CN113717021A - 基于配位效应制备高纯度倍半萜类成分的方法及其应用 - Google Patents

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CN113717021A CN202111178054.3A CN202111178054A CN113717021A CN 113717021 A CN113717021 A CN 113717021A CN 202111178054 A CN202111178054 A CN 202111178054A CN 113717021 A CN113717021 A CN 113717021A
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Abstract

本发明提供基于配位效应制备高纯度倍半萜类成分的方法及其应用，属于天然产物提取分离技术领域。所述方法包括：对吉马烯A发酵液经处理后获得的粗提物采用银离子络合逆流色谱法进行HSCCC分离获得高纯度β‑榄香烯，所述HSCCC溶剂系统为正己烷/乙酸乙酯/甲醇/硝酸银溶液。本发明通过开发了银离子逆流色谱([Ag+]‑HSCCC)。通过[Ag+]与成分间的配位力，实现结构接近化合物的分离，提高样品的分辨率，从而成功从吉马烯A发酵液中分离获得β‑榄香烯。上述方法具有简单、分离度好、纯度高等优点，为结构接近化合物的分离提供了解决思路，具有良好的实际应用之价值。

Description

基于配位效应制备高纯度倍半萜类成分的方法及其应用
技术领域
本发明属于天然产物提取分离技术领域，具体涉及基于配位效应制备高纯度倍半萜类成分的方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
β-榄香烯(β-1-甲基-1-乙烯基-2,4-二异丙烯基-环己烷)来自中草药郁金，是一种高活性且低细胞毒性的II类抗肿瘤药物，据报道具有广谱抗肿瘤作用，如肺癌、乳腺癌、胶质瘤、胃癌等。药理研究结果还表明，β-榄香烯可通过多种药理途径发挥作用，包括阻滞细胞周期、抑制细胞增殖、抗转移和抗血管生成作用，并逆转诱导细胞凋亡的多重耐药性。
由于β-榄香烯脂溶性好、分子量小的优点，可突破血脑屏障用于治疗胶质瘤。值得注意的是，β-榄香烯已被我国FDA批准用于治疗肿瘤的二类创新药，已申请美国FDA临床研究。除了上述抗癌作用外，β-榄香烯还具有抗氧化、杀幼虫等特性，并用于治疗包括气道狭窄、神经保护和类风湿性关节炎等各种疾病。由于该化合物在抗肿瘤活性方面具有广谱、安全、高效、经济等突出优势，因此较好临床应用前景。
目前β-榄香烯主要从植物来源中提取获得。然而，郁金资源有限且获得的产量极低。因此，生物合成法是获得β-榄香烯的重要途径。同时，生物合成法生产周期短、不受原料时间和供应限制、产物组成较简单，可用于大规模工业化生产。目前主要方法为生物合成吉马烯A，进一步加热转化形成β-榄香烯。
但是，加热转化过程中通常存在如蛇床烯类非定量的伴随杂质，通过传统的柱色谱通常难以进行有效的分离。因此，有必要开发一种高效的分离β-榄香烯方法，为进一步的药物开发和质量控制提供了更有效的样品。
发明人发现，已有文献报道采用传统的硅胶柱层析、大孔树脂色谱、制备型HPLC和超临界流体色谱等方法进行分离，但这些方法存在分离流程复杂、死吸附严重、溶剂消耗量大等缺点。高速逆流色谱(HSCCC)是一种独特的液-液分配色谱，具有样品回收率高、溶剂消耗少、样品变性风险低等优点，广泛的应用于天然产物分离。然而，考虑到挥发油具有化学结构相似的特点，传统HSCCC法较难进行分离。
发明内容
基于上述现有技术的不足，本发明提供基于配位效应制备高纯度倍半萜类成分的方法及其应用。本发明采用银离子逆流色谱([Ag+]-HSCCC)，通过[Ag+]与成分间的配位力，实现结构接近化合物的分离，提高样品的分辨率，从而成功分离出高纯度β-榄香烯，因此具有良好的实际应用之价值。
本发明的第一个方面，提供基于配位效应制备高纯度倍半萜类成分的方法，所述方法至少包括：
对吉马烯A发酵液经处理后获得的粗提物采用银离子络合逆流色谱法进行HSCCC分离获得高纯度β-榄香烯，所述HSCCC溶剂系统为正己烷/乙酸乙酯/甲醇/硝酸银溶液。
本发明的第二个方面，提供上述方法得到的β-榄香烯，还包括β-蛇床烯和/或吉马烯A。
本发明的第三个方面，提供上述方法和/或β-榄香烯在如下任一种或多种中的应用：
a)倍半萜类成分的药理药性研究；
