CN110382685A - 用于提高木糖吸收的表达梅奇酵母木糖转运蛋白的生物和方法 - Google Patents

用于提高木糖吸收的表达梅奇酵母木糖转运蛋白的生物和方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了来源于具有登录号No.081116‑01的梅奇酵母(Metschnikowia)株、在梅奇酵母(Metschnikowia)株登录号No.081116‑01和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的新型木糖转运蛋白和基因修饰的转运蛋白，以及从木糖产生包括木糖醇的生物衍生化合物的使用方法。

Description

用于提高木糖吸收的表达梅奇酵母木糖转运蛋白的生物和 方法
相关申请的交叉引用
本发明申请主张2016年12月21日提交的美国临时专利申请No.62/437,600的优先权益，该专利申请的内容以其全部内容作为参考并入本文。
技术领域
本发明涉及分子生物学和微生物学领域。本文提供了具有提高的木糖吸收和使用木糖作为底物、具有提高的生物衍生化合物的生产的非天然存在的微生物，以及制备和使用这些微生物的方法。
参考序列表
本发明申请包含以ASCII格式，通过EFS-Web提交并且以其全部内容作为参考并入本文的序列表。2017年12月19日所创建的所述ASCII拷贝的名称为14305-007-228_Sequence_Listing.txt并且大小为146,836字节。
发明背景
木糖是存在于作为生产生物衍生化学品的可再生原料的木质纤维生物质中的丰富的糖。然而，木质纤维生物质的使用和生物衍生化学品的生产受微生物中天然的低木糖吸收的限制。因此，在微生物中提高木糖吸收，从而提高从木糖生产生物衍生化合物的产量的方法仍未满足。本文所提供的非天然存在的微生物和方法满足了这些需要并且提供了其它相关优势。
发明概述
本文提供了具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白具有至少89％的同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本文所提供的非天然存在的微生物可以具有编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或至少7个木糖转运蛋白的外源核酸。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以具有与梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白具有至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白为梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白可以是(例如)Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p。
在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。因此，本文还提供了具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖转运蛋白具有至少89％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7、8、9、10、11或12具有至少89％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所提供的非天然存在的微生物可以具有外源核酸SEQ ID NO：13、14、15、16、17、19、20、21、22、23、24、25、26或27。
在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以是泛素-缺陷型。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有SEQ ID NO：44或者SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所提供的非天然存在的微生物具有外源核酸SEQ ID NO：49或者SEQ ID NO：45。
在一些实施方式中，所述外源核酸可以对于宿主微生物中的表达进行密码子-优化。
在一些实施方式中，本文提供了具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p具有至少74％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有与SEQ IDNO：1具有至少74％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述外源核酸具有SEQ IDNO：13或者SEQ ID NO：21所示的序列。
在一些实施方式中，本文提供了具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf1p具有至少85％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有与SEQ IDNO：2具有至少74％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述外源核酸具有SEQ IDNO：14所示的序列。
在一些实施方式中，本文提供了具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)种的ΔGxf1p具有至少89％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有与SEQ IDNO：3具有至少89％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述外源核酸具有SEQ IDNO：15所示的序列。
在一些实施方式中，本文提供了包含至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf2p/Gal2p具有至少71％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有与SEQ ID NO：4具有至少71％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述外源核酸具有SEQ ID NO：16所示的序列。
在一些实施方式中，本文提供了包含至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxs1p/Hgt12p具有至少71％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有与SEQ ID NO：7具有至少71％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述外源核酸具有SEQ ID NO：19所示的序列。
在一些实施方式中，本文提供了包含至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt5p具有至少60％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有与SEQ IDNO：8具有至少60％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述外源核酸具有SEQ IDNO：20所示的序列。
在一些实施方式中，本文提供了包含至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt2.6p具有至少84％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有与SEQ IDNO：10具有至少84％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述外源核酸具有SEQ IDNO：22或者SEQ ID NO：23所示的序列。
在一些实施方式中，本文提供了包含至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)种的Qup2p具有至少50％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有与SEQ IDNO：11具有至少50％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述外源核酸具有SEQ IDNO：24或者SEQ ID NO：25所示的序列。
在一些实施方式中，本文提供了包含至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)种的Aps1p/Hgt19p具有至少74％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有与SEQ ID NO：12具有至少74％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述外源核酸具有SEQ ID NO：26或者SEQ ID NO：27所示的序列。
本文提供了具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)的木糖转运蛋白具有至少89％的同一性的氨基酸序列。所述外源核酸可以是异源核酸。所述微生物可以处于好氧培养基或者基本厌氧的培养基中。所述微生物可以是细菌或酵母。
在一些实施方式中，所述微生物是酵母种，如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、白假丝酵母(Candidaalbicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、汉氏德巴利氏酵母(Debaryomyceshansenii)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、米根霉(Rhizobus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)。
在一些实施方式中，所述微生物是细菌种，如大肠杆菌(Escherichia coli)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、产琥珀酸曼海姆氏菌(Mannheimia succiniciproducens)、菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、乳发酵短杆菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、醋酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridium acetobutylicum)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)或者恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
本文所提供的非天然存在的微生物还可以包括能够从木糖产生生物衍生化合物，如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或3-甲基-丁醇的代谢途径。
本文还提供了产生生物衍生化合物的方法，其包括将本文所提供的非天然存在的微生物在一定条件下培养足够的一段时间以产生所述生物衍生化合物，其中所述微生物具有能够从木糖产生所述生物衍生化合物的途径。所述微生物可以在具有木糖和共基质，如纤维二糖、半纤维素、甘油、半乳糖和葡萄糖或它们的组合的培养基中培养。所述微生物可以分批培养、补料-分批培养或者连续培养。
在一些实施方式中，所述方法还可以包括将所述生物衍生化合物与培养中的其它组分分离。所述分离方法可以包括(例如)提取、连续液-液萃取、渗透气化、膜滤法、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、提取过滤、离子交换色谱、吸附色谱或超滤。
本文还提供了通过本文所述的方法所产生的生物衍生化合物。所述生物衍生化合物可以作为杂质包括(例如)甘油、乙醛、乙酸酯、甘油醛或它们的组合。本文还提供了具有一种或多种本文所述的生物衍生化合物的组合物。在一些实施方式中，所述组合物可以具有所述生物衍生木糖醇。在一些实施方式中，所述组合物可以是培养基。所述组合物可以是除去微生物的培养基。
附图说明
图1显示了通过转运的木糖的量所测量的野生型H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的有效木糖吸收(％)，当H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖转运蛋白XYT1过表达时，其进一步提高(从约55％提高至约65％)。
图2显示了通过单位OD600所转运的木糖所测量的野生型H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的有效木糖吸收(％)，当XYT1过表达时，其进一步提高(从约1.3提高至2.2)。
图3显示了H0 XYT1在酵母菌属(Saccharomyces)中的表达将酵母菌属(Saccharomyces)中的木糖转运从约10％提高至约74％(48小时)。
图4A-4C显示了宿主菌株BY4742(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))以及表达木糖转运蛋白H0梅奇酵母(Metschnikowia)种Gxf2p/Gal2p(“Gal2p”)、H0梅奇酵母(Metschnikowia)种Gxf1p(“Gxf1p”)、H0梅奇酵母(Metschnikowia)种Xyt1p(“Xyt1p”)、H0梅奇酵母(Metschnikowia)种Hxt5p(“Hxt5p”)、H0梅奇酵母(Metschnikowia)种Aps1p/Hgt19p(“Hgt19p”)、中间假丝酵母(Candida intermedia)Gxf1p(“CiGxf1p-65d”)、树干毕赤酵母(pichia stipis)Sut1p(“PsSut1p”)、泛素-缺陷型H0梅奇酵母(Metschnikowia)种Aps1p/Hgt19p(“Δubq-Hgt19p”)或者泛素-缺陷型H0梅奇酵母(Metschnikowia)种Hxt5p(“Δubq-Hxt5p”)的BY4742菌株在18h(图4A)、64h(图4B)和88h(图4C)的木糖吸收。
发明详述
本文所提供的组合物和方法部分基于来自梅奇酵母(Metschnikowia)属的新型木糖转运蛋白的克隆和鉴定的发现。发现一种或多种这些木糖转运蛋白或其变体在宿主微生物中的表达提高了木糖的吸收，以及使用木糖作为底物，通过这些微生物所产生的生物衍生化合物的产量。本文还提供了编码这些木糖转运蛋白的核酸，通过表达这些木糖转运蛋白具有提高的木糖吸收的非天然微生物，以及通过这些微生物所产生的生物衍生化合物。
如本文所使用的，当用于表示本文所述的微生物时，术语“非天然存在的”旨在表示所述微生物具有至少一个通常在参考种的天然存在的菌株，包括参考种的野生型菌株中不存在的遗传改变。遗传改变包括(例如)引入编码代谢多肽的可表达核酸的修饰、其它核酸的添加、核酸缺失和/或微生物遗传物质的其它功能性破环。这些修饰包括(例如)其用于参考种的异源、同源或者异源和同源多肽两者的编码区和功能性片段。其它修饰包括(例如)非编码调控区，其中所述修饰改变了基因或操纵子的表达。示例性的代谢多肽包括(但不限于)木糖醇生物合成途径内的酶或蛋白。
如本文所使用的，术语“微生物的”或“微生物”旨在表示作为包括在古细菌、细菌或真核域(domain)内的微小细胞存在的任何生物。因此，该术语旨在涵盖具有微小尺寸的原核或真核细胞或生物，并且包括所有种的细菌、古细菌和真细菌以及真核微生物，如酵母和真菌。该术语还包括可以培养用于生物化学物质的生产的任何种的细胞培养物。
如本文所使用的，当用于表示微生物时，术语“分离的”旨在表示基本不含如参考微生物在自然界中所存在的至少一种组分的生物。所述术语包括除去如其在自然环境中所存在的一些或所有组分的微生物。所述术语还包括除去如所述微生物在非天然存在的环境中所存在的一些或所有组分的微生物。因此，分离的微生物与如其在自然界中所存在的或者如其在非天然存在的环境中生长、储存或生存的其它物质部分或完全分离。分离的微生物的具体实例包括部分纯的微生物、基本纯的微生物和在非天然存在的培养基中培养的微生物。
如本文所使用的，术语“外源的”旨在表示将参考分子或参考活性引入到宿主微生物中。可以(例如)通过将编码核酸引入到宿主遗传物质中，如通过整合到宿主染色体上或者作为非染色体遗传物质，如质粒来引入所述分子。因此，如对于编码核酸的表达所使用的，该术语是指以可表达形式向微生物中引入所述编码核酸。当用于表示生物合成活性时，所述术语是指引入宿主参考生物中的活性。所述源可以是(例如)在引入宿主微生物后，表达参考活性的同源或异源编码核酸。因此，术语“内源的”是指存在于宿主中的参考分子或活性。类似地，当用于表示编码核酸的表达时，所述术语是指微生物内所含的编码核酸的表达。术语“异源的”是指来源于参考种以外的来源的分子或活性，然而“同源的”是指来源于宿主微生物的分子或活性。因此，本发明的编码核酸的外源表达可以使用异源或同源编码核酸之一或两者。
应理解当微生物中包含不止一种外源核酸时，所述不止一种外源核酸是指参考编码核酸或生物合成活性，如以上所讨论的。还应理解微生物可以具有相同外源核酸的一个或多个拷贝。如本文所公开的，还应理解可以将该不止一个外源核酸引入宿主微生物的单独的核酸分子上，多顺反子核酸分子上或它们的组合，并且仍认为是不止一个外源核酸。例如，如本文所公开的，可以工程设计微生物以表达编码所期望的途径的酶或蛋白的两种或更多种外源核酸。在其中将编码所期望的活性的两个外源核酸引入宿主微生物的情况下，应理解可以将所述两个外源核酸作为单一核酸引入到(例如)单个质粒上，不同的质粒上，可以在单一位点或多个位点整合到宿主染色体上，并且仍认为是两个外源核酸。类似地，应理解可以将大于两种外源核酸以任何所期望的组合，例如，在单一质粒上，在不同的质粒上引入到宿主生物中，可以在单一位点或多个位点整合到宿主染色体上，并且仍认为是两种或更多种外源核酸，例如，三种外源核酸。因此，参考外源核酸或生物合成活性的数目是指编码核酸的数目或者生物合成活性的数目，而不是引入到宿主生物中的单独的核酸的数目。
如本文所使用的，术语“木糖”是指具有化学式C5H10O5的具有甲酰基官能团的5碳单糖，其摩尔质量为150.13g/mol，并且一种IUPAC名为(3R,4S,5R)-环噁烷-2,3,4,5-四醇。木糖在本领域中还已知作为D-木糖、D-吡喃木糖、木糖苷、d-(+)-木糖、吡喃木糖、木糖(wood sugar)、xylomed和D-木戊糖(xylopentose)。
如本文所使用的，术语“木糖转运蛋白”是指有利于木糖跨过细胞膜的移动的膜蛋白。术语“梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白”是指来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖转运蛋白。如本文所使用的，术语“梅奇酵母(Metschnikowia)种”是指属于梅奇酵母(Metschnikowia)属的任何酵母种。示例性的梅奇酵母(Metschnikowia)种包括(但不限于)美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、核果梅奇酵母(Metschnikowiafructicola)、金佩梅奇酵母(Metschnikowia chrysoperlae)、Metschnikowiaandauensis、山西梅奇酵母(Metschnikowia shanxiensis)、中国梅奇酵母(Metschnikowiasinensis)、Metschnikowia zizyphicola、瑞氏梅奇酵母(Metschnikowia reukaufii)、二尖梅奇酵母(Metschnikowia bicuspidata)、Metschnikowia lunata、佐贝尔梅奇酵母(Metschnikowia zobellii)、澳洲梅奇酵母(Metschnikowia australis)、Metschnikowiaagaveae、Metschnikowia gruessii、夏威夷梅奇酵母(Metschnikowia hawaiiensis)、克里斯梅奇酵母(Metschnikowia krissii)、梅奇酵母(Metschnikowia)种NS-O-85株、梅奇酵母(Metschnikowia)种NS-O-89株、梅奇酵母(Metschnikowia)种4MS-2013株和本文所述的独特的梅奇酵母(Metschnikowia)种，梅奇酵母(Metschnikowia)种H0，作为另外一种选择，称为“H0梅奇酵母(Metschnikowia)种”。本文所述的梅奇酵母(Metschnikowia)种，即H0梅奇酵母(Metschnikowia)种是新发现的种，其以指定登记号No.081116-01鉴定并且于2016年11月8日，根据布达佩斯条约的条款，在作为国际保藏中心的加拿大国际保藏中心(“IDAC”)(地址：1015Arlington Street,Winnipeg,Manitoba,Canada R3E 3R2)保藏。
如本文所使用的，当结合蛋白使用时，术语“泛素-缺陷型”是指对一个或多个泛素化位点的泛素化和蛋白酶体-介导的降解作用耐受的蛋白的改变形式。对泛素化的耐受性可以在泛素化频率降低到泛素化完全抑制的范围内。泛素化是酶促翻译后修饰，通过该过程，泛素蛋白附接至底物蛋白的赖氨酸残基上。可以在底物蛋白的单个赖氨酸残基上形成多个泛素蛋白链，并且所述多个泛素蛋白链靶向底物蛋白以用于蛋白酶体-介导的降解作用。因此，泛素-缺陷型蛋白对泛素化和蛋白酶体-介导的降解作用具有部分或完全的耐受性。在一些实施方式中，泛素-缺陷型蛋白在可以泛素化的赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。可以泛素化的赖氨酸残基附近的突变的周围可以在一级序列内或者在3D结构内，只要突变获得了对泛素化的耐受性。这种突变可以是氨基酸替代、缺失或添加。在一些实施方式中，可以泛素化的赖氨酸残基本身被替代为另一种氨基酸。在一些实施方式中，所述赖氨酸残基缺失。在一些实施方式中，可以泛素化的赖氨酸残基附近的一个或多个氨基酸残基突变，从而使所述赖氨酸残基是泛素化机制不可接近的。在一些实施方式中，泛素-缺陷型蛋白在可以泛素化的至少两个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，泛素-缺陷型蛋白在可以泛素化的至少3个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，泛素-缺陷型蛋白在可以泛素化的至少4个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，泛素-缺陷型蛋白在可以泛素化的全部赖氨酸残基处或附近具有氨基酸替代。在一些实施方式中，泛素-缺陷型蛋白在可以泛素化的至少全部赖氨酸残基处具有氨基酸替代，并且对泛素化和蛋白酶体-介导的降解作用完全耐受。
如本文所使用的，术语“培养基”、“生长培养基”或其语法等价形式是指含有支持细胞，包括本文所述的任何微生物种的生长的营养物的液体或固体(例如，凝胶状)物质。支持生长的营养物包括：提供碳的底物，如(但不限于)木糖、纤维二糖、半纤维素、甘油、半乳糖和葡萄糖；提供基本元素的盐，包括镁、氮、磷和硫；氨基酸源，如蛋白胨或胰蛋白胨；和维生素含量源，如酵母提取物。在所述方法和鉴别本文所述的梅奇酵母(Metschnikowia)种中有用的培养基的具体实例包括具有碳源的酵母提取物蛋白胨(YEP)培养基和酵母氮源(YNB)培养基，如(但不限于)木糖、葡萄糖、纤维二糖、半乳糖或甘油或它们的组合。YEP和YNB培养基的配方在本领域中是熟知的。例如，具有4％的木糖的YEP培养基包括(但不限于)酵母提取物1.0g，蛋白胨2.0g，木糖4.0g和100mL水。作为另一实例，具有2％的葡萄糖和2％的木糖的YNB培养基包括(但不限于)生物素2μg、泛酸钙400μg、叶酸2μg、肌醇2000μg、烟酸400μg、p-氨基苯甲酸200μg、盐酸吡哆醇400μg、核黄素200μg、盐酸硫胺400μg、硼酸500μg、硫酸铜40μg、碘化钾100μg、氯化铁200μg、硫酸锰400μg、钼酸钠200μg、硫酸锌400μg、磷酸二氢钾1g、硫酸镁500mg、氯化钠100mg、氯化钙100mg、20g葡萄糖、20g木糖和1L水。本领域技术人员可以容易地确定培养基中碳源的量。当培养基中存在不止一种提供碳的底物时，这些被称为“共-基质”。培养基还可以包括除生长所需的营养物以外的物质，如仅允许所选细胞生长的物质(例如，抗生素或抗真菌剂)，其通常存在于选择培养基中，或者当在相同培养基上生长时，允许相对于另一种微生物来区分一种微生物的物质，其通常存在于鉴别或指示培养基中。这些物质是本领域技术人员所熟知的。
如本文所使用的，当用于表示培养或生长条件时，术语“好氧的”旨在表示在培养或生长条件中可用的游离氧(O2)。当用于表示培养或生长条件时，术语“厌氧的”旨在表示培养或生长条件缺少游离氧(O2)。当用于表示培养或生长条件时，术语“基本厌氧的”旨在表示液体培养基中溶氧的量小于约10％饱和。所述术语还旨在包括包含液体或固体培养基且维持在小于约1％的氧的气氛中的密封盒。
如本文所使用的，术语“生物衍生的”表示来源于生物或者通过生物合成并且可以认为是可再生资源，因为它可以通过生物产生。这种生物，具体地本文所公开的微生物可以使用原料或生物质，如糖(例如，木糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖和阿拉伯糖)、得自农业、植物、细菌或动物来源的碳水化合物，和甘油。
如本文所使用的，术语“生物基的”是指完全或部分由生物衍生化合物所组成的产物。生物基或生物衍生产物是相对于石油衍生产物来说的，其中这种产物来源于或合成自石油或石油化工原料。
本文提供了新型梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白。这些转运蛋白或它们的变体在微生物(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中的表达可以提高木糖吸收并且提高通过这些微生物从木糖产生生物衍生产品的产量。因此，本文提供了作为梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白或其变体的分离的多肽；编码梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白或其变体的分离的核酸；具有编码梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白或其变体的分离的核酸的载体；以及具有提高的木糖吸收和编码梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白或其变体的至少一种外源核酸的非天然存在的微生物。
本文提供了具有提高的木糖吸收的非天然存在的微生物，所述微生物具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白具有至少30％的同一性的氨基酸序列。所述微生物可以具有所述外源核酸的一个或多个拷贝。在一些实施方式中，所述微生物可以具有所述外源核酸的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个拷贝。
本文还提供了与梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白具有至少30％的同一性的分离的多肽。本文还提供了编码与梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白具有至少30％的同一性的多肽的分离的核酸。所述梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白包括(例如)转运蛋白，如来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p。所述梅奇酵母(Metschnikowia)种包括(例如)梅奇酵母(Metschnikowia)种H0、美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、核果梅奇酵母(Metschnikowia fructicola)、金佩梅奇酵母(Metschnikowia chrysoperlae)、Metschnikowia andauensis、山西梅奇酵母(Metschnikowia shanxiensis)、中国梅奇酵母(Metschnikowia sinensis)、Metschnikowia zizyphicola、瑞氏梅奇酵母(Metschnikowia reukaufii)、二尖梅奇酵母(Metschnikowia bicuspidata)、Metschnikowia lunata、佐贝尔梅奇酵母(Metschnikowiazobellii)、澳洲梅奇酵母(Metschnikowia australis)、Metschnikowia agaveae、Metschnikowia gruessii、夏威夷梅奇酵母(Metschnikowia hawaiiensis)、克里斯梅奇酵母(Metschnikowia krissii)、梅奇酵母(Metschnikowia)种NS-O-85株、梅奇酵母(Metschnikowia)种NS-O-89株和梅奇酵母(Metschnikowia)种4MS-2013株。所述梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白可以是来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖转运蛋白。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以包括(例如)来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p。以下提供了示例性序列。
超过一个木糖转运蛋白的表达可以进一步改善木糖吸收。照此，所述非天然存在的微生物可以具有至少1个外源核酸，或者至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或至少11个分别编码木糖转运蛋白的核酸。在一些实施方式中，所述微生物具有至少2个分别编码木糖转运蛋白的外源核酸。在一些实施方式中，所述微生物具有至少3个分别编码木糖转运蛋白的外源核酸。在一些实施方式中，所述微生物具有至少4个分别编码木糖转运蛋白的外源核酸。在一些实施方式中，所述微生物具有至少5个分别编码木糖转运蛋白的外源核酸。在一些实施方式中，所述微生物具有至少6个分别编码木糖转运蛋白的外源核酸。在一些实施方式中，所述微生物具有至少7个分别编码木糖转运蛋白的外源核酸。在一些实施方式中，所述微生物具有至少8个分别编码木糖转运蛋白的外源核酸。在一些实施方式中，所述微生物具有至少9个分别编码木糖转运蛋白的外源核酸。在一些实施方式中，所述微生物具有至少10个分别编码木糖转运蛋白的外源核酸。在一些实施方式中，所述微生物具有至少11个分别编码木糖转运蛋白的外源核酸。
本文所提供的木糖转运蛋白可以是梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白，其包括如来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的具有如序列表中所示的氨基酸序列的那些以及保留了它们的转运蛋白功能的它们的变体。例如，本文提供了具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p以及保留了Xyt1p的转运蛋白功能的它的变体。Xyt1p的转运蛋白功能包括(但不限于)将木糖转运穿过细胞壁和/或细胞膜，其可以(例如)通过对所述变体进行如本文所述或另外如本领域中已知的转运蛋白测定来确定。可以(例如)通过在微生物中表达转运蛋白并测量所述微生物对木糖吸收的提高来确定木糖转运蛋白的功能。在示例性测定中，可以在含有木糖的培养基中培养表达外源转运蛋白的非木糖利用微生物，并且可以使用Rezex RPM-monosaccharide Pb+2柱(Phenomenex)、差示折光检测器并以水作为流动相，以0.6ml/min的流速，通过高效液相色谱法(HPLC)来测量培养基中木糖的减少。在另一个示例性测定中，对于表达多种转运蛋白的野生型和转基因微生物，起始培养物可以在具有控制的量的葡萄糖和木糖(％；w/v)的YP基础培养基中生长。将未接种的培养基用作给定取样时间的参比；所述培养基指示了100％的起始木糖或时间0h时的木糖。以24h的间隔，可以从培养物中无菌移除300-1000μL体积的样品并通过0.2μm注射器过滤器过滤，从而将培养基与酵母物理分离。可以将培养基转移到玻璃小瓶中，并且可以通过HPLC检验木糖含量。可以通过与预先确定的标准曲线相比较来确定采样培养基中保留的木糖的量，并将保留的样品归一化为未接种的培养基中的木糖含量，所述未接种的培养基中的木糖含量记为培养开始时含有100％的木糖。表达外源木糖转运蛋白的非天然存在的微生物可以以高于它们的野生型对应微生物的速率消耗木糖，并且在野生型和表达外源木糖转运蛋白的非天然存在的微生物之间培养基中木糖的减少速率可以指示外源木糖转运蛋白的转运蛋白功能。
