CZ20001069A3 - Sekvence nukleové kyseliny, alely a deriváty, molekula nukleové kyseliny, protein, mikroorganizmus, transgenní rostliny, dvouděložné rostliny, jednoděložné rostliny, transgenní rostlinné buňky, způsob vytváření rostlin, použití rostlin, použití sekvence nukleové kyseliny - Google Patents

Abstract

Nové sekvence nukleové kyseliny, které kódují geranylgeranyl reduktázu, způsob vytváření nových rostlin obsahujících novou DNA sekvenci, jejichž obsah tokoferolu a/nebo chlorofylu je změněn ve srovnání se standardním typem rostlin a nové rostliny, jejich částí a/nebo výrobky z nich a rostlinné buňky. Použití DNA sekvencí pro řízení obsahu tokoferolu, chlorofylu a/nebo vitaminu K1 v transgenních rostlinách, jejich částech a/nebo výrobcích z nich a rostlinných buňkách.

Description

Sekvence nukleové kyseliny, alely a deriváty, molekula nukleové kyseliny, protein, mikroorganizmus, transgenní rostliny, dvouděložné rostliny, jednoděložné rostliny, z transgenní rostlinné buňky, způsob vytváření rostlin, použití rostlin, použití sekvence nukleové kyseliny.

Oblast techniky

Předložený vynález se týká nových sekvencí nukleové kyseliny, které kódují geranylgeranyl reduktázu, způsobu vytváření nových rostlin, které obsahují nové sekvence nukleové kyseliny a jejichž obsah tokoferolu anebo chlorofylu je změněný ve srovnání se standardním typem rostlin, těchto nových rostlin, jejich částí a plodů a rostlinných buněk, rovněž použití sekvencí nukleové kyseliny pro ovlivňování obsahu tokoferolu, chlorofylu anebo vitaminu Kg v transgenních rostlinách, jejich částech, plodech a rostlinných buňkách.

Dosavadní stav techniky

Diterpen geranylgeranyl pyrofosfát (GGPP) je tvořen jako C₂o-meziprodukt v průběhu metabolizmu rostlinných izoprenoidů. Je výsledkem přidání jedné jednotky izopentenyl pyrofosfátu (IPP) k farnesyl pyrofosfátu, což je C₁₅-seskviterpen. GGPP vstupuje do několika syntetických biochemických drah druhotného metabolizmu rostlin. Například dvě molekuly GGPP mohou být spojeny „svými konci*(„tail to tail“) a vytvoří tak C₄₀-molekuly, tetraterpeny, obecně nazývané karotenoidy, k nimž například patří βkaroten. Přidáním dalších molekul IPP, GGPP dále vstupuje do biosyntézy polyterpenů, jako jsou guma a gutaperča.

Dále může být GGPP transformován na jiné diterpeny, jako je fýtyl pyrofosfát (PPP). C₂o-molekula fytolu je běžný meziprodukt v biosyntéze tokoferolů (Soli a Schulz (1981) Biochem. Biophys. Res. Commun. 99, 907-912), rovněž syntézy chlorofylů (Beale a Weinstein (1990) v Biosynthesis of Heme and Chlorophyll (vyd. Daily H. A.) McGraw Hill, NY, 287-391). Zatímco základní strukturou všech chlorofylů (chlorofyl a, b, c atd.) je porfyrinový systém, skládající se ze čtyř pyrolových kruhů, a k tomuto systému je fytol vázán esterovou vazbou přes pyrolový kruh IV, tokoferoly jsou • ·

charakterizovány strukturou skládající se z homogentizátu a fytolového zakončení.

Skupina tokoferolů, obecně označované jako vitamin E, obsahuje několik strukturálně podobných lipofilních vitaminů, viz α-, β-, γ-, δ- a ε-tokoferol, z nichž je z biologického hlediska nejdůležitější α-tokoferol. Tokoferoly je možno nalézt v mnoha rostlinných olejích, zvláště bohaté na tokoferoly jsou oleje ze semen sóji, pšenice, kukuřice, rýže, bavlny, vojtěšky a ořechů. Také ovoce a zelenina, například maliny, fazole, hrách, fenykl, pepř atd., obsahují tokoferoly. Jak je doposud známo, tokoferoly jsou syntetizovány výlučně v rostlinách a fotosynteticky aktivních organizmech.

Pro jejich redoxní potenciál tokoferoly přispívají k zabránění oxidace nenasycených mastných kyselin vzdušným kyslíkem; α-tokoferol je nejdůležitějším lipofilním antioxidantem u člověka. Je předpokládáno, že při své funkci antioxidačních činidel tokoferoly přispívají k stabilizaci biologických membrán, protože tekutost membrán je udržována chráněním nenasycených mastných kyselin u membránových lipidů. Dále podle nedávných pozorování, pravidelný příjem relativně vysokých dávek tokoferolů může působit proti vývoji arteriosklerózy. Byly popsány další kladné fyziologické vlastnosti a vlivy tokoferolů, jako je zpoždění vzniku poškození spojených s diabetem, snížení rizika vývoje zákalu, snížení oxidační zátěže u kuřáků, protirakovinné účinky, ochranné účinky proti poškození kůže, jako jsou zarudnutí a stárnutí kůže atd.

Pro jejich oxidačně inhibiční vlastnosti jsou tokoferoly využívány nejen v rámci potravních technologií, ale jsou také používány v malířství založeném na přírodních olejích, v deodorantech a jiných kosmetických výrobkách, jako jsou přípravky chránící proti slunci, přípravky péče o kůži, rtěnky atd. Při takových aplikacích jsou tokoferolové sloučeniny jako octan a jantaran tokoferylu obvykle používanými formami při uplatnění jako vitamin E, jako přípravky podporující krevní oběh a snižující hladinu lipidů a jako přídavky do potravy při uplatnění veterinárním.

Má se za to, že v biosyntéze tokoferolů, zvláště v biosyntéze α-tokoferolu, je limitujícím faktorem fytyl pyrofosfát. Předchozí studie naznačují, že PPP je tvořen zGGPP postupnou hydrogenací izoprenoidové skupiny, během níž se tvoří jako meziprodukty dihydro-GGPP a tetrahydro-GGPP (GGPP -> dihydro-GGPP -> tetrahydro-GGPP -> PPP; srv. například Bollivar a kol., (1994) Biochemistry 33,1276312768).

• · · · • ·

Postupná hydrogenace GGPP na PPP je, jak se v současné době předpokládá, katalyzována enzymem geranylgeranyl reduktázou (GGPP reduktáza, také nazývaná geranylgeranyl pyrofosfát hydrogenáza a GGPP hydrogenáza), která je kódována v rostlinách genem Chl P. Enzym geranylgeranyl reduktáza patří do metabolizmu izoprenoidů a funguje ve dvou metabolických drahách: biosyntéze tokoferolu a biosyntéze chlorofylu.

Základní úloha tohoto enzymu byla ukázána poprvé pro biosyntézu chlorofylu (Benz a kol., (1980) Plant Sci. Lett. 19, 225-230; Soli a Schultz (1981) Biochem. Biophys. Res. Commun. 99, 907-912; Schoch a kol., (1977) Z. Pflanzenphysiol. 83, 427-436). Konečným krokem v biosyntéze chlorofylu je esterifikace chlorofylidu, která může být provedena fytyl pyrofosfátem a rovněž geranylgeranyl pyrofosfátem. Při systematických studiích mutant Rhodobacter capsulatus mohlo být ukázáno, že bacteriochlorofilid je esterifikován v prvním kroku GGPP a poté je esterifikovaný chlorofyl-GG hydrogenován (Katz a kol., (1972) J. Am. Chem. Soc. 94, 7938-7939). U vyšších rostlin může být ve většině případů nalezen fytyl-chlorofyl (chlorofyl-P) (Růdiger a Schoch (1991) v: Chlorophylls (Scheer, H., vyd.) str. 451-464, CRC Press, Boča Raton, Florida, USA). Doposud nebylo ještě vyjasněno, které substráty se účastní v reduktázové reakci v rostlinách. Předpokládá se, že rostlinný enzym geranylgeranyl reduktáza je schopen transformovat chlorofyl-GG na chlorofyl-P (Schoch a kol., (1978) Z. Pflanzenphysiol. 83, 427-436) a rovněž hydrogenovat GGPP na PPP, který je pak následně spojen s chlorofylidem (Soli a kol., (1983) Plant Physiol. 71, 849-854).

GGPP slouží jako substrát pro syntetické biochemické dráhy tokoferolu a fylochinonu ve vnějších membránách chloroplastů a pro syntézu chlorofylu v membránách thylakoidů. Redukce GGPP na PPP byla popsána poprvé v roce 1983 v Soli a kol. (Plant Physiol. (1983) 71, 849-854). Avšak doposud nebyla úspěšná izolace a charakterizace sekvencí nukleové kyseliny, které kódují rostlinné enzymy a které mohou být použity pro ovlivňování obsahu tokoferolu v transgenních rostlinách.

Základní úloha geranylgeranyl reduktázy v metabolizmu tokoferolu a chlorofylu činí tento enzym zvláště hodnotným nástrojem pro molekulární biotechnologii. Pomocí molekulárně biologických technik, jako je přenos DNA sekvencí, kódujících geranylgeranyl reduktázu, by mohlo být možné dosáhnout změn v průběhu biosyntézy tokoferolu anebo chlorofylu u rostlin. Tímto způsobem by mohlo být například možno ·

vypěstovat transgenní rostliny, které mají zvýšený nebo snížený obsah tokoferolu. Takové transgenní rostliny a jejich části, buňky anebo jejich plody, mohou být pak následně použity jako potrava a krmivo a obecně pro produkci tokoferolu, pro chemické, farmaceutické a kosmetické průmyslové použití.

Dále je důvod očekávat že rostliny, které vykazují zvýšený obsah antioxidačních tokoferolu ve srovnání se standardními typy rostlin, také vykáží zvýšenou odolnost proti nepříznivým podmínkám, zvláště proti zhoršeným oxidačním podmínkám.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je proto poskytnout nové sekvence nukleové kyseliny, s jejichž pomocí může být ovlivňován obsah tokoferolu v rostlinách, rostlinných buňkách, částech rostlin anebo rostlinných plodech.

Dále je důležitým předmětem tohoto vynálezu poskytnout transgenní rostliny, rostlinné buňky, rostlinné plody a části rostlin, které mají změněný obsah tokoferolu ve srovnání se standardním typem rostlin.

Dalším předmětem vynálezu je ukázat možné cesty, jak využít DNA sekvence, které jsou předmětem tohoto vynálezu, produktů jejich genů a rovněž transgenních rostlin, které jsou předmětem tohoto vynálezu, pro rostlinnou šlechtitelskou praxi.

Další předměty vynálezu budou zřejmé z následujícího popisu. Tyto problémy jsou řešeny jako předměty nezávislých patentových nároků, založených zvláště na poskytnutí DNA sekvencí, které jsou předmětem tohoto vynálezu, produktů genů, které jsou přímo zapojeny do biosyntézy tokoferolu a přenosu těchto DNA sekvencí do rostlin, což má za následek změněný obsah tokoferolu.

Předkládaný vynález se tedy týká DNA sekvencí, které kódují proteiny, které mají biologickou aktivitu geranylgeranyl reduktázy (také nazývané geranylgeranyl pyrofosfát hydrogenáza) nebo jejich biologicky aktivní fragment. Ve spojení s tímto vynálezem, biologicky aktivní fragment znamená, že zprostředkovaná biologická aktivita je dostatečná, aby ovlivnila obsah tokoferolu. Vynález se tedy vztahuje na DNA sekvence, které jsou izolovány z rostlin a které kódují proteiny, které mají enzymatickou aktivitu geranylgeranyl reduktázy nebo jejich biologicky aktivní fragment. Zvláště výhodná je DNA sekvence uvedená v SEQJD NO. (sekvence číslo): 1 (viz také obrázek

1).

Vynález se dále týká alel a derivátů DNA sekvencí, které jsou předmětem tohoto vynálezu, které kódují protein, který má enzymatickou aktivitu geranylgeranyl reduktázy, zvláště molekuly nukleové kyseliny, jejichž sekvence se liší od DNA sekvencí, které jsou předmětem tohoto vynálezu, v důsledku degenerace genetického kódu a které kódují protein nebo jeho fragment, který má enzymatickou aktivitu geranylgeranyl reduktázy.

Vynález se dále vztahuje na molekuly nukleové kyseliny, které obsahují DNA sekvence, které jsou předmětem tohoto vynálezu, nebo které pocházejí ze sekvencí, které jsou předmětem tohoto vynálezu, které se vyskytují v přírodě nebo vznikly postupem genovým technologickým nebo chemickým procesem a syntetickými metodami, nebo které jsou z nich odvozeny. Molekuly nukleové kyseliny mohou být jakoukoli formou nukleové kyseliny, jako je DNA nebo RNA molekuly, cDNA, genomová DNA, mRNA atd.

Vynález se také týká molekul nukleové kyseliny, kdy jsou DNA sekvence, které jsou předmětem tohoto vynálezu, spojeny s regulačními elementy, které zabezpečují transkripci a pokud je to žádoucí i translaci v buňkách rostlin.

Je tedy možné exprimovat DNA sekvence, které jsou předmětem tohoto vynálezu, v rostlinných buňkách, například pod kontrolou konstitutivních, ale také indukovatelných nebo tkáňově specifických nebo vývojově specifických regulačních elementů, zvláště promotorů. Zatímco například použití indukovatelných promotorů umožňuje dosáhnout specificky spustitelné exprese DNA sekvencí, které jsou předmětem tohoto vynálezu, v rostlinných buňkách, použití tkáňově specifických promotorů, například promotorů specifických pro semena, poskytuje možnost ovlivnit obsah tokoferolu ve specifických tkáních, například ve tkáni semena. Proto ve výhodném provedení vynálezu DNA sekvence, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou kombinovány s tkáňově specifickými promotory, zvláště s promotory specifickými pro semena.

