具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
本发明所述β榄香烯制备方法可用于分离生物发酵液中的吉玛烯A,并进一步热转化得到β榄香烯;本发明人尝试过不同菌种和/或不同发酵工艺得到的生物发酵液,均适用本发明的制备方法。具体的,本申请采用CN108060092A中公开的生物发酵工艺制备的吉玛烯A发酵液作为举例说明。
一、产物中β榄香烯含量检测方法
供试品溶液制备:将本发明制备的β榄香烯产物用正己烷稀释100倍过有机尼龙膜(0.45μm)作为供试品溶液。
对照品溶液制备:精密称取50mgβ-榄香烯标准品(购于中国食品药品检定研究院,货号100268-201402)至50ml容量瓶中,无水乙醇稀释定容作为对照品溶液。
检测条件:安捷伦气相色谱Agilent 7890B,测定条件:进样口温度250℃,进样体积 1μL,不分流;色谱柱:安捷伦HP-5ms(30m*0.25mm);色谱条件:45℃,1min,10℃ /min到300℃,300℃保温5min,FID检测器。
二、吉玛稀A含量检测方法
供试品溶液制备:
(1)发酵液:取发酵液20ml置于50ml离心管中,加入5ml正十二烷,放置摇床中震荡萃取8小时以上,然后静置5min,取上层(含乳化层)2ml置于离心管中,12000rpm离心1min使有机相和水相分层,取上清液用正己烷稀释100倍过有机尼龙膜(0.45μm)作为供试品溶液。
(2)提取或萃取的上清液:取样品用正己烷稀释10-50倍,过有机尼龙膜(0.45μm)作为供试品溶液。
对照品溶液制备:气相色谱的进样口温度在250℃,在此温度下供试品溶液里的吉玛烯A 会发生重排反应,转化成β-榄香烯,因此本实验中采用β-榄香烯作为对照品,精密称取50mg β-榄香烯标准品(购买于中国食品药品检定研究院,货号100268-201402)至50ml容量瓶中,无水乙醇稀释定容作为对照品溶液。
检测条件:安捷伦气相色谱Agilent 7890B,测定条件:进样口温度250℃,进样体积 1μL,不分流;色谱柱:安捷伦HP-5ms(30m*0.25mm);色谱条件:45℃,1min,10℃ /min到300℃,300℃保温5min,FID检测器。
三、产物中β榄香烯结构验证
化合物结构如下:
结构确证方法及结果:
取精馏纯化后的β-榄香烯产物送检NMR、MS。该化合物1HNMR谱(附图1)显示存在24个氢原子,13C NMR谱(附图2)显示存在15个碳原子包括6个双键C原子(δC 150.4, 150.3,147.7,112.1,109.9,108.3),与MS数据分子离子峰204([M]+)吻合,提示该化合物为倍半萜类化合物,且分子式为C15H24。根据不饱和度计算,该化合物还存在一个环。1H NMR(CDC l3,600MH z):1.00(3H,s,H-15)、1.45(3H,m,H-2,3a)、1.64(1H,m,H-5a)、1.56 (2H,m,H-3b,5b)、1.71(3H,s,H-11)、1.76(3H,s,H-14)、1.91(1H,m,H-6)、2.01(1H,m,H-4)、 4.59(1H,s,H-10a)、4.82(1H,s,H-10b)、4.70(1H,s,H-13a)、4.72(1H,s,H-13b)、4.89(1H,d,J =12.6Hz,H-8a)、4.90(1H,d,J=20.4Hz,H-8b)、5.82(1H,dd,J=20.4、12.6Hz,H-7)。13C NMR(CDC l3,125MHz):16.6(C-15)、21.1(C-14)、24.8(C-11)、26.8(C-5)、32.9(C-3)、39.8(C-1)、 39.9(C-2)、45.7(C-6)、52.8(C-4)、108.3(C-13)、109.9(C-8)、112.1(C-10)、147.7(C-9)、150.3 (C-12)、150.4(C-7)。以上数据与文献[榄香烯原料药的化学成分,沈阳药科大学学报,2009, 26(8)]中化合物1(-)β-榄香烯的NMR和MS数据一致,故确证该化合物为(-)β-榄香烯。