在一些实施方式中，本文还提供了作为保留了其转运蛋白功能的梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的变体的分离的多肽。本文还提供了编码作为保留了其转运蛋白功能的梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的变体的多肽的分离的核酸。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的变体是泛素-缺陷型。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白在可以泛素化的至少一个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白在可以泛素化的至少两个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白在可以泛素化的至少三个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白在可以泛素化的全部赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述氨基酸突变为赖氨酸残基的替代。在一些实施方式中，所述氨基酸突变为赖氨酸残基的缺失。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白在可以泛素化的赖氨酸残基附近具有氨基酸突变，从而使所述赖氨酸残基是泛素化机制不可接近的。在一些实施方式中，本文提供了具有编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白是保留了其转运蛋白功能的梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的变体。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是保留其转运蛋白功能的来自如本文所述的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖转运蛋白的变体。在一些实施方式中，所述H0梅奇酵母(Metschnikowia)种木糖转运蛋白的变体是泛素-缺陷型。
在一些实施方式中，本文还提供了作为保留转运蛋白功能的来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p的变体的分离的多肽。本文还提供了作为保留转运蛋白功能的来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p的变体的分离的多肽。在一些实施方式中，所述变体是泛素-缺陷型。在一些实施方式中，本文还提供了编码作为保留转运蛋白功能的来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p的变体的多肽的分离的核酸。在一些实施方式中，本文还提供了编码作为保留转运蛋白功能的来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p的变体的多肽的分离的核酸。
在一些实施方式中，本文提供了具有编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白是保留转运蛋白功能的来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p的变体。在一些实施方式中，本文提供了具有编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白是保留转运蛋白功能的来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p的变体。在一些实施方式中，所述变体是泛素-缺陷型。
本文所述的木糖转运蛋白可以具有与在本文中通过SEQ ID NO、GenBank和/或GI编号所公开的氨基酸序列具有至少30％的同一性，至少35％的同一性，至少40％的同一性，至少45％的同一性，至少50％的同一性，至少55％的同一性，至少60％的同一性，至少65％的同一性，至少70％的同一性，至少75％的同一性，至少80％的同一性，至少85％的同一性，至少90％的同一性，至少91％的同一性，至少92％的同一性，至少93％的同一性，至少94％的同一性，至少95％的同一性，至少96％的同一性，至少97％的同一性，至少98％的同一性，或者至少99％的同一性，或者相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所述的木糖转运蛋白可以具有与在本文中通过SEQ ID NO、GenBank和/或GI编号所述的氨基酸具有35％、40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性或者相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所述的木糖转运蛋白可以具有与SEQ ID NO：1-5和7-12中任一项具有35％、40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％的序列同一性或者相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本文提供了分离的多肽，其具有与梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白，如梅奇酵母(Metschnikowia)Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，本文提供了分离的核酸，其编码具有与梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白，如梅奇酵母(Metschnikowia)Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方式中，本文提供了具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白，如梅奇酵母(Metschnikowia)Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述外源核酸编码梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白，如梅奇酵母(Metschnikowia)Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p。
序列同一性(也称为同源性或相似性)是指两个核酸分子之间或者两个多肽之间的序列相似性。可以通过比较每条序列中的位置来确定同一性，其可以出于比较的目的进行比对。当所比较的序列中的位置被相同碱基或氨基酸占据时，则所述分子在该位置是同一的。序列之间的同一性程度是所述序列所共有的匹配或同源位置数目的函数。可以使用本领域中已知的软件程序进行两条序列的比对以确定它们的序列同一性百分比，所述软件程序如(例如)Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley andSons,Baltimore,MD(1999)。优选地，使用缺省参数进行比对。可以使用的在本领域中熟知的一种比对程序是设置为缺省参数的BLAST。具体地，程序为BLASTN和BLASTP，使用以下缺省参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；预期值＝10；Matrix＝BLOSUM62；描述＝50条序列；排序依据＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息可见于国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)。
具体的木糖转运蛋白的变体还可以包括(例如)当与参考木糖转运蛋白相比时的氨基酸替代、缺失、融合或截短。本文所述的梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的变体还可以含有保守性氨基酸替代，这表示可以通过不改变所述木糖转运蛋白的二级和/或三级结构的氨基酸来替代一个或多个氨基酸。这些替代可以包括通过具有类似物理化学性质的残基对氨基酸的替代，如用一个脂肪族残基(Ile、Val、Leu或Ala)替代另一个，或者碱性残基Lys和Arg，酸性残基Glu和Asp、酰胺残基Gln和Asn、羟基残基Ser和Tyr或者芳香族残基Phe和Tyr之间的替代。在Bowie等人,Science 247:1306-10(1990)中更全面地描述了表型沉默的氨基酸交换。另外，梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的变体包括对所述蛋白的功能区以外的氨基酸序列具有氨基酸替代、缺失或添加的那些，只要所述替代、缺失或添加不影响所产生的多肽的木糖转运功能。在一些实施方式中，所述变体是泛素-缺陷型。做出这些替代或缺失的技术在本领域中是熟知的并且包括(例如)定点突变。
在一些实施方式中，本文提供了具有编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p的1至50，1至45，1至40，1至35，1至30，1至25，1至20，1至15，1至10或者1到5个氨基酸替代、缺失或插入并且保留了转运蛋白功能。所述梅奇酵母(Metschnikowia)种可以是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p的1至10个氨基酸替代、缺失或插入并且保留了转运蛋白功能。所述梅奇酵母(Metschnikowia)种可以是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p的1至5个氨基酸替代、缺失或插入并且保留了转运蛋白功能。所述梅奇酵母(Metschnikowia)种可以是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的泛素-缺陷型Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p并且保留了转运蛋白功能。所述梅奇酵母(Metschnikowia)种可以是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。
本文所提供的木糖转运蛋白还包括保留了它们的转运蛋白功能的特异性梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的功能性片段。在一些实施方式中，本文提供了作为特异性梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的功能性片段的分离的多肽。在一些实施方式中，本文提供了编码作为特异性梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的功能性片段的多肽的分离的核酸。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以是保留了转运蛋白功能的木糖转运蛋白，如梅奇酵母(Metschnikowia)Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p的片段。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以是保留了转运蛋白功能的木糖转运蛋白，如来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p的片段。
在一些实施方式中，本文提供了具有与梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白，包括如梅奇酵母(Metschnikowia)Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p的功能性片段具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的分离的多肽。在一些实施方式中，本文提供了编码具有与梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白，包括如梅奇酵母(Metschnikowia)Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p的功能性片段具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽的分离的核酸。
在一些实施方式中，本文提供了具有与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖转运蛋白，包括如梅奇酵母(Metschnikowia)Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p的功能性片段具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的分离的多肽。在一些实施方式中，本文提供了编码具有与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖转运蛋白，包括如梅奇酵母(Metschnikowia)Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p的功能性片段具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽的分离的核酸。
在一些实施方式中，本文提供了具有编码保留了其转运蛋白功能的梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的功能性片段的外源核酸的非天然存在的微生物。在一些实施方式中，本文所提供的非天然存在的微生物具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸，所述木糖转运蛋白与梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白，包括如梅奇酵母(Metschnikowia)Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p的功能性片段具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。在一些实施方式中，本文所提供的非天然存在的微生物具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸，所述木糖转运蛋白与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖转运蛋白，如Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p或Aps1p/Hgt19p的功能性片段具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
在一些实施方式中，本文所述的梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的变体包括通过其它化学部分，如葡糖基基团、聚乙二醇(PEG)基团、脂类、磷酸盐、乙酰基等的共价修饰或集体缀合(aggregative conjugation)。在一些实施方式中，本文所述的梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的变体还包括(例如)由木糖转运蛋白多肽和另一种多肽所形成的融合蛋白。用于构建所述融合蛋白的所添加的多肽包括有利于木糖转运蛋白的纯化或寡聚的那些，或者提高木糖转运蛋白的稳定性和/或转运能力或转运速率的那些。在一些实施方式中，当与本文所述的木糖转运蛋白融合时，所添加的多肽获得了提高的转运能力。
本文所述的梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白可以融合至异源多肽以有利于纯化。多个可用的异源肽(肽标签)允许所述融合蛋白与结合伴侣的选择性结合。肽标签的非限制性实例包括6-His、硫氧还蛋白、血球凝集素、GST和OmpA信号序列标签。识别并结合至异源肽标签的结合伴侣可以是任何分子或化合物，其包括金属离子(例如，金属亲和柱)、抗体、抗体片段或者选择性或特异性结合所述异源肽以允许所述融合蛋白的纯化的任何蛋白或肽。
还可以修饰梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白以有利于寡聚物的形成。例如，Xyt1p多肽可以融合至促进寡聚的肽部分，如亮氨酸拉链，和某些抗体片段多肽，如Fc多肽。用于制备这些融合蛋白的技术是已知的，并且在(例如)WO 99/31241和Cosman等人,Immunity 14:123-133(2001)中得到描述。。融合至Fc多肽提供了有利于在蛋白A或蛋白G柱上通过亲和色谱法纯化的额外的益处。在Landschulz等人,Science 240:1759-64(1988)中描述了融合至亮氨酸-拉链(LZ)，例如，七肽重复序列，它是中间散布着其它氨基酸的四或五个亮氨酸残基。
可以以分离形式或者以基本纯化的形式提供本文所述的木糖转运蛋白。可以通过已知方法从重组细胞培养物中回收和纯化多肽，所述方法包括(例如)硫酸铵或乙醇沉淀、阴离子或阳离子交换色层法、磷酸纤维素色谱法、疏水性相互作用色谱法、亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法和凝集素色谱法。在一些实施方式中，蛋白色谱法用于纯化。
可以通过适合的宿主重组表达本文所述的梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白。当所述梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的异源表达是所期望的时，可以根据所述宿主的密码子使用修饰特定梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的编码序列。标准遗传密码在本领域中是熟知的，如(例如)Osawa等人,Microbiol Rev.56(1):229-64(1992)中所综述的。酵母种，包括(但不限于)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、阿斯米假丝酵母(Candida azyma)、叉开假丝酵母(Candida diversa)、木兰假丝酵母(Candidamagnoliae)、皱膜假丝酵母(Candida rugopelliculosa)、解脂耶罗威亚酵母(Yarrowialipolytica)和Zygoascus hellenicus使用标准编码。某些酵母种使用替代编码。例如，“Leu”的“CUG”标准密码子在菌种，如白假丝酵母(Candida albicans)、柱状假丝酵母(Candida cylindracea)、口津假丝酵母(Candida melibiosica)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、褶皱假丝酵母(Candida rugose)、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)和梅奇酵母(Metschnikowia)种中编码“Ser”。以下提供了H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的密码子表。来自非“CUG”进化枝种的外源基因中的DNA密码子CTG需要转变为TTG、CTT、CTC、TTA或CTA以用于梅奇酵母(Metschnikowia)种中蛋白的功能性表达。其它密码子优化可以导致梅奇酵母(Metschnikowia)种中外源基因的蛋白表达的提高。密码子优化可以导致宿主中外源基因的蛋白表达的提高。密码子优化的方法在本领域中是熟知的(例如，Chung等人,BMC Syst Biol.6:134(2012)；Chin等人,Bioinformatics 30(15):2210-12(2014))，并且多种工具是可用的(例如,https://www.dna20.com/services/ genegps的DNA2.0；和http://genomes.urv.es/OPTIMIZER的OPTIMIZER)。
表：H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的密码子
氨基酸 SLC DNA密码子
异亮氨酸 I ATT ATC ATA
亮氨酸 L CTT CTC CTA TTA TTG
缬氨酸 V GTT GTC GTA GTG
苯丙氨酸 F TTT TTC
蛋氨酸 M ATG
半胱氨酸 C TGT TGC
丙氨酸 A GCT GCC GCA GCG
甘氨酸 G GGT GGC GGA GGG
脯氨酸 P CCT CCC CCA CCG
苏氨酸 T ACT ACC ACA ACG
丝氨酸 S TCT TCC TCA TCG AGT AGC CTG
酪氨酸 Y TAT TAC
色氨酸 W TGG
谷氨酰胺 Q CAA CAG
天门冬酰胺 N AAT AAC
组氨酸 H CAT CAC
谷氨酸 E GAA GAG
门冬氨酸 D GAT GAC
赖氨酸 K AAA AAG
精氨酸 R CGT CGC CGA CGG AGA AGG
终止密码子 Stop TAA TAG TGA
此外，宿主可以同时产生其它转运蛋白，从而在相同细胞中表达多个转运蛋白，其中不同的转运蛋白可以形成寡聚物以转运相同的糖。作为另外一种选择，不同的转运蛋白可以单独起作用以转运不同的糖。
可以通过本领域中已知的常规方法产生梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的变体，如通过寡核苷酸-定位的定点突变，在特定位置引入突变。定点突变被认为是蛋白质工程的信息方法并且可以依赖于靶标蛋白的高分辨率晶体结构来进行特定氨基酸改变(Van Den Burg等人,PNAS95:2056-60(1998))。用于鉴别多种蛋白质工程目标的位点特异性改变的计算方法也是本领域中已知的(Hellinga,Nature Structural Biology 5:525-27(1998))。
本领域中已知的其它技术包括(但不限于)非信息性突变技术(一般地称为“定向进化”)。定向进化结合高通量筛选使得能够测试蛋白构象中统计学有意义的变化(Arnold,1998)。定向进化技术可以包括类似于Crameri等人,Nature 391:288-91(1998)中所述的多样化方法、定点饱和突变、交错延伸法(StEP)(Zhao等人,Nature Biotechnology 16:258-61(1998))和DNA合成/重组装(美国专利No.5,965,408)。
如本文所公开的，可以将编码木糖转运蛋白的核酸引入宿主生物。在一些情况下，还可以期望修饰生物合成途径酶或蛋白活性以提高所期望的产物的产量。例如，可以将已知提高蛋白或酶活性的突变引入编码核酸分子。另外，可以应用优化方法以提高酶或蛋白的活性和/或降低抑制活性，例如，降低负调节蛋白的活性。
一种这种优化方法是定向进化。定向进化是包括引入靶向特定基因的突变以改善和/或改变酶的性质的强有力的方法。可以通过开发和实施允许自动筛选多种酶变体(例如，>104种)的灵敏的高通量筛选测定来鉴别改善和/或改变的酶。通常进行突变和筛选的迭代循环以提供具有优化性质的酶。还已开发了可以帮助鉴别用于突变的基因区域的计算算法，并且所述计算算法可以显著减少需要产生和筛选的酶变体的数目。已发展了多种定向进化技术(有关综述，参见Hibbert等人,Biomol.Eng 22:11-19(2005)；Huisman andLalonde,In Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries,第717-742页(2007),Patel(主编),CRC Press；Otten and Quax.Biomol.Eng 22:1-9(2005)；和Sen等人,Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223(2007))以有效产生多种变体库，并且这些方法已成功应用于多种酶种类中广泛的性质的改善。已通过定向进化技术改善和/或改变的酶的特性包括，例如：对于非天然底物的转化，选择性/特异性；对于稳健的高温处理，温度稳定性；对于在较低或较高的pH条件下的生物加工，pH稳定性；底物或产物耐受性，从而可以实现高产物滴度；结合(Km)，包括拓宽底物结合以包括非天然底物；抑制(Ki)，以除去抑制副产物、底物或关键中间体；活性(kcat)，以提高酶促反应速率以实现所期望的流量；表达水平，以提高蛋白得率和整体途径流量；氧气稳定性，用于空气敏感性酶在好氧条件下的操作；和厌氧活性，用于好氧酶在不存在氧气的情况下的操作。
已发展了针对特定酶的所期望的性质，使基因突变和多样化的一些示例性方法。这些方法对于本领域技术人员来说是熟知的。任何这些可以用于改变和/或优化木糖转运蛋白或生物合成途径酶或蛋白的活性。这些方法包括(但不限于)EpPCR，其通过降低PCR反应中DNA聚合酶的保真度来引入随机点突变(Pritchard等人,J Theor.Biol.234:497-509(2005))；易错滚环扩增(epRCA)，其类似于epPCR，除了将整个环形质粒用作模板并且将在最后2个核苷酸上具有核酸外切酶耐受性硫代磷酸键的随机6-聚体用于扩增所述质粒，然后将其转化至细胞，并且在所述细胞中，所述质粒在串联重复序列再环化(Fujii等人,Nucleic Acids Res.32:e145(2004)；和Fujii等人,Nat.Protoc.1:2493-2497(2006))；DNA或家族重排，其通常包括用核酸酶，如DNA酶I或者EndoV消化两种或更多种变体基因以产生随机片段池，所述随机片段池在存在DNA聚合酶的情况下通过退火和延伸循环重新组装以产生嵌合基因库(Stemmer,Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751(1994)；和Stemmer,Nature 370:389-391(1994))；交错延伸(StEP)，其需要模板引导(template priming)，然后是具有变性和非常短的持续时间的退火/延伸(短至5秒)的2步PCR的重复循环(Zhao等人,Nat.Biotechnol.16:258-261(1998))；随机引导重组(RPR)，其中使用随机序列引物来产生与模板的不同片段互补的多个短DNA片段(Shao等人,Nucleic Acids Res 26:681-683(1998))。
其它方法包括异源双链重组，其中将线性化质粒DNA用于形成通过错配修复所修复的异源双链(Volkov等人,Nucleic Acids Res.27:e18(1999)；和Volkov等人,MethodsEnzymol.328:456-463(2000))；临时模板随机嵌合(RACHITT)，其使用了DNA酶I断裂和单链DNA(ssDNA)的大小分级(Coco等人,Nat.Biotechnol.19:354-359(2001))；截短模板上的重组延伸(RETT)，其需要在存在用作模板池的单向ssDNA片段的情况下链从引物单向生长的模板转换(Lee等人,J.Molec.Catalysis 26:119-129(2003))；简并寡核苷酸基因重排(DOGS)，其中将简并引物用于控制分子之间的重组；(Bergquist and Gibbs,MethodsMol.Biol 352:191-204(2007)；Bergquist等人,Biomol.Eng 22:63-72(2005)；Gibbs等人,Gene 271:13-20(2001))；用于产生杂合酶的增长截短法(ITCHY)，其产生了具有所关心的基因或基因片段的1个碱基对缺失的组合库(Ostermeier等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:3562-3567(1999)；和Ostermeier等人,Nat.Biotechnol.17:1205-1209(1999))；用于产生杂合酶的硫代增长截短法(THIO-ITCHY)，其类似于ITCHY，除了将硫代磷酸酯dNTP用于产生截短(Lutz等人,Nucleic Acids Res29:E16(2001))；SCRATCHY，其组合了用于重组基因的两种方法，ITCHY和DNA重排(Lutz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:11248-11253(2001))；随机漂变突变(RNDM)，其中通过epPCR进行突变，然后筛选/选择保留了可用活性的那些(Bergquist等人,Biomol.Eng.22:63-72(2005))；序列饱和突变(SeSaM)，随机突变方法，其使用硫代磷酸酯核苷酸的随机掺入和切割，产生随机长度片段池，所述随机长度片段池用作在存在“通用”碱基，如肌苷的情况下延伸的模板，并且含有肌苷的互补序列的复制提供了随机碱基掺入，并因此导致突变(Wong等人,Biotechnol.J.3:74-82(2008)；Wong等人,Nucleic Acids Res.32:e26(2004)；和Wong等人,Anal.Biochem.341:187-189(2005))；合成重排，其使用设计以编码“靶标中所有遗传多样性”的重叠寡核苷酸并且允许重排子代具有很高的多样性(Ness等人,Nat.Biotechnol.20:1251-1255(2002))；核苷酸交换和切割技术NexT，其利用了dUTP掺入与随后使用尿嘧啶DNA糖基化酶，然后用哌啶处理以进行终点DNA断裂的组合(Muller等人,Nucleic Acids Res.33:e117(2005))。
其它方法包括不依赖于序列同源性的蛋白质重组(SHIPREC)，其中将接头用于辅助两种远缘相关或不相关基因的融合，并且在所述两种基因之间产生一定范围的嵌合体，从而导致产生了单一混合杂交库(Sieber等人,Nat.Biotechnol.19:456-460(2001))；基因位点饱和突变TM(GSSMTM)，其中起始材料包括在所期望的突变位点含有简并的插入和两个引物的超螺旋双链DNA(dsDNA)质粒(Kretz等人,Methods Enzymol.388:3-11(2004))；组合盒式突变(CCM)，其包括使用短寡核苷酸盒以替代具有大量可能的氨基酸序列变化的限制区(Reidhaar-Olson等人,Methods Enzymol.208:564-586(1991)；和Reidhaar-Olson等人Science 241:53-57(1988))；组合多级盒式突变(CMCM)，其本质上类似于CCM并且使用高突变率的epPCR来鉴别热点(hot spots)和热区(hot regions)，然后通过CMCM延伸以覆盖限定的蛋白序列空间区域(Reetz等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.40:3589-3591(2001))；致突变菌株技术，其中条件性ts致突变质粒使用了mutD5基因，其编码了DNA聚合酶III的突变体亚基，从而在选择期间和当不需要选择时，在阻断有害突变的积累期间，允许随机和自然突变频率提高20至4000-X(Selifonova等人,Appl.Environ.Microbiol.67:3645-3649(2001))；Low等人,J.Mol.Biol.260:359-3680(1996))。
其它示例性方法包括浏览突变(LTM)，它是评价和优化所选氨基酸的组合突变的多维突变方法(Rajpal等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:8466-8471(2005))；基因重组装，它是可以一次应用于多个基因并且产生单个基因的大型嵌合体库(多个突变)的DNA重排法(Verenium Corporation所提供的Tunable GeneReassemblyTM(TGRTM)技术)、计算机蛋白设计自动化(PDA)，它是锚定具有特定折叠的在结构上限定的蛋白主链，并且搜索可以稳定所述折叠和整体蛋白能学的用于氨基酸替代的序列空间的优化算法，并且它通常对具有已知三维结构的蛋白最有效(Hayes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:15926-15931(2002))；和迭代饱和突变(ISM)，其包括使用结构/功能的知识来选择用于酶改善的可能位点，使用突变法，如Stratagene QuikChange(Stratagene；San Diego CA)在所选位点进行饱和突变，对于所期望的性质进行筛选/选择，并且使用改善的克隆，在另一位点重复一次并继续重复直至实现所期望的活性(Reetz等人,Nat.Protoc.2:891-903(2007)；和Reetz等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.45:7745-7751(2006))。
可以单独或以任意组合使用任何上述突变方法。另外，所述定向进化方法中的任一种或组合可以结合如本文所述的或者另外如本领域中已知的适应进化技术使用。
本文还提供了编码本文所述的梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的分离的核酸。本文所提供的核酸包括具有序列表中所提供的核酸序列的那些；在高严格性杂交条件下(例如，42°，2.5hr.，6×SCC，0.1％SDS)，杂交至序列表中所提供的核酸序列的那些；和与序列表中所提供的核酸序列具有显著核酸序列同一性的那些。本文所提供的核酸还涵盖了可以翻译以产生相同氨基酸序列的等价密码子替代。本文还提供了包含本文所述的核酸的载体。所述载体可以是适合于在宿主微生物中表达的表达载体。所述载体可以是2μ载体。所述载体可以是ARS载体。
本文所提供的核酸包括编码具有如本文所述的氨基酸序列的木糖转运蛋白的那些以及保留了转运蛋白活性的它们的变体。本文所提供的核酸可以是cDNA、化学合成的DNA、通过PCR扩增的DNA、RNA或其组合。由于遗传密码的简并度，两条DNA序列可以不同，但仍编码相同的氨基酸序列。
本文还提供了编码本文所述的梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的有用的核酸片段，包括探针和引物。可以(例如)在PCR方法中使用这些探针和引物以体外扩增或检测编码梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的核酸的存在，并且可以在DNA和RNA印迹中用于分析。还可以通过使用这些探针来鉴别表达梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的细胞。用于产生和使用这些引物和探针的方法是已知的。
