전자 발현을 유지식물에서 조절하여 수산화지방산 함량이 우수한 신품종을 개발할 수 있다.
Description
본 발명은 식물체에서 수산화지방산 함량을 증진시키는 피마자 유래 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
식물의 종자에는 다양한 종류의 불포화 지방산을 생산하는데 지방산 합성 대사를 조절하여 산업용으로 유용한 구조를 갖은 지방산을 생산하는 연구를 진행하고 있다.
피마자(castor bean)는 적도 근방의 무덥고 건조한 지역에서 재배가 되는 다년생 식물로 인도, 브라질이 세계적으로 널리 알려진 재배지이며, 중국, 동남아 일부에서도 재배가 되고 있다. 피마자를 압출과 용제추출방식을 이용하여 피마자 오일을 얻을 수 있으며, 피마자 오일은 캐스터 오일(Castor oil)이라고도 한다. 캐스터 오일은 빠르게 성장하고 있는 산업의 한 분야이며, 캐스터 오일의 화학적 구조는 유지화학 분야에 있어서도 다양한 반응성을 지녀 다양한 산업분야에서 널리 사용되고 있고, 캐스터 오일은 실제 친환경, 생태계, 재활용적인 측면에서는 오히려 석유화학분야보다 우수한 평가를 받고 있다.
피자마 오일에 포함된 수산화지방산은 의약원료, 페인트, 윤활유, 폴리머 등 다양한 산업원료로 사용된다. 하지만 피마자는 종자에 리신(ricin)이라는 치사 독소가 있다는 한계가 있어 독소가 없는 다른 유지작물에서 수산화지방산을 대량 생산하기 위한 기술이 요구되고 있다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함하는 식물체의 수산화지방산 함량 증진용 재조합 벡터 및 이를 이용하여 수산화지방산 함량이 증진된 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함하는 제1 재조합 벡터, 및 서열번호14로 표시되는 DGAT2 유전자를 포함하는 제2 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 수산화지방산 함량 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함하는 제1 재조합 벡터를 식물체에 형질도입하는 단계, 및 상기 제1 재조합 벡터가 형질도입된 식물체에 서열번호14로 표시되는 DGAT2 유전자를 포함하는 제2 재조합 벡터를 형질도입하는 단계를 포함하는 수산화지방산 함량이 증가된 식물체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함하는 제1 재조합 벡터로 형질도입된 제1 형질전환 식물체를 준비하는 단계, 서열번호14로 표시되는 DGAT2 유전자를 포함하는 제2 재조합 벡터로 형질도입된 제2 형질전환 식물체를 준비하는 단계, 및 상기 제1 형질전환 식물체와 상기 제2 형질전환 식물체를 교배하는 단계를 포함하는 식물체에서 수산화지방산 함량을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함하는 식물체의 수산화지방산 함량 증진용 재조합 벡터를 제공한다.
상기 LPAT2 및 GPAT9 유전자는 피마자에서 유래된 것일 수 있다.
상기 LPAT2 유전자 및 상기 GPAT9 유전자 사이에 서열번호13의 2A 자가절단 서열을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함하는 제1 재조합 벡터 및 서열번호14로 표시되는 DGAT2 유전자를 포함하는 제2 재조합 벡터를 포함하는, 식물체의 수산화지방산 함량 증진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 수산화지방산 함량이 증진된 식물체를 제공한다.
상기 식물체는 참깨(Sesamum indicum), 들깨(Perilla frutescens), 유채(Brassica napus), 해바라기(Helianthus annuus), 땅콩(Arachis hypogaea), 콩(Glycine max), 코코야자(Cocos nucifera), 기름야자(Elaeis guineensis), 카멜리나(Camelina sativa), 및 호호바(Simmondsia chinensis)로 이루어진 군에서 선택되는 1종의 유지식물일 수 있다.
상기 식물체는 종자의 수산화지방산 함량이 증진된 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함하는 제1 재조합 벡터를 식물체에 형질도입하는 단계, 및 상기 제1 재조합 벡터가 형질도입된 식물체에 서열번호14로 표시되는 DGAT2 유전자를 포함하는 제2 재조합 벡터를 형질도입하는 단계를 포함하는 수산화지방산 함량이 증가된 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함하는 제1 재조합 벡터로 형질도입된 제1 형질전환 식물체를 준비하는 단계, 서열번호14로 표시되는 DGAT2 유전자를 포함하는 제2 재조합 벡터로 형질도입된 제2 형질전환 식물체를 준비하는 단계, 및 상기 제1 형질전환 식물체와 상기 제2 형질전환 식물체를 교배하는 단계를 포함하는 식물체에서 수산화지방산 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 피마자 유래 LPAT2 및 GPAT9 유전자를 발현을 조절하여 식물체에서 수산화지방산 함량을 증진됨을 확인하였으며, DGAT2 유전자 형질전환체와 LPAT2 및 GPAT9 유전자 형질전환체를 교배한 후대에서 수산화지방산 함량 증진효과가 증가됨을 확인하였는바, 피마자 유래 LPAT2, GPAT9 및 DGAT2 유전자 발현을 유지식물에서 조절하여 수산화지방산 함량이 우수한 신품종을 개발할 수 있다.
도 1은 피마자 발달종자에서 RT-PCR로 증폭한 RcLPAT2와 RcGPAT9 유전자 및 2A를 사이에 포함한 RcLPAT2와 RcGPAT9 융합유전자이다.
M: 1 kb marker, L: RcLPAT2, G: RcGPAT9, LG: RcLPAT2-2A-RcGPAT2
도 2는 애기장대 형질전환에 사용된 피마자 GPAT9과 LPAT2로 구성된 벡터이다.
도 3은 CL37-RcLPAT2RcGPAT9의 T2와 T3 종자의 수산화지방산 함량 비교 분석한 것이다.
도 4는 CL37-RcDGAT2의 T1에서 T3까지의 수산화지방산 함량 변화를 분석한 것이다.
도 5는 CL37-RcLPAT2RcGPAT9의 T2와 T3 종자의 수산화지방산 함량 비교한 것이다.
M: 1 kb marker, L: RcLPAT2, G: RcGPAT9, LG: RcLPAT2-2A-RcGPAT2
도 2는 애기장대 형질전환에 사용된 피마자 GPAT9과 LPAT2로 구성된 벡터이다.