试验例1
取生物合成制备的吉玛烯A发酵液(吉马烯A含量8.50g/L)三份,分别采用实验室玻璃精馏装置、工业160L提取罐、工业100L单效浓缩器进行蒸馏提取,间歇补水,提取总时长约15小时。将蒸馏出的液体经分液漏斗或油水分离器分出油相,对于严重乳化的部分,采用高速(12000r/min)离心机离心10min,记录挥发油的总体积,取样分析吉马烯A含量,计算提取率。
往挥发油中加入无水硫酸钠干燥,滤除干燥剂,挥发油置于120℃油浴中,减压脱除残余溶剂,再升温至150℃保温反应1小时,精馏收集β-榄香烯,称重取样分析含量,计算回收率。实验结果表1所示。
表1水蒸气蒸馏提取发酵液效果
注:GM---吉马烯A(gemeneA),EM---β-榄香烯(elemene),下同
GM提取率=(挥发油中GM含量/发酵液中GM含量)*100%
EM回收率=(EM重量*EM纯度/发酵液中GM含量)*100%
实验表明,采用蒸馏法提取发酵液,会出现不同程度的乳化现象,提取过程中容易产生大量泡沫,严重影响了提取进程,同时也造成蒸馏液里面含有较多杂质,且在长时间蒸馏过程中易产生副反应生成新杂质,导致GM提取率及β榄香烯回收率均较低。
试验例2
取生物合成制备的吉马烯A发酵液400mL(吉马烯A含量10.25g/L)六份,分别加入400ml 的无水乙醇、甲醇、正丁醇、石油醚、正十二烷和95%乙醇+正己烷(1:1,v/v),振摇搅拌提取30min。对于未乳化的样品,静置沉降10小时,记录上清液体积,取上清液过滤后用气相色谱方法分析含量,并以实验室通常的过滤方法考察过滤操作的难易度。对于严重乳化的样品,采用高速离心机离心10min,记录上层上清液体积,取上清液用气相色谱方法分析含量并计算本步骤提取率。实验结果表2所示。
表2有机溶剂直接提取发酵液效果
注:提取率a=(上清液中GM含量a/发酵液中GM含量)*100%
实验表明,采用正丁醇、石油醚、正十二烷、95%与正己烷的混合溶剂(1:1,v/v)等有机溶剂提取发酵液,出现不同程度的乳化现象,常规过滤方式难以分离乳化层和有机溶剂层,虽然在实验室可采用高速(12000r/min)离心设备将乳化层分离,但是工业上发酵液的体量一般在吨位级别,目前暂时没有能够满足如此大批量分离要求的高速离心设备。
采用无水乙醇和甲醇提取时,虽未出现乳化,但提取液过滤困难,可操作性差。
试验例3
取生物合成制备的吉马烯A发酵液400mL(吉马烯A含量10.25g/L)6份,以高速离心机于3000转离心20min,弃去上层液体,底部固体沉降物(即菌丝)分别加入300ml的95%乙醇、无水乙醇、甲醇、异丙醇、石油醚、正十二烷,振摇搅拌30min,对可沉降样品过滤,对乳化样品离心,取上清液分析吉玛烯A含量,计算本步骤提取率。实验结果如表3所示。
表3不同溶剂提取菌丝效果对比
注:提取率a=(上清液中GM含量a/发酵液中GM含量)*100%
试验例4
取生物合成制备的吉马烯A发酵液40mL(吉马烯A含量10.25g/L)6份,以高速离心机于3000转离心20min,弃去上层溶液,底部固体沉降物分别加入5、10、20、30、40、50ml 的95%乙醇、振摇搅拌30min,离心沉降,取上清液分析吉玛烯A含量,计算本步骤提取率 a。实验结果如表4所示。
表4不同溶剂用量萃取菌丝效果对比
注:提取率a=(上清液中GM含量a/发酵液中GM含量)*100%;
试验例5
将生物合成制备的吉马烯A发酵液2400mL(吉马烯A含量10.25g/L)以高速离心机离心,弃去上层溶液得到底部固体沉降物;将底部固体沉降物加入无水乙醇2400mL搅拌提取1小时,过滤,得到乙醇提取液和固体菌丝渣。
将菌丝渣平均分成六份,分别加入200ml95%乙醇、无水乙醇、甲醇、异丙醇、石油醚、环己烷振摇搅拌30min,离心,取上清液用气相色谱法检测分析含量并计算本步骤提取率b。实验结果见表5.
