WO2010110591A2 - 환경 스트레스 유도성 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

환경 스트레스 유도성 프로모터 및 이의 용도 Download PDF

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WO2010110591A2
WO2010110591A2 PCT/KR2010/001793 KR2010001793W WO2010110591A2 WO 2010110591 A2 WO2010110591 A2 WO 2010110591A2 KR 2010001793 W KR2010001793 W KR 2010001793W WO 2010110591 A2 WO2010110591 A2 WO 2010110591A2
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plant
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김주곤
이나리
하선화
최양도
박수현
방승운
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명지대학교 산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems

Definitions

  • the present invention relates to an environmental stress inducible promoter and its use, and more particularly to an environmental stress inducible promoter derived from rice, a recombinant plant expression vector comprising the promoter, and a target protein produced using the recombinant plant expression vector.
  • the present invention relates to a method for producing a transformed plant using the recombinant plant expression vector, a transformed plant produced by the method, and a method for improving environmental stress resistance of the plant using the promoter.
  • a promoter is a genome region that is linked to the upper side of a gene, and controls a structural gene linked thereto to be transcribed into mRNA.
  • the promoter is activated by combining various general transcription factors, and generally has base sequences such as TATA box and CAT box that regulate gene expression. Proteins necessary for the basic metabolism of the living body must maintain a constant concentration in the cell, so the promoters linked to these genes are always activated by the action of the general transcription factor. In contrast, proteins that do not play a role in normal life and require function only under special circumstances are linked with an inducible promoter that induces expression of the structural gene. Inducible promoters are activated by the binding of specific transcription factors activated by external stimuli from the development of the organism or from environmental factors from the surroundings.
  • CaMV35S cauliflower mosaic virus 35S
  • inducible promoter capable of inducing expression of a target gene at a specific condition or at a specific time instead of a promoter that induces expression at all times in a plant tissue.
  • inducible promoter systems have been developed in which promoters isolated from microorganisms or animals are introduced into plants and chemicals are used as derivatives to trigger biosynthesis of the protein of interest.
  • a method of treating chemicals such as steroid dexamethasone, antibiotic tetratracycline, copper ions, and IPTG as an inducer has been introduced (Gatz). et al., Plant J. 2: 397-404, 1992; Weimann et al.
  • Korean Patent Registration No. 10-0781059 discloses an inducible promoter activated by environmental stress and a method for obtaining a transgenic plant that specifically produces a protein of interest to a covariate cell using the promoter.
  • 10-0578461 discloses a stress-induced promoter derived from rice, but differs from the promoter of the present invention.
  • the present invention has been devised by the above demands, and the present inventors have found that a specific promoter derived from rice is strongly induced by environmental stress as a result of efforts to develop a promoter induced by environmental stress, particularly dry (single) stress. This invention was completed.
  • the present invention provides an environmental stress inducible promoter derived from rice.
  • the present invention also provides a recombinant plant expression vector comprising the promoter.
  • the present invention also provides a method for producing a target protein using the recombinant plant expression vector.
  • the present invention also provides a method for producing a transformed plant using the recombinant plant expression vector.
  • the present invention also provides a transgenic plant produced by the above method.
  • the present invention provides a method for improving the environmental stress resistance of plants using the promoter.
  • the promoter provided by the present invention and the technology for developing a variety of environmentally stress-resistant transgenic plants are expected to contribute greatly to increasing yields of various economic crops.
  • DAG represents days after germination
  • - represents the state before drought stress treatment
  • + represents the state after drought stress treatment
  • 7d represents the state before drought stress treatment
  • 7d-dro represents the state 7 days after drought stress treatment.
  • Figure 2 is a schematic diagram of rice transformant carrier for the analysis of environmental stress inducible promoter activity.
  • NT non-transgenic (cv. Nakdong); Wsi18, Wsi18 promoter; Lea3, Lea3 promoters; Uge1, Uge1 promoter; R1G1B, R1G1B promoters; NCED3 , NCED3 promoters; PSY2 , PSY2 promoter; DXS2 , DXS2 promoter.
  • NT non-transgenic
  • Wsi18 Wsi18 promoter
  • Lea3 Lea3 promoter
  • Uge1 Uge1 promoter
  • R1G1B R1G1B promoters
  • NCED3 NCED3 promoters
  • PSY2 PSY2 promoter
  • DXS2 DXS2 promoter.
  • M mesophyll cell
  • S stomata
  • NT non-transgenic
  • Wsi18 Wsi18 promoter
  • Lea3 Lea3 promoter
  • Uge1 Uge1 promoter
  • R1G1B R1G1B promoters
  • NCED3 NCED3 promoters
  • PSY2 PSY2 promoter
  • DXS2 DXS2 promoter
  • RA root apex
  • RC root cap
  • E epidermis
  • NT non-transgenic
  • Wsi18 Wsi18 promoter
  • Lea3 Lea3 promoter
  • Uge1 Uge1 promoter
  • R1G1B R1G1B promoters.
  • Lm lemma
  • P palea
  • An anther
  • F filament
  • DAG represents days after germination
  • "0” represents the state before drought stress treatment
  • "2" and “3” represents the state after drought stress treatment
  • # 1, # 2, and # 3 are three different lines. Indicates.
  • NCED3, PSY2 a result obtained by comparing the GFP expression as before and after drought stress treatment Wsi18 promoter of the promoter after the germination of DXS2 7 day old transformants.
  • the gray bars represent the amount of RNA transcripts before drought stress treatment, and the black bars represent the amount of RNA transcripts after drought stress treatment.
  • Figure 9 is the result of observing the change in GFP expression amount in rice plants over time after stress treatment according to the promoter.
  • the present invention provides an environmental stress inducible promoter for plant gene transformation, more specifically the environment derived from rice selected from the group consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 Provide a stress inducible promoter.
  • the present invention relates to a specific promoter derived from rice, specifically, the promoter is a water-stress induced protein 18 (Wsi18) promoter of SEQ ID NO: 1, a late embryogenesis abundant protein 3 (Lee3) promoter of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 Uge1 (UDP-glucose 4-epimerase 1) promoter of RDG1B (early drought induced protein) promoter of SEQ ID NO: 4, 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase 3 (NCED3) promoter of SEQ ID NO: 5, phytoene synthase of PSY2 of SEQ ID NO: 6 2) promoter, DXS2 (1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase 2) promoter of SEQ ID NO.
  • Wsi18 water-stress induced protein 18
  • Lee3 late embryogenesis abundant protein 3
  • Uge1 UDP-glucose 4-epimerase 1 promoter of RDG1B (early
  • variants of such promoter sequences are included within the scope of the present invention.
  • Variants are base sequences that vary in base sequence but have similar functional properties to the base sequences of SEQ ID NOs: 1-7.
  • the promoter is a base having sequence homology of at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% with the base sequences of SEQ ID NOS: 1-7, respectively. Sequences may be included.
  • the "% sequence homology" for a polynucleotide is identified by comparing two optimally arranged sequences with a comparison region, wherein part of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. It may include the addition or deletion (ie, gap) compared to).
  • the environmental stress may be dry, high temperature, cold, salt, heavy metal, and the like, preferably dry (single) stress.
  • the present invention provides a recombinant plant expression vector comprising the promoter according to the present invention.
  • the recombinant plant expression vector include, but are not limited to, the vector described in FIG. 2.
  • Recombinant refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, a heterologous peptide, or a heterologous nucleic acid.
  • Recombinant cells can express genes or gene fragments that are not found in their natural form in either the sense or antisense form.
  • Recombinant cells can also express genes found in natural cells, but the genes have been modified and reintroduced into cells by artificial means.
  • vector is used to refer to a DNA fragment (s), a nucleic acid molecule, that is delivered into a cell. Vectors can replicate DNA and be reproduced independently in host cells.
  • carrier is often used interchangeably with “vector”.
  • expression vector refers to a recombinant DNA molecule comprising a coding sequence of interest and a suitable nucleic acid sequence necessary to express a coding sequence operably linked in a particular host organism. Promoters, enhancers, termination signals and polyadenylation signals available in eukaryotic cells are known.
  • Ti-plasmid vectors which, when present in a suitable host such as Agrobacterium tumerfaciens, can transfer part of themselves, the so-called T-region, into plant cells.
  • a suitable host such as Agrobacterium tumerfaciens
  • Another type of Ti-plasmid vector (see EP 0 116 718 B1) is used to transfer hybrid DNA sequences to protoplasts from which current plant cells or new plants can be produced which properly insert hybrid DNA into the plant genome. have.
  • a particularly preferred form of the Ti-plasmid vector is the so-called binary vector as claimed in EP 0 120 516 B1 and US Pat. No. 4,940,838.
  • viral vectors such as those which can be derived from double stranded plant viruses (eg CaMV) and single stranded viruses, gemini viruses, etc.
  • CaMV double stranded plant viruses
  • gemini viruses single stranded viruses
  • it may be selected from an incomplete plant viral vector.
  • the use of such vectors can be advantageous especially when it is difficult to properly transform a plant host.
  • the expression vector will preferably comprise one or more selectable markers.
  • the marker is typically a nucleic acid sequence having properties that can be selected by a chemical method, which corresponds to all genes capable of distinguishing transformed cells from non-transformed cells. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinotricin, antibiotics such as kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, and chloramphenicol Resistance genes include, but are not limited to.
  • the terminator may use a conventional terminator, such as nopalin synthase (NOS), rice ⁇ -amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, agro Terminators of the octopine gene of bacterium tumefaciens, but are not limited thereto.
  • NOS nopalin synthase
  • rice ⁇ -amylase RAmy1 A terminator phaseoline terminator
  • agro Terminators of the octopine gene of bacterium tumefaciens but are not limited thereto.
  • terminators it is generally known that such regions increase the certainty and efficiency of transcription in plant cells. Therefore, the use of terminators is highly desirable in the context of the present invention.
  • the plant expression vector may be prepared by operably linking a target gene encoding a protein of interest downstream of the promoter of the present invention.
  • "operably linked” refers to a component of an expression cassette that functions as a unit for expressing a heterologous protein.
  • a promoter operably linked to heterologous DNA encoding a protein promotes the production of functional mRNA corresponding to the heterologous DNA.
  • the protein of interest may be any kind of protein, for example, a protein that has a medical utility such as enzymes, hormones, antibodies, cytokines, or the like, and may accumulate a large amount of nutrients that may enhance the health of animals including humans.
  • a protein that has a medical utility such as enzymes, hormones, antibodies, cytokines, or the like
  • the present invention is not limited thereto.
