ES2655975T3 - Procedimiento de producción de pachulol y 7-epi-alfa-selineno - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de pruducción pachulol y 7-epi-a-selineno que comprende a) poner en contacto pirofosfato de farnesilo (FPP) con al menos un polipéptido que tiene una actividad de pachulol y 7-epi-a-selineno sintasa y que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 70 % idéntica a SEQ ID NO: 1; en el que dicho poner en contacto es in vitro, o in vivo en un organismo no humano o célula transformada para expresar dicho polipéptido; y b) opcionalmente, aislar el pachulol y 7-epi-a-selineno producido en la etapa a).

Description

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Así, pueden obtenerse ácidos nucleicos mutantes y separarse, que pueden usarse para transformar una célula hospedadora según procedimientos convencionales, por ejemplo tal como se desvela en los presentes ejemplos.

En la etapa (d), el polipéptido obtenido en la etapa (c) se criba según al menos una propiedad modificada, por ejemplo una actividad enzimática modificada deseada. Ejemplos de actividades enzimáticas deseadas, según las que puede cribarse un polipéptido expresado, incluyen actividad enzimática potenciada o reducida, por ejemplo como se mide por el valor KM o Vmáx, regioquímica o estereoquímica modificadas y utilización de sustrato o distribución de productos alteradas. El cribado de actividad enzimática puede realizarse según procedimientos familiares para el experto y los desvelados en los presentes ejemplos.

La etapa (e) proporciona la repetición de las etapas de proceso (a)-(d), que puede realizarse preferentemente en paralelo. Por consiguiente, creando un número significativo de ácidos nucleicos mutantes, pueden transformarse muchas células hospedadoras con diferentes ácidos nucleicos mutantes al mismo tiempo, permitiendo el posterior cribado de un número elevado de polipéptidos. Así pueden aumentarse las probabilidades de obtener un polipéptido de variante deseado a criterio del experto.

Todas las publicaciones mencionadas en la presente solicitud desvelan y describen los procedimientos y/o materiales a propósito de los que se citan las publicaciones.

Descripción de los dibujos

Figura 1: Cromatogramas iónicos totales del análisis de CG-EM de los productos de sesquiterpeno generados por el pachulol y la 7-epi-a-selineno sintasa de la presente invención (SEQ ID NO: 1) (A) y perfil obtenido con un control negativo (B). Los picos marcados con números se identificaron como los sesquiterpenos: β-elemeno (producto de degradación de (+)-germacreno A) (1); α-guaieno (2); seicheleno (3); α-humuleno (4); α-pachuleno (5); α-selineno (6); α-bulneseno (7); 7-epi-α-selineno (8); (E)-nerolidol (9); alcohol de sesquiterpeno no identificado (10); pachulol (11). Figura 2: Espectros de masas de los dos productos principales de pachulol y 7-epi-α-selineno sintasa de la invención (SEQ ID NO: 2) (pico 8 y pico 11 en la Figura 1 (A y B, respectivamente)) y comparación con los espectros de masas del 7-epi-α-selineno y pachulol auténticos (C y D, respectivamente). Figura 3: Estructura de los sesquiterpenos producidos por el pachulol y la 7-epi-α-selineno sintasa de la invención (SEQ ID NO: 2).

Realizaciones específicas de la invención o ejemplos

La invención se describirá ahora en más detalle a modo de los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