b)筛选和/或研发倍半萜类成分相关药物。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案通过开发了银离子逆流色谱([Ag+]-HSCCC)。通过[Ag+]与成分间的配位力，实现结构接近化合物的分离，提高样品的分辨率，从而成功从吉马烯A发酵液中分离获得β-榄香烯。上述方法具有简单、分离度高、制备产物纯度高等优点，为结构接近化合物的分离提供了解决思路，具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1为本发明化合物1-3的化学结构式(1：β-榄香烯；2：吉马烯A；3：β-蛇床烯)；
图2为本发明实施例中发酵液提取物的银离子络合逆流色谱图；
图3为本发明实施例中发酵液粗提物和分离各部分的液相色谱图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一个典型实施方式中，提供基于配位效应制备高纯度倍半萜类成分的方法，所述方法至少包括：
对吉马烯A发酵液经处理后获得的粗提物采用银离子络合逆流色谱法进行HSCCC分离获得高纯度β-榄香烯，所述HSCCC溶剂系统为正己烷/乙酸乙酯/甲醇/硝酸银溶液。
其中，吉马烯A发酵液可以为现有任意发酵可产生吉马烯A的菌株(包括重组菌株)经发酵后获得。在此不做具体限定，在本发明的一个具体实施方式中，所述吉马烯A发酵液制备可以采用如下方法：将吉马烯合成酶与法呢基焦磷酸合成酶融合蛋白的编码核酸导入宿主酵母，通过合成得到富含吉马烯A的发酵液样品，从而提高吉马烯A的产量。
本发明的又一具体实施方式中，所述对吉马烯A发酵液进行处理的方法包括：
将吉马烯A发酵液进行蒸提处理，收集冷凝液；将冷凝液上层油相转移，下层水相用有机溶剂萃取，提取残余的油；合并萃取液，干燥，减压蒸发后即可获得以β-榄香烯和吉马烯A为主要成分得到精油；将精油在惰性氛围下加热，即获得粗提物，所述粗提物为β-榄香烯和蛇床烯的混合物。
其中，所述有机溶剂为石油醚，从而能够更大程度萃取获得所期望得到的物质；
减压蒸发温度控制为25-40℃，优选为30℃。
所述惰性氛围可以为氮气氛围；
加热反应控制反应条件为：加热温度为130-180℃(优选为150℃)，加热反应时间控制为0.5-2h(优选为1h)。
本发明的又一具体实施方式中，所述采用银离子络合逆流色谱法进行HSCCC分离具体方法包括：
选择正己烷/乙酸乙酯/甲醇/硝酸银溶液的上相作为流动相，下相作为固定相，正己烷/乙酸乙酯/甲醇/硝酸银溶液体积比为9:1:9:1，其中硝酸银溶液中Ag+浓度控制为1-5mol/L，例如1、2、3、4和5mol/L。经实验证明，当水中银离子浓度为3mol/L时，β-榄香烯、吉马烯A和β-蛇床烯的KD值合适。因此，选择正己烷/乙酸乙酯/甲醇/硝酸银溶液(3mol/L)(9:1:9:1，v/v)溶剂系统用于HSCCC分离。
本发明的又一具体实施方式中，固定相以10～30mL/min(优选为20mL/min)的流速泵入HSCCC分离柱；HSCCC在25～35℃(如30℃)下以600～800rpm(优选为800rpm)转速下顺时针旋转，流动相以2.0～10.0mL/min(优选为5.0mL/min)流速，以尾端到首端的模式泵入HSCCC分离柱；平衡后，样品溶液通过进样阀进样。
上述样品溶液可以为上述粗提物溶解于正己烷/乙酸乙酯/甲醇/硝酸银溶液的上相和下相中所得。
本发明的又一具体实施方式中，所述HSCCC分离过程还包括：用紫外-可见检测器在200-220nm(优选为210nm)处连续监测柱的流出物；
使用自动进样器每1-10min(如2min)对馏分进行收集；
分离后，用氮气吹出HSCCC分离柱中溶剂；吹出的溶剂进行真空浓缩，残渣用正己烷萃取；弃去上层，下层水相真空浓缩至干，回收硝酸银。
试验证明，在优化条件下，粗样品完全溶解在选定的两相溶剂体系中，用于HSCCC分离，参数如下：转速为800rpm，两相溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-硝酸银溶液(3mol/L)(9:1:9:1，v/v)，流动相流速2.0mL/min，分离温度为25℃。在最佳条件下，从粗提物中得到化合物1(β-榄香烯)、化合物2(吉马烯A)、化合物3(β-蛇床烯)，逆流色谱的固定相保留率为73.3％，化合物1-3的纯度分别为97.1％、95.2％和96.3％。