  • the protein of interest include interleukin, interferon, platelet induced growth factor, hemoglobin, elastin, collagen, insulin, fibroblast growth factor, human growth factor, human serum albumin, erythropoietin and the like.
  • the present invention is a method for producing a target protein in a plant, characterized in that after the transformed plant with the recombinant plant expression vector, the target protein is produced in the plant by applying an environmental stress to the transformed plant.
  • the desired protein produced is as described above.
  • Plant transformation refers to any method of transferring DNA to a plant. Such transformation methods do not necessarily have a period of regeneration and / or tissue culture. Transformation of plant species is now common for plant species, including both dicotyledonous plants as well as monocotyledonous plants. In principle, any transformation method can be used to introduce hybrid DNA according to the invention into suitable progenitor cells. Method is calcium / polyethylene glycol method for protoplasts (Krens, FA et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), protoplasts Electroporation (Shillito RD et al., 1985 Bio / Technol.
  • the "plant cells” used for plant transformation may be any plant cells.
  • the plant cells may be cultured cells, cultured tissues, cultured organs or whole plants, preferably cultured cells, cultured tissues or cultured organs and more preferably any form of cultured cells.
  • Plant tissue refers to the tissues of differentiated or undifferentiated plants, such as, but not limited to, roots, stems, leaves, pollen, seeds, cancer tissues and various types of cells used in culture, ie single cells, protoplasts. (protoplast), shoots and callus tissue.
  • the plant tissue may be in planta or in an organ culture, tissue culture or cell culture.
  • the present invention comprises the steps of transforming plant cells with a recombinant plant expression vector according to the present invention.
  • It provides a method for producing a transformed plant comprising the step of regenerating the transformed plant from the transformed plant cells.
  • the method of the present invention comprises transforming plant cells with a recombinant plant expression vector according to the present invention, which transformation can be mediated by, for example, Agrobacterium tumefiaciens .
  • the method also includes the step of regenerating the transgenic plant from said transformed plant cell.
  • the method for regenerating the transformed plant from the transformed plant cell may use any method known in the art.
  • the present invention also provides a transgenic plant produced by the method for producing a transgenic plant according to the present invention.
  • the plant is a food crop selected from the group consisting of rice, wheat, barley, corn, soybeans, potatoes, wheat, red beans, oats and sorghum;
  • Vegetable crops selected from the group consisting of Arabidopsis, Chinese cabbage, radish, red pepper, strawberry, tomato, watermelon, cucumber, cabbage, melon, pumpkin, green onion, onion, and carrot;
  • Special crops selected from the group consisting of ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, sugar beet, perilla, peanut and rapeseed;
  • Fruit trees selected from the group consisting of apple trees, pear trees, jujube trees, peaches, lambs, grapes, citrus fruits, persimmons, plums, apricots and bananas;
  • the present invention also provides a method of improving the environmental stress resistance of a plant by introducing the promoter according to the invention.
  • the method can be performed by operably linking a structural gene that enhances stress resistance to the promoter of the present invention and introducing it into a plant.
  • the structural genes that enhance stress resistance encode proteins that play a role in improving plant resistance to environmental stresses such as dehydration, low temperature or salt stress.
  • LEA protein examples include the following: LEA protein; Water channel protein; Compatible solute synthetase; Detoxification enzymes of tobacco; Synthetases for osmotic substances (such as sugar, proline, or glycinebetaine); Genes encoding w-3 fatty acid desaturase of Arabidopsis thaliana , a modification enzyme of cell membrane lipids, and D9-unsaturated enzyme of cyanobacteria; P5CS, a major enzyme in proline synthesis; And AtGolS3 gene for galactinol synthesis.
  • Promoter regions based on -Tiling 300k microarray data were isolated and used for the preparation of the vector for rice transformation.
  • PCR Primer for predicting the sequence from the ATG position of the coding sequence (CDS) to about 2 kilobase pairs (kb) upstream to the promoter region and separating the promoter with a total size of 1.8-2 kb It was used as a template for manufacturing.
  • PCR primer was designed to separate a promoter of approximately 1.8-2 kb in total size. It was. As for the design conditions, the PCR conditions were 40-60% in the GC% range of the primer, 55-65 ° C in the Tm range, and salt and free Mg concentrations were 0 and 0.15 mM, respectively. PCR primers were made to have a template-specific region of 20 base pairs (bp) and a 5 'adapter sequence of 12 bp.
  • This adapter sequence is a site-specific recombination (Gateway) rather than a cloning method using conventional restriction enzymes and DNA ligase.
  • CloningTechnology CloningTechnology, Invitrogen, Carlsbad, CA).
  • the DNA to be used as a template for the PCR reaction was seeded with japponica type Nipponbare cultivar (cultivar), grown for 3 weeks in a greenhouse, and only the leaf part was excised to extract genomic DNA. Genomic DNA was first rapidly frozen by excised leaves with liquid nitrogen, finely ground using a mortar and then separated using DNAzol (Cat. No. DN128, Molecular research center, USA) solution.
  • PCR reaction was carried out in two steps.
  • the primary reaction is a reaction for separating a specific promoter from the rice genome, using a full size 32 bp template-specific sequence primer linked by a 12 bp adapter sequence.
  • the primer sequence is as follows.
  • Template specific forward primer 5′-AAAAAGCAGGCT-template specific sequence-3 ′
  • Template specific reverse primer 5'-AGAAAGCTGGGT- template specific sequence-3 '
  • the primary PCR was 50 ng of genomic DNA, 2X Taq premix (Cat. No. EP051020-T2B6-1, Solgent, Korea), template specific primers 10 pmol, 50 ul reaction in total, 95 ° C 1 min, 55 ° C 1 Minutes, 68 ° C. 2 minutes, proceeded with 30 cycles.
  • the secondary reaction was carried out to insert and amplify a specific adapter sequence ( att site) necessary for inserting the promoter into the transformation vector.
  • the length of the sequence to be additionally inserted into the promoter is about 29 bp.
  • only a portion (12 bp) of the sequence was overhanged on the template specific sequence, and the PCR was performed.
  • this reactant has both the rice promoter and the att sequence for recombination.
  • the sequence of the adapter sequence primer is as follows.
  • Att B1 adapter primer 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • Att B2 adapter primer 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • Secondary PCR is 1 ul of the first PCR reaction product, 2X Taq premix (Cat. No. EP051020-T2B6-1, Solgent, Korea), 2 pmol of adapter primers respectively, 50 ul total reaction, 95 °C 30 seconds, 45 °C 30 After 5 seconds of 68 ° C for 2 minutes and 5 cycles, the process proceeded to 95 ° C 30 seconds, 55 ° C 30 seconds, 68 ° C 2 minutes and 20 cycles.
  • the above PCR method was performed by the method proposed by Invitrogen to use the Gateway System (Cat. No. 12535-029, Invitrogen, Carlsbad, CA).
  • Gateway system (Cat. No. 12535-029, Invitrogen, Carlsbad, Calif.) was used to insert the rice transformant vehicle.
  • the amplified promoter was electrophoresed on a 1% agarose gel, and then purified by band isolation and Mega-spin agarose gel extraction kit (Cat. No. 17183, Intron, Korea) on the gel.
  • LR clonase enzyme mixture 6 ul, 0.75M NaCl 1 ul, transformation carrier 450 ng / 3 ul was added to the reactant for a total of 30 ul, 25 °C, 8 hours LR reaction, proteinase K 3 ul was added, After 1 hour of reaction at 37 °C, 2 ul of these were transformed into DH5 ⁇ competent cells.
  • the transformed DH5 ⁇ cells were placed on LB agar medium containing 50 ug / ml spectinomycin antibiotic, grown for 12 hours at 37 ° C, and then extracted from DNA of selected cells with antibiotic resistance to perform PCR reaction. Through confirming, sequencing and predicting the promoter sequence and BLAST N, the complete insertion of the isolated promoter was confirmed.
  • Carrier for transformation of rice is as follows. Between the right-border sequence and the left-border sequence, the cassette to be replaced with the promoter after recombination is the marker marker gene GFP and protease inhibitor II ( PIII ) in the 3 'direction. It is connected by terminator. This cassette has an attR sequence to perform BP and LR reactions. Selectable marker genes were made so that the herbicide resistance gene Bar gene ( bar , phosphinothricin acetyltransferase gene) was regulated by the CaMV35S promoter, which was linked to a nopalin synthase ( NOS ) terminator. In addition, by attaching the MAR sequence at the end of the right-border sequence (minimal order), it is possible to minimize the change in expression amount according to the introduction site in the chromosome to measure only the promoter-specific activity.
  • Nakdong rice seed ( Oryza sativa L. cv Nakdong) was removed only after the outer lubrication, 70% (v / v) ethanol was added and shaken gently for 1 minute. The washed seeds were added to 20% chlorax again, shaken for 1 hour, and washed several times with sterile water. Washed rice seeds were cultured for one month in embryonic callus organic medium (2N6) as described by Jan (Jang et al ., Mol breeding, 5: 453-461, 1999) for transformation.
  • 2N6 embryonic callus organic medium
  • embryonic callus was incubated and co-cultivated with agrobacterium for transformation obtained by Agrobacterium triple mating method to insert the promoter into which the promoter was inserted into the rice genome, and then transformed callus Incubated for one month in selection medium (2N6-CP). Thereafter, the selectively grown cells were picked and cultured in re-differentiation medium (MS-CP) for one to two months, after which the re-differentiated plants were purified in a greenhouse. Purified T 0 rice was treated with basa, a non-selective herbicide.
  • GFP fluorescence in seeds was determined by cutting the seeds into longitudinal and transverse sections and expressing GFP fluorescence in embryos and embryos using a luminescent image analyzer (LAS 3000, Fuji, Tokyo, Japan) and a stereomicroscope (SZX9-3122, Olympus, Tokyo, Japan). Was observed. Conditions for the LAS3000 were precision, standard, exposure time 1 second (excitation filter 460 nm, barrier filter 510 nm).
  • RT-PCR reverse-transcriptase PCR
  • RNeasy plant mini kit (Cat. No. 74904, Qiagen, Valencia, CA) was used for total RNA extraction.
  • First strand cDNA was synthesized with 400 ng of extracted total RNA (Cat. No. 18080-051, Invitrogen, Carlsbad, Calif.), And PCR was carried out using 2 ul (cDNA 2 ⁇ g) of the cDNA synthesis reaction as a template.
  • the PCR reaction used two kinds of primers.
  • the first primer is a gene- specific primer and the second primer is an OsUbi- specific primer for comparing cDNA loading control.
  • the primer sequence is as follows.
