CN102399269B - 与脂肪酸代谢调控相关的转录因子GmbZIP123及其编码基因与应用 - Google Patents
与脂肪酸代谢调控相关的转录因子GmbZIP123及其编码基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种与脂肪酸代谢调控相关的转录因子GmbZIP123及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)、(b)或(c)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物脂肪酸代谢相关的由序列1衍生的蛋白质；(c)由与序列表中序列1所示的氨基酸序列至少具有75％同源性的氨基酸序列组成且与植物脂肪酸代谢相关的蛋白质。本发明的脂肪酸相关调控蛋白及其编码基因对培育高含油植物品种，从而提高植物，特别是植物种子中脂肪酸含量具有重要意义。本发明蛋白及其编码基因在高含油植物的培育中将有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及植物转录因子及其编码基因与应用，特别涉及一种与脂肪酸代谢调控相关的转录因子GmbZIP123及其编码基因与应用。
背景技术
人类饮食中71％的脂肪酸来自于植物。在世界上的几种主要产油作物中，大豆总产油量约占30％，居世界植物油产量的第一位，棕榈油及油菜子油分别位居第二及第三世界上主要的产油作物见表1。
表1 世界上主要的产油作物
| 种类 | 生产量(百万吨) | 占总产量百分比 | 相对顺序 |
| 大豆(Soybean) | 15.50 | 29.1 | 1 |
| 棕榈(Palm) | 8.52 | 16.0 | 2 |
| 油菜籽(Rapeseed) | 7.03 | 13.2 | 3 |
| 向日葵(Sunflower) | 7.00 | 13.1 | 4 |
| 棉花籽(Cottonseed) | 3.31 | 6.2 | 5 |
| 椰子(Coconut) | 2.71 | 5.1 | 6 |
| 花生(Peanut) | 2.69 | 5.0 | 7 |
| 橄榄(Olive) | 1.63 | 3.1 | 8 |
脂肪酸的合成是植物体中最重要的代谢途径之一，存在于植物体的任何一个细胞中，是生长发育所必须的。对脂肪酸的合成的阻断会导致细胞的死亡，至今为止还没有发现一个阻断脂肪酸合成的植物突变体。
植物中脂肪酸的合成主要是在质体中进行，而动物及真菌的脂肪酸合成发生于胞质。因此植物需要存在一种不同于动物及真菌的机制——从质体运出脂肪酸到细胞的其它部位。因而在细胞中必定存在脂肪酸生产和运输的控制机制，但是迄今尚不清楚在脂肪酸的合成中质体内外是如何联系的。
植物同其它真核生物参与脂肪酸合成途径的酶有很大差异。从乙酰CoA和丙二酰CoA合成16或18个碳原子的脂肪酸至少需要30个不同的酶催化的反应来完成这一过程，而在动物、真菌及一些细菌中，以上反应是由一个存在于胞质中的多酶复合体来完成的。植物中，参加脂肪酸合成的酶分别以可溶的形式独立存在于质体的胞质中。尽管植物中参与脂肪代谢的酶很容易被分离，但问题是这些酶是否在体内也可形成一个多酶复合体。
脂肪酸合成途径中最重要的碳源是由ACCase合成的丙二酰CoA，在进入脂肪酸合成途径之前，丙二酰由CoA转移到酰基载体蛋白(ACP)上，从此脂肪酸合成都需要ACP的参与，直到形成16或18个碳原子的脂肪酸，并被用于合成甘油或被运出质体。ACP是一个分子量为9KD的酸性蛋白，它具有一个可以通过硫酯化结合乙酰基的基团。当丙二酰由CoA转移到ACP后，硫酯化的丙二酰由CoA进行一系列的聚合反应，接受乙酰ACP或乙酰CoA的乙酰基团。这一聚合反应是通过释放一个CO2分子来形成一个C-C键，CO2的释放使这一反应变得不可逆，从而使聚合反应不断进行。大多数植物中，油脂都以三酰甘油(Triacylglycerols，TAG)的形式储藏，它的含量是一个非常重要的农艺性状，TAG的生物合成称之为Kennedy途径，如同真核生物中合成膜甘油酯的途径，脂肪酸去除CoA后被转移到3-磷酸甘油的1和2位，形成中间产物PA。PA去磷酸化产生DAG。在TAG合成的最后一步，第三个脂肪酸分子被转移到空的DAG 3’-OH位置，这一步反应是由二酰甘油乙酰转移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT)催化的，此反应被认为是TAG生物合成中唯一的限速步骤。
人们已对脂类合成途径有了认知，并且已经克隆了很多参与脂类合成的酶基因。然而，对脂类合成的调控机理及其相关基因仍然知之甚少。
发明内容
本发明的目的是提供一种与脂肪酸代谢调控相关的转录因子GmbZIP123及其编码基因与应用。
本发明提供的与脂肪酸代谢调控相关的蛋白质，名称为GmbZIP123，是一种转录因子，来源于大豆属大豆(Glycine max(L.)Merrill)，是如下(a)、(b)或(c)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物脂肪酸代谢相关的由序列1衍生的蛋白质；