Aislamiento de un ADNc de sesquiterpeno sintasa de raíces de Valeriana jatamansi

Se obtuvieron plantas de Valeriana jatamansi (sinónimo: Valeriana walichii) de B & T World Seeds (Paguignan, Aigues-Vives, Francia). Las plantas se cultivaron en un invernadero a temperatura mínima de 14 ºC. Se recogieron por separado rizomas, raíces jóvenes y maduras y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. El material se machacó y se pulverizó a un polvo fino en nitrógeno líquido usando un mortero y pistilo. Se extrajo ARN total usando Concert™ Plant RNA Reagent de Invitrogen siguiendo las instrucciones del fabricante, excepto que la precipitación con isopropanol se sustituyo por una precipitación con LiCl 2 M. Se evaluó la calidad del ARN en un gel de agarosa verificando la integridad de las bandas de ARN ribosómico. El ARNm se purificó del ARN total por cromatografía de afinidad en oligodT-celulosa usando el kit de aislamiento de ARNm FastTrack® 2.0 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se diseñaron oligonucleótidos degenerados para motivos conservados observados en alineamientos de las secuencias de aminoácidos de sesquiterpeno sintasas de planta (Deguerry y col, 2006, Arch Biochem Biophys. 454(2), 123-36). La RT-PCR con estos oligonucleótidos específicos de sesquiterpeno sintasas se realizó usando el kit Qiagen OneStep RT-PCR y un ciclador de gradiente térmico Mastercycler de Eppendorf. Mezclas de reacción típicas contienen 10 µl de 5X tampón Qiagen OneStep RT-PCR, 200 µM de cada dNTP, 0,4 µM de cada cebador, 2 µl de Qiagen OneStep RT-PCR Enzyme Mix, 1 µl de inhibidor de ribonucleasas RNasin® (Promega Co.) y 1 µg de ARN total en un volumen final de 50 µl. Las condiciones del ciclador térmico fueron: 30 min a 50 ºC (transcripción inversa); 15 min a 95 ºC (activación por ADN polimerasa); 35 ciclos de 30 s a 94 ºC, 30 s a 41 a 51 ºC y 1 min a 72 ºC. Los tamaños de los productos de PCR se evaluaron en un gel de agarosa al 1,2 %. Las bandas correspondientes al tamaño esperado se eliminaron del gen, se purificaron usando el kit de extracción en gel QIAquick® (Qiagen) y se clonaron en el vector pCR®2.1-TOPO usando el kit de clonación TOPO TA (Invitrogen). Entonces se sometieron ADNc insertados a una secuenciación de ADN y la secuencia se comparó contra la base de datos de proteínas no redundantes de GenBank (NCBI) usando el algoritmo de BLASTX (Altschul y col. 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410). La combinación del cebador directo TpsCF2 (SEQ ID NO: 3) (5'-GGGA(A/T)(A/T)G(A/T)(A/T/G/C)(A/T)(C/T/G)GTTGAA(T/G)(T/G)TTATTTTTGG-3') y el cebador inverso TpsCR3 (SEQ ID NO: 4) (5'-GT(A/T)(C/G)CGTG(A/T/G/C/)G(A/C/T)GTCGTA(A/C/T)G(T/G)GTCATC-3') proporcionaron un fragmento de 81 pb que presentaba homología de secuencias con sesquiterpeno sintasas de planta conocidas.

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Entonces se usó una combinación de amplificación rápida de los extremos de ADNc 3' y 5' (RACE) para obtener la secuencia de longitud completa del ADNc correspondiente a este fragmento. Para la 3'RACE, se dedujeron dos oligonucleótidos codificantes de la secuencia de 81 pb obtenida por RT-PCR: 20-3R1 (SEQ ID NO: 5) y 20-3R2 (SEQ ID NO: 6). Se preparó un ADNc bicatenario unido a adaptador usando el kit de amplificación de ADNc Marathon™ (Clontech) siguiendo el protocolo del fabricante. Este ADNc se preparó a partir de ARNm purificado de ARN total de rizoma de V. jatamansi. Mezclas de reacción de RACE típicas contienen, en un volumen final de 50 µl, 5 µl de 10X de tampón de reacción de PCR (Clontech), 200 µM de cada dNTP, 1 µl de mezcla de polimerasas Advantage® 2, 200 nM de cada cebador y 5 µl de ADNc 250 veces diluido. La amplificación se realizó en un ciclador de gradiente térmico Mastercycler de Eppendorf. Las condiciones del ciclado térmico fueron las siguientes: 1 min a 94ºC, 5 ciclos de 5 sa 94ºCy 3 min a 72ºC, 5 ciclos de 5 s a 94ºCy 3 min a 70ºC, 20 ciclos de 5 s a 94ºCy 3 min a 68 ºC. Los productos de amplificación se evaluaron, se subclonaron, y la secuencia se analizó como se ha descrito anteriormente. El extremo 3' del ADNc se obtuvo después de una primera ronda de amplificación con el cebador 20-3R1 y el cebador AP1 (Clontech) y una segunda ronda de amplificación con el cebador 20-3R2 y el cebador AP2 (Clontech).

Se dedujeron dos cebadores inversos de la secuencia obtenida por 3'RACE: 20-5R1 (SEQ ID NO: 7) y 20-5R2 (SEQ ID NO: 8). Se usó el kit de amplificación de ADNc SMART™ RACE (Clontech) para preparar un 5'RACE-ready cDNA de ARN total de raíz de V. jatamansi. Se realizó la 5'RACE en 50 µl de 1X tampón de PCR Advantage 2 que contenía 200 µM de dNTP, 5 µl de Universal Primer Mix (Clontech), 2 µM del primer cebador específico de gen (205R1), 2,5 µl de 5'RACE-ready cDNA y 1 µl de mezcla de polimerasas Advantage® 2. Se realizó una segunda ronda de amplificación en la misma condición con 1 µl de la primera amplificación, el cebador específico de gen anidado (20-5R2) y el cebador universal anidado (Clontech). La condición de ciclado de temperaturas y el análisis de fragmentos de ADN fueron como se ha descrito anteriormente para la 3'RACE.

