WO2011074745A1 - 유전자 재조합에 의한 설사병 백신활성 유전자를 발현하는 형질전환 벼의 생산방법 - Google Patents

유전자 재조합에 의한 설사병 백신활성 유전자를 발현하는 형질전환 벼의 생산방법 Download PDF

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rice
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vaccine
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소호섭
한영희
이지영
임재욱
박경열
김영호
홍순성
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경기도
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    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a transgenic rice expressing a diarrheal vaccine active gene by genetic recombination, and more specifically, to a gene derived from cholera and E. coli, the main causative agents of diarrheal disease,
  • the present invention relates to a method for producing a transformed rice produced by insertion into a fusion protein, a transformed rice obtained by the method, a fusion protein useful as a vaccine for diarrheal disease obtained from the transformed rice, and a method for obtaining the same.
  • a substance used for vaccination is called a vaccine.
  • oral plant vaccines through transgenic crops have been recognized for their potential, and have established itself as a new direction for vaccine development.
  • Oral plant vaccines combine the safety of recombinant vaccines with the ease and efficiency of inoculating oral vaccines. Immunization is achieved by oral administration of antigen genes using plant expression vectors to transform foods into plants. Will induce a reaction.
  • Vaccines can be classified into various forms depending on the method of preparation or inoculation.Recombinant vaccines produced in E. coli, yeast, and plants by genetically engineering only the site of the antigen acting as a pathogen are considered to be the most advanced vaccines. Jang Yong Suk 1999).
  • the main cause of the development of diarrhea is the B subunit which is capable of inducing an immune response without virulence from cholera vibrio cholerae (CTB) and enterotoxigenic E. coli (ETEC).
  • CTB cholera vibrio cholerae
  • ETEC enterotoxigenic E. coli
  • Transformed rice capable of expressing diarrheal vaccine-activated fusion protein by inserting purified cholera toxin (CTB) and E. coli heat-changing enterotoxin B subunit (LTB) into the pMJ103 vector that overexpresses The invention was carried out to produce.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a transgenic rice expressing a diarrheal vaccine active gene, which is produced by transforming a gene capable of inducing an immune response from cholera bacteria and Escherichia coli, which are the main causative bacteria of diarrheal diseases, to a rice by genetic recombination. It is.
  • Another object of the present invention is to provide a fusion protein having diarrheal vaccine vaccine activity extracted from the above-mentioned transgenic rice.
  • Still another object of the present invention is to provide a diarrheal vaccine composition comprising the above-mentioned fusion protein as an active ingredient.
  • the present invention is a.
  • step 4) screening the viable callus from step 3) and culturing the second, and then selecting the second culture callus;
  • the method of producing a transgenic rice expressing the diarrheal vaccine active gene characterized in that it comprises the step of purifying the rooting plant obtained in step 5) and harvesting the rice transformant in the soil.
  • CTB (Kang et al. 2004a) and LTB (Kang et al. 2004b) genes which are non-toxic B subunits of cholera bacteria and Escherichia coli, which cause diarrheal diseases, were distributed at Chonbuk National University.
  • PMY vector with CaMV 35S promoter, Nos terminator and npt II gene and pMJ103 vector with Glb promoter, pin II terminator and bar gene were used.
  • the vector usable in the present invention is preferably pMJ103.
  • Figure 2 shows the structure of a binary vector pMJ103 for producing a transformed rice according to the present invention comprising a CTB gene represented by SEQ ID NO: 1 and LTB gene represented by SEQ ID NO: 2.
  • the PCR assay confirmed that the above-described CTB gene and LTB gene were inserted into the binary vector pMJ103.
  • Agrobacterium tumefaciens was used to prepare transformants of plants.
  • Agrobacterium tumefaciens which is mainly used for producing plant transformants, has a Ti-inducing plasmid.
  • the Ti plasmid causes Agrobacterium to infect plants, creating a kind of tumour called the crown gall.
  • T-DNA which is a site that is well interrupted by homologous recombination to the genomic DNA of plants. Therefore, by inserting the gene to be introduced into the plant at this site, and inserting the Ti plasmid into the Agro bacteria, infecting the Agro bacteria in the callus of the plant to create a transgenic plant.
  • 'in-flight culture means culturing a plant in a culture vessel equipped with sterile culture conditions.
  • the germination rate of the transformed rice showed a germination rate of at least 62.0%, compared to 87.5% of the control, but the germination rate of more than 80% in most cases can be secured more than a certain percentage of the rice introduced transgenic.
  • the bioassay by immunostrip (Immuno Strip) treatment and isolation and cultivation bastard treatment in the quarantine greenhouse confirmed that the transgenic rice expressing the diarrheal vaccine vaccine active gene according to the present invention was fixed as a transformant.
  • the diarrhea vaccine active fusion protein can be produced from the transformed rice expressing the diarrheal vaccine active gene produced by the method of the present invention, and the transformed rice prepared according to the present invention can be used as a vaccine by itself or by extracting the fusion protein. Can be used.
  • the present invention can be used as an oral diarrheal prevention vaccine composition containing the transformed rice as an active ingredient.
  • Diarrheal preventive vaccines or vaccine compositions comprising the transformed rice or fusion proteins prepared by the method of the present invention are not limited to the administration target, but are preferably administered to livestock, more preferably pigs, cattle, piglets, or calves. Can be.
  • the vaccine composition may be used in the form of a transformed rice according to the invention as it is or after drying, or may be suitably used in accordance with conventional methods with other foods or food ingredients.
  • the mixed amount of the transformed rice as an active ingredient can be arbitrarily determined appropriately according to the purpose of use.
  • a diarrheal vaccine active protein can be obtained by a safe method.
  • the use of antibiotics in the livestock industry can be remarkably reduced, resulting in an economic effect of reducing farming livestock costs. have.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the gene CTB encoding the cholera toxin B subunit represented by SEQ ID NO: 1 and the base sequence of the E. coli Heat-Labile enterotoxin B subunit gene LTB represented by SEQ ID NO: 2.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the structure of the binary vector pMJ103 for producing a rice transformant according to the present invention.
  • Figure 3 is a PCR electrophoresis picture confirming the transfer of the LTB gene and CTB gene after transferring the pMJ103 vector prepared according to the present invention to Agrobacterium.
