ES2540791B1 - Nuevas sesquiterpeno sintasas aisladas de la piel de naranja. - Google Patents

Abstract

Nuevas sesquiterpeno sintasas aisladas de la piel de naranja.#La presente invención se relaciona con un enzima natural sesquiterpeno sintasa de naranjo (CsTPS3) con actividad {de}-cadineno sintasa, así como con las variantes de dicha enzima modificadas por la substitución de al menos un aminoácido que altera su actividad catalítica, transformándolas preferentemente en enzimas con actividad elemol sintasa o germacreno D sintasa. Son asimismo objeto de la presente invención, el ácido nucleico que codifica el enzima natural CsTPS3 así como las versiones modificadas derivadas de éste, además de las construcciones génicas, vectores de expresión y cepas bacterianas que los comprenden.#La invención también se refiere al uso de estas enzimas para sintetizar sesquiterpenos, preferentemente {de}-cadineno, elemol y germacreno D, y proporciona un método para la obtención de los mismos.

Description

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representan nucleótidos diferentes en la misma posición. Los guiones representan huecos (gaps) en la secuencia de nucleótidos.

Figura 5. Alineamiento múltiple de la secuencia deducida de aminoácidos del polipéptido natural CsTPS3 (SEQ ID NO:2) y otras germacreno sintasas vegetales (Ger) filogenéticamente relacionadas. El alineamiento se realizó con el programa informático Expresso 3D Coffee (http://www.tcoffee.org/), utilizando como modelo la estructura cristalográfica de la 5-epi-aristoloqueno sintasa de tabaco (TEAS. PDB: 5EAT [DOI:10.2210/pdb5eat/pdb]). Los aminoácidos absolutamente conservados se muestran sobre fondo negro, mientras que los residuos altamente conservados se muestran sobre fondo gris (pálido u obscuro). Los motivos conservados RRX8W, RXR, GVYFEP, DDX2D, NSE/DTE de las sesquiterpenos sintasas vegetales se indican sobre el alineamiento. AdGerD (Actinidia deliciosa GerD, AAAX16121), CcGerB (Cistus creticus GerB, ACF94469), Nt5EAS (Nicotiana tabacum TEAS, Q40577); PtdGerD (Populus trichocarpa x deltoides GerD, AAR99061), RhGerD (Rosa hybrida GerD, BQ105086), y VvGerD (Vitis vinifera GerD,

AAS66357). (∆) Señala aminoácidos involucrados en la catálisis de la TEAS. Los residuos señalados con (▼) se mutagenizaron para conocer su papel en la actividad catalítica del

enzima CsTPS3. (§) Señala aminoácidos que, en la misma posición, son diferentes en el polipéptido CsTPS3 en comparación al resto de los polipéptidos con actividad TPS utilizadas en el alineamiento.

Figura 6. Árbol filogenético de sesquiterpeno sintasas vegetales de la subfamilia TPS-a, incluyendo el polipéptido CsTPS3. El árbol se construyó mediante análisis de máxima verosimilitud (maximum likelihood analysis), utilizando la secuencia de aminoácidos de enzimas con actividad cubebeno (Cub), cadineno (Cad) y germacreno (Ger) sintasa. AaGerA (Artemisia annua GerA, AAX16121), AdGerD (Actinidia deliciosa GerD, AAAX16121), CcGerB (Cistus creticus GerB, ACF94469), CiGerA (Cichorium intybus GerA, AAM21658, CmGerD (Cucumis melo GerD, ABX83200), CsTPS3 (Citrus sinensis TPS3), Ga(+)--Cad (Gossypium arboreum (+)--Cad, CAA77191), Gh(+)--Cad (Gossypium hirsitum (+)--Cadineno, AAX44033), HaCad (Helianthus annuus Cad, AAY41422), IdGerA (Ixeris dentate GerA, AAL92481), LhGerB (Lycopersicum hirsitum GerB, AAG41891), LhGerD (L. hirsitum GerD, AAG41892), LsGerA (Lactuca sativa GerA, AAM11627), Mg--Cub (Magnolia grandiflora -Cub, ACC66281), MtTPS5 (Medicago truncatula TPS5, ABB01625), Ob(+)-GerD (Ocimum basilicum (+)-GerD, AAV63786), PcGerA (Pogostemon cablin GerA, AAS86321), Pc(‒)-GerD (P. cablin (‒)-GerD, AAS86320), Pt(‒)-GerD (Populus trichorcapa x deltoids (‒)-GerD, AAR99061), RhGerD (Rosa hybrida GerD, BQ105086),

