KR20080036162A

KR20080036162A - 돼지 장독소대장균 설사증에 대한 경구 백신용 형질전환식물체 개발

Info

Publication number: KR20080036162A
Application number: KR1020060102624A
Authority: KR
Inventors: 황철호
Original assignee: 황철호
Priority date: 2006-10-22
Filing date: 2006-10-22
Publication date: 2008-04-25

Abstract

본 발명은 돼지 대장균 설사증에 대한 경구 백신용 형질전환 식물체와 개발된 백신 식물을 활용하여 효과적으로 설사병을 예방하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 장독성 대장균(Enterotoxigenic E. coli; ETEC) 987P 유래의 섬모(fimbrial) 말단 단백질을 암호화하는 유전자 (fasG)를 포함하는 형질전환 식물체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형질전환 식물체, 이의 절편 또는 이의 추출물을 포함하는 백신 조성물 및 사료 첨가제는 돼지 대장균 설사증을 예방 또는 치료하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

돼지 대장균 설사증, 형질전환 식물체, 987P (fasG), 사료 첨가제

Description

돼지 장독소대장균 설사증에 대한 경구 백신용 형질전환 식물체 개발 {Development of oral vaccine carrot to protect against ETEC 987P diarrhea in piglet}

도 1은 장독성 대장균의 fasG 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pGAfasG의 제작과정을 간략히 나타낸 모식도이다.

도 2는 여러 계통의 형질전환 당근에서 fasG 유전자의 도입 유무를 확인하기 위하여 PCR을 수행한 결과이다.

M: 분자량 마커

N: 비형질전환 당근(음성대조구)

P: 벡터 내에 삽입된 fasG(양성대조구)

1-19: fasG 형질전환 당근라인

도 3a은 7계통의 형질전환 당근 캘러스에서 추출한 fasG 단백질을 이용하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과이다.

Con: 비형질전환 당근(음성대조구)

FasG antigen: 대장균에서 생산한 fasG 단백질 (양성대조구)

M: 만산 5촌 당근

M10-23, M10-22, M10-17, M6-20, M6-18, M3-6, M3-1: 형질전환당근

도 3b은 대량생산한 3계통의 형질전환 당근 뿌리에서 추출한 fasG 단백질을 이용하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과이다.

MW: 단백질 마커

pCfasG: 대장균에서 생산한 fasG 단백질 (양성대조구)

Con: 비형질전환 당근(음성대조구)

M: 만산 5촌 당근

M3-1, M6-18, M10-22: 형질전환당근

도 4는 본 발명에 따른 형질전환 당근을 이용하여 자돈을 대상으로 수행한 백신 프로그램 스케줄을 나타낸 것이다.도 5는 형질전환 당근이 포함된 시험사료를 급여한 후 자돈에서 형성된 fasG 항체의 양을 조사하기 위하여 ELISA를 수행한 결과이다, 각 그룹에 대한 설명은 표 3에 기재되어 있다.

도 6은 본 발명에 따른 형질전환 당근의 백신의 효용성을 확인하기 위하여 마우스에 경구투여하여 항체가 생성되어 새끼 쥐에게 이행되는 실험의 스케줄을 나타낸 것이다.

도 7은 도6의 스케줄에 나타난 실험설계에 따라 진행하고 사진으로 정리한 것이다. 도 8은 형질전환 당근이 포함된 시험사료를 급여한 후 마우스에서 형성된 fasG 항체의 양을 조사하기 위하여 ELISA를 수행한 결과이며 새끼쥐에게 항체가 이행되는 가능성을 확인한 실험이다, 각 그룹에 대한 설명은 표 4에 기재되어 있다.

본 발명은 돼지 대장균 설사증에 대한 경구 백신용 형질전환 식물체에 관한 것과 개발된 경구 백신용 형질전환 식물체의 사료첨가제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 장독성 대장균 (Enterotoxigenic E. coli; ETEC) 987P 유래의 섬모(fimbriae) 단백질을 암호화하는 유전자 (fasG)을 암호화하는 유전자를 포함하는 형질전환 식물체 개발에 관한 것이다.