  • Figure 4 shows callus induction (1) and proliferation (2), re-differentiation of transformed callus (3) and transformant passage (4) by rice seeds using Agrobacterium transformed with the pMJ103 vector of the present invention The picture shown.
  • Figure 5 is an electrophoresis picture showing the PCR reaction results for identifying the LTB gene and CTB gene introduced into the rice.
  • M is a 1 kb marker
  • C is a pMJ103 binary vector
  • W is untransformed rice
  • T01 to T25 are transformed rice.
  • Figure 6 is an electrophoresis picture showing the Southern blot results for confirming the number of LTB gene and CTB gene introduced into the rice genome introduced into the potato genome.
  • Figure 7 is an electrophoresis picture showing the RT-PCR results of the mRNA of the gene in order to confirm the transcription of the LTB gene and CTB gene introduced into the rice.
  • FIG. 8 is an electrophoretic photograph showing the results of a Vasta strip assay for transformed rice T1 seeds.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of vaccine protein content analysis by G M1 -ganglioside ELISA on transformed rice T1.
  • 10 is a water soluble protein and LTB vaccine protein content composition table of transgenic rice expressing diarrheal vaccine active gene.
  • 11 is a table of the components of the medium compositions for producing a transformed rice expressing a diarrheal vaccine active gene according to the present invention.
  • CTB and LTB genes were recombined with Agrobacterium together with helper plasmids such as pMJ103 and HB101 vectors by tri parental mating.
  • Colonies of the strain inserted into the pMJ103 vector were inoculated in 3 ml of liquid YEP medium to which 100 mg L -1 of streptomycin was added, and then grown by shaking culture at 250 rpm for 2 days at 28 ° C. DNA was extracted.
  • Figure 3 is a PCR electrophoresis picture confirming the transfer of the LTB gene and CTB gene after transferring the pMJ103 vector to Agrobacterium. In Figure 3 can be confirmed the transfer of the LTB gene and CTB gene in Agrobacterium.
  • Agrobacterium was inoculated in AB-SpT medium for cancer culture at 28 ° C. for 4-5 days.
  • the Agrobacterium strains were poured into AAM medium and then transferred to 50 ml Falcon tubes and diluted to 1.5-2.0 O.D. values of 660 nm.
  • Callus was appropriately placed in a tube and inoculated for 20-30 minutes. After inoculation, the solution was well decanted and dried slightly on paper, then dried callus was placed on 1/2 2N6-AS medium and covered with sterile 3M filter paper on the callus. The callus was co-cultured for 1 day at 26.5 ° C. and 4 to 8 days at 23.5 ° C. with a filter paper covered.
  • Callus cultured for at least 5 days was placed in sterile test tubes and washed with sterile water and washed 10 times or more with 50 ml of sterile water added with 250 ug of Sepotaxime. It was sprayed onto filter paper and dried, and then transferred to 2N6-CP medium and incubated for 3 weeks at 27 ° C dark conditions. Surviving callus was secondarily selected by incubating for 2 weeks under the same conditions in 2N6-CP medium.
  • the second selected callus was incubated at 25 ° C. after being placed in MSR-CP medium, and the regenerated plants were transferred to MS0 medium to be rooted.
  • the rooting plants obtained in 2-4 were immersed in 1,000-fold hyponex solution for 7 to 10 days, and the plants immersed in 14 days were transplanted into 32-hole trays in 60 ⁇ 40 cm bottomed tofu boxes and managed in a greenhouse. Fertilization was carried out from 14 days after transplanting.
  • Plant DNA was extracted using K3030 (Bionia) extraction kit.
  • PCR was performed by adding 20 ul of pDNA 20 pM, 4 ul of sterile water, 4 ul of sterile water, 4 ul of antisense primer, and 4 ul of antisense primer to Toptaq PCR premix (core biotech).
  • PCR reaction was carried out for 10 minutes at 96 ° C., denaturation at 30 ° C. for 30 seconds, primer annealing at 54 ° C. for 30 seconds, primer extension at 72 ° C. for 2 minutes, and at 72 ° C. The reaction was completed after 15 minutes of reaction.
  • the obtained PCR reaction was confirmed by electrophoresis with 1% agarose and the results are shown in FIG. 5.
  • LTB gene and CTB gene derived from the transformation vector pMJ103 was confirmed in the transformed rice T01 to T25.
  • a total of 18 ul was prepared by mixing 10 ug of rice genomic DNA to be analyzed, a reaction buffer solution and distilled water, and left at 4 ° C. for 2 hours. Restriction enzyme (ug / 20unit) was added, mixed carefully and stored at 37 ° C. for 12 hours, and 1 ul of the reaction solution was confirmed by 1% electrophoresis.
  • genomic DNA samples digested with restriction enzymes were loaded on 0.8% (0.64 g / 80 ml) agarose gel. It was loaded for 12 hours at a voltage of 50 mA (30 V).
  • TAE buffer solution 1 ⁇ TAE buffer solution was stored at 4 ° C., and the fiber pad, filter paper, gel, and membrane were immersed in the buffer solution for 15 minutes to 1 hour.
  • the electrophoresis-treated gel was carefully transferred to a glass plate, the lower left corner of the gel was cut and set in a direction, followed by stirring for 45 minutes in the modified solution.
  • the stirred gel was transferred to a plastic pail, washed for 5 minutes in sterile water, stirred for 30 minutes in a neutralization solution, and then replaced for 15 minutes.
  • the membrane was placed on the UV cross linker (XL-1000) with the DNA attachment side up, and then the DNA was fixed, and the membrane was used for hybridization.
  • the inserted gene was PCR with specific primers, separated from the purification kit, and subjected to electrophoresis and quantification.
  • probe DNA 2 ul of probe DNA, 43 u of TE (8.0) buffer was boiled at 100 ° C. for 5 minutes and allowed to stand on ice for 5 minutes, and then the probe DNA was mixed with the Primer labeling kit reaction solution (Amersham RPN 1633), followed by P 32 radiation. 5 ul of element was added to the reaction solution mixture, mixed, and then collected again. The solution was reacted at 37 ° C. for 30 minutes and then stored on ice.
  • Primer labeling kit reaction solution Amersham RPN 1633
  • a spum column (illustra ProbeQuant G-50 MicroColumn) was prepared, a column was inserted into a 1.5 ml microtube, and isotopically labeled DNA was added. After centrifugation at 3,000 rpm for 30 seconds, the column was removed, and the isotopically labeled DNA solution was left at 100 ° C. for 5 minutes and stored for 5 minutes on ice, followed by hybridization.