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SaGerD (Santalum album GerD, ACF24768), ScGerA (Solidago canadiensis GerA, CAC36896), Sc(+)-GerD (S. canadiensis (+)-GerD, AAR3114), Sc(‒)-GerD (S. canadiensis GerD, AAR3115), SlGerC (Solanum lycopersicon GerC, AAC39431), Vv(‒)-GerD (Vitis vinifera (‒)-GerD, AAS66357), y Zo(+)-GerD (Zingiber officinale (+)-GerD, AAX40665).

Figura 7. Perfil de sesquiterpenos volátiles producidos por la proteína CsTPS3, y cada una de sus versiones mutantes, en las condiciones del ensayo enzimático I. Los sesquiterpenos se identificaron mediante análisis de cromatografía de gases acoplada a la espectrofotometría de masas. Se muestran los sesquiterpenos volátiles identificados en ensayos enzimáticos en los cuales el substrato FPP se expuso a: (A) el polipéptido CsTPS3 (SEQ ID NO:2); (B) el polipéptido modificado CsTPS3-VB2 (SEQ ID NO:4); (C) el polipéptido modificado CsTPS3-VB5 (SEQ ID NO:6); (D) el polipéptido modificado CsTPS3-VC1 (SEQ ID NO:8); (E) el polipéptido modificado CsTPS3-VC2 (SEQ ID NO:10). El número sobre cada pico del cromatograma de gases indica el sesquiterpeno volátil identificado mediante espectrofotometría de masas. (F) Espectro de masas de cada uno de los sesquiterpenos identificados. Para cada pico se muestra el espectro de masas, el nombre común y el índice de retención calculado. Se muestra también, con fines comparativos y de autenticidad de los sesquiterpeno identificados, el espectro de masas de cada uno de los estándares de la librería de sesquiterpenos volátiles utilizada.

Figura 8. Perfil de sesquiterpenos volátiles producidos por la proteína CsTPS3, y cada una de sus versiones mutantes, en las condiciones del ensayo enzimático II. Los sesquiterpenos se identificaron mediante análisis de cromatografía de gases acoplada a la espectrofotometría de masas. Se muestran los sesquiterpenos volátiles identificados en ensayos enzimáticos en los cuales el substrato FPP se expuso a: (A) el polipéptido CsTPS3 (SEQ ID NO:2); (B) el polipéptido modificado CsTPS3-VB2 (SEQ ID NO:4); (C) el polipéptido modificado CsTPS3-VB5 (SEQ ID NO:6); (D) el polipéptido modificado CsTPS3-VC1 (SEQ ID NO:8); (E) el polipéptido modificado CsTPS3-VC2 (SEQ ID NO:10). El número sobre cada pico del cromatograma de gases indica el sesquiterpeno volátil identificado mediante espectrofotometría de masas. (F) Espectro de masas de cada uno de los sesquiterpenos identificados. Para cada pico se muestra el espectro de masas, el nombre común y el índice de retención calculado. Se muestra también, con fines comparativos y de autenticidad de los sesquiterpeno identificados, el espectro de masas de cada uno de los estándares de la librería de sesquiterpenos volátiles utilizada.

