ES2626619T3 - Procedimiento de producción de (+)-zizaeno - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que tiene una actividad de (+)-zizaeno sintasa y que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 70 % idéntica a SEQ ID NO:1.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Una herramienta importante para llevar a cabo el procedimiento de la invención es el propio polipéptido. Por lo tanto, un polipéptido que tiene una actividad de (+)-zizaeno sintasa y que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 70 % idéntica a SEQ ID NO:1 es otro objeto de la presente invención.

Según una realización preferida, el polipéptido es capaz de producir (+)-zizaeno como un producto principal. Según una realización aún más preferida, es capaz de producir una mezcla de sesquiterpenos en la que (+)-zizaeno representa al menos 60 %, preferentemente al menos 80 %, preferentemente al menos 90 % de los sesquiterpenos producidos.

Según una realización más preferida, el polipéptido tiene una actividad de (+)-zizaeno sintasa.

Según una realización preferida, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos 75 %, preferentemente al menos 80 %, preferentemente al menos 85 %, preferentemente al menos 90 %, más preferentemente al menos 95 % y aún más preferentemente al menos 98 % idéntica a SEQ ID NO:1. Según una realización más preferida, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1. Según una realización aún más preferida, el polipéptido consiste en SEQ ID NO:1.

Según otra realización preferida, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es una variante de SEQ ID NO:1 obtenida por ingeniería genética. En otros términos, dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que se ha obtenido modificando SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 o su complemento. Según una realización más preferida, el polipéptido que tiene una actividad de (+)-zizaeno sintasa consiste en una secuencia de aminoácidos que es una variante de SEQ ID NO:1 obtenida por ingeniería genética, es decir, una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que se ha obtenido modificando SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 o su complemento.

Según otra realización, el polipéptido se aísla de Vetiveria zizanoides.

Tal como se usa en el presente documento, el polipéptido se entiende como un polipéptido o fragmento peptídico que abarca las secuencias de aminoácidos identificadas en el presente documento, así como polipéptidos truncados

o variantes, siempre y cuando conserven su actividad como se definió anteriormente y que compartan al menos el porcentaje definido de identidad con el correspondiente fragmento de SEQ ID NO:1.

Ejemplos de polipéptidos variantes son proteínas que se dan de manera natural que resultan de sucesos de corte y empalme de ARNm alterno o de escisión proteolítica de los polipéptidos descritos en el presente documento. Variaciones atribuibles a proteólisis incluyen, por ejemplo, diferencias en los terminales N-o C-tras la expresión en diferentes tipos de células hospedadores, debido a la separación proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de los polipéptidos de la invención. La invención también abarca los polipéptidos codificados por un ácido nucleico obtenido por mutación natural o artificial de un ácido nucleico de la invención, descritos más adelante. Por ejemplo, como se detalla en el Ejemplo 4 de más adelante, SEQ ID NO:11 es una variante de SEQ ID NO:2, obtenida por mutación artificial de SEQ ID NO:2, conduciendo a una secuencia de nucleótidos que se optimiza por la expresión en E. coli y que codifica la misma (+)-zizaeno sintasa que SEQ ID NO:2 (es decir, SEQ ID NO:1). Las secuencias SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:11 son idénticas al 76 %.

Los polipéptidos de la invención también abarcan variantes de polipéptido que resultan de una fusión de secuencias peptídicas adicionales en los extremos terminales amino y carboxilo. En particular, tal fusión puede mejorar la expresión de los polipéptidos, ser útil en la purificación de la proteína o mejorar la actividad enzimática del polipéptido en un ambiente deseado o sistema de expresión. Tales secuencias peptídicas adicionales pueden ser, por ejemplo, un péptido señal. Por consiguiente, la presente invención abarca variantes de los polipéptidos de la invención, tales como las obtenidas por fusión con otros oligo-o polipéptidos y/o las que están unidas a los péptidos señal. Los polipéptidos de la invención también abarcan los polipéptidos resultantes de una fusión con otra proteína funcional, tales como otra proteína de la ruta de biosíntesis de terpeno.