  • Labeled single-stranded probe DNA was added to 50 ml of the hybridization solution, and the prehybridized membrane was added to the hybridization solution to which the probe was added, and reacted in a shaking incubator at 40 ° C. at 40 rpm for 16 hours or more.
  • the membrane was placed on a filter paper (3MM) and then pressed to dry. After opening the X-ray film cassette, a double sterile vinyl was placed, the membrane was placed between the vinyls, and then fixed.
  • the X-ray film was mounted on a cassette and then developed after 5 days at ⁇ 70 ° C., and the results are shown in FIG. 6.
  • the solution was loaded on the column, centrifuged at 13,000 rpm for 30 seconds, and then the solution was flowed. After adding 700 ul of washing buffer A, the solution was discarded after centrifuged at 13,000 rpm for 30 seconds. To this was put 700 ul of washing buffer B and centrifuged at 13,000 rpm for 30 seconds to discard the solution.
  • Primers were artificially synthesized after designing a 292bp fragment of the LTB gene.
  • Extracted plant total RNA 20 pM 4 ul, sterile water 4 ul, sense primer 4 ul, anti-sense primer 4 ul was added to Toptaq RT-PCR premix (core biotech) and stirred to perform RT-PCR.
  • RT-PCR reaction was reverse transcription for 1 hour at 50 ° C, followed by denaturation pretreatment at 94 ° C for 5 minutes, denaturation at 94 ° C for 30 seconds, primer conjugation at 55 ° C for 30 seconds, and primer extension at 72 ° C for 1 minute. After the reaction was performed 30 times, the reaction was completed after additional reaction at 72 ° C. for 7 minutes.
  • the leaves or seeds of the transformed rice were put into SEB4 sampling buffer (Kisan Biotech) and ground and stored at room temperature for 30 seconds.
  • the upper part of the strip kit was grasped and immersed vertically in the microtube to confirm the result after 3 to 5 minutes.
  • 0.5 ml of Sportak emulsion was prepared in 1 L of water, and the rice seeds were soaked for 24 hours, and then washed. It was immersed in 100 ml of distilled water at 25 ° C for 2-3 days and water was exchanged once a day. Rice seeds were placed on a Petri dish coated with manure paper and germinated by humidifying at 30 to 33 ° C. for 2 to 3 days. After sprouting, it was pulled out and filled with clay pot about 12cm, and it was settled.
  • Basta herbicide 0.3% (3mL / L) was sprayed twice to examine the mortality between 3 and 10 days.
  • GDNA (2ug / 20ul) of the transformed plant was digested with specific restriction enzyme (HaeIII), and the cut DNA fragment was ligation using an adapter.
  • the sequencing results were analyzed to identify the region of insertion sequences.
  • IdSEB buffer 1.6 ml 6.25 ⁇ PVP40 + 8.6 ml carbonate coating buffer (KIS)
  • the solution was left in the refrigerator at 4 ° C. for 16 hours and then washed thoroughly three times with PBST buffer.

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Abstract

본 발명은 설사병 백신활성 유전자를 발현하는 형질전환 벼 및 그의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 설사병의 주된 원인세균인 콜레라균과 대장균으로 부터 유래된 유전자를 유전자 재조합 방법에 의해 벼에 삽입하여서 제조되는 형질전환 벼의 생산 방법, 상기 방법으로 얻어지는 형질전환 벼, 상기 형질전환 벼로 부터 얻어지는 설사병의 백신으로 유용한 융합단백질 및 그의 수득방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 설사병 백신활성 유전자를 발현하는 형질전환 벼를 생산하여 이를 식물성 사료로써 가축에게 제공함으로써 축산산업에서 항생물질의 사용을 현저하게 감소시켜 농가의 축산 비용을 줄이는 경제적인 효과를 얻을 수 있다. 이러한 항생물질 사용량의 감소는 경제적인 효과 이외에 소비자 건강에도 기여할 수 있다.

Description

유전자 재조합에 의한 설사병 백신활성 유전자를 발현하는 형질전환 벼의 생산방법
본 발명은 유전자 재조합에 의한 설사병 백신활성 유전자를 발현하는 형질전환 벼의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 설사병의 주된 원인세균인 콜레라균과 대장균으로 부터 유래된 유전자를 유전자 재조합 방법에 의해 벼에 삽입하여서 제조되는 형질전환 벼의 생산 방법, 상기 방법으로 얻어지는 형질전환 벼, 상기 형질전환 벼로 부터 얻어지는 설사병의 백신으로 유용한 융합단백질 및 그의 수득방법에 관한 것이다.
예방접종(Vaccination)에 사용되는 물질을 백신이라 하며, 최근에는 열에 안정하고 경구 투여가 가능할 뿐만 아니라 보다 광범위하게 보급될 수 있는 백신 개발 연구가 활발히 진행되고 있다.
현재의 백신 개발 시스템이 가지고 있는 몇 가지 문제점은 고가의 생산설비, 수송과 저장 시에 요하는 냉장설비의 경제적 부담 및 백신 투여의 어려움, 주사를 맞는 것에 대한 사람들의 보편적인 거부감 등이 있다. 따라서, 상기와 같은 문제점을 해결하고, 예방 접종의 혜택을 거의 누리지 못하고 있는 저개발국의 어린이를 위해서라도 대체백신의 개발이 요구되고 있는 것이 세계적인 추세이다.
이러한 대체백신 개발연구 중에서 형질전환 작물을 통한 경구용 식물백신이 그 가능성을 인정받아 백신개발의 새로운 방향으로 자리 매김을 하고 있다. 경구용 식물백신은 재조합 백신의 안전성과 경구백신의 접종에 있어서의 수월성과 효율성을 접목시킨 방법으로서 항원유전자를 식물체 발현벡터를 이용, 식물체에 형질전환시켜 식품을 섭취하듯이 경구투여를 시행함으로써 면역반응을 유도하게 된다.
백신은 제조방법 혹은 접종방법에 따라 여러 가지 형태로 구분할 수 있는데, 병원체에서 항원으로 작용하는 부위만을 유전자 조작하여 대장균이나 효모, 식물에서 생산하는 재조합 백신이 가장 진보된 형태의 백신으로 간주되고 있다(장용석 1999).