Vynález se dále týká proteinů, které mají biologickou aktivitu geranylgeranyl reduktázy nebo jsou jejími aktivními fragmenty, které jsou kódovány DNA sekvencí, která je předmětem tohoto vynálezu, nebo molekulou nukleové kyseliny, která je • · · 0 «« 0000 0 · « · ♦ · · · · ·

0··· « « · « • 0 000 ·0 0 • · « 0 0·· «0 · · 0 ·· 0 · předmětem tohoto vynálezu. Je výhodné když proteinem je geranylgeranyl reduktáza, výhodně z Nicotiana tabacum, zvláště výhodný je protein, který má aminokyselinovou sekvenci, která je uvedena v SEQ:ID NO. 2 (srv. také obrázek 2), nebo jeho aktivní fragment.

Dále je předmětem vynálezu poskytnout vektory a mikroorganizmy, jejichž použití umožňuje vytvářet nové rostliny, ve kterých může být dosaženo změněného obsahu tokoferolu. Tento úkol je vyřešen poskytnutím vektorů a mikroorganizmů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, které obsahují sekvence nukleové kyseliny kódující enzymy, které mají aktivitu geranylgeranyl reduktázy.

Předkládaný vynález se tedy také týká vektorů, zvláště plazmidů, kosmidů, virů, bakteriofágů a jiných vektorů obvykle používaných v genovém inženýrství, které obsahují molekuly nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu jak je popsáno výše, a které pokud je to požadováno, mohou být použity pro přenos molekul nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, do rostlin a rostlinných buněk.

Vynález se také týká transformovaných mikroorganizmů, jako jsou bakterie, viry, houby, kvasinky atd., které obsahují sekvence nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu.

Ve výhodném provedení molekuly nukleové kyseliny, obsažené ve vektorech, jsou spojeny s regulačními elementy, které zabezpečují transkripci a pokud je to vyžadováno i translaci v prokaryotických a eukaryotických buňkách.

Pokud je to vyžadováno, sekvence nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být doplněny sekvencemi zesilovačů transkripce nebo jiných regulačních elementů. Tyto regulační sekvence obsahují například také signální sekvence, které zabezpečují transport genových produktů do určitých oddělení buňky.

Předmětem vynálezu je také poskytnout nové rostliny, rostlinné buňky, části rostlin nebo rostlinné plody, které vykazují změněný obsah tokoferolu, který může být spojen s pozměněným průběhem biosyntézy chlorofylu, ve srovnání se standardním typem rostlin.

Tyto problémy byly řešeny vnesením molekul nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, a jejich exprimováním v rostlinách. Tím, že byly poskytnuty molekuly nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, je nyní možné • · · · • · • · ···· ·· • fc · · · · · • fcfcfcfc « ·· · • fc · fcfcfc « · · •fc fcfc fcfc fcfc · •fcfcfc fcfcfc fcfc · · ·· manipulovat s rostlinnými buňkami pomocí metod genové technologie takovým způsobem, že vykazují novou nebo změněnou geranylgeranyl reduktázovou aktivitu ve srovnání se standardním typem rostlinných buněk, a následkem toho vykazují pozměněný průběhem biosyntézy tokoferolu a změněný obsah tokoferolu.

Ve výhodném provedení se vynálezu týká rostlin, rostlinných buněk a jejich částí, ve kterých je obsah tokoferolu zvýšen ve srovnání se standardním typem rostlin následkem přítomnosti a exprese molekul nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu.

Vynález se také týká rostlin, u kterých přenos molekul nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, vede ke snížení obsahu tokoferolu anebo chlorofylu. Snížená produktivita biosyntézy tokoferolu anebo chlorofylu může být například dosažena přenesením konstruktů s pozitivním DNA řetězcem nebo jinými supresními mechanizmy, jako je například společná suprese.

Dále se vynález týká transgenních rostlinných buněk a rostlin obsahujících takové rostlinné buňky, jejich částí a plodů, ve kterých jsou nové molekuly nukleové kyseliny zabudovány do rostlinného genomu. Vynález se také týká rostlin, v jejichž buňkách je sekvence nukleové kyseliny, která je předmětem tohoto vynálezu, přítomna v samostatně se replikující formě, tj. rostlinná buňka obsahuje cizí DNA na samostatné molekule nukleové kyseliny.

Rostlinami, které jsou transformovány molekulami nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, a ve kterých je syntetizováno změněné množství tokoferolu anebo chlorofylu následkem přenosu takové molekuly, mohou být principiálně kterékoli rostliny. S výhodou je takovou rostlinou jednoděložná nebo dvouděložná užitková rostlina. Příklady jednoděložných rostlin jsou rostliny které patří do rodu avena (oves), trcium (pšenice), secale (žito), hordeum (ječmen), oryza (rýže), panicům, pennisetum, setaria, sorghum (proso), zea (kukuřice). Dvouděložné užitkové rostliny jsou, mezi jinými, luskovité rostliny, jako jsou luštěniny a zvláště vojtěška, sója, brukev řepka, rajské jablíčko, cukrová řepa, brambory, okrasné rostliny, stromy. Jiné užitkové rostliny mohou být například ovocné stromy (zvláště jabloně, hrušky, třešně, vinná réva, citrusové rostliny, ananasy a banány), olejové palmy, čajovník, kakaovníkové a kávovníkové keře, tabák, agáve sisalová, bavlník, len, slunečnice a rovněž léčivé rostliny a trávy z pastvin, picni obiloviny a krmné rostliny. Zvláštní ♦9 ···· • · • · · ·

9

9

999

9 9 · ♦ · 9 ·

9 9 9 • 9 * ·

9 9 · • « · · přednost je dávána obilninám, obilovinám, pšenici, žitu, ovsu, ječmenu, rýži, kukuřici a prosu, pícním obilovinám, cukrové řepě, brukvi řepce, rajským jablíčkům, bramborám, sladkým trávám, krmným trávám, trávám z pastvin a jeteli. Je samozřejmé, že se vynález týká zvláště běžných potravinových a krmných rostlin. V této souvislosti musí být, vedle již jmenovaných rostlin, zmíněny podzemnice olejná, čočka, krmné boby (Ackerbohne), řepa burák, pohanka, mrkev, topinambura, Brassica (rapa, oleifera, napus, rapifera), hořčice a tuřín.

Dále se vynález týká rozmnožovacího materiálu z rostlin, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jako jsou semena, plody, řízky, hlízy, kořenové oddenky atd., pokud tento rozmnožovací materiál může obsahovat výše popsané transgenní rostlinné buňky a rovněž části takových rostlin, jako jsou protoplasty, rostlinné buňky a závaly.

Dále se vynález týká rostlinných buněk které, v důsledku přítomnosti a pokud je to žádoucí tak i exprese molekul nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mají změněný obsah vitaminu Ki ve srovnání s rostlinnými buňkami, které neobsahují molekuly nukleové kyseliny. Lipofilní vitamin Ki, který je obsažen zvláště v rostlinách, hraje podstatnou roli při tvorbě koagulačních faktorů; nedostatek vitaminu Kj vede ke snížení srážlivosti krve, z tohoto důvodu je vitamin Κ_Ί nazýván také antihemoragický nebo koagulační vitamin. Protože exprese molekul nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, má za následek změnu aktivity geranylgeranyl reduktázy a tedy změnu průběhu syntézy PPP, a z hlediska skutečnosti, že fylochinon, nazývaný vitamin K₁₍ jako tokoferoly, obsahuje jednu fytolovou jednotku, vynález týká také rostlinných buněk a rostlin, které vykazují změněný obsah vitaminu K_1t buď samostatně nebo v kombinaci se změněným obsahem tokoferolu.

Ve výhodném provedení se vynález týká transgenních rostlinných buněk, rostlin, jejich částí a plodů, které mají změněný obsah tokoferolu ve srovnání s netransformovanými buňkami které, v důsledku přítomnosti a pokud je to žádoucí tak i exprese DNA sekvence, která kóduje rostlinnou geranylgeranyl reduktázu. Je výhodné, když DNA sekvence, obsažená v rostlinných buňkách, je sekvence kódující geranylgeranyl reduktázu, která je izolovaná z tabáku. Zvláště výhodná je DNA sekvence uvedená v SEQ:ID NO. 1 (srv. také obrázek 1). Ve zvláště výhodném provedení DNA sekvence, které jsou předmětem tohoto vynálezu, kódují proenzym geranylgeranyl reduktázy, obsahující tranzitní sekvenci pro přemístění do plastidů.

♦ φφ · • φ φ φ φφ φ · · · φ φ • φφφ .ί. ί ·..··..·

Vynález se týká dále rostlin, ve kterých je vedle genu chl P exprimován gen pro dioxygenázu hydroxyfenyl pyrohroznové kyseliny (HPD). Enzym HPD katalyzuje reakci 4-hydroxyfenyl pyrohroznové kyseliny na homogentizát který, jak bylo uvedeno výše, představuje vedle fytolu druhý prekurzor tokoferolů. Enzym HPD a rovněž jeho role v rostlinném metabolizmu izoprenoidů jsou popsány, mimo jiné v Norris a kol., The Plant Cell 7,2139-2149.

Společnou expresí, výhodněji nadbytečnou expresí sekvencí, které kódují geranylgeranyl reduktázu a HPD, může být obsah tokoferolů v transgenních rostlinách dále zvýšen ve srovnání s rostlinami, které obsahují pouze sekvence kódující chl P, které jsou předmětem tohoto vynálezu.

V jiném provedení se vynález týká hostitelských buněk, zvláště prokaryotických nebo eukaryotických buněk, které byly transformovány nebo infikovány molekulou nukleové kyseliny nebo vektorem, popsanými výše, a buněk pocházejících z těchto hostitelských buněk, které obsahují popsané molekuly nukleové kyseliny a vektory. Hostitelskými buňkami mohou být například bakterie, buňky řas, buňky kvasinek a hub a rovněž rostlinné a živočišné buňky. Vynález se také týká těch hostitelských buněk, které nejen že obsahují molekuly nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, ale obsahují dále jednu nebo více molekul nukleové kyseliny, přenesených pomocí genové technologie nebo přirozeným způsobem, které nesou genetickou informaci pro enzymy, účastnící se biosyntézy tokoferolů, chlorofylu anebo vitaminu Κ_ν

Dále je předmětem předloženého vynálezu poskytnout metodu pro vytvoření rostlinných buněk a rostlin, které vykazují změněný obsah tokoferolů.

Tento problém je řešen pomocí metody, pomocí níž je možno vytvořit nové rostliny a rostlinné buňky, které vykazují změněný obsah tokoferolů následkem přenesení molekul nukleové kyseliny, kódující geranylgeranyl reduktázu.

Dále je tento problém řešen pomocí metody, pomocí níž je možno vytvořit nové rostlinné buňky a rostliny, které následkem společného přenosu molekul nukleové kyseliny, kódující geranylgeranyl reduktázu a molekul nukleové kyseliny, kódující HPD nebo přenosu molekul nukleové kyseliny kódující geranylgeranyl reduktázu a HPD, vykazují změněný obsah tokoferolů ve srovnání se standardním typem rostlin.

Pro vytvoření takových nových rostlinných buněk a rostlin lze použít několik různých metod. Na jedné straně mohou být rostliny a rostlinné buňky pozměněny • toto to • <» ♦to ···· to · ·· to· « ·· · * ·· · • · · ·· · • · · · · běžnými transformačními metodami genové technologie tak, že do genomu rostliny jsou vloženy nové molekuly nukleové kyseliny, čímž jsou vytvořeny stabilní transformanty. Na druhé straně mohou být nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jejichž přítomnost a pokud je to žádoucí, i jejich exprese mají za následek změnu v průběhu biosyntézy tokoferolu, vneseny do rostlinných buněk nebo rostlin jako samostatně se replikující systémy. Například molekuly nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být obsaženy ve viru, který se dostane do kontaktu s rostlinou nebo rostlinnou buňkou.

Rostlinné buňky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, a které následkem exprese sekvence nukleové kyseliny, která je předmětem tohoto vynálezu, vykazují změněný obsah tokoferolu, jsou vytvářeny způsobem, který obsahuje následující kroky:

a) Vytvoření expresní kazety, která obsahuje následující DNA sekvence:

promotor, který zabezpečuje transkripci v rostlinných buňkách; přinejmenším jednu sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje protein nebo jeho aktivní fragment, který má aktivitu geranylgeranyl reduktázy, kde sekvence nukleové kyseliny je připojena k 3' konci promotoru v negativní DNA orientaci; a případně terminační signál pro ukončení transkripce a připojení poly-A sekvence k odpovídajícímu transkriptu, přičemž terminační signál je připojen na 3' konec kódující oblasti;

b) transformace rostlinných buněk expresní kazetou, vytvořenou v kroku a);

c) zregenerování transgenních rostlin a pokud je to žádoucí, rozmnožení rostlin.

Jinou možností je, že jedna nebo více sekvencí nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být vneseny do rostlinných buněk nebo rostlin jako samostatně se replikující systém.

V dalším možném provedení může být krok a) výše uvedené metody modifikován tím způsobem, že přinejmenším jedna sekvence nukleové kyseliny, která je předmětem tohoto vynálezu, která kóduje protein nebo fragment mající geranylgeranyl reduktázovou aktivitu, je připojena k 3' konci promotoru v pozitivní DNA orientaci.

