CN109136119B - 微生物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种微生物及其用途和获得番茄红素的方法，该微生物过表达TmCrtE，PagCrtB和BtCrtI基因；以及沉默Exg1和Ypl062W基因。利用根据本发明实施例的微生物，现对于现有技术，生产番茄红素的产量显著提高，生产周期短，生产效率高。

Description

微生物及其用途

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体的，本发明涉及微生物及其用途，更具体的，本发明涉及微生物、获得番茄红素的方法和微生物在制备番茄红素中的用途。

背景技术

番茄红素的开发生产主要有天然产物提取、化学合成、微生物发酵等方法。天然产物提取主要是通过成熟果实的萃取纯化获得番茄红素，然而这种生产方式受气候、品种、地理位置、成熟度等诸多不可控因素影响，具有明显的季节性，含量不稳定性，并且大面积种植、养殖的成本较高，含量通常也比较低。另外，高纯度的番茄红素在萃取纯化技术上非常困难，这些共同造成了番茄红素的成品十分昂贵。化学合成法具有原料易得价廉、反应条件温和、反应速率快、产物容易与反应体系分离的优点，但由于双键立体选择性难以控制及不同程度的化学试剂残留，其产品的质量、安全性及使用范围都受到了限制。微生物发酵法主要是利用微生物的生物代谢，将葡萄糖、淀粉、黄豆饼粉等廉价原料转化为番茄红素，这种方法不受季节、地域、气候等因素的影响，原料易获取、生产周期短、工艺操作简单、成本低廉、产物质量可控、产物易纯化、安全性高，并且环境污染较少，不仅解决了因种植植物等而占用大量耕地的问题，也解决了化学合成不环保的弊端。最重要的是，发酵法生产的番茄红素属于天然型产品，其活性与天然植物提取的活性成分一致，被认为是番茄红素生产最有前景的方法。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

目前研究较多的番茄红素产生菌的主要是三孢布拉氏霉菌。但是三孢布拉氏霉菌在传代过程中容易发生退化现象，使得番茄红素产量减少，另伴有黄曲霉毒素等有毒成分的合成，另一方面，这两种微生物的生长周期相较于酵母和大肠杆菌较长，大大降低了其生产效率，从而造成了生产番茄红素的难度加大。

为此，本发明的一个目的在于提出了一种微生物，该微生物生产番茄红素的产量高，生产周期短，生产效率高。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种微生物。根据本发明的实施例，所述微生物过表达TmCrtE，PagCrtB和BtCrtI基因；以及沉默Exg1和Ypl062W基因。利用根据本发明实施例的微生物，现对于现有技术，生产番茄红素的产量显著提高，生产周期短，生产效率高。

根据本发明的实施例，上述微生物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述微生物进一步过表达包括选自tHMG1，INO2，yap1，spt15-5，taf25-3，GapN，PYC2，SMAE1，MDH2，POS5，pntAB，ADH2，ACS6，ALD6，EUTE，ERG12，IDI1，ERG10，MVD1，ERG13，ERG8基因的至少之一。发明人发现，所述微生物进一步过表达上述基因的至少之一，其番茄红素的产量进一步提高。

根据本发明的实施例，所述微生物进一步沉默包括选自GAL1，GAL7，GAL10，GAL80，ROX1，VBA5，DOS2，Yjl064W，Yer130C，Yer134C，Ynr063W，Yor292C，Sfk1，Mef1基因的至少之一。发明人发现，所述微生物进一步沉默上述基因的至少之一，其番茄红素的产量进一步提高。

根据本发明的实施例，所述微生物是酵母菌。酵母菌的生长周期短，利用本发明实施例的微生物生产番茄红素的效率进一步提高。

根据本发明的实施例，所述微生物进一步包括可操作调控ERG9基因。根据本发明的实施例，所述可操作调控ERG9基因包括但不限于替换ERG9基因的启动子，进而使得ERG9基因的表达可以根据需要进行调控，使微生物生产番茄红素的效率进一步提高。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种获得番茄红素的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述的微生物进行发酵处理；以及将发酵处理产物进行萃取处理，以便获得所述番茄红素。利用根据本发明实施例的获得番茄红素的方法，能够高产量、高效率获得番茄红素，且番茄红素的纯度高。

根据本发明的实施例，上述获得番茄红素的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，利用根据本发明实施例的获得番茄红素的方法，获得的番茄红素产量更高、效率更高，纯度也更高。

根据本发明的实施例，所述发酵处理是通过如下方式实现的：将所述微生物进行基础发酵处理和两级分批补料发酵处理，所述基础发酵处理是在基本发酵培养基中进行的，所述两级分批补料发酵处理是通过在所述基本发酵培养基基础上依次补加第一补料培养基和第二补料培养基实现的，其中，所述基本发酵培养基为含有24g/L蛋白胨，12g/L酵母提取物和12g/L葡萄糖的YPD培养基；所述第一补料培养基为含有500g/L葡萄糖和15g/L酵母抽提物的YPD培养基；所述第二补料培养基为75％乙醇和/或50％甘油。发明人通过实验发现，采用上述发酵处理方式，微生物的扩增速率高、番茄红素的产率也进一步提高。

根据本发明的实施例，所述萃取处理包括：将所述发酵处理产物进行超声破碎处理及有机萃取处理。发明人对发酵产物进行萃取处理过程中发现，将发酵处理后产物进行超声破碎处理，相比于采用盐酸蒸煮的方法，番茄红素的降解大幅降低，萃取处理后获得的番茄红素的产量进一步提高。

在本发明的第三方面，本发明提出了前面所述微生物在制备番茄红素中的用途。如前所述，利用本发明实施例的微生物，现对于现有技术，生产番茄红素的产量显著提高，生产周期短，生产效率高。

附图说明

图1是根据本发明实施例1的敲除盒片段1的结构示意图；

图2是根据本发明实施例1的敲除盒片段2的结构示意图；

图3是根据本发明实施例1的敲除盒片段3的结构示意图；

图4是第二代工程菌株摇瓶发酵结果；

图5是根据本发明实施例4的敲除盒片段4的结构示意图；以及

图6是根据本发明实施例的发酵培养基的筛选结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

微生物

在本发明的第一方面，本发明提出了一种微生物。根据本发明的实施例，该微生物过表达TmCrtE，PagCrtB和BtCrtI基因；以及沉默Exg1和Ypl062W基因。利用根据本发明实施例的微生物，生产番茄红素的产量显著提高，生产周期短，生产效率高。

本申请所述的微生物用于生产番茄红素，相比于现有技术，其产量得到了显著提高，能够至少达到2.5g/L。

根据本发明的具体实施例，该微生物可进一步过表达包括选自tHMG1，INO2，yap1，spt15-5，taf25-3，GapN，PYC2，SMAE1，MDH2，POS5，pntAB，ADH2，ACS6，ALD6，EUTE，ERG12，IDI1，ERG10，MVD1，ERG13，ERG8基因的至少之一。

根据本你发明的再一具体实施例，该微生物可进一步沉默包括选自GAL1，GAL7，GAL10，GAL80，ROX1，VBA5，DOS2，Yjl064W，Yer130C，Yer134C，Ynr063W，Yor292C，Sfk1，Mef1基因的至少之一。

发明人发现，所述微生物进一步过表达或沉默上述基因的至少之一，微生物生产番茄红素的产量进一步显著提高。

根据本发明的具体实施例，所述微生物还可以进一步包括可操作调控ERG9基因。本申请所述的可操作调控ERG9基因是指替换ERG原始的启动子，从而实现通过葡萄糖调控ERG9的表达，从而增加番茄红素的产量。

需要说明的是，发明人通过实验，发现：表达TmCrtE，PagCrtB，BtCrtI基因能够达到在酵母体内高效合成番茄红素的目的；沉默GAL1，7，10或GAL1，7，10，80能够达到利用半乳糖诱导或利用葡萄糖浓度调节生产番茄红素的目的；过表达INO2，yap1，spt15-5，taf25-3基因是抗逆基因，可以增加番茄红素的产量；表达GapN，PYC2，SMAE1，MDH2，POS5，pntAB中的一个或多个基因能够平衡酵母体内的还原力，可以增加番茄红素的产量；过表达ADH2，ALD6，EUTE中的一个或多个基因能够增加合成番茄红素的前体物质的供应，增加番茄红素的产量；表达ERG12，IDI1，ERG10，MVD1，ERG13，ERG8中的一个或多个基因，能够平衡有关番茄红素合成中的MVA途径，增加番茄红素的产量；沉默Exg1以及Ypl062W基因以及任选地ROX1，VBA5，DOS2，Yjl064W，Yer130C，Yer134C，Ynr063W，Yor292C，Sfk1，Mef1基因的至少之一，能够从整体上调节酵母系统，从而增加番茄红素的产量。利用根据本发明实施例的微生物，番茄红素的产量得到显著提高。

获得番茄红素的方法

在本发明的第二方面，本发明提出了一种获得番茄红素的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的微生物进行发酵处理；以及将发酵处理产物进行萃取处理，以便获得所述番茄红素。利用根据本发明实施例的获得番茄红素的方法，能够高产量、高效率获得番茄红素，且番茄红素的纯度高。

根据本发明的具体实施例，所述发酵处理是通过基础发酵处理和两级分批补料发酵处理进行的，具体如下所述：

将发酵罐装入少量纯水后115度进行空灭30分钟。配制分批培养的发酵液以及补料液，校准发酵罐的pH电极，夹住发酵罐的各个管路，115度灭菌30分钟。取出发酵罐，连接空气管路，进行少量通气(0.1vvm左右即可)，同时打开冷却水装置进行冷却。待温度降至50度左右时，打开转速至100rpm。校准溶氧电极。未连接线路的状态设定溶氧值为0％，随后将转速升至600rpm，同时将通气量调至2vvm，连接溶氧电极线路，待溶氧稳定后设定该值为100％。随后将通气量和转速降低至发酵所需值(通气量1.5vvm，转速300rpm-600rpm)。先自然pH，将温度调节至30度。开始接种，初始接种OD调至0.5，所需种子液体积根据公式进行计算。(如发酵液体积为2500mL，种子液OD值为n，则接种种子液体积为2500x0.5/n mL)。开始发酵后，上罐时培养基用2M NaOH来控制pH值为5.5，初始通气量为1.5vvm，初始搅拌速率设置为300rpm，溶氧维持在30％以上(关联搅拌速率，300-600rpm)。

当葡萄糖浓度降至2g/L左右时开始补料葡萄糖，初始补料速率为10mL/L发酵液/h，以维持发酵液中葡萄糖的残留浓度在2-3g/L左右(不要降至0g/L)，每两个小时取样测量一次OD600值和检测一次葡萄糖含量，当葡萄糖浓度低于1g/L时增加补料速率。当OD值增加缓慢时(开始进入稳定期)停止补料葡萄糖，此时开始监测乙醇残留量，当乙醇浓度降至5-10g/L时开始补料乙醇甘油，初始补料速率为2mL/L发酵液/h。随后每4h取样检测一次乙醇和甘油含量，当调整补料速率使乙醇和甘油维持在5-10g/L范围内。颜色有变化后开始提取产物检测产物变化，当番茄红素浓度不再增加时结束发酵。

其中，发明人发现，在基本发酵培养基中培养菌体，相比于现有技术的培养基，菌体的生长速度和生长状态均显著优于现有技术，补加的第一补料培养基，有效保证了菌体的快速和健康的生长，补加的第二补料培养基，有效提高了番茄红素的产量。根据本发明的再一具体实施例，所述萃取处理包括：将所述发酵处理后产物进行超声破碎处理以及有机萃取处理。发明人对发酵处理后的萃取过程进行了优化筛选，发明人发现，采用超声处理的方式相比于采用盐酸蒸煮的方式，番茄红素的降解速率大幅降低，番茄红素的产量稳定。另外，需要说明的是，本申请所述的“有机萃取处理”是指采取有机溶剂对超声破碎处理产物进行萃取，有机萃取的方式不受特别限制，如根据本发明的具体实施例，可以采用丙酮溶剂从超声破碎处理产物中萃取番茄红素。

用途

在本发明的第三方面，本发明提出了前面所述的微生物在制备番茄红素中的用途。发明人经过实验证实，本申请所述的微生物在生产番茄红素方面具有显著的优势，番茄红素的产量高、番茄红素的降解速率低，生产周期短。

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1第一代工程菌株J1011-B-B-1的构建

在本实施例中，发明人详细介绍了J1011-B-B-3菌株的构建过程。

首先构建ΔLEU2：pGAL1-TmCrtE(Taxus x media)敲除盒，即敲除盒片段1，设计上、下游引物PCR扩增各片段，使其相互之间有60-80bp的重叠片段，再通过同源重组的方式将所有片段重组在一起，通过酶切线性化得到ΔLEU2：：pGAL1-TmCrtE(Taxus x media)敲除盒，如敲除盒片段1如图1所示，敲除盒片段1具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。利用酵母自身的同源重组机制将该片段通过醋酸锂法酵母转化分别整合到酵母30000B基因组上，整合位点为LEU2，由于原酵母中的LEU2没有活性，而整合后的同源左臂含有LEU2完整基因，固转化后采用SD-Leu固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末1.3g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子通过分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，成功验证的菌株命名为J1011-B-1。

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CCACGTAGGCGAAAGAAACGTTAACACACCCTGGATAACGATGATCTGGAGATCCGTTCAACGTGGTATGTTCAGCGGATAATAGACCTTTGACTAATTTATCGGATAGTCTTTTGATGTGAGCTTGGTCGTTGTC(SEQ ID NO：1)。

再构建ΔURA3：pGAL1-PagCrtB(Pantoea agglomerans)；pGAL10-BtCrtI(Blakeslea trispora)敲除盒，即敲除盒片段2，敲除盒片段2具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。设计上、下游引物PCR扩增各片段，使其相互之间有60-80bp的重叠片段，再通过同源重组的方式将所有片段重组在一起，通过酶切线性化得到ΔURA3：：pGAL1-PaCrtB(Pantoea agglomerans)；pGAL10-BtCrtI(Blakeslea trispora)敲除盒，敲除盒片段2如图2所示。利用酵母自身的同源重组机制将该片段通过醋酸锂法酵母转化分别整合到酵母J1011-B-1基因组上，整合位点为URA3，转化后采用SD-HIS固体板(合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺组氨酸的混合氨基酸粉末1.3g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子通过分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，成功验证的菌株命名为J1011-B-2。

ACGCAGATAATTCCAGGTATTTTGAAGCAGAACTTTTATTTATCATCGAATTGACTATTGCATTATTTCTATTTTGCAAAGAGGAGAAAGAATTAGGAAAGTTCATACTTCAAAAAGTTTTCCAACTTTCTCACACGAAAGGCCTCACGAAAAGGACTGTTCGTAGAATGCTAACATACAAAATTTTGTTAATTTCGTTATGTGCGGATCAGACGGAGTACTTGTCCAAATTAATAAACGATGAGCTGTTAAAAAAGGGGGATATTTTTACCCAAAAATTTTTTGCAACTAATCAAGGTAAGGAATTTTTGAAGAGACTATTTTCATTGACCGAATCAGAGTTTTATAGAGGATTTTTACTAGGAAATGAGAATTTTTGGAAATTTTTAAGAAAAGTTACAGCAATGAAAGAGCAGAGCGAGAGCATTTTTGAATATTTAAATGAATCGATCAAGACAGACAGCAATATTTTGACAAATGAGAACTTCATGTGGGTCCTAGGACTATTAGATGAAATTTCATCAATGGGTGCCGTTGGAAATCACTGGGAAATAGAATACAAGAAATTGACAGAAAGTGGTCATAAAATTGATAAGGAGAATCCATACAAGAAATCGATCGAATTATCATTGAAATCCATTCAACTAACATCACACTTGCTGGAAGATAATAACGATCTGCGTAAAAACGAGATATTCGCTATTATTCAAGCTTTGGCACATCAATGCATCAATCCGTGTAAGCAGATAAGTGAATTTGCAGTGGTAACGCTAGAGCAGACGCTCATCAATAAAATCGAAATTCCAACTAATGAGATGGAATCGGTAGAAGAATTAATTGAGGGCGGATTACTACCGTTGCTAAATTCGAGTGAAACACAGGAAGACCAGAAAATCCTCATTTCATCCATATTAACAATAATTTCAAATGTTTATTTGCATTATTTGAAACTAGGGAAGACAAGCAACGAAACGTTTTTGAAAATTTTGAGTATTTTCAATAAATTTGTAGAGGACTCAGATATTGAAAAAAAGCTACAGCAATTAATACTTGATAAGAAGAGTATTGAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTCATGGATCTGCACATGAACAAACACCAGAGTCAAACGACGTTGAAATTGAGGCTACTGCGCCAATTGATGACAATACAGACGATGATAACAAACCGAAGTTATCTGATGTAGAAAAGGATTAAAGATGCTAAGAGATAGTGATGATATTTCATAAATAATGTAATTCTATATATGTTAATTACCTTTTTTGCGAGGCATATTTATGGTGAAGGATAAGTTTTGACCATCAAAGAAGGTTAATGTGGCTGTGGTTTCAGGGTCCATAAAGCTTTTCAATTCATCATTTTTTTTTTATTCTTTTTTTTGATTTCGGTTTCCTTGAAATTTTTTTGATTCGGTAATCTCCGAACAGAAGGAAGAACGAAGGAAGGAGCACAGACTTAGATTGGTATATATACGCATATGTAGTGTTGAAGAAACATGAAATTGCCCAGTATTCTTAACCCAACTGCACAGAACAAAAACCTGCAGGAAACGAAGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATAGATCCGTCGAGTTCAAGAGAAAAAAAAAGAAAAAGCAAAAAGAAAAAAGGAAAGCGCGCCTCGTTCAGAATGACACGTATAGAATGATGCATTACCTTGTCATCTTCAGTATCATACTGTTCGTATACATACTTACTGACATTCATAGGTATACATATATACACATGTATATATATCGTATGCTGCAGCTTTAAATAATCGGTGTCACTACATAAGAACACCTTTGGTGGAGGGAACATCGTTGGTACCATTGGGCGAGGTGGCTTCTCTTATGGCAACCGCAAGAGCCTTGAACGCACTCTCACTACGGTGATGATCATTCTTGCCTCGCAGACAATCAACGTGGAGGGTAATTCTGCTAGCCTCTGCAAAGCTTTCAAGAAAATGCGGGATCATCTCGCAAGAGAGATCTCCTACTTTCTCCCTTTGCAAACCAAGTTCGACAACTGCGTACGGCCTGTTCGAAAGATCTACCACCGCTCTGGAAAGTGCCTCATCCAAAGGCGCAAATCCTGATCCAAACCTTTTTACTCCACGCGCCAGTAGGGCCTCTTTAAAAGCTTGACCGAGAGCAATCCCGCAGTCTTCAGTGGTGTGATGGTCGTCTATGTGTAAGTCACCAATGCACTCAACGATTAGCGACCAGCCGGAATGCTTGGCCAGAGCATGTATCATATGGTCCAGAAACCCTATACCTGTGTGGACGTTAATCACTTGCGATTGTGTGGCCTGTTCTGCTACTGCTTCTGCCTCTTTTTCTGGGAAGATCGAGTGCTCTATCGCTAGGGGACCACCCTTTAAAGAGATCGCAATCTGAATCTTGGTTTCATTTGTAATACGCTTTACTAGGGCTTTCTGCTCTGTCATCTTTGCCTTCGTTTATCTTGCCTGCTCATTTTTTAGTATATTCTTCGAAGAAATCACATTACTTTATATAATGTATAATTCATTATGTGATAATGCCAATCGCTAAGAAAAAAAAAGAGTCATCCGCTAGGGGAAAAAAAAAAATGAAAATCATTACCGAGGCATAAAAAAATATAGAGTGTACTAGAGGAGGCCAAGAGTAATAGAAAAAGAAAATTGCGGGAAAGGACTGTGTTATGACTTCCCTGACTAATGCCGTGTTCAAACGATACCTGGCAGTGACTCCTAGCGCTCACCAAGCTCTTAAAACGGGAATTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACGCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGAGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCCAAAACCTTCTCAAGCAAGGTTTTCAGTATAATGTTACATGCGTACACGCGTTTGTACAGAAAAAAAAGAAAAATTTGAAATATAAATAACGTTCTTAATACTAACATAACTATAAAAAAATAAATAGGGACCTAGACTTCAGGTTGTCTAACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCGGATGTGGGGGGAGGGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATATCGACAAAGGAAAAGGGGCCTGTTTATATCCTAATATCGTTAGAGTTCTGTCCTTGGAAGACGTTTGGCAACAACTGATTAATAAAAGATGCTGGAGTAGTAGTGTCGTCCCTAGGAAAGAAATAGAAGAACAAGAAAGTGACAAAGTAGCATGCTAAGCAGTAATAAATCCAGTGTGACTCAGTCTTCCTTGTTTGCTCAGGTGCATATTTCTTCTGAGAGTCCTGTAACTTCCTAGGCAAAGGGTTTTGTCCGAATGACTTACAGACCTGGTCAGAAGTTAATTTAGATCCTGCCAAGACTATTGGGACTCCTGTACCAGGGTGAGTTGATGCACCGACGAAAAATAAATTGTCATATCTGTTAGTAGAGTCCTTTGTTGAAGGTCTGAACCACAAAACCTGAAAGACATCATGTGATAAACCTAATATTGATCCCCTCCACAAGTTGAACTTAGATTGCCAGACTGATGGGTCGTTGACCTCCTCGTGTTCTATCAAGTTAGCGAAGTTGTTGACTCCCAACCTCCTCTCTATGACCTCCAAGACCATCTTTCTAGCCCTGTTGACCAACTCTGGGTAGTTCTCCTCTGCTGAGTTACCTGTCTTAGACTTCATGTGACCAATTGGAACTAAAACTATAATTGAGTCCTTATTTGGAGGTGCTGCAGACTCGTCTATCCTTGAAGGAACGTTGACGTAGAAAGATGCTTCAGAAGGCAAACCGAAATCGTTAAAAATCTCGTCGAATGACTCCTTGTAAGCCTCAGCCAAGAAAATGTTGTGGACGTCCAATTGAGGGACCTTAGTAGACATTGACCAGTAAAAAGAAATTGATGAAGATGTTAATTTCTTAGATGCCAAAGTCTTCTTTGTCCAGTTGCAAGGTGGCAACAAGTGGTGGTAAGCGTAGACCAAGTCAGCGTTGCAGACGACAGCGTCTGCCTCAATGACTTCTCCAGACTCCAAAGTGACACCAGTGACCCTCTTGTCTTTATCGACAGTGTTAATCTTAGCGACAGGAGATTGGTACCTGAACTCAGCTCCGTACTTCTTAGAAGCTATAGACTCCAACTTTTGGACGACCATGTTGAAACCACCCCTTGGGTACCAAATTCCCTCTGCGAACTCTGTATATTGCAACAATGAGTAGACT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ID NO：2)。

再构建Δgal1，Δgal7，Δgal10:pGAL10-tHMG1敲除盒，即敲除盒片段3，敲除盒片段3具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。设计上、下游引物PCR扩增各片段，使其相互之间有60-80bp的重叠片段，再通过同源重组的方式将所有片段重组在一起，通过酶切线性化得到Δgal1，Δgal7，Δgal10::pGAL10-tHMG1敲除片段，敲除盒片段3的结构如图3所示。利用酵母自身的同源重组机制将该片段通过醋酸锂法酵母转化分别整合到酵母J1011-B-2基因组上，整合位点为GAL1，GAL7和GAL10，转化后采用SD-Trp固体板(合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸的混合氨基酸粉末1.3g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子通过分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，成功验证的菌株命名为J1011-B-3.