Tal como se mencionó anteriormente, el ácido nucleico codificador del polipéptido de la invención es una herramienta útil para modificar organismos o células hospedadores no humanos destinados a usarse cuando el procedimiento se lleva a cabo in vivo.

Por tanto, un ácido nucleico codificador de un polipéptido según cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas es también un objeto de la presente invención.

Según una realización preferida, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos al menos 75 %, preferentemente al menos 80 %, preferentemente al menos 85 %, preferentemente al menos 90 %, más preferentemente al menos 95 % y aún más preferentemente al menos 98 % idéntica a SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11

o su complemento. Según una realización más preferida, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 o su complemento. Según una realización aún más preferida, el ácido nucleico consiste en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 o su complemento.

Según otra realización, el ácido nucleico se aísla de Vetiveria zizanoides.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

El ácido nucleico de la invención se puede definir como que incluye polímeros de desoxirribunucleótido o ribonucleótido en forma de o bien cadena sencilla o doble (ADN y/o ARN). Los términos “secuencia de nucleótidos” también se deberían entender como que comprende una molécula de polinucleótidos o una molécula de oligonucleótidos en la forma de un fragmento separado o como un componente de un ácido nucleico mayor. Los ácidos nucleicos de la invención también abarcan ciertas secuencias de nucleótidos aisladas que incluyen las que son sustancialmente libres de material endógeno contaminante. El ácido nucleico de la invención puede ser truncado, siempre y cuando codifique un polipéptido abarcado por la presente invención, como se describió anteriormente.

Según una realización más preferida, el al menos un ácido nucleico según cualquiera de las realizaciones anteriores comprende una secuencia de nucleótidos que se ha obtenido modificando SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 o su complemento. Preferentemente dicho ácido nucleico consiste en una secuencia de nucleótidos que se ha obtenido modificando SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 o su complemento.

La invención abarca los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia obtenida por mutación de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 o su complemento, siempre y cuando las secuencias comprendan compartir al menos el porcentaje definido de identidad con los correspondientes fragmentos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 o su complemento y siempre y cuando codifiquen un polipéptido que tenga una actividad de (+)-zizaeno sintasa, como se define en cualquiera de las anteriores realizaciones. Las mutaciones pueden ser cualquier tipo de mutaciones de estos ácidos nucleicos, tales como mutaciones puntuales, mutaciones por deleción, mutaciones por inserción y/o mutaciones por desplazamiento de marco. Un ácido nucleico variante se puede preparar para adaptar su secuencia de nucleótidos a un sistema de expresión específico. Por ejemplo, se sabe que los sistemas de expresión bacterianos expresan más eficazmente polipéptidos si se codifican los aminoácidos por un codón preferido. Debido a la degeneración del código genético, en la que más de un codón puede codificar el mismo aminoácido, las secuencias de ADN múltiples pueden codificar el mismo polipéptido, siendo todas estas secuencias de ADN abarcadas por la invención.

Otra herramienta importante para transformar los organismos o las células hospedadores adecuados para llevar a cabo el procedimiento de la invención in vivo es un vector de expresión que comprende un ácido nucleico según cualquier realización de la invención. Por tanto, tal vector también es un objeto de la presente invención.

Un “vector de expresión” como se usa en el presente documento incluye cualquier vector recombinante lineal o circular que incluye, pero no se limita, a vectores víricos, bacteriófagos y plásmidos. El experto es capaz de seleccionar un vector adecuado según el sistema de expresión. En una realización, el vector de expresión incluye el ácido nucleico de la invención operativamente unido a al menos una secuencia reguladora, la cual controla la iniciación y/o terminación de la transcripción y/o traducción, tal como un promotor, operador o potenciador transcripcional, o un sitio de unión ribosómico del ARNm y, opcionalmente, incluyendo al menos un marcador de selección. Las secuencias de nucleótidos están “operativamente unidas” cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con el ácido nucleico de la invención.