本文还提供了编码梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的核酸片段，所述核酸片段是具有能够结合至梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白的靶标mRNA或DNA序列的单链核酸的反义或正义寡核苷酸。
编码本文所述的木糖转运蛋白的核酸可以包括杂交至本文通过SEQ ID NO、GenBank和/或GI编号所公开的核酸的核酸或者杂交至编码本文通过SEQ ID NO、GenBank和/或GI编号所公开的氨基酸序列的核酸分子的核酸分子。杂交条件可以包括如本文所述的那些的本领域技术人员熟知的高度严格性、中等严格性或低严格性杂交条件。
严格杂交是指杂交的多核苷酸稳定的条件。如本领域技术人员已知的，杂交的多核苷酸的稳定性反映在杂交物的解链温度(Tm)。一般地，杂交的多核苷酸的稳定性是盐浓度，例如，钠离子浓度和温度的函数。杂交反应可以在较低的严格性条件下进行，然后通过不同，但更高的严格性清洗。对杂交严格性的提及涉及这些清洗条件。高度严格杂交包括仅允许在0.018M NaCl，65℃形成稳定的杂化多核苷酸的那些核酸序列杂交的条件，例如，如果杂交物在0.018M NaCl，65℃不稳定，则它在高严格性条件下将不会稳定，如本文所考虑的。可以(例如)通过在50％甲酰胺、5×Denhart溶液、5×SSPE、0.2％SDS中，在42℃杂交，然后在0.1×SSPE和0.1％SDS中，在65℃清洗来提供高严格性条件。除高严格性杂交条件以外的杂交条件也可以用于描述本文所公开的核酸序列。例如，短语中等严格性杂交是指相当于在50％甲酰胺、5×Denhart溶液、5×SSPE、0.2％SDS中，在42℃杂交，然后在0.2×SSPE和0.2％SDS中，在42℃清洗的条件。短语低严格性杂交是指相当于在10％甲酰胺、5×Denhart溶液、6×SSPE、0.2％SDS中，在22℃杂交，然后在1×SSPE、0.2％SDS中，在37℃清洗的条件。Denhart溶液含有1％聚蔗糖、1％聚乙烯吡咯烷酮和1％牛血清白蛋白(BSA)。20×SSPE(氯化钠、磷酸钠、乙二胺四乙酸(EDTA))含有3M氯化钠、0.2M磷酸钠和0.025M(EDTA)。其它适合的低、中等和高严格性杂交缓冲液和条件对于本领域技术人员是熟知的并且在(例如)Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring HarborLaboratory,New York(2001)；和Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)。
编码本文所提供的木糖转运蛋白的核酸包括与本文通过SEQ ID NO、GenBank和/或GI编号所公开的核酸具有特定序列同一性百分比的那些。例如，编码木糖转运蛋白的核酸可以与本文通过SEQ ID NO、GenBank和/或GI编号所述的核酸具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性或者是相同的。在一些实施方式中，所述核酸分子可以与选自SEQ ID NO：10-16和19-27的序列具有35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性或者是相同的。
在一些实施方式中，本文提供了具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Xyt1p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的分离的多肽。在一些实施方式中，本文提供了编码具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Xyt1p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽的分离的核酸。在一些实施方式中，本文提供了具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Xyt1p具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以是梅奇酵母(Metschnikowia)Xyt1p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以是保留其转运蛋白功能的梅奇酵母(Metschnikowia)Xyt1p的变体。所述木糖转运蛋白可以是梅奇酵母(Metschnikowia)Xyt1p的功能性片段。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p的1至50，1至45，1至40，1至35，1至30，1至25，1至20，1至15，1至10或者1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p的1至10个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p的1至5个氨基酸替代、缺失或插入。
在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的泛素-缺陷型Xyt1p。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Xyt1p在可以泛素化的至少一个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Xyt1p在可以泛素化的至少两个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Xyt1p在可以泛素化的至少三个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Xyt1p在可以泛素化的全部赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述氨基酸突变为赖氨酸残基的替代。在一些实施方式中，所述氨基酸突变为赖氨酸残基的缺失。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Xyt1p在可以泛素化的赖氨酸残基附近具有氨基酸突变，从而使所述赖氨酸残基是泛素化机制不可接近的。在一些实施方式中，可以泛素化的赖氨酸残基包括Xyt1p的K6、K517和K539。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Xyt1p在K6、K517和K539之一处具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Xyt1p在K6具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Xyt1p在K517具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Xyt1p在K539具有氨基酸替代。在两个些实施方式中，所述泛素-缺陷型Xyt1p在K6、K517和K539中的两个处具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Xyt1p在K517和K539具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Xyt1p在K539和K6具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Xyt1p在K6和K517具有氨基酸替代。在三个些实施方式中，所述泛素-缺陷型Xyt1p在K6、K517和K539中的三个处具有氨基酸替代。
所述梅奇酵母(Metschnikowia)种可以是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，本文提供了具有与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的分离的多肽。在一些实施方式中，本文提供了编码具有与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽的分离的核酸。在一些实施方式中，所述非天然存在的微生物具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸，所述木糖转运蛋白与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以是保留其转运蛋白功能的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p的变体。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的泛素-缺陷型Xyt1p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p的功能性片段。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p的1至50，1至45，1至40，1至35，1至30，1至25，1至20，1至15，1至10或者1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p的1至10个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p的1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。在一些实施方式中，所述核酸具有SEQ ID NO：13所示的序列。在一些实施方式中，所述核酸的序列是SEQ ID NO：13。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Xyt1p具有SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述核酸具有SEQ ID NO：53所示的序列。编码来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p的核酸可以对异源表达进行密码子优化。在一些实施方式中，编码梅奇酵母(Metschnikowia)Xyt1p的核酸对酵母宿主株中的表达进行了密码子优化。所述酵母宿主株可以是本文所述的任何酵母宿主株，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些实施方式中，编码梅奇酵母(Metschnikowia)Xyt1p的核酸对细菌宿主株中的表达进行了密码子优化。所述细菌宿主株可以是本文所述的任何细菌宿主株，如大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，编码来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p的核酸对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达进行了密码子优化。例如，在一些实施方式中，编码H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p的核酸对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达进行了密码子优化。所述核酸可以具有SEQ ID NO：21所示的序列。
在一些实施方式中，本文提供了具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Gxf1p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的分离的多肽。在一些实施方式中，本文提供了编码具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Gxf1p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽的分离的核酸。在一些实施方式中，本文提供了具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Gxf1p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是梅奇酵母(Metschnikowia)Gxf1p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是保留其转运蛋白功能的梅奇酵母(Metschnikowia)Gxf1p的变体。所述木糖转运蛋白可以是梅奇酵母(Metschnikowia)Gxf1p的功能性片段。在一些实施方式中，所述核酸编码具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf1p的1至50，1至45，1至40，1至35，1至30，1至25，1至20，1至15，1至10或者1至5个氨基酸替代、缺失或插入的木糖转运蛋白。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf1p的1至10个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf1p的1至5个氨基酸替代、缺失或插入。
在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的泛素-缺陷型Gxf1p。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf1p在可以泛素化的至少一个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf1p在可以泛素化的至少两个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf1p在可以泛素化的至少三个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf1p在可以泛素化的全部赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述氨基酸突变为赖氨酸残基的替代。在一些实施方式中，所述氨基酸突变为赖氨酸残基的缺失。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf1p在可以泛素化的赖氨酸残基附近具有氨基酸突变，从而使所述赖氨酸残基是泛素化机制不可接近的。在一些实施方式中，可以泛素化的赖氨酸残基包括Gxf1p的K9、K24和K538。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf1p在K9、K24和K538之一处具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf1p在K9具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf1p在K24具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf1p在K538具有氨基酸替代。在两个些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf1p在K9、K24和K538中的两个处具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf1p在K9和K24具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf1p在K538和K9具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf1p在K24和K538具有氨基酸替代。在三个些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf1p在K9、K24和K538中的三个处具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf1p在K9、K24和K538具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf1p在K9、K24和K538具有氨基酸替代。
所述梅奇酵母(Metschnikowia)种可以是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，本文提供了具有与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf1p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的分离的多肽。在一些实施方式中，本文提供了编码具有与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf1p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽的分离的核酸。在一些实施方式中，所述非天然存在的微生物具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸，所述木糖转运蛋白与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf1p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf1p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以是保留其转运蛋白功能的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf1p的变体。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的泛素-缺陷型Gxf1p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf1p的功能性片段。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf1p的1至50，1至45，1至40，1至35，1至30，1至25，1至20，1至15，1至10或者1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf1p的1至10个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf1p的1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。在一些实施方式中，所述核酸具有SEQ ID NO：14所示的序列。在一些实施方式中，所述核酸的序列是SEQ ID NO：14。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf1p具有SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述核酸具有SEQ IDNO：52所示的序列。在一些实施方式中，所述核酸编码H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf1p的功能性片段。例如，Gxf1p的片段可以是具有较短的N-末端的Gxf1p的变体，并且将其称为ΔGxf1p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。在一些实施方式中，所述核酸具有SEQ ID NO：15所示的序列。编码来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf1p的核酸可以对异源表达进行密码子优化。在一些实施方式中，编码梅奇酵母(Metschnikowia)Gxf1p的核酸对酵母宿主株中的表达进行了密码子优化。所述酵母宿主株可以是本文所述的任何酵母宿主株，如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。在一些实施方式中，编码梅奇酵母(Metschnikowia)Gxf1p的核酸对细菌宿主株中的表达进行了密码子优化。所述细菌宿主株可以是本文所述的任何细菌宿主株，如大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，编码来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf1p的核酸对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达进行了密码子优化。
在一些实施方式中，本文提供了具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Gxf2p/Gal2p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的分离的多肽。在一些实施方式中，本文提供了编码具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Gxf2p/Gal2p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽的分离的核酸。在一些实施方式中，本文提供了具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Gxf2p/Gal2p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是梅奇酵母(Metschnikowia)Gxf2p/Gal2p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是保留其转运蛋白功能的梅奇酵母(Metschnikowia)Gxf2p/Gal2p的变体。所述木糖转运蛋白可以是梅奇酵母(Metschnikowia)Gxf2p/Gal2p的功能性片段。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf2p/Gal2p的1至50，1至45，1至40，1至35，1至30，1至25，1至20，1至15，1至10或者1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf2p/Gal2p的1至10个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf2p/Gal2p的1至5个氨基酸替代、缺失或插入。
在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的泛素-缺陷型Gxf2p/Gal2p。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf2p/Gal2p在可以泛素化的至少一个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf2p/Gal2p在可以泛素化的至少两个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf2p/Gal2p在可以泛素化的至少三个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf2p/Gal2p在可以泛素化的至少四个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf2p/Gal2p在可以泛素化的全部赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述氨基酸突变为赖氨酸残基的替代。在一些实施方式中，所述氨基酸突变为赖氨酸残基的缺失。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf2p/Gal2p在可以泛素化的赖氨酸残基附近具有氨基酸突变，从而使所述赖氨酸残基是泛素化机制不可接近的。在一些实施方式中，可以泛素化的赖氨酸残基包括Gxf2p/Gal2p的K23、K26、K35、K542和K546。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Xyt1p在K23、K26、K35、K542和K546之一处具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf2p/Gal2p在K23具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf2p/Gal2p在K26具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf2p/Gal2p在K35具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf2p/Gal2p在K542具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf2p/Gal2p在K546具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf2p/Gal2p在K23、K26、K35、K542和K546中的两个处具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf2p/Gal2p在K23、K26、K35、K542和K546中的三个处具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf2p/Gal2p在K23、K26、K35、K542和K546中的四个处具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf2p/Gal2p在K23、K26、K35、K542和K546具有氨基酸替代。
所述梅奇酵母(Metschnikowia)种可以是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，本文提供了具有与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf2p/Gal2p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的分离的多肽。在一些实施方式中，本文提供了编码具有与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf2p/Gal2p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽的分离的核酸。在一些实施方式中，所述非天然存在的微生物具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸，所述木糖转运蛋白与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf2p/Gal2p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf2p/Gal2p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以是保留其转运蛋白功能的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf2p/Gal2p的变体。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的泛素-缺陷型Gxf2p/Gal2p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf2p/Gal2p的功能性片段。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf2p/Gal2p的1至50，1至45，1至40，1至35，1至30，1至25，1至20，1至15，1至10或者1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf2p/Gal2p的1至10个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf2p/Gal2p的1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：4。在一些实施方式中，所述核酸具有SEQ ID NO：16所示的序列。在一些实施方式中，所述核酸的序列是SEQ ID NO：16。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Gxf2p/Gal2p具有SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述核酸具有SEQ ID NO：51所示的序列。编码来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf2p/Gal2p的核酸可以对异源表达进行密码子优化。在一些实施方式中，编码梅奇酵母(Metschnikowia)Gxf2p/Gal2p的核酸对酵母宿主株中的表达进行了密码子优化。所述酵母宿主株可以是本文所述的任何酵母宿主株，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些实施方式中，编码梅奇酵母(Metschnikowia)Gxf2p/Gal2p的核酸对细菌宿主株中的表达进行了密码子优化。所述细菌宿主株可以是本文所述的任何细菌宿主株，如大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，编码来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf2p/Gal2p的核酸对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的表达进行了密码子优化。
在一些实施方式中，本文提供了具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Gxs1p/Hgt12p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的分离的多肽。在一些实施方式中，本文提供了编码具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Gxs1p/Hgt12p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽的分离的核酸。在一些实施方式中，本文提供了具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Gxs1p/Hgt12p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是梅奇酵母(Metschnikowia)Gxs1p/Hgt12p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是保留其转运蛋白功能的梅奇酵母(Metschnikowia)Gxs1p/Hgt12p的变体。所述木糖转运蛋白可以是梅奇酵母(Metschnikowia)Gxs1p/Hgt12p的功能性片段。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxs1p/Hgt12p的1至50，1至45，1至40，1至35，1至30，1至25，1至20，1至15，1至10或者1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxs1p/Hgt12p的1至10个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxs1p/Hgt12p的1至5个氨基酸替代、缺失或插入。