  • Wsi18 -specific forward primer 5'-GCGAAGGACGCGGTGATGTA-3 '(SEQ ID NO: 10)
  • Wsi18 -specific reverse primer 5'-GACACCGAACACGTCGAAGT-3 '(SEQ ID NO: 11)
  • Lea3 -specific forward primer 5'-GGCGAAGGACAAGACCTCCA-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • Lea3 -specific reverse primer 5'-CACCTGCTCACTCGCCTGTT-3 '(SEQ ID NO: 13)
  • Uge1 -specific forward primer 5'-CTGGAGATGCCGAGATCGTT-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • Uge1-specific reverse primer 5'-GCTGCTACTGGAGGATTGGA-3 '(SEQ ID NO: 15)
  • R1G1B -specific forward primer 5'-AGTCCTGAGTGCTCCAATTC-3 '(SEQ ID NO: 16)
  • R1G1B -specific reverse primer 5'-GAGCAGTGCAGGCACAATTA-3 '(SEQ ID NO: 17)
  • NCED3 -specific forward primer 5'-TTGCACGGCACCTTCATTGG-3 '(SEQ ID NO: 18)
  • NCED3 -specific reverse primer 5'-ACGCGGTCGTTGTCTGCACT-3 '(SEQ ID NO: 19)
  • PSY2 -specific forward primer 5'-CGAGATCGAGGCCAACGATT-3 '(SEQ ID NO: 20)
  • PSY2 -specific reverse primer 5'-ACAGCATTATGCAAGAGTAG-3 '(SEQ ID NO: 21)
  • DXS2 -specific forward primer 5'-TGAAGGAGCACGGCATCTAC-3 '(SEQ ID NO: 22)
  • DXS2 -specific reverse primer 5'-CCTCCTCAAGCTGGTCTACT-3 '(SEQ ID NO: 23)
  • OsUbi -specific forward primer 5'-ATGGAGCTGCTGCTGTTCTA-3 '(SEQ ID NO: 24)
  • OsUbi -specific reverse primer 5'-TTCTTCCATGCTGCTCTACC-3 '(SEQ ID NO: 25)
  • PCR conditions were 95 ° C. with PTC200 PCR machine (MJ research), cDNA 2 ul, 2X Taq premix (Cat.No. EP051020-T2B6-1, Solgent.Korea), template specific primers 10 pmol, total 20 ul It progressed by 30 cycles, 55 degreeC 30 second, 72 degreeC 1 minute, 28 cycles.
  • RNeasy plant mini kit (Cat. No. 74904, Qiagen, Valencia, CA) was used for total RNA extraction.
  • First strand cDNA was synthesized with 400 ng of extracted total RNA (Cat. No. 18080-051, Invitrogen, Carlsbad, Calif.), And PCR was carried out using 2 ul (cDNA 2 ⁇ g) of the cDNA synthesis reaction as a template.
  • the PCR reaction used two kinds of primers.
  • the first primer is a primer ( GFP- specific primer) for the relative comparison of the expression level of GFP inserted between promoters
  • the second primer is an OsUbi- specific primer for comparing cDNA loading control.
  • the primer sequence is as follows.
  • GFP -specific forward primer 5'-CAGCACGACTTCTTCAAGTCC-3 '(SEQ ID NO: 26)
  • GFP -specific reverse primer 5'-CTTCAGCTCGATGCGGTTCAC-3 '(SEQ ID NO: 27)
  • OsUbi -specific forward primer 5'-ATGGAGCTGCTGCTGTTCTA-3 '(SEQ ID NO: 24)
  • OsUbi -specific reverse primer 5'-TTCTTCCATGCTGCTCTACC-3 '(SEQ ID NO: 25)
  • PCR conditions were 95 ° C. with PTC200 PCR machine (MJ research), cDNA 2 ul, 2X Taq premix (Cat.No. EP051020-T2B6-1, Solgent.Korea), 4 pmol each of template specific primers, 20 ul total. It progressed by 30 second, 55 degreeC 30 second, 72 degreeC 1 minute, and 27-30 cycles.
  • Real-time PCR was performed using the cDNA used for the RT-PCR of 7 as a template. PCR reactions were performed using an Mx3000p Real-Time PCR machine (Stratagene, La Jolla, CA), TaqMan. A universal PCR mastermix (AppliedBiosystems, NewJersey, USA) was used, and primer pairs and probes were used as Assays-by-Design SM Service (Applied Biosystems, NewJersey, USA). This probe set had a PCR efficiency of more than 97% in the standard curve.
  • PCR conditions were cDNA 2 ul, 2X TaqMan Universal PCR mastermix 10 ul, 20X probe 1 ul, a total of 20 ul reaction, 50 °C 2 minutes 1 cycle, 95 °C 10 minutes 1 cycle, 40 cycles of 95 °C 30 seconds, 60 °C 1 minutes.
  • the primer and probe sequences used are as follows.
  • GFP -specific forward primer 5'-ACGTGAACGGCCACAAGTT-3 '(SEQ ID NO: 28)
  • GFP -specific reverse primer 5'-GGTCAGCTTGCCGTAGGT-3 '(SEQ ID NO: 29)
  • GFP probe 5'-CCCTCGCCGGACACG-3 '(SEQ ID NO: 30)
  • OsUbi -specific forward primer 5'-GCCAAGATCCAGGACAAGGA-3 '(SEQ ID NO: 31)
  • OsUbi -specific reverse primer 5'-GCCATCCTCCAGCTGCTT-3 '(SEQ ID NO: 32)
  • OsUbi probe 5'-ACCAGCAGCGTCTCAT-3 '(SEQ ID NO: 33)
  • Wsi18 was much better than the leaves after stress treatment, especially in the roots.
  • Uge1 was not very inducible in flowers, but its expression in leaf and root was similar to that of other promoters.
  • R1G1B had a higher basal level expression than other promoters and rarely expressed in seed.
  • the expression rate of the gene was not high at 20 days after germination, but increased in the later developmental stages.
  • NCED3, PSY2 and DXS2 promoters were also observed before and after stress treatment at callus, seed, 7, 20, 30, 60 and post flower stages. Unlike the above promoters, the seed was not expressed at all, and the expression level was increased after stress treatment in vegetative tissues at all stages of development.
  • Promoter specific primer sequences for isolating certain promoters of the invention from the rice genome are as follows.
  • AttB1 adapter primer 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • AttB2 adapter primer 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • GFP -specific forward primer 5'-CAGCACGACTTCTTCAAGTCC-3 '(SEQ ID NO: 26)
  • GFP -specific reverse primer 5'-CTTCAGCTCGATGCGGTTCAC-3 '(SEQ ID NO: 27)
  • OsUbi -specific forward primer 5'-ATGGAGCTGCTGCTGTTCTA-3 '(SEQ ID NO: 24)
  • OsUbi -specific reverse primer 5'-TTCTTCCATGCTGCTCTACC-3 '(SEQ ID NO: 25)
  • the environmental stress inducible promoter sequence derived from rice isolated in the present invention is as follows: 1 Wsi18 promoter sequence (1887 bp); AK064074 (SEQ ID NO: 1), 2 Lea3 promoter sequence (1963 bp); AK119713 (SEQ ID NO: 2), 3 Uge1 promoter sequence (1889 bp); AB087745 (SEQ ID NO: 3), 4 R1G1B promoter sequence (1799 bp); AF503583 (SEQ ID NO: 4), 5 NCED3 promoter sequence (1938 bp); AK119780 (SEQ ID NO: 5), 6 PSY2 promoter sequence (1928 bp); AK108154 (SEQ ID NO: 6), 7 DXS2 promoter sequence (1863 bp); AK100909 (SEQ ID NO: 7).
  • accession numbers of the genes regulated by the promoters are indicated after each promoter.
  • a rice transformation vector was produced and shown in FIG. 2.
  • 2A is pMJ401, a mother vector for cloning a promoter separated by PCR.
  • attR1, attR2 site is a site the attL1, attL2 sequence and recombinant (site-specific recombination), which promoter has then BP reaction, then LR reaction, the promoter is replaced with a cassette and attR1, attR2 sequences also replaced by attB1, attB2 sequence do.
  • MAR matrix attachment region (1.3 kb), X98408; cassette B: conversion cassette B (1.7 kb), invitrogen, Cat. No.
  • GFP modified green fluorescent protein gene (0.74 kb), U84737;
  • T PINII protease inhibitor II terminator (1.0 kb), X04118;
  • P 35S CaMV 35S promoter (0.92 kb);
  • Bar phosphinothricin acetyltransferase gene (0.59 kb), X17220;
  • T NOS nopaline synthase terminator (0.28 kb).
  • each promoter is as follows: P Wsi18 , Wsi18 promoter sequence (1886 bp); AK064074; P Lea3 , Lea3 promoter sequence (1963 bp); AK119713; P Uge1 , Uge1 promoter sequence (1889 bp); AB087745; P R1G1B, R1G1B promoter sequence (1799 bp); AF503583; P NCED3, NCED3 promoter sequence (1938 bp); AK119780; P PSY2, PSY2 promoter sequence (1952 bp); AK108154; P DXS2, DXS2 promoter sequence (1863 bp); AK100909.
  • T 3 step progeny from the rice transformed with each promoter carrier the seed was cut into longitudinal and cross sections to observe GFP expression using a stereomicroscope (SZX9-3122, Olympus, Tokyo, Japan).
  • the whole seed was not expressed GFP.
  • the newly developed GFP expression patterns of environmentally inducible promoters were divided into two categories.
  • the Wsi18 promoter and Lea3 promoter showed strong expression of GFP in embryos as well as in embryos. GFP was expressed not only in the aleurone layer, which is known to have the highest protein expression in the seeds, but also in the internal starch storage cells of embryos containing starch.
  • the R1G1B promoter was rarely expressed in the embryo, but only in the embryo and the aleurone layer. NCED3, PSY2, and DXS2 promoters were rarely expressed in seed as did the endogenous genes. In contrast, the Uge1 promoter was weakly expressed only in the embryo, unlike the expression of the endogenous gene.
  • the left panel is the leaves and roots of the plant in the stress-free state
  • the right panel is GFP expression confocal image 4 hours after the drought stress treatment.
  • the control group was not transformed, but GFP was not expressed, but all environmental inducible promoters have a degree of difference, but observed the induction of fluorescence in the leaves and roots by drought stress It was.
  • Wsi18 and NCED3 promoters showed good expression and induction in leaves.
  • R1G1B and PSY2 promoters showed fluorescence in unstressed leaves, but increased expression after stress treatment. This is the same as the result of observing the expression of the endogenous gene.
