CN117070551A - 调控种子油脂含量相关的转录因子GmMYB331及其编码基因与应用 - Google Patents

调控种子油脂含量相关的转录因子GmMYB331及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了调控种子油脂含量相关的转录因子GmMYB331及其编码基因与应用。本发明具体公开了GmMYB331蛋白或调控基因的表达物质或调控GmMYB331蛋白活性或含量的物质在调控植物种子油脂含量中的应用。将GmMYB331蛋白编码基因转入拟南芥中，得到的转基因拟南芥与野生型拟南芥相比，提高了种子中的油脂含量。核因子GmMYB331及其编码基因可以正向调控植物种子中油脂含量，通过在植物中过表达GmMYB331基因提高植物种子中油脂含量。该基因对提高和改良作物油脂成份，特别是对于提高大豆等油料植物籽粒中油脂成份，培育高油脂品种具有重要的理论和现实意义。

Description

调控种子油脂含量相关的转录因子GmMYB331及其编码基因与 应用
技术领域
本发明涉及植物转录因子及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于大豆的与调控种子油脂含量相关的转录因子GmMYB331及其编码基因与应用。
背景技术
人类饮食中71％的油脂来自于植物。在世界上的几种主要产油作物中，大豆总产油量约占30％，居世界植物油产量的第一位，棕榈油及油菜子油分别位居第二及第三(如表1所示)。
表1世界上主要的产油作物
种类 生产量(百万吨) 占总产量百分比 相对顺序
大豆(Soybean) 15.50 29.1 1
棕榈(Palm) 8.52 16.0 2
油菜籽(Rapeseed) 7.03 13.2 3
向日葵(Sunflower) 7.00 13.1 4
棉花籽(Cottonseed) 3.31 6.2 5
椰子(Coconut) 2.71 5.1 6
花生(Peanut) 2.69 5.0 7
橄榄(Olive) 1.63 3.1 8
脂肪酸的合成是植物体中最重要的代谢途径之一，它存在于植物体的任何一个细胞中，是生长发育所必须的。对它的阻断会导致细胞的死亡，因而至今为止还没有发现一个阻断脂肪酸合成的植物突变体。
植物中脂肪酸的合成主要是在质体中进行，而动物及真菌的脂肪酸合成发生于胞质。因此植物需要存在一种不同于动物及真菌的机制——从质体运出脂肪酸到细胞的其它部位。因而在细胞中必定存在脂肪酸生产和运输的控制机制，但是迄今尚不清楚在脂肪酸的合成中质体内外是如何联系的。
植物同其它真核生物在参与脂肪酸合成途径的酶上有很大差异。从乙酰CoA和丙二酰CoA合成16或18个碳原子的脂肪酸至少需要30个不同的酶催化的反应来完成这一过程，而在动物、真菌及一些细菌中，以上反应是由一个存在于胞质中的多酶复合体来完成的。植物中，参加脂肪酸合成的酶分别以可溶的形式独立存在于质体的胞质中。尽管植物中参与脂肪代谢的酶很容易被分离，但是这些酶是否在体内也可形成一个多酶复合体还是未知。
脂肪酸合成途径中最重要的碳源是由ACCase合成的丙二酰CoA，在进入脂肪酸合成途径之前，丙二酰由CoA转移到酰基载体蛋白(ACP)上，从此脂肪酸合成都需要ACP的参与，直到形成16或18个碳原子的脂肪酸，并被用于合成甘油或被运出质体。ACP是一个分子量为9KD的酸性蛋白，它具有一个可以通过硫酯化结合乙酰基的基团。当丙二酰由CoA转移到ACP后，硫酯化的丙二酰由CoA进行一系列的聚合反应，接受乙酰ACP或乙酰CoA的乙酰基团。这一聚合反应是通过释放一个CO2分子来形成一个C－C键，CO2的释放使这一反应变得不可逆，从而使聚合反应不断进行。
大多数植物中，油脂都以三酰甘油(Triacylglycerols，TAG)的形式储藏，它的含量是一个非常重要的农艺性状，TAG的生物合成称之为Kennedy途径，如同真核生物中合成膜甘油酯的途径，脂肪酸去除CoA后被转移到3-磷酸甘油的1和2位，形成中间产物PA。PA去磷酸化产生DAG。在TAG合成的最后一步，第三个脂肪酸分子被转移到空的DAG 3’-OH位置，这一步反应是由二酰甘油乙酰转移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT)催化的，此反应被认为是TAG生物合成中唯一的限速步骤。
人们已对脂类合成途径有了认知，并且已经克隆参与脂类合成的酶基因。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控植物种子油脂含量。
为了解决以上技术问题，本发明的第一个目的是提供了GmMYB331蛋白或调控基因的表达物质或调控所述GmMYB331蛋白活性或含量的物质的应用，所述应用可为下述任一种：
U1)GmMYB331蛋白或调控基因的表达物质或调控所述GmMYB331蛋白活性或含量的物质在调控植物种子油脂含量中的应用；
U2)GmMYB331蛋白或调控基因的表达物质或调控所述GmMYB331蛋白活性或含量的物质在制备调控植物种子油脂含量的产品中的应用；
U3)GmMYB331蛋白或调控基因的表达物质或调控所述GmMYB331蛋白活性或含量的物质在培育植物种子油脂含量改变的植物中的应用；
U4)GmMYB331蛋白或调控基因的表达物质或调控所述GmMYB331蛋白活性或含量的物质在制备培育植物种子油脂含量改变的植物的产品中的应用；
U5)GmMYB331蛋白或调控基因的表达物质或调控所述GmMYB331蛋白活性或含量的物质在植物育种中的应用；
所述基因编码所述GmMYB331蛋白，所述GmMYB331蛋白可为如下任一种的蛋白质：