表5二次提取实验效果
注:提取率b=(上清液中GM含量b/发酵液中GM含量)*100%
试验例6
将生物合成制备的吉马烯A发酵液2400mL(吉马烯A含量10.25g/L)以高速离心机离心,弃去上层溶液得到底部固体沉降物;将底部固体沉降物加入无水乙醇2400mL搅拌提取1 小时,过滤,得到乙醇提取液和固体菌丝渣。
将前述菌丝渣平均分成六份,分别加入50、100、150、200、250、300ml石油醚振摇搅拌30min,离心,取样上清液检测分析含量并计算本步骤提取率b。实验结果见表6。
表6二次提取过程中不同溶剂用量效果对比
注:提取率b=(上清液中GM含量b/发酵液中GM含量)*100%
试验例7
将实验例6的乙醇提取液平均分成3份,编号为1、2、3,分别减压蒸出乙醇至蒸馏瓶内出现油水分离界面,冷却至室温。将1号分去水层,加入无水硫酸钠干燥,滤除干燥剂得到吉马烯A粗品1号。2号3号分别加入80ml的石油醚和环己烷,震摇萃取,分去水相,有机相加入无水硫酸钠干燥,滤除干燥剂,减压蒸出溶剂得到吉马烯A粗品2、3号。
将吉马烯A粗品1、2、3号取样称重,分别置于120℃油浴中,减压脱除残余溶剂,再升温至150℃保温反应1小时,称重取样分析转化前的吉马烯A和转化后β-榄香烯含量,计算转化率和回收率。结果见表7。
表7不同提取工艺热转化实验
注:GM转化率=(EM粗品中EM含量/GM粗品中GM含量)*100%;
EM回收率=(EM粗品中EM含量/提取液中GM含量)*100%
实施例1
(1)、将生物合成制备的吉马烯A发酵液40L(吉马烯A含量10.25g/L)以管式离心机离心,弃去上清液得到菌丝沉淀物11.7Kg;
(2)、将菌丝沉淀物加入提取罐,以95%乙醇30L搅拌提取1小时,过滤,得到乙醇提取液和菌丝渣。
(3)、将步骤(2)中获得的菌丝渣以20L石油醚搅拌提取0.5小时,过滤分离收集石油醚提取液。
(4)、将步骤(2)中得到的乙醇提取液进行减压浓缩回收乙醇,真空度-0.06Mpa~-0.08Mpa,收集水油混合物。
(5)、步骤(4)中得到的水油混合物以石油醚4L萃取,得到石油醚萃取液,下层水相排出。
(6)、将步骤(3)中的石油醚提取液和步骤(5)中石油醚萃取液合并,依次以水、盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,滤除干燥剂。
(7)、将步骤(6)中干燥后的产物进行减压浓缩回收石油醚,真空度-0.04Mpa~-0.08Mpa,得到吉马烯A粗品。
(8)、步骤(7)中得到吉马烯A粗品在反应釜中加热转化,维持釜内温度120~150℃,保温1小时,釜内吉马烯A转化为β-榄香烯,得到β-榄香烯粗品。
(9)、将步骤(8)中得到的β-榄香烯粗品在精馏塔中进行减压精馏,塔柱填料为不锈钢网θ环,塔釜温度100~140℃,回流比为0.5~3.0,截取沸点为75-76℃/85pa的馏分,沸程不超过1℃,得到β-榄香烯258.71g。
色谱分析所得β-榄香烯纯度为97.01%,相对于发酵液吉马烯A的产率(成品中β-榄香烯含量/发酵液中吉玛烯A含量,下同)为61.21%。
实施例2
(1)、将生物合成制备的吉马烯A发酵液40L(吉马烯A含量10.25g/L)以管式离心机离心,弃去上清液得到菌丝沉淀物11.7Kg;
(2)、将菌丝沉淀物加入提取罐,以无水乙醇30L搅拌提取1小时,过滤,得到乙醇提取液和菌丝渣。
(3)、将步骤(2)中获得的菌丝渣以20L石油醚搅拌提取0.5小时,过滤分离收集石油醚提取液。
(4)、将步骤(2)中得到的乙醇提取液进行减压浓缩回收乙醇,真空度-0.06Mpa~-0.08Mpa,得到水油混合物。
(5)、步骤(4)中得到的水油混合物以石油醚4L萃取,得到石油醚萃取液,下层水相排出。
(6)、将步骤(3)中的石油醚提取液和步骤(5)中石油醚萃取液合并,依次以水、盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,滤除干燥剂。
(7)、将步骤(6)中干燥后的产物进行减压浓缩回收石油醚,真空度-0.04Mpa~-0.08Mpa,得到吉马烯A粗品。