식물백신에 관한 연구에 의해 담배에서 B형 간염 바이러스 백신 (Mason 등 1992, Thanavala 등 1995), 감자와 담배에서 세균성 설사병 백신 (Haq 등 1995), 바이러스성 설사병 백신(Mason 등 1998) 등을 생산하였다.
본 발명자들은 설사의 발병에 주된 원인세균은 콜레라균인 Vibrio cholerae (CTB)와 장내독소를 가진 대장균(ETEC, enterotoxigenic E. coli )으로부터 독성이 없이 면역반응의 유도가 가능한 B 서브유니트(subunit)인 정제된 콜레라독소(CTB)와 대장균의 열 가변성 장내독소 B 서브유니트(LTB)를 과발현(over expression)하는 pMJ103 벡터에 삽입시켜 벼를 형질전환하여 설사병 백신활성 융합단백질을 발현할 수 있는 형질전환 벼를 생산하기 위해 본 발명을 수행하였다.
본 발명의 목적은 설사병의 주된 원인세균인 콜레라균과 대장균으로부터 면역반응의 유도가 가능한 유전자를 유전자 재조합 방법으로 벼에 형질전환시켜서 제조되는 설사병 백신활성 유전자를 발현하는 형질전환 벼의 생산방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 방법으로 생산되는 설사병 백신활성 유전자를 발현하는 형질전환 벼를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기한 형질전환 벼로부터 추출되는 설사병 백신활성이 있는 융합단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기한 융합단백질을 유효성분으로 하는 설사병 백신 조성물을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은
1) 서열번호 1로 표시되는 Vibrio cholerae의 무독성 B 서브유니트 유전자, 서열번호 2로 표시되는 Escherichia coli의 무독성 B 서브유니트 유전자 및 bar 유전자를 pMJ103 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 pMJ103 재조합 벡터를 아그로박테리움에 삽입하여 형질전환 균주를 얻는 단계;
3) 캘러스 유도된 벼 종자에 상기 단계 2)에서 얻어진 형질전환된 아그로박테리움을 접종하여 공동 배양하는 단계;
4) 상기 단계 3)으로부터 생존 캘러스를 선별하여 2차 배양한 후, 2차 배양 캘러스를 선별하는 단계;
5) 선별된 2차 배양 캘러스를 명배양하여 재분화된 식물체를 MS0 배지에서 발근시키는 단계;
6) 상기 단계 5)에서 얻어진 발근 식물체를 순화시켜서 토양에 이앙하여 벼 형질전환체를 수확하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 설사병 백신활성 유전자를 발현하는 형질전환 벼의 생산방법인 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 있어서는, 설사병 원인세균인 콜레라균과 대장균의 무독성 B 서브유니트인 CTB(Kang 등 2004a)와 LTB(Kang 등 2004b) 유전자를 전북대학교에서 분양받았으며 이들 유전자가 삽입될 형질전환용 바이너리 벡터에는 CaMV 35S 프로모터, Nos 터미네이터 및 nptⅡ 유전자가 있는 pMY 벡터와 Glb 프로모터, pinⅡ 터미네이터 및 bar 유전자가 있는 pMJ103 벡터를 이용하였다. 본 발명에 이용 가능한 벡터는, 바람직하기로는 pMJ103이다.
도 2는 서열번호 1로 표시되는 CTB 유전자와 서열번호 2로 표시되는 LTB 유전자를 포함하는 본 발명에 따른 형질전환 벼를 제조하기 위한 바이너리 벡터 pMJ103의 구조를 나타낸 것이다.
바이너리 벡터 pMJ103에 상기한 CTB 유전자와 LTB 유전자가 삽입된 것을 PCR 검정으로 확인하였다.
본 발명에서는 식물의 형질전환체를 작성하는데 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterim tumefaciens)를 이용하였다. 식물의 형질전환체를 작성하는데 주로 이용되는 아그로박테리움 튜메파시엔스는 Ti 플라스미드 (tumor-inducing plasmid)를 가지고 있다. 이 Ti 플라스미드 때문에 아그로박테리아가 식물에 감염되면 crown gall이라고 하는 일종의 튜머(tumor)가 발생하게 된다. Ti 플라스미드를 좀 더 자세히 살펴보면, T-DNA라는 부위가 있으며, 이 부위는 식물의 게놈 DNA에 동종성 재조합(homologous recombination)에 의해 잘 끼어들어가는 부위이다. 따라서 이 부위에 식물에 도입하고자 하는 유전자를 넣고, Ti 플라스미드를 아그로박테리아에 삽입하여 아그로박테리아를 식물의 캘러스에 감염시켜 키우면 형진전환 식물이 만들어진다.
본 발명에 있어서 ‘기내배양’이란 무균 상태의 배양조건이 갖추어진 배양용기 내에서 식물을 배양하는 것을 의미한다.
CTB 유전자와 LTB 유전자를 포함하는 벡터 pMJ103이 삽입된 아그로박테리아에 의해 벼 캘러스를 감염시켜서 형질전환 벼를 유도, 선별하였으며, 선별된 형질전환 벼에 대하여 써던 블럿(Southern Blot)을 실시한 결과, 벼의 게놈 내에 도입된 LTB 유전자와 CTB 유전자의 삽입상태를 확인하였다.
또한, T-DNA 주변 염기서열 분석(Flanking Region Analysis) 결과로부터 LTB 유전자와 CTB 유전자가 벼의 염색체 특정부위에 삽입되었음을 확인하였다.
이렇게 형질전환된 벼의 발아율은 대조구가 87.5%인데 비하여 최소 62.0%의 발아율을 나타내었으나, 대부분 80% 이상의 발아율을 나타내어 형질전환이 도입된 벼의 일정비율 이상의 생산량을 확보할 수 있다.
면역 스트립(Immuno Strip) 처리와 격리온실 내에서 이앙 및 재배후 바스타 처리에 의한 생물검정을 통하여 본 발명에 따른 설사병 백신 활성 유전자를 발현하는 형질전환 벼가 형질전환체로 고정되었음을 확인하였다.