A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；
A2)将A1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物种子油脂含量相关的蛋白质，例如本领域技术人员可根据如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，通过取代、缺失和/或增加一个以上氨基酸，得到与如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性且具有调控植物种子油脂含量的GmMYB331蛋白突变体；
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
上述所述蛋白质的氨基酸序列SEQ ID No.2由331个氨基酸残基组成。
本发明中，所述植物育种的目的包括培育植物种子含油量高的植物。
上述应用中，所述GmMYB331蛋白可来源于大豆(Glycine max)。
上述应用中，所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述应用中，所述蛋白质标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述应用中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
上述应用中，所述调控基因表达的物质可为提高或增加或上调所述基因表达的物质。所述调控植物种子油脂含量可为提高或增加或上调植物种子油脂含量。
上述应用中，所述调控基因的表达物质或调控所述GmMYB331蛋白活性或含量的物质可为与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。
上述应用中，B1)所述的核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。所述核酸分子具体可为如下B1)或B2)所示的基因：B1)编码链的编码序列是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；B2)编码链的核苷酸是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子。上述应用中，B2)所述的含有核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达上述应用中所述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动蛋白编码基因转录的启动子，还可包括终止蛋白编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。
上述应用中，可用现有的植物表达载体构建含有所述蛋白编码基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。例如Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。上述应用中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。
本发明还提供了一种提高植物种子油脂含量的方法。
本发明所提供的提高植物种子油脂含量的方法，包括增强或提高目的植物中所述GmMYB331蛋白的活性和/或含量，或/和，所述GmMYB331蛋白的编码基因的表达量，来提高植物种子油脂含量。
上述方法中，所述增强或提高目的植物中所述GmMYB331蛋白的活性和/或含量，或/和，所述GmMYB331蛋白的编码基因的表达量，可通过向受体种子植物中导入GmMYB331基因，得到种子含油量高于所述受体植物的目的植物；所述GmMYB331基因编码上述GmMYB331蛋白。
上述方法中，所述GmMYB331基因可为如下任一所示的基因：
B1)编码链的编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；
B2)编码链的核苷酸是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子。
上述应用及方法中，所述GmMYB331蛋白的编码基因可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好的表达效果：
1)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
2)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
3)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。
在本发明中，所述GmMYB331蛋白的编码基因可通过重组表达载体导入所述目的植物中。所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子可为35S启动子。更为具体的，所述重组表达载体为将所述GmMYB331基因插入到入门载体TOPO，入门载体TOPO和目的载体pGWB411都有同源重组位点attL1和attL2，连有目的基因的载体TOPO与载体pGWB411在重组酶的作用下进行同源重组，构建植物表达载体pGWB411-GmMYB331。