양돈산업의 대규모 집단사육 추세에 따라 돼지의 설사병은 양돈장에서 가장 흔하고 또 문제시되는 질병으로 대두되고 있다(박영일, 선진문화사, 353-359, 1998). 최근 우리나라에서도 돼지의 설사병 발생이 증가하여 설사로 인한 어린 돼지의 성장지연 및 폐사로 사육농가에 경제적으로 커다란 손실을 초래하고 있는 실정이다(홍의철, 단국대학교 석사학위논문, 조기 이유 자돈에 있어 난황 항체의 첨가 효과, 2001). 특히, 병원성 대장균 감염에 의한 설사를 주 증상으로 하는 소화기 질병인 돼지 대장균 설사증은 우리나라의 거의 모든 사육농가에서 발생되는 질병이다. 돼지 대장균 설사증은 어린 돼지에서 많이 발생하며, 그 감염시기에 따라 신생자돈 설사, 포유자돈 설사 및 이유자돈 설사로 나뉜다. 태어난 지 수일 이내의 신생자돈은 위산 분비 기능 및 방어체계가 미흡하기 때문에 병원성 세균에 대해 저항력을 가지지 못한다. 특히, 초유의 불충분한 섭취, 주변 환경의 불량, 겨울철 불충분한 보온 등 여러 가지 스트레스 요인이 작용할 때는 그 증상이 심하여 폐사율이 높아지고 위축돈이 발생한다. 초유의 섭취를 통한 모체 이행 항체의 습득은 그 지속성이 2주 이후에 소실되기 시작하여 3주에는 거의 소실되므로 이 시기에 병원성 세균에 대한 저항력이 약해져서 포유자돈 설사를 일으키게 된다. 또한, 이유시기에 환경과 사료의 변화에서 오는 스트레스는 병원성 대장균의 감염과 발병을 용이하게 할 수 있다. 대장균의 감염에 의한 설사증은 병원성 대장균이 주로 오염된 사료나 물 등을 통한 경구감염에 의해 전파되며, 신생자돈에 있어서는 분변을 통한 감염이나 어미의 유두를 통한 감염이 주 경로이다. 병원성 대장균은 장관벽에 부착하여 증식한다. 이 때 질병을 일으키게 되는 중요한 두 가지 인자가 관련되는데, 그것은 집락형성 인자(colonization factor)와 독소 (toxin) 생성 여부이다. 집락형성 인자는 대장균이 소장 점막에 부착하는데 중요한 역할을 하는 것으로 균체 밖으로 돌출된 단백질로 이루어진 작은 머리털 같은 구조를 이루며 필러스(pilus) 또는 섬모(fimbriae)라고 알려져 있다. 대장균 균체 외부에 돌출된 필러스 또는 섬모를 통해 장관 벽에 부착된 대장균은 장관 내에서 증식하며 여러 가지 독소를 생산한다. 돼지 설사증을 유발하는 대장균은 그 항원성에 따라 혈청형(serotype)이 나뉘어지는데, 그것들은 각각 O(somatic), K(capsular or microcapsular), H(flagellar) 및 F(fimbrial)이다.

가장 빈번하게 분리되는 혈청형으로는 O8, O147, O149, O157이며, 이들은 장관 점막에 부착하여 집락화를 이루는데 중요한 역할을 하는 부착기인 F4(K88), F5(K99), F6(987P), F41을 하나 이상 갖고 있으며 이중 국내에서 발생하는 설사의 대부분은 987P에 의한 것이고 987P는 지속적으로 증가하는 추세를 보이고 있다(Koh et al., 2000; Choi & Chae., 1999). 증가 추세를 보이고 있는 987P 병원균 섬모 말단을 구성하는 단백질은 FasG이며, 이는 병원균의 집단화를 용이하게 해준다.

돼지 대장균 설사증을 예방 및 치료하기 위하여 많은 항생제를 사용하고 있으나, 항생제 오·남용시 돼지에게 내성 및 체내에 잔류될 가능성이 있기 때문에 현재 세계적으로 항생제 투여에 많은 제한을 두고 있다(Mason HS et al., Trends in Biotech. 13:388-392, 1995). 따라서, 돼지 대장균 설사증에 대한 안전한 백신의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다. 한편, 기존의 대장균 재조합 백신은 병원체의 오염을 근본적으로 배제하는 생산방법으로 안전하고, 생산비용이 저렴하며, 최적의 발현을 위한 유전학적 지식 및 돌연변이를 활용한 발현 벡터 체계가 완비되어 저비용 투입 대량생산에 적합하기 때문에 가장 바람직한 형태의 백신으로 알려져 있다(Haq TA et al., Science, 268: 714-716, 1995; Moffat AS, Science 268: 658-660, 1998). 그러나, 이와 같은 장점에도 불구하고, 번역 후 변형되는 일부 동식물 단백질의 경우 대장균과의 변형 체계의 차이로 인해 발현 단백질의 면역성이 저하되기도 하며, 재조합 대장균 백신의 경구투여시 장의 비우호적 조건에 의해 단백질이 파괴된다는 문제점이 있다(Amanda MW et al., Current Opinion in Biotech., 11: 126-129,2000; Moffat AS, Science, 268: 658-660, 1998; Tacker CO et al., Microes and Infection, 1: 777-783, 1999). 따라서, 식물과 같은 고등생물의 발현체계를 이용할 경우 생물간의 차이에 따른 면역성 저하문제가 해결되어질 수 있으며, 함께 공급되는 식물 조직에 의해 항원이 위장의 적대적 조건들을 회피할 수 있게 한다는 점에서 매우 효용적이다(Kong Q et al., Proc. Nat. Aca. Sci., USA 98: 11539-11544, 2001). 식물에서의 항원 생산은 생산비용 및 효율성에서 대장균에 못지 않고, 병원체에서 항원으로 작용하는 일부의 단백질만을 발현시키기 때문에 병원균과의 오염 가능성이 배제되어 안전 하며 식물체 자체를 먹는 것으로 이루어지는 접종 방법으로 인해 순수분리 등에 소요되는 비용이 절감되고 예방 목적의 이용에 수월하다(Dupont M (1999) Edible Vaccines. http://campus.fortunecity. com /sociology/729/ediblevaccines.htm). 이러한 점에서 식물체를 이용한 재조합 경구 백신의 개발이 활발해지는 추세이다.

이에 본 발명자들은 돼지 대장균 설사증에 대한 식물 백신을 개발하기 위하여 연구를 거듭하던 중, 돼지의 장 상피세포에 특이적으로 달라붙은 후 증식하여 독소를 생성하며 장상피를 자극시킴으로써 설사를 야기하는 장내 병독성 대장균의 부착용 단백질을 암호화하는 유전자가 도입된 형질전환 식물체가 돼지 대장균 설사증에 대한 경구용 백신으로서 효과적으로 사용될 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 돼지 대장균(987P) 설사증에 대한 경구용 백신으로 사용될 수 있는 형질전환 식물체(당근)를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공하고 돼지 대장균(987P) 설사증의 예방 또는 치료용 사료 첨가제를 제공하는 것이다.