(8)、步骤(7)中得到吉马烯A粗品在反应釜中加热转化,维持釜内温度120~150℃,保温1小时,釜内吉马烯A转化为β-榄香烯,得到β-榄香烯粗品。
(9)、将步骤(8)中得到的β-榄香烯粗品在精馏塔中进行减压精馏,塔柱填料为不锈钢网θ环,塔釜温度100~140℃,回流比为0.5~2.0,截取沸点为75-76℃/85pa的馏分,沸程不超过1℃,得到β-榄香烯263.22g。色谱检测β-榄香烯含量为97.05%,相对于发酵液中吉马烯A的产率为62.3%。
实施例3
(1)、将生物合成制备的吉马烯A发酵液40L(吉马烯A含量10.25g/L)以管式离心机离心,弃去上清液得到菌丝沉淀物11.7Kg;
(2)、将菌丝沉淀物加入提取罐,以甲醇30L搅拌提取1小时,过滤,得到甲醇提取液和菌丝渣。
(3)、将步骤(2)中获得的菌丝渣以20L石油醚搅拌提取0.5小时,过滤分离收集石油醚提取液。
(4)、将步骤(2)中得到的甲醇提取液进行减压浓缩回收甲醇,真空度-0.06Mpa~-0.08Mpa,得到水油混合物。
(5)、步骤(4)中得到的水油混合物以石油醚4L萃取,得到石油醚萃取液,下层水相排出。
(6)、将步骤(3)中的石油醚提取液和步骤(5)中石油醚萃取液合并,依次以水、盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,滤除干燥剂。
(7)、将步骤(6)中干燥后的产物进行减压浓缩回收石油醚,真空度-0.04Mpa~-0.08Mpa,得到吉马烯A粗品。
(8)、步骤(7)中得到吉马烯A粗品在反应釜中加热转化,维持釜内温度120~150℃,保温1小时,釜内吉马烯A转化为β-榄香烯,得到β-榄香烯粗品。
(9)、将步骤(8)中得到的β-榄香烯粗品在精馏塔中进行减压精馏,塔柱填料为不锈钢网θ环,塔釜温度100~140℃,回流比为0.5~2.0,截取沸点为75-76℃/85pa的馏分,沸程不超过1℃,得到β-榄香烯261.58g。色谱检测β-榄香烯含量为96.55%,相对于发酵液中吉马烯A的产率为61.60%。
实施例4
(1)、将生物合成制备的吉马烯A发酵液40L(吉马烯A含量10.25g/L)以管式离心机离心,弃去上清液得到菌丝沉淀物11.7Kg;
(2)、将菌丝沉淀物加入提取罐,以异丙醇30L搅拌提取1小时,过滤,得到异丙醇提取液和菌丝渣。
(3)、将步骤(2)中获得的菌丝渣以20L石油醚搅拌提取0.5小时,过滤分离收集石油醚提取液。
(4)、将步骤(2)中得到的异丙醇提取液进行减压浓缩回收异丙醇,真空度 -0.06Mpa~-0.08Mpa,得到水油混合物。
(5)、步骤(4)中得到的水油混合物以石油醚4L萃取,得到石油醚萃取液,下层水相排出。
(6)、将步骤(3)中的石油醚提取液和步骤(5)中石油醚萃取液合并,依次以水、盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,滤除干燥剂。
(7)、将步骤(6)中干燥后的产物进行减压浓缩回收石油醚,真空度-0.04Mpa~-0.08Mpa,得到吉马烯A粗品。
(8)、步骤(7)中得到吉马烯A粗品在反应釜中加热转化,维持釜内温度120~150℃,保温1小时,釜内吉马烯A转化为β-榄香烯,得到β-榄香烯粗品。
(9)、将步骤(8)中得到的β-榄香烯粗品在精馏塔中进行减压精馏,塔柱填料为不锈钢网θ环,塔釜温度100~140℃,回流比为0.5~3.0,截取沸点为75-76℃/85pa的馏分,沸程不超过1℃,得到β-榄香烯243.37g。色谱分析所得β-榄香烯纯度为96.87%,相对于发酵液吉马烯A的产率为57.50%。
实施例5
(1)、将生物合成制备的吉马烯A发酵液40L(吉马烯A含量10.25g/L)以管式离心机离心,弃去上清液得到菌丝沉淀物11.7Kg;
(2)、将菌丝沉淀物加入提取罐,以95%乙醇30L搅拌提取1小时,过滤,得到乙醇提取液和菌丝渣。
(3)、将步骤(2)中获得的菌丝渣以20L正己烷搅拌提取0.5小时,过滤分离收集正己烷提取液。
(4)、将步骤(2)中得到的乙醇提取液进行减压浓缩回收乙醇,真空度-0.06Mpa~-0.08Mpa,得到水油混合物。