  • the R1G1B promoter was excellent in pore expression, the amount of expression was higher in both leaf and root than in other promoters, and the PSY2 promoter was not expressed in the pore but was unique in the cytoplasm.
  • the Lea3 and Uge1 promoters unlike the expression of endogenous genes, had low induction in leaves.
  • T 2 seed that appear homogeneous in GFP expression in seeds and seedlings are sown in greenhouses and dried for 3 days without watering in greenhouses and natural winds in light conditions just before flowering Thereafter, the samples were collected before and after the stress treatment, and before and after removing the flowers of the flower using a stereomicroscope (SZX9-3122, Olympus, Tokyo, Japan), the tissue-specific GFP expression was observed (FIG. 6). As observed in the 7-day seedlings, the genes were not expressed in flowers without stress. However, in the case of R1G1B , unlike other environmentally inducible promoters, GFP was strongly expressed in the entire flower even without stress treatment.
  • R1G1B promoter is an environmental stress inducible promoter and has a mechanism that distinguishes it from other promoters in the expression of the gene.
  • Lea3 showed a marked increase in the amount of expression in the leaf than in the root, and the expression level before the stress treatment in the leaf was the lowest than other promoters.
  • R1G1B promoter had the highest basal expression level, but it was observed that expression was increased by stress at all stages of development.
  • These promoters also observed expression of gene insertion sites in all three lines of seeds and flowers. As a result, these promoters were induced by stress in organs of all plants at all stages of development.
  • RNA transcripts after the single stress treatment of each promoter were divided by the amount before the treatment and the gene induction rate after the stress was compared (Table 1).
  • RNA in roots and flowers increased 237 times and 492 times higher than before, respectively, and the induction rate was highest compared to other promoters.
  • Lea3 promoter was more than 170 times higher in leaf growth compared to other promoters.
  • the R1G1B promoter had the highest expression amount, while the rate of increase was the lowest compared to other promoters.
  • NCED3 , PSY2 , DXS2 promoters were compared with Wsi18 promoter before and after drought stress treatment (FIG. 8). Drought stress was removed by rooting plants grown for 7 days and dried for 2 hours in the air. Compared with six different lines for each promoter, but overall NCED3 promoter is the highest expression levels in both leaves and roots and lower the expression level than Wsi18 promoter, unlike the fluorescent image DXS2 promoter than PSY2 promoter leaf The amount of expression was high in both roots.
  • Wsi18 promoter Wsi18 promoter, Lea3 promoter, Uge1 promoter, NCED3 promoter, PSY2 promoter and DXS2 promoter, which are expressed in seeds and embryos and whose expression is rapidly increased in all organs during stress treatment.
  • R1G1B promoter is expressed in the embryo's embryo and stratum , and has high basal expression level but is induced and expressed by stress in all stages of development and organs.
  • these promoters differed in the amount and induction rate of transcripts induced by stress, and had different characteristics of promoter activity over time.

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Abstract

본 발명은 벼 유래의 환경 스트레스 유도성 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물 및 상기 프로모터를 이용하여 식물의 환경 스트레스 내성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

Description

환경 스트레스 유도성 프로모터 및 이의 용도
본 발명은 환경 스트레스 유도성 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로 벼 유래의 환경 스트레스 유도성 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물 및 상기 프로모터를 이용하여 식물의 환경 스트레스 내성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
프로모터(promoter)는 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription)되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA box, CAT box 등의 염기서열을 가지고 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 유도성 프로모터(inducible promoter)가 연결되어 있다. 즉 유도성 프로모터에는 생물체의 발달과정에서, 또는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화 된다.
유전자 전이(transformation)를 통한 형질전환 식물체를 개발함에 있어 상시적이면서 강한 발현을 하는 프로모터들, 예를 들어 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S(CaMV35S) 프로모터(Odell et al., Nature 313: 810-812, 1985)가 널리 사용되고 있다. 그러나 이러한 프로모터에 연결된 특정 유전자의 상시적이고 과다한 발현(over-expression)은 생체대사에 불필요한 대량의 단백질이 주는 유독효과로 인하여 형질전환 식물체가 발아가 되지 않거나 왜소하게 되는 등의 부작용이 나타나는 경우가 많다. 대표적인 예로서, CaMV35S 프로모터를 사용하여 환경스트레스 전사인자 유전자 DREB1A를 과발현시킨 애기장대가 저온 및 저수분 조건에 대하여 저항성을 증진되는 것은 관찰되었으나, 성장이 저해되어 왜소증(dwarfed phenotype)을 보이면서 아미노산 프롤린 및 수용성 당류의 생산이 함께 증가하는 것이 확인되었다(Lie et al., Plant Cell 10: 1391-1406, 1998; Gilmour et al., Plant Physiol. 124: 1854-1865, 2000). 이러한 부작용은 CaMV35S 프로모터 대신 환경스트레스 관련 유전자인 rd29A의 유도성 프로모터를 사용함으로써 최소화할 수 있다(Kasuga et al, Nat. Biotechnol. 17: 287-291, 1999).
그러므로, 식물체 조직에서 모든 시간대에 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 대신 특정 조건 또는 특정 시기에 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있는 유도성 프로모터를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 학술적으로는, 미생물이나 동물에서 분리된 프로모터를 식물에 도입하고 화학물질을 유도체로 사용하여 목적단백질의 생합성을 촉발하는 유도성 프로모터 시스템이 많이 개발되었다. 지금까지 화학물질에 의한 발현 유도 시스템으로서 식물에 적용된 예로서, 스테로이드 덱사메타손(dexamethasone), 항생제 테트라사이클린(tetracycline), 구리이온, IPTG 등 화학물질을 유도물질로 처리해 주는 방법이 소개된 바 있다(Gatz et al., Plant J. 2: 397-404, 1992; Weimann et al., Plant J. 5: 559-569, 1994; Aoyama T. and Chua N-H, Plant J. 11: 605-612, 1997). 그러나 이들 시스템에 사용하는 유도물질 화합물들의 가격이 극히 고가이고 그 화학물질 자체가 주는 유독한 효과를 발생하기도 하며 모든 식물에 적용되지 못하는 등의 문제점이 있다.
한국특허등록 제10-0781059호에는 환경스트레스에 의해 활성화되는 유도성 프로모터 및 상기 프로모터를 이용하여 공변세포에 특이적으로 목적단백질을 생산하는 형질전환 식물을 얻는 방법이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제10-0578461호에는 벼로부터 유래한 스트레스-유도된 프로모터가 개시되어 있으나, 본 발명의 프로모터와는 상이하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 환경 스트레스, 특히 건조(한발) 스트레스에 의해 유도되는 프로모터 개발에 노력한 결과, 벼 유래의 특정 프로모터가 환경 스트레스에 의해 강하게 유도된다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래의 환경 스트레스 유도성 프로모터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프로모터를 이용하여 식물의 환경 스트레스 내성을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명이 제공하는 프로모터와 이를 이용하여 환경스트레스 저항성 형질전환 식물의 품종개발 기술은 다양한 경제작물의 수확량 증대 등에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 프로모터에 의해 조절되는 내재 유전자 발현양을 비교한 것이다. 패널 A에서, DAG는 days after germination을 나타내며, "-"는 한발 스트레스 처리 전 상태를 나타내며, "+"는 한발 스트레스 처리 후 상태를 나타낸다. 패널 B에서, 예를 들면, 7d는 한발 스트레스 처리 전 상태를 나타내며, 7d-dro는 한발 스트레스 처리 7일 후 상태를 나타낸다.
도 2는 환경 스트레스 유도성 프로모터 활성 분석용 벼 형질전환 운반체 모식도이다.
도 3은 형질전환 벼 종자 내에서의 GFP 형광 발현 결과이다. NT, non-transgenic (cv. Nakdong); Wsi18, Wsi18 프로모터; Lea3, Lea3 프로모터; Uge1, Uge1 프로모터; R1G1B, R1G1B 프로모터; NCED3, NCED3 프로모터; PSY2 , PSY2 프로모터; DXS2, DXS2 프로모터.
도 4는 형질전환된 어린 식물체의 잎에서의 GFP 형광 발현 결과이다. 왼쪽 패널(Normal)은 스트레스를 처리하지 않은 식물체의 잎이고, 오른쪽 패널(Drought)은 한발 스트레스 4시간 처리 후의 GFP 발현 그림이다. NT, non-transgenic; Wsi18, Wsi18 프로모터; Lea3, Lea3 프로모터; Uge1, Uge1 프로모터; R1G1B, R1G1B 프로모터; NCED3, NCED3 프로모터; PSY2 , PSY2 프로모터; DXS2, DXS2 프로모터. M, mesophyll cell; S, stomata; V, vascular bundle sheath. Bar=80 μm.
도 5는 형질전환된 어린 식물체의 뿌리에서의 GFP 형광 발현 결과이다. 왼쪽 패널(Normal)은 스트레스를 처리하지 않은 식물체의 뿌리이고, 오른쪽 패널(Drought)은 한발 스트레스 4시간 처리 후의 GFP 발현 그림이다. NT, non-transgenic; Wsi18, Wsi18 프로모터; Lea3, Lea3 프로모터; Uge1, Uge1 프로모터; R1G1B, R1G1B 프로모터; NCED3, NCED3 프로모터; PSY2 , PSY2 프로모터; DXS2, DXS2 프로모터. RA, root apex; RC, root cap; E, epidermis; V, vascular cylinder. Bar=100 μm.
도 6은 형질전환 벼 꽃에서의 GFP 형광 발현 결과이다. NT, non-transgenic; Wsi18, Wsi18 프로모터; Lea3, Lea3 프로모터; Uge1, Uge1 프로모터; R1G1B, R1G1B 프로모터. Lm, lemma; P, palea; An, anther; F, filament; Lo, lodicule. Bar=1mm.
도 7은 RT-PCR을 이용한 벼 식물체에서의 GFP 발현 양 관찰 결과이다. DAG는 days after germination을 나타내며, "0"는 한발 스트레스 처리 전 상태를 나타내며, "2" 및 "3"은 한발 스트레스 처리 후 상태를 나타내며, #1, #2 및 #3는 서로 다른 3가지 라인을 나타낸다.
도 8은 NCED3, PSY2, DXS2 프로모터의 발아 후 7일된 형질전환체에서의 GFP 발현을 한발 스트레스 처리 전과 후 Wsi18 프로모터와 비교한 결과이다. 회색 막대기는 한발 스트레스 처리 전의 RNA transcripts의 양을 나타내며, 검은색 막대기는 한발 스트레스 처리 후의 RNA transcripts의 양을 나타낸다.