(c)由与序列表中序列1所示的氨基酸序列至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的氨基酸序列组成且与植物脂肪酸代谢相关的蛋白质。
序列表中的序列1由138个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第30-79位氨基酸残基为bZIP结构域。
为了使(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表2所示的标签。
表2 标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tagII | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述(b)中的取代和/或缺失和/或添加，可由自然变异或人工诱变引起。
上述(a)、(b)或(c)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表2所示的标签的编码序列得到。
编码GmbZIP123蛋白的基因也属于本发明的保护范围。
所述基因可为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：
(1)序列表中序列2所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码植物脂肪酸代谢相关蛋白的DNA分子；
(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码植物脂肪酸代谢相关蛋白的DNA分子。
所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
序列表中的序列2由417个核苷酸组成，全部为bZIP123蛋白的编码序列，自5’端第57位到第249位碱基编码bZIP结构域。
含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))、组成型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)。如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。
所述重组载体具体可为将所述基因插入pPROKII载体的多克隆位点得到的重组表达载体。所述重组载体具体可为在pROKII的BamHI和KpnI酶切位点之间(CaMV 35S启动子之后)插入序列表的序列2所示的DNA得到的重组表达载体pROKII-GmbZIP123。
扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
所述引物对具体可为如下(I)或(II)：
(I)由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对；
(II)由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到脂肪酸含量高于所述目的植物的转基因植物。所述转基因植物不仅理解为包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。将所述基因导入目的植物，会使所述蛋白质目 的植物中合成，进而是目的植物的脂肪酸含量性状得到改良。
所述基因可先进行进行如下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％，优选为多于45％，更优选为多于50％，最优选多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接。
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。
在实际操作中，也可以将本发明基因进行细胞靶向定位。可利用本领域现有的技术实现。例如，将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明基因序列融合，再导入植物细胞中，就可定位了。
所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述目的植物可为豆科植物(如大豆、百脉根、苜蓿、水黄皮等)或油料作物(如油菜、向日葵、玉米等)或油料树种等。所述双子叶植物可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥。
所述脂肪酸可为总脂肪酸和/或如下脂肪酸中的至少一种：棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和花生烯酸。