为了便于对转基因细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色反应的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。上述方法得到的植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明还提供用于检测或辅助检测过表达GmMYB331基因转基因植物的PCR试剂，所述PCR试剂包括上述引物对。
所述PCR试剂还包括进行PCR扩增所需的非引物试剂。
所述非引物试剂可为PCR反应缓冲液，和/或，DNA聚合酶或含有DNA聚合酶的溶液。
上述应用或方法中，所述组织为种子；所述植物为种子植物门单子叶植物或双子叶植物。
上述应用中，所述种子植物门植物可为下述任一种植物：
E1)双子叶植物纲植物，
E2)罂粟目植物，
E3)十字花科植物，
E4)拟南芥属植物，
E5)拟南芥。
具体可为大豆、百脉根、苜蓿、水黄皮、油菜、向日葵、拟南芥或玉米；在本发明的实施例中采用的是双子叶植物拟南芥。
本发明通过采用大豆中MYB转录因子家族成员GmMYB331来调控种子油脂合成，从而提高种子的油脂含量，并获得可稳定的效果。本发明的实验证明，本发明提供了一种与植物组织油脂含量相关的核因子GmMYB331及其编码基因GmMYB331，将该编码基因GmMYB331转入拟南芥中，得到转基因拟南芥。该转基因拟南芥与野生型拟南芥相比，提高了种子中的油脂含量。说明核因子GmMYB331及其编码基因可以调控植物种子中油脂含量，过表达后提高植物种子的油脂含量。该基因可提高和改良作物油脂成份，特别是对于提高大豆等油料植物籽粒中油脂成份，培育高油脂品种具有重要的理论和现实意义。
附图说明
图1为克隆载体/GW/TOPO示意图(A)和植物表达载体pGWB411–GmMYB331示意图(B)。
图2为GmMYB331转基因纯系的相对表达水平分析结果。
图3为GmMYB331转基因株系和对照种子总脂肪酸含量比较。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由三博生物公司合成。
大豆材料：大豆黑农44(HN44)(满为群等，大豆新品种黑农44的选育及不同种植方式对其产量和品种的影响，黑龙江农业科学2004年5期，1-5)。
根癌农杆菌GV3101，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载在如下文献中：Lee CW等，Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction bymodulating pathogen defense in Arabidopsis thaliana,Plant Cell,2009,21(9),2948-62。
实施例1、大豆与油脂代谢调控相关的转录因子GmMYB331编码基因的筛选及其cDNA克隆
以种子油脂含量为23％的大豆品种黑农44(HN44)和含量为12％的野生大豆ZYD7为材料，进行了种子发育过程中的转录组分析，构建转录因子共调控网络，检测到Williams82参考基因组新版本中编号为Glyma.20G184500的基因与种子油脂含量相关，鉴于数据库中没有命名该基因，暂时命名为GmMYB331。
1.大豆GmMYB331基因的编码序列的获得
提取黑农44(HN44)幼苗的总RNA，将RNA用逆转录酶反转录合成cDNA。
根据在PlantGDB的大豆基因组序列中GmMYB331(Glyma.20G184500)全长cDNA序列的信息，设计引物，引物序列如下：
GmMYB331-F:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGTCTGACCCTTCTACCCTCTTAC，
GmMYB331-R:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTTATCTTTGGCCATGGCGTTCAG
以HN44的cDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增,得到约1.0Kb的PCR产物(即GmMYB331基因的编码区)。经过测序，该PCR产物为996bp，GmMYB331基因的编码序列如SEQID NO.1所示的核苷酸序列，该基因编码的蛋白命名为GmMYB331，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该蛋白包含331个氨基酸。
实施例2、转GmMYB331拟南芥的获得
1.植物表达载体构建
基因克隆使用invitrogen公司提供的Gateway系统，载体3′-T突出端，用于直接连接Taq酶扩增的PCR产物。HN44中GmMYB331基因的CDS序列通过Gateway系统将目的基因GmMYB331从入门载体/GW/TOPO转移到表达载体pGWB411上，得到含有GmMYB331基因的表达载体pGWB411-GmMYB331。操作步骤如下：
(1)提取大豆品种HN44的总RNA，反转录得到cDNA，以该cDNA为模板，利用引物GmMYB331-F:5’
-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGTCTGACCCTTCTACCCTCTTAC-3’)，和
GmMYB331-R:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTTATCTTTGGCCATGGCGTTCAG-3’)进行PCR扩增，得到扩增产物(序列是SEQ ID NO.1，含有GmMYB331的编码序列(CDS))，并进行切胶回收。