TTCACCGATTCTGAGCGAATCACAGGTGAGAAATTTGGATTCGAAATAAACCTAAAAAAACTATCCAATAAGGCTTCCATAGGCTTCGTATTTCCCGACCATTCCAATTGGAAAAATTGAGCGCTGTCTTCCATGATCTTAGATAAAGCCTTAATACTTGGCTCATTTCCATTTGAGGTTAGCTCTAGCAACTGGTAAAGCATTTGAAGACCAGTTGGATCATCTCTATGCTGCCTATAGTAAGTGGAAAATAAAGTAGTAATAACGATACCTGTCACGTTCGAAACGAGATTATTGTTCGAATTATAAAGGCCATGTATAATGTTTGATTTGACGTATCCTAAGTCGTGGCTATTGCTCTTAATTAAATTGTTTCCCCCTAGCATTGAATTTTTCAACAGCATACCGGCGGTAGCTCTATTGTTCTGAAGATCCTGTAGGGAGTAGTGTTGCTTCAATACATCATCAGATTCGCCTTCAATTAAAATATAACACAAATAATTGAGAAATTCAGGTTGCAGCTGGAAGTTCTCCATAGCTTCCATTGCGTTATTACGAATCTCTGGATTTGGTGACATACAGTTCTGTAAAAGAGTTGCTAGTTGCAACACATAGTCTTCGGCGGGCTTCCATGTCGATGCCATCTTTATTCACTTAACTACTGCTAACAATTCTGGAAACCAAAGACTGCGGAATATTCTGATATGTATTACTACTATTCGCTGCTCTTCTGCATAATTAATACTGAAAAGTTTTTCATACTTTTAAACATAACCTTTTTTTAAGCAAAACTCTATGACCCGGATTAGAAAACTACGAAAAGAGGGTAATAACATAGGTGCAGGATTTCCATCGATAACGACGCCGACAATGAGCCTTGCTGCAACATCCAATTAGGACTAATAACTATCGTAGGAATTTCTACGTAATAAACTTCAACAGAGCCTAAAATTTGAAAATAAATAATCTAGAGGGGAAACTTAAAGAAATTCTATTCTTGTCAATAAAGTGGAAATCTGTCAGATGTCACAGTTTCTTTATTTGTGACACATATTTTCAACATAAATTCAGGCATTAGTGCTGTAAGCACAAAAAGTTGTGGCGATATGAATATTCCAGATTTTACTTACAAGCTGCATTGTAGTCTTACAATTCTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTATGGAAAGGACCACTCTTACATAACTAGAATAGCATTAAGAATCAGATTTACAGATAAAGATGACATTATTTTATATATATATTGTCACTCCGTTCAAGTCGACAACCAATAAAAAATTTAAAAAAAGCCAGGCAGTTAATAGAAAAAATATGATATGAATGAATATTCCACTTTCTTTTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATAAACGACATTACTATATATATAATATAGGAAGCATTTAATAGACAGCATCGTAATATATGTGTACTTTGCAGTTATGACGCCAGATGGCAGTAGTGGAAGATATTCTTTATTGAAAAATAGCTTGTCACCTTACGTACAATCTTGATCCGGAGCTTTTCTTTTTTTGCCGATTAAGAATTAATTCGGTCGAAAAAAGAAAAGGAGAGGGCCAAGAGGGAGGGCATTGGTGACTATTGAGCACGTGAGTATACGTGATTAAGCACACAAAGGCAGCTTGGAGTATGTCTGTTATTAATTTCACAGGTAGTTCTGGTCCATTGGTGAAAGTTTGCGGCTTGCAGAGCACAGAGGCCGCAGAATGTGCTCTAGATTCCGATGCTGACTTGCTGGGTATTATATGTGTGCCCAATAGAAAGAGAACAATTGACCCGGTTATTGCAAGGAAAATTTCAAGTCTTGTAAAAGCATATAAAAATAGTTCAGGCACTCCGAAATACTTGGTTGGCGTGTTTCGTAATCAACCTAAGGAGGATGTTTTGGCTCTGGTCAATGATTACGGCATTGATATCGTCCAACTGCATGGAGATGAGTCGTGGCAAGAATACCAAGAGTTCCTCGGTTTGCCAGTTATTAAAAGACTCGTATTTCCAAAAGACTGCAACATACTACTCAGTGCAGCTTCACAGAAACCTCATTCGTTTATTCCCTTGTTTGATTCAGAAGCAGGTGGGACAGGTGAACTTTTGGATTGGAACTCGATTTCTGACTGGGTTGGAAGGCAAGAGAGCCCCGAAAGCTTACATTTTATGTTAGCTGGTGGACTGACGCCAGAAAATGTTGGTGATGCGCTTAGATTAAATGGCGTTATTGGTGTTGATGTAAGCGGAGGTGTGGAGACAAATGGTGTAAAAGACTCTAACAAAATAGCAAATTTCGTCAAAAATGCTAAGAAATAGGTTATTACTGAGTAGTATTTATTTAAGTATTGTTTGTGCACTTGCCTATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGAAATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACTACACGGTCCAATGGATAAACATTTTTTATCAACACTATGATATATAAATATAATAGTTTTTCGTATATATATTCCTTTTTTTGGTCAATTTTTGAAATTTTCGTAGAAAAGGGAGAGACAAAACACATTATATCAATGAAAACGTACAAAAAGTAGATAAAGTCAGTGCTTAAACACGTCTTTTCCTTAAAAATACTTTATTATTTTTATTTTATTGAGAGGGTGGTTTAAAAATAGAAATAGAGAGAGAGGTACATACATAAACATACGCGCACAAAAGCAGAGATTAGGATTTAATGCAGGTGACGGACCCATCTTTCAAACGATTTATATCAGTGGCGTCCAAATTGTTAGGTTTTGTTGGTTCAGCAGGTTTCCTGTTGTGGGTCATATGACTTTGAACCAAATGGCCGGCTGCTAGGGCAGCACATAAGGATAATTCACCTGCCAAGACGGCACAGGCAACTATTCTTGCTAATTGACGTGCGTTGGTACCAGGAGCGGTAGCATGCGGGCCTCTTACACCTAATAAGTCCAACATGGCACCTTGTGGTTCTAGAACAGTACCACCACCGATGGTACCTACTTCGATGGATGGCATGGATACGGAAATTCTCAAATCACCGTCCACTTCTTTCATCAATGTTATACAGTTGGAACTTTCAACATTTTGTGCAGGATCTTGTCCTAATGCCAAGAAAACAGCTGTCACTAAATTAGCTGCATGTGCGTTAAATCCACCAACAGACCCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATTCTTAGCAATGTTCAACTCAACCAATGCGGAAACATCACTTTTTAACACTTTTCTGACAACATCACCAGGAATAGTAGCTTCTGCGACGACACTCTTACCACGACCTTCGATCCAGTTGATGGCAGCTGGTTTTTTGTCGGTACAGTAGTTACCAGAAACGGAGACAACCTCCATATCTTCCCAGCCATACTCTTCTACCATTTGCTTTAATGAGTATTCGACACCTTTAGAAATCATATTCATACCCATTGCGTCACCAGTAGTTGTTCTAAATCTCATGAAGAGTAAATCTCCTGCTAGACAAGTTTGAATATGTTGCAGACGTGCAAATCTTGATGTAGAGTTAAAAGCTTTTTTAATTGCGTTTTGTCCCTCTTCTGAGTCTAACCATATCTTACAGGCACCAGATCTTTTCAAAGTTGGGAAACGGACTACTGGGCCTCTTGTCATACCATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGCACCACCGCCAGCATTGATTGCCTTACAGCCACGCATGGCAGAAGCTACCAAACAACCCTCTGTAGTTGCCATTGGTATATGATAAGATGTACCATCGATAACCAAGGGGCCTATAACACCAACGGGCAAAGGCATGTAACCTATAACATTTTCACAACAAGCGCCAAATACGCGGTCGTAGTCATAATTTTTATATGGTAAACGATCAGATGCTAATACAGGAGCTTCTGCCAAAATTGAAAGAGCCTTCCTACGTACCGCAACCGCTCTCGTAGTATCACCTAATTTTTTCTCCAAAGCGTACAAAGGTAACTTACCGTGAATAACCAAGGCAGCGACCTCTTTGTTCTTCAATTGTTTTGTATTTCCACTACTTAATAATGCTTCTAATTCTTCTAAAGGACGTATTTTCTTATCCAAGCTTTCAATATCGCGGGAATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAGCTCGATTGCGCAGATGATAAACTTTTGACTTTCGATCCAGAAATGACTGTTTTATTGGTTAAAACCATTTATATTG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ID NO：3)。

更进一步，发明人通过实验验证，J1011-B-3具有高产番茄红素的性能，同时过表达TmCrtE，PagCrtB，BtCrtI基因所获得的酵母菌株，其番茄红素的产量优于其它基因组合。

在以下实验中，发明人进一步对J1011-B-3菌株进行改造，具体如下所述：

实施例2启动子和终止子的选择

为了能用半乳糖进行诱导，需要敲除代谢半乳糖的基因GAL1,GAL7,GAL10。因此特征启动子的背景菌株为敲除基因GAL1,7,10。半乳糖价格较高，并不适用于工业化生产，因此在敲除基因GAL1,7,10的基础上敲除GAL80，以期通过对葡萄糖量的控制达到对基因表达的调控。所得到的启动子信息用于构建控制类胡萝卜素合成相关基因的表达。

结果显示，在ΔGAL1/7/10/80菌株和ΔGAL1/7/10菌株中不论是诱导型启动子或是组成型启动子在稳定期强度基本一致。可见，敲除GAL80可以起到不加半乳糖即可诱导基因表达，诱导强度跟与半乳糖诱导强度相当。

酵母属于真核生物，在其体内过表达基因需要选择合适的启动子和终止子，经过反复多次实验，发明人选择了P_GAL1，P_GAL7，P_GAL10，P_GAL1-10，P_GAL10-1和P_HXT1作为表达基因的启动子。其中，P_GAL1具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，P_GAL7具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，P_GAL10具有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，P_GAL1-10具有如SEQID NO：7所示的核苷酸序列，P_GAL10-1具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列，P_HXT1具有如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。

AGTACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGCGACAGCCCTCCGACGGAAGACTCTCCTCCGTGCGTCCTGGTCTTCACCGGTCGCGTTCCTGAAACGCAGATGTGCCTCGCGCCGCACTGCTCCGAACAATAAAGATTCTACAATACTAGCTTTTATGGTTATGAAGAGGAAAAATTGGCAGTAACCTGGCCCCACAAACCTTCAAATCAACGAATCAAATTAACAACCATAGGATAATAATGCGATTAGTTTTTTAGCCTTATTTCTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGATTTTTGATCTATTAACAGATATATAAATGCAAAAGCTGCATAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTTTCGGTTTGTATTACTTCTTATTCAAATGTCATAAAAGTATCAACAAAAAATTGTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACTATA(SEQ ID NO：4)。

GACGGTAGCAACAAGAATATAGCACGAGCCGCGAAGTTCATTTCGTTACTTTTGATATCGCTCACAACTATTGCGAAGCGCTTCAGTGAAAAAATCATAAGGAAAAGTTGTAAATATTATTGGTAGTATTCGTTTGGTAAAGTAGAGGGGGTAATTTTTCCCCTTTATTTTGTTCATACATTCTTAAATTGCTTTGCCTCTCCTTTTGGAAAGCTATACTTCGGAGCACTGTTGAGCGAAGGCTCATTAGATATATTTTCTGTCATTTTCCTTAACCCAAAAATAAGGGAAAGGGTCCAAAAAGCGCTCGGACAACTGTTGACCGTGATCCGAAGGACTGGCTATACAGTGTTCACAAAATAGCCAAGCTGAAAATAATGTGTAGCTATGTTCAGTTAGTTTGGCTAGCAAAGATATAAAAGCAGGTCGGAAATATTTATGGGCATTATTATGCAGAGCATCAACATGATAAAAAAAAACAGTTGAATATTCCCTCAAAA(SEQ ID NO：5)。

TACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAA(SEQID NO：6)。

TATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAA(SEQ IDNO：7)。

TTATATTGAATTTTCAAAAATTCTTACTTTTTTTTTGGATGGACGCAAAGAAGTTTAATAATCATATTACATGGCAATACCACCATATACATATCCATATCTAATCTTACTTATATGTTGTGGAAATGTAAAGAGCCCCATTATCTTAGCCTAAAAAAACCTTCTCTTTGGAACTTTCAGTAATACGCTTAACTGCTCATTGCTATATTGAAGTACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGCGACAGCCCTCCGACGGAAGACTCTCCTCCGTGCGTCCTGGTCTTCACCGGTCGCGTTCCTGAAACGCAGATGTGCCTCGCGCCGCACTGCTCCGAACAATAAAGATTCTACAATACTAGCTTTTATGGTTATGAAGAGGAAAAATTGGCAGTAACCTGGCCCCACAAACCTTCAAATCAACGAATCAAATTAACAACCATAGGATAATAATGCGATTAGTTTTTTAGCCTTATTTCTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGATTTTTGATCTATTAACAGATATATAAATGCAAAAGCTGCATAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTTTCGGTTTGTATTACTTCTTATTCAAATGTCATAAAAGTATCAACAAAAAATTGTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACTATA(SEQ IDNO：8)。

GATTTTACGTATATCAACTAGTTGACGATTATGATATCTTTATAGATTTTAAGGTGGGGAAAGAACATGAGACCCCAGATGGAATTGATTATGGGGACATTGTTGCCTTTATATATAATTTCAATATACTAATTCAAATGATTAAAAACGTGAGGGGGACACGCAACTTCGGGTGTTAAGAAATATTTTGCTACATTAGATAATGGTGGAGTTTCCTGGCTTGTCGGATAAAAGCCATCAAATGTCGCAGCAGCTCATGTTTACGTTTGCTGTCTTCTGCCCACGTCATATGAGTGGTATTCTTCTATCAGCACTTGATGAATATTCTTTTTCTCATATATCTGAAAGACAAAAGATCGGCACGGCAATGCCCTGCAGCATTTCTTCCTAGTTTTTCCGAATTTCCATTACGTATTGGATCTTGTGCGCATATTTGTCAGTCCTTCACGGAAAAAAAAAAAGAGCACTGGGTCACTTCGGAAAAACTTTTGACTCAATGCAACAGTGTCATAATCCTTTGCGCTGTCTCTTTGAAGAAAAATCAGGAGTGCAAGATATCGATTAATTCCTTGGAAGTTATGATGGTTAGTCTTAGTTTAACTCTCTTGAAGAAGGGTTTTTTCAGTTGGTCAACACTCTTTAGAGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAGAATTCTTCATGTAATTTACCATGATTCTACGTTTTTGCAAGCAAAAATGAAGATAATCCGAGCGCATGCGCAAGTAGTCCCTGCCATGCCGCTTCGGAAAAACTTTCGAAACCAATACTCCTTACATCCGCCTTGAATTTAGGACCTACAATTGTTGTCTCTTCTGCTTGAACCAATAAGCCCTAGAAACCTTACACCCTAATTTGCACAAGAAAACTACGAAAAAATTTTTTCCTCTTTTTTCCGCAGCTCCAATCTCGCCCTGCTATTTTTTTGGTTCGGAGAAAAATAGTCGGTCGATATGAATTGAAGTTTCATTGTGGCCACTCGTTTAGGAATGGAATAACCTCCGCGAATGGAAAAAAAGAACTCGGAATATCAAAAATTCCGGCTCAAAGGAAAAATTTGCTTCAGGAGGGGGGAATTATATTCCAGATGAGACCTGCA(SEQ IDNO：9)。

选择任意的终止子(比如T_ADH2，T_GAL10，T_CYC1，T_GPM1和T_PGK1等)作为表达基因的终止子，这些元件的组合搭配能够实现多个基因的过表达。

实施例3第二代工程菌株的构建

在本实施例中，发明人以J1011-B-3菌株为基础，在J1011-B-3菌株上调整TmCrtE(Taxus x media)，PagCrtB(Pantoea Agglomerans)和BtCrtI(Blakeslea trispora)这三个基因的拷贝数，获得第二代菌株。

其中第二代工程菌株的具体特性如表1所示。按照设计选择合适的启动子和终止子，用上、下游引物PCR扩增各片段，使其相互之间有60-80bp的重叠片段，再通过同源重组的方式将所有片段重组在一起，通过酶切线性化得到各相应片段，利用酵母自身的同源重组机制将该片段通过醋酸锂法酵母转化分别整合到酵母J1011-B-3基因组上，转化后采用筛选抗性固体板进行筛选，得到的转化子通过分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，成功验证的菌株详见表1。

表1：第二代工程菌株

其中，BtCrtI具有如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列，PagCrtB具有如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列，TmCrtE具有如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。

TTATATCCTAATATCGTTAGAGTTCTGTCCTTGGAAGACGTTTGGCAACAACTGATTAATAAAAGATGCTGGAGTAGTAGTGTCGTCCCTAGGAAAGAAATAGAAGAACAAGAAAGTGACAAAGTAGCATGCTAAGCAGTAATAAATCCAGTGTGACTCAGTCTTCCTTGTTTGCTCAGGTGCATATTTCTTCTGAGAGTCCTGTAACTTCCTAGGCAAAGGGTTTTGTCCGAATGACTTACAGACCTGGTCAGAAGTTAATTTAGATCCTGCCAAGACTATTGGGACTCCTGTACCAGGGTGAGTTGATGCACCGACGAAAAATAAATTGTCATATCTGTTAGTAGAGTCCTTTGTTGAAGGTCTGAACCACAAAACCTGAAAGACATCATGTGATAAACCTAATATTGATCCCCTCCACAAGTTGAACTTAGATTGCCAGACTGATGGGTCGTTGACCTCCTCGTGTTCTATCAAGTTAGCGAAGTTGTTGACTCCCAACCTCCTCTCTATGACCTCCAAGACCATCTTTCTAGCCCTGTTGACCAACTCTGGGTAGTTCTCCTCTGCTGAGTTACCTGTCTTAGACTTCATGTGACCAATTGGAACTAAAACTATAATTGAGTCCTTATTTGGAGGTGCTGCAGACTCGTCTATCCTTGAAGGAACGTTGACGTAGAAAGATGCTTCAGAAGGCAAACCGAAATCGTTAAAAATCTCGTCGAATGACTCCTTGTAAGCCTCAGCCAAGAAAATGTTGTGGACGTCCAATTGAGGGACCTTAGTAGACATTGACCAGTAAAAAGAAATTGATGAAGATGTTAATTTCTTAGATGCCAAAGTCTTCTTTGTCCAGTTGCAAGGTGGCAACAAGTGGTGGTAAGCGTAGACCAAGTCAGCGTTGCAGACGACAGCGTCTGCCTCAATGACTTCTCCAGACTCCAAAGTGACACCAGTGACCCTCTTGTCTTTATCGACAGTGTTAATCTTAGCGACAGGAGATTGGTACCTGAACTCAGCTCCGTACTTCTTAGAAGCTATAGACTCCAACTTTTGGACGACCATGTTGAAACCACCCCTTGGGTACCAAATTCCCTCTGCGAACTCTGTATATTGCAACAATGAGTAGACTGCAGGTGCGTCGTAAGGTGACATACCCATGTACATTGTTTGAAAAGTAAAAGCCATCCTCATCTTTTTTGTTTGGAAGTATTTTGATGCTCTGTCGTATATCTTACCGAATAAGTGCAACCTAAAAATCTCTGGGACGTACTGTAACCTTATTAAGTCCCATATAGTTTCGAAGTTTCTCTTTATAGCAATGAATGTACCCTGCTCGTAGTGGACGTGTGTCTCTTTCATGAAATCTAAGAACCTACCGAATCCTAAAGGTCCCTCAATCCTGTCCAACTCACCCTTCATCTTTGTTAAGTCTGATGACAATTGGACAGCGTCACCGTCGTCGAAATGGACTTTGTAATTGTTGTCACATCTTAATAAGTCCAAGTGGTCTCCTATCCTCTCGTCTAAGTCAGCGAAAGCGTCCTCAAACAACTTAGGCATCAAGTACAATGAAGGTCCCTGGTCGAACCTGTGACCGTCGTGGTGAATGAAAGAGCACCTTCCTCCAGAGAAGTCGTTCTTCTCGACGACAGTGACTCTGAAACCCTCCCTTGCTAACCTTGCTGCTGTTGCAGTACCTCCTATTCCAGCACCTATGACGACAATGTGCTTCTTCTGATCAGACAT(SEQ ID NO：10)。

ATGTCACAACCACCATTATTGGACCACGCTACACAAACTATGGCAAACGGTTCTAAATCTTTCGCTACTGCTGCTAAATTATTCGACCCAGCAACAAGAAGATCTGTATTGATGTTGTACACCTGGTGTAGACATTGCGATGACGTTATAGATGACCAAACTCACGGTTTTGCTTCAGAAGCTGCAGCCGAAGAAGAAGCTACACAAAGATTGGCAAGATTAAGAACTTTGACATTAGCTGCATTCGAAGGTGCCGAAATGCAAGATCCAGCTTTTGCCGCTTTCCAAGAAGTTGCATTAACCCATGGTATTACTCCTAGAATGGCTTTGGATCACTTAGACGGTTTTGCAATGGATGTCGCCCAAACAAGATACGTAACCTTCGAAGACACTTTAAGATATTGTTACCATGTCGCCGGTGTTGTCGGTTTGATGATGGCTAGAGTAATGGGTGTTAGAGATGAAAGAGTTTTAGATAGAGCATGTGACTTGGGTTTAGCCTTCCAATTGACAAACATAGCTAGAGATATAATAGATGACGCAGCCATAGACAGATGCTATTTGCCAGCTGAATGGTTACAAGATGCAGGTTTGACTCCTGAAAATTACGCTGCAAGAGAAAACAGAGCCGCTTTAGCCAGAGTTGCTGAAAGATTGATAGATGCAGCCGAACCATATTACATCTCTTCACAAGCTGGTTTGCATGATTTGCCACCTAGATGCGCATGGGCCATTGCTACCGCAAGATCTGTTTACAGAGAAATCGGTATTAAAGTCAAGGCTGCAGGTGGTTCCGCATGGGATAGAAGACAACACACTTCTAAAGGTGAAAAGATCGCTATGTTGATGGCCGCTCCTGGTCAAGTTATTAGAGCAAAGACCACCAGAGTCACCCCAAGACCAGCCGGTTTATGGCAAAGACCTGTTTAA(SEQ ID NO：11)。