所述脂肪酸含量可为植物种子中的脂肪酸含量。
实验证明，本发明的蛋白及其编码基因具有提高植物含油量的功能。本发明的脂肪酸相关调控蛋白及其编码基因对培育高含油植物品种，从而提高植物，特别是植物种子中脂肪酸含量具有重要意义。本发明蛋白及其编码基因在高含油植物的培育中将有广阔的应用前景。
附图说明
图1为大豆种子发育过程中取材标准。
图2为大豆种子发育过程不同阶段脂肪酸的积累情况。
图3为重组表达载体pROKII-GmbZIP123示意图。
图4为转GmbZIP123基因植株的RT-PCR鉴定。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。所用引物均由上海生工公司合成；生物芯片由上海生物芯片公司操作分析。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。棕榈酸(16:0)，硬脂酸(18:0)，油酸(18:1)，亚油酸(18:2)，亚麻酸(18:3)，花生烯酸(20:1)标准品均购自Sigma公司。
大豆黑农44(HN44)：公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文献：满为群等，大豆新品种黑农44的选育及不同种植方式对其产量和品种的影响，黑龙江农业科学2004年5期，1-5；由黑龙江农业科学院大豆研究所2002年经黑龙江省农作物品种审定委员会审定的大豆品种，第一育成人为杜维广研究员，专利号为：CNA20020216.2，审定号为：黑审豆2002003。
pROKII载体(双元表达载体)：公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文献：D.C.Baulcombe，G.R.Saunders，M.W.Bevan，M.A.Mayo and B.D.Harrison，Expression of biologically active viral satellite RNA from thenuclear genome of transformed plants.Nature 321(1986)，pp.446-449.。
农杆菌GV3101：公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文献：Lee CW等，Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulatingpathogen defense in Arabidopsis thaliana，Plant Cell，2009，21(9)，2948-62。
哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)：种子购自Arabidopsis Biological ResourceCenter(ABRC)。
实施例1、与油脂代谢调控相关的转录因子GmbZIP123及其编码基因的发现
一、大豆种子发育过程中脂肪酸积累代谢分析
两个脂肪酸含量有差异的大豆品种或种质：黑农44(HN44)和ZYD7。HN44籽粒中油脂含量为23％，ZYD7籽粒的油脂含量为12％。
两个品种种子发育过程的七个不同阶段(如图1所示)分别取材保存。用气相色谱测量HN44、ZYD7种子在各自7个发育阶段中的油脂含量，分析在种子发育过程中油脂积累曲线(图2)。分别取油脂含量增长曲线的两个拐点阶段：HN44中取HN44-5和HN44-6；ZYD7中取ZYD7-4和ZYD7-5。分别提取上述4个材料的总RNA，通过基因芯片比较其RNA的表达。基因芯片的结果通过GOEAST聚类分析，从中筛选出有差异的转录因子。其中在HN44中上调的转录因子有68个，下调的有59个；ZYD7中上调的有65个，下调的有68个。在两个品种的两个阶段中共同上调的基因有6个(包括GmbZIP123)；共同下调的基因有16个。
二、GmbZIP123基因的克隆
从NCBI网站核酸库检索同源序列，设计编码框的两端引物，引物序列如下：
Bzip123F：5’-ATGACTATGGCTTGTTCAAG-3’；
Bzip123R：5’-TCAGTACTGCAACATGTCTG-3’。
提取大豆品种HN44种子的RNA，用toyobo公司的反转录酶ReverTra Ace反转录成cDNA，以cDNA为模板，在bZIP123F和bZIP123R的引导下进行PCR扩增，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收长度约为417bp的DNA片段，将其克隆入载体pMD-18(TaKaRa公司)中，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒进行测序，测序结果表明，该序列如序列表的序列2所示。
将编码GmbZIP123蛋白的基因命名为GmbZIP123基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。
