KR100506514B1 - 돼지 대장균 설사증에 대한 경구 백신용 형질전환 식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 대장균 설사증에 대한 경구 백신용 형질전환 식물체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 장독성 대장균(Enterotoxigenic E. coli; ETEC) 유래의 필린(pilin) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 형질전환 식물체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형질전환 식물체, 이의 절편 또는 이의 추출물을 포함하는 백신 조성물 및 사료 첨가제는 돼지 대장균 설사증을 예방 또는 치료하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

돼지 대장균 설사증에 대한 경구 백신용 형질전환 식물체{Transgenic plant for an oral vaccine against E. coli-mediated diarrhea in pig}

본 발명은 돼지 대장균 설사증에 대한 경구 백신용 형질전환 식물체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 장독성 대장균(Enterotoxigenic E. coli; ETEC) 유래의 필린(pilin) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 형질전환 식물체에 관한 것이다.

양돈산업의 대규모 집단사육 추세에 따라 돼지의 설사병은 양돈장에서 가장 흔하고 또 문제시되는 질병으로 대두되고 있다(박영일, 선진문화사, 353-359, 1998). 최근 우리나라에서도 돼지의 설사병 발생이 증가하여 설사로 인한 어린 돼지의 성장지연 및 폐사로 사육농가에 경제적으로 커다란 손실을 초래하고 있는 실정이다(홍의철, 단국대학교 석사학위논문, 조기 이유 자돈에 있어 난황 항체의 첨가 효과, 2001). 특히, 병원성 대장균 감염에 의한 설사를 주 증상으로 하는 소화기 질병인 돼지 대장균 설사증은 우리나라의 거의 모든 사육농가에서 발생되는 질병이다. 돼지 대장균 설사증은 어린 돼지에서 많이 발생하며, 그 감염시기에 따라 신생자돈 설사, 포유자돈 설사 및 이유자돈 설사로 나뉜다. 태어난 지 수일 이내의 신생자돈은 위산 분비 기능 및 방어체계가 미흡하기 때문에 병원성 세균에 대해 저항력을 가지지 못한다. 특히, 초유의 불충분한 섭취, 주변 환경의 불량, 겨울철 불충분한 보온 등 여러 가지 스트레스 요인이 작용할 때는 그 증상이 심하여 폐사율이 높아지고 위축돈이 발생한다. 초유의 섭취를 통한 모체 이행 항체의 습득은 그 지속성이 2주 이후에 소실되기 시작하여 3주에는 거의 소실되므로 이 시기에 병원성 세균에 대한 저항력이 약해져서 포유자돈 설사를 일으키게 된다. 또한, 이유시기에 환경과 사료의 변화에서 오는 스트레스는 병원성 대장균의 감염과 발병을 용이하게 할 수 있다.

대장균의 감염에 의한 설사증은 병원성 대장균이 주로 오염된 사료나 물 등을 통한 경구감염에 의해 전파되며, 신생자돈에 있어서는 분변을 통한 감염이나 어미의 유두를 통한 감염이 주 경로이다. 병원성 대장균은 장관벽에 부착하여 증식한다. 이 때 질병을 일으키게 되는 중요한 두 가지 인자가 관련되는데, 그것은 집락형성 인자(colonization factor)와 독소(toxin) 생성 여부이다. 집락형성 인자는 대장균이 소장 점막에 부착하는데 중요한 역할을 하는 것으로 균체 밖으로 돌출된 단백질로 이루어진 작은 머리털 같은 구조를 이루며 필러스(pilus) 또는 섬모(fimbriae)라고 알려져 있다. 대장균 균체 외부에 돌출된 필러스 또는 섬모를 통해 장관 벽에 부착된 대장균은 장관 내에서 증식하며 여러 가지 독소를 생산한다.

돼지 설사증을 유발하는 대장균은 그 항원성에 따라 혈청형(serotype)이 나뉘어지는데, 그것들은 각각 O(somatic), K(capsular or microcapsular), H(flagellar) 및 F(fimbrial)이다. 국내에서 발생하는 돼지 대장균 설사증 중 가장 기본적인 발병 원인균들은 K 항원성으로 알려져 있다(박최규, 김노미 (1997) 국내 돼지 질병 역학조사 및 방제기술 연구; 자돈 설사병 발생상황 조사 연구, 농촌진흥청수의과학 연구소, pp.72∼78). K 항원성의 대표적인 대장균은 장독성 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli; ETEC)으로서 필린(pilin)이라는 특이적 표면 항원(surface antigen)을 가지고 있어 이를 통해 숙주세포의 장 점막 표면 수용체에 특이적으로 결합한 후 장독소(enterotoxin)를 분비함으로써 설사를 유발한다(Mooi FR et al., J. Bact. 150:512-52118, 1982). 상기 필린은 병원균의 집단화를 용이하게 해준다.

돼지 대장균 설사증을 예방 및 치료하기 위하여 많은 항생제를 사용하고 있으나, 항생제 오·남용시 돼지에게 내성 및 체내에 잔류될 가능성이 있기 때문에 현재 세계적으로 항생제 투여에 많은 제한을 두고 있다(Mason HS et al., Trends in Biotech. 13:388-392, 1995). 따라서, 돼지 대장균 설사증에 대한 안전한 백신의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

한편, 기존의 대장균 재조합 백신은 병원체의 오염을 근본적으로 배제하는 생산방법으로 안전하고, 생산비용이 저렴하며, 최적의 발현을 위한 유전학적 지식 및 돌연변이를 활용한 발현 벡터 체계가 완비되어 저비용 투입 대량생산에 적합하기 때문에 가장 바람직한 형태의 백신으로 알려져 있다(Haq TA et al., Science, 268: 714-716, 1995; Moffat AS, Science 268: 658-660, 1998). 그러나, 이와 같은 장점에도 불구하고, 번역 후 변형되는 일부 동식물 단백질의 경우 대장균과의 변형 체계의 차이로 인해 발현 단백질의 면역성이 저하되기도 하며, 재조합 대장균 백신의 경구투여시 장의 비우호적 조건에 의해 단백질이 파괴된다는 문제점이 있다(Amanda MW et al., Current Opinion in Biotech., 11: 126-129, 2000; Moffat AS, Science, 268: 658-660, 1998; Tacker CO et al., Microes and Infection, 1: 777-783, 1999). 따라서, 식물과 같은 고등생물의 발현체계를 이용할 경우 생물간의 차이에 따른 면역성 저하문제가 해결되어질 수 있으며, 함께 공급되는 식물 조직에 의해 항원이 위장의 적대적 조건들을 회피할 수 있게 한다는 점에서 매우 효용적이다(Kong Q et al., Proc. Nat. Aca. Sci., USA 98: 11539-11544, 2001). 식물에서의 항원 생산은 생산비용 및 효율성에서 대장균에 못지 않고, 병원체에서 항원으로 작용하는 일부의 단백질만을 발현시키기 때문에 병원균과의 오염 가능성이 배제되어 안전하며 식물체 자체를 먹는 것으로 이루어지는 접종 방법으로 인해 순수분리 등에 소요되는 비용이 절감되고 예방 목적의 이용에 수월하다(Dupont M (1999) Edible Vaccines. http://campus.fortunecity.com/sociology/729/edible _vaccines.htm). 이러한 점에서 식물체를 이용한 재조합 경구 백신의 개발이 활발해지는 추세이다.