도 3은 CL37-RcLPAT2RcGPAT9의 T2와 T3 종자의 수산화지방산 함량 비교 분석한 것이다.
도 4는 CL37-RcDGAT2의 T1에서 T3까지의 수산화지방산 함량 변화를 분석한 것이다.
도 5는 CL37-RcLPAT2RcGPAT9의 T2와 T3 종자의 수산화지방산 함량 비교한 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함하는 식물체의 수산화지방산 함량 증진용 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서 LPAT2 유전자는 리소포스파티딘산 아실전이효소(lysophosphatidate acyltransferase) 단백질을 코딩하는 유전자이며 서열번호1로 표시되는 것을 특징으로 한다.
상기 LPAT2 유전자 유전자로 피마자에서 유래된 것일 수 있다.
본 발명에서 GPAT9 유전자는 3-인산 글리세롤 아실전이효소(glycerol-3- phosphate acyltransferase) 단백질을 코딩하는 유전자이며 서열번호2로 표시되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 GPAT9 유전자는 피마자에서 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 아그로박테리움으로 형질전환한 애기장대에서 T2 종자의 경우 대부분 수산화지방산 함량이 7%대나 그 이하로 나타났으나, 4번 개체가 약 24%의 함량을 나타내 대조군(CL37 애기장대, 17% 내외) 달하는 결과를 보였다. 상기 4번 형질전환 개체의 T3 세대를 진전하여 종자 지방산을 확인했더니 수산화지방산 함량이 24% 수준으로 유지되었으며, 최대 24.7% 함량을 나타냈다.
또한 수산화지방산 17%를 종자에 함유하는 CL37 애기장대와 RcLPAT2 및 RcGPAT9 발현 형질전환 애기장대(CL37-RcLPAT2GPAT9)의 T2 및 T3 종자에서 각 지방산의 조성 변화를 분석한 결과, CL37-RcLPAT2GPAT9(LG)에서 대조군 애기장대(CL37)와 비교하여 포화지방산(팔미트산, 스테아르산 및 아라키딘산) 및 올레산 함량이 감소하였다. 반면, 리놀렌산 함량은 증가하였으며, 수산화지방산의 일종인 리시놀레산, 덴시폴산의 함량이 증가함을 확인하였다.
즉, LPAT2와 GPAT9 유전자가 동시에 발현되는 경우에는 애기장대에서 수산화지방산 함량이 증진됨을 확인하였다.
따라서 본 발명의 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 식물체에서 수산화지방산 함량 증진시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에서 LPAT2와 GPAT9 유전자가 동시에 발현된 애기장대에서 지방산 조성변화를 분석한 결과, 리놀렌산 함량은 증가하였으며 수산화지방산의 일종인 리시놀레산, 덴시폴산의 함량이 증가함을 확인하였는바, 본 발명에서 수산화지방산은 리시놀레산(ricinoleic acid) 또는 덴시폴산(densipolic acid)일 수 있다.
또한 LPAT2 및 GPAT9 발현 형질전환 애기장대에서 리놀렌산 함량이 증가하는 것을 확인하였는바, LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물체에 형질도입시 리놀렌산 함량의 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 “재조합”은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서 "재조합 벡터"란 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물로, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함한다.
본 발명의 "재조합 벡터"는 상기 LPAT2 유전자 및 GPAT9 유전자가 발현될 수 있도록, 발현조절 서열과 기능적으로 연결되어 있다. 예를 들어, 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 벡터는 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명의 일실시예에서는, pB2GW7 벡터에 35S 프로모터를 종자 특이적 FAE1 프로모터에 RcGPAT9 유전자 및 RcLPAT2 유전자와 RcGPAT9 유전자 사이에 2A 서열을 포함하는 융합 유전자(RcLPAT2-2A-RcGPAT9)를 연결하여 종자 특이적으로 발현하는 형질전환 벡터를 제작하였다.
본 발명의 일실시예에서 RcLPAT2 유전자와 RcGPAT9 유전자 사이에 2A 자가절단 서열을 포함하는 융합 유전자(RcLPAT2-2A-RcGPAT9)를 제조하기 위해 2A가 포함된 벡터 앞뒤로 포함된 제한효소 서열 중 특정 서열들을 포함하는 프라이머(RcLPAT2 Apa 정방향 프라이머, RcLPAT2 Kpn 역방향 프라이머, RcGPAT9 H3 역방향 프라이머 및 RcGPAT9 Sm 정방향 프라이머2)과 같이 제작하고 이를 이용하여 PCR한 후 제한효소로 잘라 넣어 RcLPAT2와 2A와 RcGPAT9이 연결된 벡터를 제조하였다.
따라서 본 발명의 재조합 벡터는 LPAT2 유전자 및 GPAT9 유전자 사이에 2A 자가절단 서열을 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 2A 자가절단 서열은 서열번호13의 염기서열로 이루어진다.
본 발명은 다른 관점에서, 식물체의 수산화지방산 함량 증진용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 식물체의 수산화지방산 함량 증진용 조성물은 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함하는 제1 재조합 벡터 및 서열번호14로 표시되는 DGAT2 유전자를 포함하는 제2 재조합 벡터를 포함한다.
본 발명에서 LPAT2 유전자, GPAT9 유전자, 수산화지방산에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 제1 재조합 벡터는 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함한다.
전술한 실시예에서 LPAT2 유전자(서열번호1)와 GPAT9 유전자(서열번호2) 발현용 재조합 벡터는 LPAT2 유전자와 GPAT9 유전자 사이에 2A 자가절단 서열(서열번호13)을 포함하도록 제조하였는바, 본 발명의 제1 재조합 벡터는 LPAT2 유전자(서열번호1)와 GPAT9 유전자(서열번호2)사이에 서열번호13의 상기 2A 자가절단 서열을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 "제1 재조합 벡터"는 상기 LPAT2 유전자 및 GPAT9 유전자가 발현될 수 있도록, 발현조절 서열과 기능적으로 연결되어 있다. 예를 들어, 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 벡터는 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
전술한 실시예에서 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자가 형질도입된 애기장대 종자에서 수산화지방산 함량이 증가하는 것을 확인하였는바, 본 발명의 조성물은 수산화지방산 함량을 증진용도인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에서, 서열번호1의 LPAT2 유전자 및 서열번호2의 GPAT9 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환한 애기장대와 서열번호14의 RcDGAT2로 형질전환한 애기장대를 교배한 후 이들의 종자(CL37-RcLPAT2GPAT9 X RcDGAT2 F1)에서 수산화지방산 함량을 분석한 결과, 수산화지방산 함량은 24 내지 25% 대로 CL37 애기장대와 비교하여 증가하였으며, F2 세대에서는 최대 29.8%가 나와 CL37-RcDGAT2의 27%, CL37-RcLPAT2GPAT9의 25.5%에 비해 증대되었다는 것을 확인하였다.