Dalším předmětem vynálezu je ukázat výhodné aplikace sekvencí nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, a rovněž tak molekul nukleové kyseliny, které obsahují tyto sekvence nukleové kyseliny.

• ··*· ·· ··*· ·· · .· · · · · ···· • · · . ... ··«* • · · . · ···*· ·

Tento úkol je řešen tak, že nové molekuly DNA, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou použity pro přípravu rostlinných buněk a rostlin, které vykazují změněný, s výhodou zvýšený obsah tokoferolu ve srovnání se standardním typem rostlin.

Vynález se dále týká použití sekvencí nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, pro přípravu rostlin, které vykazují změněný obsah chlorofýlu.

Dále se vynález vztahuje na použití sekvencí nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, pro přípravu rostlin, které vykazují změněný, s výhodou zvýšený obsah vitaminu K-i.

Dalším předmětem vynálezu je ukázat možná použití rostlin, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jejich buněk, částí a plodů.

Vynález se zvláště vztahuje na použití rostlin, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jako krmné a potravinové rostliny. V závislosti na dosaženém zvýšení obsahu vitaminu E anebo Ki v transgenní užitkové rostlině a v jejích částech a plodech, může být možné snížit množství dotyčných vitaminů, zvláště vitaminu E, který je rovněž běžně přimícháván do krmivá či potravy a který je také často vyžadován. Za jistých okolností se běžné doplňování vitamínů může stát nadbytečným. Vedle toho se tento vynález obecně vztahuje ke zvýšení nutriční hodnoty užitkových rostlin pomocí zvýšení obsahu tokoferolů anebo fylochinonu.

Dále se vynález vztahuje na použití rostlinných buněk, rostlin, jejich částí a plodů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, pro přípravu vitamínů E anebo K₍. Vedle jejich použití, založeného na jejich vitamínových charakteristikách, např. v dietních a farmaceutických výrobcích, kosmetice, výrobcích určených pro péči o kůži, obecně pro jejich obsah vitaminu E atd., jsou tokoferoly také používány jako antioxidanty v chemických výrobcích jako jsou lipidy a oleje. Rostliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, tak představují důležitý zdroj pro výrobu tokoferolů anebo vitaminu Ki pro široké spektrum komerčních účelů.

Vynález se dále vztahuje na použití sekvencí nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, ve spojení s promotory specifickými pro semena, pro přípravu rostlin, ve kterých zvláště tkáně semen vykazují změněný, s výhodou zvýšený obsah tokoferolu. Ve výhodném provedení vynálezu, sekvence nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou použity ve spojení s USP (Báumlein a kol., (1991) Mol. Gen. Genet. 225, 459-467) nebo s hordeinovým promotorem (Brandt a kol., *·«· ··<· to · • ··« (1985) Carlsberg Res. Commun. 50, 333-345).

Výše zmíněné promotory, zvláště promotory specifické pro semena, jsou zvláště vhodné pro specifické snížení obsahu tokoferolů a chlorofyly v transgenních semenech, tím že se použijí DNA sekvence, které jsou předmětem tohoto vynálezu, ve spojení s pozitivním DNA řetězcem.

Dále se vynález týká použití geranylgeranyl reduktázového genu pro změnění obsahu tokoferolů v rostlinách.

Navíc se vynález vztahuje na použití proteinu, který má enzymatickou geranylgeranyl reduktázovou aktivitu, pro dosažení změněného obsahu tokoferolů v rostlinách.

Dále se vynález vztahuje na použití molekul nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, proteinů, které jsou předmětem tohoto vynálezu a mají geranylgeranyl reduktázovou aktivitu anebo transgenních rostlin a hostitelských buněk, které jsou předmětem tohoto vynálezu a které mají buď novou anebo pozměněnou geranylgeranyl reduktázovou aktivitu, pro určování nových herbicidních látek pro ochranu rostlin. Pro klíčovou úlohu geranylgeranyl reduktázy v biosyntéze chlorofylu a tokoferolů, DNA sekvence, které jsou předmětem tohoto vynálezu, a proteiny jimi kódované, jsou výjimečně užitečným cílem pro výzkum herbicidů.

Například proteiny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, a které mají enzymatickou geranylgeranyl reduktázovou aktivitu, mohou být použity pro strukturní analýzu pomocí X-paprsků, pro NMR spektroskopii, molekulární modelování a navrhování léků, aby byly zjištěny nebo syntetizovány inhibitory nebo efektory geranylgeranyl reduktázy a tedy potenciální herbicidy, na základě údajů a znalostí získaných těmito technikami.

Vynález se dále vztahuje na použití sekvencí nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, pro přípravu rostlin tolerantních k herbicidům. Sekvence kódující geranylgeranyl reduktázu mohou být pozměněny pomocí standardních technik, nebo mohou být doplněny novými sekvenčními elementy a následně přeneseny do rostlinných buněk. Přenos sekvencí odvozených ze sekvencí, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být například použity pro změnu vlastností rostlin takovým způsobem, že více nebo méně funkčně aktivní geranylgeranyl reduktáza nebo varianta geranylgeranyl reduktázy, která má pozměněné charakteristiky, je syntetizována • «fefe • fe fefe • fe fefefefe • fe fefe fe·· • fefe · • · · fe • fefe · fefe fefe v transgenních rostlinách, nebo že úroveň exprese genu chl P, přítomného v transgenní rostlině, je snížena. Následkem zvýšení aktivity ChL P, může být dosaženo zvýšení tolerance k herbicidům, které blokují biosyntézu chlorofylu. Podobně například exprese pozměněných geranylgeranyl reduktázových genů v transgenních rostlinách může být svázáno se zvýšením tolerance k herbicidům.

Dále se vynález týká použití sekvencí nukleové kyseliny,které jsou předmětem tohoto vynálezu, nebo jimi kódovaných proteinů pro přípravu protilátek.

Předkládaný vynález tedy obsahuje kterékoli možné použití molekul nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jejichž přítomnost a pokud je to žádoucí i jejich exprese v rostlinách způsobuje změnu obsahu tokoferolu anebo chlorofylu, stejně jako kterékoli možné použití proteinů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, a jejich fragmentů, jejichž enzymatická aktivita vede k takovýmto změnám.

V principu může být použit kterýkoli promotor, funkční ve vybrané rostlině, který splňuje požadavek, že tímto promotorem kontrolovaná exprese vede ke změněné schopnosti syntézy tokoferolu. Z hlediska použití transgenních rostlin jako potrava anebo krmné rostliny, promotory které umožňují specifickou expresi v semenech jsou v tomto ohledu zvláště vhodné. Příklady takových promotorů jsou USP promotor, hordeinový promotor a napinový promotor.

V případě, že takové promotory nejsou již známy nebo nejsou ještě dostupné, osobám se zkušeností v tomto oboru jsou známy strategie a metody izolace takových promotorů. Obecně je v prvním kroku izolována poly(A)⁺ RNA z tkáně semena a je vytvořena cDNA knihovna. V druhém kroku jsou pomocí cDNA klonů, založených na poly(A)⁺ RNA molekulách, pocházejících z jiné tkáně než ze semena, identifikovány z první knihovny pomocí hybridizace ty klony, jejichž odpovídající poly(A)⁺ RNA molekuly jsou exprimovány pouze ve tkáni semene. Následně jsou pomocí cDNA, identifikovaných tímto způsobem izolovány promotory, které pak mohou být použity pro kontrolu exprese kódujících DNA sekvencí, zde popsaných. Podobně mohou být izolovány jiné tkáňově specifické nebo vývojově specifické promotory nebo promotory, které lze indukovat abiotickými stimuly a použity podle vynálezu.

V jiném případě může být žádoucí, aby rostlina vykazovala změněný, s výhodou zvýšený obsah tokoferolu v některých částech nebo orgánech, jako následek exprese molekul nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu. V takovém případě • · ·

9

9

9 ·»·· • · • · · · může být žádoucí použití konstitutivního promotoru, například 35S RNA promotoru z viru mozaiky květáku.

Vynález také obsahuje molekuly nukleové kyseliny, které kódují proteiny s biologickou aktivitu geranylgeranyl reduktázy, nebo její biologicky aktivní fragmenty, a které hybridizují s nukleovými kyselinami, popsanými výše. V souvislosti s tímto vynálezem výraz „biologicky aktivní fragment“ znamená obecně, že fragment je dostatečný pro způsobení změny v obsahu tokoferolu. Termín „hybridizace“ znamená v souvislosti s tímto vynálezem hybridizaci za běžných hybridizačních podmínek, s výhodou za přísných podmínek, jako jsou například v Sambrook a kok, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Molekuly nukleové kyseliny, které hybridizují s molekulami, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být izolovány například z genomické DNA nebo z cDNA knihoven.

Identifikace a izolace takových molekul nukleové kyseliny může být provedena pomocí molekul nukleové kyseliny nebo částí těchto molekul nebo pomocí reverzního komplementu těchto molekul, například pomocí hybridizace podle standardních technik (viz např. Sambrook a kol., výše). Pro identifikaci a izoiaci takových molekul nukleové kyseliny mohou být také použity takové sekvence, které jsou odvozeny z DNA sekvencí, které jsou předmětem tohoto vynálezu, například degenerované oligonukleotidové primery.

Vynález tedy také obsahuje použití DNA sekvence, která je předmětem tohoto vynálezu, nebo její fragmenty pro identifikaci a izolaci homologních sekvencí z rostlin nebo jiných organizmů.

Například nukleové kyseliny, které vykazují přesně shodné nebo v podstatě shodné DNA sekvence s výše popsanými sekvencemi, nebo obsahují fragmenty těchto sekvencí, mohou být použity jako hybridizační próby. Fragmenty použité jako hybridizační próby mohou být také syntetické fragmenty, připravené pomocí obvyklých syntetizačních technik a jejich sekvence se v podstatě shoduje s molekulou nukleové kyseliny, která je předmětem tohoto vynálezu. Jakmile byly jednou geny hybridizující se sekvencemi nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, identifikovány a izolovány, je nezbytné určit jejich sekvenci a analyzovat vlastnosti proteinů, těmito • *

9

9

9 • 9 9999

9 9

9 99 9

9 · * · 9

999 sekvencemi kódovaných. Pro tento účel je osobám se zkušeností v tomto oboru známo množství standardních molekulárně biologických, biochemických a biotechnologických metod.

Molekuly hybridizující se sekvencemi nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, zahrnují také fragmenty, které kódují geranylgeranyl reduktázu nebo její biologicky, tj. enzymaticky aktivní fragmenty. Výraz fragment v tomto ohledu znamená fragmenty nebo oblasti molekul nukleové kyseliny, které jsou dostatečně dlouhé, aby kódovaly polypeptid nebo protein, který má enzymatickou aktivitu geranylgeranyl reduktázy nebo srovnatelnou enzymatickou aktivitu, jež je schopna způsobit změnu obsahu tokoferolu. Termín „derivát“ v této souvislosti znamená, že sekvence těchto molekul jsou odlišitelné od sekvencí výše popsaných molekul nukleové kyseliny v jedné nebo několika pozicích a vykazují s těmito sekvencemi velký rozsah homologie. Výraz homologie v této spojitosti znamená sekvenční shodu přinejmenším 40 %, zvláště shodu přinejmenším 60 %, s výhodou nad 80 % a zvláště výhodně nad 90 %. Odchylky od výše popsaných molekul nukleové kyseliny mohou být způsobeny delecí, adicí, substitucí inzercí nebo rekombinací.

Homologie dále znamená, že existuje funkční anebo strukturální obdoba mezi molekulami nukleové kyseliny o které se jedná nebo mezi jimi kódovanými proteiny. Pokud se týká molekul nukleové kyseliny, které jsou homologní s výše popsanými molekulami a které reprezentují deriváty těchto molekul, jedná se obvykle o variant těchto molekul, které představují odchylky vykazující toutéž biologickou funkci. To se může týkat přirozeně se vyskytujících variant, např. sekvencí z jiných organizmů nebo mutací, kde tyto změny nastaly přirozeně nebo byly vneseny pomocí specifické mutageneze. Dále se tyto varianty mohou týkat synteticky připravených sekvencí. Pokud se týká alelíckých variant, tyto mohou vzniknout přirozeně anebo se může rovněž jednat o synteticky připravené varianty, nebo varianty připravené pomocí technologie rekombinantní DNA.

Obvykle mají proteiny, kódované různými variantami a deriváty molekul nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, společné charakteristické vlastnosti. Takovými charakteristikami jsou například enzymatická aktivita, molekulární hmotnost, imunologická reaktivita, prostorová struktura atd. Dalšími společnými charakteristikami mohou být fyzikální vlastnosti, např. způsob migrace v průběhu gelové elektroforézy,

0000

0··

000· • 0 • 00« • *

0»0 ·· 00 • 0 · · • 0 0 · * · · 0 0 « 0 0 «

0* 00 chromatografické charakteristiky, sedimentační koeficienty, rozpustnost, spektroskopické vlastnosti, stabilita, pH optimum, teplotní optimum atd. Dále ovšem i reakce, těmito proteiny katalyzovaně, mohou mít společné nebo podobné rysy.