이에 본 발명자들은 돼지 대장균 설사증에 대한 식물 백신을 개발하기 위하여 연구를 거듭하던 중, 돼지의 장 상피세포에 특이적으로 달라붙은 후 증식하여 독소를 생성하며 장상피를 자극시킴으로써 설사를 야기하는 장내 병독성 대장균의 부착용 단백질을 암호화하는 유전자가 도입된 형질전환 식물체가 돼지 대장균 설사증에 대한 경구용 백신으로서 효과적으로 사용될 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 돼지 대장균 설사증에 대한 경구용 백신으로 사용될 수 있는 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 식물체, 이의 절편 또는 이의 추출물을 포함하는 돼지 대장균 설사증의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 백신 조성물을 포함하는 돼지 대장균 설사증의 예방 또는 치료용 사료 첨가제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물 또는 상기 사료 첨가제를 이용하여 돼지 대장균 설사증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

나아가, 본 발명의 다른 목적은 식물체로부터 돼지 대장균 설사증을 유발하는 대장균의 부착용 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 장독성 대장균 유래의 필린 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 형질전환 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 장독성 대장균 유래의 필린 단백질을 암호화하는 유전자가 삽입된 식물 형질전환용 벡터로 식물 조직을 형질전환하고, 이로부터 식물체를 재분화시키는 것을 포함하는, 장독성 대장균 유래의 필린 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 형질전환 식물체, 이의 절편 또는 이의 추출물을 포함하는 돼지 대장균 설사증의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 백신 조성물을 포함하는 돼지 대장균 설사증의 예방 또는 치료용 사료 첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 백신 조성물 또는 상기 사료첨가제를 돼지에 경구투여하는 것을 포함하는 돼지 대장균 설사증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

나아가, 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

a) 장독성 대장균 유래의 필린 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 벡터를 구축하는 단계;

b) 상기 식물 형질전환용 벡터로 식물 조직을 형질전환시키는 단계;

c) 상기 식물 조직을 식물체로 재분화시키는 단계; 및

d) 재분화된 형질전환 식물체로부터 필린 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 식물체로부터 재조합 필린 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 돼지 대장균 설사증 방지를 위한 경구 백신으로 사용될 수 있는, 장독성 대장균 유래의 필린 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 형질전환 식물체를 제공한다는 점에 특징이 있다.

본 발명에 따라 장 표면에 특이적으로 결합하는 장독성 대장균의 표면 항원인 필린 단백질이 포함된 형질전환 식물 또는 이의 조직은 돼지에게 투여시 일차적으로 수동면역을 유도하여 병독성 대장균과 장 점막 표면 수용체와의 특이적 경쟁을 유발시킴으로써 병독성 대장균의 결합 및 증식을 막을 수 있다(Herbers K et al., Current Opinion in Biotech., 10: 163-168, 1999). 또한, 이차적으로 다량으로 공급된 필린 단백질은 소장의 무리림프소절(Peyer's patch) 등의 장 연관 림프조직(gut-associated lymphoid tissue, GALT)을 통해 상피세포를 통과하고 림프조직으로 이동하여 면역반응을 유도하게 된다. 그 결과로 분비된 분비성 면역인자인 S-IgA가 병독성 대장균의 필린 단백질에 달라붙어 장 점막 표면 수용체와의 결합을 막는 능동면역을 유도하게 된다. 이러한 두 가지 방식의 방어기작을 통해 필린과 장 점막 표면 수용체와의 초기의 특이적 결합을 억제(anticolonization)하여 병독성 대장균에 의한 설사증의 발생을 억제할 수 있다.

본 발명에 따른 형질전환 식물체의 제조방법은 장독성 대장균 유래의 필린 단백질을 암호화하는 유전자가 삽입된 식물 형질전환용 벡터로 식물 조직을 형질전환하고, 이로부터 식물체를 재분화시키는 것을 포함한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 사용되는 필린 단백질은 장독성 대장균 유래, 바람직하게는 K88 섬모 항원형 대장균 유래인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 K88ac 섬모 항원형 대장균 유래인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에는 상기 필린 단백질 뿐 아니라, 그의 기능적 동등물을 사용할 수 있다. 필린 단백질의 "기능적 동등물"이란 장독성 대장균 유래의 단백질과 실질적으로 동등한 생리 활성을 나타내어 돼지에 투여시 필린에 대한 항체 형성을 유발할 수 있는 폴리펩티드를 말한다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 천연형 필린 단백질의 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 필린 단백질의 생리 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다.

본 발명에 사용되는 필린 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 필린 단백질 또는 그의 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 갖는 것이 바람직하다. 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는다. 상기 유전자는 PCR을 통해 증폭하여 얻어질 수 있다. 이 때 PCR은 상기 유전자의 염기서열로부터 디자인될 수 있는 프라이머, 바람직하게는 유전자의 용이한 클로닝을 위해 그 서열 내에 제한효소 인식 서열이 포함되도록 디자인된 프라이머를 이용하여 수행될 수 있다. 가장 바람직하게는 서열번호 1과 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 구성된 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있다. 본 발명에 따른 K88ac의 필린 유전자는 K88의 다른 혈청형인 K88ab 및 K88ad의 필린 유전자와 아미노산 배열 수준에서 91% 이상의 상동성을 보인다. 따라서, 경구용 백신에 의해 생성되는 항체가 폴리클로날(polyclonal)임을 고려할 때에 본 발명에 따른 K88ac 유전자로부터 암호화되는 필린 단백질은 K88ac 뿐 아니라 K88ab 및 K88ad 병원체 대항 백신으로서 충분히 이용 가능하다.