(5)、步骤(4)中得到的水油混合物以正己烷4L萃取,得到正己烷萃取液,下层水相排出。
(6)、将步骤(3)中的正己烷提取液和步骤(5)中正己烷萃取液合并,依次以水、盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,滤除干燥剂。
(7)、将步骤(6)中干燥后的产物进行减压浓缩回收正己烷,真空度-0.04Mpa~-0.08Mpa,得到吉马烯A粗品。
(8)、步骤(7)中得到吉马烯A粗品在反应釜中加热转化,维持釜内温度120~150℃,保温1小时,釜内吉马烯A转化为β-榄香烯,得到β-榄香烯粗品。
(9)、将步骤(8)中得到的β-榄香烯粗品在精馏塔中进行减压精馏,塔柱填料为不锈钢网θ环,塔釜温度100~140℃,回流比为0.5~3.0,截取沸点为75-76℃/85pa的馏分,沸程不超过1℃,得到β-榄香烯236.00g。色谱分析所得β-榄香烯纯度为96.94%,相对于发酵液吉马烯A的产率为55.8%。
实施例6
(1)、将生物合成制备的吉马烯A发酵液40L(吉马烯A含量10.25g/L)以管式离心机离心,弃去上清液得到菌丝沉淀物11.7Kg;
(2)、将菌丝沉淀物加入提取罐,以95%乙醇30L搅拌提取1小时,过滤,得到乙醇提取液和菌丝渣。
(3)、将步骤(2)中获得的菌丝渣以20L环己烷搅拌提取0.5小时,过滤分离收集环己烷提取液。
(4)、将步骤(2)中得到的乙醇提取液进行减压浓缩回收乙醇,真空度-0.06Mpa~-0.08Mpa,得到水油混合物。
(5)、步骤(4)中得到的水油混合物以环己烷4L萃取,得到环己烷萃取液,下层水相排出。
(6)、将步骤(3)中的环己烷提取液和步骤(5)中环己烷萃取液合并,依次以水、盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,滤除干燥剂。
(7)、将步骤(6)中干燥后的产物进行减压浓缩回收环己烷,真空度-0.04Mpa~-0.08Mpa,得到吉马烯A粗品。
(8)、步骤(7)中得到吉马烯A粗品在反应釜中加热转化,维持釜内温度120~150℃,保温1小时,釜内吉马烯A转化为β-榄香烯,得到β-榄香烯粗品。
(9)、将步骤(8)中得到的β-榄香烯粗品在精馏塔中进行减压精馏,塔柱填料为不锈钢网θ环,塔釜温度100~140℃,回流比为0.5~3.0,截取沸点为75-76℃/85pa的馏分,沸程不超过1℃,得到β-榄香烯273.47g。色谱分析所得β-榄香烯纯度为96.85%,相对于发酵液吉马烯A的产率为64.6%。
实施例7
(1)、将生物合成制备的吉马烯A发酵液180L(吉马烯A含量9.78g/L)以管式离心机离心,弃去上清液得到菌丝沉淀物44.3Kg;
(2)、将菌丝沉淀物加入提取罐,以95%乙醇135L搅拌提取1小时,三足离心机过滤,得到乙醇提取液和菌丝渣。
(3)、将步骤(2)中获得的菌丝渣加入提取罐,以90L石油醚搅拌提取0.5小时,以板框过滤机过滤,得到石油醚提取液。
(4)、将步骤(2)中得到的乙醇提取液进行减压浓缩回收乙醇,真空度-0.06Mpa,浓缩至残液中乙醇浓度小于5%,残液为吉马烯A的水油混合物。
(5)、步骤(4)中得到的水油混合物转入萃取罐,以石油醚18L萃取,得到石油醚萃取液,下层水相排出。
(6)、将步骤(3)中的石油醚提取液和步骤(5)中石油醚萃取液合并于洗涤罐,以水、盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,滤除干燥剂。
(7)、将步骤(6)中干燥后的产物进行减压浓缩回收石油醚,真空度-0.04Mpa~-0.08Mpa,得到吉马烯A粗品。
(8)、步骤(7)中得到吉马烯A粗品在反应釜中加热转化,维持釜内温度120~150℃,保温1小时,釜内吉马烯A转化为β-榄香烯,得到β-榄香烯粗品。
(9)、将步骤(8)中得到的β-榄香烯粗品在精馏塔中进行减压精馏,塔柱填料为不锈钢网θ环,塔釜温度100~140℃,回流比为0.5~3.0,截取沸点为75-76℃/85pa的馏分,沸程不超过1℃,得到β-榄香烯1.137Kg。色谱分析所得β-榄香烯纯度为97.49%,相对于发酵液吉马烯A的产率为62.97%。