Los vectores de expresión de la presente invención se pueden usar en los procedimientos para preparar un organismo y/o una célula hospedadores genéticamente transformados, en organismos y/o células hospedadoras que portan los ácidos nucleicos de la invención y en los procedimientos para producir o realizar polipéptidos que tienen una actividad de (+)-zizaeno sintasa, como se revela más a continuación.

Los organismos y las células hospedadores no humanos recombinantes transformados para portar al menos un ácido nucleico de la invención de manera que expresen o sobreexpresen de manera heteróloga al menos un polipéptido de la invención también son herramientas muy útiles para llevar a cabo el procedimiento de la invención. Por tanto, tales organismos y células hospedadores no humanos son otro objeto de la presente invención.

Un ácido nucleico según cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas se puede usar para transformar los organismos y las células hospedadores no humanos y el polipéptido expresado puede ser cualquiera de los polipéptidos anteriormente descritos.

Los organismos hospedadores no humanos de la invención pueden ser cualquier organismo multicelular o unicelular no humano. En una realización preferida, el organismo hospedador no humano es una planta, un procariota o un hongo. Cualquier planta, procariota u hongo es adecuado para ser transformado según la presente invención. Plantas particularmente útiles son las que producen de manera natural altas cantidades de terpenos. En una realización más preferida, la planta se selecciona entre la familia de Solanaceae, Poaceae, Brassicaceae, Fabaceae, Malvaceae, Asteraceae o Lamiaceae. Por ejemplo, la planta se selecciona entre el género Nicotiana, Solanum, Sorghum, Arabidopsis, Brassica (colza), Medicago (alfalfa), Gossypium (algodón), Artemisia, Sylvia y Mentha. Preferentemente, la planta pertenece a las especies de Nicotiana tabacum.

En una realización más preferida el organismo hospedador no humano es un microorganismo. Cualquier microorganismo es adecuado para la presente invención, pero según una realización aún más preferida dicho microorganismo es una bacteria o levadura. Más preferentemente, dicha bacteria es E. coli y dicha levadura es Saccharomyces cerevisiae.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Células eucariotas superiores aisladas también pueden ser transformadas, en lugar de organismos completos. Como células eucariotas superiores, los inventores quieren decir en el presente documento cualquier célula eucariota no humana excepto células de levadura. Células eucariotas superiores preferidas son células vegetales o células fúngicas.

El término “transformado” se refiere al hecho de que el hospedador se sometió a ingeniería genética para comprender una, dos o más copias de cada uno de los ácidos nucleicos requeridos en cualquiera de la realización anteriormente descrita. Preferentemente, el término “transformado” se refiere a hospedadores que expresan de manera heteróloga los polipéptidos codificados por el ácido nucleico con el que son transformados, así como que sobreexpresan dichos polipéptidos. Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona un organismo transformado, en el cual los polipéptidos se expresan en cantidades mayores que en el mismo organismo no transformado así.

Hay diversos procedimientos conocidos en la técnica para la creación de organismos o células hospedadores transgénicos tales como plantas, hongos, procariotas o cultivos de células eucariotas superiores. Vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con hospedadores celulares bacterianos, fúngicos, de levadura, vegetales y mamíferos están descritos, por ejemplo, en Pouwels y col., “Cloning Vectors: A Laboratory Manual”, 1985, Elsevier, Nueva York y Sambrook y col., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2º edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Vectores de clonación y expresión para plantas superiores y/o células vegetales en particular están disponibles para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Schardl y col. Gene 61: 1-11, 1987.

Procedimientos para transformar organismos o células hospedadores para portar ácidos nucleicos transgénicos son familiares para los expertos en la técnica. Para la creación de plantas transgénicas, por ejemplo, procedimientos actuales incluyen: electroporación de protoplastos vegetales, transformación mediada por liposoma, transformación mediada por agrobacterium, transformación mediada por polietilenglicol, bombardeo de partícula, microinyección de células vegetales y transformación usando virus.