본 발명에 사용되는 필린 유전자를 삽입하기 위한 식물 형질전환용 벡터로는 식물의 형질전환에 사용되는 일반적인 벡터라면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 pGA748, pMBP-1, pBI121, pRTL2, pCambia 및 pPMI로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나, 보다 바람직하게는 pGA748을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 pGA748을 이용하여 필린 유전자를 발현시키기 위한 pGApili 벡터를 제조하였다(도 1 참조).

장독성 대장균의 필린 유전자가 삽입된 식물 형질전환용 벡터를 이용하여 식물을 형질전환시키는 방법은 전기 충격법(electroporation), 입자 총법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake), 아그로박테리움 매개 형질전환법(Agrobacterium-mediated transformation) 등을 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명에서는 식물 조직(식물체 절편)을 필린 유전자가 삽입된 식물 형질전환용 벡터로 형질전환된 아그로박테리움과 공동 배양함으로써 식물을 형질전환시켰다. 이 때 형질전환된 아그로박테리움과 식물 조직을 공동 배양하기 위해서는 먼저 식물 조직의 무균 시료를 준비하는 것이 필요하다. 이를 위해 종자를 에탄올 또는 크로락스(clorox)로 소독한 후, MS⁺ 배지(MS 배지, 0.1㎍/㎖ 2iP, 5㎍/㎖ 2,4-D, 3% sucrose)에서 발아시켜 나온 배축(hypocotyl)을 형질전환에 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 식물 조직으로는 상기 배축 이외에 자엽(cotyledon) 또는 상기 자엽이나 배축으로부터 유도된 캘러스(callus)를 사용할 수도 있다.

필린 유전자가 도입된 식물 조직으로부터 캘러스를 유도하여 완전한 식물체(whole plant)로 재분화시킬 수 있다. 그 과정을 보다 구체적으로 살펴보면 다음과 같다. 필린 유전자가 도입된 식물 조직을 항생제가 첨가된 배지에서 배양하여 항생제 저항성을 갖는 캘러스만을 선별한 후, 선별된 캘러스를 체세포배 발생과정을 통하여 MS^- 배지(MS 배지, 0.1 ㎍/㎖ 2iP, 2.5% sucrose)에서 식물체로 재생시킨다. 이후, 배양된 유식물체(plantlet)의 뿌리로부터 배지를 깨끗이 제거하여 멸균 배합토에 이식한다. 이 때 비닐로 화분을 덮어 약 3주간 밀봉하는 것이 바람직하다. 그리고 나서, 큰 화분으로 옮겨 완전한 식물체(whole plant)로 재분화시킨다.

상기와 같은 방법에 의해 형질전환되어 돼지 대장균 설사증에 대한 경구용 백신으로 사용될 수 있는 식물체로는 일반적인 사료작물이라면 모두 사용될 수 있으며, 바람직하게는 귀리, 호밀, 보리, 옥수수, 피, 조, 강낭콩, 완두, 유채, 해바라기, 감자, 고구마, 호박, 알팔파, 비트, 무, 루타바카, 당근, 상추 및 배추로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 당근을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환 식물체, 이의 절편 또는 이의 추출물을 포함하는 돼지 대장균 설사증의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다. 상기에서 추출물은 액상형태일 수도 있으며, 식물체 또는 이의 절편을 동결 건조하여 분쇄한 분말형태일 수도 있다. 본 발명에 따른 백신 조성물은 약제학적으로 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다. 바람직하게는 경구투여용 제제로 제제화하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 경구투여용 고형제제 또는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등의 액상제제로 제제화하는 것이 바람직하다. 고형제제로 제제화하는 경우에는 본 발명에 따른 백신 조성물에 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분(starch), 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토스(lactose), 젤라틴(gelatin) 등을 혼합할 수 있다. 액상제제로 제제화하는 경우에는 본 발명에 따른 백신 조성물에 물 또는 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 혼합할 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 백신 조성물은 사료에 첨가되어 돼지에게 섭취시킴으로써, 이를 섭취한 돼지에게서 돼지 대장균 설사증의 필린에 대한 항체 형성을 유도하여 면역효과를 유발시킬 수 있다. 이 때 백신 조성물은 분말형태 또는 액상형태로 사료에 첨가되어질 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 형질전환 식물체를 동결 건조하여 이를 분말화한 후, 사료 및 전분과 혼합하여 환제 형태의 사료로 돼지에게 섭취시킬 수 있다. 이와 같이 본 발명에 따른 형질전환 식물체를 사료첨가제로서 사료와 혼합하여 돼지에게 급여하는 경우, 돼지에게 지속적으로 백신을 투여하는 효과를 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환 식물체를 돼지에 투여하여 돼지 대장균 설사증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 형질전환 식물체는 그 자체, 그의 절편 또는 추출물의 형태로 돼지에 투여될 수 있으며, 또한 백신 조성물로 제조되어 투여될 수도 있다. 바람직하게는 백신 조성물을 돼지의 사료와 혼합하여 투여하는 것이 바람직하다. 백신 조성물 및 사료의 제조예는 상기에 기재된 바와 같다. 이 때 본 발명에 따른 백신 조성물의 바람직한 유효량(투여량)은 사료 총 중량에 대하여 1-20 중량%이며, 가장 바람직한 유효량은 사료 총 중량에 대하여 1-10 중량%이다. 또한, 본 발명에 따른 백신 조성물은 3-4일 간격으로 3회 정도 투여하는 것이 바람직하다.

나아가, 본 발명은 식물체로부터 장독성 대장균의 필린 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명은

a) 장독성 대장균 유래의 필린 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 벡터를 구축하는 단계;

b) 상기 식물 형질전환용 벡터로 식물 조직을 형질전환시키는 단계;

c) 상기 식물 조직을 식물체로 재분화시키는 단계; 및

d) 재분화된 형질전환 식물체로부터 필린 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 식물체로부터 재조합 필린 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 식물체로부터 생산된 재조합 필린 단백질은 필린에 대한 항체를 검출하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 장독성 대장균 설사증에 대한 재조합 단백질 백신으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

필린 유전자의 클로닝

<1-1> 필린 유전자 증폭

대장균 K88ac의 필린 유전자(adhesion gene)의 염기서열(진뱅크 등록번호M29375)을 바탕으로 하여 이를 증폭하기 위한 프라이머를 제작하였다. 제작된 프라이머의 염기서열을 서열번호 1 및 서열번호 2로 각각 기재하였다. 대장균 K88ac(단국대학교 생명자원과학부 육종번식학 실험실로부터 분양받음)로부터 당업계에 공지된 방법에 따라 게노믹 DNA를 추출하였다. 이후, 주형 DNA 1ng, 1×완충용액, 0.2mM dNTP, 100pmol 정방향 프라이머, 100pmol 역방향 프라이머, Taq 중합효소 10U(Bionix)로 이루어진 PCR 반응 용액을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 7분 동안 주형 DNA를 전변성화시킨 후, 94℃에서 1분; 57℃에서 1분; 및 72℃에서 1분을 한 사이클(cycle)로 하여 총 30회 반복수행하였다. 이후, 최종적으로 72℃에서 5분간 반응시켰다. PCR 산물을 1.0% 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 870 bp의 PCR 산물을 확인하였다.