(2)将步骤(1)得到的切胶回收产物进行加A处理，具体步骤为：将20μL回收产物和20μL PCR SuperMix(Code：AS111-11，TRANSGEN BIOTECH)进行混合，进行PCR反应。反应程序：95℃5min，72℃20min，4℃保存。随后对PCR产物用普通DNA产物纯化试剂盒(Code：DP204-02，TIANGEN)纯化回收，得到回收产物GmMYB331。
(3)将步骤(2)得到的回收产物GmMYB331运用TA克隆的原理克隆与载体/GW/TOPO(/>/GW//>TA Cloning Kit,Catalog number:K2500-20,InvitogenCorporation,Carlsbad,CA,USA，图1中A)连接，得到含有SEQ ID NO.1所示的DNA片段的序列正确的重组载体命名为阳性入门克隆质粒TOPO-GmMYB331。
由于/GW/TOPO载体和过表达载体pGWB411上均带有重组位点attL1和attL2，因此连接目的基因的中间载体可以与过表达载体pGWB411在重组酶的作用下进行LR重组反应，最终目的基因GmMYB331成功构建到过表达载体pGWB411上，得到重组载体。
(4)将步骤(3)得到的阳性入门克隆质粒TOPO-GmMYB331，与目的载体pGWB411(GenBank:AB294435.1，24-AUG-2007)进行LR反应，得到含有SEQ ID NO.1所示的DNA片段的序列正确的重组载体命名pGWB411-GmMYB331，重组载体的部分图谱见图1中B。
LR反应体系：1μl阳性入门克隆质粒TOPO-GmMYB331，1μl pGWB411，1μl LRbuffer，1μl LR Enzyme mix，1μl TE buffer pH8.0，25℃6h，加0.5μl蛋白酶K后，37℃，10min，得到重组载体pGWB411-GmMYB331。
pGWB411-GmMYB331含有序列表中SEQ ID NO.1所示的GmMYB331基因CDS序列以及35S启动子，能表达SEQ ID NO.2所示的GmMYB331蛋白质与GFP的融合蛋白质，该蛋白质的表达由35S启动子驱动。
2.重组农杆菌的获得
将实施例1得到含有GmMYB331的重组载体pGWB411-GmMYB331用电击法导入根癌农杆菌GV3101,得到含有pGWB411-GmMYB331的重组农杆菌，将该重组农杆菌命名为GV3101/GmMYB331。
二、转GmMYB331拟南芥的获得及鉴定
1.转GmMYB331拟南芥的获得
将上述获得的重组农杆菌GV3101/GmMYB331培养至对数期，然后用抽真空法将其转化哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0，以下又称野生型拟南芥)中,拟南芥种子购自Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)。经培育后收获T1代种子，将种子播于含卡那霉素(50mg/L)的MS筛选培养基上，得到T1转基因拟南芥植株。
2.转GmMYB331拟南芥在RNA水平上的鉴定
收集T1转基因拟南芥植株的新鲜叶片，提取RNA，反转录得到cDNA作为模板，引物为GmMYB331QPCR-1F:5’-CCTCACCCTCACCACTTCAAAC-3’和GmMYB331QPCR-1R:5’-CGATCTCTCTGAGCCTACCGG-3’，进行Real Time-PCR鉴定，以野生型拟南芥(Col-0)为对照。拟南芥AtActin2基因为内标，所用引物为Primer-TF：5’-ATGCCCAGAAGTCTTGTTCC-3’，和Primer-TR：5’-TGCTCATACGGTCAGCGATA-3’。
取18棵T1代阳性植株，待长至4-6叶时移到蛭石上生长，收获T1代单株，各单株种子分别播种，用相同的MS筛选培养基继续筛选以观察T2代的分离情况，如此重复数代直至获得遗传稳定的转基因纯合株系，随机选取6个转GmMYB331拟南芥纯系。提取苗期RNA，采用上述Real Time-PCR方法，鉴定纯系植株中GmMYB331的表达。转基因株系OE-11、OE-3、OE-7、OE-6、OE-5和OE-8中均能检测到GmMYB331的表达，其表达量分别约为0.051，0.048，0.020，0.017，0.015和0.006。而野生型拟南芥(Col-0)中未能检测出GmMYB331的表达(图2)。上述结果进一步证明，GmMYB331基因转入拟南芥中，且得到表达。
三、转GmMYB331基因拟南芥种子中的总油脂含量分析
测定野生型拟南芥、GmMYB331过表达6个纯系种子中的总油脂含量。
种子总油脂含量测定:将干燥的种子研磨成粉，称取100mg到离心管中，平行称取四份。加入500μl的正己烷，充分混匀，37℃过夜。慢速离心3分钟，将正己烷吸入称量过新管中。剩下的粉末继续加正己烷重复浸泡、然后离心，收集正己烷到同一的离心管中。将离心管放入真空泵中，抽真空，使正己烷完全挥发。然后再次称取离心管的重量。离心管前后重量的变化即是提取的油脂重量；总油脂量(％)的计算公式为总油脂量(％)＝(提取的油脂重量/种子总重量×100％)。
统计方法如下：每个株系取30株种子，重复三次生物学实验，结果取平均值±标准差。采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05表示与野生型拟南芥相比具有显著性差异。
结果如图3所示，野生型拟南芥种子总油脂量约为40.0％(即为种子总重量的百分比)；转GmMYB331拟南芥纯系OE-11、OE-3、OE-7、OE-6、OE-5和OE-8种子总油脂量分别约为44.5％、48.1％、45.5％、43.7％、43.0％和43.5％(图3)。结果表明，6个GmMYB331转基因株系种子中的总油脂含量均极显著或显著高于对照。