Pro přípravu vnášení cizích genů do vyšších rostlin je k dispozici množství různých klonovacích vektorů, které obsahují počátek replikace aktivní v E. coli a selekční gen pro selekci transformovaných bakteriálních buněk. Příklady takových vektorů jsou pBR322, série vektorů pUC, série vektorů M13mp, pACYC184 atd. Požadovaná sekvence může být vnesena do vektoru do vhodného restrikčního místa. Získaný plazmid je pak použit pro transformaci buněk E. coli. Transformované buňky E. coli. jsou pěstovány ve vhodném médiu a následně sklizeny a lyžovány. Je z nich získán plazmid. Pro charakterizaci DNA získaného plazmidu jsou obvykle jako analytické metody použity metody restrikčního mapování, gelová elektroforéza a jiné biochemické a molekulárně biologické metody. Po každé manipulaci může být plazmidová DNA štěpena a získané fragmenty DNA mohou být připojeny k jiným sekvencím DNA. Každá plazmidová DNA sekvence může být klonována v tomtéž nebo v jiných plazmidech.

Pro vnesení DNA do rostlinné hostitelské buňky je dostupných mnoho dobře známých metod a osoby se zkušeností v tomto oboru mohou snadno určit a vybrat odpovídající vhodnou proceduru. Tyto techniky zahrnují transformaci rostlinných buněk s T-DNA pomocí Agrobacterium tumefaciens nebo Agrobacterium rhizogenes jako transformačními prostředky, fúzi protop,astů, přímý přenos genů do protoplastů pomocí izolované DNA, mikroinjekce a elektroporaci DNA, vnesení DNA pomocí biolistické metody a jiné možnosti.

Při injektování a elektroporaci DNA do rostlinných buněk nejsou na použité plazmidy kladeny žádné specifické požadavky. Totéž platí při přímém přenosu genu. Zde mohou být často použity jednoduché plazmidy, jako jsou deriváty pUC. Když však mají být tímto způsobem z transformovaných buněk regenerovány celé neporušené rostliny, je obvykle vyžadována přítomnost genu pro selekční znak. Osoba se zkušeností v oboru je obeznámena s obvyklými selekčními znaky a může snadno vhodný znak vybrat.

V závislosti na metodě zvolené pro vnesení genu (genů) o které se zajímáme, mohou být vyžadovány další DNA sekvence. Jestliže např. jsou pro transformaci • ···· 0· 0000 ·· ·· • 0 · 0 0 · 0 0 0 0 • 0 0 0 0 0 0 000· 0 0 000 00000 0 00 00 0 0000

000 0 00 000 00 00 rostlinných buněk použity plazmidy Ti nebo Ri, přinejmenším pravý okraj, ale často jak pravý tak i levý okraj T-DNA, obsažené v Ti a Ri plazmidů, musí být jakožto postranní oblasti spojeny s genem, který má být vnesen.

Pokud jsou pro transformaci použity agrobakterie, vnášená DNA musí být klonována do speciálních plazmidů, totiž do intermediárních nebo binárních vektorů. Díky sekvencím, které jsou homologní se sekvencemi v T-DNA, intermediární vektory mohou být integrovány do Ti nebo Ri plazmidů agrobakterií pomocí homologní rekombinace. Mimo to Ri plazmidy obsahují oblast vir, která je požadována pro přenos T-DNA. Intermediární vektory se nemohou v agrobakteriích replikovat. Intermediární vektor může být přenesen do agrobakterie Agrobacterium tumefaciens pomocí pomocných plazmidů (konjugace). Binární vektory se mohou replikovat v E. coli, stejně jako v agrobakteriích. Obsahují selektivní znak a linker nebo polylinker, po stranách obklopený pravou a levou hraniční oblastí T-DNA. Tyto vektory mohou být přímo transformovány do agrobakterií (Holsters a kol. (1978) Molecular and General Genetics 163, 181-187). Agrobakterie, která slouží jako hostitelská buňka bude obsahovat plazmid, obsahující vir oblast. Oblast vir je vyžadována pro přenos T-DNA do rostlinné buňky. Může být přítomna další T-DNA. Agrobakterie, která je popsaným způsobem transformována, je pak použita pro transformaci rostlinných buněk.

Použití T-DNA pro transformaci rostlinných buněk bylo důkladně studováno a je odpovídajícím způsobem popsáno v EP 120 515; Hoekema v: The Binary Plant Vector Systém, Offsetdrokkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985) kapitola V; Fraley a kol. (1993) Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 a An a kol. (1985) EMBO J. 4, 277-287.

Pro přenos DNA do rostlinné buňky mohou být rostlinné explantáty vhodným způsobem kultivovány spolu s Agrobacterium tumefaciens nebo Agrobacterium rhizogenes. Z infikovaného rostlinného materiálu (např. listů, kousků listů, úseků stonku, kořenů ale také protoplastů nebo rostlinných buněk kultivovaných vsuspenzních kulturách) mohou být ve vhodném médiu, které může obsahovat antibiotika nebo biocidy pro selekci transformovaných buněk, regenerovány celé rostliny. Regenerace rostlin je provedena pomocí obvyklých regeneračních metod za použití běžných výživných médií. Rostliny získané výše popsaným způsobem pak mohou být testovány na přítomnost vnesené DNA. Jsou známy i jiné možnosti pro vnášení cizorodé DNA, pomocí použití biolistické metody nebo pomocí transformace • fc··· ·· ···· fcfc fcfc • · · fcfcfc fcfcfcfc • · fcfcfc·· fcfcfcfc • · fcfcfc ······ • fc fcfc · fcfcfcfc • fcfcfc fcfc··· fcfc fcfc protopiastů (viz např. Wilmitzer L. (1993) Transgenic Plants, v: Biotechnology, A MultiVolume Comprehensive Treatise (H. J. Rehm, G. Reed, A. Půhler, P. Stadler, eds.) Sv. 2, 627-659, V. C. K. Weinheim- New York, Basel - Cambridge).

Zatímco transformace dvouděložných rostlin Ti plazmidovými vektorovými systémy za pomoci Agrobacterium tumefaciens je dobře zavedena, nedávné studie naznačují, že také jednoděložné rostliny mohou být transformovány pomocí vektorů, založených na Agrobacterium (Chán a kol. (1993) Plant Mol. Biol. 22, 491-506; Hiei a kol. (1994) Plant J. 6, 271-282; Deng a kol. (1990) Science in China 33, 28- 34; Wilmink a kol. (1992) plant Cell Reports 11, 67-80; May a kol. (1995) Bio/Technology 13, 486-492; Conner a Domiss (1992) Int. J. Plant Sci. 153, 550-555; Ritchie a kol. (1993) Transgenic Res. 2, 252-265).

Jinými možnými systémy pro transformaci jednoděložných rostlin jsou transformace za využití biolistického přístupu (Wan a Lemaux (1994) Plant Physiol. 104, 37-48; Vasil a kol. (1993) Bio/Technology 11 1553-1558; Ritala a kol. (1990) Theor. Appl. Genet. 79, 625-631; Altpeter a kol. (1996) Plant Cell Reports 16, 12-17), transformace protopiastů, elektroporace částečně permeabilizovaných buněk a vnesení DNA pomocí skleněných vláken.

Zvláště transformace kukuřice je popsána několikrát v literatuře popsána (srv. např. WO 95/06128, EP 0 513 849; EP 0 465 875; Fromm a kol. (1990) Biotechnology 8, 833-844; Gordon-Kamm a kol. (1990) Plant Cell 2, 603-618; Koziel a kol. (1993) Biotechnology 11, 194-200). EP 292 435 popisuje způsob, jehož pomocí lze z drobivého, zrnitého kukuřičného kalusu bez slizu získat plodnou rostlinu. Shillito a kol. ((1989) Bio/Technology 7, 581) v této souvislosti pozorovali, že dále je pro vytvoření plodné rostliny nezbytné vyjít z kalusové kultury, ze které je možno získat kulturu dělících se protopiastů, které mají schopnost regenerovat v rostlinu. Po in vitro kultivačním období sedm až osm měsíců získali Shillito a kol. rostliny, které byly schopny produkovat životaschopné potomstvo.

Prioli a Sondahl ((1989) Bio/Technology 7, 589) popisují regeneraci a množení plodných rostlin z protopiastů kukuřice - kukuřičná inbrední linie Cat 100-1. Autoři předpokládají, že regenerace plodných rostlin z protopiastů závisí na množství rozličných faktorů, jako je genotyp, fyziologické podmínky dárcovských buněk a podmínky kultivace.

• to • tototo · to · to to · ···· · ·· « • «to · ··· ·· to • ·· · ···» ·· «toto·· ·· toto

Již také byla popsána úspěšná transformace druhů obilnin, např. u ječmene (Wan a Lexaux, viz výše; Altpeter a kol. viz výše).

Jakmile je vnesená DNA zabudována do genomu rostlinné buňky, zůstává stabilní a je také trvale děděna potomstvem původně transformované buňky. Normálně obsahuje selekční znak, propůjčující resistenci kbiocidu nebo antibiotiku jako je kanamycin G418, bleomycin, hygromycin, methotrexát, glyphosát, streptomycin, suífonylurea, gentamycin nebo fosfinotricin atd. Selekční znak, který může být individuálně vybrán, by měl proto umožnit selekci transformovaných buněk z buněk, které neobsahují vnesenou DNA.

Transformované buňky rostou v rostlině obvyklým způsobem (viz též McCormick a kol. (1986) Plant Cell Reports 5, 81-84). Výsledné rostliny mohou být pěstovány běžným způsobem a mohou být množeny samoopylením nebo kříženy s rostlinami, které mají tytéž transformované nebo jiné genetické znaky. Výsledné jednotlivé hybridní rostliny mají individuální fenotypové vlastnosti. Obvykle mohou být z rostlin získána semena.

Měly by být vypěstovány dvě nebo více generací rostlin, aby bylo zajištěno, že se fenotypové vlastnosti jsou stabilně udržují a jsou děděny. Měla by také být sklízena semena, aby se zajistilo, že příslušný fenotyp a jiné charakteristiky se stabilně udržují.

Aplikací běžných metod mohou být také zjištěny ty transgenní linie, které jsou homozygotní pro nové molekuly nukleové kyseliny a může být zjištěno jejich fenotypové chování pokud se týká změněného obsahu tokoferolu a porovnáno s obsahem tokoferolu u hemizygotních linií.

Exprese proteinů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, které mají aktivitu geranylgeranyl reduktázy, lze dosáhnout použitím běžných molekulárně biologických a biochemických metod. Osoba se zkušeností v tomto oboru je seznámena s těmito technikami a je schopna si bez jakýchkoli potíží vybrat vhodnou detekční metodu, například analýza Northern blot pro detekci RNA specifické pro geranylgeranyl reduktázu a pro zjištění rozsahu akumulace RNA specifické pro geranylgeranyl reduktázu, analýza Southern blot pro určení sekvencí DNA, kódujících geranylgeranyl reduktázu nebo analýza Western blot pro zjišťování proteinů, kódovaných DNA sekvencemi, které jsou předmětem tohoto vynálezu, s výhodou CHL P. Enzymatická aktivita geranylgeranyl reduktázy může být například detekována a testována

enzymatickým testem popsaným v Soli a Schultz (1981) Biochem. Biophys. Res. Commun. 99, 907-912, který je založen na tvorbě fytylu chlorofylu.

Vynález je založen na úspěšné izolaci cDNA klonu kódujícího geranylgeranyl reduktázu z cDNA knihovny Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SRÍ. Sekvence tohoto cDNA klonu, který obsahuje kompletní otevřený čtecí rámec, je uvedena v SEQ.ID NO. 1. Pomocí sekvence uvedené v SEQJD NO. 1 bylo možno připravit transgenní rostliny, které vykazují změněný obsah tokoferolu ve srovnání se standardním typem rostlin.

Klon cDNA, obsahující DNA sekvenci uvedenou v SEQ:ID NO. 1, byl transformován do Escherichia coli a výsledný kmen E. coli byl 16. října 1997 uložen v Deutsche Sammlung fór Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, A-38124 Braunschweig, Germany pod depozičním číslem DSM 11816, uložení bylo provedeno podle Budapešťské smlouvy.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1. SEQ.ID NO. 1 ukazuje nukleotidovou sekvenci chl P cDNA geranylgeranyl reduktázy (CHL P) z Nicotiana tabacum.

Obrázek 2. SEQ:ID NO. 2 ukazuje aminokyselinovou sekvenci enzymu CHL P z N. tabacum odvozenou ze SEQJD NO. 1 uvedené na obrázku 1.

Obrázek 3. Restrikční mapa binárního vektoru BinAR, který byl použit v transformačních pokusech na rostlinách. BinAR (Hófgen a Willmitzer (1990) Plant Science 66, 221) je odvozen zBin19 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12, 8711), který obsahuje expresní kazetu pro stálou expresi chimerních genů v rostlinách, expresní kazeta byla klonována do Bin19 do restrikčních míst EcoRl a Hind lf I. Kazeta obsahuje 770 bázových párů dlouhý fragment EcoRI/HindlII, který obsahuje CaMV 35S promotor, část pUC18 polylinkeru a rovněž terminační signál genu pro oktopin syntetázu (OCS). Pro vložení kódujících sekvencí jsou zvláště vhodná jedinečná restrikční místa pUC18 polylinkeru, tj. Kpnl, Smál, BamHI, Xbal a Sall. Jako rostlinný selekční markér nese binární vektor BinAR gen pro

Obrázek 4.

Obrázek 5.

Obrázek 6.

Obrázek 7.

Obrázek 8.

• · · · · · • · ♦ * · · · · • · · • · · • · · < · rezistenci ke kanamycinu.

Sloupcový diagram ukazující obsah tokoferolů v listech 6, 9, 12 (číslování začíná od vrcholu rostliny) transgenních tabákových rostlin (řádky 28 a 30) vzhledem k odpovídajícím listům kontrolních rostlin (SNN).