本发明的又一具体实施方式中，采用HPLC色谱法对粗提物和CCC馏分进行分析，所述液相色谱法检测条件包括：色谱柱为C18柱(5μm，4.6mm×250mm，i.d.)，流动相：甲醇-水(95:5，v/v)；流速：0.5-5mL/min(优选为1.0mL/min)；检测波长：200-220nm(优选为210nm)；进样体积1-10μL(优选为5μL)。
本发明的又一具体实施方式中，分离的化合物可通过ESI-MS、1H-和13C-NMR光谱进行鉴定。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述方法得到的β-榄香烯，还包括β-蛇床烯和/或吉马烯A。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述方法和/或β-榄香烯在如下任一种或多种中的应用：
a)倍半萜类成分的药理药性研究；
b)筛选和/或研发倍半萜类成分相关药物。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
1.材料与方法
1.1实验材料
本研究中使用的吉马烯A发酵液制备采用如下方法：将吉马烯合成酶与法呢基焦磷酸合成酶融合蛋白的编码核酸导入宿主酵母，通过合成得到富含吉马烯A的样品，提高吉马烯A的产量。
1.2 HSCCC分离粗提物的制备
将吉马烯A发酵液(3.4L)加入5L水蒸气蒸馏瓶中，蒸提15h，收集冷凝液。将冷凝液上层油相转移，下层水相用石油醚萃取两次，提取残余的油。合并萃取液，用无水硫酸钠干燥，30℃减压蒸发。以β-榄香烯和吉马烯A为主要成分得到精油(33.37克)。将精油置于圆底烧瓶中，用氮气保护，加热至150℃，并保持反应时间1.0h。最后，获得β-榄香烯和蛇床烯的混合物(32.30g)用于进一步的HSCCC分离。
1.3 HSCCC两相溶剂体系的选择
选择合适的目标化合物分配系数(KD值)是HSCCC成功分离的最重要因素之一。在本研究中，采用HPLC法检测了目标化合物在不同比例正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(HEMWat)溶剂系统的KD值，为获得更好的分离效果，添加了AgNO3进行配位效应分离。
化合物的KD值采用HPLC法测定。首先，在5mL试管中制备不同比例的溶剂体系并剧烈摇晃，待充分分层平衡后，两相溶剂系统各取2mL加入3mg粗提物，剧烈振摇1min并充分分层后，将上、下相各取0.5mL分别放入4mL离心管中，分别用2mL甲醇稀释。上相直接用HPLC分析，下相加入氯化钠除去银离子后用HPLC分析。KD值定义为固定相中化合物的峰面积除以流动相中相应化合物的峰面积，公式如下：
KD＝AU/AL
AU和AL为目标化合物在固定相和流动相中的峰面积。
1.4溶剂体系和样品溶液的制备
在HSCCC分离中，由正己烷/乙酸乙酯/甲醇/硝酸银溶液(3mol/L)(9:1:9:1，v/v)组成的两相溶剂体系置于分液漏斗中。剧烈摇晃后，将溶液静置5min，待充分分层后，将上、下相分开。上相(流动相)和下相(固定相)在使用前通过超声脱气。样品溶液的制备通过将500mg精油溶解在10mL等比例的上相和下相中。
1.5 HSCCC分离过程
首先将固定相以20.0mL/min的流速注入HSCCC分离柱。HSCCC设备在30℃下以800rpm转速顺时针旋转，流动相以5.0mL/min的流速，以首端到尾端的模式泵入HSCCC分离柱。当达到流体力学平衡后，500mg粗提物样品溶液通过进样阀进样。用紫外-可见检测器在210nm处连续监测柱的流出物。使用自动进样器每2min将馏分收集到12mL试管中。分离后，用氮气吹出HSCCC分离柱中的溶剂。吹出的溶剂在40℃条件下真空浓缩，残渣用等体积正己烷进行萃取3次。弃去上层，下层水相40℃真空浓缩至干，用于回收硝酸银。
1.6 HPLC分析和结构鉴定
采用HPLC色谱法对粗提物和CCC馏分进行分析。色谱柱为C18柱(5μm，4.6mm×250mm，i.d.)，流动相为甲醇和水(95:5，v/v)，流速1.0mL/min，波长210nm，进样体积5μL。分离的化合物通过ESI-MS、1H-和13C-NMR光谱进行鉴定，NMR光谱以CDCl3作为溶剂，化学位移(δ)以百万分之一(ppm)表示，耦合常数常数(J)以Hz表示。
2.结果与讨论
2.1两相溶剂系统的筛选