所述梅奇酵母(Metschnikowia)种可以是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，本文提供了具有与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxs1p/Hgt12p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的分离的多肽。在一些实施方式中，本文提供了编码具有与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxs1p/Hgt12p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽的分离的核酸。在一些实施方式中，所述非天然存在的微生物具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸，所述木糖转运蛋白与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxs1p/Hgt12p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxs1p/Hgt12p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以是保留其转运蛋白功能的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxs1p/Hgt12p的变体。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxs1p/Hgt12p的功能性片段。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxs1p/Hgt12p的1至50，1至45，1至40，1至35，1至30，1至25，1至20，1至15，1至10或者1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxs1p/Hgt12p的1至10个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxs1p/Hgt12p的1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：7。在一些实施方式中，所述核酸具有SEQ ID NO：19所示的序列。在一些实施方式中，所述核酸的序列是SEQ ID NO：19。在一些实施方式中，所述核酸编码H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxs1p/Hgt12p的功能性片段。例如，Gxs1p/Hgt12p的片段可以是具有较短的N-末端的Gxs1p/Hgt12p的变体，并且将其称为ΔGxs1p/ΔHgt12p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：5。在一些实施方式中，所述核酸具有SEQID NO：17所示的序列。编码来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxs1p/Hgt12p的核酸可以对异源表达进行密码子优化。在一些实施方式中，编码梅奇酵母(Metschnikowia)Gxs1p/Hgt12p的核酸对酵母宿主株中的表达进行了密码子优化。所述酵母宿主株可以是本文所述的任何酵母宿主株，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些实施方式中，编码梅奇酵母(Metschnikowia)Gxs1p/Hgt12p的核酸对细菌宿主株中的表达进行了密码子优化。所述细菌宿主株可以是本文所述的任何细菌宿主株，如大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，编码来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxs1p/Hgt12p的核酸对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达进行了密码子优化。
在一些实施方式中，本文提供了具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Hxt5p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的分离的多肽。在一些实施方式中，本文提供了编码具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Hxt5p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽的分离的核酸。在一些实施方式中，本文提供了具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Hxt5p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是梅奇酵母(Metschnikowia)Hxt5p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是保留其转运蛋白功能的梅奇酵母(Metschnikowia)Hxt5p的变体。所述木糖转运蛋白可以是梅奇酵母(Metschnikowia)Hxt5p的功能性片段。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt5p的1至50，1至45，1至40，1至35，1至30，1至25，1至20，1至15，1至10或者1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt5p的1至10个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt5p的1至5个氨基酸替代、缺失或插入。
在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的泛素-缺陷型Hxt5p。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在可以泛素化的至少一个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在可以泛素化的至少两个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在可以泛素化的至少三个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在可以泛素化的全部赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述氨基酸突变为赖氨酸残基的替代。在一些实施方式中，所述氨基酸突变为赖氨酸残基的缺失。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在可以泛素化的赖氨酸残基附近具有氨基酸突变，从而使所述赖氨酸残基是泛素化机制不可接近的。在一些实施方式中，可以泛素化的赖氨酸残基包括Hxt5p的K7、K10、K29、K43和K58。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K7、K10、K29、K43和K58之一处具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K7具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K10具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K29具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K43具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K58具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K7、K10、K29、K43和K58中的两个处具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K7和K10具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K7和K29具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K7和K58具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K10和K29具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K10和K58具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K10和K43具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K29和K43具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K43和K7具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K29和K58具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K43和K58具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K7、K10、K29、K43和K58中的三个处具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K7、K10和K29具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K7、K10和K43具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K7、K10和K58具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K10、K29和K43具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K10、K29和K58具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K29、K43和K58具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K7、K10、K29、K43和K58中的四个处具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K7、K10、K29和K43具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K7、K10、K29和K58具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K7、K10、K43和K58具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K7、K29、K43和K58具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K10、K29、K43和K58具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p在K7、K10、K29、K43和K58具有氨基酸替代。
所述梅奇酵母(Metschnikowia)种可以是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，本文提供了具有与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt5p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的分离的多肽。在一些实施方式中，本文提供了编码具有与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt5p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽的分离的核酸。在一些实施方式中，所述非天然存在的微生物具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸，所述木糖转运蛋白与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt5p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt5p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以是保留其转运蛋白功能的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt5p的变体。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的泛素-缺陷型Hxt5p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt5p的功能性片段。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt5p的1至50，1至45，1至40，1至35，1至30，1至25，1至20，1至15，1至10或者1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt5p的1至10个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt5p的1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：8。在一些实施方式中，所述核酸具有SEQ ID NO：20所示的序列。在一些实施方式中，所述核酸的序列是SEQ ID NO：20。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt5p具有SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述核酸具有SEQ IDNO：50所示的序列。编码来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt5p的核酸可以对异源表达进行密码子优化。在一些实施方式中，编码梅奇酵母(Metschnikowia)Hxt5p的核酸对酵母宿主株中的表达进行了密码子优化。所述酵母宿主株可以是本文所述的任何酵母宿主株，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些实施方式中，编码梅奇酵母(Metschnikowia)Hxt5p的核酸对细菌宿主株中的表达进行了密码子优化。所述细菌宿主株可以是本文所述的任何细菌宿主株，如大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，编码来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt5p的核酸对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达进行了密码子优化。
在一些实施方式中，本文提供了具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Hxt2.6p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的分离的多肽。在一些实施方式中，本文提供了编码具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Hxt2.6p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽的分离的核酸。在一些实施方式中，本文提供了具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Hxt2.6p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是梅奇酵母(Metschnikowia)Hxt2.6p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是保留其转运蛋白功能的梅奇酵母(Metschnikowia)Hxt2.6p的变体。所述木糖转运蛋白可以是梅奇酵母(Metschnikowia)Hxt2.6p的功能性片段。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt2.6p的1至50，1至45，1至40，1至35，1至30，1至25，1至20，1至15，1至10或者1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt2.6p的1至10个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt2.6p的1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的泛素-缺陷型Hxt2.6p。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt2.6p在可以泛素化的至少一个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt2.6p在可以泛素化的至少两个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt2.6p在可以泛素化的至少三个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt2.6p在可以泛素化的全部赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述氨基酸突变为赖氨酸残基的替代。在一些实施方式中，所述氨基酸突变为赖氨酸残基的缺失。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Hxt2.6p在可以泛素化的赖氨酸残基附近具有氨基酸突变，从而使所述赖氨酸残基是泛素化机制不可接近的。
所述梅奇酵母(Metschnikowia)种可以是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，本文提供了具有与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt2.6p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的分离的多肽。在一些实施方式中，本文提供了编码具有与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt2.6p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽的分离的核酸。在一些实施方式中，所述非天然存在的微生物具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸，所述木糖转运蛋白与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt2.6p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt2.6p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以是保留其转运蛋白功能的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt2.6p的变体。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt2.6p的功能性片段。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt2.6p的1至50，1至45，1至40，1至35，1至30，1至25，1至20，1至15，1至10或者1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt2.6p的1至10个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt2.6p的1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：10。在一些实施方式中，所述核酸具有SEQ IDNO：22所示的序列。在一些实施方式中，所述核酸的序列是SEQ ID NO：22。来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt2.6p可以对异源表达进行密码子优化。在一些实施方式中，编码梅奇酵母(Metschnikowia)Hxt2.6p的核酸对酵母宿主株中的表达进行了密码子优化。所述酵母宿主株可以是本文所述的任何酵母宿主株，如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。在一些实施方式中，编码梅奇酵母(Metschnikowia)Hxt2.6p的核酸对细菌宿主株中的表达进行了密码子优化。所述细菌宿主株可以是本文所述的任何细菌宿主株，如大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，编码来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt2.6p的核酸对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达进行了密码子优化。例如，在一些实施方式中，编码H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt2.6p的核酸对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达进行了密码子优化。所述核酸可以具有SEQ ID NO：23所示的序列。
在一些实施方式中，本文提供了具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Qup2p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的分离的多肽。在一些实施方式中，本文提供了编码具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Qup2p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽的分离的核酸。在一些实施方式中，本文提供了具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Qup2p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是梅奇酵母(Metschnikowia)Qup2p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是保留其转运蛋白功能的梅奇酵母(Metschnikowia)Qup2p的变体。所述木糖转运蛋白可以是梅奇酵母(Metschnikowia)Qup2p的功能性片段。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Qup2p的1至50，1至45，1至40，1至35，1至30，1至25，1至20，1至15，1至10或者1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Qup2p的1至10个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Qup2p的1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的泛素-缺陷型Qup2p。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Qup2p在可以泛素化的至少一个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Qup2p在可以泛素化的至少两个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Qup2p在可以泛素化的至少三个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Qup2p在可以泛素化的全部赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述氨基酸突变为赖氨酸残基的替代。在一些实施方式中，所述氨基酸突变为赖氨酸残基的缺失。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Qup2p在可以泛素化的赖氨酸残基附近具有氨基酸突变，从而使所述赖氨酸残基是泛素化机制不可接近的。
所述梅奇酵母(Metschnikowia)种可以是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，本文提供了具有与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Qup2p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的分离的多肽。在一些实施方式中，本文提供了编码具有与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Qup2p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽的分离的核酸。在一些实施方式中，所述非天然存在的微生物具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸，所述木糖转运蛋白与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Qup2p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Qup2p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以是保留其转运蛋白功能的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Qup2p的变体。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Qup2p的功能性片段。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Qup2p的1至50，1至45，1至40，1至35，1至30，1至25，1至20，1至15，1至10或者1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Qup2p的1至10个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Qup2p的1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：11。在一些实施方式中，所述核酸具有SEQ ID NO：24所示的序列。在一些实施方式中，所述核酸的序列是SEQ ID NO：24。来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Qup2p可以对异源表达进行密码子优化。在一些实施方式中，编码梅奇酵母(Metschnikowia)Qup2p的核酸对酵母宿主株中的表达进行了密码子优化。所述酵母宿主株可以是本文所述的任何酵母宿主株，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些实施方式中，编码梅奇酵母(Metschnikowia)Qup2p的核酸对细菌宿主株中的表达进行了密码子优化。所述细菌宿主株可以是本文所述的任何细菌宿主株，如大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，编码来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Qup2p的核酸对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达进行了密码子优化。例如，在一些实施方式中，编码H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Qup2p的核酸对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达进行了密码子优化。所述核酸可以具有SEQ ID NO：25所示的序列。
在一些实施方式中，本文提供了具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Aps1p/Hgt19p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的分离的多肽。在一些实施方式中，本文提供了编码具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Aps1p/Hgt19p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽的分离的核酸。在一些实施方式中，本文提供了具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)Aps1p/Hgt19p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是梅奇酵母(Metschnikowia)Aps1p/Hgt19p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是保留其转运蛋白功能的梅奇酵母(Metschnikowia)Aps1p/Hgt19p的变体。所述木糖转运蛋白可以是梅奇酵母(Metschnikowia)Aps1p/Hgt19p的功能性片段。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Aps1p/Hgt19p的1至50，1至45，1至40，1至35，1至30，1至25，1至20，1至15，1至10或者1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Aps1p/Hgt19p的1至10个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Aps1p/Hgt19p的1至5个氨基酸替代、缺失或插入。
在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在可以泛素化的至少一个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在可以泛素化的至少两个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在可以泛素化的至少三个赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在可以泛素化的全部赖氨酸残基处或附近具有氨基酸突变。在一些实施方式中，所述氨基酸突变为赖氨酸残基的替代。在一些实施方式中，所述氨基酸突变为赖氨酸残基的缺失。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在可以泛素化的赖氨酸残基附近具有氨基酸突变，从而使所述赖氨酸残基是泛素化机制不可接近的。在一些实施方式中，可以泛素化的赖氨酸残基包括Aps1p/Hgt19p的K4、K20、K30和K93。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在K4、K20、K30和K93之一处具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在K4具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在K20具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在K30具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在K93具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在K4、K20、K30和K93中的两个处具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在K4和K20具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在K20和K30具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在K30和K93具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在K93和K4具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在K4和K30具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在K20和K93具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在K4、K20、K30和K93中的三个处具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在K4、K20和K30具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在K20、K30和K93具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在K30、K93和K4具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在K4、K20和K93具有氨基酸替代。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p在K4、K20、K30和K93具有氨基酸替代。