Restrikční mapa binárního vektoru Bin-Hyg-TX, který byl použit pro transformaci rostlin, který je také derivátem pBÍB (Becker, viz výše; Bevan, viz výše), který obsahuje expresní kazetu pro stálou expresi chimerních genů v rostlinách. Pro vložení kódujících sekvencí jsou zvláště vhodná jedinečná restrikční místa pUC18 polylinkeru, tj. Hpal, Kpnl, Smál, Xbal a Sall. Jako rostlinný selekční markér nese binární vektor Bin-HygTX gen pro rezistenci k hygromycinu.

Sloupcový diagram obsahu tokoferolů v listech 4, 7,10 v 12 týdnů starých transgenních liniích (# 2, 6, 33) exprimujících enzym HPD z Arabidopsis, a v kontrolních rostlinách (SNN).

Obsahu tokoferolů v 12 dnů starých semenáčkách, inkubovaných 10 hodin na světle v 20 mM pufru fosforečnanu draselného (pH 7,1; jako kontrola je voda), s 3,3 μΜ (LC) nebo 33 μΜ (HC) Acifluorfen a s 1,7 pM (LC) nebo 17 pM (HC) Rose Bengál (SNN = kontrolní rostliny standardního typu, 28 a 39 = transgenní linie).

Relativní hodnoty α-tokoferolu a γ-tokoferolu v semenech transgenních tabákových rostlin (# 7, 39, 67, 96) a tabákových rostlin standardního typu (SNN). 100 % α-tokoferolu odpovídá 6 ng/mg semen; 100 % y-tokoferolu odpovídá 62,8 ng/mg semen.

·· to · · · toto ·· to · to · · to to • ···· · >· · • · to · · · · ·· ··· to· toto

Následující příklady slouží pro ilustraci vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Klonování tabákové cDNA kódující geranylgeranyl reduktázu (CNL P)

Pro identifikaci cDNA pro geranylgeranyl reduktázu z tabáku byla cDNA knihovna Lambda ZAP II (Nicotiana tabacum SR1, Stratagene, USA) hromadně prohledávána podle návodu výrobce pomocí EST zArabidopsis thaliana, jež kóduje lokus 4D9T7P. Použitá EST sekvence vykazuje podobnost se známými sekvencemi bch P/chl P z Rhodobacter capsulatus (Young a kol. (1989) Mol. Gen. Genet. 218, 112; Bollivar a kol. (1994) J. Mol. Biol. 237, 622-640; Bollivar a kol. (1994) Biochemistry 33, 12763-12768 a Synechocystis PCC6803 (Addlesee a kol. (1996) FEBS Lett. 389, 126-130).

Použitá hybridízační próba obsahuje oblast EST sekvence v 4D9T7P (Accession No. T04791) od báze 1 k bázi 364. Próba byla izolována z knihovny PRL2 z A. thaliana (vektor: AZipLox) (Newman a kol. (1994) Plant Physiol. 106: 1241-1255) jako restrikční fragment Notl/Sall a radioaktivně označen [a-³²P]dCTP pomocí nick-translace (Life Technologies, Eggenstein, Germany).

Hybridizace byla provedena podle následujícího protokolu:

- 2 hodiny prehybridizace při 55 °C v hybridizačním roztoku, který má následující složení: 5 x CSC., 0,1% SDS, 5 x Denhardtovo reagens, 100 pg/ml denaturované DNA z lososího spermatu;

- hlavní hybridizace 12 hodin při 55 °C v čerstvém hybridizačním roztoku, který má výše uvedené složení plus radioaktivně označenou próbu;

- Promývání: 2x10minutpři55°Cs2xSSCa0,1%SDSa

1x5 minut při 55 °C s 1 x SSC a 0,1% SDS

Piazmidová DNA, izolovaná po prohledávání knihovny cDNA byla sekvenována běžnými metodami. Zjištěná chl P cDNA sekvence, uvedená v SEQ:ID NO. 1 obsahuje 1510 nukleotidů (bez poly-A řetězce); nukleotidy 1 až 1392 kódují protein 52 kDa, který obsahuje 464 aminokyselinových zbytků včetně startovního kodonu pro methionin a bez stop kodonu (nukleotidy 1392 až 1395)). Odvozená aminokyselinová sekvence proteinu CHL P je uvedena v SEQ.ID NO. 2. Nukleotidová sekvence uvedená v SEQ.ID

NO. 1 obsahuje 3'nepřekládanou oblast od nukleotidu 1396 do 1510.

Pro izolaci DNA, RNA, analýzu sekvence, restrikce, klonování, gelovou elektroforézu, radioaktivní značení, Southern, Northern a Western blot analýzy, hybridizace a podobné procedury byly používány běžné metody, jak jsou popsány ve standardních laboratorních příručkách, jako je Sambrook a kol. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2™¹ Editon, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Příklad 2: Transformace tabákových rostlin a regenerace neporušených rostlin

Pro přípravu transgenních rostlin, které exprimují nadbytek CHL P a které tak vykazují ve srovnání s netransformovanými rostlinami zvýšený obsah tokoferolu, byla sekvence uvedená v SEQ:ID NO. 1 vystřižena z vektoru pomocí restrikčních enzymů Bam HI a Sall, umístěna vmnohočetném klonovacím místě vektoru pBluescript a ligována v negativní orientaci za CaMV 35S promotor do binárního vektoru BinAR-TX (Hófgen a Willmitzer (1990) Plant Science 66, 221-230), který je odvozen z pBlB (Becker (1990) Nucleic Acid Res. 18, 203), rozštěpený týmiž restrikčními endonukleázami. Pro ilustrační účely je jako obrázek 3 uvedena restrikční mapa vektoru BinAR-TX.

Namísto zmíněného binárního vektoru BinAR-TX může být pro konstrukci chimerního genu použit kterýkoli vektor, vhodný pro transformaci rostlin, který obsahuje fúzi CaMV 35S promotoru nebo kteréhokoli jiného promotoru, který zabezpečí transkripci a translaci v rostlinných buňkách a DNA sekvence, které kódují CHL P.

Rekombinantní vektor pCHLPbin byl potom vnesen do Agrobacterium tumefaciens (kmen GV2260; (Horsch a kol. (1985) Science 227, 1229-1231) a použit pro transformaci rostlin tabáku (SNN) za použití transformační techniky listových disků (Horsch a kol. viz výše).

Pro tento účel byla kultura výsledného klonu Agrobacterium tumefaciens, narostlá přes noc, centrifugována 10 minut při 5500 ot/min a bakterie byly resuspendovány v médiu 2YT. Mladé listy tabáku, pocházející ze sterilní kultury (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN), byly rozřezány na malé plátky o průměru asi 1 cm a inkubovány krátkou dobu v bakteriální suspenzi. Následně byly listové plátky umístěny na médium MS (Murashige a Skoog (1962) Physiol. Plant 15, 473; 0,7 %

0« 00·· • · · · 0 · • · 0 0 · · ·

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 000 0 00 00· ·· ·· • · · · • 0· 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0 agar) a udržovány v temnu po dobu dvou dní. Potom byly listové plátky umístěny na médium MS (0,7% agar) s 1,6% glukózy, 1 mg/l benzylaminopurinu, 0,2 mg/l naftyloctové kyseliny, 500 mg/ claforanu (cefotaxime, Hoechst, Frankfurt, SRN) a 50 mg/l kanamyclnu kvůli indukci výhonků. Médium bylo vyměňováno každých sedm až deset dní. Po vývinu výhonků byly listové plátky přeneseny do skleněných misek, obsahujících totéž médium. Vyvinuté výhonky byly odříznuty a umístěny na médium MS s 2% sacharózou a byly z nich regenerovány celé rostliny.

Příklad 3: Analýza transgenních tabákových rostlin obsahujících rekombinantní vektor pCHLPbin

Transgenní tabákové rostliny byly transformovány, selektovány a regenerovány, jak bylo popsáno výše. Po nárůstu kořenů ve sterilní kultuře bylo 100 nezávislých prvotních transformantů přeneseno do půdy ve skleníku. Tabákové rostliny byly udržovány ve skleníku při 60% vlhkosti vzduchu a teplotě 20 až 25 °C po dobu 16 hodin na světle a teplotě 18 až 20 °C po dobu 8 hodin ve tmě.

Transformanty s normálním nebo zvýšeným obsahem tokoferolu anebo chlorofylu nevykazovaly žádný abnormální vzezření nebo celkový stav, ani změněnou rychlost růstu ve srovnání s kontrolními rostlinami.

Několik primárních transformantů vykazovalo ve srovnání se standardním typem rostlin 4krát až 6krát zvýšený obsah tokoferolu. Toto zvýšení obsahu tokoferolu může být dále zvýšeno v potomstvu T1 a T2 generace a v homozygotnlch rostlinách potomstva, získaných obvyklým samoopylením a následným zjištěním segregace semen na médiu, obsahujícím kanamycin.

Dále lze pozorovat, že obsah tokoferolu v transgenních rostlinách byl dále zvýšen ve stresových podmínkách, jak bylo zjištěno v průběhu kultivace při nízkých nebo zvýšených teplotách nebo při vysoké intenzitě světla, rovněž byl ve srovnání s kontrolními rostlinami zjištěn u stárnoucích listů.

Tokoferol byl měřen pomocí následující metody:

Listové disky byly homogenizovány v tekutém dusíku a extrahovány třikrát methanolem. Extrakty byly sebrány a eluovány na sloupci LiCrospher 100 HPLC RP-18 (Merck, Darmstadt, SRN) při rychlosti průtoku 1 ml/min s pomocí následujícího gradientu: 96% roztok B (100% methanol) / 6% roztok A (30% methanol, 10% 0,1 M φ Φ · φ φφ φφφφ ·· ·· φφφ φ · · φ • φ φφφ φ φ φ φ φ φ φφφ φφ φ φ φ φ φφφφ φφ φφφ φφ φφ octan amonný, ρΗ 5,1) po dobu 7 minut, po dobu dalších 17 minut 99% roztok B /1% roztok A, potom dalších 26 minut 94% roztok B / 6% roztok A.

Při jiném možném postupu byly sebrané extrakty analyzovány pomocí HPLC v izokratickém gradientu (gradient je následující: 2% roztok A (10% methanol a 10% kyselin octová) a 98% methanol (roztok B); rychlost průtoku 1 ml/min). Pro detekci byl použit modul Waters LC s fluorescenčním detektorem Shimadzu RF 551 (295 nm^, 325 níTlero),

Výsledky tokoferolového testu jsou uvedeny ve sloupcovém grafu na obrázku 4. Porovnání listů 6,9,12 (číslování počíná od rostlinného vrcholu) transformantů 28 a 30 s odpovídajícími listy kontrolní rostliny (SNN) ukazuje, že transgenní linie mají ve srovnání standardním typem rostlin obsah tokoferolu až 6krát vyšší.

Bez ohledu na jejich schopnost růstu na médiu obsahujícím kanamycin, transgenní tabákové rostliny byly také analyzovány hybridizací technikou Southern blot. Po hybridizací se značeným cDNA fragmentem CHL P mohou být při použití genomové DNA transformantů štěpené restrikčními enzymy, zjištěny ve srovnání s genomovou DNA kontrolních rostlin další radioaktivně značené zóny.

Analýza Northern blot odhalila v transformantech, ve srovnání s obsahem CHL P-RNA v kontrolních rostlinách, zvýšené množství specifické RNA .

Dále může být pomocí analýzy Western blot zjištěna v transgenních rostlinách zvýšená exprese geranylgeranyl reduktázy. Transformanty vykazovaly ve srovnání s kontrolními rostlinami zvýšené množství proteinu CHL P.

Kromě toho může být potvrzeno testy importu plastidů (provedeny podle Grimm a kol. (1989) Plant Mol. Biol. 13, 583-593), že pre-protein CHL P, kódovaný sekvencí uvedenou v SEQJD NO. 1, byl importován do plastidů po in vitro transkripci a translaci.

Příklad 4: Konstrukce CHL P konstruktů s pozitivní orientací a jejich přenos do tabáku

Zatímco transgenní rostliny, vytvořené a analyzované podle příkladů 2 a 3 vykazují zvýšený obsah tokoferolu, způsobený zvýšenou expresí DNA sekvence, která je předmětem tohoto vynálezu, následující konstrukt s pozitivní orientací byl konstruován a přenesen do tabáku aby byiy vytvořeny tabákové rostliny se sníženou aktivitou CHL P.

Sekvence cDNA uvedená v SEQJD NO. 1 byla z vektoru vystřižena pomocí • fe · · • fe · ··· • fe · · · · fefefefe • · fefefe·· fefefefe · · fefefe fe·····

2o ·· ·♦ · ···· ··· · ·· ··· ·· ·· restrikčních enzymů Kpnl a Xbal, umístěných vmnohočetném klonovacím místě vektoru pBluescript a fúzovány v pozitivní orientaci s 35S promotorem viru mozaiky květáku v binárním vektoru BinTX (srv. příklad 2), který byl štěpen týmiž restrikčními enzymy. Výsledný rekombinantní vektor pCHLPASbin byl přenesen do tabáku pomocí transformace listových disků zprostředkované Agrobacterium tumefaciens, jak bylo popsáno v příkladu 2. Potom byly regenerovány transgenní rostliny. Bylo regenerováno přibližně 100 nezávislých transgenních linií a byla u nich pomocí standardních metod, jako je Southern blot, dokázána inzerce kopií transgenní DNA.