즉, 피마자 유래의 LPAT2와 GPAT9은 애기장대의 종자에서 같이 발현하여 수산화지방산의 함량을 증진하는 데에 관여하는 유전자임을 확인하였으며, 또한 피마자 DGAT2 유전자와 함께 발현하였을 때 애기장대 종자의 수산화지방산 함량을 더욱 증진시킴을 확인하였다.
상기 조성물은 서열번호14으로 표시되는 DGAT2 유전자를 포함하는 제2 재조합 벡터를 포함한다.
본 발명에서 제2 재조합 벡터는 서열번호14으로 표시되는 DGAT2 유전자를 포함한다.
본 발명에서 DGAT2 유전자는 디글리세리드 아실전이효소(Diglyceride acyltransferase) 단백질을 코딩하는 유전자로 서열번호14로 표시되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기 DGAT2 유전자는 피마자 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 "제2 재조합 벡터"는 상기 DGAT2 유전자가 발현될 수 있도록, 발현조절 서열과 기능적으로 연결되어 있다. 예를 들어, 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 벡터는 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 수산화지방산 함량이 증진된 식물체에 관한 것이다.
본 발명에서 재조합 벡터는 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함한다.
본 발명의 수산화지방산 함량이 증진된 식물체은 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자 발현이 증가하여 수산화지방산 함량이 증진되는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 전술한 실시예에서 서열번호14로 표시되는 DGAT2 유전자, 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자 발현의 발현이 동시에 증진된 식물체에서 수산화지방산 함량이 가장 우수함을 확인하였는바, 본 발명에 따른 식물체는 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자 발현이 증진된 동시에 서열번호14로 표시되는 DGAT2 유전자 발현이 증진된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 유전자 발현의 증진은 LPAT2 유전자, GPAT9 유전자 또는 GPAT9 유전자를 식물체에 재조합 벡터로 형질전환하여 LPAT2 유전자, GPAT9 유전자 또는 GPAT9 유전자의 발현이 증진된 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은, 유전물질인 DNA를 다른 계통의 살아 있는 세포에 주입했을 때, DNA가 그 세포에 들어가 유전형질을 변화시키는 현상으로, 형질변환, 형전환, 또는 형변환이라고도 한다.
본 발명에서 상기 벡터로 식물체를 "형질전환"하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로는, 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method) 또는 아그로박테리아 분사법(Agrobacterium spraying method)을 이용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법 또는 아그로박테리아 분사법(Agrobacterium spraying method)을 이용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "식물체"는, 성숙한 식물체뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미이다.
본 발명에서 상기 식물체는 참깨(Sesamum indicum), 들깨(Perilla frutescens), 유채(Brassica napus), 해바라기(Helianthus annuus), 땅콩(Arachis hypogaea), 콩(Glycine max), 코코야자(Cocos nucifera), 기름야자(Elaeis guineensis), 카멜리나(Camelina sativa) 및 호호바(Simmondsia chinensis)로 이루어진 군에서 선택되는 1종의 유지식물일 수 있으며, 구체적으로 카멜리나(Camelina sativa)일 수 있다.
본 발명에서 상기 형질전환된 식물체는 서열번호1의 LPAT2 유전자 및 서열번호2의 GPAT9 유전자가 발현되어 수산화지방산 함량이 증진된 것을 특징으로 하며, 구체적으로 종자의 수산화지방산 함량이 증진된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 수산화지방산 함량이 증가된 식물체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 식물체의 제조방법은 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함하는 제1 재조합 벡터를 식물체에 형질도입하는 단계, 및 상기 제1 재조합 벡터가 형질도입된 식물체에 서열번호14로 표시되는 DGAT2 유전자를 포함하는 제2 재조합 벡터를 형질도입하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 LPAT2 유전자, GPAT9 유전자, 제1 재조합 벡터, 제2 재조합 벡터, 식물체, 형질도입 및 수산화지방산에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
상기 식물체를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같으며, 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물체로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.
전술한 실시예에서 피마자 유래의 LPAT2와 GPAT9은 애기장대의 종자에서 같이 발현하여 수산화지방산의 함량을 증진하는 데에 관여하는 유전자임을 확인하였으며, 또한 피마자 DGAT2 유전자와 함께 발현하였을 때 애기장대 종자의 수산화지방산 함량을 더욱 증진시킴을 확인하였다.
제1 재조합 벡터가 형질도입된 LPAT2 유전자, GPAT9 유전자 발현 식물체에 서열번호14으로 표시되는 DGAT2 유전자를 포함하는 제2 재조합 벡터를 형질도입함으로써 하나의 식물체에서 피마자 유래의 LPAT2 유전자, GPAT9 유전자 및 DGAT2 유전자를 동시에 발현시켜 대조군(목적 유전자를 형질전환하지 않음), LPAT2 유전자 또는 GPAT9 유전자 발현 식물체와 비교하여 종자에서 수산화지방산 함량을 보다 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 다른 관점에서 식물체에서 수산화지방산 함량을 증가 시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 수산화지방산 함량을 증가시키는 방법은 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함하는 제1 재조합 벡터로 형질도입된 제1 형질전환 식물체를 준비하는 단계, 서열번호14로 표시되는 DGAT2 유전자를 포함하는 제2 재조합 벡터로 형질도입된 제2 형질전환 식물체를 준비하는 단계, 및 상기 제1 형질전환 식물체와 상기 제2 형질전환 식물체를 교배하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 LPAT2 유전자, GPAT9 유전자, DGAT2 유전자, 제1 재조합 벡터, 제2 재조합 벡터, 형질도입, 수산화지방산, 식물체에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 “제1 형질전환 식물체”는 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함하는 제1 재조합 벡터로 형질도입되어 LPAT2 유전자 및 GPAT9 유전자가 발현이 대조군과 비교하여 증진된 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 대조군은 제1 재조합 벡터 또는 제2 재조합 벡터가 형질도입되지 않은 식물체를 의미한다.