본 발명에 따른 모든 형질전환 계통에 대한 GM1 강글리오사이드(ganglioside) 반응 결과, 모든 형질전환 계통이 설사병에 대한 백신 역할을 하는 pentamer 구조를 가지는 백신으로 나타났다. 따라서 본 발명의 방법으로 생산되는 설사병 백신활성 유전자를 발현하는 형질전환 벼로부터 설사병 백신활성 융합단백질을 생산할 수 있으며, 본 발명에 따라 제조된 형질전환 벼는 그 자체로써 또는 융합단백질을 추출하여 백신으로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기한 형질전환 벼를 유효성분으로 함유하는 경구용 설사병 예방 백신 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 방법으로 제조되는 형질전환 벼 또는 융합단백질을 포함하는 설사병 예방 백신 또는 백신 조성물은 그 투여대상에 제한이 없으나, 바람직하기로는 가축, 더욱 바람직하기로는 돼지, 소, 자돈, 또는 송아지에게 투여될 수 있다.
상기 백신 조성물은 본 발명에 따른 형질전환 벼를 그대로 사용하거나 건조시킨 후 분말형태로 사용할 수 있으며, 또한 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분으로서 형질전환 벼의 혼합량은 사용목적에 따라 적당하게 임의로 결정될 수 있다.
설사병 백신활성 유전자를 발현하는 형질전환 벼를 생산하는 본 발명의 방법에 따르면 안전한 방법에 의해 설사병 백신활성 단백질을 얻을 수 있다.
본 발명에 따르면, 설사병 백신활성 유전자를 발현하는 형질전환 벼를 생산하여 이를 식물성 사료로써 가축에게 제공함으로써 축산산업에서 항생물질의 사용을 현저하게 감소시켜 농가의 축산 비용을 줄이는 경제적인 효과를 얻을 수 있다.
이러한 항생물질 사용량의 감소는 경제적인 효과 이외에 소비자 건강에도 기여할 수 있다.
도 1은 서열번호 1로 표시되는 콜레라톡신 B 서브유닛을 코딩하는 유전자 CTB의 염기서열과 서열번호 2로 표시되는 E. coli Heat-Labile 엔테로톡신 B 서브유닛 유전자 LTB의 염기서열을 함께 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 벼 형질전환체를 제조하기 위한 바이너리 벡터 pMJ103의 구조를 나타낸 개략도이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 pMJ103 벡터를 아그로박테리움에 전이시킨 후 LTB 유전자와 CTB 유전자의 전이를 확인한 PCR 전기영동 사진이다.
도 4는 본 발명의 pMJ103 벡터로 형질전환된 아그로박테리움을 이용한 벼 종자에 의한 캘러스 유도(1) 및 증식(2), 형질전환 캘러스의 재분화(3) 그리고 형질전환체 계대배양(4)을 나타낸 사진이다.
도 5는 벼에 도입된 LTB 유전자와 CTB 유전자를 확인하기 위한 PCR 반응 결과를 나타낸 전기영동사진이다. 여기에서 M은 1kb 크기의 마커이고, C는 pMJ103 바이너리 벡터이며, W는 형질전환되지 않은 벼이고, T01 내지 T25는 형질전환된 벼이다.
도 6은 벼에 도입된 LTB 유전자와 CTB 유전자가 감자 게놈 내로 도입된 개수를 확인하기 위한 서던 블롯 결과를 나타낸 전기영동 사진이다.
도 7은 벼에 도입된 LTB 유전자와 CTB 유전자의 전사 여부를 확인하기 위하여, 상기 유전자의 mRNA의 RT-PCR 결과를 나타낸 전기영동 사진이다.
도 8은 형질전환된 벼 T1 종자에 대한 바스타 스트립 검정결과를 나타낸 전기영동 사진이다.
도 9는 형질전환된 벼 T1에 대한 GM1-ganglioside ELISA에 의한 백신 단백질 함량 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 설사병 백신 활성 유전자를 발현하는 형질전환 벼의 수용성 단백질과 LTB 백신 단백질 함량 조성 표이다.
도 11은 본 발명에 따른 설사병 백신활성 유전자를 발현하는 형질전환 벼를 생산하기 위한 배지 조성물들의 성분 표이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
실시예 1 형질전환용 벡터의 제작
식물 형질전환에 이용하기 위하여 CTB와 LTB 유전자는 pMJ103 벡터와 HB101 벡터와 같은 헬퍼 플라스미드와 함께 트리페런탈메이팅(tri parental mating) 방법으로 아그로박테리움에 이들 유전자를 함께 재조합시켰다.
pMJ103 벡터에 삽입된 균주의 콜로니는 스트렙토마이신 100mg L-1 첨가된 액체 YEP 배지 3 ml에 접종하여 28℃에서 250rpm으로 2일간 진탕 배양하여 증식하였으며 플라스미드 DNA 추출 키트(AccuPrep, 바이오니아)를 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다.
프라이머는 LTB 유전자 292bp 조각, CTB 유전자 298bp 조각, bar 유전자 302bp DNA 조각을 디자인한 후 인공합성하였다.
96 ℃에서 10 분 동안 변성 전처리하고, 변성반응 96℃ 30초, 프라이머 접합 54℃ 30 초, 프라이머 확장 72℃ 2 분, 35 회 등 과 같은 PCR 프로그램으로 반응시킨 후 1% 아가로스에 의한 전기영동에 의해 아그로박테리움에 삽입되었는지를 확인하였다.
도 3은 pMJ103벡터를 아그로박테리움에 전이시킨 후 LTB 유전자와 CTB 유전자의 전이를 확인한 PCR 전기영동 사진이다. 도 3에서 아그로박테리움에 LTB 유전자와 CTB 유전자의 전이를 확인할 수 있다.
실시예 2 벼의 형질전환 및 형질전환체의 기내 선발
2-1) 캘러스의 유도
일미벼와 녹양벼 종자를 까서 상태가 양호한 것만을 선별하였다. 선별된 종자를 50 ml 팔콘 튜브에 넣고 100% 에탄올에 30초간 진탕하였다. 진탕기를 이용하여 1/2 락스에 40분간 진탕한 후, 멸균수로 3회 이상 10분 동안 세척하여 종이(3M사 제품) 위에서 물기가 완전히 마를 때까지 건조시켰다.
2N6 배지에 배(씨눈)이 위로 향하게 플레이트 당 10 내지 13개를 치상한 후 27 ℃에서 3 내지 4주간 암배양하였다. 3주가 되면 1 내지 2 mm 크기의 둥글고 갈변이 되지 않은, 연노랑색 또는 아이보리색을 띠는 잘 부서지는 것들만 선발하여 2N6 배지에서 다시 3일간 증식 배양하였다.