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Tal como se utiliza aquí, el término “porcentaje de identidad” se refiere al porcentaje de

aminoácidos que en una comparación de dos o más proteínas ocupan la misma posición relativa a lo largo del alineamiento. El término porcentaje de similaridad usado aquí es una medida estadística del grado de parentesco de dos o más secuencias de proteínas, basadas en las propiedades químicas de cada grupo de aminoácidos comparados a lo largo de las secuencias. Ambos parámetros, el porcentaje de identidad y el de similaridad, se calculan mediante programas informáticos que asignan un valor numérico a cada grupo de aminoácidos comparados a lo largo de la secuencia de proteínas alineadas. La similaridad deja margen para la variación conservativa, esto es la sustitución de un residuo hidrofóbico tal como isoleucina, valina, leucina o metionina aminoácidos por otro, o la sustitución de un residuo polar por otro, tales como arginina por lisina, ácido glutámico por aspártico, or glutamina por asparagina. La sustitución intencionada de un aminoácido puede hacerse en base a similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos siempre que se conserve la actividad biológica del polipéptido. En una realización preferente, los porcentajes de homología indicados en el presente documento se refieren a porcentajes de identidad de secuencia. Por ejemplo la identidad de secuencia de aminoácidos en tanto por ciento (%) con respecto a una secuencia de referencia particular, puede ser el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia de referencia. Si fuese necesario, pueden introducirse huecos en las secuencias alineadas para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, sin que por ello sean considerados substituciones conservativas de la identidad de secuencias.

El término “molécula de ácido nucleico modificada” tal como se usa aquí, se refiere a una

molécula de DNA que tienen diferencias en su secuencia de deoxiribonucleotidos (deleciones, inserciones, transiciones y transversiones) con respecto a la molécula natural o salvaje (wild type). En consecuencia, tales cambios o “mutaciones” son transmitidos a las proteínas codificadas en la forma de aminoácidos substituidos, delecionados o añadidos (inserciones). La mutación puede no tener efecto sobre la actividad enzimática de la proteína mutada, o por el contrario puede incrementarla, reducirla o aniquilarla por completo. En otros casos, el aminoácido remplazado corresponde a una substitución conservativa o no conservativa. Por ejemplo, el cambio de un aminoácido hidrofóbico por uno hidrofílico (cargado o polar) en el sitio activo de una proteína o en capas circundantes podría afectar la actividad de la proteína. Tales modificaciones pueden introducir en una molécula de ácidos nucleicos mediante técnicas conocidas con el nombre de mutagénesis dirigida (site-directed mutagenesis). Para tal fin, existen diversos kits comerciales basados en técnicas de PCR,

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condiciones adecuadas para favorecer o inducir la expresión de dicho ácido nucleico. De manera general, el método de inducción utilizado depende en cierta medida del tipo de vector de expresión utilizado, que como regla general en el caso de vectores comerciales es indicado por el fabricante. Asimismo, con la finalidad de conseguir las mejores condiciones de cultivo y de inducción posibles para cada tipo de proteína que se quiera expresar, se pueden modificar otras variables tales como temparatura, tiempo de inducción, medio de cultivo utilizado, etc. En lo que se refiere a la expresión de proteínas del tipo sesquiterpeno sintasa en bacterias, las condiciones de crecimiento e inducción son bastante conocidas y están disponibles para el experto medio en el estado de la técnica, y pueden variarse a juicio y deseo del especialista o técnico en cuestión.

Otro aspecto de la invención hace referencia al uso del polipéptido de la invención para la síntesis, preferentemente in vitro, de sesquiterpenos. Según la presente invención, el polipéptido de la invención permite sintetizar un sesquiterpeno que se selecciona entre al menos uno del grupo compuesto por: -cubebeno,-copaeno, -cubebeno, -elemeno, gurjuneno, E--cariofileno, -humuleno, germacreno D, biciclogermacreno ,-muuroleno, bulneseno, cubebol, -cadineno, elemol, germacreno D-4-ol, bulnesol, guaiol y una combinación cualquiera de dos o más de los anteriores. Más preferentemente, el sesquiterpeno que se sintetiza es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: cadineno, elemol y germacreno D, o una combinación cuaquiera de dos o más de los

anteriores.