<1-2> 염기서열 분석

상기 실시예 <1-1>에서 얻은 PCR 산물의 염기서열을 분석한 결과, DNA 수준에서 K88ac 필린 유전자(진뱅크 등록번호 M29375)와 100%의 상동성을 보임을 확인하였다. 또한, 하기 표 1에서 보는 바와 같이, K88의 다른 혈청형인 K88ab 및 K88ad 필린 유전자와 아미노산 배열 수준에서 91% 이상의 상동성을 보임을 확인하였다. 또한, 코돈 사용방식(codon usage)의 비교를 통해 상기 필린 유전자의 염기서열이 당근에서 고빈도로 사용되어지는 코돈으로 구성되어있음을 확인하였으며, 이 결과로부터 필린 단백질이 당근에서 안정적으로 발현될 수 있을 것으로 판단되었다. 본 발명에 따라 분리된 장독성 대장균 K88ac 필린 유전자의 염기서열을 서열번호 3으로 기재하였으며, 이로부터 암호화되는 필린 단백질의 서열을 서열번호 4로 기재하였다.

염기서열 및 아미노산 서열의 상동성 비교 결과

	K88ab의 필린 유전자(진뱅크 등록번호 M29374)	K88ad의 필린 유전자(진뱅크 등록번호 M29376)
본 발명에 따른 K88ac의 필린 유전자	93a/95b	96/91

^a염기서열 상동성(%)

^b아미노산 서열 상동성(%)

<1-3> 필린 유전자를 포함하는 재조합 벡터 구축

상기 실시예 <1-1>에서 얻은 PCR 산물을 겔로부터 분리·정제하여 유전자의 지속적인 발현을 유도하는 CaMV 35S 프로모터를 가지고 있는 식물 형질전환용 벡터인 pGA748(포항공대 안진흥 교수로부터 분양받음)에 클로닝하였다. 제조된 벡터를 'pGApili'라 명명하였다(도 1 참조).

<실시예 2>

필린 유전자를 포함하는 형질전환 당근의 제조

<2-1> 식물 재료

상기 실시예 1에서 분리한 필린 유전자를 도입하기 위한 식물로 대풍5촌(D; 중앙종묘), 만산5촌(M; 중앙종묘), 조춘5촌(J; 중앙종묘), 여름5촌(Y; 서울종묘) 및 한여름 5촌(H; 농우종묘)으로 이루어진 5 품종의 당근을 사용하였다.

<2-2> 아그로박테리움 형질전환 및 배양

상기 실시예 <1-3>에서 제조한 pGApili 벡터를 동결-해동(freeze-thaw) 방법(Glevin et al., Plant molecular biology. Kluwer academic Publishers A3/7, 1988)으로 아그로박테리움 LBA4404에 도입시켰다. 이후, 필린 유전자를 포함하는 아그로박테리움을 2일간 M9 배지(6g/ℓ Na₂HPO₄, 3g/ℓ KH₂PO₄, 0.5g/ℓ NaCl, 1g/ℓ NH₄Cl, 0.5g/ℓ MgSO₄, 2g/ℓ glucose, 0.015g/ℓ CaCl₂)에서 배양하여 이를 MS⁺ 배지(MS 배지, 0.1㎍/㎖ 2iP, 5㎍/㎖ 2,4-D, 3% sucrose)에 재현탁시켰다.

<2-3> 당근 형질전환

토마스 등의 방법(Thomas et al., Plant Cell Rep. 8:354357, 1989)에 따라 당근 형질전환을 수행하였다. 각 품종의 당근 종자를 70% 에탄올로 30초간 4회 세척한 후, 상업용 표백제(유한락스)로 20분간 표면 살균하였다. 이후, 멸균 증류수로 3회 수세한 후, 0.7% 피토아카(phytoagar, Duchefa) 고체배지에 치상하여 25℃, 암조건 하에서 2주간 발아시켰다. 생장한 배축을 0.25-0.5㎝ 간격으로 절단한 후, MS⁺ 배지에서 2일간 80rpm로 진탕 배양하였다. 이후, 상기 당근 배축을 상기 실시예 <2-2>에서 재현탁된 아그로박테리움 배양액과 함께 암조건에서 10분간 공동배양한 후, 식물 절편을 자연건조(air dry)하여 MS⁺ 배지에서 2일간 25℃, 80rpm, 암조건에서 배양하였다. 이후, 카르베니실린(carbenicillin) 400㎍/㎖와 카나마이신(kanamycin) 100㎍/㎖이 포함된 MS⁺ 배지에서 형질전환된 개체만을 선발하였다. 총 494개의 형질전환된 캘러스를 얻었다. 각 캘러스를 MS^- 배지(MS 배지, 0.1 ㎍/㎖ 2iP, 2.5% sucrose)로 옮겨 완전한 식물체로 재분화시켰다.

<2-4> 당근 품종에 따른 형질전환 캘러스의 발생율 조사

당근 품종에 따른 캘러스 발생율을 조사한 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 조춘5촌, 여름5촌, 한여름5촌, 대풍5촌, 만산5촌의 순으로 높았다. 또한, 계대배양을 통한 세포주로서의 캘러스의 안정적 유지율은 여름5촌, 조춘5촌, 대풍5촌, 만산5촌, 한여름5촌의 순으로 높았다. 특히, 한여름5촌의 경우는 형질전환 후 캘러스 유도율은 높으나 세포주 유지 효율은 낮았다. 형질전환율 및 세포주 유지 측면을 고려해 볼 때 여름5촌이 당근 형질전환에 가장 적합한 것으로 나타났다.