2-2) 공동배양
아그로박테리움을 AB-SpT 배지에 접종하여 28℃에서 4 내지 5일 동안 암배양하였다. 상기 아그로박테리움 균주를 AAM 배지에 부운 후 50ml 팔콘 튜브에 옮긴 다음 660nm의 O.D.값이 1.5 내지 2.0이 되게 희석하였다. 캘러스를 튜브에 적당히 담고 20 내지 30분간 접종하였다. 접종 후에 용액은 잘 따라내고 종이 위에서 살짝 건조한 다음, 건조된 캘러스를 1/2 2N6-AS 배지에 치상하고, 캘러스 위에 멸균된 3M 여과지를 덮어주었다. 여과지를 덮은 상태로 26.5 ℃에서 1일, 23.5 ℃에서 4일 내지 8일간 상기 캘러스를 공동 배양하였다.
2-3) 형질전환 캘러스 선발
5일 이상 배양된 캘러스를 멸균된 시험관에 담고 멸균수로 세척해서 세폭탁심 (Cefotaxime) 250 ug을 첨가한 멸균수 50 ml로 10회 이상 세척하였다. 이를 거름종이 위에 살포하여 건조한 후, 2N6-CP 배지에 옮겨 27 ℃ 암조건에서 3주간 배양하였다. 살아남은 캘러스를 2N6-CP 배지에서 동일조건으로 2주 동안 배양하여 2차 선발하였다.
2-4) 형질전환 캘러스의 재분화 식물체 유도 및 발근
2차 선발된 캘러스는 MSR-CP 배지에 치상후 25 ℃에서 명배양하고, 재분화 식물체는 MS0 배지에 옮겨 발근시켰다.
2-5) 형질전환 식물체 순화 및 온실재배
상기 2-4에서 얻어진 발근 식물체를 1,000배 hyponex 용액에 7 내지 10일간 침지 순화하고, 14일간 침지 순화한 식물체를 60 × 40 cm 바닥이 막힌 두부상자 안에 있는 32공 트레이에 이식하여 온실에서 관리하여 이앙 후 14일 부터 시비 재배하였다.
상기한 벼 캘러스의 유도(1) 및 증식(2), 형질전환 캘러스의 재분화(3) 그리고 형질전환체 계대배양(4)을 도 4에 나타내었다.
실시예 3 PCR에 의한 형질전환체 검정
K3030(바이오니아) 추출키트를 이용하여 식물체 DNA를 추출하였다.
상기 실시예 2에서 재분화된 벼의 gDNA 20 pM 4 ul와 멸균수 4 ul, 센스 프라이머 4 ul, 안티센스 프라이머 4 ul를 Toptaq PCR premix (코아바이오텍)에 첨가한 후 혼합하여 PCR을 수행하였다.
PCR 반응은 변성 전처리를 96 ℃에서 10 분, 변성반응을 96 ℃에서 30 초, 프라이머 어닐링(annealing)을 54 ℃에서 30 초, 프라이머 연장을 72 ℃에서 2 분 동안 35 회 반응시키고, 72 ℃에서 15 분 반응시킨 후 반응을 마쳤다.
얻어진 PCR 반응물을 1% 아가로스에 의한 전기영동으로 확인하고 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 보이는 바와 같이, 형질전환 벡터 pMJ103으로부터 유래한 LTB 유전자와 CTB 유전자가 형질전환된 벼 T01 내지 T25에서 확인되었다.
실시예 4 써던 블롯에 의한 형질전환체 DNA 발현 검정
4-1) 제한효소에 의한 게놈 DNA의 절단
분석하고자 하는 벼 게놈 DNA 10 ug과 반응완충용액 및 증류수를 혼합하여 총 18 ul를 제조하여 4 ℃에서 2시간 정도 방치하였다. 제한효소(ug/20unit)를 가하고 조심스럽게 혼합하여 37 ℃에서 12시간 동안 보관한 후, 반응액 중 1 ul를 1% 전기영동으로 확인하였다.
4-2) 블로팅을 위한 전기영동
겔판을 3차 멸균수, 70% 에탄올, 3차 멸균수로 세척한 후, 제한효소로 절단된 게놈 DNA 시료를 0.8% (0.64g/80ml) 아가로스 겔에 로딩하였다. 50mA (30V)의 전압으로 12시간동안 로딩하였다.
4-3) 겔 모세관 전이
1×TAE 완충용액은 4 ℃ 냉장 보관하고, fiber pad, 여과지, 겔, 멤브레인을 상기 완충용액에 15분에서 1시간 동안 침지하였다. 전기영동이 끝난 겔을 조심스럽게 유리판에 옮기고, 겔의 좌측 아래쪽 모서리를 절단하여 방향을 설정하여 변성 용액에 45분간 교반하였다.
교반된 겔은 플라스틱 통에 옮겨 멸균수에서 5분간 세척하고 중화 용액에서 30분간 교반한 후, 중화 용액을 교체한 후 다시 15분 동안 교반하였다.
Trans-Blot (Bio-Rad사 제품) 이용 겔을 옮겨서 카세트를 잠그고 트랜스퍼 완충액(1×TAE)으로 탱크를 가득 채운 후, super cooling coil과 교반용 자석바를 넣은 후 교반기 위에 올려놓고 15 V, 0.2 A에서 12시간 전이시켰다.
다음날 전이장치(transfer-blot)를 해체하여 겔과 멤브레인을 뒤집은 후 컴(comb)과 멤브레인에 연필로 이름을 표시하고 10X SSC로 5분간 세척하였다. 이 멤브레인을 30분 동안 압착 건조하였다.
UV 크로스 링커(XL-1000)에 멤브레인을 DNA 부착면을 위로하여 올려놓은 후 DNA를 고정시키고, 이 멤브레인을 하이브리다이제이션에 사용하였다.
4-4) 표지화된 프로브 DNA 제조
삽입 유전자를 특이 프라이머로 PCR한 후 정제키트에서 분리하여 전기영동 및 정량 확인을 실시하였다.