본 발명의 “제2 형질전환 식물체”는 서열번호14으로 표시되는 DGAT2 유전자를 포함하는 제2 재조합 벡터로 형질도입되어 DGAT2 유전자가 발현이 대조군과 비교하여 증진된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 실시예에서 서열번호1의 LPAT2 유전자 및 서열번호2의 GPAT9 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환한 애기장대와 서열번호14의 RcDGAT2로 형질전환한 애기장대를 교배한 후 이들의 종자(CL37-RcLPAT2GPAT9 X RcDGAT2 F1)에서 수산화지방산 함량을 분석한 결과, 수산화지방산 함량은 24 내지 25% 대로 대조군(CL37)과 비교하여 증가하였으며, F2 세대에서는 최대 29.8%가 나와 CL37-RcDGAT2의 27%, CL37-RcLPAT2GPAT9의 25.5%에 비해 증대되었다는 것을 확인하였다.
즉, 제1 형질전환 식물체와 상기 제2 형질전환 식물체를 교배한 후대의 종자에서 수산화지방산 함량이 증진되는 것을 확인하였는바, 본 발명의 식물체에서 수산화지방산 함량을 증가 시키는 방법은 상기 제1 형질전환 식물체와 상기 제2 형질전환 식물체를 교배시키는 것을 특징으로 한다.
상기 제1 형질전환 식물체와 상기 제2 형질전환 식물체를 교배시킨 식물체의 후대는 LPAT2 유전자, GPAT9 유전자 및 DGAT2 유전자의 발현이 동시에 증진되어 수산화지방산 함량이 증가된다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
<실시예1> 피마자 유래 GPAT9과 LPAT2 분리 및 재조합 발현 벡터의 제조
피마자 전장 유전체 해독(whole genome sequencing) 데이터를 애기장대 GPAT9과 LPAT2 유전자 염기서열을 query로 하여 블라스트(blast) 검색한 결과, 피마자 유래 LPAT2 유전자(서열번호1) 및 GPAT9 유전자(서열번호2)의 염기서열을 확보하였고 이를 토대로 표 2와 같이 프라이머를 제작하였다.
| 유전자 명칭 | Sequence (5’-3’) |
| LPAT2 유전자 (서열번호1) |
ATGGCTGTTGCAGCTGTAGCTGTTATCTTACCATTGGGTGTTCTCTTTTTCTTGTCTGGTTTAGTTGTTAATCTCTTTCAGGCAATCTGCTTTGTTCTGATTAGGCCAATCTCAAAGAGTAGTTACAGAATGATCAATAGAGCTTTAGCTGAGTTGTTATGGCTGGAACTTGTATGGCTCGTTGACTGGTGGGCTAAAATTAAGATCCAAGTATATACAGATCGAGAGACATTGTGCTTGATGGGCAAAGAACATGCGCTTATCTTAGCCAACCACAGAAGCGACATTGATTGGCTTGTTGGATGGATGTTGGCTCAGCGCGCAGGATGTCTTGGCAGTGCATTAGCTGTCATGAAGAAATCATCAAAATTTCTTCCGGTCATAGGCTGGTCCATGTGGTTTTCCGAGTACCTATTCCTGGAAAGAAGCTGGGCCAAGGATGAAAGCACATTAAAGTCAGGTATCCAACGGCTAAAGGACTTCCCTCGACCCTTTTGGTTGGGTCTCTTTGTTGAAGGAACTCGCTTTACGAAGGCAAAGCTTTTAGCAGCTCAGCAATATGCTGCTTCACAAGGGCTGCCGATCCCTAGAAATGTTTTGATTCCTCGTACCAAGGGTTTTGTTTCAGCAGTAAGTAATATGCGCTCGTTTGTCCCAGCCATTTATGATGTAACAGTTGCTATTCCAAAAAATTCACCTCAACCCACAATGCTCAGGCTTTTCAAGGGGCAATCTTCAGTGGTGCATGTACACATTAAACGGCATTTGATGAAGGATTTGCCTGAAACAGATGATGCTGTTGCTCAATGGTGTAAAGATCTATTTGTGGCGAAGGATGCATTATTGGACAAGCATATTGCTGAGGACACATTCAGCGAGCAAGAACTGCAGGATATTGGCCGACCAAAGAAGTCTCTTGTGGTTGTTACCTTGTGGTCGTGCTTGCTTATCTTTGGGACTTTGAAGTTCCTCCAGTGGTCATCACTTTTGTCATCATGGAAGGGTATTGCGTTGTCAATGTCTGCCCTGGCAATCGTTACTGTCCTTATGCACATCTTGATACGCTTTTCGCAATCGGAGCATTCAACCCCTGCTCAGGTTGCCCCAGCAAACCATGCTCAGGTTGCCCCGGAAAACCCCCAAAATGGAGGAGAGCCTTCAGAAAAAGCAGAAAACAAACAGGACTAG |
| GPAT9 유전자 (서열번호2) |
ATGAGCACTGCGGGTAAACTAAACTCATCGAGCTCAGAATTGGACTTGGATCGACCTAATATCGAAGATTATCTTCCTTCTGGATCCTCTATTCATGAACCTCACGGCAAGCTCCGCCTGCGTGATTTGCTGGATATTTCGCCAGCCCTAACAGAAGCAGCTGGTGCAATTGTTGATGACTCGTTTACACGATGTTTCAAGTCGAATCCTCCTGAACCATGGAATTGGAATATATATCTATTTCCCCTATGGTGTTGTGGTGTTGTGATTCGATATGGGATTTTGTTCCCTGTCAGGGTTCTGGTGCTGACGATAGGGTGGATAATATTTCTTTCAGCGTACATTCCTGTGCATTTGCTACTGAAAGGACATGAGAAGTTGAGGAAAAAGTTAGAGAGGTGTTTGGTGGAGTTAATTTGCAGCTTCTTTGTGGCATCATGGACTGGAGTTGTCAAGTACCATGGGCCACGGCCTAGCATTCGACCTAAACAGGTTTTTGTGGCTAATCATACCTCCATGATTGATTTTATCGTCTTAGAGCAGATGACTGCATTTGCTGTTATTATGCAAAAACATCCTGGTTGGGTTGGACTTTTACAAAGCACTATACTAGAGAGTGTTGGTTGTATCTGGTTCAACCGTTCAGAGGCAAAAGATCGCGAAATTGTAGCAAAAAAGTTAAGGGACCATGTTCAGGGTGCTGACAATAACCCCCTTCTCATATTTCCTGAAGGGACTTGTGTAAATAACCACTATACTGTGATGTTCAAGAAGGGTGCATTTGAACTGGGGTGTACCGTTTGCCCAATTGCAATCAAATACAATAAAATTTTTGTTGATGCATTTTGGAACAGCAGGAAGCAGTCCTTTACAACGCATCTGCTGCAACTTATGACATCATGGGCTGTTGTTTGTGATGTCTGGTACTTGGAGCCACAAAATCTGAGACCTGGAGAAACACCCATTGAGTTTGCAGAGAGGGTCAGGGACATAATATCTGTACGAGCAGGTCTTAAAAAGGTTCCTTGGGATGGATATCTGAAGTATTCTCGCCCTAGCCCAAAACATAGAGAGAGAAAGTAA |
피마자 발달종자에서 추출한 전체 RNA를 주형으로 RcLPAT2 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 이용하여 RT-PCR(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction)하여 RcLPAT2를 클로닝하였고, RcGPAT9 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 이용하여 RT-PCR하여 RcGPAT9 유전자를 클로닝하였다.
각 유전자를 pENTR/D-TOPO 벡터에 클로닝한 후 시퀀싱하여 기존의 염기서열과 다르지 않음을 확인하였다.
RcLPAT2 유전자와 RcGPAT9 유전자 사이에 2A 자가절단 서열(서열번호13)을 포함하는 융합 유전자(RcLPAT2-2A-RcGPAT9)를 제조하기 위해 2A가 포함된 벡터 앞뒤로 포함된 제한효소 서열 중 특정 서열들을 포함하는 프라이머(RcLPAT2 Apa 정방향 프라이머, RcLPAT2 Kpn 역방향 프라이머, RcGPAT9 H3 역방향 프라이머 및 RcGPAT9 Sm 정방향 프라이머2)과 같이 제작하고 이를 이용하여 PCR한 후 제한효소로 잘라 넣어 RcLPAT2와 2A(자가절단 서열) 및 RcGPAT9이 연결된 벡터를 제조하였다.
2A 자가절단 서열(서열번호13):
AGCCAGCAAGACAGCGATCAGCTCCTCAACTTCGACCTCCTCAAGCTCGCCGGCGACGTCGAGAGCAACGACGGCCCGATCACCTGTAAGTCGGAC
이를 다시 RcLPAT2_F_B1과 RcGPAT9_R_B2 프라이머로 PCR하여 pDONR201 벡터에 Gateway BP clonase를 이용하여 BP 반응(reaction)으로 삽입하여 pENTR/D-TOPO 벡터에 클로닝 하였다.
도 1은 RcLPAT2 유전자, RcGPAT9 유전자 및 RcLPAT2 유전자와 RcGPAT9 유전자 사이에 2A 자가절단 서열을 포함하는 융합 유전자(RcLPAT2-2A-RcGPAT9)의 크기를 확인한 결과이다. 분석결과 RcLPAT2 유전자는 1.188 kb, RcGPAT9 유전자는 1.083 kb, RcLPAT2-2A-RcGPAT9 유전자는 2.382 kb 임을 확인하였다.
RcGPAT9 유전자는 pB2GW7 벡터에 35S 프로모터를 종자 특이적 FAE1 프로모터로 교체한 벡터에 Gateway LR clonase를 이용하여 LR reaction으로 삽입하여 대장균(E.coli)에 도입하였다. 시퀀싱을 수행하여 에러 없는 클론을 선발하였다. 시퀀싱하여 에러가 없는 클론으로 pB2GW7 벡터에 35S 프로모터를 종자 특이적 파세올린(phaseolin) 프로모터로 교체한 벡터에 게이트웨이 LR 클로네이스(Gateway LR clonase)를 이용하여 LR reaction으로 삽입하였고 도 2와 같은 벡터를 구축하였다.
<실시예2> RcLPAT2 및 RcGPAT9 발현 애기장대 종자의 수산화지방산 함량 변화 분석
완성된 벡터 전체를 시퀀싱한 결과 에러가 없는 클론으로 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens GV3101 strain)에 형질전환(transformation)하고 애기장대 형질전환에 사용하였다.
종자에서 전체지방산 중 수산화지방산 17%를 생산하는 CL37 애기장대에 이 벡터들로 형질전환 결과, RcGPAT9 만 도입된 형질전환 애기장대에서는 수산화지방산 함량이 대조군(CL37)과 유의한 차이가 없었다. 반면에 RcLPAT2와 RcGPAT9이 동시에 도입된 형질전환 애기장대의 T2 종자의 경우 대부분 수산화지방산 함량이 7%대나 그 이하로 나타났으나, 4번 개체 하나만 약 24%에 달하는 결과를 보였다. 상기 4번 형질전환 개체의 T3 세대를 진전하여 종자 지방산을 확인했더니 수산화지방산 함량이 24% 수준으로 유지되었으며, 최대 24.7% 함량을 나타냈다(도 3).
다음으로 RcLPAT2와 RcGPAT9이 동시에 형질도입된 애기장대(CL37-RcLPAT2GPAT9))의 지방산 조성변화를 분석하였다. 대조군(CL37)과 RcLPAT2 및 RcGPAT9 발현 형질전환 애기장대( CL37-RcLPAT2GPAT9)의 T2 및 T3 종자에서 각 지방산의 조성을 분석하였다(표 3).