당근 품종에 따른 형질전환율 및 세포주 유지율

당근 품종	형질전환된 조직 당 발생하는 항생제 저항성 캘러스의 퍼센트 (%)	유지된 세포주의 수
대풍5촌	13	120
한여름5촌	14	17
조춘5촌	21.5	142
만산5촌	6.4	39
여름5촌	19.4	176

<실시예 3>

대장균에서 재조합 필린 단백질 생산

상기 실시예 1에서 얻은 필린 유전자를 대장균 발현 시스템인 pET32 벡터(Novagen)에 삽입하고, 이를 대장균에 도입시켰다. 형질전환된 대장균 세포를 OD₆₀₀ 값이 0.6이 될 때까지 배양하고, 4℃에서 16시간 보관한 후, 새로운 배지에서 다시 배양하였다. 이후, OD₆₀₀값이 0.4-0.6이 되었을 때 IPTG를 최종농도가 1 mM이 되도록 첨가하여 한 시간 동안 더 배양하였다. 이렇게 하여 티오레독신(thioredoxin; 17.38 kDa)과 결합된 46.03 kDa의 K88ac 필린 단백질을 대량발현시켰다.

이후, pET 시스템 메뉴얼(Novagen)의 불용성 단백질 추출 방법에 따라 필린 단백질을 추출한 후, SDS-PAGE를 수행하였다. 겔로부터 필린 단백질에 해당하는 밴드를 잘라낸 후, 이를 호모게나이저(homogenizer)로 곱게 분쇄하였다. 단백질을 용출시키기 위하여, 분쇄된 겔에 확산 완충용액(diffusion buffer; 50mM Tris-Cl, pH 8.0, 0.1% SDS)을 첨가하여 4℃에서 16시간 이상 진탕배양하였다. 4℃, 12000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액만을 회수하였다. 회수된 상층액에 4배양의 아세톤을 첨가하고, -20℃에서 16시간 이상 침전시켰다. 다시 원심분리한 후, 펠렛(pellet)을 PBS(phosphate-buffer saline) 완충용액에 녹였다. 이렇게 수득된 필린 단백질은 웨스턴 블럿 분석과 ELISA 분석에 이용되었으며, 또한 재조합 단백질 백신으로 이용되었다.

<실시예 4>

형질전환 당근 분석

<4-1> 형질전환 당근에서 필린 유전자의 도입 확인

항생제 저항성을 통해 상기 실시예 2에서 얻은 형질전환 세포주 중 체세포 배발생 단계에 있는 54계통을 대상으로 필린 유전자의 도입 여부 확인 실험을 수행하였다. 이를 위해 각 당근으로부터 DNA를 분리한 후, 이를 주형으로 하여 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법에 따라 PCR을 수행하였다. 그 결과, 조사 대상 세포주의 97%에서 필린 유전자가 게놈 DNA(genomic DNA) 내에 안정적으로 삽입되었음이 확인되었다(도 2 참조).

<4-2> 형질전환 당근에서 필린 단백질의 발현 확인

상기 실시예 <4-1>에서 PCR을 통하여 유전자 도입이 확인된 당근 유식물체에서 필린 단백질이 발현되는지 확인하기 위하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.

a. 필린 단백질의 폴리클로날 항체 제작

웨스턴 블럿 분석을 위한 1차 항체(primary antibody)를 생산하기 위해, 상기 실시예 3에서 분리된 필린 단백질 100㎍과 프로운즈 보조제(Freund's adjuvant, GibcoBRL)를 22G 니들(needle)이 연결된 주사기에 넣어 혼합한 후, 토끼의 피하에 2주 간격으로 3회 주사하였다. 이후, 토끼로부터 심장 채혈하고, 얻은 혈청을 동결 건조하여 -70℃에서 보관하였다.

b. 총 단백질 추출

필린 유전자가 도입되지 않은 비형질전환 당근 유식물체(대조구)와 형질전환 당근 유식물체 0.1 g을 호모게나이저로 분쇄한 후, 동량의 2×샘플 완충용액(protein sample buffer; 0.125M Tris-Cl, pH 6.8, 4% SDS, 20% glycerol, 10% β-mercaptoethanol, 0.0025g Brilliant Blue R)을 첨가하고 균질화(homogenization)하였다. 30초 간격으로 볼텍싱(vortexing)과 아이스(ice)에 두는 과정을 5회 반복한 후, 4℃, 12000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액만을 회수하고 -20℃에 보관하였다.

c. 웨스턴 블럿 분석

상기 b.에서 추출된 총 단백질로 15% SDS-PAGE을 수행하였다. 이후, 트랜스-블럿 세포(Trans-Blot Cell, Bio-Rad)를 이용하여 70V에서 2시간 동안 니트로셀룰로즈 막(nitrocellulose membrane, S&S)에 블럿팅(blotting)하였다. 상기 막을 TBST 용액(100mM Tris, pH 8.0, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20)으로 10분간 세척한 후, 5% 넌팻 드라이 밀크(nonfat dry milk)를 포함하는 TBST 용액으로 45분간 블로킹(blocking)하였다. 이후, 상기 a.에서 제작된 필린 폴리클로날 항체(1차 항체)를 1:2,500의 비율로 TBST 용액에 희석한 후, 이를 상기 막에 처리하여 30분간 반응시켰다. 1차 항체를 반응시킨 후, 2차 항체(anti-rabbit IgG-AP conjugate, Promega)를 1:7,500의 비율로 TBST 용액에 희석하고 상기 막에 처리하여 30분간 반응시켰다. 이후, NBT/BCIP를 이용한 AP 시스템(Promega)으로 상온 암조건에서 발색 반응시켰다. 형질전환 식물조직 내 발현된 필린 단백질의 정량을 위해 BCA 방법(Sigma)으로 정량된 재조합 필린 단백질을 포함하는 웨스턴 분석 결과를 멜라이네Ⅲ 프로그램(MelanieⅢ program, Genebio)으로 비교하였다.

웨스턴 분석 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, J1-15, Y14-1, M1-17 및 Y7-1의 4계통에서 대조구와 큰 차이를 보이는 밴드를 확인할 수 있었다. 그 중에서 J1-15와 Y14-1 계통에서는 예상된 28.9 kDa의 밴드가 나타났다. 이에 반해, M1-17과 Y7-1 계통에서는 예상된 28.9kDa의 크기의 단백질 밴드와 더불어 예상하지 않은 크기의 단백질 밴드(52 kDa 및 36 kDa)가 나타났다. 이는 재조합 단백질의 대장균 내 발현시 자주 일어나는 현상으로서 예상하지 않은 크기의 단백질들은 아마도 세포 내에서 번역 후 변형된 것이거나, 또는 세포 내에서 자기들끼리 결합하여 충분히 변성되지 않아서 생긴 것으로 추정된다. 따라서, 본 발명자들은 대조구와 비교하여 구별되는 밴드들을 모두 도입 유전자 유래의 단백질 밴드로 간주하였다. 또한, 멜라이네Ⅲ 프로그램을 이용한 분석 결과, 상기 4 계통에서 28.9 kDa의 필린 단백질이 0.1-4 ㎍/g 범위의 농도로 축적되었음을 확인할 수 있었다.