프로브 DNA 2 ul, TE(8.0) 완충액 43 u를 100 ℃에서 5분간 끓인후 얼음에서 5분간 방치한 다음, 이 프로브 DNA를 Primer labeling kit 반응용액 (Amersham RPN 1633)에 혼합하고, P32 방사선 동위원소 5 ul를 반응용액 혼합물에 첨가하여 혼합한 후, 다시 모았다. 이 용액을 37 ℃에서 30분 동안 반응시킨 후 얼음에 보관하였다.
반응을 멈추기 위해 스펌컬럼 (illustra ProbeQuant G-50 MicroColumn)을 준비하여 1.5 ml 미세 튜브에 컬럼을 삽입하고 동위원소로 표지된 DNA를 첨가하였다. 3,000 rpm에서 30초간 원심분리한 후 컬럼을 제거하고, 상기 동위원소 표지된 DNA 용액을 100 ℃에서 5분간 방치하고 얼음에 5분간 저장한 후 하이브리다이제이션을 실시하였다.
4-5) 프리하이브리다이제이션(pre-hybridization) 및 하이브리다이제이션
100 ug/ml 연어정자 DNA를 100 ℃에서 5 분간 끓인 후 다시 얼음에 5 분간 보관하여 프리하이브리다이제이션 용액으로 하였다. 사각용기를 에탄올과 3차 멸균수로 세척하여 여기에 프리하이브리다이제이션 용액 50 ml를 첨가하였다. 전이된 Hybond-N+ 멤브레인을 용액에 침지하여 65 ℃에서 40 rpm의 진탕 인큐베이터로 2시간 동안 반응시키고, 2시간 후 프리하이브리다이제이션 용액을 제거하였다.
표지화된 단일가닥 프로브 DNA를 하이브리다이제이션 용액 50 ml에 첨가하고, 프리하이브리다이제이션된 멤브레인을 프로브가 첨가된 하이브리다이제이션 용액에 투입하여 65 ℃에서 40 rpm으로 진탕 인큐베이터에서 16시간 이상 반응시켰다.
4-6) 검출
하이브리다이제이션 용액을 버리고 1차로 세척 완충액으로 5분간 5회 정도 세척하고, 2차 세척 완충액으로 세척 후 상온에서 15분간 40 rpm으로 세척, 3차 세척 완충액으로 세척 후 37 ℃에서 30분간 40 rpm으로 세척, 3차 세척 완충액으로 2회 세척 후 68℃에서 30분간 40rpm으로 세척, 4차 세척 완충액으로 세척하였다.
멤브레인을 여과지(3MM)에 올린 후 눌러서 건조시키고, X-ray 필름 카세트를 연 후 2중 멸균비닐을 올려놓고 비닐 사이에 멤브레인을 넣고 덮은 후 고정시켰다.
상기 X-선 필름을 카세트에 장착한 후 -70 ℃에서 5일후 현상하여, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
실시예 5 RT-PCR에 의한 형질전환체의 mRNA발현 검정
5-1) 전체 RNA 분리 : easy-spinTM (Intron 17221)
종자 20 내지 50 mg을 마쇄한 후, 세포용출 완충액 1 ml를 넣고 강하게 10 초 동안 교반하고, 클로로포름 200 ul를 첨가하여 13,000 rpm, 4℃에서 10 분간 원심분리하였다. 상등액 400 ul를 새로운 1.5 ml 튜브에 옮겨서 결합 완충액 400 ul를 부드럽게 2 내지 3회에 나누어 혼합하여 상온에서 1분간 방치하였다.
컬럼에 상기 용액을 로딩하여 13,000 rpm에서 30 초간 원심분리한 후 용액을 흘려보내고, 세척용 완충액 A 700 ul를 넣고 13,000 rpm에서 30 초간 원심분리 후 용액을 버렸다. 여기에 세척용 완충액 B 700 ul를 넣고 13,000 rpm에서 30 초간 원심분리 후 용액을 버렸다.
13,000 rpm에서 1 내지 2분간 원심분리한 후 용출 완충액 50 ul를 넣고 상온에서 1분간 방치하고 13,000 rpm에서 1분간 원심분리하였다.
5-2) RT-PCR 반응
프라이머는 LTB 유전자의 292bp 조각을 디자인한 후 인공 합성하였다. 추출된 식물체 전체 RNA 20 pM 4 ul와 멸균수 4 ul, 센스프라이머 4 ul, anti-sense primer 4 ul를 Toptaq RT-PCR premix (코아바이오텍)에 첨가한 후 교반하여 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR 반응은 50 ℃에서 1 시간 동안 역전사 반응시킨 후, 변성 전처리을 94 ℃에서 5 분, 변성 반응을 94 ℃에서 30 초, 프라이머 접합을 55 ℃에서 30 초, 프라이머 확장을 72 ℃에서 1 분하고, 30 회 반응시킨 후 72 ℃에서 7 분 추가 반응한 후 반응을 마쳤다.
PCR 반응물은 1% 아가로스에 의한 전기영동으로 확인하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
실시예 6 스트립 바(Strip bar)에 의한 형질전환체 단백질 발현 검정
형질전환된 벼의 잎이나 종자를 SEB4 시료 추출버퍼(기산바이오텍)에 넣고 분쇄하여 30초 동안 상온에 보관하였다.
시료 추출물을 미세튜브에 옮긴 후, 스트립 키트의 상단부위를 잡고 미세튜브에 수직으로 담가서 3 내지 5분 경과 후 결과를 확인하였다.
그 결과, 도 9에서 보이는 바와 같이 대조구를 제외한 모든 T1 형질전환체가 PAT 단백질이 발현하여 제초제 저항을 나타내었다.
실시예 7 제초제 처리에 의한 형질전환체 선발
물 1L에 스포탁 유제 0.5 ml를 조제한 후 벼 종자를 24시간 침종한 후 건져서 세척하였다. 증류수 100 ml에 25 ℃에서 2 내지 3일간 침지하고 하루에 1회씩 물을 교환하였다. 거름종이를 깐 페트리 디쉬에 상기한 벼 종자를 올려놓고 30 내지 33 ℃에서 2 내지 3일 동안 다습하게 하여 발아시켰다. 싹이 나면 건져내어 칼라포트에 12cm 정도 용토를 채운 후 정식하였다.
정식 후 20일과 27일에 Basta 제초제 0.3%(3mL/L)를 2회 살포하여 3일에서 10일 사이의 고사율을 조사하였다.