采用高速逆流色谱分离的最重要步骤之一是选择恰当的溶剂系统。根据Ito提出的黄金法则，目标化合物在两相之间的分配系数应该在0.2-2.0的范围内，同时两个化合物之间的分离因子α值应该高于1.5。由于目标化合物的极性较小，发现正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水是较为理想的溶剂体系，通过改变四种溶剂的体积比可以覆盖广泛的极性范围。通过测试该系统不同体积比，并通过HPLC法测定目标化合物的KD值。但检测结果表明，化合物的KD值均都太小，即采用传统的HSCCC法无法将这些化合物有效分开。
目标化合物1-3在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(9:1:9:1，v/v)溶剂系统，不同浓度硝酸银(0～3mol/L)的KD值结果列于表1中。结果表明，如果溶剂系统中没有[Ag+]，化合物1-3都将会很快被洗脱，无法分离。而随着[Ag+]浓度的增加，分配系数增加，所有峰的洗脱时间延长，分离系数也有所提高。如表1所示，对于正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(9:1:9:1，v/v)溶剂系统，当水中银离子浓度增加到3mol/L时，3种化合物的KD值合适。因此，选择正己烷/乙酸乙酯/甲醇/硝酸银溶液(3mol/L)(9:1:9:1，v/v)溶剂系统用于高速逆流色谱的分离。
表1目标化合物在不同溶剂系统中的分配系数
Figure BDA0003296071170000091
2.2逆流色谱的分离流程
如图2所示，在优化条件下，粗样品(500mg)完全溶解在选定的两相溶剂体系(20mL)中，用于高速逆流色谱分离，参数如下：转速为800rpm，两相溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-硝酸银溶液(3mol/L)(9:1:9:1，v/v)，流动相流速2.0mL/min，分离温度为25℃。在最佳条件下，从500mg粗提物中得到化合物1(54.1mg)、化合物2(28.5mg)、化合物3(3.4mg)，逆流色谱的固定相保留率为73.3％。液相纯度如图3所示，化合物1-3的纯度分别为97.1％、95.2％和96.3％。
2.3结构鉴定
化合物1：β-榄香烯(图3中峰1),无色油状物,EI-MS m/z 204[M]+.1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.93(3H,s,H-15),5.75(1H,dd,J＝17.2,11.0Hz,H-1),4.82(1H,d,J＝11.0Hz,H-3a),4.83(1H,d,J＝17.2Hz,H-3b),4.52(1H,s,H-2a),4.65(1H,s,H-2b),1.64(3H,s,H-14),1.68(3H,s,H-13),4.63(1H,s,H-12a),4.75(1H,s,H-12b).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ15.6(C-15),20.0(C-13),23.7(C-14),25.8(C-8),31.9(C-6),38.8(C-10),38.9(C-9),44.7(C-7),51.7(C-5),107.2(C-12),108.8(C-2),111.1(C-3),146.7(C-4),149.3(C-1),149.4(C-11)。
化合物2：吉马烯A(图3中峰2),无色油状物,EI-MS m/z 204[M]+.1H NMR(400MHz,CDCl3):δ1.31(3H,s,H-14),1.40(3H,br s,H-15),1.49-1.56(1H,m,H-8a),1.61(3H,s,H-12),1.67-1.72(1H,m,H-8b),1.75-2.37(9H,m,H-2ab,3ab,6ab,7,9ab),4.52(1H,d,J＝9.98Hz,H-5),4.67(1H,m,H-13a),4.72-4.77(1H,m,H-1),4.79(1H,s,H-13b).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ16.8(C-14),16.9(C-15),20.4(C-12),26.8(C-2),33.8(C-8),35.0(C-6),39.8(C-3),42.4(C-9),51.5(C-7),108.2(C-13),126.5(C-1),129.1(C-4),131.8(C-5),138.3(C-10),153.90(C-11)。