上述实验表明，大豆MYB类转录因子GmMYB331对种子中总油脂的合成呈正调控作用，其编码基因GmMYB331的过量表达，可提高转基因植株种子中总油脂的含量。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> 调控种子油脂含量相关的转录因子GmMYB331及其编码基因与应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 996
<212> DNA
<213> 大豆（Glycine max）
<400> 1
atgtctgacc cttctaccct cttaccctcc tcccaccacc accacaacca ccatgtgcca 60
ctcatccaag gcggcgccac cgcaccctcc tcctcctcca ccaccctagc ccgagaatac 120
cgcaagggca actggaccat ccaagagacc ctcattctca tcactgcaaa aaagctcgac 180
gacgagcgca ggctcaaaac ccctgctgca tgtagcacct ccaccaccac caccagaacc 240
agcggcgagc tccggtggaa atgggtggag aactattgct ggagccatgg ctgcttgcga 300
agccagaacc aatgcaacga caaatgggac aacctcctcc gcgattacaa aaaggttcgc 360
gactacgagt ccaaatcaaa cgacaacgac aacaacaaca acaaacactt cccttcttat 420
tggaccctca acaaacaaca acgtaaggaa cagaacctcc cctccaacat ggtcttcgaa 480
gtctaccaaa ccatcgccga tgtcctccaa cgaaaacaaa cacaatccca aagacaacat 540
caacaacctc tggctattcc attagttact tcctcaccct caccacttca aacacttcca 600
ccacctcctc taccaccacc gccgcctccg ccacctcctc ctccgccagt tagctccacc 660
actccggtag gctcagagag atcggaatca tcaggaactg agcacagtga ggatgatgat 720
gatgggtcgg aatcaaaacg taggaaagtt aagaaccttg gttcaagaat aatgcaaagt 780
gcatcggtgt tggcacgagc tcttaggagt tgtgaggaga agaaggagaa acggcaccgt 840
gaaatgattg agctggagca aaggaggatt cagatggagg aagctcggaa tgaggttcac 900
cggcaaggca tcgcgaccct tgtcgccgcc gtcaccaacc tttccggtgc cattgagtca 960
ctcattaata attctgaacg ccatggccaa agataa 996
<210> 2
<211> 331
<212> PRT
<213> 大豆（Glycine max）
<400> 2
Met Ser Asp Pro Ser Thr Leu Leu Pro Ser Ser His His His His Asn
1 5 10 15
His His Val Pro Leu Ile Gln Gly Gly Ala Thr Ala Pro Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Thr Thr Leu Ala Arg Glu Tyr Arg Lys Gly Asn Trp Thr Ile Gln
35 40 45
Glu Thr Leu Ile Leu Ile Thr Ala Lys Lys Leu Asp Asp Glu Arg Arg
50 55 60
Leu Lys Thr Pro Ala Ala Cys Ser Thr Ser Thr Thr Thr Thr Arg Thr
65 70 75 80
Ser Gly Glu Leu Arg Trp Lys Trp Val Glu Asn Tyr Cys Trp Ser His
85 90 95
Gly Cys Leu Arg Ser Gln Asn Gln Cys Asn Asp Lys Trp Asp Asn Leu
100 105 110
Leu Arg Asp Tyr Lys Lys Val Arg Asp Tyr Glu Ser Lys Ser Asn Asp
115 120 125
Asn Asp Asn Asn Asn Asn Lys His Phe Pro Ser Tyr Trp Thr Leu Asn
130 135 140
Lys Gln Gln Arg Lys Glu Gln Asn Leu Pro Ser Asn Met Val Phe Glu
145 150 155 160
Val Tyr Gln Thr Ile Ala Asp Val Leu Gln Arg Lys Gln Thr Gln Ser
165 170 175