En particular, y como se mencionó anteriormente, la -cadineno sintasa CsTPS3 (SEQ ID NO:2) por una parte puede utilizarse en la síntesis -cadineno y también de otros sesquiterpenos cíclicos tales como -copaeno, -cubebeno, germacreno D , y/o elemol. Por otra parte, las TPS modificadas producto de la invención pueden usarse para mejorar la producción y/o la biosíntesis de elemol, germacreno D, -gurjuneno, biciclogermacreno, guaiol, bulnesol y -elemeno, incrementando la distribución de estos sesquiterpenos en comparación a la cantidad relativa de -cadineno, -cubebeno, cubebol y -copaeno, productos principales de la actividad catalítica de la proteína natural de referencia CsTPS3. Este hecho puede resultar en métodos para incrementar la producción y/o la pureza del elemol, germacreno D, -gurjuneno y biciclogermacreno, guaiol, bulnesol y -elemeno, incrementando la recuperación de estos sesquiterpenos cíclicos del medio de reacción. Ejemplo de ello, son aquellos polipéptidos modificado que generan como producto principal elemol, además de una pequeña parte de guaiol y bulnesol, y solo trazas de -copaeno,

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oxigenados. Es sabido que el aroma más intenso del aceite esencial de las naranjas se debe a la presencia de terpenos cuyas concentraciones son relativamente muy bajas. El característico olor dulce y fresco de la piel de las naranjas se debe principalmente al -y sinensal (0.02%), cuyo umbral de detección es tan solo de 0.05 ppb (Högnadóttir y Rouseff, [2003] J. Chromatogr. A. 998, 201-211).

TABLA 3

Composición de sesquiterpenos del flavedo de naranjas Navel. El análisis de sesquiterpenos se realizó en extractos de flavedo mediante GC-MS. Los sesquiterpenos se identificaron por coincidencia del tiempo de retención (RT) y el espectro de masas (MS) de los estándares disponibles, o por la coincidencia el espectro de masas de los compuestos presentes en las librerías de referencia. Los datos corresponden a las cantidades relativas de cada sesquiterpeno identificado, representados en la forma de porcentaje (%) de área respecto al área total de los picos del cromatograma. Los resultados corresponden al valor de la media de tres réplicas biológicas y sus correspondientes desviaciones estándar.