所述梅奇酵母(Metschnikowia)种可以是梅奇酵母(Metschnikowia)H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，本文提供了具有与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Aps1p/Hgt19p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的分离的多肽。在一些实施方式中，本文提供了编码具有与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Aps1p/Hgt19p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列的多肽的分离的核酸。在一些实施方式中，所述非天然存在的微生物具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸，所述木糖转运蛋白与H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Aps1p/Hgt19p具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Aps1p/Hgt19p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以是保留其转运蛋白功能的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Aps1p/Hgt19p的变体。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白是H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Aps1p/Hgt19p的功能性片段。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白可以具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Aps1p/Hgt19p的1至50，1至45，1至40，1至35，1至30，1至25，1至20，1至15，1至10或者1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Aps1p/Hgt19p的1至10个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Aps1p/Hgt19p的1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：12。在一些实施方式中，所述核酸具有SEQ ID NO：26所示的序列。在一些实施方式中，所述核酸的序列是SEQ ID NO：26。在一些实施方式中，所述泛素-缺陷型Aps1p/Hgt19p具有SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述核酸具有SEQ ID NO：49所示的序列。来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Aps1p/Hgt19p可以对异源表达进行密码子优化。在一些实施方式中，编码梅奇酵母(Metschnikowia)Aps1p/Hgt19p的核酸对酵母宿主株中的表达进行了密码子优化。所述酵母宿主株可以是本文所述的任何酵母宿主株，如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。在一些实施方式中，编码梅奇酵母(Metschnikowia)Aps1p/Hgt19p的核酸对细菌宿主株中的表达进行了密码子优化。所述细菌宿主株可以是本文所述的任何细菌宿主株，如大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，编码来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Aps1p/Hgt19p的核酸对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达进行了密码子优化。例如，在一些实施方式中，编码H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Aps1p/Hgt19p的核酸对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达进行了密码子优化。所述核酸可以具有SEQ ID NO：27所示的序列。
如以上所提供的，所述非天然存在的微生物可以具有至少1个外源核酸，或者至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个编码本文所述的木糖转运蛋白的组合的核酸。在一些实施方式中，所述非天然存在的微生物表达两个本文所述的木糖转运蛋白。在一些实施方式中，所述非天然存在的微生物表达三个本文所述的木糖转运蛋白。在一些实施方式中，所述非天然存在的微生物表达四个本文所述的木糖转运蛋白。在一些实施方式中，所述非天然存在的微生物表达五个本文所述的木糖转运蛋白。在一些实施方式中，所述非天然存在的微生物表达六个本文所述的木糖转运蛋白。在一些实施方式中，所述非天然存在的微生物表达七个本文所述的木糖转运蛋白。在一些实施方式中，所述非天然存在的微生物表达八个本文所述的木糖转运蛋白。在一些实施方式中，所述非天然存在的微生物表达九个本文所述的木糖转运蛋白。在一些实施方式中，所述非天然存在的微生物表达十个本文所述的木糖转运蛋白。在一些实施方式中，所述非天然存在的微生物表达十一个本文所述的木糖转运蛋白。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白的组合包括来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p和Aps1p/Hgt19p及其变体的2、3、4、5、6、7、8、9或10个木糖转运蛋白。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白的组合包括来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p和Aps1p/Hgt19p及其变体的2、3、4、5、6、7、8、9或10个木糖转运蛋白。
可以通过本领域熟知的多种方法分离本文所提供的木糖转运蛋白，例如，重组表达系统、沉淀、凝胶过滤、离子交换、反相和亲和色谱法等。其它熟知的方法描述于Deutscher等人，Guide to Protein Purification:Methods in Enzymology,182卷(Academic Press,(1990))。作为另外一种选择，可以使用熟知的重组方法获得本文所提供的分离的木糖转运蛋白(参见，例如，Sambrook等人,如上,1989；Ausubel等人,如上,1999)。本领域技术人员可以选择用于本文所提供的分离的木糖转运蛋白的生物化学纯化的方法和条件，并且(例如)通过功能测定来监测纯化。
用于制备木糖转运蛋白的方法的一种非限制性实例是使用本领域中熟知的方法，在适合的宿主细胞，如细菌细胞、酵母细胞或者其它适合的细胞中表达编码所述木糖转运蛋白的核酸，并且如本文所述，再次使用熟知的纯化方法回收所表达的木糖转运蛋白。可以直接从已用如本文所述的表达载体转化的细胞分离本文所提供的木糖转运蛋白。重组表达的木糖转运蛋白还可以作为具有适当亲合标签，如谷胱甘肽S转移酶(GST)、多聚组氨酸、抗生蛋白链菌素等的融合蛋白表达，并且如果需要，进行亲合纯化。如果需要，本文所述的木糖转运蛋白的多肽可以保留所述亲合标签，或者任选地，可以使用除去亲合标签所熟知的方法从所述多肽上除去所述亲合标签，例如，使用适当的酶促或化学切割。因此，本文提供了不具有或任选地具有亲合标签的木糖转运蛋白的多肽。因此，在一些实施方式中，本文提供了表达本文所述的木糖转运蛋白的多肽的宿主细胞。还可以使用本领域技术人员熟知的多肽合成方法，通过化学合成产生本文所述的木糖转运蛋白的多肽。
在一些实施方式中，本文提供了构建宿主菌株的方法，除其它步骤外，所述方法可以包括将本文所公开的载体引入到能够发酵的宿主细胞中。可以使用在本领域中熟知的技术将本发明所述的载体稳定或瞬时引入到宿主细胞中，所述技术包括(但不限于)缀合、电穿孔、化学转化、转导、转染和超声转化。本文公开了其它方法，所述方法中的任一种可以在本发明所述的方法中使用。
本文还提供了含有编码木糖转运蛋白的多核苷酸分子的载体，以及用这些载体转化的宿主细胞。本发明公开的任何多核苷酸分子可以包含在载体中，其通常包括用于在宿主中增殖的可选择标志物和复制起点。所述载体还可以包括适合的转录和翻译调控序列，如可操作性地连接至编码木糖转运蛋白的多核苷酸分子的来源于哺乳动物、真菌、细菌、病毒或昆虫基因的那些。这些调控序列的实例包括转录启动子、操纵子或增强子、mRNA核糖体结合位点和控制转录和翻译的适当序列。当所述调控序列与编码靶标蛋白的DNA功能相关时，核苷酸序列是可操作性地连接的。因此，如果所述启动子核苷酸序列指导木糖转运蛋白序列的转录，则所述启动子核苷酸序列可操作性地连接至所述木糖转运蛋白。
适合于编码本发明公开所述的木糖转运蛋白的核酸分子的克隆的载体的选择基于其中所述载体将转化的宿主细胞，并且在适用的情况下，基于要表达的木糖转运蛋白的来源宿主细胞。适合于木糖转运蛋白表达的宿主细胞包括原核生物和酵母，以下将对它们进行讨论。从技术角度来看，适合的载体和宿主生物的组合的选择是常规主题。
在这些宿主细胞中表达的木糖转运蛋白还可以是包括来自其它蛋白的序列的融合蛋白。如以上所讨论的，可以包括这些领域以使得(例如)木糖转运蛋白具有提高的功能性、改善的稳定性或者有利于木糖转运蛋白的纯化。例如，编码强烈结合至木糖的肽的核酸序列可以框内融合至木糖转运蛋白的跨膜序列，从而所得的融合蛋白结合木糖并以高于野生型转运蛋白的速率跨细胞膜转运糖。
可以通过引入编码一种或多种木糖转运蛋白的可表达核酸来产生本文所提供的非天然存在的微生物。在一些实施方式中，所述宿主微生物具有从木糖产生产物，如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或3-甲基-丁醇的一种或多种生物合成途径。本文所述的木糖转运蛋白的表达可以提高木糖吸收并且提高这些微生物的这些生物衍生产物的产量。
宿主微生物可以选自(例如)细菌、酵母、真菌或适用于或适合于发酵过程的任何多种其它微生物，并且所述非天然存在的微生物可以在它们中产生。类似地，示例性的酵母或真菌种包括选自下列的任何种：酵母目(Saccharomycetales)酵母菌科(Saccaromycetaceae)，包括酵母菌属(Saccharomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、假丝酵母属(Candida)、克卢费氏酵母属(Kluyveromyces)和毕赤氏酵母属(Pichia)；酵母目(Saccharomycetales)耶罗威亚酵母科(Dipodascaceae)，包括耶罗威亚酵母属(Yarrowia)；裂殖酵母目(Schizosaccharomycetales)裂殖酵母科(Schizosaccaromycetaceae)，包括裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)；散囊菌目(Eurotiales)发菌科(Trichocomaceae)，包括曲霉属(Aspergillus)；和毛霉菌目(Mucorales)毛霉菌科(Mucoraceae)，包括根霉属(Rhizopus)。宿主酵母或真菌的非限制性种包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、白假丝酵母(Candida albicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、汉氏德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、米根霉(Rhizobus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)等。
还可以在来自以下属，包括酵母菌属(Saccharomyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)和克鲁维酵母菌属(Kluveromyces)的酵母宿主细胞中表达本文所述的木糖转运蛋白。在一个实施方式中，所述酵母宿主是酿酒酵母(S.cerevisiae)。酵母载体可以含有来自高拷贝载体的2μ酵母质粒的复制起点序列和低拷贝数载体的CEN序列。酵母载体上的其它序列可以包括自主复制序列(ARS)、启动子区、多腺苷酸化序列、转录终止序列和可选择标志物基因。在一些实施方式中，载体是在酵母和细菌，如大肠杆菌(E.coli)两者中可复制的(称为穿梭载体)。除酵母载体的上述特征外，穿梭载体还包括在细菌，如大肠杆菌(E.coli)中用于复制和选择的序列。
示例性的细菌包括(例如)选自下列的任何种：肠杆菌目(Enterobacteriales)肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，包括埃希氏菌属(Escherichia)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)；气单胞菌目(Aeromonadales)琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)，包括厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)；巴斯德氏菌目(Pasteurellales)巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)，包括放线杆菌属(Actinobacillus)和曼海姆氏菌属(Mannheimia)；根瘤菌目(Rhizobiales)慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)，包括根瘤菌属(Rhizobium)；芽孢杆菌目(Bacillales)芽孢杆菌科(Bacillaceae)，包括芽孢杆菌属(Bacillus)；放线菌目(Actinomycetales)棒杆菌科(Corynebacteriaceae)和链霉菌科(Streptomycetaceae)，分别包括棒状杆菌属(Corynebacterium)和链霉菌属(Streptomyces)；红螺菌目(Rhodospirillales)醋杆菌科(Acetobacteraceae)，包括葡糖杆菌属(Gluconobacter)；鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)，包括发酵单胞菌属(Zymomonas)；乳杆菌目(Lactobacillales)乳杆菌科(Lactobacillaceae)和链球菌科(Streptococcaceae)，分别包括乳杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus)；梭菌目(Clostridiales)梭菌科(Clostridiaceae)梭菌属(Clostridium)；和假单胞菌目(Pseudomonadales)假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，包括假单胞菌属(Pseudomonas)。宿主细菌的非限制性种包括(例如)大肠杆菌(Escherichia coli)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、产琥珀酸曼海姆氏菌(Mannheimiasucciniciproducens)、菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、乳发酵短杆菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、醋酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridium acetobutylicum)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
用于在原核宿主中使用的表达载体通常包括一种或多种表型可选择标志物基因。这些基因编码(例如)赋予抗生素抗性或者提供营养缺陷要求的蛋白。多种这些载体是易于从商品化来源获得的。实例包括(例如)pSPORT载体、pGEM载体(Promega,Madison,Wis.)、pPROEX载体(LTI,Bethesda,Md.)、Bluescript载体(Stratagene)和pQE载体(Qiagen)。
昆虫宿主细胞培养系统也可以用于本文所述的木糖转运蛋白的表达。可以使用如(例如)Luckow and Summers,1988的综述中所述的杆状病毒表达系统来表达目标木糖转运蛋白。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是特别有用的宿主生物，因为它是适合于基因工程的良好鉴定的微生物。其它特别有用的宿主生物包括细菌，如大肠杆菌(E.coli)。应理解任何适合的微生物宿主生物可以用于表达本文所述的木糖转运蛋白以提高木糖吸收。还可以修饰所述微生物宿主生物以引入代谢和/或遗传修饰，从而从木糖产生所期望的产物或者进一步提高所期望的产物的产量，如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或者3-甲基-丁醇。
用于本文所述的木糖转运蛋白的表达的适合的表达载体的选择基于要使用的宿主细胞。用于大肠杆菌(E.coli)的适合的表达载体的实例包括pET、pUC和如本领域中已知的类似的载体。在一些实施方式中，用于木糖转运蛋白的表达的载体包括用于浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)的穿梭质粒pIJ702、用于巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)的pGAPZalpha-A,B,C和pPICZalpha-A,B,C(Invitrogen)，和用于丝状真菌的pFE-1和pFE-2以及如本领域中已知的类似的载体。
为了辅助插入特定载体而对本文所述的编码木糖转运蛋白的核酸的修饰(例如，通过修饰限制酶切位点)、在特定表达系统或宿主的易于使用(例如，使用优选的宿主密码子)等是已知的并且打算使用。用于产生木糖转运蛋白的基因工程方法包括根据已知方法，所述多核苷酸分子在无细胞表达系统中、在宿主细胞中、在组织中和在动物模型中的表达。
可以(例如)通过在本领域中熟知的重组和检测方法来实施用于在非天然存在的宿主中构建和测试木糖转运蛋白的表达水平的方法。这些方法可见于(例如)Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley and Sons,Baltimore,MD(1999)。
可以使用在本领域中熟知的技术将参与生物衍生产品产生的途径的外源核酸序列稳定或瞬时引入到宿主细胞中，所述技术包括(但不限于)缀合、电穿孔、化学转化、转导、转染和超声转化。对于大肠杆菌(E.coli)或其它原核细胞中的外源表达，真核核酸的基因或cDNA中的一些核酸序列可以编码靶向信号，如N末端线粒体或其它靶向信号，如果需要，其可以在转化至原核宿主细胞中之前除去。例如，线粒体前导序列的除去导致大肠杆菌(E.coli)中的表达提高(Hoffmeister等人,J.Biol.Chem.280:4329-4338(2005))。对于酵母或其它真核细胞中的外源表达，基因可以在胞液中表达而不添加前导序列，或者通过添加适合的靶向序列，如适合于宿主细胞的线粒体靶向或分泌信号，可以靶向线粒体或其它细胞器，或者靶向用于分泌。因此，应理解可以将除去或包括靶向序列的核酸序列的适当修饰引入外源核酸序列以赋予所期望的性质。此外，可以使用在本领域中熟知的技术对基因进行密码子优化以实现所述蛋白优化的表达。对于密码子优化可用的工具包括Gao等人,Biotechnology progress 20.2(2004):443-448中所述的“UpGene”；Fuglsang,Proteinexpression and purification 31.2(2003):247-249中所述的“密码子优化器(Codonoptimizer)”。如常规技术人员将理解的，使用本领域中的这些或任何其它可用的工具来对本文所述的具体核酸序列进行密码子优化，从而在具体宿主株中表达相应基因将是常规实践。
可以构建表达载体以包括可操作性地连接至在宿主生物中起作用的表达控制序列的一个或多个编码木糖转运蛋白和/或生物合成途径的其它酶的核酸。适合在本发明所述的微生物宿主生物中使用的表达载体包括(例如)质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人造染色体，包括对于向宿主染色体稳定整合可操作的载体和选择序列或标志物。另外，所述表达载体可以包括一个或多个可选择标志物基因和适当的表达控制序列。还可以包括(例如)提供抗生素或毒素抗性、补充营养缺陷或者提供培养基中不存在的关键营养物的可选择标志物基因。表达控制序列可以包括在本领域中熟知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当共表达两种或更多种外源编码核酸时，两种核酸可以插入(例如)到单一表达载体或者不同的表达载体中。对于单一载体表达，所述编码核酸可以操作性地连接至一个公共表达控制序列或者连接至不同的表达控制序列，如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。可以使用本领域中熟知的方法确认参与代谢或合成途径的外源核酸序列的转化。这些方法包括(例如)核酸分析，如mRNA的RNA印迹或聚合酶链反应(PCR)扩增，或者用于基因产物表达的免疫印迹法，或者其它适合的分析方法以测试所引入的核酸序列或其相应基因产物的表达。本领域的那些技术人员应理解以足够的量表达所述外源核酸以产生所期望的产物，并且还应理解可以使用本领域中熟知的和如本文所公开的方法优化表达水平以获得足够的表达。
本文还提供了对于木糖转运蛋白活性分析和木糖转运的量和速率测定有用的试剂、组合物和方法。
本发明公开的木糖转运蛋白的多肽完全或部分可以用于产生在纯化所述木糖转运蛋白或者检测它们的表达以及用于鉴定所述木糖转运蛋白的分子作用的试剂工具中有用的多克隆和单克隆抗体。优选地，使用常规方法，在抗体制备中使用了含有所述木糖转运蛋白的唯一表位的肽。用于肽表位选择和抗体生产的方法是已知的。参见，例如，Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow and Land(主编),1988Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Monoclonal Antibodies,Hybridomas:ANew Dimension in Biological Analyses,Kennet等人(主编),1980Plenum Press,NewYork。
本文所提供的非天然存在的微生物通过表达本文所述的木糖转运蛋白具有提高的木糖吸收。在一些实施方式中，本文所提供的微生物可以具有一种或多种生物合成途径以从木糖产生化合物，如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或3-甲基-丁醇，并且所述提高的木糖吸收提高了该化合物的产量。所述生物合成途径可以是内源途径或外源途径。本文所提供的微生物还可以具有编码参与产物，如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或3-甲基-丁醇的一种或多种生物合成途径的一种或多种酶或蛋白的可表达的核酸。根据对于生物合成所选的宿主微生物，可以表达用于特定生物合成途径的一些或全部的核酸。在一些实施方式中，所述宿主微生物可以具有生物合成途径的所有酶的内源表达以从木糖产生化合物和天然产生化合物，其可以通过进一步表达本文所述的木糖转运蛋白来改善。在一些实施方式中，所述宿主微生物可以缺乏用于所期望的生物合成途径的一种或多种酶或蛋白，然后将所缺乏的酶或蛋白的可表达核酸引入所述宿主以用于后续外源表达。作为另外一种选择，如果所选宿主显示出一些途径基因的内源表达，但是缺乏其它基因，则需要所缺乏的酶或蛋白的编码核酸以实现所期望的化合物的生物合成。因此，非天然存在的微生物还可以包括外源酶或蛋白活性以获得所期望的生物合成途径，或者可以通过引入与一种或多种内源酶或蛋白一起从木糖产生所期望的产物，如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或3-甲基-丁醇的一种或多种外源酶或蛋白来获得所期望的生物合成途径。
具有从木糖生产木糖醇的生物合成途径的微生物在本领域中是已知的。在一些实施方式中，本文提供了具有如本文所述的至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸以及从木糖产生木糖醇的生物合成途径的非天然存在的微生物。随着木糖吸收的提高，所述微生物还可以具有改善的从木糖产生木糖醇的产量。本文还提供了通过将具有木糖醇生物合成途径的本文所提供的非天然存在的微生物在一定条件下培养足够的一段时间以产生木糖醇来生产生物衍生木糖醇的方法。
木糖醇是广泛用作糖的低热值、低-碳水化合物替代的五碳糖醇；木糖醇不影响患有糖尿病的人和具有高血糖的个体的胰岛素水平(Drucker等人,Arch of Oral Biol.24:965-970(1979))。木糖醇的甜度与蔗糖大致相同，但是卡路里低33％。木糖醇的消耗还有益于口腔卫生，因为它将龋齿降低了33％；还报道木糖醇抑制健康牙齿釉质的脱矿并且使受损牙釉质再矿化(Steinberg等人,Clinical Preventive Dentistry 14:31-34(1992)；Maguire等人,British Dental J.194:429-436(2003)；Grillaud等人,Arch ofPediatrics and Adolescent Medicine 12:1180-1186(2005))。另外，口香糖中的木糖醇抑制变形链球菌(Streptoccocus mutans)的生长(Haresaku等人,Caries Res.41:198-203(2007))，并且它降低了急性中耳感染的发病率(Azarpazhooh等人,Cochrane Database ofSystematic Reviews 11:CD007095(2011))。
木糖醇的微生物生产提供了可以降低生产成本的成本有效的下游加工(Rivas等人,Biotechnol.Prog.19:706-713(2003))。该方法将降低对纯化的木糖的需求，从而产生极高纯度、易于分离的产物，并且可适应来自不同地理位置的广泛的原材料来源(Ur-Rehman等人,Critical Reviews in Food Science and Nutrition 55:1514-1528(2013))。
多种酵母种(假丝酵母种(Candida spp.)、汉氏德巴利氏酵母(Debaryomyceshansenii)、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、克鲁维酵母菌种(Kluyveromvces spp)、嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、酵母菌种(Saccharomyces spp.)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))已鉴别具有将木糖转化为木糖醇的能力。(Sirisansaneeyakul等人,J.Ferment.Bioeng.80:565-570(1995)；Onishi等人,Agric.Biol.Chem.30:1139-1144(1966)；Barbosa等人,J.Ind.Microbiol.3:241-251(1988)；Gong等人,Biotechnol.Lett.3:125-130(1981)；Vandeska等人,WorldJ.Microbiol.Biotechnol.11:213-218(1995)；Dahiya等人,Cabdirect.org 292-303(1990)；Gong等人,Biotechnol.Bioeng.25:85-102(1983))。还已在多种酵母(酵母菌种(Saccharomyces spp.)、汉氏德巴利氏酵母(D.hansenii)、粉状毕赤酵母(P.farinose)、汉逊酵母种(Hansenula spp.)、Endomycopsis chodatii、假丝酵母种(Candida spp.)和新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans))中发现了从木酮糖产生木糖醇的能力)(Onishi等人,Appl.Microbiol.18:1031-1035(1969))。生物生产木糖醇的大部分研究是通过酵母，并且持续发现了能够将木糖转化为木糖醇的新型酵母种(Kamat等人,J.App.Microbiol.115:1357-1367(2013)；Bura等人,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.39:1003-1011(2012)；Junyapate等人,Antonie Van Leeuwenhoek 105:471-480(2014)；Guaman-Burneo等人,Antonie Van Leeuwenhoek 108:919-931(2015)；Cadete等人,Int.J.Syst.Evolv.Microbiol.65:2968-2974(2015))。
酿酒酵母(S.cerevisiae)是在多种食品加工中使用的酵母生物，但其不能天然有效利用木糖。通过表达来自其它酵母种，如木糖发酵酵母(S.stipitis)(树干毕赤酵母(P.stipitis))和休哈塔假丝酵母(C.shehatae)的木糖还原酶，将其工程设计以从木糖产生木糖醇(Hallborn等人,Bio/Technology 9:1090-1095；Hallborn等人,Appl.Microbiol.Biotechol.42:326-333(1994)；Lee等人,Process Biochem.35:1199-1203(2000)；Giovinden等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.55:76-80(2001)；Chung等人,Enzyme Microb.Technol.30:809-816(2002))。
已研究了在酿酒酵母(S.cerevisiae)中用于木糖醇生产的替代途径。在转酮醇酶-缺陷型酿酒酵母(S.cerevisiae)株中木糖发酵酵母(S.stipitis)木糖醇脱氢酶的表达和木酮糖激酶基因的缺失使得能够通过多步途径将葡萄糖转化为木糖醇(Toivari等人,Appl.Enviorn.Microbiol.73:5471-5476(2007))。
粗糙链孢霉(Neurospora crassa)纤维糊精转运蛋白和胞内β-葡萄糖苷酶的表达使其能够在木糖醇生产期间同时使用纤维二糖和木糖(Oh等人,Metab.Eng.15:226-234(2013)；Zha等人,PLoS One 8:e68317(2013))。此外，酿酒酵母(S.cerevisae)ALD5、IDP2或者木糖发酵酵母(S.stipitis)ZWF1的过表达导致了提高的NADPH水平，从而导致了更高的木糖醇产量(Oh等人,Metab.Eng.15:226-234(2013))。
可以通过使用NADPH-偏好和NADH-偏好的木糖还原酶两者来降低NAD(P)H辅因子的限制从而改善木糖醇的生产。通过野生型NADPH-偏好和突变体NADH-偏好的木糖发酵酵母(S.stipitis)的木糖还原酶和酿酒酵母(S.cerevisiae)ZWF1和ACS1的表达，在酿酒酵母(S.cerevisiae)中使用了该策略(Jo等人,Biotechnol.J.10:1935-1943(2015))。
为了降低木糖醇生产的加工成本，在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达了木糖发酵酵母(S.stipitis)的木糖还原酶、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的β-葡萄糖苷酶、米曲霉(A.oryzae)的β-木糖苷酶和里氏木霉(Trichoderma reesei)的木聚糖内切酶(Guirimand等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.100:3477-3487(2016))。这些真菌酶的表达使得能够直接降解半纤维素，而无需添加外源酶。
热带假丝酵母(C.tropicalis)是病原性的，但是也是木糖醇的天然生产菌之一。一些专利和文献已描述了来自假丝酵母属(Candida)的酵母作为从木糖生产木糖醇的宿主菌株的应用；即，热带假丝酵母(C.tropicalis)ATCC 13803(PCT/IN2009/000027&KR100259470)、热带假丝酵母(C.tropicalis)ATCC 9968(PCT/FI1990/000015)、热带假丝酵母(C.tropicalis)KFCC 10960(KR100199819)、热带假丝酵母(C.tropicalis)(NRRL12968)(PCT/IN2013/000523)、热带假丝酵母(C.tropicalis)ATCC 750(West等人,WorldJ.Mircrobiol.Biotechnol.25:913-916(2009))和热带假丝酵母(C.tropicalis)ATCC7349(SAROTE等人,J.Ferment.and Bioeng.80:565-570(1995))。用于改善热带假丝酵母(C.tropicalis)中木糖醇生产的一种策略是来自近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)的NADH-偏好的木糖还原酶的表达，其使得能够通过NADPH和NADH两者来减少木糖(Lee等人,Appl.Enviorn.Microbiol.69:6179-6188(2003))。木糖醇脱氢酶的缺失通过阻断木糖醇分解代谢来提高木糖醇的产量，但是需要共基质，如葡萄糖或甘油来再生用于木糖还原酶活性的NADPH(Ko等人,Appl.Environ.Microbiol.72:4207-4213(2006)；Ko等人,Biotechnol.Lett.28:1159-1162(2006))。通过将木糖醇脱氢酶基因的缺失与粗糙链孢霉(N.crassa)木糖还原酶的表达结合，进一步改善了木糖醇的生产(Jeon等人,BioprocessBiosyst.Eng.35:191-198(2012))。通过表达来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的木糖转运蛋白，再次进一步改善了该菌株的木糖吸收和木糖醇生产(Jeon等人,BioprocessBiosyst.Eng.36:809-817(2013))。