La combinación de 3' y 5'-RACE permitió la reconstitución de la secuencia de longitud completa de un ADNc que se llamó ValR20 (SEQ ID NO: 9). La secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 10) mostró homología con las sesquiterpeno sintasas de planta y contuvo motivos de aminoácidos de terpeno sintasas típicas tales como el motivo DDxxD. Las secuencias más próximas fueron una secuencia de aminoácidos de vetispiradieno sintasa de S. tuberosum (49 % de identidad) y una supuesta sesquiterpeno sintasa de V. vinifera (hasta el 46 % de identidad).

Ejemplo 2

Expresión heteróloga y caracterización de ValR20 como 7-epi-α-selineno y pachulol sintasa

Se diseñaron dos oligonucleótidos, Val-R20-topo-inicio (SEQ ID NO: 11) y Val-R20-parada (SEQ ID NO: 12), a partir de las regiones de inicio y parada de ValR20 y se usaron para amplificar la secuencia de longitud completa de este ADNc. Se diseñó Val-R20-topo-inicio según los kits de expresión Champion™ pET Direccional TOPO® (Invitrogen). La amplificación se realizó con la ADN polimerasa Pfu (Promega) del conjunto de 5'-RACE-Ready cDNA preparado con el kit de amplificación de ADNc Smart RACE (Clontech). Las condiciones de ciclado térmico fueron las siguientes: 2 min a 95 ºC; 32 ciclos de 5 s a 94 ºC, 20 s a 53 ºC y 3 min a 72 ºC. Los productos de PCR se purificaron sobre un gel de agarosa y se eluyeron usando el kit de extracción en gel QIAquick® (Qiagen, Valencia, CA). El producto de PCR se ligó en el plásmido pET101 siguiendo el protocolo del fabricante (Invitrogen). Las construcciones se verificaron por secuenciación de ADN. Se seleccionó un clon, 504-ValR20 (SEQ ID NO: 2), para la posterior expresión heteróloga y experimentos de ensayo enzimático. En comparación con las secuencias reconstituidas de RACE, la secuencia de 504-ValR20 (SEQ ID NO: 2) mostró cuatro diferencias de nucleótidos que condujeron a tres cambios de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos codificada por 504-ValR20 se proporciona en SEQ ID NO: 1.

El plásmido se transfirió a células de E. coli BL21 Star™ (DE3) (Invitrogen). Se usaron colonias individuales de células transformadas para inocular 5 ml de medio LB. Después de alcanzar una DO de 0,3, se usaron cultivos de 5 ml para inocular 25 ml de medio LB. Los cultivos se incubaron a 37 ºC hasta que alcanzó una DO de 0,5 y entonces se transfirieron a una estufa de incubación a 20 ºC. Después de 1 hora de equilibrado, la expresión de las proteínas se indujo mediante la adición de IPTG 1 mM y el cultivo se incubó durante la noche a 20 ºC. Al día siguiente, las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en 1 ml de tampón de extracción (MOPSO 50 mM, pH 7,4, DTT 1 mM, 10 % de glicerol) y se rompieron por sonicación. Los residuos de células se sedimentaron por centrifugación de 30 min a 18.000 g y se recuperó el sobrenadante que contenía las proteínas solubles.

Los ensayos enzimáticos se realizaron en tubos de vidrio sellados con Teflon usando 250 µl de extracto de proteína en un volumen final de 5 ml de tampón de extracción complementado con MgCl2 10 mM y pirofosfato de farnesilo 100 a 250 µM (preparado como se describe por Keller y Thompson, J. Chromatogr 645(1), 161-167, 1993). Los ensayos se solaparon con 3 ml de pentano y los tubos se incubaron durante la noche a 30 ºC. Se recuperó la fase de pentano y el medio se extrajo con un segundo volumen de pentano. Las fracciones de pentano combinadas se concentraron bajo nitrógeno y se analizaron por CG-EM en un sistema detector selectivo de masas de cuadrupolo de CG Hewlett-Packard 6890N, equipado con una columna capilar de 0,25 mm de diámetro interno por 30 m de longitud DB-1EM (J&W Scientific). La temperatura del horno se programó de 50 ºC (1 min de mantenimiento) a 280 ºC a 10 ºC/min. El gas portador fue He a un flujo constante de 1 ml/min. La identidad de los productos se

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Claims (1)

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