CN111303094A

CN111303094A - 一种茶藨子木层孔菌苯并呋喃类衍生物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111303094A
Application number: CN202010268336.1A
Authority: CN
Inventors: 刘玉红; 张永清; 蒋海强; 吴浩然; 徐凌川; 董梅月
Original assignee: Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2020-04-08
Filing date: 2020-04-08
Publication date: 2020-06-19
Anticipated expiration: 2040-04-08
Also published as: CN111303094B

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种茶藨子木层孔菌苯并呋喃类衍生物及其制备方法和应用。本发明从茶藨子木层孔菌的甲醇提取物中分离出三种新的苯并呋喃类化合物，根据NMR分析，阐明了它们的结构，并通过CD计算推导了三种化合物的绝对构型，该三种化合物为首次报道。本发明公开了三种化合物的理化性质和光学活性，具有较好的免疫促进活性，能够促进脾淋巴细胞的增殖，为首次研究发现，可用于制备增强免疫功能的药物。

Description

一种茶藨子木层孔菌苯并呋喃类衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种茶藨子木层孔菌苯并呋喃类衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

茶藨子木层孔菌为针层孔菌属药用真菌，主要分布在中国，日本和韩国在内的东亚地区，喜欢生活在山楂或梨树的树桩上。作为传统中药，茶藨子木层孔菌具有增强免疫力、治疗胃肠道癌症等功能。苯并呋喃类化合物及其类似物在自然界普遍存在，具有抗菌、抗真菌、抗肿瘤、抗病毒等作用。而高度氧化的苯并呋喃类化合物在自然界并不常见。

免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成，是机体执行免疫应答及免疫功能的重要系统。其中，免疫细胞是免疫系统发挥免疫功能的基础。淋巴细胞是免疫细胞的重要组成部分，在体内分布广泛，包括T细胞、B细胞和NK细胞等亚类，分别介导机体的细胞免疫、体液免疫及对肿瘤细胞和病毒感染细胞的杀伤作用等重要免疫学功能。机体免疫功能的高低直接影响机体的抗病能力。提高机体免疫力在很多疾病的治疗中发挥重要作用。许多疾病都需要通过增加免疫细胞数量来提高机体免疫力。研究表明，一些免疫复方可以通过激活免疫细胞而增强机体免疫力。

发明内容

本发明从茶藨子木层孔菌中发现了一种高度氧化的苯并呋喃类衍生物，其化学结构式为：

其中，R₁为H或OH或OCH₃；

R₂为OCH₃或OH。

更具体的，本发明获得了三个新的具有相同母核结构的苯并呋喃类化合物类似物，分别为化合物1，化合物2和化合物3；通过1D-NMR和2D-NMR光谱方法鉴定了它们的化学结构，并利用CD法确定了它们的绝对构型；其具体结构为：

本发明所述的茶藨子木层孔菌苯并呋喃类衍生物的制备方法，包括以下步骤：

(1)取干燥的茶藨子木层孔菌研磨成粉末，并在室温下用甲醇冷浸提取一个月，过滤并浓缩后，获得茶藨子木层孔菌粗提物；

(2)粗提物经硅胶柱色谱纯化，依次用二氯甲烷-乙酸乙酯和乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱得到七个馏分Frs.A-G；

(3)馏分Fr.C经Sephadex LH-20色谱柱，甲醇洗脱，得到八个馏分Frs.C1-C8；

(4)通过反相HPLC进一步分离Fr.C4，得到七个组分Frs.C9-C15；

(5)将Fr.C12通过反相HPLC纯化并用MeOH-H₂O洗脱，得到化合物1，化合物2；

(6)将FCr.15进行正相HPLC纯化并用正己烷-乙酸乙酯洗脱产生化合物3。

步骤(1)中茶藨子木层孔菌与甲醇的质量体积比为0.36g/ml。

步骤(2)中二氯甲烷-乙酸乙酯中二氯甲烷与乙酸乙酯的体积比与用量依次为A:100:0,2500mL、B:1:9,2500mL、C:1:1,6000mL、D:0:100,6000mL；乙酸乙酯-甲醇中乙酸乙酯与甲醇的体积比与用量依次为E:9:1,6000mL、F:6:3,5000mL、G:1:1,5000mL。