En una realización, el ADN transformado está integrado en un cromosoma de un organismo y una célula hospedadores no humanos de manera que da como resultado un sistema recombinante estable. Cualquier procedimiento de integración cromosómica conocido en la técnica se puede usar en la práctica de la invención, incluyendo, pero no limitándose a, intercambio de casete mediado por recombinasa (RMCE), inserción cromosómica específica a sitio vírica, adenovirus e inyección pronuclear.

Para llevar a cabo el procedimiento para producir (+)-zizaeno in vitro, como se expuso anteriormente en el presente documento, es muy ventajoso proporcionar un procedimiento de producción de al menos un polipéptido que tenga una actividad de (+)-zizaeno sintasa como se describe en cualquier realización de la invención. Por lo tanto, la invención proporciona un procedimiento para producir al menos un polipéptido según cualquier realización de la invención que comprende

a) cultivar un organismo o una célula hospedadores no humanos según cualquier realización de la invención;

b) aislar el polipéptido del organismo o la célula hospedadores no humanos en una etapa a).

Según una realización preferida, dicho procedimiento comprende, además, antes de la etapa a), transformar un organismo o una célula hospedadores no humanos con al menos un ácido nucleico según cualquier realización de la invención, de manera que dicho organismo exprese el polipéptido codificado por dicho ácido nucleico.

Se pueden usar un ácido nucleico según cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas.

La transformación y el cultivo del organismo o la célula hospedadores no humanos se puede llevar a cabo como se describió anteriormente para el procedimiento de producción de (+)-zizaeno in vivo. La etapa b) se puede realizar usando cualquier técnica bien conocida en la técnica para aislar un polipéptido particular a partir de un organismo o una célula.

Una “variante de polipéptido” como se denomina en el presente documento significa un polipéptido que tiene una actividad de (+)-zizaeno sintasa y que es sustancialmente homólogo al polipéptido según cualquiera de las realizaciones anteriores, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la codificada por cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención debido a una o más deleciones, inserciones o sustituciones.

Las variantes pueden comprender secuencias sustituidas de manera conservadora, significando que un residuo de aminoácidos dado está reemplazado por un residuo que tiene características fisioquímicas similares. Ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen sustituciones de un residuo alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu, o Ala por otro, o sustituciones de un residuo polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Véase Zubay, Biochemistry, 1983, Addison-Wesley Pub. Co. Los efectos de tales sustituciones se pueden calcular usando matrices de puntuación de sustitución tales como PAM-120, PAM-200, y PAM-250 como se discute en Altschul, J. Mol. Biol., 1991, 219, 555-565. Se conocen bien otras de tales sustituciones conservadoras, por ejemplo, sustituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobicidad similares.

imagen6

imagen7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Ejemplo 2

Secuenciación de genoteca de ADNc y amplificación de un ADNc de sesquiterpeno sintasa

Se usó la tecnología de secuenciación paralela a gran escala de fragmentos pequeños de ADN desarrollada por Illumina (San Diego, California) para secuenciar la genoteca completa de ADNc. La preparación del ADN para secuenciar, la secuenciación y la reunión de las lecturas se realizaron por Fasteris SA (Plan-les-Ouates, Suiza). La genoteca de ADNc se trató siguiendo el Genomic Sample Prep Kit (Illumina) y se secuenció sobre el sistema del Genome Analyzer (Illumina). Se obtuvieron un total de 4,2 millones de lecturas de 35 pb (de los cuales 3,6 millones eran secuencias únicas). Estas lecturas se reunieron usando EDENA 2.1.1, un programa informático que encuentra solapamientos entre las lecturas y reúne de nuevo contigos (Hernandez D., François P., Farinelli L., Østerås M., y Schrenzel J., “De novo bacterial genome sequencing: Millions of very short reads assembled on a desktop computer”. Genome Res. 18(5), 802-809, 2008). Después de eliminar contigos más cortos de 100 bases, se obtuvieron 4.324 contigos únicos con una longitud máxima de 1.882 pb. Se realizó otra reunión usando el programa Velvet 1.0 ((Zerbino y Birney (2008), “Velvet: algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs”. Genome Res. 18(5), 821-829), proporcionando 9.264 contigos únicos de longitud entre 100 y 2.006 bases.