如果提供甘油作为共基质，则可以通过在热带假丝酵母(C.tropicalis)中表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶来提高NADPH的再生(Ahmad等人,BioprocessBiosyst.Eng.35:199-204(2012))。还可以通过使甘油激酶缺失并且表达来自木糖发酵酵母(S.stipitis)的三种NADPH-再生甘油脱氢酶来提高木糖醇的产量(Ahmad等人,Bioprocess Biosyst.Eng.36:1279-1284(2013))。从混合糖底物生产木糖醇的问题之一在于来自热带假丝酵母(C.tropicalis)的木糖还原酶可以将阿拉伯糖转化为阿糖醇，它是木糖醇生产中的污染物。为了防止该问题，使内源木糖还原酶缺失，并且与细菌阿拉伯糖吸收酶一起表达来自粗糙链孢霉(N.crassa)的突变的木糖-特异性木糖还原酶(Yoon等人,Biotechnol.Lett.33:747-753(2011)；Nair等人,ChemBioChem 9:1213-1215(2008))。这最大程度减少了阿糖醇的形成，同时允许阿拉伯糖吸收用于细胞生长。
马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)是乳制品中常见的耐热酵母。由于其高生长速率，耐受高达52℃的温度且具有使用多种糖的能力，因此它可以用于木糖醇的生产。在马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)中，粗糙链孢霉(N.crassa)木糖还原酶的表达单独或者与木糖醇脱氢酶基因的缺失结合导致了木糖醇在最适42℃的生产(Zhang等人,Bioresour.Technol.152:192-201(2014))。通过测试多种木糖转运蛋白的表达，进一步改善了木糖醇的生产：马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)水甘油通道蛋白、中间假丝酵母(C.intermedia)葡萄糖/木糖协助运输蛋白或者中间假丝酵母(C.intermedia)葡萄糖/木糖同向转运蛋白(Zhang等人,Bioresour.Technol.175:642-645(2015))。发现中间假丝酵母(C.intermedia)葡萄糖/木糖协助运输蛋白的表达对于提高木糖醇的得率和产量是有效的，并且值得注意地，产生了最高的所报道的最终木糖醇浓度。还在导致菌株具有改善的木糖利用和木糖醇生产能力的进化适应实验中使用了马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)(Sharma等人,Bioprocess Biosyst.Eng.39:835-843(2016))。
已将两种其它酵母种基因工程设计以研究木糖醇的生产。汉氏德巴利氏酵母(D.hansenii)是另一种渗透压耐受的和非病原性的天然木糖醇生产菌。通过木糖醇脱氢酶基因的缺失，在该菌种中提高了木糖醇的产量(Pal等人,Bioresour.Technol.147:449-455(2013))。巴斯德毕赤氏酵母(P.pastoris)是常用于蛋白表达的酵母。已工程设计通过葡萄糖-阿糖醇-木酮糖-木糖醇途径从葡萄糖直接产生木糖醇(Cheng等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.98:3539-3552(2014))。这是通过表达来自氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)的木糖醇脱氢酶和来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的木酮糖-形成阿糖醇脱氢酶实现的。
除丝状真菌和酵母之外，已观察到有限数量的细菌菌种(棒状杆菌种(Corynebacterium)和Enterobacter liquefaciens)从木糖产生木糖醇(Yoshitake等人,Agric.Biol.Chem.35:905-911(1971)；Yoshitake等人,Agric.Biol.Chem.37:2261-2267(1973)；Yoshitake等人,Agric.Biol.Chem.40:1493-1503(1976)；Rangaswamy等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.60:88-93(2002))。还已报道了耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)能够从木酮糖产生木糖醇(Izumori等人,J.Ferment.Technol.66:33-36(1988))。后续的细菌筛选发现葡糖杆菌种(Gluconobacterspp.)和木醋杆菌(Acetobacterxylinum)能够通过阿糖醇向木酮糖以及木酮糖向木糖醇的连续转化，将阿糖醇转化为木糖醇(Suzuki等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.66:2614-2620(2002))。
微藻是可再生资源生产的有吸引力的平台。已报道了一次木糖醇在微藻中的生产，其中来自粗糙链孢霉(Neurospora crassa)的木糖还原酶在莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)中的表达使其将少量木糖转化为木糖醇(Pourmir等人,J.Biotechnol.165:178-183(2013))。
已观察到多种丝状真菌(青霉菌种(Penicillium spp.)、曲霉属种(Aspergillusspp.)、甘薯根霉(Rhizopus nigricans)、粉红胶霉(gliocladium roseum)、黄丝衣霉(Byssochlamys fulva)、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)、粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)和球拟酵母(Torulopsis utilis))的提取物包含能够将木糖转化为木糖醇的酶(Chiang等人,Nature 188:79-81(1960)；Chiang等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.3:554-559(1960)；Chiang等人,Biochem.Biophys.Acta.29:664-5(1958))。后续研究鉴别了能够以不同程度的效率将木糖转化为木糖醇的其它丝状真菌(艾伯塔石座菌(Petromyces albertensis)、青霉菌种(Penicillium spp.)和黑曲霉(A.niger))(Dahiya等人,Can.J.Microbiol.37:14-18(1991)；Sampaio等人,Brazilian J.Microbiol.34:325-328(2003))。
里氏木霉(Trichoderma reesei)是分泌纤维素酶的丝状真菌，当为了阻断木糖醇代谢而使木糖醇脱氢酶和L-阿糖醇-4-脱氢酶的基因缺失时，其产生了更多的木糖醇(Dashtban等人,Appl.Biochem.Biotecnol.169:554-569(2013))。当木糖还原酶过表达且木酮糖激酶受抑制时，木糖醇在里氏木霉(T.reesei)中的产量升高(Hong等人,BiomedRes.Int.2014:169705(2014))。Phanerochaete sordida是具有木质素降解活性的白腐菌，当表达来自黄孢原毛平革菌(P.chrysosporium)的木糖还原酶基因时，它产生更多的木糖醇(Hirabayashi等人,J.Biosci.Bioeng.120:6-8(2015))。
细菌通过木糖异构酶代替木糖还原酶-木糖醇脱氢酶途径代谢木糖。因此，用于木糖醇生产的细菌宿主的使用通常包括木糖还原酶的重组表达。在大肠杆菌(E.coli)中表达了来自热带假丝酵母(C.tropicalis)的木糖还原酶并且发现它对于从木糖产生木糖醇是起作用的(Suzuki等人,J.Biosci.Bioeng.87:280-284(1999))。后续研究结合内源木酮糖激酶基因的缺失，表达了来自博伊丁假丝酵母(C.boidinii)、纤维假丝酵母(C.tenuis)和木糖发酵酵母(S.stipitis)的木糖还原酶(Cirino等人,Biotechnol.Bioeng.95:1167-1176(2006))。为了改善从葡萄糖和木糖的混合物的木糖醇生产，用克服了木糖代谢的葡萄糖抑制的突变体替代环化AMP受体蛋白。木糖转运蛋白XylE或者XylFGH的表达具有与用突变体形式替代环化AMP受体蛋白的类似影响(Khankal等人,J.Biotechnol.134:246-252(2008))。
对于改善细菌中木糖醇的生产，辅因子再生也是重要的，这已通过大量基因缺失和辅因子再生途径的表达在大肠杆菌(E.coli)进行了研究(Chin等人,Biotechnol.Bioeng.102:209-220(2009)；Chin等人,Biotechnol.Prog.27:333-341(2011)；Iverson等人,World J.Microbiol.Biotechnol.29:1225-1232(2013)；Iverson等人,BMC Syst.Biol.10:31(2016))。针对改善从葡萄糖和木糖的混合物生产木糖醇的另一项研究破坏了磷酸烯醇丙酮酸-依赖性葡萄糖磷酸转移酶系统以消除分解代谢产物阻遏(Su等人,Metab.Eng.31:112-122(2015))。通过破坏木糖异构酶、木酮糖激酶和磷酸烯醇丙酮酸-依赖性果糖磷酸转移酶系统，在该菌株中阻断了内源木糖代谢，并且表达粗糙链孢霉(N.crassa)木糖还原酶以优化木糖醇的生产。
乳酸乳球菌(L.lactis)是乳品加工，如乳酪生产中常用的良好-鉴定的细菌，并且它可以用于其它食品-相关工艺。当它表达木糖发酵酵母(S.stipitis)的木糖还原酶和短乳杆菌(L.brevis)的木糖转运蛋白时，乳酸乳球菌(L.lactis)能够从木糖产生木糖醇(Nyyossola等人,J.Biotechnol.118:55-56(2005))。
乳发酵短杆菌(C.glutamicum)是具有多种工业用途，如MSG生产的细菌。已将其工程设计以共利用木糖和葡萄糖，这是木糖醇生产的重要性状(Sasaki等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.85:105-115(2009))。为了优化乳发酵短杆菌(C.glutamicum)中木糖醇的生产，结合其乳酸脱氢酶、木酮糖激酶和磷酸烯醇丙酮酸-依赖性果糖磷酸转移酶基因的破坏，已将其工程设计以表达来自纤维假丝酵母(C.tenuis)的戊糖转运蛋白和突变木糖还原酶(Sasaki等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.86:1057-1066(2010))。还通过表达木糖发酵酵母(S.stipitis)木糖还原酶实现了乳发酵短杆菌(C.glutamicum)中木糖醇的生产(Kim等人,Enzyme Microb.Technol.46:366-371(2010))。粘质红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)木糖还原酶、大肠杆菌(E.coli)l-阿拉伯糖异构酶、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)d-阿洛酮糖-3表异构酶、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)l-木酮糖还原酶和融合戊糖转运蛋白的表达使得能够从木糖和阿拉伯糖的混合物产生木糖醇而不会形成阿糖醇(Dhar等人,J.Biotechnol.230:63-71(2016))。
应理解具有天然或工程设计的从木糖产生木糖醇的生物合成途径的本文所提供的或者另外本领域中已知的微生物可以用作宿主菌株，当表达如本文所述的编码木糖转运蛋白的外源核酸时，其可以具有提高的木糖吸收和改善的从木糖产生木糖醇的产量。可以采用其它代谢工程以进一步提高这些宿主菌株中木糖醇的生产。
具有从木糖生产乙醇的生物合成途径的微生物在本领域中是已知的。在一些实施方式中，本文提供了具有如本文所述的至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸以及从木糖产生乙醇的生物合成途径的非天然存在的微生物。随着木糖吸收的提高，所述微生物还可以具有改善的从木糖产生乙醇的产量。本文还提供了通过将具有乙醇生物合成途径的本文所提供的非天然存在的微生物在一定条件下培养足够的一段时间以产生乙醇来生产生物衍生乙醇的方法。
乙醇具有一些用途并且最常用作燃料添加剂。作为燃料添加剂，乙醇是低价值产品，其大部分生产成本归因于原料价格。因此，将期望开发用于从易得、廉价起始材料，如木质纤维素生产乙醇的产乙醇和发酵过程。目前，认为葡萄糖和木糖两者的发酵是生物质向乙醇经济转化的最优先选项。大部分微生物能够发酵葡萄糖，但已报道仅有少数有效使用木糖，并且更少数发酵这种戊糖为乙醇。
相对少数野生型微生物可以发酵D-木糖。这些微生物通常不适合大规模发酵。这种不利程度可能是(例如)由于对微生物的不熟悉、获得微生物的困难、在预处理的木质纤维素上的产量和生长不良或者当在来源于生物质的混合糖上生长时，得率不令人满意。(C.Abbas,“Lignocellulosics to ethanol:meeting ethanol demand in the future,”The Alcohol Textbook,第4版(K.A.Jacques,T.P.Lyons and D.R.Kelsall主编).Nottingham University Press,Nottingham,UK,2003,第41-57页；C.Abbas,“Emergingbiorefineries and biotechnological applications of nonconventional yeast:nowand in the future,”The Alcohol Textbook,第4版(K.A.Jacques,T.P.Lyons andD.R.Kelsall主编).Nottingham University Press,Nottingham,United Kingdom,2003,第171-191页)。
酵母被认为是用于木糖酒精发酵的有前景的微生物(参见Ryabova，如上)。它们具有比细菌更大的细胞，耐受病毒感染并且往往更耐受来自乙醇的负反馈。此外，已对于一些种广泛研究了酵母的生长和代谢。
已知一些酵母天然发酵D-木糖。这些包括(例如)树干毕赤酵母(P.stipitis)、休哈塔假丝酵母(C.shehatae)和嗜鞣管囊酵母(P.tannophilus)(参见Ryabova，如上；Cite2,C.Abbas 2003)。常见的啤酒酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)已知天然不发酵D-木糖，但是已报道了的确发酵D-木糖的一些代谢工程酿酒酵母(S.cerevisiae)株。
大量研究已描述了通过重组酿酒酵母(S.cerevisiae)的D-木糖代谢(参见，例如,Matsushika等人,Applied Microbiology and Biotechnology 84,no.1(2009):37-53；美国专利公开No.2005/0153411A1(2005年7月14日)；美国专利公开No.2004/0231661A1(2004年11月25日)；美国专利No.4,368,268(1983年1月11日)；美国专利No.6,582,944(2003年6月24日)；美国专利No.7,226,735(2007年6月5日)；美国专利公开No.2004/0142456A1(2004年7月22日)；Jeffries,T.W.&Jin,Y-S.,Appl.Microbiol.Biotechnol.63:495-509(2004)；Jin,Y-S.,Met.Eng.6:229-238(2004)；Pitkanen,J-Y.,Helsinki Univ.of Tech.,Dept.ofChem.Tech.,Technical Biochemistry Report(2005年1月)；Porro,D.等人,App.&Env.Microbiol.65(9):4211-4215(1999)；Jin,Y-S.,等人,App.&Env.Microbiol.70(11):6816-6825(2004)；Sybirna,K,等人,Curr.Genetics 47(3):172-181(2005)；Toivari,M.H.,等人,Metabolic Eng.3:236-249(2001)。
酵母中D-木糖的代谢沿类似于通过戊糖磷酸途径的葡萄糖代谢的途径进行。来自D-木糖的碳通过糖酵解过程被加工成乙醇或者通过呼吸性TCA酸环被加工成CO2。向乙醇的发酵部分依赖于丙酮酸盐代谢，它是可以在呼吸或发酵中使用的代谢产物(参见van Hoek,P.,等人,Appl.&Enviro.Microbiol.64(6)；2133-2140(1998))。丙酮酸盐在丙酮酸盐通过丙酮酸脱羧酶(E.C.4.1.1.1)脱羧为乙醛后进入发酵。丙酮酸脱羧酶是生物素-依赖性羧化酶家组成员。它通过ATP裂解催化丙酮酸盐脱羧以形成丁酮二酸盐。丁酮二酸盐可以用于脂肪、葡萄糖和一些氨基酸或其它衍生物的合成。所述酶是高度保守的并且存在于多种原核生物和真核生物中。
能够从木糖产生乙醇的其它微生物在本领域中也是已知的。已报道耐热甲醇营养型酵母多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)(也称为安格斯毕赤酵母(P.angusta))分别具有37℃和48℃的最适和最高生长温度，并且在一定条件下可以天然发酵D-木糖。(US8071298；Voronovsky等人,FEMS Yeast Res.5(11):1055-62(2005))。另外，已报道当经受好氧和微好氧条件两者时，三株树干毕赤酵母(P.stipitis)和三株休哈塔假丝酵母(C.shehatae)发酵木糖。在所考虑的菌株中，树干毕赤酵母(P.stipitis)NRRL Y-7124能够以0.39g每克木糖的得率(76％的理论得率)和与休哈塔假丝酵母(C.shehatae)NRRL Y-12878所显示的最快速度相当的速度利用好氧提供的几乎150g/L木糖的7g/L以产生52g/L乙醇。对于所有测试株，由好氧培养所产生的发酵比微好氧培养的更有利。Slininger,P.J.等人,Biotechnol Lett(1985)7:431。
例如，在葡萄糖、果糖和蔗糖上生长的产乙醇细菌运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)通过Entner-Douderoff途径将这些糖代谢为CO2和乙醇。尽管野生菌株不可以使用木糖作为碳源，但是已工程设计了能够在这种糖上生长的运动发酵单胞菌(Z.mobilis)的重组株(美国专利公开No.20080187973；美国专利No.5,514,583；美国专利No.5,712,133；WO 95/28476；Feldmann等人(1992)Appl Microbiol Biotechnol 38:354-361；Zhang等人(1995)Science 267:240-243)。
已报道了通过重组大肠杆菌(E.coli)的木糖向乙醇的转化。添加少量的钙、镁和亚铁离子刺激发酵。Beall等人,Biotechnology and Bioengineering 38,no.3(1991):296-303。
应理解具有天然或工程设计的从木糖产生乙醇的生物合成途径的本文所提供的或者另外本领域中已知的微生物可以用作宿主菌株，当表达如本文所述的编码木糖转运蛋白的外源核酸时，其可以具有提高的木糖吸收和改善的从木糖产生乙醇的产量。可以采用其它代谢工程以进一步提高这些宿主菌株中乙醇的生产。
具有从木糖生产正丁醇的生物合成途径的微生物在本领域中是已知的。参见，例如，Kudahettige-Nilsson RL,等人,Bioresour Technol.176:71-9(2015)；Xin F,等人,Appl Environ Microbiol.,80(15):4771-8(2014)；Xiao H,等人,Metab Eng.14(5):569-78(2012)；Zhang J,等人,Biotechnol Lett.38(4):611-7(2016)；Yu L,等人BiotechnolBioeng.112(10):2134-41(2015)；Steen,等人,Microb Cell Fact.7:36(2008)；PásztorA,等人,Biotechnol Bioeng.,112(1):120-8(2015)；Shi S,等人,Sci Rep.6:25675(2016)；Dellomonaco C,等人,Nature,10:476(7360):355-9(2011)。在一些实施方式中，本文提供了具有如本文所述的至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸以及从木糖产生正丁醇的生物合成途径的非天然存在的微生物。随着木糖吸收的提高，所述微生物还可以具有改善的从木糖产生正丁醇的产量。本文还提供了通过将具有正丁醇生物合成途径的本文所提供的非天然存在的微生物在一定条件下培养足够的一段时间以产生正丁醇来生产生物衍生正丁醇的方法。
丁醇作为燃料提供了一些益处。丁醇是四碳醇，它是和大部分溶剂(醇、醚、醛、酮和烃)可混溶的透明中性液体并且微溶于水(与完全可混溶的乙醇相比，水溶性6.3％)。它具有与汽油相当的辛烷值，这使其成为制备用于燃烧汽油的任何内燃机的有价值的燃料。燃料测试也已证明丁醇在存在水的情况下不会发生相分离，并且对弹性体膨胀无不利影响。丁醇不仅具有比乙醇更接近于汽油的更高的含能量，因此它在燃料经济性方面的妥协性更低，而且由于其低蒸气压，它还可以容易地添加至常规汽油。
可以通过丙酮、丁醇和乙醇发酵途径(“ABE途径”)实现丁醇的生物合成。使用细菌醋酪酸梭状芽孢杆菌的溶剂-产生种，这种丁醇发酵生产途径的产物为6份丁醇、3份丙酮和1份乙醇。已将丁醇-生产途径引入多种宿主生物。例如，出于它们的高生长速率和遗传工具效率，在大肠杆菌(Escherichia coli)(Atsumi等人,Nature 451:86-89(2008))和酿酒酵母(S.cerevisiae)(Steen等人,Microb.Cell Fact 7:36(2008))中表达了该途径。出于它们潜在更高的溶剂耐受性，使用了恶臭假单胞菌(P.putida)，短乳杆菌(L.brevis)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(Nielsen等人,Metab.Eng.11:262-273(2009)；Berezina等人,Appl.Microbiol.Biot.87:635-646(2010))。
使用粮食作物作为起始材料用于丁醇生产的替代是生物质，具体地木质纤维素生物质。已将梭菌(Clostridium spp.)株工程设计以对于木糖产生丁醇，如糖化丙酮丁醇梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)(例如，糖化丙酮丁醇梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)株ATCC 27021或者糖化丙酮丁醇梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)株ATCC 27022)。参见，例如，美国专利No.8900841。将解纤维梭菌(C.cellulolyticum)工程设计以改变其天然缬氨酸合成途径用于从结晶纤维素生产异丁醇(Higashide等人,Appl.Environ.Microb.77:2727-2733(2011))。向噬纤维梭菌(C.cellulovorans)，其天然产生丁酸作为主要代谢产物，引入醛/醇脱氢酶(AdhE2)以将来自纤维素的前体丁酰-CoA转化为1-丁醇(Yang等人,Metab.Eng.32:39-48(2015))。还使用解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)显示了从木糖生产1-丁醇(Bhandiwad等人,Metab.Eng.21:17-25(2014))。
为了提高纤维素分解速率并减少污染的机会，使用了嗜热微生物。使用纤维二糖作为底物，在热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)中显示了嗜热生物中异丁醇生产的第一实例(Lin等人,Metab.Eng.24:1-8(2014))。在本研究中，研究了参与异丁醇合成的酶的热稳定性。将本研究的结果应用于通过表达和优化异丁醇生物合成途径，在热纤维梭菌(C.thermocellum)中将纤维素向异丁醇的直接转化(Lin等人,Metab.Eng.31:44-52(2015))。
酿酒酵母(S.cerevisiae)具有一些益处，如从己糖产生乙醇的高产量和对乙醇以及木质纤维素生物质的酸解产物中的其它抑制化合物的高耐受性。尽管这种酵母的标准株不可以使用戊糖，如木糖，但是可以通过整合用于木糖吸收途径，如来自树干毕赤酵母(P.stipitis)的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的细胞间表达的基因和用于展示来自棘孢曲霉(A.acleatus)的β-葡萄糖苷酶的基因提供可以发酵木糖和纤维寡糖的重组酵母菌株。参见，例如，美国专利公开No.20100129885；美国专利公开No.20100261241。
应理解本文所提供的或另外本领域中已知的具有从木糖产生正丁醇的天然或工程设计的生物合成途径的微生物可以用作宿主菌株。当表达如本文所述的编码木糖转运蛋白的外源核酸时，这些微生物可以具有提高的木糖吸收和改善的从木糖生产正丁醇的产量。可以采用其它代谢工程以进一步提高这些宿主菌株中正丁醇的产量。
具有从木糖生产异丁醇的生物合成途径的微生物在本领域中是已知的。参见，例如,Felpeto-Santero C,等人,AMB Express 5(1):119(2015)。在一些实施方式中，本文提供了具有如本文所述的至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸以及从木糖产生异丁醇的生物合成途径的非天然存在的微生物。随着木糖吸收的提高，所述微生物还可以具有改善的从木糖产生异丁醇的产量。本文还提供了通过将具有异丁醇生物合成途径的本文所提供的非天然存在的微生物在一定条件下培养足够的一段时间以产生异丁醇来生产生物衍生异丁醇的方法。
异丁醇，也是生物燃料候选，已在表达异源五步骤代谢途径的重组微生物中得到生产(参见，例如，WO/2007/050671、WO/2008/098227和WO/2009/103533)。用于异丁醇生产的其它途径在本领域中也是已知的。参见，例如，US 8530226 B2；US 8114641 B2；US8975049 B2。包括用于从五-碳(戊糖)糖，包括木糖生产异丁醇的途径的重组微生物在本领域中也是已知的。(参见，例如，WO 2012173659；WO 2011153144)。可以工程设计重组微生物以表达功能性外源木糖异构酶。在酵母中起作用的外源木糖异构酶在本领域中是已知的。参见，例如，US2006/0234364。外源木糖异构酶基因可以操作性连接至在酵母细胞中起作用的启动子和终止子序列。改善异丁醇产量的多种基因工程方法在本领域中也是已知的。(参见，例如，Avalos等人,Nature Biotechnology 31,335–41(2013))。
例如，重组酿酒酵母(S.cerevisiae)已知从木糖产生异丁醇。参见，例如，US20130035515；Brat等人,FEMS yeast research 13.2(2013):241-244；Lee,Won-Heong等人Bioprocess and biosystems engineering 35.9(2012):1467-1475；将优化的，胞质定位的缬氨酸生物合成途径的过表达与来自植物发酵梭菌(C.phytofermentans)的木糖异构酶XylA、转二羟丙酮基酶Tal1和木酮糖激酶Xks1的过表达一起同时进行使得重组酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞能够补足ilv2,3,5三重缺失突变体的缬氨酸营养缺陷以用于在作为唯一碳源的d-木糖上生长。此外，在酮酸脱羧酶Aro10和乙醇脱氢酶Adh2的额外过表达之后，细胞能够直接将D-木糖发酵为异丁醇。
应理解具有天然或工程设计的从木糖产生异丁醇的生物合成途径的本文所提供的或者另外本领域中已知的微生物可以用作宿主菌株，当表达如本文所述的编码木糖转运蛋白的外源核酸时，其可以具有提高的木糖吸收和改善的从木糖产生异丁醇的产量。可以采用其它代谢工程以进一步提高这些宿主菌株中异丁醇的产量。
具有生产异丙醇的生物合成途径的微生物在本领域中是已知的。Hanai T,等人,Appl Environ Microbiol.,73(24):7814-8(2007)。在一些实施方式中，本文提供了具有如本文所述的至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸以及从木糖产生异丙醇的生物合成途径的非天然存在的微生物。随着木糖吸收的提高，所述微生物还可以具有改善的从木糖产生异丙醇的产量。本文还提供了通过将具有异丙醇生物合成途径的本文所提供的非天然存在的微生物在一定条件下培养足够的一段时间以产生异丙醇来生产生物衍生异丙醇的方法。
乙烯的聚合提供了聚乙烯，它是一类具有多种有用应用的塑料。传统上，通过炼制的非可再生化石燃料生产乙烯，但是生物学衍生的乙醇脱水为乙烯提供了从可再生碳源，即来自可发酵糖发酵的乙醇生产乙烯的替代途径。类似地，异丙醇和正丙醇可以脱水为丙烯，其反过来可以聚合为聚丙烯。和聚乙烯一样，使用生物学-衍生的丙醇作为起始材料(即，异丙醇或正丙醇)将导致产生“绿色聚丙烯”。参见，例如，WO 2009/049274、WO 2009/103026、WO 2009/131286、WO 2010/071697、WO 2011/031897、WO 2011/029166、WO 2011/022651、WO 2012/058603。
已在工程设计以具有异丙醇途径并且产生提高的量的异丙醇的重组乳杆菌(Lactobacillus)宿主细胞(例如，儒氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri))中观察到了异丙醇的生产。参见，例如，WO2013178699A1。还观察到了使用合成途径，通过工程设计的大肠杆菌(Escherichia coli)，从纤维二糖直接生产异丙醇。参见，例如，Soma等人,Journal ofbioscience and bioengineering 114.1:80-85(2012)。
应理解具有天然或工程设计的从木糖产生异丙醇的生物合成途径的本文所提供的或者另外本领域中已知的微生物可以用作宿主菌株，当表达如本文所述的编码木糖转运蛋白的外源核酸时，其可以具有提高的木糖吸收和改善的从木糖产生异丙醇的产量。可以采用其它代谢工程以进一步提高这些宿主菌株中异丙醇的产量。
阿糖醇属于戊糖醇家族并且作为甜味剂在食品工业中和作为防龋剂和脂肪组织降低剂在人治疗剂的生产中使用。它还可以用作化学产品，如阿糖酸和木糖酸、丙烯、乙二醇、木糖醇等的底物。它包括在指定用于其它生物技术研究的12种C3-C6化合物结构单元的列表中。可以在来自农业、林业(L-阿拉伯糖、葡萄糖)和生物柴油工业(甘油)的废料的生物转化或生物转换过程中，通过酵母生产这种多元醇。存在能够利用生物质水解产物来有效生产L-或D-阿糖醇的来自假丝酵母属(Candida)、毕赤氏酵母属(Pichia)、德巴利酵母属(Debaryomyces)和接合酵母属(Zygosaccharomyces)的天然酵母以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的基因修饰菌株。Kordowska-Wiater,Journal of AppliedMicrobiology 119,303-314(2015)。
具有生产阿糖醇的生物合成途径的微生物在本领域中是已知的。(参见，例如，Kordowska-Wiater,Journal of Applied Microbiology 119,303-314(2015)；Nozaki等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.,67(9):1923-29(2003))。例如，最近鉴别的Zygocaccharomyces rouxxii NRRL 27,624株已知从葡萄糖产生作为主要代谢产物的D-阿糖醇(Saha等人,J Ind Microbiol Biotechnol 34:519–523(2007))。然而，还将其鉴别为从木糖和从木糖和木酮糖的混合物产生D-阿糖醇和木糖醇(Saha等人,2007)。基于这些结果，从木糖产生D-阿糖醇的途径包括木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和阿糖醇脱氢酶(Saha等人,2007)。另外，麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)已显示通过木酮糖还原酶从D-木酮糖产生D-阿糖醇(Cheng等人,Microbial.Cell Factories,10:5(2011))。还发现通过在德巴利酵母属(Debaryomyces)、地霉属(Geotrichum)和梅奇酵母属(Metschnikowia)内的酵母种中添加木糖和甘油，改善了阿糖醇的生产(国际专利申请公开WO 2012/011962(2012))。
在一些实施方式中，本文提供了具有如本文所述的至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸以及从木糖产生阿糖醇的生物合成途径的非天然存在的微生物。随着木糖吸收的提高，所述微生物还可以具有改善的从木糖产生阿糖醇的产量。本文还提供了通过将具有阿糖醇生物合成途径的本文所提供的非天然存在的微生物在一定条件下培养足够的一段时间以产生阿糖醇来生产生物衍生阿糖醇的方法。