나아가, 본 발명의 다른 목적은 식물체로부터 돼지 대장균 설사증을 유발하는 대장균의 부착용 단백질을 보다 안정하게 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 장독성 대장균(987P) 섬모 말단 유래의 FasG 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 형질전환 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 장독성 대장균 섬모 말단 유래의 FasG 단백질을 암호화하는 유전자가 삽입된 식물 형질전환용 벡터로 식물 조직을 형질전환하고, 이로부터 식물체를 재분화시키는 것을 포함하는, 장독성 대장균 섬모 말단 유래의 FasG 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 형질전환 식물체, 이의 절편 또는 이의 추출물을 포함하는 돼지 대장균(987P) 설사증의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 백신 조성물을 포함하는 돼지 대장균 설사증의 예방 또는 치료용 사료 첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 백신 조성물 또는 상기 사료첨가제를 돼지에 경구투여하는 것을 포함하는 돼지 대장균 설사증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

나아가, 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 장독성 대장균 섬모 말단 유래의 FasG 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 벡터를 구축하는 단계;

2) 상기 식물 형질전환용 벡터로 식물 조직을 형질전환시키는 단계;

3) 상기 식물 조직을 식물체로 재분화시키는 단계; 및

4) 재분화된 형질전환 식물체로부터 FasG 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 식물체로부터 재조합 FasG 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 돼지 대장균 설사증 방지를 위한 경구 백신으로 사용될 수 있는, 장독성 대장균 섬모 말단 유래의 FasG 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 형질전환 식물체를 제공한다는 점에 특징이 있다.

본 발명에 따라 장 표면에 특이적으로 결합하는 장독성 대장균의 섬모 말단 단백질인 FasG 단백질이 포함된 형질전환 식물 또는 이의 조직은 돼지에게 투여시 일차적으로 수동면역을 유도하여 병독성 대장균과 장 점막 표면 수용체와의 특이적 경쟁을 유발시킴으로써 병독성 대장균의 결합 및 증식을 막을 수 있다(Herbers K et al., Current Opinion in Biotech., 10: 163-168, 1999). 또한, 이차적으로 다량으로 공급된 FasG 단백질은 소장의 무리림프소절(Peyer's patch) 등의 장 연관 림프조직(gut-associated lymphoid tissue, GALT)을 통해 상피세포를 통과하고 림프조직으로 이동하여 면역반응을 유도하게된다. 그 결과로 분비된 분비성 면역인자인 S-IgA가 병독성 대장균의 FasG 단백질에 달라붙어 장 점막 표면 수용체와의 결합을 막는 능동면역을 유도하게 된다. 이러한 두 가지 방식의 방어기작을 통해 FasG 과 장 점막 표면 수용체와의 초기의 특이적 결합을 억제(anticolonization)하여 병독성 대장균에 의한 설사증의 발생을 억제할 수 있다.

본 발명에 따른 형질전환 식물체의 제조방법은 장독성 대장균 섬모 말단 유래의 FasG 단백질을 암호화하는 유전자가 삽입된 식물형질전환용 벡터로 식물 조직을 형질전환하고, 이로부터 식물체를 재분화시키는 것을 포함한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 사용되는 FasG 단백질은 장독성 대장균 유래, 바람직하게는 987P 섬모 항원형 대장균 유래인 것이 바람직하다.

본 발명에 사용되는 FasG 유전자를 삽입하기 위한 식물 형질전환용 벡터로는 식물의 형질전환에 사용되는 일반적인 벡터라면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 pGA748, pMBP-1, pBI121, pRTL2, pCambia 및 pPMI로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나, 보다 바람직하게는 pGA748을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 pGA748을 이용하여 FasG 유전자를 발현시키기 위한 pGAfasG 벡터를 제조하였다(도 1 참조).

장독성 대장균의 FasG 유전자가 삽입된 식물 형질전환용 벡터를 이용하여 식물을 형질전환시키는 방법은 전기 충격법(electroporation), 입자 총법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake), 아그로박테리움 매개 형질전환법(Agrobacterium-mediated transformation) 등을 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명에서는 식물 조직(식물체 절편)을 FasG 유전자가 삽입된 식물 형질전환용 벡터로 형질전환된 아그로박테리움과 공동 배양함으로써 식물을 형질전환시켰다. 이때 형질전환된 아그로박테리움과 식물 조직을 공동 배양하기 위해서는 먼저 식물 조직의 무균 시료를 준비하는 것이 필요하다. 이를 위해 종자를 에탄올 또는 크로락스(clorox)로 소독한 후, MS⁺ 배지(MS 배지, 0.1㎍/㎖ 2iP, 5㎍/㎖ 2,4-D, 3% sucrose)에서 발아시켜 나온 배축(hypocotyl)을 형질전환에 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 식물 조직으로는 상기 배축 이외에 자엽(cotyledon) 또는 상기 자엽이나 배축으로부터 유도된 캘러스(callus)를 사용할 수도 있다. FasG 유전자가 도입된 식물 조직으로부터 캘러스를 유도하여 완전한 식물체(whole plant)로 재분화 시킬 수 있다. 그 과정을 보다 구체적으로 살펴보면 다음과 같다. FasG 유전자가 도입된 식물 조직을 항생제가 첨가된 배지에서 배양하여 항생제 저항성을 갖는 캘러스만을 선별한 후, 선별된 캘러스를 체세포배 발생과정을 통하여 MS^- 배지(MS 배지, 0.1 ㎍/㎖ 2iP, 2.5% sucrose)에서 식물체로 재생시킨다. 이후, 배양된 유식물체(plantlet)의 뿌리로부터 배지를 깨끗이 제거하여 멸균 배합토에 이식한다. 이 때 비닐로 화분을 덮어 약 3주간 밀봉하는 것이 바람직하다. 그리고 나서, 큰 화분으로 옮겨 완전한 식물체(whole plant)로 재분화시킨다.