Se compararon todos los contigos generados frente una base de datos de secuencias de proteína (que contenían una selección de 7.000 secuencias de proteína vegetal) usando el algoritmo Blastx (Altschul y col, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990). Se retuvieron los contigos que mostraban homología de secuencia significante con sesquiterpeno sintasas vegetales y la homología se confirmó más realizando, para cada contigo seleccionado, una investigación de blast frente a las secuencias de proteína no redundantes de NCBI (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov). De este modo, 15 contigos se confirmaron como fragmentos de ADNc codificador de sesquiterpeno.

Uno de los contigos seleccionados (VzCtg306, SEQ ID NO:3) era de 1.090 pb de longitud y las comparaciones de secuencia con terpeno sintasas de longitud completa mostraron que el extremo 3’ y el extremo 5’ estaban perdidos. Se diseñaron dos cebadores directos (ctg306-3R1 (SEQ ID NO:4) y ctg306-3R2 (SEQ ID NO:5)) y dos cebadores inversos (ctg306-5R1 (SEQ ID NO:6) y ctg306-5R2, (SEQ ID NO:7)) a partir de esta secuencia y se usaron para la Amplificación Rápida de los Extremos de ADNc (RACE). Se usó el SMART™ RACE cDNA Amplification Kit (Clontech Laboratories, Mountain View, CA) con la transcriptasa inversa PrimeScript (TaKaRa Bio, Shiga, Japón). Así, se prepararon un conjunto de ADNc Preparado por 5’RACE SMART™ y un ADNc Preparado por 3’RACE SMART™ cada uno a partir de 1,2 µg de ARN total de raíz de vetiver. Para la 5’RACE, se realizó una primera ronda de PCR con los cebadores UPM (Clontech Laboratories) y el cebador ctg306-5R1 (SEQ ID NO:6) seguido de una segunda ronda de PCR con el cebador NUP (Clontech Laboratories) y el cebador ctg306-5R2 (SEQ ID NO:7). Para el 3’RACE, se realizó una primera ronda de PCR con los cebadores UPM (Clontech Laboratories) y el cebador ctg306-3R1 (SEQ ID NO:4) seguido de una segunda ronda de PCR con el cebador NUP (Clontech Laboratories) y el cebador ctg306-3R2 (SEQ ID NO:5). Las amplificaciones se realizaron en las condiciones detalladas en el manual de fabricante (Clontech):

La combinación del 5’ y 3’RACE siguió la reconstitución de un ADNc de 1.925 pb (VzZS, SEQ ID NO:8) que contenía un marco de lectura abierto de 1.668 pb (SEQ ID NO:2) codificador de una proteína de 555 aminoácidos de longitud (SEQ ID NO:1).

Ejemplo 3

Expresión heteróloga y caracterización enzimática

El marco de lectura abierto VzZS de longitud completa (VzZS-ORF, SEQ ID NO:2) se amplificó a partir del conjunto de ADNc Preparado por 5’RACE SMART™ usando el cebador ctg306-inicio (SEQ ID NO:9) y ctg306-parada (SEQ ID NO:10). La amplificación de este ADNc para las construcciones de expresión se realizó usando la Pfu ADN polimerasa (Promega, Madison, WI, USA), en un volumen final de 50 µl que contenía 5 µl de Pfu ADN polimerasa 10x tampón, 200 µM cada dNTP, 0,4 µM cada cebador directo e inverso, 2,9 unidades de Pfu ADN polimerasa y 2,5 µl del ADNc (preparado como se describió anteriormente). Las condiciones de ciclación térmica eran las siguientes: 1,5 min a 95 ºC; 30 ciclos de 45 s a 95 ºC, 30 s a 54 ºC y 4 min a 72 ºC; y 10 min a 72 ºC.

Se insertaron los productos de PCR en el vector pET101/D-TOPO usando el Champion pET101 Directional TOPO Expression Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones de fabricación. Se seleccionaron diversos clones y los insertos de plásmido secuenciados para confirmar que la secuencia era idéntica a la secuencia obtenida por RACE.