Transformanty vykazovaly pomalejší rychlost růstu než kontrolní rostliny, nižší pigmentaci, snížený obsah CHL P-specifické RNA a snížený obsah CHL P proteinu, vysoký obsah geranylgeranyl chlorofylu (až 50 % celkového obsahu chlorofylu, ve srovnání s 100 % fyfyl clorofylu u standardního typu rostlin) a rovněž snížený obsah chlorofylu a tokoferolu.

Příklad 5: Zvýšená exprese aktivní geranylgeranyl reduktázy v Escherichia coli.

Pro přípravu expresních klonů, které zvýšeně exprimují rekombinantní CHL P v E. coli byl z DNA sekvence uvedené v SEQ:ID NO. 1 amplifikován pomocí PCR otevřený čtecí rámec pro předpokládaný zralý (procesovaný) protein (1 min 94 °C; 2 min 60 °C; 3 min 72 °C; 25 cyklů), za pomoci oligonukleotidových primerů

CSYN 1 5'-cgc cat ggg ccg caa tet tcg tgt tgc ggt-3' a

CSYN 2 5'-gca gat ctg tcc att tcc ctt ctt agt gca-3'.

Pomnožený PCR fragment byl čištěn a štěpen pomocí restrikčních enzymů Ncol a BglII a vligován do expresního vektoru pQE60 (Qiagen, Hilden, SRN), který byl rozštěpen týmiž enzymy. Iniciační kodon ATG (tvořící část rozpoznávací sekvence pro restrikční enzym Notl), byl následován sekvencí chl P, počínaje nukleotidem 148 otevřeného čtecího rámce CHL P cDNA sekvence. Následkem toho je methionin následován glycinem, který odpovídá aminokyselinovému zbytku 50 v peptidové sekvenci, odvozené z cDNA sekvence.

Pro expresi rostlinného CHL P byly kmeny E. coli XL 1 Blue (Stratagene,

LaJolla, CA, USA) nebo SG 13009 (Gottesmann a kol. (1981) J. Bacteriol. 148, 256273) transformovány rekombinantním vektorem. Po indukci transkripce rekombinantního genu přidáním IPTG byl v kmenech E. coli exprimován protein o molekulární hmotnosti 47 kDa. Protein bylo možno detekovat v sedimentu z bakteriálního extraktu a byl čištěn z celkového extraktu za denaturačních podmínek pomocí Ni-afinitního sloupce podle návodu výrobce (Qiagen, Hilden, Germany).

Vyčištěný protein byl injikován králíkům kvůli imunizaci.

U proteinu vyčištěného z celkového extraktu bylo potvrzeno, že má geranylgeranyl reduktázovou aktivitu kombinovaným enzymatickým testem s bakteriální chlorofyl syntetázou za použití chlorofýllidu a GGPP. Enzymatický test byl proveden podle protokolu v Oster a kol. (1997) J. Biol. Chem. 272, 9671-9676.

Pigmenty chlorofyl-GG a chlorofyl-fytol byly odděleny pomocí HPLC na sloupci (4 x250 nm) naplněném RP 18 Gromse, 120 ODS5, při rychlosti průtoku 1,2 ml/min za použití následujícího gradientu, skládajícího se z 60% acetonu (roztok A) a 100% acetonu (roztok B): to 75 % roztoku A a 25 % roztoku B, 2 minuty; v rozmezí t₂₄ na 45 % roztoku A a 55 % roztoku B; v rozmezí U13 na 30 % roztoku A a 70 % roztoku B; v rozmezí t₁₃-i₇100 % roztoku; t₁₇.₂i 100 roztoku B izokraticky; následovalo v rozmezí 5 minut na 75 % roztoku A a 25 % roztoku B; potom dále 5 minut 75 % roztoku A a 25 % roztoku B izokraticky. Tetrapyroly byly detekovány pomocí fluorescenčního detektoru (Aex 425 nm, 665 nm).

Příklad 6: Současná exprese genu CHL P a genu HPD v Nicotiana tabacum

Pomoci oligonukleotidových primerů hpdolil 5'-tta ggt acc atg ggc cac caa acc gcc gcc gtt tca g-3' a hpoli2 5'-tga gtc gac cac aat cct tta gtt ggt tet tet tet tg-3' byla z cDNA knihovny Arabidopsis thaliana amplifikována sekvence HPD cDNA (Accession No.: AF 000228) mezi nukleotidy 37 a 1404, poté klonována a sekvenována. Amplifikovaný fragment byl štěpen restrikčními endonukleázami Kpnl a Sall a ligován do binárního vektoru Bin-Hyg-TX, také štěpeného Kpnl a Sall. Vektor Bin-Hyg-TX je derivát pBÍB (Becker, viz výše), stejně jako je vektor BínAR-TX, použitý v příkladu 2), který umožňuje expresi kódující oblasti, ligované do mnohočetného klonovacího místa, pod kontrolou promotoru 35S RNA z viru mozaiky květáku. NA rozdíl od vektoru Bin-Hyg-TX, použitého pro expresi genu CHL P, který umožňuje • ···· to· to··· ·· ·· • to · ··* totototo • to ····· toto·· • * · · · «totototo· ·· ·« · ·«·· toto·· ·· ··· ·· ·· selekci rostlinných buněk pomocí kanamycinu, binární vektor Bin-Hyg-TX nese jako selekční gen pro rostlinné buňky gen resistence k hygromycinu. Pro ilustrační účely je na obrázku 5 uvedena restrikční mapa vektoru Bin-Hyg-TX.

Místo zmíněného binárního vektoru Bin-Hyg-TX je možno pro konstrukci chimerního genu použít kterýkoli vektor, vhodný pro transformaci rostlin, obsahující fúzí s promotorem CaMV 35S nebo jakýmkoli jiným promotorem, který zabezpečuje transkripci a translaci v rostlinných buňkách a sekvence DNA pro HPD.

Potom byl proveden přenos výsledného rekombinantního vektoru pBinHygHPD na tabák SNN pomocí Agrobacteríum tumefaciens, jak je popsáno výše v příkladu 2, přičemž transgenní tabákové výhonky byly selektovány na médiu, které obsahovalo hygromycin. Rostliny získané po regeneraci byly použity jako kontrolní rostliny.

Kromě toho, transformanty 28 a 30, popsané v příkladu 2, a jakož i další transformanty, které vysoce exprimují gen CHL P pod kontrolou 35S RNA promotoru, byly transformovány metodou transformace listových disků rekombinantním vektorem pBinHygHPD a pomocí selekce na médiu, které obsahovalo jak kanamycin tak hygromycin, byly regenerovány neporušené rostliny.

Úspěšný přenos a exprese chimerního HPD genu byly potvrzeny ve všech transgenních rostlinách vhodnými hybridizačními pokusy Southern a Northern blot, přičemž jako próba byl použit výše zmíněný PCR fragment, kódující HPD.

Porovnání obsahu tokoferolu (analýza byla provedena tak, jak byla popsána v příkladu 3) v listech transgenních rostlin, které exprimují samotný gen CHL P (viz příklad 3, transformanty 28 a 30), a rostlin, které exprimují společně geny HPD a CHL P (transformanty 28+HPD a 30+HPD) odhalilo, že obsah tokoferolu může být dále zvýšen současnou expresí genu pro dioxygenázu kyseliny hydroxyfenyl pyrohroznové.

Jinak mohou být získány transgenní rostliny, které exprimují gen CHL P a rovněž gen HPD, křížením vhodných transgenních linií, zvláště křížením homozygotních „CHL P linii“ s homozygotními „HPD liniemi“.

Další zvýšení obsahu tokoferolu může být očekáváno u dvojitých transformantů (a dvojitých kříženců) v stresujících podmínkách (např. zvýšená teplota, světelný stres a podobně).

Kromě výše popsaných dvojitých transformantů, které exprimují HPD a CHL P, byly také transgenní HPD linie analyzovány s ohledem na obsah tokoferolu a vliv «000 00 000· ·0 00 00 0 000 0000

0 0 000 0 0000 0 · 000 00000 · 00 ·· · 0·0·

000 0 00 0·0 00 00 stresujících podmínek na jejich obsah tokoferolu. Je možno ukázat, že nadbytečná exprese HPD v listech tabáku má ve srovnání s netransgenními kontrolními rostlinami za následek 2 až 3násobné zvýšení obsahu tokoferolu a že obsah tokoferolu je zvýšen zvláště za stresujících podmínek.

Obrázek 6 ukazuje obsah tokoferolu v listech 4, 7 a 10 u transgenních linií tabéku starých 12 týdnů (# 2, 6 a 33), které exprimují enzym dioxygenázu kyseliny hydroxyfenyl pyrohroznové (HPD) z Arabidopsis, ve srovnání s kontrolními rostlinami (SNN). Rostliny byly pěstovány buď při 38 °C nebo při 10 °C a při intenzitě světla přibližně 200 pmol foton/m²/sec. Tokoferol je zvýšeně hromaděn v rostlinách se zvyšujícím se věkem listů. Zvláště ve starších listech se obsah tokoferolu zvyšuje mnohem více u rostlin pěstovaných při 38 °C a dosahuje 2krát vyššího množství ve srovnání s kontrolními rostlinami. Pro srovnání, obsah tokoferolu v transformantech držených při nižší teplotě byl ve srovnání se standardním typem rostlinám pouze slabě zvýšen.

Tyto výsledky naznačují, že v případě zvýšené potřeby tokoferolu, např. zvláště za stresujících podmínek, HPD specielně upřednostňuje v transgenních rostlinách tvorbu těchto antioxidantů.

Příklad 7: Zvýšená rezistence transgenních rostlin proti oxidačnímu stresu

Transgenní rostliny, vytvořené podle příkladů 2 a 3 byly analyzovány se zřetelem na vliv inhibičních a oxidačních sloučenin v pokusech, při nichž byly inkubovány listové disky. Patnáct semenáčků bylo inkubováno v pufru 20 mM fosforečnanu draselného (pH 7,1) po dobu 10 hodin na světle. Rostliny byly inkubovány v kontrolních vzorcích (voda), ve vzorcích s 3,3 pM (nízká koncentrace = LC) nebo 33 μΜ (vysoká koncentrace = HC) Acifluorfenu (získán od BASF, Ludwigshafen, SRN), což je inhibitor protoporfyrinogen oxidázy a ve vzorcích s 1,7 μΜ (nízká koncentrace = LC) nebo 17 μΜ (vysoká koncentrace = HC) bengálské červeně (kyselá červeň, 4,5,6,7-tetrachloro-2',4',5',7'-tetrajodofIuorescein, získaný od SigmaAldrich, Deisenhofen, SRN), který produkuje reaktivní druhy kyslíku. Obsah tokoferolu je ve srovnání se standardním typem rostlin (SNN) asi 2 až 3krát vyšší v analyzovaných transgenních liniích (28, 30) ve vzorku v kontrolním pufru a také za stresujících oxidačních podmínek.

0» 0000 00 00 • * 0 «00»

0 »00 0 0 » 0 · 000 00 0

0 0 0 0 0 0

0*0 0« 00 ·*»·

Výsledky naznačují, že pro jejich obsah tokoferolu, zvýšený ve srovnání se standardním typem rostlin, rostliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, vykazují zvýšenou snášenlivost k oxidačnímu stresu. Proto je možno očekávat zvýšenou antioxidační ochranu buněčných membrán proti reaktivním druhům kyslíku u rostlin, které jsou předmětem tohoto vynálezu.

Příklad 8: Obsah tokoferolu v semenech transgenních rostlin

Tokoferol byl extrahován podle výše popsanou procedurou ze semen transgenních rostlin, které vykazovaly ve srovnání se standardním typem rostlin zvýšený obsah tokoferolu v listech, způsobený expresí CHL P pod kontrolou CaMV 35S promotoru (viz příklad 2). Výsledky kvantitativního stanovení tokoferolu pomocí HPLC, ve srovnání s kontrolními tabákovými rostlinami, jsou uvedeny na obrázku 8.

Vedle α-tokoferolu byl kvantitativně stanoven také γ-tokoferol. Druhá jmenovaná sloučenina je obecně přítomna v semenech tabáku ve vysokém množství; poměr ytokoferolu k α-tokoferolu je v semenech tabáku asi 1: 10. Obsah obou forem tokoferolu, zvláště α-tokoferolu, je v transgenních rostlinách se zvýšenou expresí geranylgeranyl reduktázy, ve srovnání s kontrolními rostlinami asi 2 až 3krát vyšší.

Tyto výsledky, které odrážejí účinek konstitutivní exprese CHL P pod kontrolou promotoru 35S na obsah tokoferolu v semenech jasně naznačují, že použitím promotorů specifických pro semena (nebo promotoru, který je specificky indukovatelný vtkáni semene) může být dále zvýšena exprese geranylgeranyl reduktázy v tkáni semene a následkem toho i obsah tokoferolu.

Pokud by snad molekulárně biologické postupy nebyly odpovídajícím způsobem popsány, tak byly provedeny podle standardních metod, jak jsou popsány například v Sambrook a kol. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Editon, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor New York. Pokud se týká transformace rostlin odkazujeme na obecně známé přehledné články a rovněž na zprávy a publikace zde zmiňované.