상기와 같은 방법에 의해 형질전환되어 돼지 대장균 설사증에 대한 경구용 백신으로 사용될 수 있는 식물체로는 일반적인 사료작물이라면 모두 사용될 수 있으며, 바람직하게는 귀리, 호밀, 보리, 옥수수, 피, 조, 강낭콩, 완두, 유채, 해바라기, 감자, 고구마, 호박, 알팔파, 비트, 무, 루타바카, 당근, 상추 및 배추로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 당근을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환 식물체, 이의 절편 또는 이의 추출물을 포함하는 돼지 대장균 설사증의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다. 상기에서 추출물은 액상형태일 수도 있으며, 식물체 또는 이의 절편을 동결 건조하여 분쇄한 분말형태일 수도 있다. 본 발명에 따른 백신 조성물은 약제학적으로 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다. 바람직하게는 경구투여용 제제로 제제화하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 경구투여용 고형제제 또는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등의 액상제제로 제제화하는 것이 바람직하다. 고형제제로 제제화하는 경우에는 본 발명에 따른 백신 조성물에 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분(starch), 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토스(lactose), 젤라틴(gelatin) 등을 혼합할 수 있다. 액상제제로 제제화하는 경우에는 본 발명에 따른 백신 조성물에 물 또는 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 혼합할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 백신 조성물은 사료에 첨가되어 돼지에게 섭취시킴으로써, 이를 섭취한 돼지에게서 돼지 대장균 설사증의 fasG에 대한 항체 형성을 유도하여 면역효과를 유발시킬 수 있다. 이 때 백신 조성물은 분말형태, 입자형태 또는 액상형태로 사료에 첨가되어질 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 형질전환 식물체를 동결 건조하여 이를 분말화한 후, 사료 및 전분과 혼합하여 환제 형태의 사료로 돼지에게 섭취시킬 수 있다. 이와 같이 본 발명에 따른 형질전환 식물체를 사료첨가제로서 사료와 혼합하여 돼지에게 급여하는 경우, 돼지에게 지속적으로 백신을 투여하는 효과를 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환 식물체를 돼지에 투여하여 돼지 대장균 설사증을 예방 또는 치료제로 제공한다. 형질전환 식물체는 그 자체, 그의 절편 또는 추출물의 형태로 돼지에 투여될 수 있으며, 또한 백신 조성물로 제조되어 투여될 수도 있다. 바람직하게는 백신 조성물을 돼지의 사료와 혼합하여 투여하는 것이 바람직하다. 백신 조성물 및 사료의 제조 예는 상기에 기재된 바와 같다. 이 때 본 발명에 따른 백신 조성물의 바람직한 유효량(투여량)은 사료 총 중량에 대하여 1-20 중량%이며, 가장 바람직한 유효량은 사료 총 중량에 대하여 1-10 중량%이다. 또한, 본 발명에 따른 백신 조성물은 3-4일 간격으로 3회 정도 투여하는 것이 바람직하다.

나아가, 본 발명은 식물체로부터 장독성 대장균의 FasG 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명은

a) 장독성 대장균 섬모 말단 유래의 FasG 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 벡터를 구축하는 단계;

b) 상기 식물 형질전환용 벡터로 식물 조직을 형질전환시키는 단계;

c) 상기 식물 조직을 식물체로 재분화시키는 단계; 및

d) 재분화된 형질전환 식물체로부터 FasG 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 식물체로부터 재조합 FasG 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 식물체로부터 생산된 재조합 FasG 단백질은 fasG에 대한 항체를 검출하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 장독성 대장균 설사증에 대한 재조합 단백질 백신으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

FasG 유전자의 클로닝

<1-1> FasG 유전자 증폭

대장균 987P의 FasG 유전자(adhesion gene)의 염기서열(진뱅크 등록번호 L29412)을 바탕으로 하여 이를 증폭하기 위한 프라이머를 제작하였다. 제작된 프라이머의 염기서열을 서열번호 1 및 서열번호 2로 각각 기재하였다. 대장균 987P(단국대학교 생명자원과학부 육종번식학 실험실로부터 분양받음)로부터 당업계에 공지된 방법에 따라 게노믹 DNA를 추출하였다. 이후, 주형 DNA 1ng, 1×완충용액, 0.2mM dNTP, 100pmol 정방향 프라이머, 100pmol 역방향 프라이머, Taq 중합효소 10U(Bionix)로 이루어진 PCR 반응 용액을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 7분 동안 주형 DNA를 전변성화시킨 후, 94℃에서 1분; 57℃에서 1분; 및 72℃에서 1분을 한 사이클(cycle)로 하여 총 30회 반복수행하였다. 이후, 최종적으로 72℃에서 5분간 반응시켰다. PCR 산물을 1.0% 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 1224 bp의 PCR 산물을 확인하였다.