Se usó el plásmido pET101-VzZS para transformar células de E. coli BI21(DE3) (Novagen, Madison, WI). Se usaron colonias únicas de células transformadas para inocular 5 ml de medio LB. Después de 5 a 6 horas de incubación a 37 ºC, los cultivos se transfirieron a una incubadora a 20 ºC y se dejaron 1 hora para equilibrado. A continuación, la expresión de la proteína se indujo por la adición de IPTG 1 mM y el cultivo se incubó durante la noche a 20 ºC. Al día siguiente, las células se recogieron por centrifugación, se sometieron a resuspensión en 0,1 volumen de MOPSO 50 mM pH 7, glicerol al 10 % y se lisaron por sonicación. Los extractos se aclararon por centrifugación (30 min a 20.000 g) y los sobrenadantes que contenían las proteínas solubles se usaron para experimentos adicionales.

15

25

35

45

55

Se usaron los extractos de proteína de E. coli brutos que contenían la proteína recombinante para la caracterización de las actividades enzimáticas. Se sintetizó farnesil-difosfato (FPP) como se describe por Keller, R.K., y Thompson, R., J. Chromatogr. 645(1), 161-167, 1993. Los ensayos se realizaron en 1 a 4 ml de MOPSO 50 mM pH 7, glicerol al 10 %, DTT 1 mM, MgCl2 10 mM en presencia de 10 a 100 µM de sustrato y 0,1 a 0,5 mg de proteína bruta. Los tubos se incubaron 12 a 24 horas a 30 ºC y se extrajeron dos veces con un volumen de pentano. Después de la concentración bajo un flujo de nitrógeno, los extractos se analizaron por GC y GC-MS y se compararon con extractos de ensayo con proteínas control. El análisis por GC se realizó sobre un sistema Agilent 6890 Series GC equipado con un detector de ionización por llama que usa un diámetro interno de 0,25 mm por columna de capilaridad SPB-1 30 m (Supelco, Bellefonte, PA). El gas vehículo era He a un flujo constante de 1 ml/min. La temperatura de horno inicial era de 80 ºC (mantenida 1 min) seguido de un gradiente de 10 ºC/min hasta 300 ºC. El análisis por GC-MS se realizó en las mismas condiciones y los espectros se registraron en un detector de masas Agilent 5975.

En estas condiciones, la proteína recombinante codificada por el ADNc de VzZS produjo un sesquiterpeno principal que representaba el 75 % de la mezcla de sesquiterpeno producida. El producto principal se identificó como (+)zizaeno mediante el enfrentamiento del espectro de masas y el índice de retención con patrones auténticos y datos publicados (Joulain, D., y König, W.A., “The Atlas of Spectral Data of Sesquiterpene Hydrocarbons”, EB Verlag, Hamburg, 1998). La enzima produce también 6,9 % de prezizaeno, 2,8 % de α-funebreno, 2,7 % de β-funebreno y al menos otros 3 sesquiterpenos a proporciones entre 0,85 y 8,7 % (Figura 2). Así, el ADNc de VzZS aislado de Vetiveria zizanoides codificó una (+)-zizaeno sintasa (SEQ ID NO:1) que producía el precursor de hidrocarburo de los sesquiterpenos más abundantes en raíces de vetiver (Khusimol, zizaen-12-al, ácido khuzénico). La enzima también produjo como productos secundarios algunos de los precursores de los constituyentes menores de las raíces de vetiver.

Ejemplo 4

Uso de la proteína VzZS recombinante para la producción in vivo de (+)-zizaeno en bacterias

Para la expresión óptima de la VzZS en E. coli, se rediseñó la secuencia de ADN del ORF del ADNc de VzCtg306 para tener en cuenta el uso del codón del hospedador y otros parámetros que influyen en la estabilidad del ARNm y su traducción. La secuencia optimizada (VzZS-opt, SEQ ID NO:11) se diseñó y se sintetizó con los sitios de restricción NdeI y KpnI y los extremos 3’ y 5’ (DNA 2.0, Menlo Park, CA, USA) y se subclonaron en el plásmido pETDuet-1 (Novagene, Madison, WI) proporcionando el plásmido pETDuet-VzZS-opt.