化合物3：β-蛇床烯(图3中峰3),淡黄色油状物,,EI-MS m/z 204[M]+.1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.73(3H,s,H-15),1.31(3H,m,H-1a,H-6a,H-9a),1.46(2H,m,H-1b,H-9b),1.57(5H,m,H-2,H-6b,H-8),1.75(3H,s,H-13),1.82(1H,d,J＝12.08Hz,H-5),1.99(3H,m,H-3a,H-7),2.31(1H,d,J＝13.12Hz,H-3b),4.44(1H,s,H-14a),4.70(2H,brs,H-12a,H-14b),4.72(1H,s,H-12b).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ16.4(C-15),21.0(C-13),23.5(C-2),26.8(C-8),29.7(C-6),36.0(C-10),36.9(C-3),41.2(C-9),42.0(C-1),45.9(C-7),49.9(C-5),105.4(C-14),108.1(C-12),150.8(C-4),151.0(C-11)。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.基于配位效应制备高纯度倍半萜类成分的方法，其特征在于，所述方法至少包括：
对吉马烯A发酵液经处理后获得的粗提物采用银离子络合逆流色谱法进行HSCCC分离获得高纯度β-榄香烯，所述HSCCC溶剂系统为正己烷/乙酸乙酯/甲醇/硝酸银溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对吉马烯A发酵液进行处理的方法包括：
将吉马烯A发酵液进行蒸提处理，收集冷凝液；将冷凝液上层油相转移，下层水相用有机溶剂萃取，提取残余的油；合并萃取液，干燥，减压蒸发后即可获得以β-榄香烯和吉马烯A为主要成分得到精油；将精油在惰性氛围下加热，即获得粗提物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为石油醚；
减压蒸发温度控制为25-40℃，优选为30℃。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述惰性氛围为氮气氛围；
加热反应控制反应条件为：加热温度为130-180℃(优选为150℃)，加热反应时间控制为0.5-2h(优选为1h)。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用银离子络合逆流色谱法进行HSCCC分离具体方法包括：
选择正己烷/乙酸乙酯/甲醇/硝酸银溶液的上相作为流动相，下相作为固定相，正己烷/乙酸乙酯/甲醇/硝酸银溶液体积比为9:1:9:1，其中硝酸银溶液中Ag+浓度为1-5mol/L。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述固定相以10～30mL/min(优选为20mL/min)的流速泵入HSCCC分离柱；HSCCC在25～35℃(如30℃)下以600～800rpm(优选为800rpm)转速顺时针旋转，流动相以2.0～10.0mL/min(优选为5.0mL/min)流速，以尾端到首端的模式泵入HSCCC分离柱；平衡后，样品溶液通过进样阀进样；
优选的，所述样品溶液为粗提物溶解于正己烷/乙酸乙酯/甲醇/硝酸银溶液的上相和下相中所得。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述HSCCC分离过程还包括：在200-220nm(优选为210nm)处连续监测柱的流出物；
每1-10min(优选为2min)对馏分进行收集。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用HPLC色谱法对粗提物和CCC馏分进行分析，所述液相色谱法检测条件包括：色谱柱为C18柱(5μm，4.6mm×250mm，i.d.)，流动相：甲醇-水(95:5，v/v)；流速：0.5-5mL/min(优选为1.0mL/min)；检测波长：200-220nm(优选为210nm)；进样体积1-10μL(优选为5μL)。
9.权利要求1-8任一项所述方法得到的β-榄香烯。
10.权利要求1-8任一项所述方法和/或权利要求9所述β-榄香烯在如下任一种或多种中的应用：
a)倍半萜类成分的药理药性研究；
b)筛选和/或研发倍半萜类成分相关药物。
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