<1-2> 염기서열 분석

상기 실시예 <1-1>에서 얻은 PCR 산물의 염기서열을 분석한 결과, DNA 수준에서 987P FasG 유전자 (진뱅크 등록번호L29412)와 100%의 상동성을 보임을 확인하였다. 또한, 코돈 사용방식(codon usage)의 비교를 통해 상기 FasG 유전자의 염기서열이 당근에서 고빈도로 사용되어지는 코돈으로 구성되어있음을 확인하였으며, 이 결과로부터 FasG 단백질이 당근에서 안정적으로 발현될 수 있을 것으로 판단되었다. 본 발명에 따라 분리된 장독성 대장균 987P FasG 유전자의 염기서열을 서열번호 3으로 기재하였으며, 이로부터 암호화되는 FasG 단백질의 서열을 서열번호 4로 기재하였다. 또한, 하기 표 1에서 보는 바와 같이, 987P 장독소 대장균이 국내 환경에 적응하여 변화되었는지 여부를 확인하기 위하여 현재 농가에서 설사를 일으키고 있는 987P 균주 (00284)를 분리한 서울대학교 수의병리학실험실로부터 분양받아 검증한 결과 변이되지 않았음을 확인할 수 있었다.

표 1. 염기서열 및 아미노산 서열의 상동성 비교 결과

	987P	000284
000284	99^a/99^b	100/100

^a염기서열 상동성(%)

^b아미노산 서열 상동성(%)

<1-3> FasG 유전자를 포함하는 재조합 벡터 구축 및 식물 조직 내의 단백질 생산 최적화 벡터 구축

상기 실시예 <1-1>에서 얻은 PCR 산물을 겔로부터 분리·정제하여 유전자의 지속적인 발현을 유도하는 CaMV 35S 프로모터를 가지고 있는 식물 형질전환용 벡터인 pGA748(포항공대 안진흥 교수로부터 분양받음)에 클로닝하였다. 제조된 벡터를 'pGAfasG'라 명명하였다(도 1 참조).

<실시예 2>

FasG 유전자를 포함하는 형질전환 당근의 제조

<2-1> 식물 재료

상기 실시예 1에서 분리한 FasG 유전자를 도입하기 위한 식물로 조춘5촌(J; 중앙종묘), 한여름 5촌(H; 농우종묘) 및 만산5촌(M; 중앙종묘)으로 이루어진 3품종의 당근을 사용하였다.

<2-2> 아그로박테리움 형질전환 및 배양

상기 실시예 <1-3>에서 제조한 pGAfasG 벡터를 동결-해동(freeze-thaw) 방법(Glevin et al., Plant molecular biology.Kluwer academic Publishers A3/7, 1988)으로 아그로박테리움 LBA4404에 도입시켰다. 이후, FasG 유전자를 포함하는 아그로박테리움을 2일간 M9 배지(6g/ℓ Na₂HPO₄, 3g/ℓ KH₂PO₄, 0.5g/ℓ NaCl, 1g/ℓ NH₄Cl, 0.5g/ℓ MgSO₄, 2g/ℓglucose, 0.015g/ℓ CaCl₂)에서 배양하여 이를 MS⁺ 배지(MS 배지, 0.1㎍/㎖ 2iP, 5㎍/㎖ 2,4-D, 3% sucrose)에 재현탁 시켰다.

<2-3> 당근 형질전환

토마스 등의 방법(Thomas et al., Plant Cell Rep. 8:354357, 1989)에 따라 당근 형질전환을 수행하였다. 각 품종의 당근 종자를 70% 에탄올로 30초간 4회 세척한 후, 상업용 표백제(유한락스)로 20분간 표면 살균하였다. 이후, 멸균 증류수로 3회 수세한 후, 0.7% 피토아카(phytoagar, Duchefa) 고체배지에 치상하여 25℃, 암조건 하에서 2주간 발아시켰다. 생장한 배축을 0.25-0.5㎝ 간격으로 절단한 후, MS⁺ 배지에서 2일간 80rpm로 진탕 배양하였다. 이후, 상기 당근 배축을 상기 실시예 <2-2>에서 재현탁된 아그로박테리움 배양액과 함께 암조건에서 10분간 공동배양한 후, 식물 절편을 자연건조(air dry)하여 MS⁺ 배지에서 2일간 25℃, 80rpm, 암조건에서 배양하였다. 이후, 카르베니실린(carbenicillin) 400㎍/㎖와 카나마이신(kanamycin) 100㎍/㎖이 포함된 MS⁺ 배지에서 형질전환된 개체만을 선발하였다. 총 494개의 형질전환된 캘러스를 얻었다. 각 캘러스를 MS^- 배지(MS 배지, 0.1 ㎍/㎖ 2iP, 2.5% sucrose)로 옮겨 완전한 식물체로 재분화시켰다.

<2-4> 당근 품종에 따른 형질전환 캘러스의 발생율 조사

당근 품종에 따른 캘러스 발생율을 조사한 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 만산5촌, 한여름5촌, 조춘5촌의 순으로 높았다. 또한, 계대배양을 통한 세포주로서의 캘러스의 안정적 유지율은 조춘5촌, 만산5촌, 한여름5촌의 순으로 높았다. 식물체를 만들기 위하여 순화과정까지 살펴본 결과 만산5촌이 당근 형질전환에 가 장 적합한 것으로 나타났다.