Para evaluar la producción in vivo de (+)-zizaeno, se transformaron células de E. coli con el plásmido pETDuetVzZS-opt y se evaluó la producción de sesquiterpenos a partir del conjunto de FPP endógeno. Para incrementar la productividad de las células, también se expresaron en las mismas células una FPP sintasa y los genes codificadores de una ruta de mevalonato parcial. Estos últimos genes se organizaron en un operón único y codificaron una mevalonato quinasa (mvaK1), una fosfomevalonato quinasa (mvaK2), una mevalonato difosfato descarboxilasa (MvaD) y una isopentenil difosfato isomerasa (idi) y mevalonato exógeno convertido en isopentenil difosfato (IPP) y dimetilalil difosfato (DMAPP), los dos sustratos de la FPP sintasa.

El gen de la FPP sintasa de levadura se amplificó a partir del ADN genómico de S. cerevisiae usando los cebadores FPPy_NcoI (SEQ ID NO:12) y FPPy-Eco (SEQ ID NO:13). El ADN genómico se aisló a partir de S. cerevisiae usando el Qiagen RNA/DNA Maxi kit (Qiagen AG, Basel, Suiza). El PCR se realizó con la Pfu ADN polimerasa (Promega AG, Dubendorf, Suiza) en un volumen final de 50 µl que contenía 0,4 µl de cada cebador, dNTPs 200 µM, 0,5 µl de ADN polimerasa, 5 µl de ADN genómico de S. cerevisiae. La condición de ciclación de PCR era la siguiente: 90 s a 95 ºC; 28 ciclos de 45 s a 95 ºC, 30 s a 54 ºC y 4 min a 72 ºC; 10 min a 72 ºC. El ADN amplificado se ligó como fragmento Ndel-EcoRI en el primer sitio de clonación múltiple (MCS1) del plásmido pACYCDuet-1 (Novagen, Madison, WI) proporcionando el plásmido pACYCDuet-FPPs que portaba el gen de FPP bajo el control de un promotor T7.

Se amplificó un operón que contenía los genes codificadores de mvaK1, mvaK2, MvaD e idi a partir del ADN genómico de Streptococcus pneumoniae (ATCC BAA-334, LGC Standards, Molsheim, Francia) con los cebadores MVA-up1-inicio (SEQ ID NO:14) y MVA-up2-parada (SEQ ID NO:15). La PCR se realizó usando la ADN polimerasa PfuUltra™ II Fusión HS (Stratagene, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, EEUU). La composición de la mezcla de PCR era según las instrucciones del fabricante. La condición de ciclación térmica era 2 min a 95 ºC; 30 ciclos de 20 s a 95 ºC, 20 s a 58 ºC y 90 s a 72 ºC; y 3 min a 72 ºC. El fragmento de 3,8 kb se purificó sobre un gel de agarosa y se ligó usando el In-Fusion™ Dry-Down PCR Cloning Kit (Clontech Laboratories) en el segunda MCS del plásmido pACYCDuetFPPs digerido con NdeI y XhoI proporcionando el plásmido pACYCDuet-4506. Las secuencias de los dos insertos se secuenciaron completamente para excluir cualquier mutación.

Se transformaron células de E. coli BL21 Star™(DE3) (Invitrogen, Carlsbad, CA) con el plásmido pETDuet-VzZS-opt

o se transformaron conjuntamente con el mismo plásmido y con el plásmido pACYCDuet-4506. Las células transformadas se seleccionen sobre placas de LB-agarosa con carbenicilina (50 µg/ml) y cloranfenicol (34 µg/ml). Se usaron colonias únicas para inocular 5 ml de medio LB líquido complementado con los mismos antibióticos. El cultivo se incubó durante la noche a 37 ºC. Al día siguiente se inocularon con 0,2 ml del cultivo de noche 2 ml de medio TB

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2