ATGGCTTATACCGCAATGGCAGCAGGAACTCAGTCATTGCAGTTGAGGACAGTCGCCTCTTACCAGGAGTGCAACTCAATGAGGTCTTGCTTCAAGTTGACCCCATTCAAGTCATTCCACGGTGTCAACTTCAACGTTCCTTCTTTAGGTGCCGCCAACTGCGAAATCATGGGTCACTTGAAATTGGGTTCTTTGCCATACAAACAGTGTTCAGTATCATCTAAGTCAACTAAGACTATGGCCCAGTTGGTAGATTTGGCAGAGACCGAGAAAGCCGAGGGAAAGGATATCGAGTTCGATTTTAACGAGTATATGAAGTCTAAGGCTGTCGCTGTTGATGCAGCCTTGGATAAGGCCATCCCTTTGGAGTATCCAGAGAAGATCCATGAGTCTATGAGGTACTCATTGTTGGCCGGAGGAAAAAGGGTCAGACCTGCATTATGCATCGCTGCTTGCGAGTTAGTAGGTGGTTCTCAGGACTTGGCCATGCCAACCGCATGTGCCATGGAAATGATTCATACCATGTCATTGATTCACGATGATTTGCCTTGCATGGACAACGACGACTTCAGAAGGGGAAAGCCTACCAATCACAAGGTTTTCGGAGAGGACACTGCTGTTTTAGCCGGTGACGCATTGTTATCTTTCGCTTTTGAACACATCGCCGTTGCCACATCAAAAACTGTCCCATCTGACAGGACCTTGAGAGTCATTTCTGAGTTGGGTAAAACCATCGGTTCACAGGGATTGGTCGGAGGTCAGGTAGTCGACATCACTTCTGAGGGAGACGCCAACGTCGACTTAAAGACATTGGAGTGGATTCACATTCACAAGACTGCCGTCTTGTTGGAATGCTCTGTTGTTTCTGGAGGAATCTTGGGTGGAGCTACCGAGGATGAGATTGCTAGAATAAGAAGATACGCCAGGTGCGTCGGTTTGTTGTTCCAGGTTGTCGACGACATTTTGGATGTCACCAAGTCTTCAGAGGAATTGGGAAAGACCGCCGGTAAAGACTTATTGACCGACAAGGCTACCTACCCTAAGTTGATGGGTTTGGAGAAGGCCAAAGAGTTTGCAGCAGAATTAGCTACCAGGGCAAAGGAAGAGTTGTCATCATTCGACCAGATCAAGGCAGCCCCTTTGTTAGGATTGGCCGATTACATCGCTTTCAGGCAAAACTAA(SEQ ID NO：12)。

更进一步，发明人通过实验验证，结果如图4所示，在摇瓶条件下，J1011-B-5，6，7和J1011-B-33～36具有比J1011-B-3更高产番茄红素的性能。

实施例4沉默基因的工程菌株的构建

在本实施例中，发明人详细介绍了在上述工程菌的基础上敲除另外一些基因获得沉默基因工程菌株的实验过程。

在酿酒酵母中，有很多潜在的基因在敲除后对细胞积累番茄红素化合物有明显的影响，因此构建一系列背景菌株用于增加番茄红素产量。构建方法为在需要灭活的基因中以潮霉素抗性基因为标记构建相应的敲除盒片段，敲除盒片段见图4。将该片段通过醋酸锂法酵母转化分别整合到上述工程菌中，最后用含有潮霉素抗性的平板进行筛选得到疑似带有抗性的菌株，用PCR进行验证，得到的第四代工程菌株见表2。其中，敲除盒片段中的灭活基因序列可从NCBI上下载，从而可以设计得到图5的敲除框。

表2：沉默工程菌株特性

更进一步，发明人通过实验验证，J1011-B-9,10,11,13,15,19都具有比J1011-B-3更高产番茄红素的性能。

实施例5过表达基因的工程菌株的构建

在本实施例中，发明人详细介绍了在上述工程菌株上过表达相关的实验过程。

选择合适的启动子和终止子构建表3中相关基因的表达框，在实施例4的基础上选择合适的基因作为插入位点，通过设计上、下游引物PCR扩增各片段，使其相互之间有60-80bp的重叠片段，再通过同源重组的方式将所有片段重组在一起，通过酶切线性化得到即可实现沉默基因又能过表达基因的基因片段。利用酵母自身的同源重组机制将该片段通过醋酸锂法酵母转化分别整合到上述工程菌株基因组上，转化后采用筛选平板进行筛选，得到的转化子通过分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，成功验证的菌株详见表3。

更进一步，发明人通过实验验证，J1011-B-4和J1011-B-20～32都具有高产番茄红素的性能。

表3：过表达基因的工程菌株

其中，INO2基因具有如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列，gapN基因具有如SEQIDNO：14所示的核苷酸序列，PYC2基因具有如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列，SMAE1基因具有如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列，MDH2基因具有如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列，POS5基因具有如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列，pntA基因具有如SEQID NO：19所示的核苷酸序列，pntB基因具有如SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列，ADH2基因具有如SEQ IDNO：21所示的核苷酸序列，ACS6基因具有如SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列，ALD6基因具有如SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列，EUTE基因具有如SEQID NO：24所示的核苷酸序列，ERG12基因具有如SEQ ID NO：25所示的核苷酸序列，IDI1基因具有如SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列，ERG10基因具有如SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列，MVD1基因具有如SEQ IDNO：28所示的核苷酸序列，ERG13基因具有如SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列，tHMG1基因具有如SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列，ERG8基因具有如SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列，yap1基因具有如SEQ ID NO：32所示的核苷酸序列。spt15-5基因具有如SEQ ID NO：51所示的核苷酸序列。taf25-3基因具有如SEQ ID NO：52所示的核苷酸序列。

ATGTCCCAAGCAACTGGGAACGAATTACTGGGTATCCTAGATCTGGATAACGATATAGACTTTGAAACTGCTTACCAAATGCTCAGCAGTAACTTCGACGACCAAATGTCTGCGCACATACATGAAAACACGTTTAGTGCAACTTCCCCTCCTCTGTTAACACACGAGCTCGGCATAATTCCTAACGTGGCAACCGTGCAACCCTCTCACGTAGAAACTATACCTGCCGATAACCAAACTCATCATGCTCCTTTGCATACTCATGCTCACTATCTAAATCACAACCCTCATCAACCAAGCATGGGTTTTGATCAAACGCTTGGTCTCAAGTTGTCTCCTTCCAGTTCGGGGTTGTTGAGCACGAATGAATCGAATGCCATTGAACAGTTTTTAGACAATCTAATATCACAGGATATGATGTCTTCCAACGCTTCCATGAACTCCGATTCACATCTACATATAAGATCACCAAAAAAGCAGCATAGGTATACCGAATTAAATCAAAGATATCCTGAAACACATCCACACAGTAACACAGGGGAGTTACCCACAAACACAGCAGATGTGCCAACTGAGTTCACCACGAGGGAAGGACCTCATCAGCCTATCGGCAATGACCACTACAACCCGCCACCGTTTTCAGTACCTGAGATACGAATCCCAGACTCTGATATTCCAGCCAATATCGAGGACGACCCTGTGAAGGTACGGAAATGGAAACACGTTCAAATGGAGAAGATACGAAGAATAAACACCAAAGAAGCCTTTGAAAGGCTCATTAAATCAGTAAGGACCCCACCAAAGGAAAACGGGAAAAGAATTCCCAAGCATATTCTTTTAACTTGTGTAATGAACGATATCAAGTCCATTAGAAGCGCAAATGAAGCACTACAGCACATACTGGATGATTCCTGA(SEQ ID NO：13)。

ATGACTAAGCAATACAAGAACTACGTTAACGGTGAATGGAAGTTGTCTGAAAACGAAATTAAAATCTATGAACCTGCTTCAGGTGCAGAATTAGGTTCCGTTCCAGCTATGAGTACAGAAGAAGTAGATTACGTTTACGCTTCTGCTAAGAAAGCCCAACCTGCTTGGAGAGCATTGTCATATATCGAAAGAGCTGCATACTTACATAAGGTTGCTGATATATTGATGAGAGACAAGGAAAAGATTGGTGCAATCTTATCTAAAGAAGTAGCCAAGGGTTATAAATCCGCTGTTAGTGAAGTTGTCAGAACCGCTGAAATTATAAACTACGCCGCTGAAGAAGGTTTAAGAATGGAAGGTGAAGTTTTGGAAGGTGGTTCTTTCGAAGCAGCCTCTAAAAAGAAAATTGCAGTAGTTAGAAGAGAACCTGTCGGTTTAGTATTGGCCATTTCCCCTTTCAATTATCCAGTAAACTTAGCTGGTAGTAAGATCGCCCCAGCTTTGATTGCTGGTAATGTTATAGCCTTTAAACCACCTACACAAGGTTCTATTTCAGGTTTGTTATTGGCAGAAGCCTTCGCTGAAGCAGGTTTGCCTGCTGGTGTTTTTAACACAATTACCGGTAGAGGTTCCGAAATCGGTGACTACATTGTCGAACACCAAGCTGTAAACTTCATCAACTTCACTGGTTCTACAGGTATAGGTGAAAGAATCGGTAAAATGGCTGGTATGAGACCAATTATGTTAGAATTGGGTGGTAAAGATTCTGCAATAGTTTTAGAAGATGCCGACTTAGAATTGACCGCTAAGAATATCATTGCCGGTGCTTTTGGTTATTCCGGTCAAAGATGTACTGCAGTCAAAAGAGTTTTAGTCATGGAAAGTGTTGCCGATGAATTGGTCGAAAAGATAAGAGAAAAGGTTTTGGCATTGACTATCGGTAATCCTGAAGATGACGCCGACATCACTCCATTGATCGATACAAAGTCAGCTGACTACGTTGAAGGTTTGATTAATGATGCAAACGACAAGGGTGCAACCGCCTTGACTGAAATTAAAAGAGAGGGTAACTTAATCTGCCCAATCTTGTTCGATAAGGTTACTACAGACATGAGATTAGCTTGGGAAGAACCATTTGGTCCTGTCTTGCCAATAATCAGAGTTACATCTGTCGAAGAAGCTATCGAAATATCTAATAAGTCAGAATATGGTTTGCAAGCATCAATCTTTACAAACGATTTCCCTAGAGCCTTTGGTATTGCTGAACAATTGGAAGTAGGTACCGTTCATATCAACAACAAGACACAAAGAGGTACCGATAATTTTCCATTCTTGGGTGCTAAGAAATCTGGTGCAGGTATCCAAGGTGTCAAATACTCCATTGAAGCTATGACCACTGTAAAGAGTGTCGTATTTGATATTAAATAA(SEQ IDNO：14)。

ATGTATCCAAGGGTCTATGAAGATTTCCAAAAGATCAGAGAAACATACGGTGATTTATCAGTTCTACCAACCAAAAATTTCCTAGCACCAGCAGAACCTGATGAAGAAATCGAAGTCACCATCGAACAAGGTAAGACTTTGATTATCAAATTGCAAGCTGTTGGTGACTTAAATAAGAAAACTGGGCAAAGAGAAGTGTATTTTGAATTGAACGGTGAATTAAGAAAGATCAGAGTTGCAGACAAGTCACAAAACATACAATCTGTTGCTAAACCAAAGGCTGATGTCCACGATACTCACCAAATCGGTGCACCAATGGCTGGTGTTATCATAGAAGTTAAAGTACATAAAGGGTCTTTGGTGAAAAAGGGCGAATCGATTGCTGTTTTGAGTGCCATGAAAATGGAAATGGTTGTCTCTTCACCAGCAGATGGTCAAGTTAAAGATGTTTTCATTAGGGATGGTGAAAGTGTTGACGCATCAGATTTGTTGGTTGTCCTAGAAGAAGAAACCCTACCCCCATCCCAAAAAAAGTAA(SEQ ID NO：15)。

ATGTGGCCTATTCAGCAATCGCGTTTATATTCTTCTAACACTAGATCGCATAAAGCTACCACAACAAGAGAAAATACTTTCCAAAAGCCATACAGCGACGAGGAGGTCACTAAAACACCCGTCGGTTCTCGCGCCAGAAAGATCTTCGAAGCTCCTCACCCACATGCCACTCGTTTGACTGTAGAAGGTGCCATAGAATGTCCCTTGGAGAGCTTTCAACTTTTAAACTCTCCTTTATTTAACAAGGGTTCTGCATTTACACAAGAAGAAAGGGAAGCGTTTAATTTAGAAGCATTGCTACCACCACAAGTGAACACTTTGGACGAACAACTGGAAAGAAGCTACAAGCAGTTATGCTATTTGAAGACGCCCTTGGCCAAAAACGACTTCATGACGTCTTTGAGAGTACAGAACAAAGTCCTATATTTTGCATTAATAAGGAAACATATCAAGGAATTAGTTCCTATCATTTACACCCCAACCGAAGGTGATGCTATTGCTGCCTATTCCCACAGGTTCAGAAAGCCAGAAGGTGTGTTTTTAGACATTACCGAACCTGATTCCATCGAACGTAGATTGGCTACATACGGTGGAGACAAAGATGTAGACTACATCGTTGTGTCGGATTCGGAAGGTATTCTGGGAATTGGTGACCAAGGTATCGGTGGTGTACGTATTGCTATCTCCAAATTGGCATTGATGACGCTGTGCGGTGGTATTCATCCCGGCCGTGTGCTACCTGTGTGTTTGGACGTCGGTACTAACAACAAGAAACTAGCCCGTGACGAATTGTACATGGGTAACAAGTTCTCCAGAATCAGGGGTAAGCAATATGACGACTTCTTGGAAAAATTCATCAAGGCCGTTAAGAAAGTGTATCCAAGCGCCGTTCTGCATTTCGAAGATTTCGGTGTTAAGAACGCTAGAAGATTGCTAGAAAAGTACAGGTACGAATTGCCATCATTCAACGATGACATTCAGGGCACCGGTGCCGTCGTGATGGCCTCGTTGATTGCTGCTTTGAAACATACCAACAGAGACTTGAAAGACACCAGAGTGCTTATTTACGGTGCCGGGTCTGCGGGCCTCGGTATCGCAGACCAAATTGTGAATCATATGGTCACGCACGGCGTTGACAAGGAAGAAGCGCGCAAGAAAATCTTCTTGATGGACAGACGTGGGTTAATTCTACAATCTTACGAGGCTAACTCCACTCCCGCCCAACACGTATACGCTAAGAGTGATGCGGAATGGGCTGGTATCAACACCCGCTCTTTACATGATGTGGTGGAGAACGTCAAACCAACGTGTTTGGTTGGCTGCTCCACACAAGCAGGCGCATTCACTCAAGATGTCGTAGAAGAAATGCACAAGCACAATCCTAGACCGATCATTTTCCCATTATCCAACCCTACTAGACTACACGAAGCCGTTCCTGCCGATTTAATGAAGTGGACCAACAACAACGCTCTTGTAGCTACCGGATCTCCTTTCCCACCTGTTGACGGTTACCGTATCTCGGAGAACAACAATTGTTACTCTTTCCCAGGTATCGGTTTAGGTGCCGTACTATCGCGTGCCACCACTATCACAGACAAGATGATCTCCGCTGCAGTGGACCAACTAGCCGAATTGTCGCCACTAAGAGAGGGCGACTCGAGACCTGGGTTGCTACCCGGCCTGGACACCATCACCAACACCTCTGCGCGTCTAGCTACCGCTGTGATCTTGCAAGCACTCGAGGAGGGAACCGCCCGTATCGAGCAAGAACAAGTACCGGGAGGAGCTCCCGGCGAAACTGTCAAGGTTCCTCGTGACTTTGACGAATGTTTACAGTGGGTCAAAGCCCAAATGTGGGAGCCTGTGTACAGACCTATGATCAAGGTCCAACATGACCCATCGGTGCACACCAACCAATTGTAG(SEQ ID NO：16)。

ATGCCTCACTCAGTTACACCATCCATAGAACAAGATTCGTTAAAAATTGCCATTTTAGGTGCTGCCGGTGGTATCGGGCAGTCGTTATCGCTGCTTTTGAAAGCTCAGTTGCAATACCAGTTAAAGGAGAGCAACCGGAGCGTTACCCACATTCATCTGGCTCTTTACGATGTCAACCAAGAAGCCATCAACGGTGTTACCGCCGACTTGTCTCATATAGACACCCCCATTTCCGTGTCGAGCCACTCTCCTGCAGGTGGCATTGAGAACTGTTTGCATAACGCTTCTATTGTTGTCATTCCTGCAGGTGTTCCAAGAAAACCTGGCATGACTCGTGATGACTTATTTAACGTGAATGCTGGTATCATTAGCCAGCTCGGTGATTCTATTGCAGAATGTTGTGATCTTTCCAAGGTCTTCGTTCTTGTCATTTCCAACCCTGTTAATTCTTTAGTCCCAGTGATGGTTTCTAACATTCTTAAGAACCATCCTCAGTCTAGAAATTCCGGCATTGAAAGAAGGATCATGGGTGTCACCAAGCTCGACATTGTCAGAGCGTCCACTTTTCTACGTGAGATAAACATTGAGTCAGGGCTAACTCCTCGTGTTAACTCCATGCCTGACGTCCCTGTAATTGGCGGGCATTCTGGCGAGACTATTATTCCGTTGTTTTCACAGTCAAACTTCCTATCGAGATTAAATGAGGATCAATTGAAATATTTAATACATAGAGTCCAATACGGTGGTGATGAAGTGGTCAAGGCCAAGAACGGTAAAGGTAGTGCTACCTTATCGATGGCCCATGCCGGTTATAAGTGTGTTGTCCAATTTGTTTCTTTGTTATTGGGTAACATTGAGCAGATCCATGGAACCTACTATGTGCCATTAAAAGATGCGAACAACTTCCCCATTGCTCCTGGGGCAGATCAATTATTGCCTCTGGTGGACGGTGCAGACTACTTTGCCATACCATTAACTATTACTACAAAGGGTGTTTCCTATGTGGATTATGACATCGTTAATAGGATGAACGACATGGAACGCAACCAAATGTTGCCAATTTGCGTCTCCCAGTTAAAGAAAAATATCGATAAGGGCTTGGAATTCGTTGCATCGAGATCTGCATCATCTTAA(SEQ ID NO：17)。

ATGTTTGTCAGGGTTAAATTGAATAAACCAGTAAAATGGTATAGGTTCTATAGTACGTTGGATTCACATTCCCTAAAGTTACAGAGCGGCTCGAAGTTTGTAAAAATAAAGCCAGTAAATAACTTGAGGAGTAGTTCATCAGCAGATTTCGTGTCCCCACCAAATTCCAAATTACAATCTTTAATCTGGCAGAACCCTTTACAAAATGTTTATATAACTAAAAAACCATGGACTCCATCCACAAGAGAAGCGATGGTTGAATTCATAACTCATTTACATGAGTCATACCCCGAGGTGAACGTCATTGTTCAACCCGATGTGGCAGAAGAAATTTCCCAGGATTTCAAATCTCCTTTGGAGAATGATCCCAACCGACCTCATATACTTTATACTGGTCCTGAACAAGATATCGTAAACAGAACAGACTTATTGGTGACATTGGGAGGTGATGGGACTATTTTACACGGCGTATCAATGTTCGGAAATACGCAAGTTCCTCCGGTTTTAGCATTTGCTCTGGGCACTCTGGGCTTTCTATTACCGTTTGATTTTAAGGAGCATAAAAAGGTCTTTCAGGAAGTAATCAGCTCTAGAGCCAAATGTTTGCATAGAACACGGCTAGAATGTCATTTGAAAAAAAAGGATAGCAACTCATCTATTGTGACCCATGCTATGAATGACATATTCTTACATAGGGGTAATTCCCCTCATCTCACTAACCTGGACATTTTCATTGATGGGGAATTTTTGACAAGAACGACAGCAGATGGTGTTGCATTGGCCACTCCAACGGGTTCCACAGCATATTCATTATCAGCAGGTGGATCTATTGTTTCCCCATTAGTCCCTGCTATTTTAATGACACCAATTTGTCCTCGCTCTTTGTCATTCCGACCACTGATTTTGCCTCATTCATCCCACATTAGGATAAAGATAGGTTCCAAATTGAACCAAAAACCAGTCAACAGTGTGGTAAAACTTTCTGTTGATGGTATTCCTCAACAGGATTTAGATGTTGGTGATGAAATTTATGTTATAAATGAGGTCGGCACTATATACATAGATGGTACTCAGCTTCCGACGACAAGAAAAACTGAAAATGACTTTAATAATTCAAAAAAGCCTAAAAGGTCAGGGATTTATTGTGTCGCCAAGACCGAGAATGACTGGATTAGAGGAATCAATGAACTTTTAGGATTCAATTCTAGCTTTAGGCTGACCAAGAGACAGACTGATAATGATTAA(SEQ ID NO：18)。