090 0

99 • 9 0 · · · · · · · · · · ♦ 9 ··

-34SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE (i) PŘIHLAŠOVATEL:

(A) JMÉNO: Institut fúr Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (B) ULICE: Corrensstrasse 3 (C) MĚSTO: Gattersleben (E) STÁT: Spolková republika Německo (F) PSČ: 06466 (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Ovlivňování obsahu tokoferolu v transgenních rostlinách (iii) POČET SEKVENCÍ: 3 (iv) POČÍTAČOVÉ VYBAVENÍ:

(A) TYP MÉDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (2) INFORMACE K SEKVENCI č.l:

(i) CHARACTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1510 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvouvláknový (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLECULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) POZITIVNÍ ŘETĚZEC: ne (xi) POPIS SEKVENCE: Sekvence č.l:

ATGGCTTCCA	TTGCTCTCAA	AACTTTCACC	GGCCTCCGTC	AATCCTCGCC	GGAAAACAAT	60
TCCATTACTC	TTTCTAAATC	CCTCGCCTTC	ACCCAAACCC	ACCGTAGGCT	CCGAATCAAT	120
GCTTCCAAAT	CCAGCCCAAG	AGTCAACGGC	CGCAATCTTC	GTGTTGCGGT	GGTGGGCGGT	180
GGTCCTGCTG	GTGGCGCCGC	CGCTGAAACA	CTCGCCAAGG	GAGGAATTGA	AACCTTCTTA	240
ATCGAACGCA	AAATGGACAA	CTGCAAACCC	TGCGGTGGGG	CCATCCCACT	TTGCATGGTG	300
GGAGAATTTG	ACCTCCCTTT	GGATATCATT	GACCGGAAAG	TTACAAAGAT	GAAGATGATT	360
TCCCCATCCA	ACGTTGCTGT	TGATATTGGT	CAGACTTTAA	AGCCTCACGA	GTACATCGGT	420
ATGGTGCGCC	GCGAAGTACT	CGATGCTTAC	CTCCGTGACC	GCGCTGCTGA	AGCCGGAGCC	480
TCTGTTCTCA	ACGGCTTGTT	CCTCAAAATG	GACATGCCCA	AAGCTCCCAA	CGCACCTTAC	540

• · · ♦ • · · · ·· ·· ♦ ·

« ·* · <*· ····

-Η

GTCCTTCACT ACACAGCTTA CGACTCCAAA ACTAATGGCG CGGGGGAGAA GCGTACCCTG 600

GAAGTTGACG CCGTTATCGG CGCTGACGGT GCAAATTCCC GTGTCGCAAA ATCCATAAAC 660

GCCGGTGACT	ACGAGTACGC	TATTGCATTC	CAAGAAAGGA	TTAAAATTTC	CGATGATAAA	720
ATGAAGTATT	ACGAGAATTT	AGCTGAAATG	TACGTGGGTG	ATGACGTGTC	CCCTGATTTT	780
TACGGGTGGG	TTTTCCCCAA	ATGTGACCAC	GTTGCCGTTG	GCACTGGCAC	AGTCACCCAC	840
AAAGCTGACA	TCAAAAAATT	CCAGCTAGCT	ACAAGATTGA	GAGCTGATTC	CAAAATCACC	900
GGCGGAAAAA	TTATCCGGGT	CGAGGCCCAC	CCGATTCCAG	AACACCCAAG	ACCCAGAAGA	960
TTACAAGACA	GAGTTGCATT	GGTTGGTGAT	GCGGCAGGGT	ACGTGACCAA	ATGTTCGGGC	1020
GAAGGGATTT	ACTTCGCGGC	AAAGAGTGGA	CGTATGTGTG	CTGAAGCAAT	TGTTGAAGGG	1080
TCAGAAATGG	GAAAAAGAAT	GGTGGACGAG	AGTGATTTGA	GGAAGTATTT	GGAGAAATGG	1140
GACAAGACTT	ATTGGCCAAC	GTACAAGGTG	CTTGATATAT	TGCAGAAGGT	ATTTTACAGO	1200
TCGAATCCGG	CGAGGGAAGC	ATTTGTTGAA	ATGTGCGCAG	ATGAGTATGT	GCAGAAGATG	1260
ACATTTGACA	GCTATTTGTA	CAAGAAAGTA	GCACCAGGAA	ACCCAATTGA	AGACTTGAAG	1320
CTTGCTGTGA	ATACCATTGG	AAGTTTGGTG	AGAGCTAATG	CACTAAGAAG	GGAAATGGAC	1380
AAGCTCAGTG	TATAAGAAGA	TTAACAGCAT	TAATATTTTC	TTGTAATTGA	AGGATTTATT	1440
TCTCAAATTA	CTCTGTAAAC	ACCTTTCATC	CTGCCTTTAA	TCGGATTTAT	GTAACTTCAT	1500

AATTTGAGCT 1510 (2) INFORMACE Κ SEKVENCI č.2:

(i) CHARACTERIŠTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1510 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednovláknový (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLECULY: protein (ix) ZÁKLADNÍ RYS:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 1..1392 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE č:2:

ATG Met 1

GCT Ala

TCC ATT GCT

CTC Leu

AAA Lys

ACT Thr

TTC ACC GGC CTC CGT CAA

TCC Ser 15

TCG Ser

48

Ser

Ile

Ala 5

Phe

Thr 10

Gly

Leu Arg

Gin

CCG

GAA

AAC

AAT

TCC

ATT

ACT

CTT

TCT

AAA

TCC

CTC

CCC

TTC

ACC

CAA

96

Pro

Glu

Asn

Asn

Ser

Ile

Thr

Leu

Ser

Lys

Ser

Leu

Pro

Phe

Thr

Gin

20

25

30

• · 9 · • · · • · · • · · ·« ♦· ···· • · · » · · · * • * · ·

ACC

CAC

CGT

AGG

CTC

CGA

ATC

AAT

GCT

TCC

AAA

TCC

AGC

CCA

AGA

GTC

Thr

His

Arg 35

Arg

Leu

Arg

Ile

Asn 40

Ala

Ser

Lys

Ser

Ser 45

Pro

Arg

Val

AAC

GGC

CGC

AAT

CTT

CGT

GTT

GCG

GTG

GTG

GGC

GGT

GGT

CCT

GCT

GGT

Asn

Gly 50

Arg

Asn

Leu

Arg

Val 55

Ala

Val

Val

Gly

Gly 60

Gly

Pro

Ala

Gly

GGC

GCC

GCC

GCT

GAA

ACA

CTC

GCC

AAG

GGA

GGA

ATT

GAA

ACC

TTC

TTA

Gly 65

Ala

Ala

Ala

Glu

Thr 70

Leu

Ala

Lys

Gly

Gly 75

Ile

Glu

Thr

Phe

Leu 80

ATC

GAA

CGC

AAA

ATG

GAC

AAC

TGC

AAA

CCC

TGC

GGT

GGG

GCC

ATC

CCA

Ile

Glu

Arg

Lys

Met 85

Asp

Asn

Cys

Lys

Pro 90

Cys

Gly

Gly

Ala

Ile 95

Pro

CTT

TGC

ATG

GTG

GGA

GAA

TTT

GAC

CTC

CCT

TTG

GAT

ATC

ATT

GAC

CGG

Leu

Cys

Met

Val 100

Gly

Glu

Phe

Asp

Leu 105

Pro

Leu

Asp

Ile

Ile 110

Asp

Arg

AAA

GTT

ACA

AAG

ATG

AAG

ATG

ATT

TCC

CCA

TCC

AAC

GTT

GCT

GTT

GAT

Lys

Val

Thr

Lys

Met

Lys

Met

Ile

Ser

Pro

Ser

Asn

Val

Ala

Val

Asp

115 120 125

144

192

240

288

336

384

ATT

GGT

CAG

ACT

TTA

AAG

CCT

CAC

GAG

TAC

ATC

GGT

ATG

GTG

CGC

CGC

Ile

Gly

Gin

Thr

Leu

Lys

Pro

His

Glu

Tyr

Ile

Gly

Met

Val

Arg

Arg

130

135

140

432

GAA Glu 145

GTA Val

CTC Leu

GAT GCT TAC CTC CGT GAC

CGC Arg

GCT Ala 155

GCT GAA GCC Ala Glu Ala

GGA GCC Gly Ala 160

Asp Ala Tyr Leu 150

Arg

Asp

TCT

GTT

CTC

AAC

GGC

TTG

TTC

CTC

AAA

ATG

GAC

ATG

CCC

AAA

GCT

CCC

Ser

Val

Leu

Asn

Gly

Leu

Phe

Leu

Lys

Met

Asp

Met

Pro

Lys

Ala

Pro

165

170

175

480

528

AAC

GCA

CCT

TAC

GTC

CTT

CAC

TAC

ACA

GCT

TAC

GAC

TCC

AAA

ACT

AAT

Asn

Ala

Pro

Tyr 180

Val

Leu

His

Tyr

Thr 185

Ala

Tyr

Asp

Ser

Lys 190

Thr

Asn

GGC

GCG

GGG

GAG

AAG

CGT

ACC

CTG

GAA

GTT

GAC

GCC

GTT

ATC

GGC

GCT

Gly

Ala

Gly 195

Glu

Lys

Arg

Thr

Leu 200

Glu

Val

Asp

Ala

Val 205

Ile

Gly

Ala

GAC

GGT

GCA

AAT

TCC

CGT

GTC

GCA

AAA

TCC

ATA

AAC

GCC

GGT

GAC

TAC

Asp

Gly 210

Ala

Asn

Ser

Arg

Val 215

Ala

Lys

Ser

Ile

Asn 220

Ala

Gly

Asp

Tyr

GAG

TAC

GCT

ATT

GCA

TTC

CAA

GAA

AGG

ATT

AAA

ATT

TCC

GAT

GAT

AAA

Glu 225

Tyr

Ala

Ile

Ala

Phe 230

Gin

Glu

Arg

Ile

Lys 235

Ile

Ser

Asp

Asp

Lys 240

ATG

AAG

TAT

TAC

GAG

AAT

TTA

GCT

GAA

ATG

TAC

GTG

GGT

GAT

GAC

GTG

Met

Lys

Tyr

Tyr

Glu 245

Asn

Leu

Ala

Glu

Met 250

Tyr

Val

Gly

Asp

Asp 255

Val

TCC

CCT

GAT

TTT

TAC

GGG

TGG

GTT

TTC

CCC

AAA

TGT

GAC

CAC

GTT

GCC

Ser

Pro

Asp

Phe

Tyr

Gly

Trp

Val

Phe

Pro

Lys

Cys

Asp

His

Val

Ala

576

624

672

720

768

816

260

265 φφ ·

ΦΦ φφφφ φ φ · φφφφ φ φ · · * φ · φφ »·*

270

GTT Val

GGC ACT GGC

ACA GTC ACC

CAC AAA GCT GAC ATC AAA AAA

TTC CAG

864

Gly Thr 275

Gly

Thr Val

Thr

His 280

Lys

Ala

Asp

Ile

Lys 285

Lys

Phe

Gin

CTA

GCT

ACA

AGA

TTG

AGA

GCT

GAT

TCC

AAA

ATC

ACC

GGC

GGA

AAA

ATT

912

Leu

Ala

Thr

Arg

Leu

Arg

Ala

Asp

Ser

Lys

Ile

Thr

Giy

Gly

Lys

Ile

290 295 300

ATC CGG Ile Arg 305

GTC Val

GAG GCC Glu Ala

CAC His 310

CCG ATT CCA GAA CAC CCA AGA CCC AGA AGA

960

Pro

Ile

Pro

Glu His 315

Pro Arg Pro Arg Arg 320

TTA

CAA

GAC

AGA

GTT

GCA

TTG

GTT

GGT

GAT

GCG

GCA

GGG

TAC

GTG

ACC

1008

Leu

Gin

Asp

Arg

Val

Ala

Leu

Val

Gly

Asp

Ala

Ala

Gly

Tyr

Val

Thr

325

330

335

AAA

TGT

TCG

GGC

GAA

GGG

ATT

TAC

TTC

GCG

GCA

AAG

AGT

GGA

CGT

ATG

1056

Lys

Cys

Ser

Gly

Glu

Gly

Ile

Tyr

Phe

Ala

Ala

Lys

Ser

Gly

Arg

Met

340

345

350

TGT

GCT

GAA

GCA

ATT

GTT

GAA

GGG

TCA

GAA

ATG

GGA

AAA

AGA

ATG

GTG

1104

Cys

Ala

Glu

Ala

Ile

Val

Glu

Gly

Ser

Glu

Met

Gly

Lys

Arg

Met

Val

355

360

365

GAC

GAG

AGT

GAT

TTG

AGG

AAG

TAT

TTG

GAG

AAA

TGG

GAC

AAG

ACT

TAT

1152

Asp

Glu

Ser

Asp

Leu

Arg

Lys

Tyr

Leu

Glu

Lys

Trp

Asp

Lys

Thr

Tyr

370

375

380

TGG

CCA

ACG

TAC

AAG

GTG

CTT

GAT

ATA

TTG

CAG

AAG

GTA

TTT

TAC

AGG

1200

Trp

Pro

Thr

Tyr

Lys

Val

Leu

Asp

Ile

Leu

Gin

Lys

Val

Phe

Tyr

Arg

385

390

395

400

TCG

AAT

CCG

GCG

AGG

GAA

GCA

TTT

GTT

GAA

ATG

TGC

GCA

GAT

GAG

TAT

1248

Ser

Asn

Pro

Ala

Arg

Glu

Ala

Phe

Val

Glu

Met

Cys

Ala

Asp

Glu

Tyr

405 410 415

GTG

CAG

AAG

ATG

ACA

TTT

GAC

AGC

TAT

TTG

TAC

AAG

AAA

GTA

GCA

CCA

1296

Val

Gin

Lys

Met

Thr

Phe

Asp

Ser

Tyr

Leu

Tyr

Lys

Lys

Val

Ala

Pro

420

425

430

GGA Gly

AAC Asn

CCA Pro 435

ATT Ile

GAA GAC Glu Asp

TTG AAG CTT GCT

GTG AAT ACC ATT

GGA AGT

1344

Leu

Lys 440

Leu

Ala

Val

Asn

Thr 445

Ile

Gly

Ser

TTG

GTG

AGA

GCT

AAT

GCA

CTA

AGA

AGG

GAA

ATG

GAC

AAG

CTC

AGT

GTA

1392

Leu

Val

Arg

Ala

Asn

Ala

Leu

Arg

Arg

Glu

Met

Asp

Lys

Leu

Ser

Val

450

455

460

TAAGAAGATT AACAGCATTA ATATTTTCTT GTAATTGAAG GATTTATTTC TCAAATTACT 1452

CTGTAAACAC CTTTCATCCT GCCTTTAATC GGATTTATGT AACTTCATAA TTTGAGCT 1510 (2) INFORMACE Κ SEKVENCI Č.3:

(i) CHARACTERIŠTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 464 aminokyselin ·» »· » · · <

I · · « »» ·»·· > · · • · ··* (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLECULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE č:3:

Met Ala Ser Ile Ala Leu Lys Thr Phe Thr Gly 15 10

Pro Glu Asn Asn Ser Ile Thr Leu Ser Lys Ser 20 25

Thr His Arg Arg Leu Arg Ile Asn Ala Ser Lys 35 40

Asn Gly Arg Asn Leu Arg Val Ala Val Val Gly 50 55

Gly Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ala Lys Gly Gly 65 70 75

Ile Glu Arg Lys Met Asp Asn Cys Lys Pro Cys

90 95 • · ·· ·«

Leu Arg Gin Ser Ser 15

Leu Pro Phe Thr Gin 30

Ser Ser Pro Arg Val 45

Gly Gly Pro Ala Gly 60

Ile Glu Thr Phe Leu 80

Gly Gly Ala Ile Pro

Leu

Cys

Met

Val 100

Gly

Glu

Phe

Asp

Leu 105

Pro

Leu

Asp

Ile

Ile 110

Asp

Arg

Lys

Val

Thr 115

Lys

Met

Lys

Met

Ile 120

Ser

Pro

Ser

Asn

Val 125

Ala

Val

Asp

Ile

Gly 130

Gin

Thr

Leu

Lys

Pro 135

His

Glu

Tyr

Ile

Gly 140

Met

Val

Arg

Arg

Glu 145

Val

Leu

Asp

Ala

Tyr 150

Leu

Arg

Asp

Arg

Ala 155

Ala

Glu

Ala

Gly

Ala 160

Ser

Val

Leu

Asn

Gly

Leu

Phe

Leu

Lys

Met

Asp

Met

Pro

Lys

Ala

Pro

165 170 175

Asn

Ala

Pro

Tyr 180

Val

Leu

His

Tyr

Thr 185

Ala

Tyr

Asp

Ser

Lys 190

Thr

Asn

Gly

Ala

Gly 195

Glu

Lys

Arg

Thr

Leu 200

Glu

Val

Asp

Ala

Val 205

Ile

Gly

Ala

Asp

Gly 210

Ala

Asn

Ser

Arg

Val 215

Ala

Lys

Ser

Ile

Asn 220

Ala

Gly

Asp

Tyr

Glu 225

Tyr

Ala

Ile

Ala

Phe 230

Gin

Glu

Arg

Ile

Lys 235

Ile

Ser

Asp

Asp

Lys 240

Met

Lys

Tyr

Tyr

Glu 245

Asn

Leu

Ala

Glu

Met 250

Tyr

Val

Gly

Asp

Asp 255

Val

Ser

Pro

Asp

Phe 260

Tyr

Gly

Trp

Val

Phe 265

Pro

Lys

Cys

Asp

His 270

Val

Ala

Val

Gly

Thr 275

Gly

Thr

Val

Thr

His 280

Lys

Ala

Asp

Ile

Lys 285

Lys

Phe

Gin

Claims (46)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Sekvence nukleové kyseliny vyznačující se tím, že kóduje rostlinný protein, který má geranylgeranyl reduktázovou aktivitu nebo jeho aktivní fragment.
2. 2. Sekvence nukleové kyseliny podle patentového nároku 1, vyznačující se tím, že kóduje protein tabáku.
3. 3. Sekvence nukleové kyseliny podle SEQ:ID NO. 1.
4. 4. Sekvence nukleové kyseliny, která je přinejmenším z 60 % shodná se sekvencí podle kteréhokoli z předchozích patentových nároků a kóduje protein, který má geranylgeranyl reduktázovou aktivitu nebo jeho aktivní fragment.
5. 5. Sekvence nukleové kyseliny podle patentového nároku 4, přičemž sekvenční shoda přesahuje 80 %.
6. 6. Sekvence nukleové kyseliny podle patentového nároku 1, vyznačující se t i m, že je obsažena v klonu DSM 11816.
7. 7. Alely a deriváty sekvence nukleové kyseliny podle kteréhokoli z předchozích patentových nároků, vyznačující se tím, že kódují protein, který má geranylgeranyl reduktázovou aktivitu nebo jeho aktivní fragment
8. 8. Molekula nukleové kyseliny vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci nukleové kyseliny podle kteréhokoli z předchozích patentových nároků.
9. 9. Molekula nukleové kyseliny podle patentového nároku 8, vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci nukleové kyseliny podle kteréhokoli z patentových nároků 1 až 7 ve spojení s regulačními elementy, které zabezpečují transkripci a translaci v prokaryotických a eukaryotických buňkách.

   • · fefefefe » · · » fefefefe fe ·
10. 10. Molekula nukleové kyseliny podle patentových nároků 8 nebo 9, vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci nukleové kyseliny podle kteréhokoli z patentových nároků 1 až 7 ve spojení s promotory, které zabezpečují transkripci a translací v rostlinných buňkách.
11. 11. Molekula nukleové kyseliny podle patentového nároku 10, vyznačující se tím, že promotor je konstitutivní, indukovatelný, tkáňově specifický nebo vývojově specifický promotor.
12. 12. Molekula nukleové kyseliny podle patentového nároku 11, vyznačující se tím, že promotor je specifický pro semena.
13. 13. Molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoli z patentových nároků 8 až 12, vyznačující se tím, že dále obsahuje sekvence zesilovačů transkripce, sekvence kódující signální peptidy nebo jiné regulační sekvence.
14. 14. Molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoli z patentových nároků 8 až 13, ve které má kódující sekvence nukleové kyseliny negativní orientaci.
15. 15. Molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoli z patentových nároků 8 až 13, ve které má kódující sekvence nukleové kyseliny pozitivní orientaci.
16. 16. Protein mající biologickou aktivitu geranylgeranyl reduktázy nebo jeho aktivní fragment, vyznačující se tím, že je kódován DNA sekvencí nebo molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoli z předchozích patentových nároků.
17. 17. Protein mající biologickou aktivitu geranylgeranyl reduktázy nebo jeho aktivní fragment, vyznačující se tím, že má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ:ID NO. 2 nebo její části.
18. 18. Mikroorganizmus vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci nukleové kyseliny nebo molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoli z patentových nároků 1 až 15.
19. 19. Transgenní rostliny, které obsahují sekvenci nukleové kyseliny, sekvenci nukleové kyseliny z ní odvozenou nebo molekulu nukleové kyseliny, která kóduje protein, který má geranylgeranyl reduktázovou aktivitu nebo jeho aktivní fragment, rovněž tak části uvedených rostlin a transgenní rozmnožovací materiál uvedených rostlin, jako jsou protoplasty, rostlinné buňky, závaly, semena, hlízy, řízky atd. a rovněž transgenní potomstvo těchto rostlin.
20. 20. Rostliny podle patentového nároku 19, ve kterých sekvence nukleové kyseliny nebo molekula nukleové kyseliny je sekvence nukleové kyseliny nebo molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoli z patentových nároků 1 až 15.
21. 21. Rostliny podle patentových nároků 19 nebo 20, které vykazují změněný obsah tokoferolu ve srovnání se standardním typem rostlin.
22. 22. Rostliny podle patentového nároku 21, které vykazují zvýšený obsah tokoferolu ve srovnání se standardním typem rostlin.
23. 23. Rostliny podle patentových nároků 19 nebo 20, které vykazují změněný obsah vitaminu Ki ve srovnání se standardním typem rostlin.
24. 24. Rostliny podle patentového nároku 23, které vykazují zvýšený obsah vitaminu K-, ve srovnání se standardním typem rostlin.
25. 25. Rostliny podle patentových nároků 19 nebo 20, které vykazují změněný obsah chlorofylu ve srovnání se standardním typem rostlin.
26. 26. Rostliny podle patentového nároku 25, které vykazují zvýšený obsah chlorofylu ve srovnání se standardním typem rostlin.

    • · · ·
27. 27. Dvouděložné rostliny podle kteréhokoli z patentových nároků 19 až 26.
28. 28. Rostliny podle patentového nároku 27, které jsou užitkové rostliny, rostliny poskytující potravu anebo krmivo, zvláště brukev řepka, sója, rajská jablíčka, brambory, cukrová řepa, jetel.
29. 29. Jednoděložné rostliny podle kteréhokoli z patentových nároků 19 až 26.
30. 30. Rostliny podle patentového nároku 29, které jsou užitkové rostliny, rostliny poskytující potravu anebo krmivo, zvláště obiloviny jako pšenice, ječmen, kukuřice, oves, žito, rýže, sladké trávy a pícniny.
31. 31. Rostliny podle kteréhokoli z patentových nároků 19 až 30, v nichž je do rostlinného genomu zabudována sekvence nukleové kyseliny, která kóduje protein, který má geranylgeranyl reduktázovou aktivitu nebo jeho aktivní fragment, rovněž tak části uvedených rostlin a transgenní rozmnožovací materiál uvedených rostlin, jako jsou protoplasty, rostlinné buňky, závaly, semena, hlízy, řízky atd. a rovněž transgenní potomstvo těchto rostlin.
32. 32. Transgenní rostlinné buňky, včetně protoplastů, které obsahují sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje protein, který má geranylgeranyl reduktázovou aktivitu nebo jeho aktivní fragment.
33. 33. Rostlinné buňky podle patentového nároku 32, včetně protoplastů, které vykazují ve srovnání s netransformovanými rostlinnými buňkami změněný, s výhodou zvýšený obsah tokoferolů, vitaminu Κ_Ί anebo chlorofylu.
34. 34. Rostliny a rostlinné buňky podle kteréhokoli z patentových nároků 19 až 33, které dále obsahují sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje dioxygenázu hydroxyfenyl pyrohroznové kyseliny.
35. 35. Způsob vytváření rostlin nebo rostlinných buněk, podle kteréhokoli z patentových nároků 19 až 34, v y z n a č u j í c í se t í m, že obsahuje kroky:

    a) vytvoření sekvence nukleové kyseliny, která obsahuje následující složky, spojené ve směru 5'- 3':

    promotor funkční v rostlinách, s výhodou promotor specifický pro semena přinejmenším jednu sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje protein, který má geranylgeranyl reduktázovou aktivitu nebo jeho aktivní fragment, a případně terminační signál pro ukončení transkripce a připojení poly-A sekvence k odpovídajícímu transkriptu a rovněž případně DNA sekvence z nich odvozené;

    b) přenesení sekvence nukleové kyseliny z kroku a) do rostlinné buňky a případně zabudování sekvence nukleové kyseliny do rostlinného genomu,

    c) pokud je to žádoucí, zregenerování zcela transformovaných rostlin a popřípadě pěstování rostlin.
36. 36. Použití rostlin podle kteréhokoli z patentových nároků 19 až 31 a 34 jako potrava nebo krmné rostliny.
37. 37. Použití rostlin podle kteréhokoli z patentových nároků 19 až 31 a 34 pro produkci tokoferolů anebo vitaminu K|.
38. 38. Použití sekvence nukleové kyseliny, která kóduje protein, který má geranylgeranyl reduktázovou aktivitu nebo jeho aktivní fragment, pro určení, izolaci nebo pomnožení sekvence nukleové kyseliny, která kóduje protein, který má geranylgeranyl reduktázovou aktivitu nebo jeho aktivní fragment.
39. 39. Použití sekvence nukleové kyseliny, která kóduje protein, který má geranylgeranyl reduktázovou aktivitu nebo jeho aktivní fragment, nebo proteinu, který má geranylgeranyl reduktázovou aktivitu pro vytvoření protilátek.
40. 40. Použití sekvence nukleové kyseliny, která kóduje protein, který má geranylgeranyl reduktázovou aktivitu nebo jeho aktivní fragment pro vytváření transgenních rostlin

    -li&

    nebo rostlinných buněk.
41. 41. Použití podle patentového nároku 40, kde rostlina nebo rostlinná buňka vykazuje změněný obsah tokoferolu.
42. 42. Použití podle patentového nároku 40, kde rostlina nebo rostlinná buňka vykazuje změněný obsah chlorofýlu.
43. 43. Použití podle patentového nároku 40, kde rostlina nebo rostlinná buňka vykazuje změněný obsah vitaminu Ki.
44. 44. Použití podle patentového nároku 40, kde rostlina nebo rostlinná buňka vykazuje zvýšenou odolnost k herbicidu ve srovnání se standardním typem rostlin.
45. 45. Použití podle kteréhokoli z patentových nároků 40 až 44, kde rostlina nebo rostlinná buňka dále obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje dioxygenázu hydroxyfenyl pyrohroznové kyseliny.
46. 46. Použití sekvence nukleové kyseliny, která kóduje protein, který má geranylgeranyl reduktázovou aktivitu nebo jeho aktivní fragment, nebo protein, který má geranylgeranyl reduktázovou aktivitu pro určení efektorů rostlinné geranylgeranyl reduktázy.