표 2. 당근 품종에 따른 형질전환율 및 세포주 유지율

당근 품종	형질전환된 조직 당 발생하는 항생제 저항성 캘러스의 퍼센트 (%)	유지된 세포주의 수	재분화
한여름5촌 조춘5촌 만산5촌	13% 21.5% 40%	201 274 266	13 53 53

<실시예 3>

대장균에서 재조합 FasG 단백질 생산

상기 실시예 1에서 얻은 FasG 유전자를 대장균 발현 시스템인 pET32 벡터(Novagen)에 삽입하고, 이를 대장균에 도입시켰다. 형질전환된 대장균 세포를 OD600 값이 0.6이 될 때까지 배양하고, 4℃에서 16시간 보관한 후, 새로운 배지에서 다시 배양하였다. 이후, OD600값이 0.4-0.6이 되었을 때 IPTG를 최종농도가 1 mM이 되도록 첨가하여 한 시간 동안 더 배양하였다. 이렇게 하여 티오레독신(thioredoxin; 17.38 kDa)과 결합된 62.22KDa의 987P FasG 단백질을 대량 발현시켰다. 이후, pET 시스템 메뉴얼(Novagen)의 불용성 단백질 추출 방법에 따라 필린 단백질을 추출한 후, SDS-PAGE를 수행하였다. 겔로부터 필린 단백질에 해당하는 밴드를 잘라낸 후, 이를 호모게나이저(homogenizer)로 곱게 분쇄하였다. 단백질을 용출시키기 위하여, 분쇄된 겔에 확산 완충용액(diffusion buffer; 50mM Tris-Cl, pH 8.0, 0.1% SDS)을 첨가하여 4℃ 에서 16시간 이상 진탕배양하였다. 4℃, 12000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액만을 수하였다. 회수된 상층액에 4배양의 아세톤을 첨가하고, -20℃에서 16시간 이상 침전시켰다. 다시 원심분리한 후, 펠렛(pellet)을 PBS(phosphate buffer saline) 완충용액에 녹였다. 이렇게 수득된 FasG 단백질은 웨스턴 블럿 분석과 ELISA 분석에 이용되었으며, 또한 재조합 단백질 백신으로 이용되었다.

<실시예 4>

형질전환 당근 분석

<4-1> 형질전환 당근에서 FasG 유전자의 도입 확인

항생제 저항성을 통해 상기 실시예 2에서 얻은 형질전환 세포주 중 체세포 배발생 단계에 있는 35개 세포주(조춘 : 11, 한여름 : 6, 만산 : 18)를 대상으로 FasG 유전자의 도입 여부 확인 실험을 수행하였다. 이를 위해 각 당근으로부터 DNA를 분리한 후, 이를 주형으로 하여 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법에 따라 PCR을 수행하였다. 그 결과, 조사 대상 세포주의 97%에서 FasG 유전자가 게놈DNA (genomic DNA) 내에 안정적으로 삽입되었음이 확인되었다(도 2 참조).

<4-2> 형질전환 당근에서 FasG 단백질의 발현 확인

상기 실시예 <4-1>에서 PCR을 통하여 유전자 도입이 확인된 당근 유식물체에서 FasG 단백질이 발현되는지 확인하기 위하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.

a. FasG 단백질의 폴리클로날 항체 제작

웨스턴 블럿 분석을 위한 1차 항체(primary antibody)를 생산하기 위해, 상기 실시예 3에서 분리된 FasG 단백질 100㎍과 프로운즈 보조제(Freund's adjuvant, GibcoBRL)를 22G 니들(needle)이 연결된 주사기에 넣어 혼합한 후, 토끼의 피하에 2주 간격으로 3회 주사하였다. 이후, 토끼로부터 심장 채혈하고, 얻은 혈청을 동결 건조하여 -70℃에서 보관하였다.

b. 총 단백질 추출

FasG 유전자가 도입되지 않은 비형질전환 당근 유식물체(대조구)와 형질전환 당근 유식물체 0.1 g을 호모게나이저로 분쇄한 후, 동량의 2×샘플 완충용액(protein sample buffer; 0.125M Tris-Cl, pH 6.8, 4% SDS, 20% glycerol, 10% β-mercaptoethanol, 0.0025g Brilliant Blue R)을 첨가하고 균질화(homogenization)하였다. 30초 간격으로 볼텍싱(vortexing)과 아이스(ice)에 두는 과정을 5회 반복한 후, 4℃, 12000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액만을 회수하고 -20℃에 보관하였다.