이들 계통 중 식물조직 내에서 발현되어 축적된 병원균 항원의 양과 식물체 수준에서의 생장속도 및 정상 발육을 기준으로 최종적으로 과발현 세포주로서 M1-17과 Y14-1을 선발하였으며, 저발현 세포주로는 Y19-22를 선발하였다.

<실시예 5>

쥐에 대한 백신 당근 경구투여시 면역 반응 조사

<5-1> 시험사료 제조

과발현 세포주 M1-17, 저발현 세포주 Y19-22, 비형질전환 당근(음성 대조구) 및 상기 실시예 3에서 제조된 재조합 필린 단백질(양성 대조구)을 각각 동결 건조시켜 분말화하였다. 이후, 각 분말을 유지사료(삼양) 및 전분과 혼합한 후, 펠렛팅(pelleting)하여 40℃ 배양기(incubator)에서 3일간 건조하였다. 이 때 과발현 세포주 및 저발현 세포주의 분말은 각각 1, 3 및 5g으로, 비형질전환 당근의 분말은 5g, 그리고 재조합 필린 단백질의 분말은 10g으로 첨가하여 시험사료를 제조하였다.

<5-2> 경구투여

실험 마우스로는 21일령된 SPF(specific pathogene free) BALB/c(대한 바이오링크)를 이용하였다. 경구투여 12시간 전에 마우스를 금식을 시킨 후, 상기 <5-1>에서 제조한 각 시험사료를 1주 간격으로 마우스에 4회 경구투여하였다. 투여 후 28일에 심장 채혈하였다. 모든 실험은 총 5회 반복 수행되었다.

<5-3> 항체 형성 조사

콜리간 등의 간접 ELISA(Indirect ELISA) 방법(Coligan et al., Current Protocols in Immun. NIH pp. 2.0.1-22, 1992)에 따라 마우스 내 항체 형성 유무를 분석하였다. 먼저, 상기 실시예 3에서 분리된 재조합 필린 단백질을 10㎍/㎖가 되도록 탄산-중탄산 완충용액(carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.6)에 희석하고, 마이크로플레이트(microplate, Costar^? 3590 96 well assay plate)에 100㎍씩 넣어 4℃에서 16시간 이상 코팅(coating)하였다. 코팅된 플레이트를 PBST 용액(0.15 M PBS, 0.05% Tween 20)으로 3회 세척한 후, 5% 논팻 드라이 밀크를 포함하는 PBST 용액을 200 ㎕씩 분주하여 실온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 이후, 플레이트를 PBST 용액으로 7회 세척하였다. 상기 실시예 <5-2>에서 획득된 항혈청을 희석 완충용액(dilution buffer)으로 희석하고, 이를 상기 플레이트에 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. PBST 용액에 1: 5,000의 비율로 희석시킨 2차 항체(anti-mouse IgG-AP conjugate, Promega)를 상기 플레이트에 첨가하여 37℃에서 (0.5)시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 플레이트에 NPP(p-nitrophenyl phosphate, phosphate substrate tablet, Sigma) 기질 완충용액을 첨가하여 15-30분간 상온 암조건에서 발색 반응시켰다. 5M NaOH를 첨가하여 반응을 종료시켰다. 이후, 마이크로타이터 플레이트 리더(microtiter plate reader, V-max, Molecular Devices)를 이용하여 405nm에서 흡광도(absorbance)를 조사하였다.

그 결과, 저발현 세포주 Y19-22을 5g 투여한 경우 10㎍의 재조합 필린 단백질을 투여한 경우에 비해 다소 높은 항체 형성을 나타냈으며, 투여량이 증가함에 따라 항체 형성이 증가됨을 확인할 수 있었다. 과발현 세포주 M1-17은 3 g 투여시 가장 많은 항체 형성을 보였으나, 5 g 투여시에는 오히려 항체 형성이 감소된 것으로 나타났다. 그 이유는 많은 양의 항원 투여시 항원에 대한 내성이 생겨 면역성이 저하되었기 때문으로 사료된다(도 4 참조).

<실시예 6>

형질전환 당근 경구투여시 돼지의 면역 반응 및 증체량 변화 조사

<6-1> 형질전환 당근 경구투여 및 공격접종(challenge)

실험 돼지로는 21일령 된 3원 교잡종(Duroc ×Yorkshire ×Landrace) 자돈(충남 전의면 소재 힘찬 농장)을 사용하였다. 5 마리의 실험구에는 동결 건조된 형질전환 당근(Y14-1)을 사료의 2%로 첨가하여 14일간 자유 채식시켰으며, 5 마리의 음성 대조구에는 비형질전환 당근을 사료의 2%로 첨가하여 14일간 자유 채식시켰다. 또한, 5 마리의 양성 대조구에는 1㎎ 재조합 필린 단백질을 사료에 첨가하여 14일간 자유 채식시켰다. 시험사료를 급여한 후 15일째 되는 날에는 모든 자돈에게 ETEC K88ac(5×10⁹ cfu/㎖)을 2㎖씩 8시간 간격으로 경구로 공격접종하였다(도 5 참조).

<6-2> 항체 형성 조사

시험사료 급여 0일, 7일, 14일, 21일 및 28일에 각 자돈으로부터 혈액을 채취하여 상기 실시예 <5-3>과 동일한 방법에 따라 ELISA를 수행하였다. 모든 실험을 총 5회 반복 수행하였다. 그 결과, 형질전환 당근(실험구)을 경구투여한 지 7일째 되는 혈청에서 재조합 필린 단백질(양성 대조구)과 유사한 수준의 높은 항체가를 보였으며, 14일 이후로도 계속적으로 높은 항체가를 유지하였다. 특히, 장독성 대장균 K88ac를 공격접종시킨 후 6일째 되는 21일의 혈청에서 가장 높은 항체가를 보였다. 이에 반해 재조합 필린 단백질을 경구투여한 경우에는 투여 후 14일 이후부터 오히려 음성 대조구보다 더 낮은 항체가를 보였으며, 대장균 공격접종시에는 약간의 면역반응만이 생성되었다(도 6 참조).