应理解具有天然或工程设计的从木糖产生阿糖醇的生物合成途径的本文所提供的或者另外本领域中已知的微生物可以用作宿主菌株，当表达如本文所述的编码木糖转运蛋白的外源核酸时，其可以具有提高的木糖吸收和改善的从木糖产生阿糖醇的产量。可以采用其它代谢工程以进一步提高这些宿主菌株中阿糖醇的产量。
具有从木糖生产乙酸乙酯的生物合成途径的微生物在本领域中是已知的。Morrissey JP等人,Yeast,32(1):3-16(2015)。在一些实施方式中，本文提供了具有如本文所述的至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸以及从木糖产生乙酸乙酯的生物合成途径的非天然存在的微生物。随着木糖吸收的提高，所述微生物还可以具有改善的从木糖产生乙酸乙酯的产量。本文还提供了通过将具有乙酸乙酯生物合成途径的本文所提供的非天然存在的微生物在一定条件下培养足够的一段时间以产生乙酸乙酯来生产生物衍生乙酸乙酯的方法。
乙酸乙酯是环境友好的溶剂，其具有多种工业应用。乙酸乙酯的微生物合成是所期望的。酵母产生大量这种酯的能力是长期已知的，并且可以应用于从可再生原材料的大规模酯生产。异常毕赤酵母(P.anomala)、产朊假丝酵母(C.utilis)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)是以高得率将糖转化为乙酸乙酯的酵母。等人,Appl MicrobiolBiotechnol(2014)98:5397–5415。
多种乙酸乙酯的合成需要氧，这通常通过通气来提供。乙酸乙酯是易挥发的，从而通气导致其相转移和汽提。这种汽提过程不可避免，但是在实验期间需要充分处理，并且为合成酯成本有效的过程集成的回收提供了机会。
应理解具有天然或工程设计的从木糖产生乙酸乙酯的生物合成途径的本文所提供的或者另外本领域中已知的微生物可以用作宿主菌株，当表达如本文所述的编码木糖转运蛋白的外源核酸时，其可以具有提高的木糖吸收和改善的从木糖产生乙酸乙酯的产量。可以采用其它代谢工程以进一步提高这些宿主菌株中乙酸乙酯的产量。
具有生产苯基-乙醇的生物合成途径的微生物在本领域中是已知的。参见，例如，Kim B,等人,Biotechnol Bioeng.111(1):115-24(2014)。在一些实施方式中，本文提供了具有如本文所述的至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸以及从木糖产生苯基-乙醇的生物合成途径的非天然存在的微生物。随着木糖吸收的提高，所述微生物还可以具有改善的从木糖产生苯基-乙醇的产量。本文还提供了通过将具有苯基-乙醇生物合成途径的本文所提供的非天然存在的微生物在一定条件下培养足够的一段时间以产生苯基-乙醇来生产生物衍生苯基-乙醇的方法。
苯基-乙醇是可以通过微生物生产的无色、透明、轻微粘度液体。已发现苯基-乙醇存在于一些天然精油中、食物、香料和烟草中，以及未蒸馏的酒精饮料、啤酒和酒中。它防止或延缓细菌生长，并因此保护化妆品和个人护理产物不会腐坏。苯基-乙醇还赋予产品香味。
应理解具有天然或工程设计的从木糖产生苯基-乙醇的生物合成途径的本文所提供的或者另外本领域中已知的微生物可以用作宿主菌株，当表达如本文所述的编码木糖转运蛋白的外源核酸时，其可以具有提高的木糖吸收和改善的从木糖产生苯基-乙醇的产量。可以采用其它代谢工程以进一步提高这些宿主菌株中苯基-乙醇的产量。
具有生产2-甲基-丁醇的生物合成途径的微生物在本领域中是已知的。参见，例如，US 8114641 B2；US 8975049 B2。在一些实施方式中，本文提供了具有如本文所述的至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸以及从木糖产生2-甲基-丁醇的生物合成途径的非天然存在的微生物。随着木糖吸收的提高，所述微生物还可以具有改善的从木糖产生2-甲基-丁醇的产量。本文还提供了通过将具有2-甲基-丁醇生物合成途径的本文所提供的非天然存在的微生物在一定条件下培养足够的一段时间以产生2-甲基-丁醇来生产生物衍生2-甲基-丁醇的方法。
2-甲基-丁醇可以用作溶剂和其它化学品生产中的中间体。2-甲基-丁醇还应用于燃料和润滑油添加剂、浮选助剂、腐蚀抑制剂的生产、药物、油漆溶剂和萃取剂。
应理解具有天然或工程设计的从木糖产生2-甲基-丁醇的生物合成途径的本文所提供的或者另外本领域中已知的微生物可以用作宿主菌株，当表达如本文所述的编码木糖转运蛋白的外源核酸时，其可以具有提高的木糖吸收和改善的从木糖产生2-甲基-丁醇的产量。可以采用其它代谢工程以进一步提高这些宿主菌株中2-甲基-丁醇的产量。
具有生产3-甲基-丁醇的生物合成途径的微生物在本领域中是已知的。参见，例如，US 8114641 B2；US 8975049 B2；US 7985567 B2。在一些实施方式中，本文提供了具有如本文所述的至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸以及从木糖产生3-甲基-丁醇的生物合成途径的非天然存在的微生物。随着木糖吸收的提高，所述微生物还可以具有改善的从木糖产生3-甲基-丁醇的产量。本文还提供了通过将具有3-甲基-丁醇生物合成途径的本文所提供的非天然存在的微生物在一定条件下培养足够的一段时间以产生3-甲基-丁醇来生产生物衍生3-甲基-丁醇的方法。
3-甲基-丁醇(也称为异戊醇)是透明、无色的醇。3-甲基-丁醇是香蕉油生产中的主要成分，它是自然界中存在的酯并且还在工业中作为风味剂生产。它也是用于细菌鉴别性吲哚试验的柯氏试剂的主要成分。3-甲基-丁醇还在氯仿：异戊醇试剂中用作消泡剂。
应理解具有天然或工程设计的从木糖产生3-甲基-丁醇的生物合成途径的本文所提供的或者另外本领域中已知的微生物可以用作宿主菌株，当表达如本文所述的编码木糖转运蛋白的外源核酸时，其可以具有提高的木糖吸收和改善的从木糖产生3-甲基-丁醇的产量。可以采用其它代谢工程以进一步提高这些宿主菌株中3-甲基-丁醇的生产。
基于对于特定化合物所选的宿主微生物的生物合成途径组成，本文所提供的非天然存在的微生物可以包括至少一种外源表达的生物合成途径-编码核酸和多达全部所述化合物的一种或多种生物合成途径的编码核酸。所述化合物可以是(例如)木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或者3-甲基-丁醇。例如，可以通过相应编码核酸的外源表达，在缺乏从木糖生产乙醇所需的途径酶或蛋白的宿主中建立乙醇的生物合成。换言之，在缺乏乙醇途径的全部的酶或蛋白的宿主中，可以包括所述途径中的所有酶或蛋白的外源表达，尽管应理解即使所述宿主含有所述途径酶或蛋白中的至少一种，但是仍可以表达所述途径的全部酶或蛋白。例如，可以在酿酒酵母(S.cerevisiae)中包括用于乙醇生产的途径中的全部酶或蛋白的外源表达以提高从木糖生产乙醇的产量，尽管酿酒酵母(S.cerevisiae)具有除木糖转运蛋白之外的从木糖产生乙醇的生物合成途径的所有酶的内源表达。
考虑到本文所提供的教导和指导，本领域技术人员将理解以可表达形式引入的编码核酸的数目将至少与所选的宿主微生物的途径缺陷并列。因此，本发明的非天然存在的微生物可以具有1、2、3、4、5、6、7或8个以至多达全部编码构成生物合成途径的酶或蛋白的核酸。在一些实施方式中，所述非天然存在的微生物还可以包括有利于或优化特定化合物的生物合成或者赋予宿主微生物其它有用功能的其它遗传修饰。一种这种其它功能可以包括(例如)特定化合物的一个或多个途径前体的合成增强。
通常，选择宿主微生物，从而使其作为天然产生的分子或者作为提供所期望的前体的从头产生或通过所述宿主微生物天然产生的前体产量的提高的工程设计产物产生了所期望的产物或者所期望的产物的前体。例如，在宿主生物，如大肠杆菌(E.coli)中天然产生了乙醇。如本文所公开的，宿主生物可以工程设计以提高前体的产量。另外，已工程设计以产生所期望的前体的微生物可以用作宿主生物，并且可以进一步工程设计以表达特定生物合成途径的酶或蛋白。
在一些实施方式中，从含有从木糖合成化合物，如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或3-甲基-丁醇的酶促能力的宿主产生了本文所提供的非天然存在的微生物。在该具体实施方式中，它对于提高所期望的产物的合成或积累可以是有用的，以(例如)驱使生物合成途径反应向所期望的产物的生产进行。可以通过(例如)编码用于从木糖生产化合物，如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或者3-甲基-丁醇的一个或多个生物合成途径酶或蛋白的核酸的过表达来完成合成或积累的提高。可以(例如)通过内源基因的外源表达或者通过异源基因的外源表达来进行所期望的途径的生物合成途径的酶和/或蛋白的过表达。因此，可以容易地修饰如本文所提供的具有提高的木糖吸收的微生物以用于产生所期望的化合物，例如，通过1、2、3、4、5个和多达全部编码所期望的产物的生物合成途径酶或蛋白的核酸的过表达。另外，可以通过导致生物合成途径中的酶活性提高的内源基因突变来产生非天然存在的生物。
在特别有用的实施方式中，使用编码核酸的外源表达。外源表达赋予了定制宿主的表达和/或调控元件的能力和实现通过用户控制的所期望的表达水平的应用。然而，在其它实施方式中，也可以使用内源表达，如当与诱导型启动子或者其它调控元件连接时，通过除去负调控效应因子或者基因启动子的诱导。因此，可以通过提供适当的诱导剂来上调具有天然存在的诱导型启动子的内源基因，或者可以工程设计内源基因的调控区以引入诱导型调控元件，借此使得能够在所期望的时间调控内源基因表达的提高。类似地，可以作为引入非天然存在的微生物的外源基因的调控元件包含诱导型启动子。
应理解可以将一种或多种外源核酸中的任一种引入微生物以产生所期望的产物，如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或3-甲基-丁醇的产量提高的非天然存在的微生物。可以引入核酸以给予(例如)微生物从木糖产生乙醇的生物合成途径。作为另外一种选择，可以引入编码核酸以产生中间微生物，其具有催化一些所期望的反应以赋予生物合成能力的生物合成能力。例如，具有生物合成途径的非天然存在的微生物可以包含编码所期望的酶或蛋白的至少两个外源核酸。因此，应理解可以在本发明的非天然存在的微生物中包含生物合成途径的两种或更多种酶或蛋白的任何组合。类似地，应理解可以在本发明的非天然存在的微生物中包含生物合成途径的三个或以上的酶或蛋白的任意组合，只要所期望的生物合成途径的酶和/或蛋白的组合导致相应所期望的产物的产生。类似地，根据需要，可以在本发明的非天然存在的微生物中包含如本文所公开的生物合成途径的四个或以上的酶或蛋白的任意组合，只要所期望的生物合成途径的酶和/或蛋白的组合导致相应所期望的产物的产生。
除如本文所述的所期望的产物的生物合成外，还可以以彼此和/或与本领域中熟知的其它微生物和方法的不同组合使用本文所提供的非天然存在的微生物和方法以实现通过其它途径的产物生物合成。例如，除乙醇生产菌的使用以外，生产乙醇的一种替代方法是通过添加能够将乙醇途径中间产物转化为乙醇的另一种微生物。一种这种程序包括(例如)产生乙醇途径中间产物的微生物的发酵。然后，乙醇途径中间产物可以用作将乙醇途径中间产物转化为乙醇的第二微生物的底物。可以将乙醇途径中间产物直接添加至第二生物的另一培养，或者可以通过(例如)细胞分离从乙醇途径中间产物产生菌的原始培养中除去这些微生物，然后可以使用向发酵肉汤中后续添加所述第二生物以产生最终产物，而不使用中间产物纯化步骤。尽管在本文中将乙醇用作实例，但是相同方法可以用于其它所期望的产物的生产，如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或者3-甲基-丁醇。
在其它实施方式中，可以以多种子途径组合本文所提供的非天然存在的微生物和方法以实现所期望的产物的生物合成。在这些实施方式中，本发明的所期望的产物的生物合成途径可以分离成不同的微生物，并且所述不同的微生物可以共培养以产生最终产物。在该生物合成方案中，一种微生物的产物是第二微生物的底物，直至合成了最终产物。例如，可以通过构建含有用于一种途径中间产物向另一种途径中间产物或产物的转化的生物合成途径的微生物来完成所期望的产物的生物合成。作为另外一种选择，还可以通过使用两种生物在相同容器中的共培养或共发酵从微生物生物合成产生所期望的产物，其中所述第一微生物产生所期望的产物的中间产物，而所述第二微生物将所述中间产物转化为所期望的产物。所述所期望的产物可以是木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或者3-甲基-丁醇。
考虑到本文所提供的教导和指导，本领域技术人员将理解对于本文所提供的非天然存在的微生物和方法，与其它微生物，与具有子途径的其它非天然存在的微生物的共培养以及与在本领域中熟知的产生所期望的产物的其它化学和/或生物化学程序的组合一起存在多种组合和排列。
在一些实施方式中，本文所提供的生产生物衍生化合物的方法还包括使用本领域中熟知的多种方法与培养中的其它组分分离。所述生物衍生化合物可以是木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或者3-甲基-丁醇。这些分离方法包括(例如)提取程序以及包括连续液-液萃取、渗透气化、膜滤法、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、提取过滤、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、吸附色谱、超滤、活性炭吸附、pH调节和沉淀或者以上列举的一种或多种方法的组合的方法。上述所有方法在本领域中是熟知的。
可以培养本文所述的任何非天然存在的微生物以产生和/或分泌所期望的生物衍生化合物，其包括，如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇，2-甲基-丁醇或者3-甲基-丁醇。例如，可以培养本文所提供的微生物用于生物合成生产所期望的化合物。因此，在一些实施方式中，本文提供了含有本文所述的所期望的生物衍生化合物或其中间体的培养基。在一些方面，还可以将培养基与产生所期望的生物衍生化合物或其中间产物的非天然存在的微生物分离。将微生物与培养基分离的方法在本领域中是熟知的。示例性方法包括过滤、絮凝、沉淀、离心、沉降等。
对于所期望的生物衍生化合物，包括如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或者3-甲基-丁醇的生产，在具有碳源及其它必需营养素的培养基中培养本文所提供的微生物。在一些实施方式中，在好氧培养基中培养本文所提供的微生物。在一些实施方式中，在基本厌氧培养基中培养本文所提供的微生物。如本文所述，实现所期望的产物，如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或3-甲基-丁醇的生物合成的一个示例性生长条件包括厌氧培养或发酵条件。在某些实施方式中，本文所提供的非天然存在的微生物可以在厌氧或基本厌氧条件下维持、培养或发酵。简要地，厌氧条件是指缺少氧的环境。基本厌氧条件包括(例如)培养、分批发酵或连续发酵，从而培养基中的溶氧浓度保持在0至10％饱和之间。基本厌氧条件还包括将细胞在维持在小于1％的氧的气氛的密封盒内的液体培养基或固体琼脂上生长或休眠。可以通过(例如)用N2/CO2的混合物或者其它适合的非氧气或气体向培养中鼓泡来维持氧的百分比。
有时希望并且可以非常期望在发酵罐中维持厌氧条件以降低整个过程的成本。可以(例如)通过首先用氮气向培养基鼓泡，然后用隔膜和钳口盖密封烧瓶来获得这些条件。对于未观察到厌氧生长的菌株，可以通过用小孔使隔膜穿孔以用于有限通气来施加微氧或基本厌氧条件。先前已描述了示例性厌氧条件并且所述示例性厌氧条件在本领域中是熟知的。在(例如)2007年8月10日提交的美国专利公开2009/0047719中描述了示例性的好氧和厌氧条件。如本文所公开的，可以以分批、补料-分批或连续方式进行发酵。如果需要，还可以在两相中进行发酵。第一相可以是好氧的以允许高生长，并因此允许高产量，然后是高得率的厌氧相。
如果需要，可以根据需要，通过添加碱，如NaOH或其它碱，或者酸将培养基的pH维持在所期望的pH，具体地中性pH，如约7的pH，以将培养基维持在所期望的pH。可以使用分光光度计通过测量光密度(600nm)来确定生长速率，并且可以通过监测碳源随时间的减少来确定葡萄糖的吸收速率。
用于本文所提供的微生物的培养基可以包括木糖，其作为唯一碳源或者与本文所述的或本领域中已知的一种或多种共基质结合。所述培养基还可以包含其它补充剂，如酵母提取物和/或蛋白胨。所述培养基还可以包含(例如)任何其它碳水化合物源，其可以向非天然存在的微生物提供碳源。这些碳源包括，例如：其它糖，如纤维二糖、半纤维素、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉；或者甘油。所述源可以是生物质水解产物。因此，所述培养基可以包含木糖和共基质葡萄糖。所述培养基可以包含木糖和共基质纤维二糖。所述培养基可以包含木糖和共基质半纤维素。所述培养基可以包含木糖和共基质半乳糖。所述培养基可以包含木糖和共基质甘油。
所述培养基可以具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或更大量的糖(w/v)。在一些实施方式中，所述培养基可以具有2％的糖。在一些实施方式中，所述培养基可以具有4％的糖。在一些实施方式中，所述培养基可以具有10％的糖。在一些实施方式中，所述培养基可以具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或更大量的木糖(w/v)。所述培养基可以具有1％的木糖。所述培养基可以具有2％的木糖。所述培养基可以具有3％的木糖。所述培养基可以具有4％的木糖。所述培养基可以具有5％的木糖。所述培养基可以具有6％的木糖。所述培养基可以具有7％的木糖。所述培养基可以具有8％的木糖。所述培养基可以具有9％的木糖。所述培养基可以具有10％的木糖。所述培养基可以具有11％的木糖。所述培养基可以具有12％的木糖。所述培养基可以具有12％的木糖。所述培养基可以具有13％的木糖。所述培养基可以具有14％的木糖。所述培养基可以具有15％的木糖。所述培养基可以具有16％的木糖。所述培养基可以具有17％的木糖。所述培养基可以具有18％的木糖。所述培养基可以具有19％的木糖。所述培养基可以具有20％的木糖。
所述培养基可以是富含C5的培养基，其以五碳糖(如木糖)作为主要碳源。所述培养基还可以具有C6糖(六碳糖)。在一些实施方式中，所述培养基可以具有C6糖作为主要碳源。在一些实施方式中，所述C6糖是葡萄糖。所述培养可以具有C6糖和C5糖两者作为碳源，并且可以具有以不同比例存在的C6糖和C5糖。在一些实施方式中，培养基中C6糖的量与C5糖的量的比(C6：C5比)在约10：1至约1：10之间。例如，所述培养基中C6：C5比可以为约10：1，9：1，8：1，7：1，6：1，5：1，3：1，2：1，1：1，1：2，1：3，1：4，1：5，1：6，1：7，1：8，1：9或者1：10。在一些实施方式中，所述培养基中C6：C5比为约3：1。在一些实施方式中，所述培养基中C6：C5比为约1：1。在一些实施方式中，所述培养基中C6：C5比为约1：5。在一些实施方式中，所述培养基中C6：C5比为约1：10。所述C5糖可以是木糖，并且所述C6糖可以是葡萄糖。在一些实施方式中，培养基中葡萄糖的量与木糖的量的比(葡萄糖：木糖比)在约10：1至约1：10之间。例如，所述培养基中葡萄糖：木糖比可以为约10：1，9：1，8：1，7：1，6：1，5：1，3：1，2：1，1：1，1：2，1：3，1：4，1：5，1：6，1：7，1：8，1：9或者1：10。在一些实施方式中，所述培养基中葡萄糖：木糖比为约3：1。在一些实施方式中，所述培养基中葡萄糖：木糖比为约1：1。在一些实施方式中，所述培养基中葡萄糖：木糖比为约1：5。在一些实施方式中，所述培养基中葡萄糖：木糖比为约1：10。
其它碳水化合物源包括(例如)可再生原料和生物质。在本发明所述的方法中可以用作原料的示例性生物质类型包括纤维素生物质、半纤维素生物质和木质素原料或原料部分。这些生物质原料含有(例如)作为碳源有用的碳水化合物基质，如木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。考虑到本文所提供的教导和指导，本领域技术人员将理解以上举例说明的那些以外的可再生原料和生物质也可以用于培养本发明所述的微生物以用于生产所期望的生物衍生化合物，包括，如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或3-甲基-丁醇。
因此，考虑到本文所提供的教导和指导，本领域技术人员将理解当在作为碳源的木糖上生长时，可以产生分泌本文所述的生物合成的化合物的非天然存在的微生物。这些化合物包括(例如)木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或者3-甲基-丁醇及其任何中间代谢物。所有所需要的是在一种或多种所需要的酶或蛋白活性中进行工程设计以实现所期望的产物或中间体的生物合成，包括(例如)用于产生所期望的产物的一些或全部生物合成途径的包括。因此，本文提供了当在碳水化合物或其它碳源上生长时，生产和/或分泌所期望的产物，如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或3-甲基-丁醇，并且当在木糖和任选地其它碳水化合物或碳源上生长时，产生和/或分泌所述所期望的化合物的生物合成途径中所示的中间代谢物的非天然存在的微生物。
使用如本文举例说明的本领域中熟知的方法构建本文所提供的非天然存在的微生物，从而以足够的量外源表达编码木糖转运蛋白的至少一种核酸以提高木糖吸收和提高从木糖产生所期望的产物的产量。应理解在足以产生所期望的产物，如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或者3-甲基-丁醇的条件下培养本文所提供的微生物。按照本文所提供的教导和指导，本文所提供的非天然存在的微生物可以实现所期望的产物的生物合成，从而导致产生约0.1-200mM或以上的胞内浓度。通常，所期望的产物的胞内浓度在约3-150mM之间，具体地约5-125mM之间，并且更具体地约8-100mM之间，包括约10mM、20mM、50mM、80mM或以上。还可以从本文所提供的非天然存在的微生物实现每个这些示例性范围之间或以上的胞内浓度。
在一些实施方式中，培养条件包括厌氧或基本厌氧生长或者维持条件。先前已描述了示例性厌氧条件并且所述示例性厌氧条件在本领域中是熟知的。本文描述了并且在(例如)美国专利公开2009/0047719中描述了用于发酵过程的示例性厌氧条件。任何这些条件以及在本领域中熟知的其它厌氧条件可以用于所述非天然存在的微生物。在这些厌氧或基本厌氧条件下，生产菌株可以以5-10mM或以上以及在本文中举例说明的所有其它浓度的胞内浓度合成所期望的产物。应理解，尽管上述说明是指胞内浓度，但是生产性微生物可以胞内产生所期望的产物和/或将所述产物分泌到培养基中。
示例性发酵过程包括(但不限于)补料-分批发酵和分批分离；补料-分批发酵和连续分离；以及连续发酵和连续分离。在示例性分批发酵流程中，使生产生物在用适当气体鼓泡的适合尺寸的生物反应器中生长。在厌氧条件下，用惰性气体或气体，例如，氮气、N2/CO2混合物、氩气、氦等的组合对培养鼓泡。随着细胞生长和使用碳源，以大致平衡碳源和/或营养物的消耗的速度将其它碳源和/或其它营养物补料至生物反应器。将生物反应器的温度维持在所期望的温度，通常在22-37℃的范围内，但是基于生产生物的生长特征和/或发酵过程所需的条件，所述温度可以维持在更高或更低的温度。生长持续所期望的一段时间，从而在发酵罐中实现所期望的培养特征，例如，细胞密度、产物浓度等。在补料-分批发酵过程中，基于所期望的培养条件，发酵的时间长度通常在几小时至几天的范围内，例如，8至24小时，或者1、2、3、4或5天，或者长达2周。根据需要，pH可以是控制或不控制的，在此情况下在运行结束时，其中pH不控制的培养通常将降低至pH 3-6。在一些实施方式中，可以首先降低初始pH，然后在培养期间提高。在一个实施方式中，培养基的初始pH为约6，并且在培养期间，pH首先降低至5.5，并且随后升高至约6.5。在培养期完成时，可以将发酵罐的内容物通过细胞分离单元，例如，离心机、过滤单元等以除去细胞和细胞碎片。在其中胞内表达所期望的产物的情况下，可以根据需要，在将细胞与发酵肉汤分离之前或之后，使细胞酶促或化学裂解或破裂，以释放其它产物。可以将发酵肉汤转移至产物分离单元。通过在本领域中使用的标准分离程序进行产物分离以将所期望的产物与稀释的水溶液分离。基于所述发酵过程的产物的化学特性，这些方法包括(但不限于)使用与水不混溶的有机溶剂(例如，甲苯或其它适合的溶剂，包括(但不限于)二乙醚、乙酸乙酯、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷、氯仿、苯、戊烷、己烷、庚烷、石油醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、二噁烷、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)等)的液-液萃取法以提供所述产物的有机溶液，如果适当，标准蒸镏法等。
在示例性完全连续发酵流程中，生产生物通常首先以分批模式长成以实现所期望的细胞密度。当碳源和/或其它营养物耗尽时，以所期望的速率连续提供具有相同组成的补料培养基，通常具有相对高的糖浓度，并且以相同速率排出发酵液。在这些条件下，生物反应器中的产物浓度以及细胞密度通常保持恒定。如以上所讨论的，发酵罐的温度保持在所期望的温度。在连续发酵阶段，通常对于优化生产，期望维持适合的pH范围。可以使用常规方法监测和维持pH，其包括添加适合的酸或碱以维持所期望的pH范围。根据情况和需要，连续操作所述生物反应器延长的一段时间，通常至少一周至几周并且长达一个月或更长的时间。根据需要，定期监测发酵液和/或培养，包括多达每天取样，以确保产物浓度和/或细胞密度的一致性。以连续方式，随着新的补料培养基的提供，恒定除去发酵罐的内容物。根据需要，在除去或不除去细胞和细胞碎片的情况下，通常使含有细胞、培养基和产物的排出液流经受连续的产物分离程序。在本领域中使用的连续分离方法可以用于将所述产物与稀释的水溶液分离，其包括(但不限于)使用与水不混溶的有机溶剂(例如，甲苯或其它适合的溶剂，包括(但不限于)二乙醚、乙酸乙酯、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷、氯仿、苯、戊烷、己烷、庚烷、石油醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、二噁烷、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)等)的连续液-液萃取法、标准连续蒸镏法等，或者本领域中熟知的其它方法。
除本文所公开的培养和发酵条件之外，实现所期望的产物的生物合成的生长条件可以包括向所述培养条件中添加渗透保护剂。在某些实施方式中，本文所提供的非天然存在的微生物可以如本文所述，在存在渗透保护剂的情况下维持、培养或发酵。简要地，渗透保护剂是指用作渗透剂并且帮助如本文所述的微生物在渗透应力下存活的化合物。渗透保护剂包括(但不限于)甜菜碱、氨基酸和糖海藻糖。这些的非限制性实例为甘氨酸甜菜碱、果仁糖甜菜碱、二甲基噻亭、二甲基锍基丙酸酯、3-二甲基锍基-2-甲基丙酸酯、哌啶酸、二甲基锍基乙酸酯、胆碱、L-卡尼汀和四氢嘧啶(ectoine)。在一个方面，所述渗透保护剂为甘氨酸甜菜碱。本领域的技术人员应理解适合于保护本文所述的微生物抵抗渗透应力的渗透保护剂的量和类型将取决于所使用的微生物。所述培养条件中渗透保护剂的量可以是(例如)不超过约0.1mM、不超过约0.5mM、不超过约1.0mM、不超过约1.5mM、不超过约2.0mM、不超过约2.5mM、不超过约3.0mM、不超过约5.0mM、不超过约7.0mM、不超过约10mM、不超过约50mM、不超过约100mM或者不超过约500mM。
所述培养条件可以包括(例如)液体培养程序以及发酵及其它大规模培养程序。如本文所述，可以在厌氧或基本厌氧的培养条件下获得特别有用的生物合成产物得率。
本文所述的培养条件可以放大并连续生长以用于所期望的产物的生产。示例性的生长程序包括(例如)补料-分批发酵和分批分离；补料-分批发酵和连续分离，或连续发酵和连续分离。所有这些方法在本领域中是熟知的。发酵程序对于商品化的量的所期望的产物的生物合成生产是特别有用的。通常并且如非连续培养程序一样，连续和/或近-连续生产包括将本文所提供的微生物在充足的营养物和培养基中培养以保持和/或几乎保持指数期的生长。处于这些条件下的连续培养可以包括(例如)生长或培养1、2、3、4、5、6或7天或以上。另外，连续培养可以包括1周、2、3、4或5或更多周并且长达数月的更长的时间段。作为另外一种选择，如果适合于具体应用，可以将本发明的生物培养数小时。应理解连续和/或近-连续培养条件还可以包括这些示例性时间段之间的所有时间间隔。还应理解培养本文所提供的微生物的时间是出于所期望的目的，生产足够量的产物的足够的一段时间。
发酵程序在本领域中是熟知的。简要地，可以在(例如)补料-分批发酵和分批分离；补料-分批发酵和连续分离，或连续发酵和连续分离中使用用于生物合成生产所期望的产物的发酵。分批和连续发酵程序的实例在本领域中是熟知的。
除使用大量所期望的产物的连续生产，使用本文所提供的生产菌株的上述发酵程序之外，所述生物衍生产物还可以(例如)同时经受化学合成和/或酶促过程以将所述产物转化为其它产物，或者所述生物衍生产物可以与发酵培养分离并且如果需要，顺序经受化学和/或酶转化以将所述产物转化为其它产物。
为了产生更好的生产菌，可以使用代谢模型来优化生长条件。建模还可以用于设计另外优化所述途径的利用的基因敲除(参见，例如，美国专利公开US 2002/0012939、US2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654和US 2004/0009466，和美国专利No.7,127,379)。建模分析使得能够可靠地预测对于将代谢向所期望产物更有效的生产的方向转变的细胞生长的影响。
本文还提供了具有通过本文所述的微生物所产生的生物衍生化合物和其它组分的组合物。除所述生物衍生产物以外的组分可以是细胞部分，例如，微量的培养基细胞部分，或者可以是在存在本文所提供的具有木糖转运蛋白的非天然存在的微生物的情况下所产生的发酵肉汤或培养基或其纯化或部分纯化的部分。当通过本文所公开的微生物生产时，所述组合物可以具有(例如)降低的副产物水平。所述组合物可以具有(例如)一种或多种生物衍生化合物，如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或3-甲基-丁醇，和本文所提供的微生物的细胞裂解液或培养上清液。所述其它组分可以是副产物或杂质，如甘油、乙醛、乙酸酯、甘油醛或它们的组合。所述副产物可以是甘油。所述副产物可以是乙醛。所述副产物可以是甘油醛。所述副产物可以是乙酸酯。所述杂质可以是甘油。所述杂质可以是乙醛。所述杂质可以是甘油醛。所述杂质可以是乙酸酯。
在一些实施方式中，可以选择碳原料及其它细胞吸收源，如磷酸盐、氨、硫酸盐、氯化物及其它卤素以改变存在于通过本文所提供的微生物所产生的生物衍生化合物中的原子的同位素分布。以上列举的多种碳原料及其它吸收源将在本文中统称为“吸收源”。吸收源可以提供存在于通过本文所提供的微生物所产生的生物衍生化合物中或者副产物或杂质中的任何原子的同位素富集。可以对于任何靶原子，包括(例如)碳、氢、氧、氮、硫、磷、氯化物或其它卤素实现同位素富集。
在一些实施方式中，可以选择所述吸收源以改变碳-12、碳-13和碳-14的比。在一些实施方式中，可以选择所述吸收源以改变氧-16、氧-17和氧-18的比。在一些实施方式中，可以选择所述吸收源以改变氢、氘和氚的比。在一些实施方式中，可以选择所述吸收源以改变氮-14和氮-15的比。在一些实施方式中，可以选择所述吸收源以改变硫-32、硫-33、硫-34和硫-35的比。在一些实施方式中，可以选择所述吸收源以改变磷-31、磷-32和磷-33的比。在一些实施方式中，可以选择所述吸收源以改变氯-35、氯-36和氯-37的比。
在一些实施方式中，可以通过选择一种或多种吸收源将靶原子的同位素比改变至所期望的比。吸收源可以来源于天然来源，如自然界所存在的，或者来源于人为来源，并且本领域技术人员可以选择天然来源、人为来源或它们的组合以实现所期望的靶原子的同位素比。人为吸收源的实例包括(例如)至少部分来源于化学合成反应的吸收源。这些同位素富集的吸收源可以是商购的或者在实验室中制备的和/或任选地与所述吸收源的天然源混合以实现所期望的同位素比。在一些实施方式中，可以通过选择如自然界中所存在的所期望的吸收源来源来实现吸收源的靶原子同位素比。例如，如本文所讨论的，天然源可以是生物基的，其来源于生物或者通过生物合成，或者是如石油基产品或大气的来源。在一些这些实施方式中，碳源(例如)可以选自化石燃料-衍生的碳源，其可以相对不含碳-14，或者环境或大气碳源，如CO2，其可以比其石油-衍生的对应物具有更大量的碳-14。
在地球大气中，不稳定的碳同位素碳-14或放射性碳大致占1012个碳原子中的1个，并且其半衰期为约5700年。通过包括宇宙射线和常规氮(14N)的核反应，在上层大气中补充碳储量。由于其很早之前衰变，因此化石燃料不包含碳-14。化石燃料的燃烧降低了大气碳-14的份数，即所谓的“苏斯效应”。
确定化合物中原子的同位素比的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。使用本领域中已知的技术，如加速质谱(AMS)、稳定同位素比质谱(SIRMS)和点特异性天然同位素分馏核磁共振技术(SNIF-NMR)，通过质谱容易地评价了同位素富集。这些质谱技术可以与分离技术，如液相色谱(LC)、高效液相色谱(HPLC)和/或气相色谱等集成。
就碳而言，在美国作为通过美国材料试验协会(ASTM)国际组织，使用放射性碳年代测定，用于确定固体、液体和气体样品的生物基含量的标准化分析方法开发了ASTMD6866。该标准基于用于确定产品的生物基含量的放射性碳年代测定的使用。ASTM D6866于2004年首次颁布，并且该标准当前有效的版本为ASTM D6866-11(2011年4月1日生效)。放射性碳年代测定技术对于本领域技术人员来说是熟知的，其包括本文所述的那些。