c. 웨스턴 블럿 분석

상기 b.에서 추출된 총 단백질로 15% SDS-PAGE을 수행하였다. 이후, 트랜스-블럿 세포(Trans-Blot Cell, Bio-Rad)를 이용하여 70V에서 2시간 동안 니트로셀룰로즈 막(nitrocellulose membrane, S&S)에 블럿팅(blotting)하였다. 상기 막을TBST 용액(100mM Tris, pH 8.0, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20)으로 10분간 세척한 후, 5% 넌팻 드라이 밀크(nonfat dry milk)를 포함하는 TBST 용액으로 45분간 블로킹(blocking)하였다. 이후, 상기 a.에서 제작된 FasG 폴리클로날 항체(1차 항체)를 1:2,500의 비율로 TBST 용액에 희석한 후, 이를 상기 막에 처리하여 30분간 반응시 켰다. 1차 항체를 반응시킨 후, 2차 항체(anti-rabbit IgG-AP conjugate, Promega)를 1:7,500의 비율로 TBST 용액에 희석하고 상기막에 처리하여 30분간 반응시켰다. 이후, NBT/BCIP를 이용한 AP 시스템(Promega)으로 상온 암조건에서 발색 반응시켰다. 형질전환 식물조직 내 발현된 FasG 단백질의 정량을 위해 BCA 방법(Sigma)으로 정량된 재조합 FasG 단백질을 포함하는 웨스턴 분석 결과를 멜라이네Ⅲ 프로그램(MelanieⅢ program, Genebio)으로 비교하였다. 그 결과 M3-1, M3-6, M10-17, M10-22, M10-23의 5계통에서 대조구와 차이를 보이는 예상된 크기의 44.5KDa와 비슷한 band를 확인하였다(도 3a참조). 그리고 예상하지 않은 크기의 band(60kDa, 25kDa)를 M3-5, M3-6, M6-17, M6-20, M10-17, M10-22계통에서 확인하였는데 이는 재조합 단백질의 대장균 내 발현 시 자주 일어나는 현상으로서 예상하지 않은 크기의 단백질들은 아마도 세포 내에서 번역 후 변형된 것이거나, 또는 세포 내에서 자기들끼리 결합하여 충분히 변성되지 않아서 생긴 것으로 추정된다. 따라서, 본 발명자들은 대조구와 비교하여 구별되는 밴드들을 모두 도입 유전자 유래의 단백질 밴드로 간주하였다. 또한, 멜라이네Ⅲ 프로그램을 이용한 분석 결과, 상기 7 계통에서 44.5KDa의 FasG 단백질이 0.5~3.5㎍/g 범위의 농도로 축적되었음을 확인할 수 있었다. 이들 계통 중 백신 식물 사용에 적절한 세포주를 선발하기 위하여 식물조직 내 발현되어 축적된 병원균 항원의 양과 식물체 수준에서의 생장속도 및 정상 발육을 기준으로 M3-1, M10-22를 선발하여 대량생산 체계를 구축하였다. 당근 내 항원 생산 여부를 확인하기 위하여 당근뿌리를 이용하여 당근 유식물체와 동일하게 실험을 진행하여 FasG 단백질 발현을 확인하였다(도 3b 참조).

<실시예 5>

987P fasG 형질전환 당근 경구투여를 통한 돼지 대장균 설사증 예방 효과

<5-1> 항원으로 작용할 수 있는 적정농도 확인

16일령 된 3원 교잡종 (Duroc×Yorkshire×Landrace) 자돈 (충남 전의면 소재 힘찬 농장) 15 마리를 5마리씩 총 3 그룹으로 나누었다. 하기 표 3에 기재된 각 시험사료를 유지사료(삼양)에 첨가하여 각 그룹의 자돈에 경구투여하였다. 시험사료의 투여는 16일령, 24일령 및 30일령에 4일 간격으로 3회에 걸쳐 수행하였다(도 7 참조). 이때 음성 대조구에는 유지사료만을 투여하였으며, 동결건조한 일반당근 1g에 5(저농도), 50㎍(고농도) 재조합 단백질(R987PP)을 섞어 사용하여 해당 항원의 효과 검증 및 적정 농도를 확인하였다. 대장균 접종 5일 전부터는 사료에서 항생제(아플라마이신(apramycin), 고려화학)를 제거하여 공급하였다. 하기 표 4에 기재된 각 당근의 중량은 모두 건조 중량(dry weight)이다.

표 3. 실험그룹 및 그에 따른 시험사료

그룹	도면상의 표기	시험사료
음성대조구 양성대조구¹ 양성대조구¹	CON-987P R987PP(low) R987PP(high)	비형질전환 당근(1g/두) 재조합 FasG 단백질¹(5㎍/두)+비형질전환 당근(1g/두) 재조합 FasG 단백질¹(50㎍/두)+비형질전환 당근(1g/두)

¹실시예 3에서 제조된 대장균 재조합 fasG 단백질

<5-2> 항체 형성 조사

콜리간 등의 간접 ELISA(Indirect ELISA) 방법(Coligan et al., Current Protocols in Immun. NIH pp. 2.0.1-22, 1992)에 따라 자돈 내 항체 형성 유무를 분석하였다. 먼저, 상기 실시예 3에서 분리된 재조합 FasG 단백질을 10㎍/㎖가 되도록 탄산-중탄산 완충용액(carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.6)에 희석하고, 마이크로플레이트(microplate, Costar 3590 96 well assay plate)에 100㎍씩 넣어 4℃에서 16시간 이상 코팅(coating)하였다. 코팅된 플레이트를 PBST 용액(0.15 M PBS, 0.05% Tween 20)으로 3회 세척한 후, 5% 논팻 드라이 밀크를 포함하는 PBST 용액을 200 ㎕ 씩 분주하여 실온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 이후, 플레이트를 PBST 용액으로 7회 세척하였다. 상기 실시예 <5-3> 에서 획득된 항혈청을 희석 완충용액(dilution buffer)으로 희석하고, 이를 상기 플레이트에 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. PBST 용액에 1: 5,000의 비율로 희석시킨 2차 항체(anti-mouse IgG-AP conjugate, Promega)를 상기 플레이트에 첨가하여 37℃에서 (0.5)시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 플레이트에 NPP(p-nitrophenyl phosphate, phosphate substrate tablet, Sigma) 기질 완충용액을 첨가하여 15-30분간 상온 암조건에서 발색 반응시켰다. 5M NaOH를 첨가하여 반응을 종료시켰다. 이후, 마이크로타이터 플레이트 리더(microtiter plate reader, V-max, Molecular Devices)를 이용하여 405nm에서 흡광도(absorbance)를 조사하였다.