<6-3> 자돈 증체량 조사

당근 백신의 투여를 통한 돼지 대장균 설사증으로부터의 자돈 보호 효과를 정량적으로 판정하기 위해, 자돈의 평균 일당 증체량(ADG; average daily gain)을 조사하였다. 평균 체중이 4.97±0.19 kg인 15마리의 자돈을 대상으로 시험사료 급여 기간(14일) 동안의 체중 변화를 조사하였다. 그 결과, 하기 표 3에 기재된 바와 같이, 형질전환 당근을 투여한 자돈은 비형질전환 당근을 투여하거나, 재조합 필린 단백질을 투여한 자돈에 비해 평균 60 kg 이상 높은 증체량을 보였다. 이는 이유 후의 생육이 가장 왕성한 시기에 돼지 대장균 설사증이 미치는 영향을 반영한 것으로서 형질전환 당근의 투여를 통해 증체량이 유지된 것으로 생각된다.

자돈의 ADG에 대한 당근 백신의 효과

	비형질전환 당근	형질전환 당근	재조합 필린 단백질	SE1
ADG(kg)	250b	326a	261ab	28

¹합동표준오차(Pooled standard error)

^ab 동일한 문자는 P<0.10 수준에서 유의적 차이가 없음을 의미함

상기 결과들로부터 본 발명에 따라 장독성 대장균의 필린 유전자가 도입된 형질전환 당근이 돼지 대장균 설사증에 대한 경구용 백신으로 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

<실시예 7>

형질전환 당근 경구투여를 통한 돼지 대장균 설사증 예방 효과

16일령 된 3원 교잡종(Duroc ×Yorkshire ×Landrace) 자돈(충남 전의면 소재 힘찬 농장) 24 마리를 4마리씩 총 6 그룹으로 나누었다. 하기 표 4에 기재된 각 시험사료를 유지사료(삼양)에 첨가하여 각 그룹의 자돈에 경구투여하였다. 시험사료의 투여는 16일령, 24일령 및 30일령에 4일 간격으로 3회에 걸쳐 수행하였다(도 7 참조). 이 때 음성 대조구에는 유지사료만을 투여하였으며, 실험구에는 시험사료 80g을 펜(pen) 단위로 사료 200g에 혼합하여 투여하였다(사료 총 중량에 대하여 20 중량%로 투여). 또한, 면역보조제(adjuvant)로는 콜레라 톡신(cholera toxin, Sigma)을 사용하였으며, PBS 10㎖에 160㎍을 첨가하여 펜 단위로 당근과 혼합 투여하였다. 대장균 접종 5일 전부터는 사료에서 항생제(아플라마이신(apramycin), 고려화학)를 제거하여 공급하였다. 하기 표 4에 기재된 각 당근의 중량은 모두 건조 중량(dry weight)이다.

실험그룹 및 그에 따른 시험사료

그룹	도면상의 표기	시험사료
양성대조구 1	K88RP	재조합 필린 단백질1(50㎍/두)+비형질전환 당근(20g/두)
양성대조구 2	K88RP+AD	재조합 필린 단백질(50㎍/두)+비형질전환 당근(20g/두)+면역보조제(40㎍/㎖)
실험구	K88TC+AD	본 발명에 따른 형질전환 당근(20g/두)+면역보조제(40㎍/㎖)
음성대조구 1	CON	-
음성대조구 2	NC	비형질전환 당근(20g/두)
음성대조구 3	NC+AD	비형질전환 당근(20g/두)+면역보조제(40㎍/㎖)

¹실시예 3에서 제조된 대장균 재조합 필린 단백질

이후, 자돈이 28일령이 되었을 때 K88ac와 987P(단국대학교 김인호 교수님으로부터 분양받음)를 1×10¹¹ cfu/㎖의 농도로 2㎖씩 2회 공격접종하였다. 그리고 나서, 12시간 간격으로 쉐르만 등의 방법(Sherman et al., Infect Immun. 42:656-658, 1983)에 따라 FC 스코어(fecal score)(정상적인 분: 0, 연변: 1, 묽은 설사: 2, 심한 설사: 3)를 측정하였다.

대장균의 공격접종 12시간 후 FC 스코어의 측정 결과를 도 8에 도시하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 형질전환 당근을 투여한 경우에는 설사가 유발되지 않았다. 또한, 하기 표 5에서 보는 바와 같이, 공격접종한지 3일째 되는 날에도 본 발명에 따른 형질전환 당근을 투여한 경우에는 설사가 전혀 유발되지 않음을 확인할 수 있었다.

대장균 공격접종 후 자돈의 임상 반응 결과

그룹	실험에 사용된 자돈의 수	3일째 되는 날 설사가 유발된자돈의 수(FC 스코어1)
양성대조구 1	4	3(0.6875)
양성대조구 2	4	2(0.25)
실험구	4	0(0)
음성대조구 1	4	3(1)
음성대조구 2	4	3(0.75)
음성대조구 3	4	3(0.56)

¹측정된 FC 스코어의 평균값(mean fecal consistency score)

상기 결과로부터 본 발명에 따라 장독성 대장균 유래의 필린 유전자가 도입된 형질전환 당근이 돼지 대장균 설사증에 대하여 탁월한 예방 효과를 나타냄을 알 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 장독성 대장균의 필린 유전자가 도입된 형질전환 식물체를 제조하고, 상기 식물체를 마우스 및 돼지에게 경구투여한 결과, 마우스 및 돼지에서 장독성 대장균의 필린에 대한 항체 형성이 유도되었음을 확인하였다. 또한, 자돈에서 대장균에 의한 설사증을 예방할 수 있음을 확인하였다. 본 발명에 따른 형질전환 식물체 및 이를 포함하는 백신 조성물은 돼지 대장균 설사증을 치료 또는 예방하는데 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 종래 돼지 대장균 설사증 방지에 사용되고 있는 항생제를 대체하는 고부가가치 사료첨가제로서 유용하게 사용될 수 있으며, 이를 통해 양돈농가의 생산성 향상과 고품질 축산물의 생산에 크게 이바지할 것으로 기대된다.

도 1은 장독성 대장균의 필린 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pGApili의 제작과정을 간략히 나타낸 모식도이다.

도 2는 여러 계통의 형질전환 당근에서 필린 유전자의 도입 유무를 확인하기 위하여 PCR을 수행한 결과이다.

MW: 분자량 마커

C: 비형질전환 당근(대조구)

J: 조춘5촌

Y: 여름5촌

M: 만산5촌

도 3은 5계통의 형질전환 당근에서 추출한 필린 단백질을 이용하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과이다.

Po: 대장균 재조합 필린 단백질

C: 비형질전환 당근

J1-15, Y14-1, M1-17, Y7-1 및 Y19-22: 형질전환 당근

도 4는 형질전환 당근이 포함된 시험사료를 급여한 후 마우스에서 형성된 필린 항체의 양을 조사하기 위하여 ELISA를 수행한 결과이다.