实施例2、GmbZIP123转基因拟南芥的获得和鉴定
一、GmbZIP123植物表达载体的构建
1、提取大豆品种HN44种子的RNA，反转录成cDNA。
2、设计含有BamH I和Kpn I接头序列的特异引物对如下：
Bzip123-PF：5’-CGCGGATCCATGACTATGGCTTGTTCAAG-3’；
Bzip123-PR5’-CGGGGTACCTCAGTACTGCAACATGTCTG-3’。
3、以步骤1的cDNA为模板，用步骤2的特异引物对进行PCR，回收PCR产物。
4、用限制性内切酶BamH I和Kpn I双酶切PCR产物，回收酶切产物。
5、用限制性内切酶BamH I和Kpn I双酶切pROKII载体，回收载体骨架。
6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到连接产物。
7、将连接产物进行测序，结果表明，得到了重组表达载体pROKI I-GmbZIP123(出发质粒为pROKII，在CaMV 35S启动子之后，BamHI和KpnI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA)。重组表达载体pROKII-GmbZIP123如图3所示。
二、转化拟南芥及转基因植株的鉴定
1、将重组表达载体pROKII-GmbZIP123通过电击法导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。
2、通过用抽真空法(Clough-SJ，Bent-AF.Floral dip：a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant-Journal.1998，16：6，735-743)将重组农杆菌转入哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)，收获种子(T1代种子)，播于含卡那霉素(50mg/L)的MS筛选培养基上；待T1代植株长至4-6叶时移到蛭石上生长。
3、收获T1代单株，各单株种子分别播种，用相同的MS筛选培养基继续筛选以观察T2代的分离情况，如此重复直至T3代，获得遗传稳定的纯合株系。
三、转空载体对照植株的获得
用pROKII代替重组表达载体pROKII-GmbZIP123，其它同步骤二，得到转空载体植株。
四、转GmbZIP123基因植株的分子鉴定
分别提取9个步骤二得到的T3代纯合株系(bZIP-1、bZIP-2、bZIP-3、bZIP-4、bZIP-5、bZIP-6、bZIP-7、bZIP-18、bZIP-20)和步骤三得到的T3代转空载体植株的2星期苗的RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板用bZIP123F和bZIP123R组成的引物对进行RT-PCR鉴定，结果见图4。9个纯合株系中除bZIP-6和bZIP-20外均有GmbZIP123基因的转录，均为确定的转GmbZIP123基因拟南芥纯系。
五、转GmbZIP123基因植株种子脂肪组分及含量分析
实验样本如下(每个株系15粒种子)：T3代转GmbZIP123基因拟南芥植株系(bZIP-1、bZIP-4和bZIP-7)，T3代转空载体植株和哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)。
1、总脂肪酸含量测定
总脂肪酸含量即总脂肪酸在种子中的质量百分含量。
总脂肪酸的测定方法参照Pritam等(Pritam S.Sukhija and D.L.Palmquist(1988)Rapid Method for Determination of Total Fatty Acid Content andComposition of Feedstuffs and Feces J.Agric.Food Chem.，36：1202-1206)的 方法进行：种子经充分研磨后，称10mg，加入1ml硫酸甲醇溶液(2.5ml硫酸/100ml甲醇)及10μl内标液(100μg 17烷酸/ml乙酸乙酯)，100℃，1h，收集上清，每1ml上清加入500μl正己烷和300μl 10％(质量百分含量)NaCl水溶液，最后真空抽干，加30μl乙酸乙酯，取上清液用气相色谱(AGILENT 6890 GC)法进行测定，以Sigma公司的脂肪酸甲酯作为标准对照。17烷酸即正十七烷酸或称十七碳酸。
气相色谱参数如下：色谱柱内径0.25mm，长度30m；载体为乙酸乙酯，粒径为0.25μm；载气为氦；柱温为120℃，进样口温度为120℃，进样量为1μl，载气流速为2ml/min。