ATGCGAATTGGCATACCAAGAGAACGGTTAACCAATGAAACCCGTGTTGCAGCAACGCCAAAAACAGTGGAACAGCTGCTGAAACTGGGTTTTACCGTCGCGGTAGAGAGCGGCGCGGGTCAACTGGCAAGTTTTGACGATAAAGCGTTTGTGCAAGCGGGCGCTGAAATTGTAGAAGGGAATAGCGTCTGGCAGTCAGAGATCATTCTGAAGGTCAATGCGCCGTTAGATGATGAAATTGCGTTACTGAATCCTGGGACAACGCTGGTGAGTTTTATCTGGCCTGCGCAGAATCCGGAATTAATGCAAAAACTTGCGGAACGTAACGTGACCGTGATGGCGATGGACTCTGTGCCGCGTATCTCACGCGCACAATCGCTGGACGCACTAAGCTCGATGGCGAACATCGCCGGTTATCGCGCCATTGTTGAAGCGGCACATGAATTTGGGCGCTTCTTTACCGGGCAAATTACTGCGGCCGGGAAAGTGCCACCGGCAAAAGTGATGGTGATTGGTGCGGGTGTTGCAGGTCTGGCCGCCATTGGCGCAGCAAACAGTCTCGGCGCGATTGTGCGTGCATTCGACACCCGCCCGGAAGTGAAAGAACAAGTTCAAAGTATGGGCGCGGAATTCCTCGAGCTGGATTTTAAAGAGGAAGCTGGCAGCGGCGATGGCTATGCCAAAGTGATGTCGGACGCGTTCATCAAAGCGGAAATGGAACTCTTTGCCGCCCAGGCAAAAGAGGTCGATATCATTGTCACCACCGCGCTTATTCCAGGCAAACCAGCGCCGAAGCTAATTACCCGTGAAATGGTTGACTCCATGAAGGCGGGCAGTGTGATTGTCGACCTGGCAGCCCAAAACGGCGGCAACTGTGAATACACCGTGCCGGGTGAAATCTTCACTACGGAAAATGGTGTCAAAGTGATTGGTTATACCGATCTTCCGGGCCGTCTGCCGACGCAATCCTCACAGCTTTACGGCACAAACCTCGTTAATCTGCTGAAACTGTTGTGCAAAGAGAAAGACGGCAATATCACTGTTGATTTTGATGATGTGGTGATTCGCGGCGTGACCGTGATCCGTGCGGGCGAAATTACCTGGCCGGCACCGCCGATTCAGGTATCAGCTCAGCCGCAGGCGGCACAAAAAGCGGCACCGGAAGTGAAAACTGAGGAAAAATGTACCTGCTCACCGTGGCGTAAATACGCGTTGATGGCGCTGGCAATCATTCTTTTTGGCTGGATGGCAAGCGTTGCGCCGAAAGAATTCCTTGGGCACTTCACCGTTTTCGCGCTGGCCTGCGTTGTCGGTTATTACGTGGTGTGGAATGTATCGCACGCGCTGCATACACCGTTGATGTCGGTCACCAACGCGATTTCAGGGATTATTGTTGTCGGAGCACTGTTGCAGATTGGCCAGGGCGGCTGGGTTAGCTTCCTTAGTTTTATCGCGGTGCTTATAGCCAGCATTAATATTTTCGGTGGCTTCACCGTGACTCAGCGCATGCTGAAAATGTTCCGCAAAAATTAA(SEQ ID NO：19)

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ATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTGCACCGGGAAAGGTTATTATTTTTGGTGAACACTCTGCTGTGTACAACAAGCCTGCCGTCGCTGCTAGTGTGTCTGCGTTGAGAACCTACCTGCTAATAAGCGAGTCATCTGCACCAGATACTATTGAATTGGACTTCCCGGACATTAGCTTTAATCATAAGTGGTCCATCAATGATTTCAATGCCATCACCGAGGATCAAGTAAACTCCCAAAAATTGGCCAAGGCTCAACAAGCCACCGATGGCTTGTCTCAGGAACTCGTTAGTCTTTTGGATCCGTTGTTAGCTCAACTATCCGAATCCTTCCACTACCATGCAGCGTTTTGTTTCCTGTATATGTTTGTTTGCCTATGCCCCCATGCCAAGAATATTAAGTTTTCTTTAAAGTCTACTTTACCCATCGGTGCTGGGTTGGGCTCAAGCGCCTCTATTTCTGTATCACTGGCCTTAGCTATGGCCTACTTGGGGGGGTTAATAGGATCTAATGACTTGGAAAAGCTGTCAGAAAACGATAAGCATATAGTGAATCAATGGGCCTTCATAGGTGAAAAGTGTATTCACGGTACCCCTTCAGGAATAGATAACGCTGTGGCCACTTATGGTAATGCCCTGCTATTTGAAAAAGACTCACATAATGGAACAATAAATACAAACAATTTTAAGTTCTTAGATGATTTCCCAGCCATTCCAATGATCCTAACCTATACTAGAATTCCAAGGTCTACAAAAGATCTTGTTGCTCGCGTTCGTGTGTTGGTCACCGAGAAATTTCCTGAAGTTATGAAGCCAATTCTAGATGCCATGGGTGAATGTGCCCTACAAGGCTTAGAGATCATGACAAAGTTAAGTAAATGTAAAGGCACCGATGACGAGGCCGTAGAAACTAATAATGAACTGTATGAACAACTATTGGAATTGATAAGAATAAATCATGGACTGCTTGTCTCAATCGGTGTTTCTCATCCTGGATTAGAACTTATTAAAAATCTGAGCGATGATTTGAGAATTGGCTCCACAAAACTTACCGGTGCTGGTGGCGGCGGTTGCTCTTTGACTTTGTTACGAAGAGACATTACTCAAGAGCAAATTGACAGTTTCAAAAAGAAATTGCAAGATGATTTTAGTTACGAGACATTTGAAACAGACTTGGGTGGGACTGGCTGCTGTTTGTTAAGCGCAAAAAATTTGAATAAAGATCCTAAAATCAAATCCCTAGTATTCCAATTATTTGAAAATAAAACTACCACAAAGCAACAAATTGACGATCTATTATTGCCAGGAAACACGAATTTACCATGGACTTCATAA(SEQ ID NO：25)。

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ATGACCGTTTACACAGCATCCGTTACCGCACCCGTCAACATCGCAACCCTTAAGTATTGGGGGAAAAGGGACACGAAGTTGAATCTGCCCACCAATTCGTCCATATCAGTGACTTTATCGCAAGATGACCTCAGAACGTTGACCTCTGCGGCTACTGCACCTGAGTTTGAACGCGACACTTTGTGGTTAAATGGAGAACCACACAGCATCGACAATGAAAGAACTCAAAATTGTCTGCGCGACCTACGCCAATTAAGAAAGGAAATGGAATCGAAGGACGCCTCATTGCCCACATTATCTCAATGGAAACTCCACATTGTCTCCGAAAATAACTTTCCTACAGCAGCTGGTTTAGCTTCCTCCGCTGCTGGCTTTGCTGCATTGGTCTCTGCAATTGCTAAGTTATACCAATTACCACAGTCAACTTCAGAAATATCTAGAATAGCAAGAAAGGGGTCTGGTTCAGCTTGTAGATCGTTGTTTGGCGGATACGTGGCCTGGGAAATGGGAAAAGCTGAAGATGGTCATGATTCCATGGCAGTACAAATCGCAGACAGCTCTGACTGGCCTCAGATGAAAGCTTGTGTCCTAGTTGTCAGCGATATTAAAAAGGATGTGAGTTCCACTCAGGGTATGCAATTGACCGTGGCAACCTCCGAACTATTTAAAGAAAGAATTGAACATGTCGTACCAAAGAGATTTGAAGTCATGCGTAAAGCCATTGTTGAAAAAGATTTCGCCACCTTTGCAAAGGAAACAATGATGGATTCCAACTCTTTCCATGCCACATGTTTGGACTCTTTCCCTCCAATATTCTACATGAATGACACTTCCAAGCGTATCATCAGTTGGTGCCACACCATTAATCAGTTTTACGGAGAAACAATCGTTGCATACACGTTTGATGCAGGTCCAAATGCTGTGTTGTACTACTTAGCTGAAAATGAGTCGAAACTCTTTGCATTTATCTATAAATTGTTTGGCTCTGTTCCTGGATGGGACAAGAAATTTACTACTGAGCAGCTTGAGGCTTTCAACCATCAATTTGAATCATCTAACTTTACTGCACGTGAATTGGATCTTGAGTTGCAAAAGGATGTTGCCAGAGTGATTTTAACTCAAGTCGGTTCAGGCCCACAAGAAACAAACGAATCTTTGATTGACGCAAAGACTGGTCTACCAAAGGAATAA(SEQ ID NO：28)。

ATGAAACTCTCAACTAAACTTTGTTGGTGTGGTATTAAAGGAAGACTTAGGCCGCAAAAGCAACAACAATTACACAATACAAACTTGCAAATGACTGAACTAAAAAAACAAAAGACCGCTGAACAAAAAACCAGACCTCAAAATGTCGGTATTAAAGGTATCCAAATTTACATCCCAACTCAATGTGTCAACCAATCTGAGCTAGAGAAATTTGATGGCGTTTCTCAAGGTAAATACACAATTGGTCTGGGCCAAACCAACATGTCTTTTGTCAATGACAGAGAAGATATCTACTCGATGTCCCTAACTGTTTTGTCTAAGTTGATCAAGAGTTACAACATCGACACCAACAAAATTGGTAGATTAGAAGTCGGTACTGAAACTCTGATTGACAAGTCCAAGTCTGTCAAGTCTGTCTTGATGCAATTGTTTGGTGAAAACACTGACGTCGAAGGTATTGACACGCTTAATGCCTGTTACGGTGGTACCAACGCGTTGTTCAACTCTTTGAACTGGATTGAATCTAACGCATGGGATGGTAGAGACGCCATTGTAGTTTGCGGTGATATTGCCATCTACGATAAGGGTGCCGCAAGACCAACCGGTGGTGCCGGTACTGTTGCTATGTGGATCGGTCCTGATGCTCCAATTGTATTTGACTCTGTAAGAGCTTCTTACATGGAACACGCCTACGATTTTTACAAGCCAGATTTCACCAGCGAATATCCTTACGTCGATGGTCATTTTTCATTAACTTGTTACGTCAAGGCTCTTGATCAAGTTTACAAGAGTTATTCCAAGAAGGCTATTTCTAAAGGGTTGGTTAGCGATCCCGCTGGTTCGGATGCTTTGAACGTTTTGAAATATTTCGACTACAACGTTTTCCATGTTCCAACCTGTAAATTGGTCACAAAATCATACGGTAGATTACTATATAACGATTTCAGAGCCAATCCTCAATTGTTCCCAGAAGTTGACGCCGAATTAGCTACTCGCGATTATGACGAATCTTTAACCGATAAGAACATTGAAAAAACTTTTGTTAATGTTGCTAAGCCATTCCACAAAGAGAGAGTTGCCCAATCTTTGATTGTTCCAACAAACACAGGTAACATGTACACCGCATCTGTTTATGCCGCCTTTGCATCTCTATTAAACTATGTTGGATCTGACGACTTACAAGGCAAGCGTGTTGGTTTATTTTCTTACGGTTCCGGTTTAGCTGCATCTCTATATTCTTGCAAAATTGTTGGTGACGTCCAACATATTATCAAGGAATTAGATATTACTAACAAATTAGCCAAGAGAATCACCGAAACTCCAAAGGATTACGAAGCTGCCATCGAATTGAGAGAAAATGCCCATTTGAAGAAGAACTTCAAACCTCAAGGTTCCATTGAGCATTTGCAAAGTGGTGTTTACTACTTGACCAACATCGATGACAAATTTAGAAGATCTTACGATGTTAAAAAATAA(SEQ ID NO：29)。

ATGGTTTTAACCAATAAAACAGTCATTTCTGGATCGAAAGTCAAAAGTTTATCATCTGCGCAATCGAGCTCATCAGGACCTTCATCATCTAGTGAGGAAGATGATTCCCGCGATATTGAAAGCTTGGATAAGAAAATACGTCCTTTAGAAGAATTAGAAGCATTATTAAGTAGTGGAAATACAAAACAATTGAAGAACAAAGAGGTCGCTGCCTTGGTTATTCACGGTAAGTTACCTTTGTACGCTTTGGAGAAAAAATTAGGTGATACTACGAGAGCGGTTGCGGTACGTAGGAAGGCTCTTTCAATTTTGGCAGAAGCTCCTGTATTAGCATCTGATCGTTTACCATATAAAAATTATGACTACGACCGCGTATTTGGCGCTTGTTGTGAAAATGTTATAGGTTACATGCCTTTGCCCGTTGGTGTTATAGGCCCCTTGGTTATCGATGGTACATCTTATCATATACCAATGGCAACTACAGAGGGTTGTTTGGTAGCTTCTGCCATGCGTGGCTGTAAGGCAATCAATGCTGGCGGTGGTGCAACAACTGTTTTAACTAAGGATGGTATGACAAGAGGCCCAGTAGTCCGTTTCCCAACTTTGAAAAGATCTGGTGCCTGTAAGATATGGTTAGACTCAGAAGAGGGACAAAACGCAATTAAAAAAGCTTTTAACTCTACATCAAGATTTGCACGTCTGCAACATATTCAAACTTGTCTAGCAGGAGATTTACTCTTCATGAGATTTAGAACAACTACTGGTGACGCAATGGGTATGAATATGATTTCTAAAGGTGTCGAATACTCATTAAAGCAAATGGTAGAAGAGTATGGCTGGGAAGATATGGAGGTTGTCTCCGTTTCTGGTAACTACTGTACCGACAAAAAACCAGCTGCCATCAACTGGATCGAAGGTCGTGGTAAGAGTGTCGTCGCAGAAGCTACTATTCCTGGTGATGTTGTCAGAAAAGTGTTAAAAAGTGATGTTTCCGCATTGGTTGAGTTGAACATTGCTAAGAATTTGGTTGGATCTGCAATGGCTGGGTCTGTTGGTGGATTTAACGCACATGCAGCTAATTTAGTGACAGCTGTTTTCTTGGCATTAGGACAAGATCCTGCACAAAATGTTGAAAGTTCCAACTGTATAACATTGATGAAAGAAGTGGACGGTGATTTGAGAATTTCCGTATCCATGCCATCCATCGAAGTAGGTACCATCGGTGGTGGTACTGTTCTAGAACCACAAGGTGCCATGTTGGACTTATTAGGTGTAAGAGGCCCGCATGCTACCGCTCCTGGTACCAACGCACGTCAATTAGCAAGAATAGTTGCCTGTGCCGTCTTGGCAGGTGAATTATCCTTATGTGCTGCCCTAGCAGCCGGCCATTTGGTTCAAAGTCATATGACCCACAACAGGAAACCTGCTGAACCAACAAAACCTAACAATTTGGACGCCACTGATATAAATCGTTTGAAAGATGGGTCCGTCACCTGCATTAAATCCTAA(SEQID NO：30)

ATGTCAGAGTTGAGAGCCTTCAGTGCCCCAGGGAAAGCGTTACTAGCTGGTGGATATTTAGTTTTAGATACAAAATATGAAGCATTTGTAGTCGGATTATCGGCAAGAATGCATGCTGTAGCCCATCCTTACGGTTCATTGCAAGGGTCTGATAAGTTTGAAGTGCGTGTGAAAAGTAAACAATTTAAAGATGGGGAGTGGCTGTACCATATAAGTCCTAAAAGTGGCTTCATTCCTGTTTCGATAGGCGGATCTAAGAACCCTTTCATTGAAAAAGTTATCGCTAACGTATTTAGCTACTTTAAACCTAACATGGACGACTACTGCAATAGAAACTTGTTCGTTATTGATATTTTCTCTGATGATGCCTACCATTCTCAGGAGGATAGCGTTACCGAACATCGTGGCAACAGAAGATTGAGTTTTCATTCGCACAGAATTGAAGAAGTTCCCAAAACAGGGCTGGGCTCCTCGGCAGGTTTAGTCACAGTTTTAACTACAGCTTTGGCCTCCTTTTTTGTATCGGACCTGGAAAATAATGTAGACAAATATAGAGAAGTTATTCATAATTTAGCACAAGTTGCTCATTGTCAAGCTCAGGGTAAAATTGGAAGCGGGTTTGATGTAGCGGCGGCAGCATATGGATCTATCAGATATAGAAGATTCCCACCCGCATTAATCTCTAATTTGCCAGATATTGGAAGTGCTACTTACGGCAGTAAACTGGCGCATTTGGTTGATGAAGAAGACTGGAATATTACGATTAAAAGTAACCATTTACCTTCGGGATTAACTTTATGGATGGGCGATATTAAGAATGGTTCAGAAACAGTAAAACTGGTCCAGAAGGTAAAAAATTGGTATGATTCGCATATGCCAGAAAGCTTGAAAATATATACAGAACTCGATCATGCAAATTCTAGATTTATGGATGGACTATCTAAACTAGATCGCTTACACGAGACTCATGACGATTACAGCGATCAGATATTTGAGTCTCTTGAGAGGAATGACTGTACCTGTCAAAAGTATCCTGAAATCACAGAAGTTAGAGATGCAGTTGCCACAATTAGACGTTCCTTTAGAAAAATAACTAAAGAATCTGGTGCCGATATCGAACCTCCCGTACAAACTAGCTTATTGGATGATTGCCAGACCTTAAAAGGAGTTCTTACTTGCTTAATACCTGGTGCTGGTGGTTATGACGCCATTGCAGTGATTACTAAGCAAGATGTTGATCTTAGGGCTCAAACCGCTAATGACAAAAGATTTTCTAAGGTTCAATGGCTGGATGTAACTCAGGCTGACTGGGGTGTTAGGAAAGAAAAAGATCCGGAAACTTATCTTGATAAATAG(SEQID NO：31)。

ATGAGTGTGTCTACCGCCAAGAGGTCGCTGGATGTCGTTTCTCCGGGTTCATTAGCGGAGTTTGAGGGTTCAAAATCTCGTCACGATGAAATAGAAAATGAACATAGACGTACTGGTACACGTGATGGCGAGGATAGCGAGCAACCGAAGAAGAAGGGTAGCAAAACTAGCAAAAAGCAAGATTTGGATCCTGAAACTAAGCAGAAGAGGACTGCCCAAAATCGGGCCGCTCAAAGAGCTTTTAGGGAACGTAAGGAGAGGAAGATGAAGGAATTGGAGAAGAAGGTACAAAGTTTAGAGAGTATTCAGCAGCAAAATGAAGTGGAAGCTACTTTTTTGAGGGACCAGTTAATCACTCTGGTGAATGAGTTAAAAAAATATAGACCAGAGACAAGAAATGACTCAAAAGTGCTGGAATATTTAGCAAGGCGAGATCCTAATTTGCATTTTTCAAAAAATAACGTTAACCACAGCAATAGCGAGCCAATTGACACACCCAATGATGACATACAAGAAAATGTTAAACAAAAGATGAATTTCACGTTTCAATATCCGCTTGATAACGACAACGACAACGACAACAGTAAAAATGTGGGGAAACAATTACCTTCACCAAATGATCCAAGTCATTCGGCTCCTATGCCTATAAATCAGACACAAAAGAAATTAAGTGACGCTACAGATTCCTCCAGCGCTACTTTGGATTCCCTTTCAAATAGTAACGATGTTCTTAATAACACACCAAACTCCTCCACTTCGATGGATTGGTTAGATAATGTAATATATACTAACAGGTTTGTGTCAGGTGATGATGGCAGCAATAGTAAAACTAAGAATTTAGACAGTAATATGTTTTCTAATGACTTTAATTTTGAAAACCAATTTGATGAACAAGTTTCGGAGTTTTGTTCGAAAATGAACCAGGTATGTGGAACAAGGCAATGTCCCATTCCCAAGAAACCCATCTCGGCTCTTGATAAAGAAGTTTTCGCGTCATCTTCTATACTAAGTTCAAATTCTCCTGCTTTAACAAATACTTGGGAATCACATTCTAATATTACAGATAATACTCCTGCTAATGTCATTGCTACTGATGCTACTAAATATGAAAATTCCTTCTCCGGTTTTGGCCGACTTGGTTTCGATATGAGTGCCAATCATTACGTCGTGAATGATAATAGCACTGGTAGCACTGATAGCACTGGTAGCACTGGCAATAAGAACAAAAAGAACAATAATAATAGCGATGATGTACTCCCATTCATATCCGAGTCACCGTTTGATATGAACCAAGTTACTAATTTTTTTAGTCCGGGATCTACCGGCATCGGCAATAATGCTGCCTCTAACACCAATCCCAGCCTACTGCAAAGCAGCAAAGAGGATATACCTTTTATCAACGCAAATCTGGCTTTCCCAGACGACAATTCAACTAATATTCAATTACAACCTTTCTCTGAATCTCAATCTCAAAATAAGTTTGACTACGACATGTTTTTTAGAGATTCATCGAAGGAAGGTAACAATTTATTTGGAGAGTTTTTAGAGGATGACGATGATGACAAAAAAGCCGCTAATATGTCAGACGATGAGTCAAGTTTAATCAAGAACCAGTTAATTAACGAAGAACCAGAGCTTCCGAAACAATATCTACAATCGGTACCAGGAAATGAAAGCGAAATCTCACAAAAAAATGGCAGTAGTTTACAGAATGCTGACAAAATCAATAATGGCAATGATAACGATAATGATAATGATGTCGTTCCATCTAAGGAAGGCTCTTTACTAAGGTGTTCGGAAATTTGGGATAGAATAACAACACATCCGAAATACTCAGATATTGATGTCGATGGTTTATGTTCCGAGCTAATGGCAAAGGCAAAATGTTCAGAAAGAGGGGTTGTCATCAATGCAGAAGACGTTCAATTAGCTTTGAATAAGCATATGAACTAA(SEQ ID NO：32)。

ATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGGAGTTTAAAGGGGCAAACAAGATAGTGTTTGATCCAAATACCAGACAAGTATGGGAAAACCAGAATCGAGATGGAACAAAACCAGCAACTACTTTCCAGAGTGAAGAGGTCATAAAAAGAGCTGCCCCAGAATCTGAAAAAGACACCTCCGCCACATCAAGTATTGTTCCAGAGCTATAGAACATTGTGGCAACTGTGACTTTGGGGAGCAGGTTAGATCTGAAAACAGTTGCGCTACATGCCCGTATGCAGAATATAACCCCTAGCGTTTTGCTGCTGTCATCATGCGTATAGAGAGCCAAAAACTACAGCTTTAATTTTTGCCTCAGGGAAAATGGTTGTTACCGGTGCAAAAAGTGAGGATGACTCAAAGCTGGCCAGAAGAATATATGCAGGAATTATCCAAAAAATCAGGTTTGCAGCTAAATTCACAGACTTCAAAATACAAAATATTGTCGGTTCGTGTGACGTTAATTTCCCTATACGTCTAGAAGGGTTAGCATTCAGTCATGGTACTTTCTCCTCCTATGAGCCAGAATTGTTTCCTGGTTTGATCTATAGAATGGTGAAGCCGAAAATTGTGTTGTTAATTTTTGTTTCAGGAAAGATTGTTCTTCTGGAGCAAAGCAAAGGGAGGAAATTTACCAAGCTTTTGAAGCTATATACCCAGTTCTAAGTGAATTTAGAAAAATGTGA(SEQ ID NO：51)

ATGGATTTTGAGGAAGATTACGATGCGGAGTTTGATGATAATCAAGAAGGACAATTAGAAACACCTTTTCCATCGGTTGCGGGAGCCGATGATGGGGACAATGATAATGATGACTCTGTCGCAGAAAACATGAAGAAGAAGCAAAAGAGAGAGGCTGTAGTGGATGATGGGAGTGAAAATGCATTTGGTATACCCGAATTTACAAGAAAAGATAAGACTCTGGAGGAGATTTTAGAGATGATGGACAGTACTCCTCCTATCATTCCCGATGCAGTAATAGACTACTATTTAACCAAAAACGGGTTTAACGTAGCATATGTACAAGTGAAACGACTTTTAGCACTTGCTACTCAGAAATTTGTTAGTGATATAGCTAAGGATGCCTACGAATATTCCAGGATCAGGTCTTCCGTAGCGGTATCTAATGCTAACAACAGTCAGGCGAGAGCTAGGCAGCTATTGCAAGGACAGCGACAGACTGGCGTGCAGCAGATTTCACAACAACAACATCAACAGAATGAGAAGACTACAGCAAGCATAGTTGTTCTGACGGTGAACGATCCCAGTAGCGCTGTTGCTGAATACGGGCTCAATATAGGTCGCCCAGACTTTTATCGTTAG(SEQ ID NO：52)

实施例8新一代工程菌株的构建

根据实施例1～7，将有效果的改造进行叠加组合，如将有效果的敲除基因Ypl062W,Yer130C,Yer134c,Exg1等两两组合进行敲除，结果显示双基因敲除会得到产量更高的菌株。

在此基础上，我们将有效果的改造进行叠加组合，形成新一代的工程菌株，菌株特性如下表4.