실시예 8 플랭킹 영역 분석(Flanking region analysis)에 의한 형질전환체 검정
형질전환된 식물의 gDNA (2ug/20ul)를 특정 제한효소로(HaeIII) 절단하고, 어댑터를 이용하여 잘려진 DNA조각을 라이게이션(ligation)하였다.
어댑터의 A1 프라이머와 T-DNA의 오른쪽 보더(RB1) 프라이머 세트와 A2 프라이머와 오른쪽 보더(RB2) 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 실시하고, PCR 산물에 대하여 오른쪽 보더(RB2) 프라이머를 사용하여 2차 PCR을 수행한 후 직접 염기서열 분석(Direct sequencing, GG바이오)을 실시하였다.
시퀀싱 결과를 분석하여 삽입유전자 인접서열 부분을 확인하였다.
표 1
계통번호 유전자삽입염색체번호 삽입유전자수 삽입유전자 및 위치 계통번호 유전자삽입염색체번호 삽입유전자수 삽입유전자 및 위치
대조구 - - - T13 5, 9 2 -
T01 3, 5 2 - T14 2 -
T02 3 플라스미드 T15 2 플라스미드
T03 8 1 인트론 T16 2 -
T04 7 2이상 - T17 3 1 인트론
T05 3 1 엑손 T18 1 1 인트론
T06 3 1 인트론 T19 미검출 플라스미드
T07 6 1 유전자사이 T20 미검출 -
T08 3, 9 2 - T21 5 플라스미드
T09 1 - T22 5 -
T10 2 1 B T23 2 -
T11 12 1 B T24 1이상 -
T12 미검출 - T25 8 1 플라스미드
실시예 9 GM1-강글리오사이드(ganglioside) ELISA에 의한 형질전환체의 백신 단백질 발현 검정
9-1) GM1-강글리오사이드 코팅
GM1-강글리오사이드(860065P) 3 ul/ml (스탁 1 mg/ml)를 카보네이트 코팅 완충액(기산과학) 15 ml에 용해하였다. 상기 용액을 4 ℃의 냉장고에서 16시간 동안 방치한 후, PBST 완충액으로 3회 완벽하게 세척하였다.
9-2) 블로킹
4%의 지방이 제거된 건조 밀크 200 ul를 웰에 로딩하여 GM1이 결합되지 않은 곳을 블로킹하였다. 37 ℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 반응시킨 후, PBST 완충용액으로 3회 세척하였다.
9-3) 시료 조제
세균으로부터 정제된 LTB 0.2 내지 12.8 ng과 백신 벼에서 추출한 단백질(100 μg)을 IdSEB 완충액 100 ul에 용해하여 96 웰 플레이트에 로딩하였다.
※ IdSEB 완충액 : 1.6 ml 6.25 × PVP40 + 8.6 ㎖ 카보네이트 코팅 완충액 (기산과학)
상기 용액을 4 ℃의 냉장고에서 16시간 동안 방치한 후, PBST 완충액으로 3회 완벽하게 세척하였다.
9-4) 1차 항체 (Anti-Rabbit LTB, 1/5,000, Abcam) 첨가
카보네이트 코팅 완충액 (기산과학)에 1차 항체를 첨가(2ul/10ml)하였다. 37 ℃의 인큐베이터에서 2시간 동안 반응시킨 후, PBST 완충용액 200 ul로 3회 반복하여 완벽하게 세척하였다.
9-5) 2차 항체 (Goat Anti Rabbit IgG-AP, 1/1,000, SantaCruz) 및 기질 첨가
ECI 완충액 (기산과학)에 2차 항체를 첨가하여 (1 ul/ml), 37 ℃의 인큐베이터에서 2시간 동안 반응시켰다. PBST 완충용액 200 ul로 3회 완벽하게 세척하고, PNP 기질 완충용액을 첨가(1개 PNP/5ml)한 다음, 37 ℃의 인큐베이터에서 30분에서 1시간 동안 반응시켰다.
ELISA 검출기를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
상술한 실시예 및 도면은 발명의 내용을 상세히 설명하기 위한 목적일 뿐, 발명의 기술적 사상의 범위를 한정하고자 하는 목적이 아니며, 이상에서 설명한 본 발명은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하므로 상기 실시예 및 첨부된 도면에 한정되는 것이 아님은 물론이며, 후술하는 청구범위 뿐만이 아니라 청구범위와 함께 균등범위를 포함하여 판단되어야 한다.
본 발명에 따른 서열번호 1로 표시되는 콜레라톡신 B 서브유닛을 코딩하는 유전자 CTB의 염기서열과 서열번호 2로 표시되는 E. coli Heat-Labile 엔테로톡신 B 서브유닛 유전자 LTB의 염기서열을 서열목록으로 본 출원서와 함께 제출하였다.

Claims (7)

1) 서열번호 1로 표시되는 Vibrio cholerae의 무독성 B 서브유니트 유전자, 서열번호 2로 표시되는 Escherichia coli의 무독성 B 서브유니트 유전자 및 bar 유전자를 pMJ103 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 pMJ103 재조합 벡터를 아그로박테리움에 삽입하여 형질전환 균주를 얻는 단계;
3) 캘러스 유도된 벼 종자에 상기 단계 2)에서 얻어진 형질전환된 아그로박테리움을 접종하여 공동 배양하는 단계;
4) 상기 단계 3)으로부터 생존 캘러스를 선별하여 2차 배양한 후, 2차 배양 캘러스를 선별하는 단계;
5) 선별된 2차 배양 캘러스를 명배양하여 재분화된 식물체를 MS0 배지에서 발근시키는 단계;
6) 상기 단계 5)에서 얻어진 발근 식물체를 순화시켜서 토양에 이앙하여 벼 형질전환체를 수확하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 설사병 백신활성 유전자를 발현하는 형질전환 벼의 생산방법.
제 1항에 따른 방법으로 생산되는 설사병 백신활성 형질전환체를 보유한 벼.
제 2항에 따른 벼에서 추출되는 융합단백질.
제 3항에 있어서, 상기 융합단백질이 설사병 백신활성을 가지는 것인 융합단백질.
제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 융합단백질이 가축용 설사병 백신활성을 가지는 것인 융합단백질.
제 6항에 있어서, 상기 융합단백질이 돼지 또는 소의 설사병 백신활성을 가지는 것인 융합단백질.
제 3항에 따른 융합단백질을 유효성분으로 하는 설사병 백신 조성물.
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