各个株系的平均总脂肪酸含量见表3。bZIP-1种子的总脂肪酸含量为29±1.0％，bZIP-4和bZIP-7种子的总脂肪酸含量均为28±1.0％，转空载体植株种子的总脂肪酸含量为26±1.0％，哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)种子的总脂肪酸含量为25±1.5％。结果表明：3个转基因株系种子的总脂肪酸含量均比野生型植株和转空载体植株有所提高；与野生型植株相比，bZIP-1、bZIP-4和bZIP-7的种子总脂肪酸含量分别增加12.4％、9.6％和9.8％。
表3 各个株系的平均总脂肪酸含量
| 株系 | 总脂肪酸含量 |
| 转空载体植株 | 26±1.0％ |
| 哥伦比亚生态型拟南芥 | 25±1.5％ |
| bZIP-1 | 29±1.0％ |
| bZIP-4 | 28±1.0％ |
| bZIP-7 | 28±1.0％ |
2、脂肪酸各组分含量测定
各种脂肪酸含量即该种脂肪酸在种子中的质量百分含量。
各种脂肪酸的测定方法参照Pritam等(Pritam S.Sukhija and D.L.Palmquist(1988)Rapid Method for Determinat ion of Total Fatty Acid Content andComposition of Feedstuffs and Feces J.Agric.Food Chem.，36：1202-1206)的方法进行：种子经充分研磨后，称10mg，加入1ml硫酸甲醇溶液(2.5ml硫酸/100ml甲醇)，及10μl内标液(100μg 17烷酸/ml乙酸乙酯)，100℃，1h，收集上清，每1ml上清加入500μl正己烷和300μl 10％(质量百分含量)NaCl水溶液，最后真空抽干，加30μl乙酸乙酯，取上清液用气相色谱(AGILENT 6890GC)法进行测定，以Sigma公司的各种脂肪酸标准品作为标准对照。
气相色谱参数如下：色谱柱内径0.25mm，长度30m；载体为乙酸乙酯，粒径为 0.25μm；载气为氦；柱温为120℃，进样口温度为120℃，进样量为1μl，载气流速为2ml/min。
结果见表4。
表4 各个株系的脂肪酸各组分的平均含量
| 转空载体植株 | 哥伦比亚生态型拟南芥 | bZIP-1 | bZIP-4 | bZIP-7 | |
| 棕榈酸(16:0) | 2.0±0.03％ | 1.9±0.02％ | 2.6±0.03％ | 2.5±0.02％ | 2.4±0.02％ |
| 硬脂酸(18:0) | 0.3±0.02％ | 0.3±0.02％ | 0.4±0.01％ | 0.4±0.01％ | 0.4±0.01％ |
| 油酸(18:1) | 3.0±0.03％ | 3.1±0.02％ | 3.6±0.01％ | 3.5±0.01％ | 3.8±0.04％ |
| 亚油酸(18:2) | 9.0±0.05％ | 8.9±0.06％ | 10.8±0.02％ | 10.1±0.04％ | 9.8±0.03％ |
| 亚麻酸(18:3) | 6.5±0.04％ | 6.0±0.03％ | 7.3±0.01％ | 7.2±0.02％ | 7.3±0.01％ |
| 花生烯酸(20:1) | 4.3±0.03％ | 4.0±0.02％ | 5.4±0.01％ | 5.4±0.02％ | 5.4±0.02％ |
与转空载体植株和哥伦比亚生态型植株的种子相比，各GmbZIP123转基因株系种子的各脂肪酸含量均显著升高，并呈显著差异。
上述实验证明GmbZIP123是与植物的油脂代谢调控相关的基因，过量表达GmbZIP123提高了种子(籽粒)中脂肪酸的含量。
Claims (8)
1.一种DNA分子，其核苷酸序列是序列表中的序列2。
2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体。
3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是将权利要求1所述DNA分子插入pROKII载体的多克隆位点得到的重组表达载体。
4.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒。
5.含有权利要求1所述DNA分子的重组菌。
6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求1所述DNA分子导入目的植物中，得到脂肪酸含量高于所述目的植物的转基因植物；
所述目的植物为拟南芥；
所述脂肪酸含量为植物种子中的脂肪酸含量。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：权利要求1所述DNA分子通过权利要求2或3所述重组载体导入所述目的植物中。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述脂肪酸为总脂肪酸和/或如下脂肪酸中的至少一种：棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和花生烯酸。
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