表4.新一代工程菌株的特征

注：“√”代表该基因被敲除，"+"代表该基因过表达一个拷贝，"*"代表该基因过表达至少2个拷贝，“-”代表该基因不被操作(即不被敲除或不过表达)

更进一步，发明人通过研究证明，新一代工程菌株J1011-B-37～84具有高产番茄红素的性能。

实施例9新二代工程菌株的构建

在上一代工程菌株的基础上，我们挑选了18个优势菌株，在此基础上构建了新二代的工程菌株探究gapN和EUTE基因对番茄红素产量的影响，菌株特性如下表5.

表5.新二代工程菌株的特征

注：“√”代表该基因被过表达，“-”代表该基因不被过表达

更进一步，发明人通过研究证明，新一代工程菌株J1011-B-85～138具有高产番茄红素的性能。

实施例10工程菌摇瓶培养发酵过程

在本实施例中，发明人详细介绍了实施例1～9所获得的工程菌株的发酵培养过程。

摇瓶发酵采用两级种子培养，将平板上的重组菌株挑到含有5mL YPD培养基的PA瓶中，30度摇床摇起一级种子液，过夜培养(一般14-18h)后，菌体长到对数生长期(OD在5-8左右)，再以1％的接种量将菌株转移到含有50mL YPD培养基的250mL摇瓶中，摇瓶培养得到二级种子液。约14-18h后，测二级种子的OD₆₀₀值，然后计算接种到含有200mL发酵培养基YPDG的500mL摇瓶中，使菌体终浓度OD600＝0.5，需要多少的二级种子液，然后取出算出的体积并离心，去掉上清，再用对应的发酵培养基将菌体悬浮并加入相应的500mL摇瓶中，置于30度摇床开始摇瓶发酵。每隔一段时间(约4h)取样测定细胞浓度，并在8h后将摇瓶上的报纸去掉，约48h后开始取样存于-80度冰箱留待测定番茄红素的产生情况。

实施例11产物萃取方式比较

在本实施例中，发明人对发酵处理后所获得的产物进行萃取的方式进行了筛选，筛选过程如下所述。

方法一：从冰箱中取出样品解冻，取500μL发酵液于15mL离心管(冰上预冷)中，5000g 4度离心2min来收集菌体，去上清后再用1mL纯水重悬洗涤菌体，再加入1mL 3N的HCl并沸水浴3min来破碎细胞，离心去掉HCl后用水洗涤一次。再向其中加入1mL的丙酮(HPLC级别)，0.2g玻璃珠，1％的抗氧化剂，震荡5min，然后5000g 4度离心2min，转移上清到50mL的离心管中；再次重复加入上述提取液，并震荡，然后收集萃取液，直至菌体无明显黄色；混匀收集到的丙酮萃取液，取出2mL，12000rpm离心10分钟，再取上清1.2mL至棕色的HPLC进样瓶中，进行HPLC分析。

方法二：从冰箱中取出样品解冻，取500μL发酵液于15mL离心管(冰上预冷)中，5000g 4度离心2min来收集菌体，去上清后再用1mL纯水重悬并洗涤菌体。再向其中加入4mL的丙酮(HPLC级别)，0.2g玻璃珠，1％的抗氧化剂，震荡5min，然后冰浴超声5-10min，然后5000g 4度离心2min，转移上清到50mL的离心管中；再次重复加入上述提取液，并震荡，然后收集萃取液，直至菌体无明显黄色；混匀收集到的丙酮萃取液，取出2mL，12000rpm离心10分钟，再取上清1.2mL至棕色的HPLC进样瓶中，进行HPLC分析。

检测方法：番茄红素的检测使用四元HPLC进行的，检测器是紫外检测器，番茄红素的吸收波长是474nm，色谱柱Agilent Zorbax C18(150mm*4.6mm*5μm)，流动相A(乙腈：水＝9：1)和流动相B(甲醇：异丙醇＝3：2)按如下条件分析：0-90％B(0-15min)，90％B(15-30min)，90％-0B(30-35min)，流速1mL/min。

结果显示：方法一中产物经盐酸煮过后，番茄红素会降解，产量检测不稳定，且该方法得到的样品间隔一段时间再检测，甚至能从100mg/L降解到10mg/L，方法二得到的样品比较稳定，间隔一段时间再检测，只从100mg/L到90mg/L。说明方法二的提取方案比方法一更稳定更好。

实施例12工程菌发酵罐培养发酵方法比较

在本实施例中，发明人对发酵培养基的条件进行了优化筛选，实验过程如下所述：

本实施例中的菌种采用J1011-B-3，种子培养基采用YPD培养基，发酵培养基采用摇瓶优化过的4种培养基进一步探索发酵罐水平的最优培养基，各种培养基配方如下：

①培养基2号:YPD含盐培养基

2.5L分批培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，0.8％KH₂PO₄和2％葡萄糖；

1L葡萄糖补料培养基：500g/L葡萄糖，5g/L MgSO₄，3.5g/L K₂SO₄，0.28g/L Na₂SO₄，10g/L酵母提取物。

1L乙醇补料培养基:100％乙醇。

②培养基5号：YPD丰富培养基

2.5L分批培养基：60g蛋白胨，30酵母提取物和30g葡萄糖(比YPD更加丰富)；

1L补料培养基1：500g/L葡萄糖，15g/L酵母抽提物

500mL补料培养基2:300mL无水乙醇,100ml甘油，100mL纯水。

上罐培养采用fed-batch方式，首先是分批培养，待碳源葡糖糖基本消耗完后开始补料，补料采用两级补料方式，分别为葡萄糖补料阶段(用于合成生物量)和乙醇甘油补料阶段(用于产物合成)。具体方法如下。

将发酵罐装入少量纯水后115度进行空灭30分钟。配制分批培养的发酵液以及补料液，校准发酵罐的pH电极，夹住发酵罐的各个管路，115度灭菌30分钟。取出发酵罐，连接空气管路，进行少量通气(0.1vvm左右即可)，同时打开冷却水装置进行冷却。待温度降至50度左右时，打开转速至100rpm。校准溶氧电极。未连接线路的状态设定溶氧值为0％，随后将转速升至600rpm，同时将通气量调至2vvm，连接溶氧电极线路，待溶氧稳定后设定该值为100％。随后将通气量和转速降低至发酵所需值(通气量1.5vvm，转速300rpm-600rpm)。先自然pH，将温度调节至30度。开始接种，初始接种OD调至0.5，所需种子液体积根据公式进行计算。(如发酵液体积为2500mL，种子液OD值为n，则接种种子液体积为2500x0.5/n mL)。开始发酵后，上罐时培养基用2M NaOH来控制pH值为5.5，初始通气量为1.5vvm，初始搅拌速率设置为300rpm，溶氧维持在30％以上(关联搅拌速率，300-600rpm)。

发酵程序：当分批培养时葡萄糖浓度降至2g/L左右时开始补料葡萄糖，初始补料速率为10mL/L发酵液/h，以维持发酵液中葡萄糖的残留浓度在2-3g/L左右(不要降至0g/L)，每两个小时取样测量一次OD600值和检测一次葡萄糖含量，当葡萄糖浓度低于1g/L时增加补料速率。当OD值增加缓慢时(开始进入稳定期)停止补料葡萄糖，此时开始监测乙醇残留量，当乙醇浓度降至5-10g/L时开始补料乙醇甘油，初始补料速率为2mL/L发酵液/h。随后每4h取样检测一次乙醇和甘油含量，当调整补料速率使乙醇和甘油维持在5-10g/L范围内。颜色有变化后开始提取产物检测产物变化，当番茄红素浓度不再增加时结束发酵。

产物检测方式与实施例9中方法二相同。

结果显示:培养基5号产量优于培养基2号，所以该培养基为最优培养基，发酵策略是优化的两步补料发酵，先补葡萄糖长菌体，在生长的稳定期补乙醇来提高产量。

实施例13菌株的上罐发酵培养

在本实施例中，发明人按照实施例12中得到的最佳发酵培养方式对构建的部分工程菌株进行了发酵，结果如表6所示。

表6：

可以看出，根据本发明实施例构建的工程菌株具有高产番茄红素的性能。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉生物技术研究院

<120> 微生物及其用途

<130> PIDC3171654

<160> 34

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5136

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 敲除盒片段1的核苷酸序列

<400> 1

ataacgagaa cacacagggg cgctatcgca cagaatcaaa ttcgatgact ggaaattttt 60

tgttaatttc agaggtcgcc tgacgcatat acctttttca actgaaaaat tgggagaaaa 120

aggaaaggtg agagcgccgg aaccggcttt tcatatagaa tagagaagcg ttcatgacta 180

aatgcttgca tcacaatact tgaagttgac aatattattt aaggacctat tgttttttcc 240

aataggtggt tagcaatcgt cttactttct aacttttctt accttttaca tttcagcaat 300

atatatatat atatttcaag gatataccat tctaatgtct gcccctaaga agatcgtcgt 360

tttgccaggt gaccacgttg gtcaagaaat cacagccgaa gccattaagg ttcttaaagc 420

tatttctgat gttcgttcca atgtcaagtt cgatttcgaa aatcatttaa ttggtggtgc 480

tgctatcgat gctacaggtg ttccacttcc agatgaggcg ctggaagcct ccaagaaggc 540

tgatgccgtt ttgttaggtg ctgtgggtgg tcctaaatgg ggtaccggta gtgttagacc 600

tgaacaaggt ttactaaaaa tccgtaaaga acttcaattg tacgccaact taagaccatg 660

taactttgca tccgactctc ttttagactt atctccaatc aagccacaat ttgctaaagg 720

tactgacttc gttgttgtca gagaattagt gggaggtatt tactttggta agagaaagga 780

agacgatggt gatggtgtcg cttgggatag tgaacaatac accgttccag aagtgcaaag 840

aatcacaaga atggccgctt tcatggccct acaacatgag ccaccattgc ctatttggtc 900

cttggataaa gctaatgttt tggcctcttc aagattatgg agaaaaactg tggaggaaac 960

catcaagaac gaattcccta cattgaaggt tcaacatcaa ttgattgatt ctgccgccat 1020

gatcctagtt aagaacccaa cccacctaaa tggtattata atcaccagca acatgtttgg 1080

tgatatcatc tccgatgaag cctccgttat cccaggttcc ttgggtttgt tgccatctgc 1140

gtccttggcc tctttgccag acaagaacac cgcatttggt ttgtacgaac catgccacgg 1200

ttctgctcca gatttgccaa agaataaggt caaccctatc gccactatct tgtctgctgc 1260

aatgatgttg aaattgtcat tgaacttgcc tgaagaaggt aaggccattg aagatgcagt 1320

taaaaaggtt ttggatgcag gtatcagaac tggtgattta ggtggttcca acagtaccac 1380

cgaagtcggt gatgctgtcg ccgaagaagt taagaaaatc cttgcttaaa tttaactcct 1440

taagttactt taatgattta gtttttatta ttaataattc atgctcatga catctcatat 1500

acacgtttat aaaacttaaa tagattgaaa atgtattaaa gattcctcag ggattcgatt 1560

tttttggaag tttttgtttt tttttccttg agatgctgta gtatttggga acaattatac 1620

aatcgaaaga tatatgctta cattcgaccg ttttagccgt gatcattatc ctatagtaac 1680

ataacctgaa gcataactga cactactatc atcaatactt gtcacatgag aactctgtga 1740

ataattaggc cactgaaatt tgatgcctga aggaccggca tcacggattt tcgataaagc 1800

acttagtatc acactaattg gcttttcgcg caaattaaag ccttcgagcg tcccaaaacc 1860

ttctcaagca aggttttcag tataatgtta catgcgtaca cgcgtttgta cagaaaaaaa 1920

agaaaaattt gaaatataaa taacgttctt aatactaaca taactataaa aaaataaata 1980

gggacctaga cttcaggttg tctaactcct tccttttcgg ttagagcgga tgtgggggga 2040

gggcgtgaat gtaagcgtga cataactaat tacatgatat cgacaaagga aaaggggcct 2100

gtttatattg aattttcaaa aattcttact ttttttttgg atggacgcaa agaagtttaa 2160

taatcatatt acatggcaat accaccatat acatatccat atctaatctt acttatatgt 2220

tgtggaaatg taaagagccc cattatctta gcctaaaaaa accttctctt tggaactttc 2280

agtaatacgc ttaactgctc attgctatat tgaagtacgg attagaagcc gccgagcggg 2340

cgacagccct ccgacggaag actctcctcc gtgcgtcctg gtcttcaccg gtcgcgttcc 2400

tgaaacgcag atgtgcctcg cgccgcactg ctccgaacaa taaagattct acaatactag 2460

cttttatggt tatgaagagg aaaaattggc agtaacctgg ccccacaaac cttcaaatca 2520

acgaatcaaa ttaacaacca taggataata atgcgattag ttttttagcc ttatttctgg 2580

ggtaattaat cagcgaagcg atgatttttg atctattaac agatatataa atgcaaaagc 2640

tgcataacca ctttaactaa tactttcaac attttcggtt tgtattactt cttattcaaa 2700

tgtcataaaa gtatcaacaa aaaattgtta atatacctct atactttaac gtcaaggaga 2760

aaaaactata atggcttata ccgcaatggc agcaggaact cagtcattgc agttgaggac 2820

agtcgcctct taccaggagt gcaactcaat gaggtcttgc ttcaagttga ccccattcaa 2880

gtcattccac ggtgtcaact tcaacgttcc ttctttaggt gccgccaact gcgaaatcat 2940

gggtcacttg aaattgggtt ctttgccata caaacagtgt tcagtatcat ctaagtcaac 3000

taagactatg gcccagttgg tagatttggc agagaccgag aaagccgagg gaaaggatat 3060

cgagttcgat tttaacgagt atatgaagtc taaggctgtc gctgttgatg cagccttgga 3120

taaggccatc cctttggagt atccagagaa gatccatgag tctatgaggt actcattgtt 3180

ggccggagga aaaagggtca gacctgcatt atgcatcgct gcttgcgagt tagtaggtgg 3240

ttctcaggac ttggccatgc caaccgcatg tgccatggaa atgattcata ccatgtcatt 3300

gattcacgat gatttgcctt gcatggacaa cgacgacttc agaaggggaa agcctaccaa 3360

tcacaaggtt ttcggagagg acactgctgt tttagccggt gacgcattgt tatctttcgc 3420

ttttgaacac atcgccgttg ccacatcaaa aactgtccca tctgacagga ccttgagagt 3480

catttctgag ttgggtaaaa ccatcggttc acagggattg gtcggaggtc aggtagtcga 3540

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accacagcgt accatgtgcg ccacgaggcc tcaaacgtaa aacaatcgaa acgaaaagaa 8640

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tggtttaaaa atagaaatag agagagaggt acatacataa acatacgcgc acaaaagcag 3480

agattaggat ttaatgcagg tgacggaccc atctttcaaa cgatttatat cagtggcgtc 3540

caaattgtta ggttttgttg gttcagcagg tttcctgttg tgggtcatat gactttgaac 3600

caaatggccg gctgctaggg cagcacataa ggataattca cctgccaaga cggcacaggc 3660

aactattctt gctaattgac gtgcgttggt accaggagcg gtagcatgcg ggcctcttac 3720

acctaataag tccaacatgg caccttgtgg ttctagaaca gtaccaccac cgatggtacc 3780

tacttcgatg gatggcatgg atacggaaat tctcaaatca ccgtccactt ctttcatcaa 3840

tgttatacag ttggaacttt caacattttg tgcaggatct tgtcctaatg ccaagaaaac 3900

agctgtcact aaattagctg catgtgcgtt aaatccacca acagacccag ccattgcaga 3960

tccaaccaaa ttcttagcaa tgttcaactc aaccaatgcg gaaacatcac tttttaacac 4020

ttttctgaca acatcaccag gaatagtagc ttctgcgacg acactcttac cacgaccttc 4080

gatccagttg atggcagctg gttttttgtc ggtacagtag ttaccagaaa cggagacaac 4140

ctccatatct tcccagccat actcttctac catttgcttt aatgagtatt cgacaccttt 4200

agaaatcata ttcataccca ttgcgtcacc agtagttgtt ctaaatctca tgaagagtaa 4260

atctcctgct agacaagttt gaatatgttg cagacgtgca aatcttgatg tagagttaaa 4320

agctttttta attgcgtttt gtccctcttc tgagtctaac catatcttac aggcaccaga 4380

tcttttcaaa gttgggaaac ggactactgg gcctcttgtc ataccatcct tagttaaaac 4440

agttgttgca ccaccgccag cattgattgc cttacagcca cgcatggcag aagctaccaa 4500

acaaccctct gtagttgcca ttggtatatg ataagatgta ccatcgataa ccaaggggcc 4560

tataacacca acgggcaaag gcatgtaacc tataacattt tcacaacaag cgccaaatac 4620

gcggtcgtag tcataatttt tatatggtaa acgatcagat gctaatacag gagcttctgc 4680

caaaattgaa agagccttcc tacgtaccgc aaccgctctc gtagtatcac ctaatttttt 4740

ctccaaagcg tacaaaggta acttaccgtg aataaccaag gcagcgacct ctttgttctt 4800

caattgtttt gtatttccac tacttaataa tgcttctaat tcttctaaag gacgtatttt 4860

cttatccaag ctttcaatat cgcgggaatc atcttcctca ctagatgatg aaggtcctga 4920

tgagctcgat tgcgcagatg ataaactttt gactttcgat ccagaaatga ctgttttatt 4980

ggttaaaacc atttatattg aattttcaaa aattcttact ttttttttgg atggacgcaa 5040

agaagtttaa taatcatatt acatggcaat accaccatat acatatccat atctaatctt 5100

acttatatgt tgtggaaatg taaagagccc cattatctta gcctaaaaaa accttctctt 5160

tggaactttc agtaatacgc ttaactgctc attgctatat tgaagtacgg attagaagcc 5220

gccgagcggg cgacagccct ccgacggaag actctcctcc gtgcgtcctg gtcttcaccg 5280

gtcgcgttcc tgaaacgcag atgtgcctcg cgccgcactg ctccgaacaa taaagattct 5340

acaatactag cttttatggt tatgaagagg aaaaattggc agtaacctgg ccccacaaac 5400

cttcaaatca acgaatcaaa ttaacaacca taggataata atgcgattag ttttttagcc 5460

ttatttctgg ggtaattaat cagcgaagcg atgatttttg atctattaac agatatataa 5520

atgcaaaagc tgcataacca ctttaactaa tactttcaac attttcggtt tgtattactt 5580

cttattcaaa tgtcataaaa gtatcaacaa aaaattgtta atatacctct atactttaac 5640

gtcaaggaga aaaaactata gcgcaatgat tgaatagtca aagatttttt ttttttaatt 5700

tttttttttt catagaactt tttatttaaa taaatcacgt ctatatatgt atcagtataa 5760

cgtaaaaaaa aaaacaccgt cagttaaaca aaacataaat aaaaaaaaaa agaagtgtca 5820

aatcaagtgt caaatgtata cttctttttt ttactttgtt cagaacaact tctcattttt 5880

ttctactcat aactttagca tcacaaagta cacaataata acgagtagta acacttttat 5940

agttcataca tgcttcaact acttaataaa tgattgtatg ataatgtttt caatgtaaga 6000

gatttcgatt atccacaaac tttgaaacac agggacacaa ttcttgatat gctttcaacc 6060

gctgcgtttt ggatacctat tcttgacata atatgactac cattttgtta ttgtacgtgg 6120

ggcagttgac gtcttatcat atgtcaaagt catttgcgaa gttcttggca agttgccaac 6180

tgacgagatg cagtaaaaag agattgccgt cttgaaactt tttgtccttt tttttttccg 6240

gggactctac gagaaccctt tgtcctactg attaattttg tactgaattt ggacaattca 6300

gattttagta gacaagcgcg aggaggaaaa gaaatgacag aaaaattccg atggacaaga 6360

agataggaaa aaaaaaaagc tttcaccgat ttcctagacc ggaaaaaagt cgtatgacat 6420

cagaatgaaa aattttcaag ttagacaagg acaaaatcag gacaaattgt aaagatatga 6480

taaatcattt gattcagcgc caatttgccc ttttccattt tccattaaat ctctgttctc 6540

tcttacttat atgatgatta ggtatcatct gtataaaact cctttcttaa tttcactcta 6600

aagcataccc catagagaag atctttcggt tcgaagacat tcctacgcat aataagaata 6660

ggagggaata atgccagaca atctatcatt acatttaagc ggctcttcaa aaagattgaa 6720

ctctcgccaa cttatggaat cttccaatga gacctttgcg ccaaataatg tggatttgga 6780

aaaagagtat aagtcatctc agagtaatat aactaccgaa gtttatgagg catcgagctt 6840

tgaagaaaaa gtaagctcag aaaaacctca atacagctca ttctggaaga aaatctatta 6900

tgaatatgtg gtcgttgaca aatcaatctt gggtgtttct attctggatt catttatgta 6960

caaccaggac ttgaagcccg tcgaaaaaga aaggcgggtt tggtcctggt acaattattg 7020

ttacttctgg cttgctgaat gtttcaatat caacacttgg caaattgcag ctacaggtct 7080

acaactgggt ctaaattggt ggcagtgttg gataacaatt tggattgggt acggtttcgt 7140

tggtgctttt gttgttttgg cctctagagt tggatctgct tatcatttgt cattccctat 7200

atcatctaga gcatcattcg gtattttctt ctctttatgg cctgttatta atagagtcgt 7260

catggccatc gtttggtata gtgtccaagc ttatattgcg gcaactcccg tatcattaa 7319

<210> 4

<211> 457

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PGAL1的核苷酸序列

<400> 4

agtacggatt agaagccgcc gagcgggcga cagccctccg acggaagact ctcctccgtg 60

cgtcctggtc ttcaccggtc gcgttcctga aacgcagatg tgcctcgcgc cgcactgctc 120

cgaacaataa agattctaca atactagctt ttatggttat gaagaggaaa aattggcagt 180

aacctggccc cacaaacctt caaatcaacg aatcaaatta acaaccatag gataataatg 240

cgattagttt tttagcctta tttctggggt aattaatcag cgaagcgatg atttttgatc 300

tattaacaga tatataaatg caaaagctgc ataaccactt taactaatac tttcaacatt 360

ttcggtttgt attacttctt attcaaatgt cataaaagta tcaacaaaaa attgttaata 420

tacctctata ctttaacgtc aaggagaaaa aactata 457

<210> 5

<211> 500

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PGAL7的核苷酸序列

<400> 5

gacggtagca acaagaatat agcacgagcc gcgaagttca tttcgttact tttgatatcg 60

ctcacaacta ttgcgaagcg cttcagtgaa aaaatcataa ggaaaagttg taaatattat 120

tggtagtatt cgtttggtaa agtagagggg gtaatttttc ccctttattt tgttcataca 180

ttcttaaatt gctttgcctc tccttttgga aagctatact tcggagcact gttgagcgaa 240

ggctcattag atatattttc tgtcattttc cttaacccaa aaataaggga aagggtccaa 300

aaagcgctcg gacaactgtt gaccgtgatc cgaaggactg gctatacagt gttcacaaaa 360

tagccaagct gaaaataatg tgtagctatg ttcagttagt ttggctagca aagatataaa 420

agcaggtcgg aaatatttat gggcattatt atgcagagca tcaacatgat aaaaaaaaac 480

agttgaatat tccctcaaaa 500

<210> 6

<211> 215

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PGAL10的核苷酸序列

<400> 6

tacttcaata tagcaatgag cagttaagcg tattactgaa agttccaaag agaaggtttt 60

tttaggctaa gataatgggg ctctttacat ttccacaaca tataagtaag attagatatg 120

gatatgtata tggtggtatt gccatgtaat atgattatta aacttctttg cgtccatcca 180

aaaaaaaagt aagaattttt gaaaattcaa tataa 215

<210> 7

<211> 668

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PGAL1-10的核苷酸序列

<400> 7

tatagttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac 60

ttttatgaca tttgaataag aagtaataca aaccgaaaat gttgaaagta ttagttaaag 120

tggttatgca gcttttgcat ttatatatct gttaatagat caaaaatcat cgcttcgctg 180

attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tattatccta tggttgttaa 240