도 9는 프로모터에 따른 스트레스 처리 후 시간 경과에 따른 벼 식물체에서의 GFP 발현 양의 변화를 관찰한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물 유전자 형질전환을 위한 환경 스트레스 유도성 프로모터를 제공하며, 더욱 구체적으로 서열번호 1 내지 서열번호 7의 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 벼 유래의 환경 스트레스 유도성 프로모터를 제공한다.
본 발명은 벼 유래의 특정 프로모터에 관한 것으로서, 구체적으로, 상기 프로모터는 서열번호 1의 Wsi18(water-stress induced protein 18) 프로모터, 서열번호 2의 Lea3(late embryogenesis abundant protein 3) 프로모터, 서열번호 3의 Uge1(UDP-glucose 4-epimerase 1) 프로모터, 서열번호 4의 R1G1B(early drought induced protein) 프로모터, 서열번호 5의 NCED3(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase 3) 프로모터, 서열번호 6의 PSY2(phytoene synthase 2) 프로모터, 서열번호 7의 DXS2(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase 2) 프로모터이다.
또한, 상기 프로모터 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1 내지 7의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 프로모터는 서열번호 1 내지 7의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 프로모터에 있어서, 상기 환경 스트레스는 건조, 고온, 냉해, 염해, 중금속 등일 수 있으며, 바람직하게는 건조(한발) 스트레스이다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다. 재조합 식물 발현 벡터의 일례로서, 도 2에 기재된 벡터를 예를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 식물 발현 벡터에서, 상기 식물 발현 벡터는 본 발명의 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동가능하게 연결시켜 제조된 것일 수 있다. 본 발명에서, "작동가능하게 연결된"은 이종 단백질을 발현하기 위한 단위로서 기능하는 발현 카세트의 성분을 말한다. 예를 들면, 단백질을 코딩하는 이종 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터는 이종 DNA에 해당하는 기능적 mRNA의 생산을 촉진한다.
상기 목적 단백질은, 모든 종류의 단백질일 수 있으며, 예컨대 효소, 호르몬, 항체, 사이토카인 등의 의학적 활용성이 있거나, 사람을 포함한 동물의 건강을 증진시킬 수 있는 영양성분을 다량 축적할 수 있는 단백질이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 목적 단백질의 일예로는, 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 성장 인자, 인간 혈청 알부민, 에리스로포이에틴 등이 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터로 식물체를 형질전환시킨 후, 형질전환된 식물체에 환경 스트레스를 가하여 상기 식물체 내에서 목적 단백질이 생산되도록 하는 것을 특징으로 하는 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 생산된 목적 단백질은 전술한 바와 같다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.
"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환 식물의 제조 방법에 의해 제조된 형질전환 식물을 제공한다. 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있으며, 바람직하게는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파와 같은 단자엽 식물일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 프로모터를 식물에 도입함으로써 식물의 환경 스트레스 내성을 향상시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 프로모터에 스트레스 내성을 향상시키는 구조유전자를 작동가능하게 연결하여 식물에 도입함으로써 수행될 수 있다. 상기 스트레스 내성을 향상시키는 구조유전자는 탈수, 저온 또는 염 스트레스와 같은 환경 스트레스에 대한 식물의 내성을 향상시키는 데 역할을 담당하는 단백질을 암호화한다. 그의 예는 다음을 포함한다: LEA 단백질; 물 채널 단백질; 상용성 용질의 합성효소; 담배의 해독 효소; 삼투압조절 물질(예컨대 설탕, 프롤린, 또는 글리신베타인)에 대한 합성효소; 세포막 지질의 변형 효소인 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 w-3 지방산 불포화화효소 및 남조류의 D9-불포화화효소를 암호화하는 유전자; 프롤린 합성의 주요 효소인 P5CS; 및 갈락티놀 합성을 위한 AtGolS3 유전자.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 프로모터 서열(promoter sequence) 예측(prediction) 및 추출(extraction)
기존의 보고된 환경 스트레스 유도 단백질 유전자인 Wsi18, Lea의 서열을 IRGSP(International Rice Genome Sequencing Project) 서열과 blast N을 수행하여 예측한 프로모터 지역과 TIGR(The Institute for Genomic Research)의 annotation data와 3'-Tiling 300k 마이크로어레이 데이타를 근거로 한 프로모터 지역을 분리하여 벼 형질전환용 벡터 제작에 사용하였다. coding sequence (CDS)의 ATG 위치에서부터 약 2 킬로베이스페어(kb) 위쪽(upstream)까지의 서열을 프로모터 지역으로 예측하고, 이 서열을 전체 크기가 1.8-2 kb 정도의 프로모터를 분리하기 위한 PCR Primer 제작용 주형(template)으로 사용하였다.
2. 프로모터(promoter)의 증폭(amplification) 및 분리(isolation)
예측된 2 kb의 프로모터 서열을 주형으로, primer designer 4 software ver.4.20(Sci-Ed Software, Durham, NC)을 이용, 전체 크기가 약 1.8-2 kb 정도의 프로모터를 분리하기 위한 PCR 프라이머를 디자인하였다. 디자인 조건은 PCR 조건이 프라이머의 GC% 범위가 40-60%, Tm 범위 55-65℃, salt 및 free Mg의 농도를 각각 0, 0.15 mM로 하였다. 프라이머 (PCR primer)는 그 길이가 주형 특이적 영역(template-specific region)이 20 베이스페어 (bp), 5' 어댑터 서열(adaptor sequence)이 12 bp가 되도록 하였다. 이 어댑터 서열은 기존의 제한효소(restriction enzyme)와 DNA ligase(DNA 접합효소)를 이용한 클로닝 방법이 아닌 site-specific recombination(Gateway
Figure PCTKR2010001793-appb-I000001
CloningTechnology, Invitrogen, Carlsbad, CA)을 위해 삽입한 서열이다. PCR 반응의 주형으로 사용할 DNA는 자포니카형 (japponica type) Nipponbare 품종 (cultivar)의 벼를 파종하여, 온실에서 3주간 키운 후, 잎 부분만 절제하여, genomic DNA를 추출하였다. genomic DNA는 우선 절제한 잎을 액체 질소로 급 냉동시키고, 막자사발을 이용하여 곱게 마쇄한 후, DNAzol(Cat. No. DN128, Molecular research center, USA) 용액을 이용하여 분리하였다. PCR 반응은 두 단계로 나누어서 진행하였다. 1차 반응은 벼의 게놈 (genome)에서 특정 프로모터를 분리하기 위한 반응으로, 12 bp 어댑터 서열로 연결된 전체 크기 32 bp 주형 특이적 서열 프라이머(template-specific sequence primer)를 사용한다. 프라이머 서열은 아래와 같다.
주형 특이적 정방향 프라이머: 5'-AAAAAGCAGGCT-주형 특이적 서열-3'
주형 특이적 역방향 프라이머: 5'-AGAAAGCTGGGT-주형 특이적 서열-3'
1차 PCR은 genomic DNA 50 ng, 2X Taq premix (Cat. No. EP051020-T2B6-1, Solgent, Korea), 주형 특이적 프라이머 각각 10 pmol, 전체 50 ul 반응으로, 95℃ 1분, 55℃ 1분, 68℃ 2분, 30 사이클로 진행하였다.
2차 반응은 프로모터를 형질전환용 벡터에 삽입하기 위해 필요한 특정 adaptor sequence (att site)를 삽입, 증폭하기 위해 실시하였다. 프로모터에 부가적으로 삽입되어야 할 서열의 길이는 약 29 bp로, PCR의 효율을 높이기 위하여 이 서열의 일부 (12 bp)만을 주형 특이적 서열에 overhang으로 달아 첫 번째 PCR을 시행한 후, 이 PCR 반응액의 1/50 (1 ul)을 취해 다시 전체 재조합 서열을 갖는 프라이머 (어댑터 서열 프라이머)로 두 번째 PCR 반응을 한다. 따라서, 이 반응물은 벼의 프로모터와 재조합을 위한 att sequence를 모두 갖게 된다. 어댑터 서열 프라이머의 서열은 아래와 같다.
attB1 adaptor primer: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'(서열번호 8)
attB2 adaptor primer: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'(서열번호 9)
2차 PCR은 1차 PCR 반응물 1 ul, 2X Taq premix(Cat. No. EP051020-T2B6-1, Solgent, Korea), 어댑터 프라이머 각각 2 pmol, 전체 50 ul 반응으로, 95℃ 30초, 45℃ 30초, 68℃ 2분, 5 사이클 후, 다시 95℃ 30초, 55℃ 30초, 68℃ 2분, 20 사이클로 진행하였다. 위의 PCR 방법은 Gateway System(Cat. No.12535-029, Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하기 위해 Invitrogen에서 제시한 방법으로 수행하였다.
3. 증폭된 프로모터의 클로닝
Gateway system(Cat. No.12535-029, Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 벼 형질전환용 운반체에 삽입하였다. 먼저, 증폭시킨 프로모터는 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동 후, 겔 상에서 band isolation 및 Mega-spin agarose gel extraction kit (Cat. No.17183, Intron, Korea)으로 정제(purification)하였다. 정제한 프로모터 5 ul, BP clonase enzyme mixture 4 ul, 5X BP 반응 버퍼 4 ul, pDONR 벡터 300 ng/2 ul, TE 버퍼 (10 mM Tris/pH8.0, 1mM EDTA), 전체 20 ul BP 반응을 25℃, 16시간 동안 수행하였다. 이후, 이 반응물에 LR clonase enzyme mixture 6 ul, 0.75M NaCl 1 ul, 형질전환용 운반체 450 ng/3 ul 첨가하여 전체 30 ul, 25℃, 8시간 동안 LR 반응시켰고, proteinase K 3 ul를 첨가, 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 이 중 2 ul를 취해 DH5α competent cell에 형질전환하였다. 형질전환시킨 DH5α 세포는 50 ug/ml spectinomycin 항생제를 포함한 LB agar 배지에 깔고, 37℃ 항온기에서 12시간 키운 후, 항생제 저항성을 가진 선발된 세포에서 DNA를 추출하여 프로모터가 삽입되어 있는지를 PCR 반응을 통하여 확인, sequencing 및 예측했던 프로모터 서열과 BLAST N을 수행, 분리한 프로모터의 완전한 삽입을 확인하였다.