步骤(4)中反相HPLC采用MeOH-H₂O洗脱，甲醇与水的体积比为42：58；步骤(5)中反相HPLC采用MeOH-H₂O洗脱，甲醇与水的体积比为35：65。

步骤(6)中正己烷与乙酸乙酯的体积比为6：4。

将本发明所述的化合物应用于促进脾淋巴细胞的增殖试验，发现本发明获得的苯并呋喃类新化合物具有较好的免疫促进活性。因此，本发明所述的茶藨子木层孔菌苯并呋喃类衍生物可以应用于制备增强免疫功能的药物中，更进一步的，本发明所述的茶藨子木层孔菌苯并呋喃类衍生物可以应用于制备促进淋巴细胞增殖的药物中。

综上所述，本发明发现了三个新的具有相同母核结构的苯并呋喃类化合物类似物，通过1D-NMR和2D-NMR光谱方法鉴定了它们的化学结构，并利用CD光谱确定了它们的绝对构型。该化合物为首次报道。

本发明获得的苯并呋喃类新化合物具有较好的免疫促进活性，能够促进脾淋巴细胞的增殖，为首次研究发现，可用于制备增强免疫功能的药物。

附图说明

图1为化合物1的HREIMS谱；

图2为化合物1的红外光谱；

图3为化合物1的¹H NMR谱；

图4为化合物1的¹H-¹H COSY谱；

图5为化合物1的¹³C NMR谱；

图6为化合物1的HMQC谱；

图7为化合物1的HMBC谱；

图8为化合物1的NOESY谱；

图9为化合物1的对溴苯甲酸酯衍生物的CD和UV光谱；

图10为化合物2的HREIMS谱；

图11为化合物2的IR光谱；

图12为化合物2的¹H NMR谱；

图13为化合物2的¹³C NMR谱；

图14为化合物2的¹H-¹H COSY谱；

图15为化合物2的HMQC谱；

图16为化合物2的HMBC谱；

图17为化合物2的NOESY谱；

图18为化合物2的CD谱；

图19为化合物3的HREIMS谱；

图20为化合物3的IR光谱；

图21为化合物3的¹H NMR谱；

图22为化合物3的¹³C NMR谱；

图23为化合物3的¹H-¹H COSY谱；

图24为化合物3的HMQC谱；

图25为化合物3的HMBC谱；

图26为化合物3的NOESY谱；

图27为化合物3的对溴苯甲酸酯衍生物的CD和UV光谱；

图28为脾淋巴细胞增殖指数分析。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步阐述。必须说明下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

采用Varian Unity 600核磁共振仪测定NMR。采用JMS-700MStation光谱仪或JMX-AX500MStation光谱仪测定HREIMS和HRCIMS。分别使用Shimadzu UV 1650PC分光光度计、JASCO J-725圆二色谱仪、JASCO FT-IR 410红外分光光度计测量UV，CD和IR光谱。用Cosmosil C18-AR-II(10×250mm，5mm)和Cosmosil 5SL-II(10×250mm，5mm)色谱柱进行制备型HPLC分离。