Gln Arg Gln His Gln Gln Pro Leu Ala Ile Pro Leu Val Thr Ser Ser
180 185 190
Pro Ser Pro Leu Gln Thr Leu Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro
195 200 205
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Val Ser Ser Thr Thr Pro Val Gly
210 215 220
Ser Glu Arg Ser Glu Ser Ser Gly Thr Glu His Ser Glu Asp Asp Asp
225 230 235 240
Asp Gly Ser Glu Ser Lys Arg Arg Lys Val Lys Asn Leu Gly Ser Arg
245 250 255
Ile Met Gln Ser Ala Ser Val Leu Ala Arg Ala Leu Arg Ser Cys Glu
260 265 270
Glu Lys Lys Glu Lys Arg His Arg Glu Met Ile Glu Leu Glu Gln Arg
275 280 285
Arg Ile Gln Met Glu Glu Ala Arg Asn Glu Val His Arg Gln Gly Ile
290 295 300
Ala Thr Leu Val Ala Ala Val Thr Asn Leu Ser Gly Ala Ile Glu Ser
305 310 315 320
Leu Ile Asn Asn Ser Glu Arg His Gly Gln Arg
325 330

Claims (10)

1.应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：
U1)GmMYB331蛋白或调控基因的表达物质或调控所述GmMYB331蛋白活性或含量的物质在调控植物种子油脂含量中的应用；
U2)GmMYB331蛋白或调控基因的表达物质或调控所述GmMYB331蛋白活性或含量的物质在制备调控植物种子油脂含量的产品中的应用；
U3)GmMYB331蛋白或调控基因的表达物质或调控所述GmMYB331蛋白活性或含量的物质在培育植物种子油脂含量改变的植物中的应用；
U4)GmMYB331蛋白或调控基因的表达物质或调控所述GmMYB331蛋白活性或含量的物质在制备培育植物种子油脂含量改变的植物的产品中的应用；
U5)GmMYB331蛋白或调控基因的表达物质或调控所述GmMYB331蛋白活性或含量的物质在植物育种中的应用；
所述基因编码所述GmMYB331蛋白，所述GmMYB331蛋白是如下任一种的蛋白质：
A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；
A2)将A1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物种子油脂含量功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述GmMYB331蛋白来源于大豆(Glycinemax)。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述调控基因的表达物质或调控所述GmMYB331蛋白活性或含量的物质为与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为如下B1)或B2)所示的基因：
B1)编码链的编码序列是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；
B2)编码链的核苷酸是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子。
5.一种提高植物种子油脂含量的方法，其特征在于：包括增强或提高目的植物中权利要求1或2中所述GmMYB331蛋白的活性和/或含量，或/和，权利要求1或2中所述GmMYB331蛋白的编码基因的表达量，来提高植物种子油脂含量。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述增强或提高目的植物中权利要求1或2中所述GmMYB331蛋白的活性和/或含量，或/和，权利要求1或2中所述GmMYB331蛋白的编码基因的表达量包括向受体种子植物中导入GmMYB331基因，得到种子含油量高于所述受体植物的目的植物；所述GmMYB331基因编码权利要求1或2中所述GmMYB331蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述GmMYB331基因为如下B1)或B2)所示的基因：
B1)编码链的编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；
B2)编码链的核苷酸是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子。
8.根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于：所述植物为种子植物门的双子叶植物或单子叶植物。
9.权利要求1或2所述应用中所述的GmMYB331蛋白。
10.权利要求3中所述的生物材料。
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