tttgattcgt tgatttgaag gtttgtgggg ccaggttact gccaattttt cctcttcata 300

accataaaag ctagtattgt agaatcttta ttgttcggag cagtgcggcg cgaggcacat 360

ctgcgtttca ggaacgcgac cggtgaagac caggacgcac ggaggagagt cttccgtcgg 420

agggctgtcg cccgctcggc ggcttctaat ccgtacttca atatagcaat gagcagttaa 480

gcgtattact gaaagttcca aagagaaggt ttttttaggc taagataatg gggctcttta 540

catttccaca acatataagt aagattagat atggatatgt atatggtggt attgccatgt 600

aatatgatta ttaaacttct ttgcgtccat ccaaaaaaaa agtaagaatt tttgaaaatt 660

caatataa 668

<210> 8

<211> 668

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PGAL10-1的核苷酸序列

<400> 8

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcaatac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccca ttatcttagc ctaaaaaaac cttctctttg gaactttcag 180

taatacgctt aactgctcat tgctatattg aagtacggat tagaagccgc cgagcgggcg 240

acagccctcc gacggaagac tctcctccgt gcgtcctggt cttcaccggt cgcgttcctg 300

aaacgcagat gtgcctcgcg ccgcactgct ccgaacaata aagattctac aatactagct 360

tttatggtta tgaagaggaa aaattggcag taacctggcc ccacaaacct tcaaatcaac 420

gaatcaaatt aacaaccata ggataataat gcgattagtt ttttagcctt atttctgggg 480

taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat gcaaaagctg 540

cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcggtttg tattacttct tattcaaatg 600

tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt caaggagaaa 660

aaactata 668

<210> 9

<211> 1123

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P HXT1的核苷酸序列

<400> 9

gattttacgt atatcaacta gttgacgatt atgatatctt tatagatttt aaggtgggga 60

aagaacatga gaccccagat ggaattgatt atggggacat tgttgccttt atatataatt 120

tcaatatact aattcaaatg attaaaaacg tgagggggac acgcaacttc gggtgttaag 180

aaatattttg ctacattaga taatggtgga gtttcctggc ttgtcggata aaagccatca 240

aatgtcgcag cagctcatgt ttacgtttgc tgtcttctgc ccacgtcata tgagtggtat 300

tcttctatca gcacttgatg aatattcttt ttctcatata tctgaaagac aaaagatcgg 360

cacggcaatg ccctgcagca tttcttccta gtttttccga atttccatta cgtattggat 420

cttgtgcgca tatttgtcag tccttcacgg aaaaaaaaaa agagcactgg gtcacttcgg 480

aaaaactttt gactcaatgc aacagtgtca taatcctttg cgctgtctct ttgaagaaaa 540

atcaggagtg caagatatcg attaattcct tggaagttat gatggttagt cttagtttaa 600

ctctcttgaa gaagggtttt ttcagttggt caacactctt tagaggtaaa aaaaaaaaaa 660

aaaaaaaaaa aaagagaatt cttcatgtaa tttaccatga ttctacgttt ttgcaagcaa 720

aaatgaagat aatccgagcg catgcgcaag tagtccctgc catgccgctt cggaaaaact 780

ttcgaaacca atactcctta catccgcctt gaatttagga cctacaattg ttgtctcttc 840

tgcttgaacc aataagccct agaaacctta caccctaatt tgcacaagaa aactacgaaa 900

aaattttttc ctcttttttc cgcagctcca atctcgccct gctatttttt tggttcggag 960

aaaaatagtc ggtcgatatg aattgaagtt tcattgtggc cactcgttta ggaatggaat 1020

aacctccgcg aatggaaaaa aagaactcgg aatatcaaaa attccggctc aaaggaaaaa 1080

tttgcttcag gaggggggaa ttatattcca gatgagacct gca 1123

<210> 10

<211> 1749

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> BtCrtI的核苷酸序列

<400> 10

ttatatccta atatcgttag agttctgtcc ttggaagacg tttggcaaca actgattaat 60

aaaagatgct ggagtagtag tgtcgtccct aggaaagaaa tagaagaaca agaaagtgac 120

aaagtagcat gctaagcagt aataaatcca gtgtgactca gtcttccttg tttgctcagg 180

tgcatatttc ttctgagagt cctgtaactt cctaggcaaa gggttttgtc cgaatgactt 240

acagacctgg tcagaagtta atttagatcc tgccaagact attgggactc ctgtaccagg 300

gtgagttgat gcaccgacga aaaataaatt gtcatatctg ttagtagagt cctttgttga 360

aggtctgaac cacaaaacct gaaagacatc atgtgataaa cctaatattg atcccctcca 420

caagttgaac ttagattgcc agactgatgg gtcgttgacc tcctcgtgtt ctatcaagtt 480

agcgaagttg ttgactccca acctcctctc tatgacctcc aagaccatct ttctagccct 540

gttgaccaac tctgggtagt tctcctctgc tgagttacct gtcttagact tcatgtgacc 600

aattggaact aaaactataa ttgagtcctt atttggaggt gctgcagact cgtctatcct 660

tgaaggaacg ttgacgtaga aagatgcttc agaaggcaaa ccgaaatcgt taaaaatctc 720

gtcgaatgac tccttgtaag cctcagccaa gaaaatgttg tggacgtcca attgagggac 780

cttagtagac attgaccagt aaaaagaaat tgatgaagat gttaatttct tagatgccaa 840

agtcttcttt gtccagttgc aaggtggcaa caagtggtgg taagcgtaga ccaagtcagc 900

gttgcagacg acagcgtctg cctcaatgac ttctccagac tccaaagtga caccagtgac 960

cctcttgtct ttatcgacag tgttaatctt agcgacagga gattggtacc tgaactcagc 1020

tccgtacttc ttagaagcta tagactccaa cttttggacg accatgttga aaccacccct 1080

tgggtaccaa attccctctg cgaactctgt atattgcaac aatgagtaga ctgcaggtgc 1140

gtcgtaaggt gacataccca tgtacattgt ttgaaaagta aaagccatcc tcatcttttt 1200

tgtttggaag tattttgatg ctctgtcgta tatcttaccg aataagtgca acctaaaaat 1260

ctctgggacg tactgtaacc ttattaagtc ccatatagtt tcgaagtttc tctttatagc 1320

aatgaatgta ccctgctcgt agtggacgtg tgtctctttc atgaaatcta agaacctacc 1380

gaatcctaaa ggtccctcaa tcctgtccaa ctcacccttc atctttgtta agtctgatga 1440

caattggaca gcgtcaccgt cgtcgaaatg gactttgtaa ttgttgtcac atcttaataa 1500

gtccaagtgg tctcctatcc tctcgtctaa gtcagcgaaa gcgtcctcaa acaacttagg 1560

catcaagtac aatgaaggtc cctggtcgaa cctgtgaccg tcgtggtgaa tgaaagagca 1620

ccttcctcca gagaagtcgt tcttctcgac gacagtgact ctgaaaccct cccttgctaa 1680

ccttgctgct gttgcagtac ctcctattcc agcacctatg acgacaatgt gcttcttctg 1740

atcagacat 1749

<210> 11

<211> 930

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PagCrtB的核苷酸序列

<400> 11

atgtcacaac caccattatt ggaccacgct acacaaacta tggcaaacgg ttctaaatct 60

ttcgctactg ctgctaaatt attcgaccca gcaacaagaa gatctgtatt gatgttgtac 120

acctggtgta gacattgcga tgacgttata gatgaccaaa ctcacggttt tgcttcagaa 180

gctgcagccg aagaagaagc tacacaaaga ttggcaagat taagaacttt gacattagct 240

gcattcgaag gtgccgaaat gcaagatcca gcttttgccg ctttccaaga agttgcatta 300

acccatggta ttactcctag aatggctttg gatcacttag acggttttgc aatggatgtc 360

gcccaaacaa gatacgtaac cttcgaagac actttaagat attgttacca tgtcgccggt 420

gttgtcggtt tgatgatggc tagagtaatg ggtgttagag atgaaagagt tttagataga 480

gcatgtgact tgggtttagc cttccaattg acaaacatag ctagagatat aatagatgac 540

gcagccatag acagatgcta tttgccagct gaatggttac aagatgcagg tttgactcct 600

gaaaattacg ctgcaagaga aaacagagcc gctttagcca gagttgctga aagattgata 660

gatgcagccg aaccatatta catctcttca caagctggtt tgcatgattt gccacctaga 720

tgcgcatggg ccattgctac cgcaagatct gtttacagag aaatcggtat taaagtcaag 780

gctgcaggtg gttccgcatg ggatagaaga caacacactt ctaaaggtga aaagatcgct 840

atgttgatgg ccgctcctgg tcaagttatt agagcaaaga ccaccagagt caccccaaga 900

ccagccggtt tatggcaaag acctgtttaa 930

<210> 12

<211> 1182

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> TmCrtE的核苷酸序列

<400> 12

atggcttata ccgcaatggc agcaggaact cagtcattgc agttgaggac agtcgcctct 60

taccaggagt gcaactcaat gaggtcttgc ttcaagttga ccccattcaa gtcattccac 120

ggtgtcaact tcaacgttcc ttctttaggt gccgccaact gcgaaatcat gggtcacttg 180

aaattgggtt ctttgccata caaacagtgt tcagtatcat ctaagtcaac taagactatg 240

gcccagttgg tagatttggc agagaccgag aaagccgagg gaaaggatat cgagttcgat 300

tttaacgagt atatgaagtc taaggctgtc gctgttgatg cagccttgga taaggccatc 360

cctttggagt atccagagaa gatccatgag tctatgaggt actcattgtt ggccggagga 420

aaaagggtca gacctgcatt atgcatcgct gcttgcgagt tagtaggtgg ttctcaggac 480

ttggccatgc caaccgcatg tgccatggaa atgattcata ccatgtcatt gattcacgat 540

gatttgcctt gcatggacaa cgacgacttc agaaggggaa agcctaccaa tcacaaggtt 600

ttcggagagg acactgctgt tttagccggt gacgcattgt tatctttcgc ttttgaacac 660

atcgccgttg ccacatcaaa aactgtccca tctgacagga ccttgagagt catttctgag 720

ttgggtaaaa ccatcggttc acagggattg gtcggaggtc aggtagtcga catcacttct 780

gagggagacg ccaacgtcga cttaaagaca ttggagtgga ttcacattca caagactgcc 840

gtcttgttgg aatgctctgt tgtttctgga ggaatcttgg gtggagctac cgaggatgag 900

attgctagaa taagaagata cgccaggtgc gtcggtttgt tgttccaggt tgtcgacgac 960

attttggatg tcaccaagtc ttcagaggaa ttgggaaaga ccgccggtaa agacttattg 1020

accgacaagg ctacctaccc taagttgatg ggtttggaga aggccaaaga gtttgcagca 1080

gaattagcta ccagggcaaa ggaagagttg tcatcattcg accagatcaa ggcagcccct 1140

ttgttaggat tggccgatta catcgctttc aggcaaaact aa 1182

<210> 13

<211> 915

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> INO2基因的核苷酸序列

<400> 13

atgtcccaag caactgggaa cgaattactg ggtatcctag atctggataa cgatatagac 60

tttgaaactg cttaccaaat gctcagcagt aacttcgacg accaaatgtc tgcgcacata 120

catgaaaaca cgtttagtgc aacttcccct cctctgttaa cacacgagct cggcataatt 180

cctaacgtgg caaccgtgca accctctcac gtagaaacta tacctgccga taaccaaact 240

catcatgctc ctttgcatac tcatgctcac tatctaaatc acaaccctca tcaaccaagc 300

atgggttttg atcaaacgct tggtctcaag ttgtctcctt ccagttcggg gttgttgagc 360

acgaatgaat cgaatgccat tgaacagttt ttagacaatc taatatcaca ggatatgatg 420

tcttccaacg cttccatgaa ctccgattca catctacata taagatcacc aaaaaagcag 480

cataggtata ccgaattaaa tcaaagatat cctgaaacac atccacacag taacacaggg 540

gagttaccca caaacacagc agatgtgcca actgagttca ccacgaggga aggacctcat 600

cagcctatcg gcaatgacca ctacaacccg ccaccgtttt cagtacctga gatacgaatc 660

ccagactctg atattccagc caatatcgag gacgaccctg tgaaggtacg gaaatggaaa 720

cacgttcaaa tggagaagat acgaagaata aacaccaaag aagcctttga aaggctcatt 780

aaatcagtaa ggaccccacc aaaggaaaac gggaaaagaa ttcccaagca tattctttta 840

acttgtgtaa tgaacgatat caagtccatt agaagcgcaa atgaagcact acagcacata 900

ctggatgatt cctga 915

<210> 14

<211> 1428

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> gapN基因的核苷酸序列

<400> 14

atgactaagc aatacaagaa ctacgttaac ggtgaatgga agttgtctga aaacgaaatt 60

aaaatctatg aacctgcttc aggtgcagaa ttaggttccg ttccagctat gagtacagaa 120

gaagtagatt acgtttacgc ttctgctaag aaagcccaac ctgcttggag agcattgtca 180

tatatcgaaa gagctgcata cttacataag gttgctgata tattgatgag agacaaggaa 240

aagattggtg caatcttatc taaagaagta gccaagggtt ataaatccgc tgttagtgaa 300

gttgtcagaa ccgctgaaat tataaactac gccgctgaag aaggtttaag aatggaaggt 360

gaagttttgg aaggtggttc tttcgaagca gcctctaaaa agaaaattgc agtagttaga 420

agagaacctg tcggtttagt attggccatt tcccctttca attatccagt aaacttagct 480

ggtagtaaga tcgccccagc tttgattgct ggtaatgtta tagcctttaa accacctaca 540

caaggttcta tttcaggttt gttattggca gaagccttcg ctgaagcagg tttgcctgct 600

ggtgttttta acacaattac cggtagaggt tccgaaatcg gtgactacat tgtcgaacac 660

caagctgtaa acttcatcaa cttcactggt tctacaggta taggtgaaag aatcggtaaa 720

atggctggta tgagaccaat tatgttagaa ttgggtggta aagattctgc aatagtttta 780

gaagatgccg acttagaatt gaccgctaag aatatcattg ccggtgcttt tggttattcc 840

ggtcaaagat gtactgcagt caaaagagtt ttagtcatgg aaagtgttgc cgatgaattg 900

gtcgaaaaga taagagaaaa ggttttggca ttgactatcg gtaatcctga agatgacgcc 960

gacatcactc cattgatcga tacaaagtca gctgactacg ttgaaggttt gattaatgat 1020

gcaaacgaca agggtgcaac cgccttgact gaaattaaaa gagagggtaa cttaatctgc 1080

ccaatcttgt tcgataaggt tactacagac atgagattag cttgggaaga accatttggt 1140

cctgtcttgc caataatcag agttacatct gtcgaagaag ctatcgaaat atctaataag 1200

tcagaatatg gtttgcaagc atcaatcttt acaaacgatt tccctagagc ctttggtatt 1260

gctgaacaat tggaagtagg taccgttcat atcaacaaca agacacaaag aggtaccgat 1320

aattttccat tcttgggtgc taagaaatct ggtgcaggta tccaaggtgt caaatactcc 1380

attgaagcta tgaccactgt aaagagtgtc gtatttgata ttaaataa 1428

<210> 15

<211> 537

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PYC2基因的核苷酸序列

<400> 15

atgtatccaa gggtctatga agatttccaa aagatcagag aaacatacgg tgatttatca 60

gttctaccaa ccaaaaattt cctagcacca gcagaacctg atgaagaaat cgaagtcacc 120

atcgaacaag gtaagacttt gattatcaaa ttgcaagctg ttggtgactt aaataagaaa 180

actgggcaaa gagaagtgta ttttgaattg aacggtgaat taagaaagat cagagttgca 240

gacaagtcac aaaacataca atctgttgct aaaccaaagg ctgatgtcca cgatactcac 300

caaatcggtg caccaatggc tggtgttatc atagaagtta aagtacataa agggtctttg 360

gtgaaaaagg gcgaatcgat tgctgttttg agtgccatga aaatggaaat ggttgtctct 420

tcaccagcag atggtcaagt taaagatgtt ttcattaggg atggtgaaag tgttgacgca 480

tcagatttgt tggttgtcct agaagaagaa accctacccc catcccaaaa aaagtaa 537

<210> 16

<211> 1923

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SMAE1基因的核苷酸序列

<400> 16

atgtggccta ttcagcaatc gcgtttatat tcttctaaca ctagatcgca taaagctacc 60

acaacaagag aaaatacttt ccaaaagcca tacagcgacg aggaggtcac taaaacaccc 120

gtcggttctc gcgccagaaa gatcttcgaa gctcctcacc cacatgccac tcgtttgact 180

gtagaaggtg ccatagaatg tcccttggag agctttcaac ttttaaactc tcctttattt 240

aacaagggtt ctgcatttac acaagaagaa agggaagcgt ttaatttaga agcattgcta 300

ccaccacaag tgaacacttt ggacgaacaa ctggaaagaa gctacaagca gttatgctat 360

ttgaagacgc ccttggccaa aaacgacttc atgacgtctt tgagagtaca gaacaaagtc 420

ctatattttg cattaataag gaaacatatc aaggaattag ttcctatcat ttacacccca 480

accgaaggtg atgctattgc tgcctattcc cacaggttca gaaagccaga aggtgtgttt 540

ttagacatta ccgaacctga ttccatcgaa cgtagattgg ctacatacgg tggagacaaa 600

gatgtagact acatcgttgt gtcggattcg gaaggtattc tgggaattgg tgaccaaggt 660

atcggtggtg tacgtattgc tatctccaaa ttggcattga tgacgctgtg cggtggtatt 720

catcccggcc gtgtgctacc tgtgtgtttg gacgtcggta ctaacaacaa gaaactagcc 780

cgtgacgaat tgtacatggg taacaagttc tccagaatca ggggtaagca atatgacgac 840

ttcttggaaa aattcatcaa ggccgttaag aaagtgtatc caagcgccgt tctgcatttc 900

gaagatttcg gtgttaagaa cgctagaaga ttgctagaaa agtacaggta cgaattgcca 960

tcattcaacg atgacattca gggcaccggt gccgtcgtga tggcctcgtt gattgctgct 1020

ttgaaacata ccaacagaga cttgaaagac accagagtgc ttatttacgg tgccgggtct 1080

gcgggcctcg gtatcgcaga ccaaattgtg aatcatatgg tcacgcacgg cgttgacaag 1140

gaagaagcgc gcaagaaaat cttcttgatg gacagacgtg ggttaattct acaatcttac 1200

gaggctaact ccactcccgc ccaacacgta tacgctaaga gtgatgcgga atgggctggt 1260

atcaacaccc gctctttaca tgatgtggtg gagaacgtca aaccaacgtg tttggttggc 1320

tgctccacac aagcaggcgc attcactcaa gatgtcgtag aagaaatgca caagcacaat 1380

cctagaccga tcattttccc attatccaac cctactagac tacacgaagc cgttcctgcc 1440

gatttaatga agtggaccaa caacaacgct cttgtagcta ccggatctcc tttcccacct 1500

gttgacggtt accgtatctc ggagaacaac aattgttact ctttcccagg tatcggttta 1560

ggtgccgtac tatcgcgtgc caccactatc acagacaaga tgatctccgc tgcagtggac 1620

caactagccg aattgtcgcc actaagagag ggcgactcga gacctgggtt gctacccggc 1680

ctggacacca tcaccaacac ctctgcgcgt ctagctaccg ctgtgatctt gcaagcactc 1740

gaggagggaa ccgcccgtat cgagcaagaa caagtaccgg gaggagctcc cggcgaaact 1800

gtcaaggttc ctcgtgactt tgacgaatgt ttacagtggg tcaaagccca aatgtgggag 1860

cctgtgtaca gacctatgat caaggtccaa catgacccat cggtgcacac caaccaattg 1920

tag 1923

<210> 17

<211> 1134

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> MDH2基因的核苷酸序列

<400> 17

atgcctcact cagttacacc atccatagaa caagattcgt taaaaattgc cattttaggt 60

gctgccggtg gtatcgggca gtcgttatcg ctgcttttga aagctcagtt gcaataccag 120

ttaaaggaga gcaaccggag cgttacccac attcatctgg ctctttacga tgtcaaccaa 180

gaagccatca acggtgttac cgccgacttg tctcatatag acacccccat ttccgtgtcg 240

agccactctc ctgcaggtgg cattgagaac tgtttgcata acgcttctat tgttgtcatt 300

cctgcaggtg ttccaagaaa acctggcatg actcgtgatg acttatttaa cgtgaatgct 360

ggtatcatta gccagctcgg tgattctatt gcagaatgtt gtgatctttc caaggtcttc 420

gttcttgtca tttccaaccc tgttaattct ttagtcccag tgatggtttc taacattctt 480

aagaaccatc ctcagtctag aaattccggc attgaaagaa ggatcatggg tgtcaccaag 540

ctcgacattg tcagagcgtc cacttttcta cgtgagataa acattgagtc agggctaact 600

cctcgtgtta actccatgcc tgacgtccct gtaattggcg ggcattctgg cgagactatt 660

attccgttgt tttcacagtc aaacttccta tcgagattaa atgaggatca attgaaatat 720

ttaatacata gagtccaata cggtggtgat gaagtggtca aggccaagaa cggtaaaggt 780

agtgctacct tatcgatggc ccatgccggt tataagtgtg ttgtccaatt tgtttctttg 840

ttattgggta acattgagca gatccatgga acctactatg tgccattaaa agatgcgaac 900

aacttcccca ttgctcctgg ggcagatcaa ttattgcctc tggtggacgg tgcagactac 960

tttgccatac cattaactat tactacaaag ggtgtttcct atgtggatta tgacatcgtt 1020

aataggatga acgacatgga acgcaaccaa atgttgccaa tttgcgtctc ccagttaaag 1080

aaaaatatcg ataagggctt ggaattcgtt gcatcgagat ctgcatcatc ttaa 1134

<210> 18

<211> 1245

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> POS5基因的核苷酸序列

<400> 18

atgtttgtca gggttaaatt gaataaacca gtaaaatggt ataggttcta tagtacgttg 60

gattcacatt ccctaaagtt acagagcggc tcgaagtttg taaaaataaa gccagtaaat 120

aacttgagga gtagttcatc agcagatttc gtgtccccac caaattccaa attacaatct 180

ttaatctggc agaacccttt acaaaatgtt tatataacta aaaaaccatg gactccatcc 240

acaagagaag cgatggttga attcataact catttacatg agtcataccc cgaggtgaac 300

gtcattgttc aacccgatgt ggcagaagaa atttcccagg atttcaaatc tcctttggag 360

aatgatccca accgacctca tatactttat actggtcctg aacaagatat cgtaaacaga 420

acagacttat tggtgacatt gggaggtgat gggactattt tacacggcgt atcaatgttc 480

ggaaatacgc aagttcctcc ggttttagca tttgctctgg gcactctggg ctttctatta 540

ccgtttgatt ttaaggagca taaaaaggtc tttcaggaag taatcagctc tagagccaaa 600

tgtttgcata gaacacggct agaatgtcat ttgaaaaaaa aggatagcaa ctcatctatt 660

gtgacccatg ctatgaatga catattctta cataggggta attcccctca tctcactaac 720

ctggacattt tcattgatgg ggaatttttg acaagaacga cagcagatgg tgttgcattg 780

gccactccaa cgggttccac agcatattca ttatcagcag gtggatctat tgtttcccca 840

ttagtccctg ctattttaat gacaccaatt tgtcctcgct ctttgtcatt ccgaccactg 900

attttgcctc attcatccca cattaggata aagataggtt ccaaattgaa ccaaaaacca 960

gtcaacagtg tggtaaaact ttctgttgat ggtattcctc aacaggattt agatgttggt 1020

gatgaaattt atgttataaa tgaggtcggc actatataca tagatggtac tcagcttccg 1080

acgacaagaa aaactgaaaa tgactttaat aattcaaaaa agcctaaaag gtcagggatt 1140

tattgtgtcg ccaagaccga gaatgactgg attagaggaa tcaatgaact tttaggattc 1200

aattctagct ttaggctgac caagagacag actgataatg attaa 1245

<210> 19

<211> 1533

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> pntA基因的核苷酸序列

<400> 19

atgcgaattg gcataccaag agaacggtta accaatgaaa cccgtgttgc agcaacgcca 60

aaaacagtgg aacagctgct gaaactgggt tttaccgtcg cggtagagag cggcgcgggt 120

caactggcaa gttttgacga taaagcgttt gtgcaagcgg gcgctgaaat tgtagaaggg 180

aatagcgtct ggcagtcaga gatcattctg aaggtcaatg cgccgttaga tgatgaaatt 240

gcgttactga atcctgggac aacgctggtg agttttatct ggcctgcgca gaatccggaa 300

ttaatgcaaa aacttgcgga acgtaacgtg accgtgatgg cgatggactc tgtgccgcgt 360

atctcacgcg cacaatcgct ggacgcacta agctcgatgg cgaacatcgc cggttatcgc 420

gccattgttg aagcggcaca tgaatttggg cgcttcttta ccgggcaaat tactgcggcc 480

gggaaagtgc caccggcaaa agtgatggtg attggtgcgg gtgttgcagg tctggccgcc 540

attggcgcag caaacagtct cggcgcgatt gtgcgtgcat tcgacacccg cccggaagtg 600

aaagaacaag ttcaaagtat gggcgcggaa ttcctcgagc tggattttaa agaggaagct 660

ggcagcggcg atggctatgc caaagtgatg tcggacgcgt tcatcaaagc ggaaatggaa 720

ctctttgccg cccaggcaaa agaggtcgat atcattgtca ccaccgcgct tattccaggc 780

aaaccagcgc cgaagctaat tacccgtgaa atggttgact ccatgaaggc gggcagtgtg 840

attgtcgacc tggcagccca aaacggcggc aactgtgaat acaccgtgcc gggtgaaatc 900

ttcactacgg aaaatggtgt caaagtgatt ggttataccg atcttccggg ccgtctgccg 960

acgcaatcct cacagcttta cggcacaaac ctcgttaatc tgctgaaact gttgtgcaaa 1020

gagaaagacg gcaatatcac tgttgatttt gatgatgtgg tgattcgcgg cgtgaccgtg 1080

atccgtgcgg gcgaaattac ctggccggca ccgccgattc aggtatcagc tcagccgcag 1140

gcggcacaaa aagcggcacc ggaagtgaaa actgaggaaa aatgtacctg ctcaccgtgg 1200

cgtaaatacg cgttgatggc gctggcaatc attctttttg gctggatggc aagcgttgcg 1260

ccgaaagaat tccttgggca cttcaccgtt ttcgcgctgg cctgcgttgt cggttattac 1320

gtggtgtgga atgtatcgca cgcgctgcat acaccgttga tgtcggtcac caacgcgatt 1380

tcagggatta ttgttgtcgg agcactgttg cagattggcc agggcggctg ggttagcttc 1440

cttagtttta tcgcggtgct tatagccagc attaatattt tcggtggctt caccgtgact 1500

cagcgcatgc tgaaaatgtt ccgcaaaaat taa 1533

<210> 20

<211> 1389

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> pntB基因的核苷酸序列

<400> 20

atgtctggag gattagttac agctgcatac attgttgccg cgatcctgtt tatcttcagt 60

ctggccggtc tttcgaaaca tgaaacgtct cgccagggta acaacttcgg tatcgccggg 120

atggcgattg cgttaatcgc aaccattttt ggaccggata cgggtaatgt tggctggatc 180

ttgctggcga tggtcattgg tggggcaatt ggtatccgtc tggcgaagaa agttgaaatg 240

accgaaatgc cagaactggt ggcgatcctg catagcttcg tgggtctggc ggcagtgctg 300

gttggcttta acagctatct gcatcatgac gcgggaatgg caccgattct ggtcaatatt 360

cacctgacgg aagtgttcct cggtatcttc atcggggcgg taacgttcac gggttcggtg 420

gtggcgttcg gcaaactgtg tggcaagatt tcgtctaaac cattgatgct gccaaaccgt 480

cacaaaatga acctggcggc tctggtcgtt tccttcctgc tgctgattgt atttgttcgc 540

acggacagcg tcggcctgca agtgctggca ttgctgataa tgaccgcaat tgcgctggta 600

ttcggctggc atttagtcgc ctccatcggt ggtgcagata tgccagtggt ggtgtcgatg 660

ctgaactcgt actccggctg ggcggctgcg gctgcgggct ttatgctcag caacgacctg 720

ctgattgtga ccggtgcgct ggtcggttct tcgggggcta tcctttctta cattatgtgt 780

aaggcgatga accgttcctt tatcagcgtt attgcgggtg gtttcggcac cgacggctct 840

tctactggcg atgatcagga agtgggtgag caccgcgaaa tcaccgcaga agagacagcg 900

gaactgctga aaaactccca ttcagtgatc attactccgg ggtacggcat ggcagtcgcg 960

caggcgcaat atcctgtcgc tgaaattact gagaaattgc gcgctcgtgg tattaatgtg 1020

cgtttcggta tccacccggt cgcggggcgt ttgcctggac atatgaacgt attgctggct 1080

gaagcaaaag taccgtatga catcgtgctg gaaatggacg agatcaatga tgactttgct 1140

gataccgata ccgtactggt gattggtgct aacgatacgg ttaacccggc ggcgcaggat 1200

gatccgaaga gtccgattgc tggtatgcct gtgctggaag tgtggaaagc gcagaacgtg 1260

attgtcttta aacgttcgat gaacactggc tatgctggtg tgcaaaaccc gctgttcttc 1320

aaggaaaaca cccacatgct gtttggtgac gccaaagcca gcgtggatgc aatcctgaaa 1380

gctctgtaa 1389

<210> 21

<211> 1047

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ADH2基因的核苷酸序列

<400> 21

atgtctattc cagaaactca aaaagccatt atcttctacg aatccaacgg caagttggag 60

cataaggata tcccagttcc aaagccaaag cccaacgaat tgttaatcaa cgtcaagtac 120

tctggtgtct gccacaccga tttgcacgct tggcatggtg actggccatt gccaactaag 180

ttaccattag ttggtggtca cgaaggtgcc ggtgtcgttg tcggcatggg tgaaaacgtt 240

aagggctgga agatcggtga ctacgccggt atcaaatggt tgaacggttc ttgtatggcc 300

tgtgaatact gtgaattggg taacgaatcc aactgtcctc acgctgactt gtctggttac 360

acccacgacg gttctttcca agaatacgct accgctgacg ctgttcaagc cgctcacatt 420

cctcaaggta ctgacttggc tgaagtcgcg ccaatcttgt gtgctggtat caccgtatac 480

aaggctttga agtctgccaa cttgagagca ggccactggg cggccatttc tggtgctgct 540

ggtggtctag gttctttggc tgttcaatat gctaaggcga tgggttacag agtcttaggt 600

attgatggtg gtccaggaaa ggaagaattg tttacctcgc tcggtggtga agtattcatc 660

gacttcacca aagagaagga cattgttagc gcagtcgtta aggctaccaa cggcggtgcc 720

cacggtatca tcaatgtttc cgtttccgaa gccgctatcg aagcttctac cagatactgt 780

agggcgaacg gtactgttgt cttggttggt ttgccagccg gtgcaaagtg ctcctctgat 840

gtcttcaacc acgttgtcaa gtctatctcc attgtcggct cttacgtggg gaacagagct 900

gataccagag aagccttaga tttctttgcc agaggtctag tcaagtctcc aataaaggta 960

gttggcttat ccagtttacc agaaatttac gaaaagatgg agaagggcca aattgctggt 1020

agatacgttg ttgacacttc taaataa 1047

<210> 22

<211> 1959

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ACS6基因的核苷酸序列

<400> 22

atgtctcaga ctcacaagca tgctattcct gctaacatag ctgacagatg cttaataaat 60

ccagaacagt atgaaactaa atacaagcaa tctataaacg atcctgacac tttctgggga 120

gagcagggta agatattgga ctggattaca ccataccaaa aggtcaagaa cacttcattt 180

gctcctggta atgtttctat taaatggtac gaggacggta cattaaactt agcagcaaac 240

tgcttggaca ggcacttgca agagaacgga gacagaactg caataatttg ggagggtgac 300

gacgcatctc aatctaagca catatcatac agagagttac acagagacgt ttgcagattc 360

gctaacacat tgttggattt gggaataaag aaaggtgacg ttgttgcaat ttatatgcct 420

atggttcctg aggctgctgt cgctatgttg gcttgcgcaa ggataggagc tgtccattct 480

gtcatttttg gtggtttttc acctgaggca atagcaggta ggataattga ttcatcttca 540

aggttggtca taactgcaga tgagggagtc agggcaggaa gatctattcc attgaagaag 600

aacgttgacg atgcattgaa gaacccaaac gttacttctg tcgagcacgt cattgtctta 660

aaaagaactg gaaacgacat agactggcaa gagggtaggg acttatggtg gagggacttg 720

attgagaagg cttcacctga acaccagcca gaggcaatga atgcagaaga cccattgttt 780

attttatata catctggatc tacaggaaag ccaaagggag tcttgcatac tacaggtggt 840

tacttggtct atgcagcaac aacttttaag tatgtcttcg actaccaccc tggtgacatt 900