각각의 지방산 별로 함량 분석한 결과, CL37-RcLPAT2GPAT9(LG)에서 대조군 애기장대(CL37)와 비교하여 16:0(팔미트산, Palmitic acid), 18:0(스테아르산, Stearic acid), 20:0(아라키딘산, Arachidic acid)와 같은 포화지방산 함량이 감소하였다. 18:1 지방산(올레산, Oleic acid) 함량은 대조군 애기장대(CL37) 29.9%로 나타났으나, CL37-RcLPAT2GPAT9에서 약 4.5 내지 7.4%가 감소하여 22.5% 내지 25.5%로 나타났다.
반면, 18:3 지방산(리놀렌산, Linolenic acid) 함량은 대조군 애기장대(CL37) 6.2%로 나타났으며, CL37-RcLPAT2GPAT9에서 2.1 내지 2.6% 증가하여 8.3% 내지 8.8%로 나타났다. 그리고 18:1-OH 지방산(리시놀레산, Ricinoleic acid)은 대조군 애기장대(CL37) 14.2%로 나타났으며, CL37-RcLPAT2GPAT9에서 5% 가량 증가하여 19.0 내지 19.8%로 나타났다.
18:2-OH(덴시폴산, Densipolic acid)는 대조군 애기장대(CL37) 3.1%로 나타났으며 CL37-RcLPAT2GPAT9에서 1.4 내지 1.8% 증가하여 4.5 내지 4.9%로 나타났다.
CL37-RcLPAT2GPAT9의 T2(LG#4)와 T3(LG#4-4, LG#4-6, LG#4-12, LG#4-13, LG#4-14)를 비교했을 때에는 수산화지방산 함량의 차이가 크지 않았기 때문에 세대에 따른 유의한 변화를 볼 수는 없었다.
<실시예3> DGAT2 유전자 추가 도입에 따른 종자의 수산화지방산 함량 변화 분석
종자의 저장지방을 합성대사경로인 케네디 경로(Kennedy pathway)에 있는 3개의 아실전이효소(acyltransferase) 중 GPAT9, LPAT2 외에 가장 결정적인 효소는 DGAT 유전자이다. 따라서 피마자의 DGAT2 유전자를 추가로 도입하여 시너지 효과가 있는지 확인하였다.
피자마 유래 DGAT2 유전자 형질전환 애기장대의 제조 및 수산화지방산 함량 변화 분석
히그로마이신(Hygromycin) 저항성 유전자를 포함하는 pCAMBIA1300에 종자특이 파세올린(phaseolin) 프로모터를 삽입하고 RcDGAT2 유전자(서열번호14)를 추가 삽입하였고 에러 없이 삽입된 클론을 아그로박테리움(Agrobacterium)에 도입하였고 CL37 형질전환에 사용하였다. 그 결과, 19개의 형질전환체 중에 1번 개체가 22.9%의 수산화지방산 함량을 보였고 이를 T2, T3까지 세대진전한 결과 최대 27%까지 증진되었다(도 4).
| 유전자 명칭 | Sequence (5’-3’) |
| RcDGAT2 유전자 (서열번호14) |
ATGGGGGAAGAAGCGAATCATAATAATAATAATAATAATATCAATAGTAATGATGAGAAGAATGAAGAGAAATCAAATTATACAGTTGTAAATTCGAGAGAACTATACCCAACGAACATATTTCACGCACTGTTAGCGTTGAGCATATGGATTGGTTCAATCCATTTCAATCTCTTCTTACTCTTCATCTCTTATCTCTTCCTTTCTTTTCCCACATTCCTCCTGATTGTTGGATTTTTTGTGGTGTTAATGTTCATTCCGATCGACGAACACAGTAAGTTGGGCCGTCGTTTGTGCAGGTATGTATGCAGACATGCGTGCAGTCATTTTCCGGTAACTCTCCATGTTGAAGACATGAATGCTTTTCATTCTGATCGTGCTTACGTTTTTGGTTATGAGCCACATTCAGTATTTCCCCTTGGTGTTTCTGTACTATCAGATCACTTTGCTGTCCTGCCCCTTCCTAAAATGAAGGTCCTTGCAAGTAACGCTGTGTTTCGCACACCAGTTTTAAGGCATATATGGACATGGTGTGGTCTTACATCAGCAACAAAGAAAAATTTCACTGCCCTCCTAGCATCTGGTTATAGTTGCATTGTGATTCCCGGTGGAGTTCAAGAGACATTTTATATGAAGCATGGCTCTGAGATTGCTTTCCTTAAGGCGAGAAGAGGGTTTGTCCGAGTAGCTATGGAGATGGGTAAACCCTTGGTTCCAGTTTTCTGCTTTGGTCAATCGAACGTGTACAAGTGGTGGAAACCTGATGGCGAGTTATTTATGAAAATTGCTAGAGCTATTAAGTTCAGCCCAATTGTCTTTTGGGGAGTTCTCGGTTCTCATTTACCGCTACAACGTCCAATGCATGTTGTCGTCGGTAAACCGATTGAGGTGAAGCAAAATCCACAGCCTACAGTGGAAGAGGTCTCAGAAGTACAGGGTCAGTTTGTTGCGGCACTTAAAGATCTTTTTGAAAGGCATAAAGCACGGGTTGGCTATGCAGACCTTACACTTGAAATTCTTTGA |
RcLPAT2, RcGPAT9 및 DGAT2 동시 발현 애기장대의 수산화지방산 함량 변화 분석
수산화지방산 함량 최대치를 보이는 RcLPAT2 및 RcGPAT9 형질전환 애기장대(CL37-LG#4-4)와 CL37-RcDGAT2 형질전환 애기장대를 인공교배하여 유전자 집적을 시도하였다.
CL37-RcLPAT2GPAT9 X RcDGAT2 F1의 종자 수산화지방산 함량은 24 내지 25%대로 균일하게 나왔으며 최대치는 25.5%로 나타났다(도 5). F2 세대에서는 최대 29.8%가 나와 CL37-RcDGAT2의 27%, CL37-RcLPAT2GPAT9의 25.5%에 비해 증대되었다는 것을 알 수 있었다.