C: 비형질전환 당근 분말 5g

Po: 대장균 재조합 필린 단백질 10g

Y1: 저발현 형질전환 당근 Y19-22 분말 1g

Y3: 저발현 형질전환 당근 Y19-22 분말 3g

Y5: 저발현 형질전환 당근 Y19-22 분말 1g

M1: 과발현 형질전환 당근 M1-17 분말 1g

M3: 과발현 형질전환 당근 M1-17 분말 3g

M5: 과발현 형질전환 당근 M1-17 분말 5g

도 5는 본 발명에 따른 형질전환 당근을 이용하여 자돈을 대상으로 수행한 백신 프로그램 스케줄을 나타낸 것이다.

도 6은 도 5의 도시된 백신 프로그램에 따라 임상 실험을 수행한 후, 각 그룹의 자돈에서 형성된 필린 항체의 양을 조사하기 위하여 ELISA를 수행한 결과를 나타낸 것이다.

Po: 대장균 재조합 필린 단백질

TC: 형질전환 당근

C: 비형질전환 당근

도 7은 본 발명에 따른 형질전환 당근의 돼지 대장균 설사증 예방 효과를 알아보기 위하여 수행한 FC 스코어(fecal score) 측정 실험의 스케줄을 나타낸 것이다.

도 8은 대장균 K88ac와 987P의 공격접종 12시간 후 각 그룹의 자돈의 FC 스코어를 측정한 결과를 나타낸 것으로서, 각 그룹에 대한 설명은 표 4에 기재되어 있다.

<110> HWANG, Cheol Ho <120> Transgenic plant for an oral vaccine against E. coli-mediated diarrhea in pig <130> NP03-0051 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR <400> 1 gtggatatca aggggttta 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR <400> 2 catgctaggt tcagcggagc 20 <210> 3 <211> 840 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 atgaaaaaga ctctgattgc actggcaatg gctgcatctg ctgcatctgg tatggcacat 60 gcctggatga ctggtgattt caatggttcg gtcgatatcg gtggtagtat cactgcagat 120 gattatcgtc agaaatggga atggaaagtt ggtacaggtc ttaatggatt tggtaatgta 180 ttgaatgacc tgaccaatgg tggaaccaaa ctgaccatta ctggtactgg taataagcca 240 attttgttag gccggaccaa agaagcattt gctacgccag taactggtgg tgtagatgga 300 attcctcata ttgcatttac tgactatgaa ggagcttctg tagtactcag aaaccctgat 360 ggtgaaacta ataaaaaagg tttagcatat tttgttctgc cgatgaaaaa tgcagagggc 420 actaaagttg gttcagagaa agtgaatgca tcttatgccg gtgtgttagg gagaggtggg 480 gttacttctg cggacgggga gctgctttcg ctttttgccg acgggttgag ctctatcttt 540 tgtggtggtt tgccgagggg ttctgaactc tcggctggga gtgccgcagc ggcgcgcaca 600 aagttgtttg gaagtctatc aagaaatgat attctcggac agattcaaag agtaaacgca 660 aatattactt ctcttgttga cgtcgcaggt tcttacaggg aaaacatgga gtacactgat 720 ggaactgttg tttctgctgc ctatgcactg ggtattgcaa acggtcagac tattgaggca 780 acttttaatc aggctgtaac taccagcact cagtggagcg ctccgctgaa cctagcatga 840 840 <210> 4 <211> 290 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Arg Gly Gly Tyr Gln Gly Val Tyr Phe Met Glu Thr Lys Lys Thr Leu 1 5 10 15 Ile Ala Leu Ala Met Ala Ala Ser Ala Ala Ser Gly Met Ala His Ala 20 25 30 Trp Met Thr Gly Asp Phe Asn Gly Ser Val Asp Ile Gly Gly Ser Ile 35 40 45 Thr Ala Asp Asp Tyr Arg Gln Lys Trp Glu Trp Lys Val Gly Thr Gly 50 55 60 Leu Asn Gly Phe Gly Asn Val Leu Asn Asp Leu Thr Asn Gly Gly Thr 65 70 75 80 Lys Leu Thr Ile Thr Gly Thr Gly Asn Lys Pro Ile Leu Leu Gly Arg 85 90 95 Thr Lys Glu Ala Phe Ala Thr Pro Val Thr Gly Gly Val Asp Gly Ile 100 105 110 Pro His Ile Ala Phe Thr Asp Tyr Glu Gly Ala Ser Val Val Leu Arg 115 120 125 Asn Pro Asp Gly Glu Thr Asn Lys Lys Gly Leu Ala Tyr Phe Val Leu 130 135 140 Pro Met Lys Asn Ala Glu Gly Thr Lys Val Gly Ser Glu Lys Val Asn 145 150 155 160 Ala Ser Tyr Ala Gly Val Leu Gly Arg Gly Gly Val Thr Ser Ala Asp 165 170 175 Gly Glu Leu Leu Ser Leu Phe Ala Asp Gly Leu Ser Ser Ile Phe Cys 180 185 190 Gly Gly Leu Pro Arg Gly Ser Glu Leu Ser Ala Gly Ser Ala Ala Ala 195 200 205 Ala Arg Thr Lys Leu Phe Gly Ser Leu Ser Arg Asn Asp Ile Leu Gly 210 215 220 Gln Ile Gln Arg Val Asn Ala Asn Ile Thr Ser Leu Val Asp Val Ala 225 230 235 240 Gly Ser Tyr Arg Glu Asn Met Glu Tyr Thr Asp Gly Thr Val Val Ser 245 250 255 Ala Ala Tyr Ala Leu Gly Ile Ala Asn Gly Gln Thr Ile Glu Ala Thr 260 265 270 Phe Asn Gln Ala Val Thr Thr Ser Thr Gln Trp Ser Ala Pro Leu Asn 275 280 285 Leu Ala 290

Claims (16)

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10. 서열번호 4로 표시되는 장독성 대장균(enterotoxigenic E. coli ETEC) 유래의 필린(pilin) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 형질전환 식물체, 이의 절편 또는 이의 추출물을 포함하는 돼지 대장균 설사증의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
11. 제 10항에 있어서, 상기 백신은 경구투여용인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
12. 제 10항의 백신 조성물을 포함하는 돼지 대장균 설사증의 예방 또는 치료용 사료 첨가제.
13. 제 10항의 백신 조성물 또는 제 12항의 사료 첨가제를 돼지에 경구투여하는 것을 포함하는 돼지 대장균 설사증을 예방 또는 치료하는 방법.
14. 제 10항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
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