Verde-inmaduro Verde-maduro Maduros

% %%

Sesquiterpenos cíclicos

-Copaeno

0.0213 ± 0,0013 0.0304 ± 0.0036 0.0261 ± 0.0010

-Cubebeno

0.0169 ± 0.0056 0.0226 ± 0.0001 0.0180 ± 0.0007

-Elemeno

0.0424 ± 0.0018 0.0422 ± 0.0022 0.0485 ± 0.0055

-Copaeno

0.0029 ± 0.0004 0.0245 ± 0.0001 0.0294 ± 0.0004

-Humuleno

0.0122 ± 0.0010 0.0111 ±0.0011 0.0054 ± 0.0005

Germacreno D

0.0135 ± 0.0022 0.0279 ± 0.0018 0.0153 ± 0.0003

-Muuroleno

n.d. 0.0093 ± 0.0024 0.0082 ± 0.0010

Valenceno

n.d. n.d. 0.0915 ± 0.0049

-Cadineno

0.0340 ± 0.0022 0.0542 ± 0.0001 0.0425 ± 0.0029

-Sesquifelandreno

0.0093 ± 0.0021 0.0115 ± 0.0004 0.0055 ± 0.0001

Elemol

0.0078 ± 0.0020 0.0161 ± 0.0004 0.0132 ± 0.0012

Total relativo

0.1603 0.2497 0.3035

Sesquiterpenos acíclicos

Z--Farneseno

0.0310 ± 0.0004 0.0170 ± 0.0003 0.0102 ± 0.0034

-Farneseno

0.0540 ± 0.0081 n.d. n.d

Nerolidol

0.0022 ± 0.0003 0.0065 ± 0.0007 0.0053 ± 0.0015

-Sinensal

0.0781 ± 0.0029 0.0463 ± 0.0020 0.0277 ± 0.0012

-Sinensal

0.1073 ± 0.0024 0.0468 ± 0.0004 0.0295 ± 0.0013

Total relativo

0.2726 0.1166 0.0727

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reveló que otros residuos de aminoácidos altamente conservados y que son esenciales para la actividad de la proteína modelo 5-epi-aristoloqueno sintasa de tabaco (TEAS) (Starks y col., [1997] Science 277, 1815-1820), están también conservados en polipéptido CsTPS3. Interesantemente, solo el primer residuo de treonina de la tétrada 401TTTY405 involucrada en la actividad catalítica de TEAS, está conservado en la secuencia homóloga 415TSGS418 del polipéptido CsTPS3 (Fig. 5). El residuo G417 está conservado en las GerD de populus y kiwi, así como en la GerB de C. creticus. Por otra parte, la última posición de la tétrada está ocupada por un residuo de serina (S418) en el polipéptido CsTPS3, mientras que en el resto de las proteínas presentes en el alineamiento tienen un residuo de tirosina (Y) conservado en dicha posición (Fig. 5). Estas observaciones sugieren que los aminoácidos que conforman la tétrada 415TSGS418 podrían estar involucrados en el especificidad de producto de la proteína CsTPS3 (SEQ ID NO:2) de naranjo objeto de la invención. El residuo de

(Y278

tirosina en la posición 278 ) de TEAS, el cual está conservado en todas las sesquiterpenos sintasas cíclicas, también lo está en el polipéptido CsTPS3. Este hecho apoya nuestra hipótesis de que la proteína CsTPS3 corresponde a una sesquiterpeno

Y278

sintasa cíclica. Se ha sugerido que el residuo estabiliza la carga positiva del intermediario carbocatiónico que precede a la etapa de ciclización del FPP (Maruyama y col., [2001] Biol Pharm Bull. 24, 1171-1175; Chang y col., [2005] Biotechnol. Lett. 27, 285288).

El análisis filogenético de la secuencia deducida de aminoácidos de la proteína CsTPS3 (SEQ ID NO:4) objeto de la invención, con el de otras sesquiterpeno sintasas con probada actividad germacreno D y cadineno (Cad) sintasa, agrupa a la CsTPS3 con GerD de otras especies de Rósidas (Vitis vinefera, Rosa hybrid, Populus trichorcapa,y Cistus creticus,) y con la asterácea Actinia deliciosa (Fig. 6). La GerD de la monocotiledónea Zingiber officinale y la cubebeno sintasa (Cub) de la gimnosperma Magnolia grandiflora agrupan separadamente de las sesquiterpeno ciclasas de dicotiledóneas.

EJEMPLO 4. Caracterización bioquímica de la actividad Sesquiterpeno Sintasa: Expresión heteróloga de la proteína CsTPS3 en células bacterianas, Preparación de extractos proteicos libres de células y ensayo in vitro de la actividad Sesquiterpeno Sintasa

La actividad catalítica de la proteína CsTPS3 (SEQ ID NO:2) se ensayó in vitro utilizando extractos proteicos preparados a partir de células de la cepa bacteriana Escherichia coli BL21(DE3) portadoras de la región codificante del gen Cstps3 (SEQ ID NO:1). que había sido previamente clonado en el vector de expresión pET45b(+). Extractos proteicos