즉, 피마자 유래의 LPAT2와 GPAT9은 애기장대의 종자에서 같이 발현하여 수산화지방산의 함량을 증진하는 데에 관여하는 유전자임을 확인하였으며, 또한 피마자 DGAT2 유전자와 함께 발현하였을 때 애기장대 종자의 수산화지방산 함량을 더욱 증진시킴을 확인하였다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Castor LPAT2 and GPAT9 genes related to the increase of hydroxy
fatty acid content and use thereof
<130> DP20200188
<160> 14
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1188
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LPAT2 gene
<400> 1
atggctgttg cagctgtagc tgttatctta ccattgggtg ttctcttttt cttgtctggt 60
ttagttgtta atctctttca ggcaatctgc tttgttctga ttaggccaat ctcaaagagt 120
agttacagaa tgatcaatag agctttagct gagttgttat ggctggaact tgtatggctc 180
gttgactggt gggctaaaat taagatccaa gtatatacag atcgagagac attgtgcttg 240
atgggcaaag aacatgcgct tatcttagcc aaccacagaa gcgacattga ttggcttgtt 300
ggatggatgt tggctcagcg cgcaggatgt cttggcagtg cattagctgt catgaagaaa 360
tcatcaaaat ttcttccggt cataggctgg tccatgtggt tttccgagta cctattcctg 420
gaaagaagct gggccaagga tgaaagcaca ttaaagtcag gtatccaacg gctaaaggac 480
ttccctcgac ccttttggtt gggtctcttt gttgaaggaa ctcgctttac gaaggcaaag 540
cttttagcag ctcagcaata tgctgcttca caagggctgc cgatccctag aaatgttttg 600
attcctcgta ccaagggttt tgtttcagca gtaagtaata tgcgctcgtt tgtcccagcc 660
atttatgatg taacagttgc tattccaaaa aattcacctc aacccacaat gctcaggctt 720
ttcaaggggc aatcttcagt ggtgcatgta cacattaaac ggcatttgat gaaggatttg 780
cctgaaacag atgatgctgt tgctcaatgg tgtaaagatc tatttgtggc gaaggatgca 840
ttattggaca agcatattgc tgaggacaca ttcagcgagc aagaactgca ggatattggc 900
cgaccaaaga agtctcttgt ggttgttacc ttgtggtcgt gcttgcttat ctttgggact 960
ttgaagttcc tccagtggtc atcacttttg tcatcatgga agggtattgc gttgtcaatg 1020
tctgccctgg caatcgttac tgtccttatg cacatcttga tacgcttttc gcaatcggag 1080
cattcaaccc ctgctcaggt tgccccagca aaccatgctc aggttgcccc ggaaaacccc 1140
caaaatggag gagagccttc agaaaaagca gaaaacaaac aggactag 1188
<210> 2
<211> 1083
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GPAT9 gene
<400> 2
atgagcactg cgggtaaact aaactcatcg agctcagaat tggacttgga tcgacctaat 60
atcgaagatt atcttccttc tggatcctct attcatgaac ctcacggcaa gctccgcctg 120
cgtgatttgc tggatatttc gccagcccta acagaagcag ctggtgcaat tgttgatgac 180
tcgtttacac gatgtttcaa gtcgaatcct cctgaaccat ggaattggaa tatatatcta 240
tttcccctat ggtgttgtgg tgttgtgatt cgatatggga ttttgttccc tgtcagggtt 300
ctggtgctga cgatagggtg gataatattt ctttcagcgt acattcctgt gcatttgcta 360
ctgaaaggac atgagaagtt gaggaaaaag ttagagaggt gtttggtgga gttaatttgc 420
agcttctttg tggcatcatg gactggagtt gtcaagtacc atgggccacg gcctagcatt 480
cgacctaaac aggtttttgt ggctaatcat acctccatga ttgattttat cgtcttagag 540
cagatgactg catttgctgt tattatgcaa aaacatcctg gttgggttgg acttttacaa 600
agcactatac tagagagtgt tggttgtatc tggttcaacc gttcagaggc aaaagatcgc 660
gaaattgtag caaaaaagtt aagggaccat gttcagggtg ctgacaataa cccccttctc 720
atatttcctg aagggacttg tgtaaataac cactatactg tgatgttcaa gaagggtgca 780
tttgaactgg ggtgtaccgt ttgcccaatt gcaatcaaat acaataaaat ttttgttgat 840
gcattttgga acagcaggaa gcagtccttt acaacgcatc tgctgcaact tatgacatca 900
tgggctgttg tttgtgatgt ctggtacttg gagccacaaa atctgagacc tggagaaaca 960
cccattgagt ttgcagagag ggtcagggac ataatatctg tacgagcagg tcttaaaaag 1020
gttccttggg atggatatct gaagtattct cgccctagcc caaaacatag agagagaaag 1080
taa 1083
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RcLPAT2 forward primer
<400> 3
caccatggct gttgcagctg t 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RcLPAT2 reverse primer
<400> 4
gtcctgtttg ttttctgctt 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RcGPAT9 forward primer
<400> 5
caccatgagc actgcgggta aa 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RcGPAT9 reverse primer
<400> 6
ttactttctc tctctatgtt ttgg 24
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RcLPAT2 Apa forward primer
<400> 7
ttgggccctt caccatggct gtt 23
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RcLPAT2 Kpn reverse primer
<400> 8
ggggtaccgt cctgtttgtt ttctgctttt tc 32
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RcGPAT9 H3 reverse primer
<400> 9
ttaagcttac tttctctctc tatgttttg 29
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RcGPAT9 Sm forward primer 2
<400> 10
cccccgggat gagcactgcg ggtaaac 27
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RcLPAT2 B1 forward primer
<400> 11
aaaaagcagg ctttcaccat ggctgttgc 29
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RcGPAT9 B2 reverse primer
<400> 12
agaaagctgg gtacgccaag cttttacttt c 31
<210> 13
<211> 96