实施例1茶藨子木层孔菌苯并呋喃类衍生物及其制备方法

取干燥的茶藨子木层孔菌(1.8千克)研磨成粉末，并在室温下用甲醇(5升)冷浸提取一个月，过滤并浓缩后，获得20g的茶藨子木层孔菌粗提物。粗提物(20g)经硅胶柱色谱纯化，依次用二氯甲烷-乙酸乙酯(A:100:0,2500mL；B:1:9,2500mL；C:1:1,6000mL；D:0:100,6000mL)和乙酸乙酯-甲醇(E:9:1,6000mL；F:6:3,5000mL；G:1:1,5000mL)梯度洗脱得到七个馏分(Frs.A-G)。Fr.C(2.51g)经Sephadex LH-20色谱柱，甲醇洗脱，得到八个馏分(Frs.C1-C8)。通过反相HPLC(MeOH/H₂O，42：58，v/v)进一步分离Fr.C4(0.592g)，得到七个组分(Frs.C9-C15)。将Fr.C12通过反相HPLC纯化并用MeOH/H₂O(35:65，v/v)洗脱，得到化合物1(1.0mg，t_R＝42.0min)，化合物2(0.5mg，t_R＝34.6min)。将FCr.15进行正相HPLC纯化并用正己烷/乙酸乙酯(6：4，v/v)洗脱产生化合物3(1.1mg，t_R＝30.4min)。

化合物1、2、3的具体结构为：

实施例2化合物1的对溴苯甲酸酯衍生物的制备

化合物1(1.0mg)溶于无水吡啶(0.11mL)后，加入对溴苯甲酰氯(10mg)和4-二甲基氨基吡啶(0.25mg)，室温反应3h。将反应混合物真空浓缩，并将粗产物通过TLC(氯仿-甲醇，20：1)纯化，得到化合物1的对溴苯甲酸酯衍生物。

实施例3化合物3的对溴苯甲酸酯衍生物的制备

化合物3(1.0mg)溶于无水二氯甲烷(0.15mL)后，加入对溴苯甲酰氯(4mg)，三乙胺(15μL)和4-二甲氨基吡啶(0.3mg)，室温反应3h。将反应混合物真空浓缩，并将粗产物通过TLC(正己烷-乙酸乙酯，8：2)纯化，得到化合物3的对溴苯甲酸酯衍生物。

实施例4化合物1-3的结构鉴定

化合物1：白色无定形粉末。HREIMS(图1)确定其分子式为C₁₃H₁₂O₅。红外光谱显示了3393、1687和1595cm^-1处的吸收带，分别代表羟基，羰基和芳香族基团(图2)。化合物1的¹HNMR(图3)和COSY(图4)数据显示含有1,2-二取代苯环：δ_H7.60(1H，dd，J＝7.8Hz，J＝0.9Hz，H-6)，7.42(1H，td，J＝7.8Hz，J＝1.4Hz)7.38(1H，td，J＝7.8Hz，J＝0.9Hz)，7.98(1H，dd，J＝7.8Hz，J＝1.4Hz)；此外，它还显示了三个连续的含氧次甲基信号：δ_H4.84(1H，d，J＝2.7Hz，H-2)，4.00(1H，dd，J＝3.4Hz，J＝2.7Hz，H-3)，5.12(1H，d，J＝3.4Hz，H-4)；以及甲氧基δ_H3.52(3H，s，3-OCH₃)。¹³CNMR(图5)谱图与HMQC(图6)显示存在12个碳，包括δ_C193.9(C-1)处的酮羰基碳；苯并呋喃环：δ_C112.8(C-6)，127.1(C-7)，125.9(C-8)，122.8(C-9)，157.3(C-5a)，124.3(C-9a)，116.1(C-1a)，167.7(C-4a)；三个含氧次甲基δ_C74.1(C-2)，87.6(C-3)，64.9(C-4)；以及甲氧基碳δ_C59.8。HMBC(图7)光谱显示了δ_H4.84(H-2)与C-1相关；δ_H5.12(H-4)与C-2，C-3，C-4a相关，表明C-1，C-2，C-3，C-4顺序键合，并且C1-C2-C3-C4片段与C-4a相连。此外，根据八个不饱合度进一步推断出酮羰基碳C-1与季碳C-1a连接形成氢化的二苯并呋喃酮骨架。同时，根据HMBC光谱，判断出甲氧基与C-3相连。