<5-3> 형질전환 백신당근의 항원성 평가

시험사료 급여 0일, 8일, 14일에 각 자돈으로부터 혈액을 채취하여 하기 실시 예 <5-2> 방법에 따라 ELISA를 수행하였다. 모든 실험을 총 3회 반복 수행하였다. 그 결과, 재조합 FasG 단백질 첨가한 양성대조구 형질전환 당근(실험구)을 경구투여한 지 14일째 되는 혈청에서 음성대조구와 비교하였을 때 높은 항체가를 보였다.

<실시예 6>

987P fasG 형질전환 당근의 백신 효과 입증을 위한 마우스 실험

- 형질전환 당근을 투여시 어미쥐에 생성된 항체가 새끼에 이행되는가를 판단함.

<6-1> 이론적 배경

소화기 계통 대장균 백신 접종된 모돈에서 태어난 자돈의 설사 발생이 많이 감소되고 성장이 촉진된다는 사실이 입증되고 있다. 현재 사용 중인 소화기 계통 질병(전염성위장염, 로타바이러스감염증, 돼지유행성설사병)은 분만 5주전과 2주전 두 번 근육 주사하여 예방하고 있다. 이는 항원 투여 후 항체가 생성되는데 7～10일정도가 소요되기 때문이다 (강, 2003).

초유 항체의 존재가 백신을 중화시켜 적절한 면역반응을 유도하지 못하는 경우도 발생하기 때문에 자돈이 태어난 이후에는 개별의 백신 투여를 실시하지 않았다. LT-B 형질전환된 토마토를 이용하여 실험하였을 경우 3일, 10일을 반복적으로 14회 경구투여 하여 70일과 96일에 혈청을 채취하여 항체가를 측정한 결과 96일이 70일에 비하여 26배 이상 증가하여 분만일을 95일경에 맞추어서 실험 일정을 세웠고 adjuvant와 함께 투여했을 때가 오히려 면역 유도율이 3배정도 낮게 나와 adjuvant처리를 하지 않고 실험을 진행하였다 (Walmsley et al., 2003).

<6-1> 백신 효과 검증을 위한 마우스 형질전환 당근 경구투여

1차 실험에서는 5주령 마우스 (specific pathogene free : SPF, BALB/c - 대한바이오링크사) 12마리를 사용하였으며, 2차 실험에서는 40마리를 사용하였다. 하기 표 4에 기재된 각 시험 재료는 일반당근, 재조합단백질 (R987PP : 100㎍)을 첨가 당근 및 형질전환당근(987P : 2g)의 3처리로 시험을 수행하였다. 시험 사료의 재조는 일반마우스사료 (삼양사)를 녹말과 1 : 1로 혼합한 후 펠렛팅하여 40℃ incubator에서 3일간 건조하여 사용하였다.

사료와 물은 자유채식토록 하였고 12시간 전에는 금식을 시킨 후 3일, 11일 교차시켜 간격을 두고 임신 전 12회, 후 2회 경구투여를 실시하였다 (도 6a, b 참조).

표 4. 실험그룹 및 그에 따른 시험사료

그룹	도면상의 표기	시험사료
음성대조구 양성대조구1 양성대조구2	CON TC R987PP	비형질전환 당근(2g/두) 형질전환 당근(2g/두) 재조합 FasG 단백질(100㎍/두)+비형질전환 당근(2g/두)

1실시예 3에서 제조된 대장균 재조합 필린 단백질

<6-2> 항체 형성 조사

모체로부터 신생마우스로의 항체 이행을 평가하기 위하여 어미 쥐에 987P 백신당근을 경구투여한 후 어미 쥐에서 0일, 60일 (1차실험), 65일 (2차 실험) 및 분 만 후와 21일 동안 포유시킨 후 심장 채혈하였다 (Figure 6). <5-2> 방법으로 ELISA를 실시한 결과 일반당근을 먹인 대조구에 비하여 2배정도 항체가 형성됨을 확인하였고 분만 1일 후 새끼 혈청을 확인한 결과 일부 태반 통과성이 있음을 확인할 수 있었다. 수유 후 새끼의 혈청을 채취하여 동일하게 실험한 결과 일반당근을 먹인 대조구에 비하여 987P백신 당근과 재조합 987P 단백질을 먹인 처리구에서 항체 형성이 확인되어 모체로부터 신생마우스로의 항체 이행의 가능성을 확인하였다 (도 7 참조).

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 장독성 대장균의 FasG 유전자가 도입된 형질전환 식물체를 제조하고, 상기 식물체를 돼지에게 경구투여한 결과, 돼지에서 장독성 대장균 987P 자돈에서 대장균에 의한 설사증을 예방할 수 있음을 확인하였다. 본 발명에 따른 형질전환 식물체 및 이를 포함하는 백신 조성물은 돼지 대장균 설사증을 치료 또는 예방하는데 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 종래 돼지 대장균 설사증 방지에 사용되고 있는 항생제를 대체하는 고부가가치 사료첨가제로서 유용하게 사용될 수 있으며, 이를 통해 양돈 농가의 생산성 향상과 고품질 축산물의 생산에 크게 이바지할 것으로 기대된다.

Claims

서열번호 4로 표시되는 장독성 대장균(enterotoxigenic E. coli ETEC) 987P 유래의 FasG 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 형질전환 식물체, 이의 절편 또는 이의 추출물을 포함하는 돼지 대장균 설사증의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 백신은 경구투여용인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1항의 백신 조성물을 포함하는 돼지 대장균 설사증의 예방 또는 치료용 사료 첨가제.
제 1항의 백신 조성물 또는 제 3항의 사료 첨가제를 돼지에 경구투여하는 것을 포함하는 돼지 대장균 설사증을 예방 또는 치료하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.