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2A self-cleaving sequence
<400> 13
agccagcaag acagcgatca gctcctcaac ttcgacctcc tcaagctcgc cggcgacgtc 60
gagagcaacg acggcccgat cacctgtaag tcggac 96
<210> 14
<211> 1023
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RcDGAT2 gene
<400> 14
atgggggaag aagcgaatca taataataat aataataata tcaatagtaa tgatgagaag 60
aatgaagaga aatcaaatta tacagttgta aattcgagag aactataccc aacgaacata 120
tttcacgcac tgttagcgtt gagcatatgg attggttcaa tccatttcaa tctcttctta 180
ctcttcatct cttatctctt cctttctttt cccacattcc tcctgattgt tggatttttt 240
gtggtgttaa tgttcattcc gatcgacgaa cacagtaagt tgggccgtcg tttgtgcagg 300
tatgtatgca gacatgcgtg cagtcatttt ccggtaactc tccatgttga agacatgaat 360
gcttttcatt ctgatcgtgc ttacgttttt ggttatgagc cacattcagt atttcccctt 420
ggtgtttctg tactatcaga tcactttgct gtcctgcccc ttcctaaaat gaaggtcctt 480
gcaagtaacg ctgtgtttcg cacaccagtt ttaaggcata tatggacatg gtgtggtctt 540
acatcagcaa caaagaaaaa tttcactgcc ctcctagcat ctggttatag ttgcattgtg 600
attcccggtg gagttcaaga gacattttat atgaagcatg gctctgagat tgctttcctt 660
aaggcgagaa gagggtttgt ccgagtagct atggagatgg gtaaaccctt ggttccagtt 720
ttctgctttg gtcaatcgaa cgtgtacaag tggtggaaac ctgatggcga gttatttatg 780
aaaattgcta gagctattaa gttcagccca attgtctttt ggggagttct cggttctcat 840
ttaccgctac aacgtccaat gcatgttgtc gtcggtaaac cgattgaggt gaagcaaaat 900
ccacagccta cagtggaaga ggtctcagaa gtacagggtc agtttgttgc ggcacttaaa 960
gatctttttg aaaggcataa agcacgggtt ggctatgcag accttacact tgaaattctt 1020
tga 1023
Claims (9)
- 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함하는 식물체의 수산화지방산 함량 증진용 재조합 벡터.
- 제 1항에 있어서,
상기 LPAT2 및 GPAT9 유전자는 피마자에서 유래된 것인,
재조합 벡터. - 제 1항에 있어서,
상기 LPAT2 유전자 및 상기 GPAT9 유전자 사이에 서열번호13으로 표시되는 2A 자가절단 서열을 더 포함하는 것인,
재조합 벡터. - 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함하는 제1 재조합 벡터, 및
서열번호14로 표시되는 DGAT2 유전자를 포함하는 제2 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 수산화지방산 함량 증진용 조성물. - 제 1항의 재조합 벡터로 형질전환된 수산화지방산 함량이 증진된 식물체.
- 제 5항에 있어서,
상기 식물체는 참깨(Sesamum indicum), 들깨(Perilla frutescens), 유채(Brassica napus), 해바라기(Helianthus annuus), 땅콩(Arachis hypogaea), 콩(Glycine max), 코코야자(Cocos nucifera), 기름야자(Elaeis guineensis), 카멜리나(Camelina sativa), 및 호호바(Simmondsia chinensis)로 이루어진 군에서 선택되는 1종의 유지식물인 것인,
식물체. - 제 5항에 있어서,
상기 식물체는 종자의 수산화지방산 함량이 증진된 것을 특징으로 하는,
식물체. - 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함하는 제1 재조합 벡터를 식물체에 형질도입하는 단계, 및
상기 제1 재조합 벡터가 형질도입된 식물체에 서열번호14로 표시되는 DGAT2 유전자를 포함하는 제2 재조합 벡터를 형질도입하는 단계를 포함하는,
수산화지방산 함량이 증가된 식물체의 제조방법. - 서열번호1로 표시되는 LPAT2 유전자 및 서열번호2로 표시되는 GPAT9 유전자를 포함하는 제1 재조합 벡터로 형질도입된 제1 형질전환 식물체를 준비하는 단계,
서열번호14로 표시되는 DGAT2 유전자를 포함하는 제2 재조합 벡터로 형질도입된 제2 형질전환 식물체를 준비하는 단계, 및
상기 제1 형질전환 식물체와 상기 제2 형질전환 식물체를 교배하는 단계를 포함하는,
식물체에서 수산화지방산 함량을 증가시키는 방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020200141419A KR102535423B1 (ko) | 2020-10-28 | 2020-10-28 | 수산화지방산 함량 증진에 관여하는 피마자 유래 lpat2와 gpat9 유전자 및 이의 용도 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114615881A (zh) * | 2019-08-07 | 2022-06-10 | 罗特哈姆斯泰德研究有限公司 | 产生甘油三酯的非人类生物体 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090022328A (ko) * | 2007-08-30 | 2009-03-04 | 대한민국(관리부서:농촌진흥청) | 자가 절단 2ａ배열을 포함하는 베타카로틴 생합성용 융합폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 형질전환 식물체 |
| KR101749429B1 (ko) | 2015-12-11 | 2017-06-21 | 대한민국(환경부 국립생물자원관장) | 올레산 수화효소 유전자, 상기 유전자를 함유한 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 |
-
2020
- 2020-10-28 KR KR1020200141419A patent/KR102535423B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR101749429B1 (ko) | 2015-12-11 | 2017-06-21 | 대한민국(환경부 국립생물자원관장) | 올레산 수화효소 유전자, 상기 유전자를 함유한 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 |
Non-Patent Citations (5)
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|---|
| Daniel Lunn 등. Plant Physiology. Vol. 179, 페이지 1050-1063 (2019.03.)* * |
| GenBank Accession Number EU391594 (2018.12.07.)* * |
| GenBank Accession Number KF857224 (2016.12.31.)* * |
| GenBank Accession Number NM_001323687 (2020.07.05.)* * |
| Hyun Uk Kim 등. BMC Genomics. Vol. 16, No. 230, 페이지 1-21 (2015.03.24.)* * |
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|---|---|---|---|---|
| CN114615881A (zh) * | 2019-08-07 | 2022-06-10 | 罗特哈姆斯泰德研究有限公司 | 产生甘油三酯的非人类生物体 |
| CN114615881B (zh) * | 2019-08-07 | 2024-06-04 | 罗特哈姆斯泰德研究有限公司 | 产生甘油三酯的非人类生物体 |
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| KR102535423B1 (ko) | 2023-05-25 |
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