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sesquiterpenos volátiles producidos por el polipéptido CsTPS3 (SEQ ID NO:2) se identificaron varios sesquiterpenos, de los cuales el -cadineno fue el producto mayoritario (27,36%) (Table 6 y Fig. 8A). La identificación de los picos minoritarios reveló que correspondían a los sesquiterpenos cíclicos α-copaeno (19,60%), β-cubebeno (14,30%), 5 germacreno D (9,36%), elemol (7,49%), cubeol (4,42%), biciclogermacreno (3,58%), αmuuroleno (1,92%), germacreno D-4-ol (1,90%), α-bulneseno (1,69%), E-cariofileno (1,48%), α-cubebeno (1,12%). Ya que el β-cadineno fue el producto mayoritario de la actividad enzimática de la proteína CsTPS3 (SEQ ID NO:2), esta se clasificò como una β-cadineno sintasa. La estructura molecular de los sesquiterpenos producidos por el polipéptido

10 CsTPS3 se muestra en la Fig. 2.

TABLA 5

Abundancia relativa de los sesquiterpenos producidos in vitro por el polipéptido natural CsTPS3 y sus respectivas versiones modificadas. La actividad catalítica de los enzimas se ensayó según el método descrito en el ensayo enzimático I. Los datos corresponden a porcentajes (%) de área de cada sesquiterpeno con respecto al total del área de los picos detectados en el perfil de volátiles.

Polipéptidos modificados

CsTPS3 VB2 VB5 VC1 VC2

Sesquiterpeno % % % % %

α-Copaeno

9,65 - - - -

-Gurjuneno

- - - 13,98 10,59

β-Cubebeno

14,55 - - - -

Germacreno D

11,8 - - 77,61 75,91

Biciclogermacreno

4,05 - - 8,4 13,5

β-Cadineno

46,91 - - - -

Cubebol

7,11 - - - -

Elemol

5,93 77,49 87,78 - -

Guaiol

- 22,51 12,22 - -

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cadenas laterales de ciertos aminoácidos claves, son suficientes para alterar la especificidad de sus mecanismos de reacción. Los residuos de aminoácidos localizados en las capas que rodean el sitio activo pueden también influenciar la conformación y la especificidad de producto de las sesquiterpenos sintasas. En este sentido, se ha demostrado que la biotecnología a través del uso de técnicas del DNA recombinante e ingeniería genética constituye una poderosa estrategia para manipular la actividad catalítica de las sesquiterpeno sintasas, permitiendo incrementar el rendimiento y/o especificidad de ciertos sesquiterpenos de interés.

Materiales y Métodos: Las versiones modificadas de la -cadineno sintasa (CsTPS3, SEQ ID NO:2) objeto de la invención, se generaron in vitro mediante mutagénesis dirigida. Para ello se introdujeron de forma específica mutaciones puntuales o combinación de múltiples mutaciones puntuales en la secuencia nucleotídica del cDNA del gen Cstps3 (SEQ ID NO:2). Los cDNAs modificados objetos de la invención codifican polipéptidos modificados que contienen substituciones específicas en su secuencia de aminoácidos, con respecto a la secuencia natural del enzima -cadineno sintasa de naranjo (CsTPS3, SEQ ID NO:4). Para generar sustituciones individuales o múltiples de pares de bases, se utilizaron los sistemas comerciales QuickChange® II Site-direct y QuickChange® Multi Site-Direct Mutagenesis kits (Stratagene), respectivamente. Ambos tipos de sistemas permitieron la introducción de mutaciones específicas (puntuales o múltiples) en un único ensayo, en la secuencia nucleotídica del cDNA que codifica el polipéptido natural CsTPS3 (SEQ ID NO:2), el cual había sido previamente clonado en el vector de expresión pET45b(+). Ambos métodos requieren la síntesis de oligonucleotidos modificados de 25 ‒45 bases de longitud, que llevan la mutación o mutaciones de interés y que se utilizaran como cebadores en una única reacción de PCR. La substitución de las bases deseadas debe localizarse en el centro del oligonucleotido y con una secuencia correcta a ambos lados de 10-15 nucleótidos. Para el diseño de los cebadores se utilizó el programa informático QuickChange (http:://www.stratagene.com/qcprimerdesign), según las instrucciones del fabricante. Los cebadores utilizados para la mutagénesis del cDNA del gen Cstps3 se muestran en la Tabla

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Claims (1)

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