通过计算¹H-¹H耦合常数和NOESY(图8)实验，确定了1的相对构型。在1的NOESY谱图中，H-2与H-4相关，证明H-2和H-4都位于平伏键。此外，H-2和H-3之间(J＝2.7Hz)以及H-3和H-4之间的耦合常数较小(J＝3.4Hz)表示H-3也处于平伏键。因此，2-OH，3-OCH₃和4-OH位于直立键。通过CD确定1的绝对构型(参考文献Cardoso CL,Bolzani VS,Silva DH,Ishii H,BerovaN,Nakanishi K.The absolute configuration of 1-(3',4'-dihydroxycinnamoyl)cyclopentane-2,3-diol from the amazonian tree Chimarrhisturbinata.JNAT PROD 2006；69:1046.)，将1转化为相应的对溴苯甲酸酯，对溴苯甲酸酯衍生物的结果CD光谱(图9)在250nm处表现出负Cotton效应(UV：λmax248nm)，这表明p-溴苯甲酸酯和共轭烯酮发色团存在负手性，对应(2R，3S，4S)构型。因此，化合物1的结构为(2R，3S，4S)-4-二羟基-3-甲氧基-3,4-二氢-1(2H)-二苯并呋喃酮。

化合物2：白色无定形粉末。HREI-MS谱(图10)测定分子离子峰[M]+218.0584，分子式确定为C₁₂H₁₀O₄。红外光谱分析显示了3371(OH)，1661(C＝O)，1579cm^-1(芳香族)的特征谱带(图11)。根据分子式和光谱特征，推导2含有两个羟基。综合¹H NMR，HMBC，HMQC，COSY和¹³CNMR谱(图12-16)的整体特征，δ_H2.67(H-2a)和2.42(H-2b)分别与羰基碳(191.2)相关，表明C-2未被羟基取代。另外，2的苯并呋喃母核的结构类似于化合物1，这近一步说明两个羟基位于C-3和C-4。2的相对构型由NOESY谱(图17)确定，其中H-3与H-4相关，表明H-3与H-4空间位置接近。2的绝对构型是根据旋光度和CD光谱数据确定。2的[α]_D为-40.0，CD数据在193nm(Δε+2.1)显示正Cotton效应，在203nm(Δε-8.0)显示负Cotton效应(图18)，因此2的绝对构型被确定为3S，4S。因此，2的结构为(3S，4S)-3,4-二羟基-3,4-二氢-1(2H)-二苯并呋喃酮。

化合物3为白色无定形粉末。HREIMS确定其分子式为C₁₄H₁₄O₅(图19)。IR光谱显示出在3419(OH)，1687(C＝O)和1593cm^-1(芳香族)处的吸收带附(20)。3的NMR数据(图21-25)与化合物1相比，发现存在另一个甲氧基基团。根据HMBC谱发现该基团位于C-2。NOESY谱(图26)显示H-2与H-3相关，H-3与H-4相关；H-2和H-3之间(J＝2.5Hz)以及H-3与H-4之间(J＝6.4Hz)，表明H-3的位于平伏键，而H-4的位于直立键。3的对溴苯甲酸酯衍生物的CD光谱(图27)在249nm(UV：λmax247nm)处显示负Cotton效应效应，表明对溴苯甲酸酯和共轭烯酮发色团之间为负螺旋，对应构型为(2S，3S，4S)。根据上述数据，推导化合物3为(2S，3S，4S)-2,3-二甲氧基-4-羟基-3,4-二氢-1(2H)-二苯并呋喃酮。

表1化合物1-3的¹H and ¹³C NMR数据

实施例5化合物1-3的免疫促进活性测试。

1脾淋巴细胞悬液制备

取清洁级BALB/c小鼠颈椎脱臼处死，70％酒精浸泡10min，无菌条件下剖开小鼠腹腔取脾，研磨过100目筛网，Hank's液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，1000r/min离心5min，弃上清；加红细胞裂解液(Tris-NH₄Cl)10mL，混匀脾细胞，静止4～5min，待红细胞完全破碎，1000r/min离心5min，弃上清，去除红细胞，Hank's液洗2～3遍，用RPMI-1640培养液(含10％的小牛血清)重悬细胞，计数，调整细胞浓度为6～8×10⁶个/mL。