tactggtgca cagctgacgt tggatgggtc acaggtcact cttacttgtt gtacggacct 960

ttggcatgcg gtgctactac attgatgttc gagggagtcc ctaactggcc tacacctgct 1020

aggatgtgcc aggttgtcga caagcaccag gtcaacatac tgtacacagc accaacagct 1080

attagggcat tgatggcaga gggtgacaag gcaattgagg gaacagacag gtcttctttg 1140

agaatattgg gatctgtcgg tgagccaata aacccagagg catgggagtg gtactggaag 1200

aagataggaa aggagaaatg tccagtcgtc gacacatggt ggcagacaga gacaggtgga 1260

tttatgataa ctcctttgcc aggagctata gagttgaagg ctggttcagc aacaaggcca 1320

ttcttcggag tccagcctgc attggtcgac aacgagggtc atccacagga aggtgctaca 1380

gagggtaact tagtcattac tgactcttgg cctggtcagg ctaggacatt gttcggtgac 1440

catgagaggt tcgagcagac ttacttttct acatttaaaa atatgtactt ttctggagac 1500

ggtgctagaa gggatgaaga tggttactat tggataactg gtagggtcga tgatgtctta 1560

aacgtctcag gacacaggtt gggaactgct gaaattgaat cagcattggt cgctcaccct 1620

aagatagctg aggcagctgt cgtcggaatt cctcacgcaa ttaagggaca ggcaatttac 1680

gcatacgtca ctttgaacca cggtgaagag ccatcaccag agttgtacgc agaggttagg 1740

aactgggtca ggaaggagat tggacctttg gcaactccag acgtcttgca ctggacagac 1800

tcattgccta agacaaggtc tggaaaaata atgaggagaa tattgaggaa aattgctgct 1860

ggagatactt caaacttggg tgacacttct acattggctg acccaggtgt tgtcgagaaa 1920

ccattggagg aaaaacaggc aatagctatg ccatcttaa 1959

<210> 23

<211> 1503

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ALD6基因的核苷酸序列

<400> 23

atgactaagc tacactttga cactgctgaa ccagtcaaga tcacacttcc aaatggtttg 60

acatacgagc aaccaaccgg tctattcatt aacaacaagt ttatgaaagc tcaagacggt 120

aagacctatc ccgtcgaaga tccttccact gaaaacaccg tttgtgaggt ctcttctgcc 180

accactgaag atgttgaata tgctatcgaa tgtgccgacc gtgctttcca cgacactgaa 240

tgggctaccc aagacccaag agaaagaggc cgtctactaa gtaagttggc tgacgaattg 300

gaaagccaaa ttgacttggt ttcttccatt gaagctttgg acaatggtaa aactttggcc 360

ttagcccgtg gggatgttac cattgcaatc aactgtctaa gagatgctgc tgcctatgcc 420

gacaaagtca acggtagaac aatcaacacc ggtgacggct acatgaactt caccacctta 480

gagccaatcg gtgtctgtgg tcaaattatt ccatggaact ttccaataat gatgttggct 540

tggaagatcg ccccagcatt ggccatgggt aacgtctgta tcttgaaacc cgctgctgtc 600

acacctttaa atgccctata ctttgcttct ttatgtaaga aggttggtat tccagctggt 660

gtcgtcaaca tcgttccagg tcctggtaga actgttggtg ctgctttgac caacgaccca 720

agaatcagaa agctggcttt taccggttct acagaagtcg gtaagagtgt tgctgtcgac 780

tcttctgaat ctaacttgaa gaaaatcact ttggaactag gtggtaagtc cgcccatttg 840

gtctttgacg atgctaacat taagaagact ttaccaaatc tagtaaacgg tattttcaag 900

aacgctggtc aaatttgttc ctctggttct agaatttacg ttcaagaagg tatttacgac 960

gaactattgg ctgctttcaa ggcttacttg gaaaccgaaa tcaaagttgg taatccattt 1020

gacaaggcta acttccaagg tgctatcact aaccgtcaac aattcgacac aattatgaac 1080

tacatcgata tcggtaagaa agaaggcgcc aagatcttaa ctggtggcga aaaagttggt 1140

gacaagggtt acttcatcag accaaccgtt ttctacgatg ttaatgaaga catgagaatt 1200

gttaaggaag aaatttttgg accagttgtc actgtcgcaa agttcaagac tttagaagaa 1260

ggtgtcgaaa tggctaacag ctctgaattc ggtctaggtt ctggtatcga aacagaatct 1320

ttgagcacag gtttgaaggt ggccaagatg ttgaaggccg gtaccgtctg gatcaacaca 1380

tacaacgatt ttgactccag agttccattc ggtggtgtta agcaatctgg ttacggtaga 1440

gaaatgggtg aagaagtcta ccatgcatac actgaagtaa aagctgtcag aattaagttg 1500

taa 1503

<210> 24

<211> 1404

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> EUTE基因的核苷酸序列

<400> 24

atgaatcaac aggatattga acaggtggtg aaagcggtac tgctgaaaat gcaaagcagt 60

gacacgccgt ccgccgccgt tcatgagatg ggcgttttcg cgtccctgga tgacgccgtt 120

gcggcagcca aagtcgccca gcaagggtta aaaagcgtgg caatgcgcca gttagccatt 180

gctgccattc gtgaagcagg cgaaaaacac gccagagatt tagcggaact tgccgtcagt 240

gaaaccggca tggggcgcgt tgaagataaa tttgcaaaaa acgtcgctca ggcgcgcggc 300

acaccaggcg ttgagtgcct ctctccgcaa gtgctgactg gcgacaacgg cctgacccta 360

attgaaaacg caccctgggg cgtggtggct tcggtgacgc cttccactaa cccggcggca 420

accgtaatta acaacgccat cagcctgatt gccgcgggca acagcgtcat ttttgccccg 480

catccggcgg cgaaaaaagt ctcccagcgg gcgattacgc tgctcaacca ggcgattgtt 540

gccgcaggtg ggccggaaaa cttactggtt actgtggcaa atccggatat cgaaaccgcg 600

caacgcttgt tcaagtttcc gggtatcggc ctgctggtgg taaccggcgg cgaagcggta 660

gtagaagcgg cgcgtaaaca caccaataaa cgtctgattg ccgcaggcgc tggcaacccg 720

ccggtagtgg tggatgaaac cgccgacctc gcccgtgccg ctcagtccat cgtcaaaggc 780

gcttctttcg ataacaacat catttgtgcc gacgaaaagg tactgattgt tgttgatagc 840

gtagccgatg aactgatgcg tctgatggaa ggccagcacg cggtgaaact gaccgcagaa 900

caggcgcagc agctgcaacc ggtgttgctg aaaaatatcg acgagcgcgg aaaaggcacc 960

gtcagccgtg actgggttgg tcgcgacgca ggcaaaatcg cggcggcaat cggccttaaa 1020

gttccgcaag aaacgcgcct gctgtttgtg gaaaccaccg cagaacatcc gtttgccgtg 1080

actgaactga tgatgccggt gttgcccgtc gtgcgcgtcg ccaacgtggc ggatgccatt 1140

gcgctagcgg tgaaactgga aggcggttgc caccacacgg cggcaatgca ctcgcgcaac 1200

atcgaaaaca tgaaccagat ggcgaatgct attgatacca gcattttcgt taagaacgga 1260

ccgtgcattg ccgggctggg gctgggcggg gaaggctgga ccaccatgac catcaccacg 1320

ccaaccggtg aaggggtaac cagcgcgcgt acgtttgtcc gtctgcgtcg ctgtgtatta 1380

gtcgatgcgt ttcgcattgt ttaa 1404

<210> 25

<211> 1332

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ERG12基因的核苷酸序列

<400> 25

atgtcattac cgttcttaac ttctgcaccg ggaaaggtta ttatttttgg tgaacactct 60

gctgtgtaca acaagcctgc cgtcgctgct agtgtgtctg cgttgagaac ctacctgcta 120

ataagcgagt catctgcacc agatactatt gaattggact tcccggacat tagctttaat 180

cataagtggt ccatcaatga tttcaatgcc atcaccgagg atcaagtaaa ctcccaaaaa 240

ttggccaagg ctcaacaagc caccgatggc ttgtctcagg aactcgttag tcttttggat 300

ccgttgttag ctcaactatc cgaatccttc cactaccatg cagcgttttg tttcctgtat 360

atgtttgttt gcctatgccc ccatgccaag aatattaagt tttctttaaa gtctacttta 420

cccatcggtg ctgggttggg ctcaagcgcc tctatttctg tatcactggc cttagctatg 480

gcctacttgg gggggttaat aggatctaat gacttggaaa agctgtcaga aaacgataag 540

catatagtga atcaatgggc cttcataggt gaaaagtgta ttcacggtac cccttcagga 600

atagataacg ctgtggccac ttatggtaat gccctgctat ttgaaaaaga ctcacataat 660

ggaacaataa atacaaacaa ttttaagttc ttagatgatt tcccagccat tccaatgatc 720

ctaacctata ctagaattcc aaggtctaca aaagatcttg ttgctcgcgt tcgtgtgttg 780

gtcaccgaga aatttcctga agttatgaag ccaattctag atgccatggg tgaatgtgcc 840

ctacaaggct tagagatcat gacaaagtta agtaaatgta aaggcaccga tgacgaggcc 900

gtagaaacta ataatgaact gtatgaacaa ctattggaat tgataagaat aaatcatgga 960

ctgcttgtct caatcggtgt ttctcatcct ggattagaac ttattaaaaa tctgagcgat 1020

gatttgagaa ttggctccac aaaacttacc ggtgctggtg gcggcggttg ctctttgact 1080

ttgttacgaa gagacattac tcaagagcaa attgacagtt tcaaaaagaa attgcaagat 1140

gattttagtt acgagacatt tgaaacagac ttgggtggga ctggctgctg tttgttaagc 1200

gcaaaaaatt tgaataaaga tcctaaaatc aaatccctag tattccaatt atttgaaaat 1260

aaaactacca caaagcaaca aattgacgat ctattattgc caggaaacac gaatttacca 1320

tggacttcat aa 1332

<210> 26

<211> 867

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> IDI1基因的核苷酸序列序列

<400> 26

atgactgccg acaacaatag tatgccccat ggtgcagtat ctagttacgc caaattagtg 60

caaaaccaaa cacctgaaga cattttggaa gagtttcctg aaattattcc attacaacaa 120

agacctaata cccgatctag tgagacgtca aatgacgaaa gcggagaaac atgtttttct 180

ggtcatgatg aggagcaaat taagttaatg aatgaaaatt gtattgtttt ggattgggac 240

gataatgcta ttggtgccgg taccaagaaa gtttgtcatt taatggaaaa tattgaaaag 300

ggtttactac atcgtgcatt ctccgtcttt attttcaatg aacaaggtga attactttta 360

caacaaagag ccactgaaaa aataactttc cctgatcttt ggactaacac atgctgctct 420

catccactat gtattgatga cgaattaggt ttgaagggta agctagacga taagattaag 480

ggcgctatta ctgcggcggt gagaaaacta gatcatgaat taggtattcc agaagatgaa 540

actaagacaa ggggtaagtt tcacttttta aacagaatcc attacatggc accaagcaat 600

gaaccatggg gtgaacatga aattgattac atcctatttt ataagatcaa cgctaaagaa 660

aacttgactg tcaacccaaa cgtcaatgaa gttagagact tcaaatgggt ttcaccaaat 720

gatttgaaaa ctatgtttgc tgacccaagt tacaagttta cgccttggtt taagattatt 780

tgcgagaatt acttattcaa ctggtgggag caattagatg acctttctga agtggaaaat 840

gacaggcaaa ttcatagaat gctataa 867

<210> 27

<211> 1197

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ERG10基因的核苷酸序列

<400> 27

atgtctcaga acgtttacat tgtatcgact gccagaaccc caattggttc attccagggt 60

tctctatcct ccaagacagc agtggaattg ggtgctgttg ctttaaaagg cgccttggct 120

aaggttccag aattggatgc atccaaggat tttgacgaaa ttatttttgg taacgttctt 180

tctgccaatt tgggccaagc tccggccaga caagttgctt tggctgccgg tttgagtaat 240

catatcgttg caagcacagt taacaaggtc tgtgcatccg ctatgaaggc aatcattttg 300

ggtgctcaat ccatcaaatg tggtaatgct gatgttgtcg tagctggtgg ttgtgaatct 360

atgactaacg caccatacta catgccagca gcccgtgcgg gtgccaaatt tggccaaact 420

gttcttgttg atggtgtcga aagagatggg ttgaacgatg cgtacgatgg tctagccatg 480

ggtgtacacg cagaaaagtg tgcccgtgat tgggatatta ctagagaaca acaagacaat 540

tttgccatcg aatcctacca aaaatctcaa aaatctcaaa aggaaggtaa attcgacaat 600

gaaattgtac ctgttaccat taagggattt agaggtaagc ctgatactca agtcacgaag 660

gacgaggaac ctgctagatt acacgttgaa aaattgagat ctgcaaggac tgttttccaa 720

aaagaaaacg gtactgttac tgccgctaac gcttctccaa tcaacgatgg tgctgcagcc 780

gtcatcttgg tttccgaaaa agttttgaag gaaaagaatt tgaagccttt ggctattatc 840

aaaggttggg gtgaggccgc tcatcaacca gctgatttta catgggctcc atctcttgca 900

gttccaaagg ctttgaaaca tgctggcatc gaagacatca attctgttga ttactttgaa 960

ttcaatgaag ccttttcggt tgtcggtttg gtgaacacta agattttgaa gctagaccca 1020

tctaaggtta atgtatatgg tggtgctgtt gctctaggtc acccattggg ttgttctggt 1080

gctagagtgg ttgttacact gctatccatc ttacagcaag aaggaggtaa gatcggtgtt 1140

gccgccattt gtaatggtgg tggtggtgct tcctctattg tcattgaaaa gatatga 1197

<210> 28

<211> 1191

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> MVD1基因的核苷酸序列

<400> 28

atgaccgttt acacagcatc cgttaccgca cccgtcaaca tcgcaaccct taagtattgg 60

gggaaaaggg acacgaagtt gaatctgccc accaattcgt ccatatcagt gactttatcg 120

caagatgacc tcagaacgtt gacctctgcg gctactgcac ctgagtttga acgcgacact 180

ttgtggttaa atggagaacc acacagcatc gacaatgaaa gaactcaaaa ttgtctgcgc 240

gacctacgcc aattaagaaa ggaaatggaa tcgaaggacg cctcattgcc cacattatct 300

caatggaaac tccacattgt ctccgaaaat aactttccta cagcagctgg tttagcttcc 360

tccgctgctg gctttgctgc attggtctct gcaattgcta agttatacca attaccacag 420

tcaacttcag aaatatctag aatagcaaga aaggggtctg gttcagcttg tagatcgttg 480

tttggcggat acgtggcctg ggaaatggga aaagctgaag atggtcatga ttccatggca 540

gtacaaatcg cagacagctc tgactggcct cagatgaaag cttgtgtcct agttgtcagc 600

gatattaaaa aggatgtgag ttccactcag ggtatgcaat tgaccgtggc aacctccgaa 660

ctatttaaag aaagaattga acatgtcgta ccaaagagat ttgaagtcat gcgtaaagcc 720

attgttgaaa aagatttcgc cacctttgca aaggaaacaa tgatggattc caactctttc 780

catgccacat gtttggactc tttccctcca atattctaca tgaatgacac ttccaagcgt 840

atcatcagtt ggtgccacac cattaatcag ttttacggag aaacaatcgt tgcatacacg 900

tttgatgcag gtccaaatgc tgtgttgtac tacttagctg aaaatgagtc gaaactcttt 960

gcatttatct ataaattgtt tggctctgtt cctggatggg acaagaaatt tactactgag 1020

cagcttgagg ctttcaacca tcaatttgaa tcatctaact ttactgcacg tgaattggat 1080

cttgagttgc aaaaggatgt tgccagagtg attttaactc aagtcggttc aggcccacaa 1140

gaaacaaacg aatctttgat tgacgcaaag actggtctac caaaggaata a 1191

<210> 29

<211> 1476

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ERG13基因的核苷酸序列

<400> 29

atgaaactct caactaaact ttgttggtgt ggtattaaag gaagacttag gccgcaaaag 60

caacaacaat tacacaatac aaacttgcaa atgactgaac taaaaaaaca aaagaccgct 120

gaacaaaaaa ccagacctca aaatgtcggt attaaaggta tccaaattta catcccaact 180

caatgtgtca accaatctga gctagagaaa tttgatggcg tttctcaagg taaatacaca 240

attggtctgg gccaaaccaa catgtctttt gtcaatgaca gagaagatat ctactcgatg 300

tccctaactg ttttgtctaa gttgatcaag agttacaaca tcgacaccaa caaaattggt 360

agattagaag tcggtactga aactctgatt gacaagtcca agtctgtcaa gtctgtcttg 420

atgcaattgt ttggtgaaaa cactgacgtc gaaggtattg acacgcttaa tgcctgttac 480

ggtggtacca acgcgttgtt caactctttg aactggattg aatctaacgc atgggatggt 540

agagacgcca ttgtagtttg cggtgatatt gccatctacg ataagggtgc cgcaagacca 600

accggtggtg ccggtactgt tgctatgtgg atcggtcctg atgctccaat tgtatttgac 660

tctgtaagag cttcttacat ggaacacgcc tacgattttt acaagccaga tttcaccagc 720

gaatatcctt acgtcgatgg tcatttttca ttaacttgtt acgtcaaggc tcttgatcaa 780

gtttacaaga gttattccaa gaaggctatt tctaaagggt tggttagcga tcccgctggt 840

tcggatgctt tgaacgtttt gaaatatttc gactacaacg ttttccatgt tccaacctgt 900

aaattggtca caaaatcata cggtagatta ctatataacg atttcagagc caatcctcaa 960

ttgttcccag aagttgacgc cgaattagct actcgcgatt atgacgaatc tttaaccgat 1020

aagaacattg aaaaaacttt tgttaatgtt gctaagccat tccacaaaga gagagttgcc 1080

caatctttga ttgttccaac aaacacaggt aacatgtaca ccgcatctgt ttatgccgcc 1140

tttgcatctc tattaaacta tgttggatct gacgacttac aaggcaagcg tgttggttta 1200

ttttcttacg gttccggttt agctgcatct ctatattctt gcaaaattgt tggtgacgtc 1260

caacatatta tcaaggaatt agatattact aacaaattag ccaagagaat caccgaaact 1320

ccaaaggatt acgaagctgc catcgaattg agagaaaatg cccatttgaa gaagaacttc 1380

aaacctcaag gttccattga gcatttgcaa agtggtgttt actacttgac caacatcgat 1440

gacaaattta gaagatctta cgatgttaaa aaataa 1476

<210> 30

<211> 1509

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> tHMG1基因的核苷酸序列

<400> 30

atggttttaa ccaataaaac agtcatttct ggatcgaaag tcaaaagttt atcatctgcg 60

caatcgagct catcaggacc ttcatcatct agtgaggaag atgattcccg cgatattgaa 120

agcttggata agaaaatacg tcctttagaa gaattagaag cattattaag tagtggaaat 180

acaaaacaat tgaagaacaa agaggtcgct gccttggtta ttcacggtaa gttacctttg 240

tacgctttgg agaaaaaatt aggtgatact acgagagcgg ttgcggtacg taggaaggct 300

ctttcaattt tggcagaagc tcctgtatta gcatctgatc gtttaccata taaaaattat 360

gactacgacc gcgtatttgg cgcttgttgt gaaaatgtta taggttacat gcctttgccc 420

gttggtgtta taggcccctt ggttatcgat ggtacatctt atcatatacc aatggcaact 480

acagagggtt gtttggtagc ttctgccatg cgtggctgta aggcaatcaa tgctggcggt 540

ggtgcaacaa ctgttttaac taaggatggt atgacaagag gcccagtagt ccgtttccca 600

actttgaaaa gatctggtgc ctgtaagata tggttagact cagaagaggg acaaaacgca 660

attaaaaaag cttttaactc tacatcaaga tttgcacgtc tgcaacatat tcaaacttgt 720

ctagcaggag atttactctt catgagattt agaacaacta ctggtgacgc aatgggtatg 780

aatatgattt ctaaaggtgt cgaatactca ttaaagcaaa tggtagaaga gtatggctgg 840

gaagatatgg aggttgtctc cgtttctggt aactactgta ccgacaaaaa accagctgcc 900

atcaactgga tcgaaggtcg tggtaagagt gtcgtcgcag aagctactat tcctggtgat 960

gttgtcagaa aagtgttaaa aagtgatgtt tccgcattgg ttgagttgaa cattgctaag 1020

aatttggttg gatctgcaat ggctgggtct gttggtggat ttaacgcaca tgcagctaat 1080

ttagtgacag ctgttttctt ggcattagga caagatcctg cacaaaatgt tgaaagttcc 1140

aactgtataa cattgatgaa agaagtggac ggtgatttga gaatttccgt atccatgcca 1200

tccatcgaag taggtaccat cggtggtggt actgttctag aaccacaagg tgccatgttg 1260

gacttattag gtgtaagagg cccgcatgct accgctcctg gtaccaacgc acgtcaatta 1320

gcaagaatag ttgcctgtgc cgtcttggca ggtgaattat ccttatgtgc tgccctagca 1380

gccggccatt tggttcaaag tcatatgacc cacaacagga aacctgctga accaacaaaa 1440

cctaacaatt tggacgccac tgatataaat cgtttgaaag atgggtccgt cacctgcatt 1500

aaatcctaa 1509

<210> 31

<211> 1356

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ERG8基因的核苷酸序列

<400> 31

atgtcagagt tgagagcctt cagtgcccca gggaaagcgt tactagctgg tggatattta 60

gttttagata caaaatatga agcatttgta gtcggattat cggcaagaat gcatgctgta 120

gcccatcctt acggttcatt gcaagggtct gataagtttg aagtgcgtgt gaaaagtaaa 180

caatttaaag atggggagtg gctgtaccat ataagtccta aaagtggctt cattcctgtt 240

tcgataggcg gatctaagaa ccctttcatt gaaaaagtta tcgctaacgt atttagctac 300

tttaaaccta acatggacga ctactgcaat agaaacttgt tcgttattga tattttctct 360

gatgatgcct accattctca ggaggatagc gttaccgaac atcgtggcaa cagaagattg 420

agttttcatt cgcacagaat tgaagaagtt cccaaaacag ggctgggctc ctcggcaggt 480

ttagtcacag ttttaactac agctttggcc tccttttttg tatcggacct ggaaaataat 540

gtagacaaat atagagaagt tattcataat ttagcacaag ttgctcattg tcaagctcag 600

ggtaaaattg gaagcgggtt tgatgtagcg gcggcagcat atggatctat cagatataga 660

agattcccac ccgcattaat ctctaatttg ccagatattg gaagtgctac ttacggcagt 720

aaactggcgc atttggttga tgaagaagac tggaatatta cgattaaaag taaccattta 780

ccttcgggat taactttatg gatgggcgat attaagaatg gttcagaaac agtaaaactg 840

gtccagaagg taaaaaattg gtatgattcg catatgccag aaagcttgaa aatatataca 900

gaactcgatc atgcaaattc tagatttatg gatggactat ctaaactaga tcgcttacac 960

gagactcatg acgattacag cgatcagata tttgagtctc ttgagaggaa tgactgtacc 1020

tgtcaaaagt atcctgaaat cacagaagtt agagatgcag ttgccacaat tagacgttcc 1080

tttagaaaaa taactaaaga atctggtgcc gatatcgaac ctcccgtaca aactagctta 1140

ttggatgatt gccagacctt aaaaggagtt cttacttgct taatacctgg tgctggtggt 1200

tatgacgcca ttgcagtgat tactaagcaa gatgttgatc ttagggctca aaccgctaat 1260

gacaaaagat tttctaaggt tcaatggctg gatgtaactc aggctgactg gggtgttagg 1320

aaagaaaaag atccggaaac ttatcttgat aaatag 1356

<210> 32

<211> 1953

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> yap1基因的核苷酸序列

<400> 32

atgagtgtgt ctaccgccaa gaggtcgctg gatgtcgttt ctccgggttc attagcggag 60

tttgagggtt caaaatctcg tcacgatgaa atagaaaatg aacatagacg tactggtaca 120

cgtgatggcg aggatagcga gcaaccgaag aagaagggta gcaaaactag caaaaagcaa 180

gatttggatc ctgaaactaa gcagaagagg actgcccaaa atcgggccgc tcaaagagct 240

tttagggaac gtaaggagag gaagatgaag gaattggaga agaaggtaca aagtttagag 300

agtattcagc agcaaaatga agtggaagct acttttttga gggaccagtt aatcactctg 360

gtgaatgagt taaaaaaata tagaccagag acaagaaatg actcaaaagt gctggaatat 420

ttagcaaggc gagatcctaa tttgcatttt tcaaaaaata acgttaacca cagcaatagc 480

gagccaattg acacacccaa tgatgacata caagaaaatg ttaaacaaaa gatgaatttc 540

acgtttcaat atccgcttga taacgacaac gacaacgaca acagtaaaaa tgtggggaaa 600

caattacctt caccaaatga tccaagtcat tcggctccta tgcctataaa tcagacacaa 660

aagaaattaa gtgacgctac agattcctcc agcgctactt tggattccct ttcaaatagt 720

aacgatgttc ttaataacac accaaactcc tccacttcga tggattggtt agataatgta 780

atatatacta acaggtttgt gtcaggtgat gatggcagca atagtaaaac taagaattta 840

gacagtaata tgttttctaa tgactttaat tttgaaaacc aatttgatga acaagtttcg 900

gagttttgtt cgaaaatgaa ccaggtatgt ggaacaaggc aatgtcccat tcccaagaaa 960

cccatctcgg ctcttgataa agaagttttc gcgtcatctt ctatactaag ttcaaattct 1020

cctgctttaa caaatacttg ggaatcacat tctaatatta cagataatac tcctgctaat 1080

gtcattgcta ctgatgctac taaatatgaa aattccttct ccggttttgg ccgacttggt 1140

ttcgatatga gtgccaatca ttacgtcgtg aatgataata gcactggtag cactgatagc 1200

actggtagca ctggcaataa gaacaaaaag aacaataata atagcgatga tgtactccca 1260

ttcatatccg agtcaccgtt tgatatgaac caagttacta atttttttag tccgggatct 1320

accggcatcg gcaataatgc tgcctctaac accaatccca gcctactgca aagcagcaaa 1380

gaggatatac cttttatcaa cgcaaatctg gctttcccag acgacaattc aactaatatt 1440

caattacaac ctttctctga atctcaatct caaaataagt ttgactacga catgtttttt 1500

agagattcat cgaaggaagg taacaattta tttggagagt ttttagagga tgacgatgat 1560

gacaaaaaag ccgctaatat gtcagacgat gagtcaagtt taatcaagaa ccagttaatt 1620

aacgaagaac cagagcttcc gaaacaatat ctacaatcgg taccaggaaa tgaaagcgaa 1680

atctcacaaa aaaatggcag tagtttacag aatgctgaca aaatcaataa tggcaatgat 1740

aacgataatg ataatgatgt cgttccatct aaggaaggct ctttactaag gtgttcggaa 1800

atttgggata gaataacaac acatccgaaa tactcagata ttgatgtcga tggtttatgt 1860

tccgagctaa tggcaaaggc aaaatgttca gaaagagggg ttgtcatcaa tgcagaagac 1920

gttcaattag ctttgaataa gcatatgaac taa 1953

<210> 51

<211> 720

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> spt15-5基因的核苷酸序列

<400> 51

atggccgatg aggaacgttt aaaggagttt aaaggggcaa acaagatagt gtttgatcca 60

aataccagac aagtatggga aaaccagaat cgagatggaa caaaaccagc aactactttc 120

cagagtgaag aggtcataaa aagagctgcc ccagaatctg aaaaagacac ctccgccaca 180

tcaagtattg ttccagagct atagaacatt gtggcaactg tgactttggg gagcaggtta 240

gatctgaaaa cagttgcgct acatgcccgt atgcagaata taacccctag cgttttgctg 300

ctgtcatcat gcgtatagag agccaaaaac tacagcttta atttttgcct cagggaaaat 360

ggttgttacc ggtgcaaaaa gtgaggatga ctcaaagctg gccagaagaa tatatgcagg 420

aattatccaa aaaatcaggt ttgcagctaa attcacagac ttcaaaatac aaaatattgt 480

cggttcgtgt gacgttaatt tccctatacg tctagaaggg ttagcattca gtcatggtac 540

tttctcctcc tatgagccag aattgtttcc tggtttgatc tatagaatgg tgaagccgaa 600

aattgtgttg ttaatttttg tttcaggaaa gattgttctt ctggagcaaa gcaaagggag 660

gaaatttacc aagcttttga agctatatac ccagttctaa gtgaatttag aaaaatgtga 720

<210> 52

<211> 621

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> taf25-3基因的核苷酸序列

<400> 52

atggattttg aggaagatta cgatgcggag tttgatgata atcaagaagg acaattagaa 60

acaccttttc catcggttgc gggagccgat gatggggaca atgataatga tgactctgtc 120

gcagaaaaca tgaagaagaa gcaaaagaga gaggctgtag tggatgatgg gagtgaaaat 180

gcatttggta tacccgaatt tacaagaaaa gataagactc tggaggagat tttagagatg 240

atggacagta ctcctcctat cattcccgat gcagtaatag actactattt aaccaaaaac 300

gggtttaacg tagcatatgt acaagtgaaa cgacttttag cacttgctac tcagaaattt 360

gttagtgata tagctaagga tgcctacgaa tattccagga tcaggtcttc cgtagcggta 420

tctaatgcta acaacagtca ggcgagagct aggcagctat tgcaaggaca gcgacagact 480

ggcgtgcagc agatttcaca acaacaacat caacagaatg agaagactac agcaagcata 540

gttgttctga cggtgaacga tcccagtagc gctgttgctg aatacgggct caatataggt 600

cgcccagact tttatcgtta g 621

Claims (8)

1.一种微生物，其特征在于，

过表达TmCrtE，PagCrtB，BtCrtI和tHMG1基因；以及

沉默Exg1、Ypl062W、GAL1、GAL7和GAL10基因；

其中，所述微生物为酵母菌，

使用SEQ ID NO:1所示ΔLEU2：pGAL1-TmCrtE敲除盒将TmCrtE整合入染色体，整合位点为LEU2；

使用SEQ ID NO:2所示ΔURA3：pGAL1-PagCrtB；pGAL10-BtCrtI敲除盒将PagCrtB和BtCrtI整合入染色体，整合位点为URA3。

2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，进一步过表达包括选自INO2，yap1，spt15-5，taf25-3，GapN，PYC2，SMAE1，MDH2，POS5，pntAB，ADH2，ACS6，ALD6，EUTE，ERG12，IDI1，ERG10，MVD1，ERG13，ERG8基因的至少之一。

3.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，进一步沉默包括选自GAL80，ROX1，VBA5，DOS2，Yjl064W，Yer130C，Yer134C，Ynr063W，Yor292C，Sfk1，Mef1基因的至少之一。

4.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，进一步包括可操作调控ERG9基因。

5.一种获得番茄红素的方法，其特征在于，包括：

将权利要求1～4任一项所述的微生物进行发酵处理；以及

将发酵处理产物进行萃取处理，以便获得所述番茄红素。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵处理是通过如下方式实现的：

将所述微生物进行基础发酵处理和两级分批补料发酵处理，所述基础发酵处理是在基本发酵培养基中进行的，所述两级分批补料发酵处理是通过在所述基本发酵培养基基础上依次补加第一补料培养基和第二补料培养基实现的，

其中，所述基本发酵培养基为含有24g/L蛋白胨，12g/L酵母提取物和12g/L葡萄糖的YPD培养基；

所述第一补料培养基为含有500g/L葡萄糖和15g/L酵母抽提物的YPD培养基；

所述第二补料培养基为75％乙醇和/或50％甘油。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述萃取处理包括：

将所述发酵处理产物进行匀浆破碎或酶解破碎处理以及有机萃取处理。

8.权利要求1～4任一项所述微生物在制备番茄红素中的用途。

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