벼 형질전환용 운반체(pMJ401)는 다음과 같다. 오른쪽 경계 서열(right-border sequence)과 왼쪽 경계서열(left-border sequence) 사이에 재조합 후 프로모터와 교체가 될 카세트가 3' 방향에 마커 유전자 (visiable marker gene)인 GFP와 PINII (protease inhibitor II) 터미네이터로 연결되어 있다. 이 카세트는 BP 및 LR 반응을 수행할 수 있도록 attR 서열을 가지고 있다. 선발 유전자 (selectable marker gene)는 제초제 저항성 유전자 Bar gene(bar, phosphinothricin acetyltransferase gene)이 CaMV35S 프로모터에 의해서 조절되도록 제조되었고, 이 유전자는 NOS (nopalin synthase) 터미네이터로 연결되어 있다. 또한, 오른쪽 경계 서열(right-border sequence) 말단에 MAR sequence를 장착함으로써 염색체 내 도입부위에 따른 발현 양의 변화를 최소화하여 프로모터 고유의 활성만을 측정할 수 있도록 하였다.
4. 아그로박테리움(Agrobacterium-mediated)을 이용한 벼의 형질전환(transformation)
낙동 벼 종자(Oryza sativa L. cv Nakdong)를 겉 호영만 제거한 후, 70%(v/v) 에탄올을 첨가하고, 1분 동안 가볍게 흔들어 씻어냈다. 씻어낸 종자들은 다시 20% chlorax 에 넣어 1시간 동안 흔들어 소독하고, 멸균수로 여러 번 세척하였다. 세척한 벼 종자는 형질전환을 위해, 장 (Jang)에 의해 기술된 바와 같이(Jang et al., Mol breeding, 5:453-461, 1999) 캘러스 유기 배지 (2N6)에서 한 달간 배양하여 배아 캘러스(embryonic callus)를 유기한 후, Agrobacterium triple mating 방법으로 얻은 형질전환용 아그로박테리움과 공동배양(co-cultivation) 하여 상기 프로모터가 삽입된 형질전환 운반체를 벼 게놈에 삽입시킨 후, 형질전환된 캘러스 선택 배지(2N6-CP)에서 한 달간 배양하였다. 이후, 선택적으로 자란 세포들을 골라 재분화 배지(MS-CP)에서 한 달에서 두 달간 배양 후 재분화된 식물체를 온실에서 순화시켰다. 순화된 T0 벼는 비선택성 제초제인 바스타 (basta) 처리를 하여 제초제 저항성을 보이는 식물체만 골라 후대 검정을 하였다.
5. 벼 기관별 GFP 형광 발현 관찰
프로모터의 활성 분석을 위하여 사용한 visible 마커 유전자 GFP의 발현 확인은 종자, 발아 후 7일이 지난 모의 잎과 뿌리, 출수 전의 꽃 기관에서 한발 스트레스 처리 전과 후에 관찰하였다. 유전자의 발현 관찰은 유전자 삽입 및 분리가 확실히 관찰될 수 있는 T2, T3 단계에서 실시하였다. 종자에서의 GFP 형광 발현은 종자를 종단, 횡단면으로 잘라 luminescent image analyzer (LAS 3000, Fuji, Tokyo, Japan)과 stereomicroscope (SZX9-3122, Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 배와 배유에서 GFP 형광 발현을 관찰하였다. LAS3000의 조건은 precision, standard, exposure time 1초 (excitation filter 460 nm, barrier filter 510 nm)로 하였다. 종자에서 GFP 형광 발현을 관찰한 종자들은 다시 에탄올과 20% chlorax 용액에 소독, selectable marker bar gene의 활성 확인을 위하여, PPT 성분이 함유되어 있는 MS-P배지 (PPT 4 mg/l) 암 상태에서 이틀간 발아시킨 후, 광 조건의 항온기(incubator chamber)에서 닷새 동안 키운 후, 실온에서 4시간 동안 식물체를 말려 confocal microscope (Zen 2009 LE, Carl Zeiss, USA)로 유전자 발현을 관찰하였다. 꽃에서의 환경 스트레스에 의한 유전자 발현 유도 여부 확인은 꽃이 출수하기 직전에 식물체가 화분에 심어져 있는 상태 그대로 온실 안에서 3일 동안 물을 주지 않고, 방치한 후 채취하여 stereomicroscope (SZX9-3122, Olympus, Tokyo, Japan)을 이용, 꽃의 호영을 제거하기 전과 후를 관찰, 기관별 GFP 발현을 관찰하였다.
6. RT-PCR(reverse-transcriptase PCR)을 통한 내재 유전자 (endogenous gene) 발현 양상 관찰
발아 후 20일, 30일, 60일이 지난 낙동 벼의 잎과 뿌리, 출수 전 꽃 기관의 한발 스트레스 처리 전과 후, 그리고 종자에서 total RNA를 추출하였다. 한발 스트레스는 식물체를 뿌리째 뽑아 공기 중에서 2시간 말려 처리하였다. total RNA 추출에는 RNeasy plant mini kit (Cat. No. 74904, Qiagen, Valencia, CA)을 사용하였다. 추출한 total RNA 400 ng으로 first strand cDNA 합성을 하였고 (Cat. No. 18080-051, Invitrogen, Carlsbad, CA), 이 cDNA 합성 반응물 2 ul (cDNA 2μg)를 취해 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 두 종류의 프라이머를 사용하였다. 첫 번째 프라이머는 내재 유전자에 특이적인 프라이머 (gene-specific primer)이고, 두 번째 프라이머는 사용한 cDNA 양(loading control) 비교를 위한 프라이머(OsUbi-specific primer)이다. 프라이머 서열은 아래와 같다.
Wsi18-specific forward primer: 5'-GCGAAGGACGCGGTGATGTA-3'(서열번호 10)
Wsi18-specific reverse primer: 5'-GACACCGAACACGTCGAAGT-3'(서열번호 11)
Lea3-specific forward primer: 5'-GGCGAAGGACAAGACCTCCA-3'(서열번호 12)
Lea3-specific reverse primer: 5'-CACCTGCTCACTCGCCTGTT-3'(서열번호 13)
Uge1-specific forward primer: 5'-CTGGAGATGCCGAGATCGTT-3'(서열번호 14)
Uge1-specific reverse primer: 5'-GCTGCTACTGGAGGATTGGA-3'(서열번호 15)
R1G1B-specific forward primer: 5'-AGTCCTGAGTGCTCCAATTC-3'(서열번호 16)
R1G1B-specific reverse primer: 5'-GAGCAGTGCAGGCACAATTA-3'(서열번호 17)
NCED3-specific forward primer: 5'-TTGCACGGCACCTTCATTGG-3'(서열번호 18)
NCED3-specific reverse primer: 5'-ACGCGGTCGTTGTCTGCACT-3'(서열번호 19)
PSY2-specific forward primer: 5'-CGAGATCGAGGCCAACGATT-3'(서열번호 20)
PSY2-specific reverse primer: 5'-ACAGCATTATGCAAGAGTAG-3'(서열번호 21)
DXS2-specific forward primer: 5'-TGAAGGAGCACGGCATCTAC-3'(서열번호 22)
DXS2-specific reverse primer: 5'-CCTCCTCAAGCTGGTCTACT-3'(서열번호 23)
OsUbi-specific forward primer: 5'-ATGGAGCTGCTGCTGTTCTA-3'(서열번호 24)
OsUbi-specific reverse primer: 5'-TTCTTCCATGCTGCTCTACC-3'(서열번호 25)
PCR 조건은 PTC200 PCR machine (MJ research), cDNA 2 ul, 2X Taq premix (Cat. No. EP051020-T2B6-1, Solgent. Korea), 주형 특이적 프라이머 각각 10 pmol, 전체 20 ul 반응으로, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분, 28 사이클로 진행하였다.
7. RT-PCR(reverse-transcriptase PCR)을 통한 GFP 발현 양 관찰
발아 후 20일, 60일이 지난 형질전환 벼의 잎과 뿌리, 출수 전 꽃 기관의 한발 스트레스 처리 전과 후, 그리고 종자에서 total RNA를 추출하였다. 한발 스트레스는 성숙한 식물체를 뿌리째 뽑아 공기 중에서 2시간 말려 처리하였다. total RNA 추출에는 RNeasy plant mini kit (Cat. No. 74904, Qiagen, Valencia, CA)을 사용하였다. 추출한 total RNA 400 ng으로 first strand cDNA 합성을 하였고 (Cat. No. 18080-051, Invitrogen, Carlsbad, CA), 이 cDNA 합성 반응물 2 ul (cDNA 2μg)를 취해 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 두 종류의 프라이머를 사용하였다. 첫 번째 프라이머는 프로모터간 삽입된 GFP의 발현 양을 상대 비교하기 위한 프라이머 (GFP-specific primer)이고, 두 번째 프라이머는 사용한 cDNA 양(loading control) 비교를 위한 프라이머 (OsUbi-specific primer)이다. 프라이머 서열은 아래와 같다.
GFP-specific forward primer: 5'-CAGCACGACTTCTTCAAGTCC-3'(서열번호 26)
GFP-specific reverse primer: 5'-CTTCAGCTCGATGCGGTTCAC-3'(서열번호 27)
OsUbi-specific forward primer: 5'-ATGGAGCTGCTGCTGTTCTA-3'(서열번호 24)
OsUbi-specific reverse primer: 5'-TTCTTCCATGCTGCTCTACC-3'(서열번호 25)
PCR 조건은 PTC200 PCR machine (MJ research), cDNA 2 ul, 2X Taq premix (Cat. No. EP051020-T2B6-1, Solgent. Korea), 주형 특이적 프라이머 각각 4 pmol, 전체 20 ul 반응으로, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분, 27-30 사이클로 진행하였다.
8. Real-time PCR을 통한 GFP 발현 양 관찰
상기 7의 RT-PCR에 사용하였던 cDNA를 주형으로 하여, 실시간(real-time) PCR을 수행하였다. PCR 반응은 Mx3000p Real-Time PCR machine (Stratagene, La Jolla, CA)을 이용, TaqMan
Figure PCTKR2010001793-appb-I000002
universal PCR mastermix (AppliedBiosystems, NewJersey, USA)를 사용하였고, 프라이머 쌍과 프로브는 Assays-by-DesignSM Service (Applied Biosystems, NewJersey, USA)를 이용하였다. 이 프로브 세트는 standard curve에서 PCR 효율(efficiency)이 97% 이상이었다. PCR 조건은 cDNA 2 ul, 2X TaqMan
Figure PCTKR2010001793-appb-I000003
universal PCR mastermix 10 ul, 20X 프로브 1 ul, 전체 20 ul 반응으로, 50℃ 2분 1 사이클, 95℃ 10분 1 사이클, 40 사이클의 95℃ 30초, 60℃ 1분으로 진행하였다. 사용한 프라이머와 프로브 서열은 다음과 같다.