2测定法

于96孔培养板中，每孔加入100μL细胞悬液，再加入100μL不同浓度的样品溶液，同时设对照组(加100μL培养液)、阳性组(加100μL ConA，浓度10μg/mL)，另设空白组(只加培养基不加细胞)。置5％CO₂，37℃培养48h。培养结束前4h，于每孔加入5mg/mL的MTT 20μL，培养结束后，每孔加入酸化的20％的SDS溶液120μL裂解细胞，过夜，使甲瓒沉淀溶解，以空白组调零，在酶标仪上测各孔的吸收度A值(测定波长570nm，参比波长630nm)，并计算淋巴细胞增殖指数＝样品组吸光值/对照组吸光值。

3数据处理

所有数据均以均值±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验。P﹤0.05表示两组间差异显著。

4实验结果

结果见表1和图28，化合物均能够促进脾淋巴细胞的增殖，与对照组比较具有显著性意义。在浓度10、20、40μM时，化合物1的脾淋巴细胞增殖指数分别为1.15、1.22、1.41，化合物2的脾淋巴细胞增殖指数分别为1.17、1.21、1.27，化合物3的脾淋巴细胞增殖指数分别为1.12、1.23、1.36，在实验浓度下均具有一定的剂量依赖关系。说明我们获得的苯并呋喃类新化合物具有较好的免疫促进活性。

表1化合物对脾淋巴细胞增殖的影响(A570nm，x±s)

与对照比较*P<0.05，**P<0.01。

Claims

1.一种茶藨子木层孔菌苯并呋喃类衍生物，其特征在于，其化学结构式为：

其中，R₁为H或OH或OCH₃；

R₂为OCH₃或OH。

2.根据权利要求1所述的一种茶藨子木层孔菌苯并呋喃类衍生物，其特征在于，其化学结构式为：

3.根据权利要求1所述的一种茶藨子木层孔菌苯并呋喃类衍生物，其特征在于，其化学结构式为：

4.根据权利要求1所述的一种茶藨子木层孔菌苯并呋喃类衍生物，其特征在于，其化学结构式为：

5.一种权利要求1所述的茶藨子木层孔菌苯并呋喃类衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(4)通过反相HPLC进一步分离Fr.C4，得到七个组分Frs.C9-C15；

6.根据权利要求5所述的茶藨子木层孔菌苯并呋喃类衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中茶藨子木层孔菌与甲醇的质量体积比为0.36g/ml。

7.根据权利要求5所述的茶藨子木层孔菌苯并呋喃类衍生物的制备方法，其特征在于，步骤步骤(2)中二氯甲烷-乙酸乙酯中二氯甲烷与乙酸乙酯的体积比与用量依次为A:100:0，2500mL、B:1:9，2500mL、C:1:1，6000mL、D:0:100，6000mL；乙酸乙酯-甲醇中乙酸乙酯与甲醇的体积比与用量依次为E:9:1，6000mL、F:6:3，5000mL、G:1:1，5000mL。

8.根据权利要求5所述的茶藨子木层孔菌苯并呋喃类衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中反相HPLC采用MeOH-H₂O洗脱，甲醇与水的体积比为42：58；步骤(5)中反相HPLC采用MeOH-H₂O洗脱，甲醇与水的体积比为35：65；步骤(6)中正己烷与乙酸乙酯的体积比为6：4。

9.权利要求1或2或3或4所述的茶藨子木层孔菌苯并呋喃类衍生物在制备增强免疫功能的药物中的应用。

10.权利要求1或2或3或4所述的茶藨子木层孔菌苯并呋喃类衍生物在制备促进淋巴细胞增殖的药物中的应用。