GFP-specific forward primer: 5'-ACGTGAACGGCCACAAGTT-3'(서열번호 28)
GFP-specific reverse primer: 5'-GGTCAGCTTGCCGTAGGT-3'(서열번호 29)
GFP probe: 5'-CCCTCGCCGGACACG-3'(서열번호 30)
OsUbi-specific forward primer: 5'-GCCAAGATCCAGGACAAGGA-3'(서열번호 31)
OsUbi-specific reverse primer: 5'-GCCATCCTCCAGCTGCTT-3'(서열번호 32)
OsUbi probe: 5'-ACCAGCAGCGTCTCAT-3'(서열번호 33)
실시예 1. 프로모터에 의해 조절되는 내재 유전자 발현 양의 비교
프로모터들을 분리하기 전에, 이 프로모터들에 의해 발현이 조절되는 내재 유전자(endogenous gene)들의 발현 양을 낙동 벼에서 관찰하였다(도 1). 전 발달 단계, 대표적인 기관들에서 스트레스 처리 전과 처리 후, total RNA를 추출하여, 각 유전자들에 특이적인 프라이머를 제작하여 RT-PCR을 수행하였다. 예상대로, 스트레스 처리 전에는 거의 발현되지 않다가, 처리 후 그 발현 양이 현격히 증가함을 관찰하였고, 따라서 이 유전자들의 프로모터들을 분리하였다. Wsi18, Lea3, Uge1 유전자는 종자에서도 발현하였고, 전 발달단계에서 스트레스 처리 후에 발현 양이 현격히 증가하였다. 특히 Lea3는 종자에서의 발현 양이 다른 프로모터들보다 가장 높았고, 잎과 뿌리 모두에서 발현율이 우수하였다. Wsi18은 스트레스 처리 후에 특히 뿌리에서의 발현 양이 잎보다 훨씬 우수하였다. Uge1은 꽃에서의 유도성은 그리 높지 않았지만, 잎과 뿌리에서는 발현율이 다른 프로모터들과 비슷하였다. R1G1B는 basal level expression이 다른 프로모터들에 비해서 높고, 종자에서는 거의 발현을 하지 않았다. 이 유전자는 발아 후 20일째에는 발현율이 그다지 높지 않았으나, 그 이후의 발달 단계에서는 발현 양이 증가하였다. NCED3, PSY2, DXS2 프로모터도 캘러스, 종자, 발아 후 7일, 20일, 30일, 60일 그리고 꽃 단계에서 스트레스 처리 전과 후에 관찰하였다. 위의 프로모터들과는 다르게 종자에서는 전혀 발현을 하지 않았고, 전 발달단계의 vegetative tissue에서 스트레스 처리 후 발현 양이 증가하였다.
실시예 2. 프로모터의 증폭을 위한 프라이머 서열 디자인
벼의 게놈에서 본 발명의 특정 프로모터를 분리하기 위한 프로모터 특이적 프라이머 서열은 하기와 같다.
① 프로모터 특이 프라이머 서열(promoter-specific primer sequence)
a. Wsi18 프로모터 프라이머
forward primer: 5'-AAAAAGCAGGCTCTAATATTATCAGCCCGGAG-3'(서열번호 34)
reverse primer: 5'-AGAAAGCTGGGTACCAACACACGAACTGAAAC-3'(서열번호 35)
b. Lea3 프로모터 프라이머
forward primer: 5'-AAAAAGCAGGCTTCACATGCAGCGATATGAAT-3'(서열번호 36)
reverse primer: 5'-AGAAAGCTGGGTGCGCGAATGTTAGAACTCTG-3'(서열번호 37)
c. Uge1 프로모터 프라이머
forward primer: 5'-AAAAAGCAGGCTCGATCGAATGACGGACGTTA-3'(서열번호 38)
reverse primer: 5'-AGAAAGCTGGGTGTGTGTGGGGTTTGATGAAG-3'(서열번호 39)
d. R1G1B 프로모터 프라이머
forward primer: 5'-AAAAAGCAGGCTATAGCTGTTGTACTGATGTC-3'(서열번호 40)
reverse primer: 5'-AGAAAGCTGGGTCTCTCGCAGTATTACCAACA-3'(서열번호 41)
e. NCED3 프로모터 프라이머
forward primer: 5'-AAAAAGCAGGCTTCCAGCTAGTTCCAGCTAAG-3'(서열번호 42)
reverse primer: 5'-AGAAAGCTGGGTTGGTGAGACGCGGCCAAGAT-3'(서열번호 43)
f. PSY2 프로모터 프라이머
forward primer: 5'-AAAAAGCAGGCTCTACGTTCGTCGTTCCTCAC-3'(서열번호 44)
reverse primer: 5'-AGAAAGCTGGGTGTCGACGAACACGCGTTGCC-3'(서열번호 45)
g. DXS2 프로모터 프라이머
forward primer: 5'-AAAAAGCAGGCTACGCATGCTCTTATCGTAGG-3'(서열번호 46)
reverse primer: 5'-AGAAAGCTGGGTTACCGCGACGCAGCAAGCAAG-3'(서열번호 47)
② 재조합용 프라이머 서열(attB1, attB2 sequence, Invitrogen)
attB1 adaptor primer: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'(서열번호 8)
attB2 adaptor primer: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'(서열번호 9)
③ cDNA 증폭용 프라이머 서열
GFP-specific forward primer: 5'-CAGCACGACTTCTTCAAGTCC-3'(서열번호 26)
GFP-specific reverse primer: 5'-CTTCAGCTCGATGCGGTTCAC-3'(서열번호 27)
OsUbi-specific forward primer: 5'-ATGGAGCTGCTGCTGTTCTA-3'(서열번호 24)
OsUbi-specific reverse primer: 5'-TTCTTCCATGCTGCTCTACC-3'(서열번호 25)
실시예 3. 본 발명의 프로모터 서열의 분리
본 발명에서 분리한 벼 유래의 환경 스트레스 유도성 프로모터 서열은 하기와 같다: ① Wsi18 프로모터 서열(1887bp); AK064074 (서열번호 1), ② Lea3 프로모터 서열(1963bp); AK119713 (서열번호 2), ③ Uge1 프로모터 서열(1889bp); AB087745 (서열번호 3), ④ R1G1B 프로모터 서열(1799bp); AF503583 (서열번호 4), ⑤ NCED3 프로모터 서열(1938bp); AK119780 (서열번호 5), ⑥ PSY2 프로모터 서열(1928bp); AK108154 (서열번호 6), ⑦ DXS2 프로모터 서열(1863bp); AK100909 (서열번호 7). 프로모터에 의해 조절되는 유전자의 accession number를 각 프로모터 뒤에 표시하였다.
실시예 4. 벼 형질전환용 벡터 제작
벼 형질전환용 벡터를 제작하였으며, 도 2에 도시하였다. 도 2의 A는 PCR로 분리한 프로모터를 클로닝하기 위한 모벡터인 pMJ401이다. attR1, attR2 site는 BP 반응 후 프로모터가 가지고 있는 attL1, attL2 서열과 재조합(site-specific recombination)이 일어나는 부위로, LR 반응 후, 프로모터는 카세트와 교체되고 attR1, attR2 서열도 attB1, attB2 서열로 교체된다. 각 유전자에 대한 설명은 하기와 같다. MAR: matrix attachment region(1.3kb), X98408; cassette B: conversion cassette B(1.7kb), invitrogen, Cat. No. 11828-019; GFP: modified green fluorescent protein gene(0.74kb), U84737; TPINII: protease inhibitor II terminator(1.0kb), X04118; P35S: CaMV 35S 프로모터(0.92kb); Bar: phosphinothricin acetyltransferase gene(0.59kb), X17220; TNOS: nopaline synthase terminator(0.28kb).
도 2의 B는 삽입되는 본 발명의 프로모터를 나타낸다. 각 프로모터에 대한 설명은 하기와 같다: P Wsi18 , Wsi18 프로모터 서열(1886bp); AK064074; P Lea3 , Lea3 프로모터 서열(1963 bp); AK119713; P Uge1 , Uge1 프로모터 서열(1889bp); AB087745; P R1G1B, R1G1B 프로모터 서열(1799bp); AF503583; P NCED3, NCED3 프로모터 서열(1938bp); AK119780; P PSY2, PSY2 프로모터 서열(1952bp); AK108154; P DXS2, DXS2 프로모터 서열(1863bp); AK100909.
실시예 5. 형질전환 벼 종자 내에서의 GFP 형광 발현
각 프로모터 운반체를 형질전환시킨 벼로부터 T2, T3 단계 후대 획득 후, 종자를 종단, 횡단면으로 잘라 stereomicroscope (SZX9-3122, Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 GFP 발현을 관찰하였다. 형질전환을 시키지 않은 대조구(NT)에서는 종자 전체적으로 GFP가 발현되지 않았다. 새롭게 개발한 환경 유도성 프로모터들의 GFP 발현 패턴은 크게 두 가지로 나뉘었다. Wsi18 프로모터, Lea3 프로모터는 종자의 배 뿐만 아니라 배유에서도 강한 GFP 발현을 보였다. 종자 내에서 단백질 발현 양이 제일 높다고 알려진 호분층(aleurone layer)뿐만 아니라, 전분(starch)이 대부분인 배유의 내부 녹말 저장 세포에서도 GFP가 발현되었다. R1G1B 프로모터는 배유에서는 거의 발현되지 않았고, 배와 호분층(aleurone layer)에서만 발현되었다. NCED3, PSY2, DXS2 프로모터는 내재 유전자와 마찬가지로 종자에서는 거의 발현되지 않았다. 반면에, Uge1 프로모터는 내재 유전자의 발현과는 다르게, 배에서만 약하게 발현되었다.
실시예 6. 형질전환된 어린 식물체에서의 GFP 형광 발현
각 프로모터 운반체로 형질전환시킨 벼를 T2 단계까지 진전시켜 후대 획득 후, 그 종자에서 호영을 벗겨 내고 stereomicroscope (SZX9-3122,Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 GFP 발현을 관찰하여 동형접합체(homozygote)인지를 확인하였다. 확인된 종자들은 종자 소독 후, 항온기(27℃)에서 7일 동안 키운 후, 실온에서 4시간 동안 식물체를 말려 confocal microscope (Zen 2009 LE, Carl Zeiss, USA)로 GFP 형광 발현을 잎(도 4)과 뿌리(도 5)에서 관찰하였다. 도 4 및 도 5에서, 왼쪽 패널(Normal)은 스트레스를 처리하지 않은 상태의 식물체의 잎과 뿌리이고, 오른쪽 패널(Drought)은 한발 스트레스 처리 4시간 후의 GFP 발현 confocal image이다. 도 4 및 도 5와 같이, 형질전환을 시키지 않은 대조구(NT)는 GFP가 발현되지 않았지만, 모든 환경 유도성 프로모터들은 정도의 차이가 있지만, 한발 스트레스에 의하여 잎과 뿌리에서 형광이 유도되는 것을 관찰하였다. Wsi18과 NCED3 프로모터는 잎에서의 발현 양과 유도성이 우수하였다. R1G1B와 PSY2 프로모터는 스트레스를 처리하지 않은 잎에서 형광 발현을 보였지만, 스트레스 처리 후에 발현이 증가함을 관찰할 수 있었다. 이는 내재 유전자의 발현 양상을 관찰한 결과와 같다. 특히, R1G1B 프로모터는 기공에서의 발현이 우수하였으며, 발현 양이 다른 프로모터들보다 잎과 뿌리 모두 높았고, PSY2 프로모터는 기공에서는 발현하지 않고, 세포질에서의 발현이 특이하였다. 하지만, Lea3와 Uge1 프로모터는 내재 유전자의 발현과는 달리 잎에서의 유도성이 낮았다.
실시예 7. 형질전환 벼 꽃에서의 GFP 형광 발현
종자 및 어린 묘에서 GFP 발현을 균등(homozygous)하게 보이는 T2 후대 종자를 온실에 파종하여 꽃이 출수하기 직전에 빛 조건의 온실, 자연 풍에 화분 상태로 물을 주지 않은 채, 3일 동안 말린 후, 채취하여 스트레스를 처리 전과 처리 후, stereomicroscope (SZX9-3122, Olympus, Tokyo, Japan)을 이용, 꽃의 호영을 제거하기 전과 후, 조직별 GFP 발현을 관찰하였다(도 6). 7일 유식물체에서 관찰하였듯이, 스트레스를 처리하지 않은 상태에서는 꽃에서도 유전자가 발현을 하지 않았다. 하지만, R1G1B의 경우에는 다른 환경 유도성 프로모터와 달리 스트레스를 처리하지 않은 상태에서도 꽃의 전체에서 GFP가 강하게 발현하였다. 이는 R1G1B 프로모터가 환경 스트레스 유도성 프로모터이면서, 그 유전자의 발현에 있어 그 외 다른 프로모터들과 구별되는 기작을 가지고 있음을 나타낸다. 전체적으로 Uge1 프로모터를 제외한 모든 프로모터가 vegatative tissue에서처럼 스트레스 처리 후 꽃의 모든 기관에서 GFP가 발현하였다.
실시예 8. RT-PCR을 이용한 벼 식물체에서의 GFP 발현 양 관찰
발아 후 20일, 60일이 지난 벼의 잎과 뿌리, 출수 전의 꽃 기관, 종자에서 한발 스트레스 처리 전과 후의 total RNA를 추출하였다. 한발 스트레스는 성숙한 식물체를 뿌리째 뽑아 공기 중에서 2시간 말려 처리하였다. total RNA 추출은 RNeasy plant mini kit(Cat. No. 74904, Qiagen, Valencia, CA)을 사용하였다. 추출한 total RNA 400 ng으로 first strand cDNA 합성을 하였고 (Cat. No. 18080-051, Invitrogen, Carlsbad, CA), 이 cDNA 합성 반응물 2 ul를 취해 주형으로 PCR을 시행하여 증폭시킨 후, 1.2% 아가로스 겔에 전기영동(gel electrophosresis) 하였다. marker는 100 bp ladder 500ng을 사용하였고, 각 PCR product는 5 ul 씩 loading 하였다. GFP-specific primer로 증폭시킨 PCR 산물로, 프로모터간 삽입된 GFP의 발현 양을 상대 비교하기 위한 것으로 산물의 크기는 142 bp이다.
스트레스 처리 전에는 그 기본 발현 양(basal expression level)이 거의 없거나, 약간 발현하는 수준으로 다양하지만, 모든 프로모터가 vegatative tissue인 잎과 뿌리, reproductive organ인 꽃에서 스트레스에 의해 발현 양이 증가함을 관찰하였다(도 7). 이는 현미경으로 관찰한 GFP의 발현과 같다. Wsi18, Lea3, Uge1의 경우, 처리 전의 발현 양은 극히 미미하였으나, 스트레스에 의한 발현 양은 현저하게 증가하였다. 상기 세가지 프로모터, 특히, Wsi18의 경우, 서로 다른 3라인간의 발현 양의 증가가 다른 프로모터들에 비해 균일하였고, 뿌리에서의 발현 양의 증가는 상당히 우수하였다. Lea3은 현미경의 이미지와는 다르게 뿌리보다 잎에서의 발현 양의 증가가 현저하였고, 잎에서의 스트레스 처리 전의 발현 양은 다른 프로모터들보다 가장 낮았다. R1G1B 프로모터는 basal expression level이 가장 높았으나, 전 발달단계에서 스트레스에 의해 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 이 프로모터들은 종자와 꽃에서도 유전자의 삽입 부위가 서로 다른 3라인에서 모두 발현하는 것을 관찰하였다. 결과적으로, 이 프로모터들은 전 발달단계, 모든 식물체의 기관에서 스트레스에 의해 발현이 유도되어졌다.
실시예 9. real-time PCR을 이용한 벼 식물체에서의 GFP 발현 양 관찰
각 프로모터의 한발 스트레스 처리 후의 RNA transcripts의 양을 처리 전의 양으로 나누어 스트레스 후의 유전자 유도율을 비교하였다 (표 1).
표 1
20DAG 60DAG Flower
Leaf Root Leaf Root
Wsi18 53.1±28.6 325.5±189.8 36.7±12.8 237.2±205.6 492.2±82.2
Lea3 330.4±407.8 68.2±4.2 170.3±7.4 3.0±0.5 38.3±13.2
Uge1 287.5±31.3 9.3±6.4 46.9±14.2 16.9±7.2 2.3±0.1
R1G1B 1.5±0.8 5.7±3.8 5.0±2.7 8.8±3.6 9.1±3.3
발아 후 20일, 60일된 벼의 잎과 뿌리, 출수 전 꽃에서 서로 다른 3라인을 비교하였다. 한발 스트레스는 성숙한 식물체를 뿌리째 뽑아 공기 중에서 2시간 말려 처리하였다. Wsi18 프로모터는 뿌리와 꽃에서의 RNA 양이 스트레스 전보다 각각 237배, 492배 이상 증가하였고, 다른 프로모터들에 비해 유도율이 가장 높았다. Lea3 프로모터는 잎에서의 증가율이 170배 이상으로 다른 프로모터들과 비교하였을 때 가장 높았다. R1G1B 프로모터는 발현 양이 높은 것에 비해, 증가율은 다른 프로모터들에 비해 가장 낮았다.
NCED3, PSY2, DXS2 프로모터의 발아 후 7일된 형질전환체에서의 GFP 발현을 한발 스트레스 처리 전과 후 Wsi18 프로모터와 비교하였다(도 8). 한발 스트레스는 7일 자란 식물체를 뿌리째 뽑아 공기 중에서 2시간 말려 처리하였다. 각 프로모터의 서로 다른 6라인을 가지고 비교하였을 때, 전반적으로 NCED3 프로모터가 잎과 뿌리 모두에서 발현 양이 가장 높았으나 Wsi18 프로모터보다는 발현 양이 낮았고, 형광 이미지와는 다르게 DXS2 프로모터가 PSY2 프로모터보다 잎과 뿌리 모두에서 발현 양이 높았다.
실시예 10. 스트레스 처리 후 시간 경과에 따른 벼 식물체에서의 GFP 발현 양 변화
포장에서의 스트레스는 일시적인 것이 아니라 지속적인 것이므로, 이에 대한 프로모터의 활성 변화를 관찰하기 위하여, 30일 동안 키운 식물체를 뿌리째로 공기 중에서 말려 한발 스트레스 처리를 하고, 시간의 경과에 따른 잎에서의 프로모터 활성의 변화 추이를 관찰하였다(도 9). R1G1B, Wsi18 프로모터의 경우, 스트레스 처리 4시간까지 유전자의 발현이 증가하다가, 그 이후 유전자의 발현 양이 유지되거나 감소하였고, Uge1 역시 발현 양의 증가가 R1G1B, Wsi18처럼 현저하진 않지만, 기본 발현 양보다 4배 증가 후 발현 양이 유지됨을 관찰하였다. Lea3는 그 발현 양은 시간이 흐를수록 증가하였다. 8시간의 전 식물체의 공기 중에서의 한발 스트레스는 뿌리가 땅에 심겨져 있는 포장에서의 극심한 가뭄 스트레스와 맞먹으므로, 이들 프로모터들은 포장에서의 오랜 한발 스트레스에 대해서도 활성을 보일 것으로 보인다.
지금까지의 결과로 환경 유도성 프로모터는 크게 두 부류로 나뉘었다. 종자의 배와 배유에서 발현을 하고, 스트레스 처리 시 모든 기관에서 발현 양이 급격히 증가하는 Wsi18 프로모터, Lea3 프로모터, 주로 잎과 뿌리에서 발현이 유도되어지는 Uge1 프로모터, NCED3 프로모터, PSY2 프로모터 그리고 DXS2 프로모터, 종자의 배, 호분층에서 발현을 하고, basal expression level은 높지만 전 발달단계와 기관에서 스트레스에 의해 유도, 발현하는 R1G1B 프로모터이다. 또한, 이 프로모터들은 스트레스에 의해 유도되어지는 transcripts의 양과 유도율도 전부 달랐고, 시간의 경과에 따른 프로모터의 활성도 제각기 다른 특성을 가지고 있었다.

Claims (10)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 7의 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 벼 유래의 환경 스트레스 유도성 프로모터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 환경 스트레스는 건조 스트레스인 것을 특징으로 하는 프로모터.
  3. 제1항에 따른 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 상기 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조된 재조합 식물 발현 벡터.
  5. 제4항에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물체를 형질전환시킨 후, 형질전환된 식물체에 환경 스트레스를 가하여 상기 식물체 내에서 목적 단백질이 생산되도록 하는 것을 특징으로 하는 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 목적 단백질은 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 성장 인자, 인간 혈청 알부민 및 에리스로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제3항에 따른 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법.
  8. 제7항의 방법에 의해 제조된 형질전환 식물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 식물은 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물.
  10. 제1항에 따른 프로모터를 식물에 도입함으로써 식물의 환경 스트레스 내성을 향상시키는 방법.
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