通过碳-14(14C)与碳-12(12C)的比值来估计化合物的生物基含量。具体地，根据下式计算现代分率(Fraction Modern，Fm)：Fm＝(S-B)/(M-B)，其中B、S和M分别代表空白、样品和现代参比的14C/12C比。现代分率是来自“现代”的样品的14C/12C比的偏差的测量。现代的定义是归一化至δ13CVPDB＝-19/1000的国家标准局(NBS)草酸I(即标准参考物质(SRM)4990b)的放射性碳浓度(公元1950年)的95％(Olsson,The use of Oxalic acid as aStandard.in,Radiocarbon Variations and Absolute Chronology,Nobel Symposium,12th Proc.,John Wiley&Sons,New York(1970))。使用国际上约定的定义：0.95乘以归一化至δ13CVPDB＝-19/1000的NBS草酸I(SRM 4990b)的比活力，计算(例如)通过ASM所测量的质谱结果。这相当于1.176±0.010×10-12的绝对(公元1950年)14C/12C比(Karlen等人,ArkivGeofysik,4:465-471(1968))。标准计算考虑了一种同位素相对于另一种的差异吸收，例如，生物系统对12C的吸收优先于13C，然后优先于14C，并且这些修正反映为对于δ13所修正的Fm。
草酸标准品(SRM 4990b或HOx 1)是从一批1955年的甜菜所制备的。尽管制备了1000磅，但是这种草酸标准品不再是可商购的。草酸II标准品(HOx 2；N.I.S.T名称为SRM4990 C)是由一批1977年的法国甜菜糖蜜所制成的。在1980年代早期，12个实验室的小组测量了两种标准品的比值。草酸II与1的活性的比值为1.2933±0.001(加权平均数)。HOx II的同位素比为-17.8/1000。ASTM D6866-11建议使用可用的草酸II标准品SRM 4990C(Hox2)作为现代标准品(参见Mann,Radiocarbon,25(2):519-527(1983)中有关原始vs.现用的草酸标准品的讨论)。Fm＝0％代表材料中完全缺少碳-14原子，因此表示是化石(例如，石油基)碳源。在对于1950年后来自核弹试验的向大气注入的碳-14进行修正之后，Fm＝100％表示完全现代的碳源。如本文所述，这种“现代”源包括生物基源。
如ASTM D6866中所述，由于1950年代的核试验项目的持续但逐渐减弱的影响，其导致了如ASTM D6866-11中所述的碳-14在大气中的大量富集，因此现代碳的百分比(pMC)可以大于100％。由于所有样品的碳-14活性是以“核弹前”的标准品为参考的，并且因为几乎所有的新的生物基产品是在核弹后的环境中产生的，因此所有pMC值(对于同位素份数修正后)必须乘以0.95(截止2010年)以更好地反映样品真正的生物基含量。大于103％的生物基含量表明要么是发生了分析误差，要么是生物基碳源超过数年。
ASTM D6866相对于材料的总有机物含量来定量生物基含量，但是不考虑所存在的无机碳及其它含有非碳的物质。例如，基于ASTM D6866，50％淀粉-基材料和50％水的产品将认为具有生物基含量＝100％(作为100％生物基的50％的有机物含量)。在另一个实例中，50％淀粉-基材料、25％石油基材料和25％的水的产品将具有生物基含量＝66.7％(75％有机物含量，但仅有50％的产品是生物基的)。在另一个实例中，作为50％有机碳并且是石油基产品的产品将认为具有生物基含量＝0％(50％有机碳，但是来自化石来源)。因此，基于用于确定化合物或材料的生物基含量的熟知方法和已知标准品，本领域技术人员可以容易地确定生物基含量和/或本发明所述的具有所期望的生物基含量的所使用的所制备的下游产品。
应用碳-14年代测定技术来定量材料的生物基含量在本领域中是已知的(Currie等人,Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B,172:281-287(2000))。例如，碳-14年代测定已用于定量含有对苯二甲酸酯-的材料中的生物基含量(Colonna等人,Green Chemistry,13:2543-2548(2011))。值得注意地，来源于可再生的1,3-丙二醇和石油-衍生的对苯二甲酸的聚丙烯对苯二甲酸酯(PPT)聚合物导致Fm值接近30％(即，因为3/11的所述聚合物碳衍生自可再生的1,3-丙二醇，8/11来自化石端成员对苯二甲酸)(Currie等人，如上，2000)。相反，衍生自可再生的1,4-丁二醇和可再生的对苯二甲酸两者的聚对苯二甲酸丁二醇酯聚合物导致生物基含量大于90％(Colonna等人，如上，2011)。
因此，在一些实施方式中，本文提供了具有反映大气碳，也称为环境碳吸收源的碳-12、碳-13和碳-14比的生物衍生化合物。所述生物衍生化合物包括如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或者3-甲基-丁醇。例如，在一些方面，所述生物衍生化合物可以具有至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或者多至100％的Fm值。在一些这些实施方式中，所述吸收源是CO2。在一些实施方式中，本文提供了具有反映石油基碳吸收源的碳-12、碳-13和碳-14比的生物衍生化合物。在该方面，本文所提供的生物衍生化合物可以具有小于95％，小于90％，小于85％，小于80％，小于75％，小于70％，小于65％，小于60％，小于55％，小于50％，小于45％，小于40％，小于35％，小于30％，小于25％，小于20％，小于15％，小于10％，小于5％，小于2％或小于1％的Fm值。在一些实施方式中，本文所提供的生物衍生化合物可以具有通过大气碳吸收源与石油基吸收源的组合所获得的碳-12、碳-13和碳-14比。使用这种吸收源的组合是可以改变碳-12、碳-13和碳-14比的一种方式，并且各个比将反映吸收源的比。
此外，本文还提供了产物衍生的生物衍生化合物，其包括如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或3-甲基-丁醇，其中所述生物衍生化合物的碳-12、碳-13和碳-14同位素比与环境中所存在的CO2的值大致相同。例如，在一些方面，本文提供了具有与环境中所存在的CO2的值大致相同的碳-12相对于碳-13相对于碳-14的同位素比，或者本文所公开的任何其它的比的生物衍生化合物。如本文所公开的，应理解产物可以具有与环境中所存在的CO2的值大致相同的碳-12相对于碳-13相对于碳-14的同位素比，或者任何本文所公开的比，其中所述产物是从如本文所公开的生物衍生化合物所产生的，其中对所述生物衍生产物化学修饰以产生最终产物。如本文所述，化学修饰生物衍生产物以产生所期望的产物的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。
本文还提供了具有通过本文所述的微生物所产生的生物衍生化合物和其它组分的组合物。除所述生物衍生产物以外的组分可以是细胞部分，例如，微量的培养基细胞部分，或者可以是在存在本文所提供的具有木糖转运蛋白的非天然存在的微生物的情况下所产生的发酵肉汤或培养基或其纯化或部分纯化的部分。当通过本文所公开的微生物生产时，所述组合物可以具有(例如)降低的副产物水平。所述组合物可以具有(例如)一种或多种生物衍生化合物，如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或3-甲基-丁醇，和本文所提供的微生物的细胞裂解液或培养上清液。所述其它组分可以是副产物或杂质，如甘油、乙醛、乙酸酯、甘油醛或它们的组合。所述副产物可以是甘油。所述副产物可以是乙醛。所述副产物可以是甘油醛。所述副产物可以是乙酸酯。所述杂质可以是甘油。所述杂质可以是乙醛。所述杂质可以是甘油醛。所述杂质可以是乙酸酯。
在一些实施方式中，本文提供的组合物可以具有生物衍生木糖醇和其它组分。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的上清液。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的细胞部分。所述其它组分可以是用于产生生物衍生木糖醇的具有如本文所述的编码木糖转运蛋白的外源核酸的微生物。所述其它组分可以是本文所提供的微生物的细胞裂解液。所述其它组分可以是副产物，如甘油、乙醛、乙酸酯、甘油醛或它们的组合。
在一些实施方式中，本文提供的组合物可以具有生物衍生乙醇和其它组分。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的上清液。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的细胞部分。所述其它组分可以是用于产生生物衍生乙醇的具有如本文所述的编码木糖转运蛋白的外源核酸的微生物。所述其它组分可以是本文所提供的微生物的细胞裂解液。所述其它组分可以是副产物，如甘油、乙醛、乙酸酯、甘油醛或它们的组合。
在一些实施方式中，本文提供的组合物可以具有生物衍生正丁醇和其它组分。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的上清液。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的细胞部分。所述其它组分可以是用于产生生物衍生正丁醇的具有如本文所述的编码木糖转运蛋白的外源核酸的微生物。所述其它组分可以是本文所提供的微生物的细胞裂解液。所述其它组分可以是副产物，如甘油、乙醛、乙酸酯、甘油醛或它们的组合。
在一些实施方式中，本文提供的组合物可以具有生物衍生异丁醇和其它组分。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的上清液。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的细胞部分。所述其它组分可以是用于产生生物衍生异丁醇的具有如本文所述的编码木糖转运蛋白的外源核酸的微生物。所述其它组分可以是本文所提供的微生物的细胞裂解液。所述其它组分可以是副产物，如甘油、乙醛、乙酸酯、甘油醛或它们的组合。
在一些实施方式中，本文提供的组合物可以具有生物衍生异丙醇和其它组分。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的上清液。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的细胞部分。所述其它组分可以是用于产生生物衍生异丙醇的具有如本文所述的编码木糖转运蛋白的外源核酸的微生物。所述其它组分可以是本文所提供的微生物的细胞裂解液。所述其它组分可以是副产物，如甘油、乙醛、乙酸酯、甘油醛或它们的组合。
在一些实施方式中，本文提供的组合物可以具有生物衍生阿糖醇和其它组分。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的上清液。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的细胞部分。所述其它组分可以是用于产生生物衍生阿糖醇的具有如本文所述的编码木糖转运蛋白的外源核酸的微生物。所述其它组分可以是本文所提供的微生物的细胞裂解液。所述其它组分可以是副产物，如甘油、乙醛、乙酸酯、甘油醛或它们的组合。
在一些实施方式中，本文提供的组合物可以具有生物衍生乙酸乙酯和其它组分。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的上清液。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的细胞部分。所述其它组分可以是用于产生生物衍生乙酸乙酯的具有如本文所述的编码木糖转运蛋白的外源核酸的微生物。所述其它组分可以是本文所提供的微生物的细胞裂解液。所述其它组分可以是副产物，如甘油、乙醛、乙酸酯、甘油醛或它们的组合。
在一些实施方式中，本文提供的组合物可以具有生物衍生苯基-乙醇和其它组分。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的上清液。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的细胞部分。所述其它组分可以是用于产生生物衍生苯基-乙醇的具有如本文所述的编码木糖转运蛋白的外源核酸的微生物。所述其它组分可以是本文所提供的微生物的细胞裂解液。所述其它组分可以是副产物，如甘油、乙醛、乙酸酯、甘油醛或它们的组合。
在一些实施方式中，本文提供的组合物可以具有生物衍生2-甲基-丁醇和其它组分。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的上清液。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的细胞部分。所述其它组分可以是用于产生生物衍生2-甲基-丁醇的具有如本文所述的编码木糖转运蛋白的外源核酸的微生物。所述其它组分可以是本文所提供的微生物的细胞裂解液。所述其它组分可以是副产物，如甘油、乙醛、乙酸酯、甘油醛或它们的组合。
在一些实施方式中，本文提供的组合物可以具有生物衍生3-甲基-丁醇和其它组分。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的上清液。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的细胞部分。所述其它组分可以是用于产生生物衍生3-甲基-丁醇的具有如本文所述的编码木糖转运蛋白的外源核酸的微生物。所述其它组分可以是本文所提供的微生物的细胞裂解液。所述其它组分可以是副产物，如甘油、乙醛、乙酸酯、甘油醛或它们的组合。
本文还提供了具有通过本文所述的非天然存在的微生物或者使用本文所述的方法所产生的一种或多种生物衍生化合物的生物基产品。在一些实施方式中，本文提供了使用本文所述的生物衍生化合物，如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或者3-甲基-丁醇所产生的生物基产品。这种生产可以包括将所述生物衍生化合物化学反应(例如，化学转化、化学官能化、化学偶联、氧化、还原、聚合、共聚合等)成最终产品。在一些实施方式中，本文提供了具有本文所述的生物衍生化合物，如木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇或者3-甲基-丁醇的生物基产品。在一些实施方式中，本文提供了具有至少2％，至少3％，至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％或者100％的如本文所公开的生物衍生化合物的生物基产品。
应理解在本文所提供的本发明的定义内，还提供了不显著影响本发明的多个实施方式的活性的改变。因此，以下实施例旨在说明，但不限制本发明。在整个本发明申请中，已参考了多个出版物。在本发明中，这些出版物的公开内容，包括GenBank和GI编号出版物以其全部内容作为参考并入本文以更全面地描述本发明所属领域的技术现状。
实施例I
木糖转运蛋白在H0梅奇酵母(Metschnikowia)种中的表达
将H0梅奇酵母(Metschnikowia)种酵母在多种培养基中生长，并且通过转录组分析测量多种木糖转运蛋白的表达。如在下表中所提及的，“FPKM”是指“每一百万个图谱(map)测序数据(read)中每1K个转录本碱基的片段数”；所有培养基包括2％蛋白胨和1％酵母提取物的标准组成；在所有培养基中最终的糖浓度为总计2％；“高”和“低”表示三个所测试的生物实验重复中所发现的最大和最小FPKM值。
表：H0梅奇酵母(Metschnikowia)种中木糖转运蛋白的转录组分析
实施例II
H0梅奇酵母(Metschnikowia)种中工程设计提高的木糖吸收
H0梅奇酵母(Metschnikowia)种被确认具有稳健的木糖吸收和代谢机制，其具有消耗和代谢木糖作为唯一碳源的能力。通过将H0在已知的量的木糖中生长并且通过高效液相色谱法测量培养基中保留的木糖来测量木糖吸收。将剩余的木糖的量与标准曲线以及接种培养基中所述糖的量相比较。如图1和图2所示，在野生型H0梅奇酵母(Metschnikowia)种中观察到了有效的木糖转运。在48小时内，H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖吸收测量为24至48克之间，并且在6天内为90克(初始OD600＝0.2)，其显著高于本领域中已知的酵母的木糖吸收率。参见Hector等人,Applied microbiology and biotechnology 80(4):675-684(2008)(报道以初始OD600＝1.0，在好氧条件下，在48h中酿酒酵母(S.cerevisiae)的木糖吸收率为10-15克)；Runquist,等人,Appl Microbiol Biotechnol 82:123(2009)(报道在厌氧条件下，在48h中酵母(TMB34XX)的木糖吸收率为4克)；Apel等人,Scientificreports 6(2016)(报道在好氧条件下，在48h中酵母的木糖吸收率为9克)。在过表达Xyt1p的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种中，木糖转运进一步提高，还如图1和图2所示。为了过表达Xyt1p，使用了H0 XYT1盒，其由驱动XYT1的H0 TPI1启动子和从H0 PGK1启动子表达的杀稻瘟菌素组成。引物Y33和Y33R扩增与载体DeBONO_E28.7中的H0 TPI1启动子和H0 RPL15A终止子具有30和31bp的同源性的来自H0基因组DNA的XYT1 OFR。XYT1扩增子是组装到DeBONO_E28.7的EcoRI和SalI位点的Gibson。通过NdeI使所得Xyt1p载体线性化。引物Y41和Y41R用于扩增来自DeBONO_E29的H0 PGK1pro-杀稻瘟菌素-H0PGK1终止子。将所得扩增子重组到消化的H0TPI1pro-XYL1-RPL15A终止子的NdeI位点。以1.5kv和25uF和200ohm，在0.1cm电转杯中，将载体电穿孔到H0中。在液体YPD中回收电穿孔细胞4小时。最终，用液体YPD将细胞稀释至30％，并将100uL细胞混合物在含有350ug/mL杀稻瘟菌素的YPD琼脂上涂板。在48h后，挑取单个菌落，并在YPD琼脂杀稻瘟菌素培养基上再次划线。根据经验确定选择转基因H0所需的杀稻瘟菌素浓度。
实施例III
工程设计具有提高的木糖吸收的的酿酒酵母(S.cerevisiae)
酿酒酵母(S.cerevisiae)不具有有效利用木糖作为碳源的功能机制。酿酒酵母(S.cerevisiae)具有完全注释的基因组，完整的转录组数据和数百种对于遗传和生物化学调控所发展的工具。将来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖转运蛋白引入酿酒酵母(S.cerevisiae)以提高木糖吸收和从可再生生物质合成生物衍生产物。酿酒酵母(S.cerevisiae)BY4742用作异源过表达来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖转运蛋白的遗传平台。
克隆了编码来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的下列木糖转运蛋白：Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p(具有短N-末端的Gxf1p的变体)、Gxs1p/Hgt12p和Hxt5p的基因，并且对BY4742中的表达进行密码子优化。如图3所示，通过Xyt1p的表达，在48小时中从培养基转运的木糖从BY4742中的约10％提高至表达Xyt1p的BY4742中的约74％。
合成了编码来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf1p、ΔGxf1p、Gxs1p/Hgt12p和Hxt5p的基因，并将其转化至BY4742以用于通过HPLC测试木糖转运。在对于Xyt1p的设计之后，从来源于质粒pUG6的TEF启动子和终止子表达了编码Gxf1p、ΔGxf1p、Gxs1p/Hgt12p和Hxt5p中的每一个的基因。通过诺尔丝菌素选择所有开放阅读框(ORF)。
由于H0 CTG密码子的使用，通过ThermoFisher，作为双链“基因串”合成了对应于H0转运蛋白的所有ORF。通过以上所提供的密码子翻译表翻译了H0转运蛋白的ORF。将所得氨基酸序列转换回DNA。将所得DNA输入ThermoFisher genestrings网络界面。所述网络界面修改了所述核苷酸序列，从而根据需要保持氨基酸，但是核苷酸将改变以实现腺嘌呤-胸腺嘧啶与鸟嘌呤-胞嘧啶之间几乎平衡的比例。合成的XYT1 ORF分别在5'端侧接了与TEF启动子具有同源性和在pUG6上在3'端侧接了与TEF终止子具有同源性的约25bp以有利于Gibson组装。所述ORF是组装到pUG6中的，通过Y10，Y10R引物线性化的，缺失了G418耐受性的ORF的Gibson。使用引物Y15和Y15R，从pZL29扩增H0 ADH1启动子-NAT-H0 PGK1终止子，并将其组装到TEF启动子-XYT1-TEF终止子质粒中。含有XYT1的完整质粒称为DeBONO_E35.3。E35.3用作全部GXF1、ΔGXF1、GXS1/HGT12、HXT5、HGT19的碱基载体克隆。通过Y53和Y53R引物扩增DeBONO_E35.3载体以使所述载体线性化，并且同时去除XYL1，从而产生片段Y53(fY53)。通过Gibson组装，将每个合成的，密码子优化的转运蛋白克隆到fY53。使用引物Y16，Y16R或者Y96i和Y95Ri，通过PCR使表达转运蛋白和NAT耐受性的盒线性化以用于在位点YIL100W和YLR123C向可疑的ORF整合。使用标准酵母菌(Saccharomyces)电穿孔或化学转化方法，将线性化的转运蛋白整合到所述可疑位点中。
通过100ug/mL NAT，在固体YPD培养基中回收转基因酵母。如上所述合成GXF2/GAL2。将GXF2/GAL2克隆到具有一般结构的G418耐受性载体中：CCW12启动子-GXF2/GAL2-H0DIT1终止子。从载体DeBONO_E54扩增启动子-终止子序列。使用引物Y83和Y83R使该载体线性化以获得fY83。GXF2/GAL2基因串是组装到fY83中的Gibson。使用引物Y91i+Y93Ri，通过PCR使转运蛋白盒线性化以用于在位点YLR122C向可疑的ORF的整合。如上所述，转化所述线性化盒，并且通过200ug/mL G418选择GXF2/GAL2转基因。
以下提供了在本实施例中使用的相关引物序列。
实施例IV
野生型和泛素-缺陷型木糖转运蛋白的木糖吸收
通过预测工具‘UbiPred’，检查了本文所述的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种转运蛋白的一级序列的泛素化位点/残基(Tung and Ho,(2008),BMC Bioinformatics,9,310)。将Hxt5p、Hgt19p、Xyt1p、Gxf1p和Gal2p的泛素-缺陷型突变体工程设计以将它们鉴别为泛素化位点的所有胞质面赖氨酸(“K”)残基替代为精氨酸(“R”)。
表：胞质面赖氨酸(“K”)残基(ATG/M是残基No.1)
如木糖修正测定中所示，分别对于Δubq-Hxt5p和Δubq-HGT19p，与天然转运蛋白相比，在18h和64h，用R替代K使木糖吸收加倍和增加4倍(图4A和4B)。当从H0梅奇酵母(Metschnikowia)种Xyt1p和H0梅奇酵母(Metschnikowia)种Gal2p中除去所有泛素化位点并在宿主株BY4742中表达时，所述转运蛋白不再是功能性的。产生无泛素转运蛋白的所回收的转基因酵母生长缓慢，与表达未修饰的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种Xyt1p和Gal2p的酵母相比，其需要加倍的生长时间。无法回收无泛素Gxf1p产生细胞。这些结果表明尽管在Hxt5p和Hgt19p中抑制，但是在Xyt1p、Gxf1p和Gal2p中，对于木糖转运和/或蛋白质稳定需要泛素化位点。
序列表
<110> 创新生物科学公司
<120> 用于提高木糖吸收的表达梅奇酵母木糖转运蛋白的生物和方法
<130> 14305-007-228
<140> TBA
<141> On even date herewith
<150> 62/437,600
<151> 2016-12-21
<160> 59
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 Xyt1p 的序列
<400> 1
Met Gly Tyr Glu Glu Lys Leu Val Ala Pro Ala Leu Lys Phe Lys Asn
1 5 10 15
Phe Leu Asp Lys Thr Pro Asn Ile His Asn Val Tyr Val Ile Ala Ala
20 25 30
Ile Ser Cys Thr Ser Gly Met Met Phe Gly Phe Asp Ile Ser Ser Met
35 40 45
Ser Val Phe Val Asp Gln Gln Pro Tyr Leu Lys Met Phe Asp Asn Pro
50 55 60
Ser Ser Val Ile Gln Gly Phe Ile Thr Ala Ser Met Ser Leu Gly Ser
65 70 75 80
Phe Phe Gly Ser Leu Thr Ser Thr Phe Ile Ser Glu Pro Phe Gly Arg
85 90 95
Arg Ala Ser Leu Phe Ile Cys Gly Ile Leu Trp Val Ile Gly Ala Ala
100 105 110
Val Gln Ser Ser Ser Gln Asn Arg Ala Gln Leu Ile Cys Gly Arg Ile
115 120 125
Ile Ala Gly Trp Gly Ile Gly Phe Gly Ser Ser Val Ala Pro Val Tyr
130 135 140
Gly Ser Glu Met Ala Pro Arg Lys Ile Arg Gly Thr Ile Gly Gly Ile
145 150 155 160
Phe Gln Phe Ser Val Thr Val Gly Ile Phe Ile Met Phe Leu Ile Gly
165 170 175
Tyr Gly Cys Ser Phe Ile Gln Gly Lys Ala Ser Phe Arg Ile Pro Trp
180 185 190
Gly Val Gln Met Val Pro Gly Leu Ile Leu Leu Ile Gly Leu Phe Phe
195 200 205
Ile Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Ala Lys Gln Gly Tyr Trp Glu Asp
210 215 220
Ala Glu Ile Ile Val Ala Asn Val Gln Ala Lys Gly Asn Arg Asn Asp
225 230 235 240
Ala Asn Val Gln Ile Glu Met Ser Glu Ile Lys Asp Gln Leu Met Leu
245 250 255
Asp Glu His Leu Lys Glu Phe Thr Tyr Ala Asp Leu Phe Thr Lys Lys
260 265 270
Tyr Arg Gln Arg Thr Ile Thr Ala Ile Phe Ala Gln Ile Trp Gln Gln
275 280 285
Leu Thr Gly Met Asn Val Met Met Tyr Tyr Ile Val Tyr Ile Phe Gln
290 295 300
Met Ala Gly Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Leu Val Pro Ser Leu Ile Gln
305 310 315 320
Tyr Ile Ile Asn Met Ala Val Thr Val Pro Ala Leu Phe Cys Leu Asp
325 330 335
Leu Leu Gly Arg Arg Thr Ile Leu Leu Ala Gly Ala Ala Phe Met Met
340 345 350
Ala Trp Gln Phe Gly Val Ala Gly Ile Leu Ala Thr Tyr Ser Glu Pro
355 360 365
Ala Tyr Ile Ser Asp Thr Val Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asp His Lys
370 375 380
Ser Ala Ala Lys Gly Val Ile Ala Cys Cys Tyr Leu Phe Val Cys Ser
385 390 395 400
Phe Ala Phe Ser Trp Gly Val Gly Ile Trp Val Tyr Cys Ser Glu Val
405 410 415
Trp Gly Asp Ser Gln Ser Arg Gln Arg Gly Ala Ala Leu Ala Thr Ser
420 425 430
Ala Asn Trp Ile Phe Asn Phe Ala Ile Ala Met Phe Thr Pro Ser Ser
435 440 445
Phe Lys Asn Ile Thr Trp Lys Thr Tyr Ile Ile Tyr Ala Thr Phe Cys
450 455 460
Ala Cys Met Phe Ile His Val Phe Phe Phe Phe Pro Glu Thr Lys Gly
465 470 475 480
Lys Arg Leu Glu Glu Ile Gly Gln Leu Trp Asp Glu Gly Val Pro Ala
485 490 495
Trp Arg Ser Ala Lys Trp Gln Pro Thr Val Pro Leu Ala Ser Asp Ala
500 505 510
Glu Leu Ala His Lys Met Asp Val Ala His Ala Glu His Ala Asp Leu
515 520 525
Leu Ala Thr His Ser Pro Ser Ser Asp Glu Lys Thr Gly Thr Val
530 535 540
<210> 2
<211> 524
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 Gxf1p 的序列
<400> 2
Met Ser Gln Asp Glu Leu His Thr Lys Ser Gly Val Glu Thr Pro Ile
1 5 10 15
Asn Asp Ser Leu Leu Glu Glu Lys His Asp Val Thr Pro Leu Ala Ala
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Leu Pro Glu Lys Ser Phe Lys Asp Tyr Ile Ser Ile Ser Ile Phe Cys
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Leu Phe Val Ala Phe Gly Gly Phe Val Phe Gly Phe Asp Thr Gly Thr
50 55 60
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65 70 75 80
Met Asn Ala Gln Gly Glu Tyr Tyr Leu Ser Asn Val Arg Thr Gly Leu
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Met Val Ser Ile Phe Asn Val Gly Cys Ala Val Gly Gly Ile Phe Leu
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Cys Lys Ile Ala Asp Val Tyr Gly Arg Arg Ile Gly Leu Met Phe Ser
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Met Val Val Tyr Val Val Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ala Ser Thr Thr
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Lys Trp Tyr Gln Tyr Phe Ile Gly Arg Leu Ile Ala Gly Leu Ala Val
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Gly Thr Val Ser Val Ile Ser Pro Leu Phe Ile Ser Glu Val Ala Pro
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195 200 205
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Ala Leu Phe Leu Val Ala Gly Met Leu Asn Met Pro Glu Ser Pro Arg
225 230 235 240
Tyr Leu Val Glu Lys Ser Arg Ile Asp Asp Ala Arg Lys Ser Ile Ala
245 250 255
Arg Ser Asn Lys Val Ser Glu Glu Asp Pro Ala Val Tyr Thr Glu Val
260 265 270
Gln Leu Ile Gln Ala Gly Ile Asp Arg Glu Ala Leu Ala Gly Ser Ala
275 280 285
Thr Trp Met Glu Leu Val Thr Gly Lys Pro Lys Ile Phe Arg Arg Val
290 295 300
Ile Met Gly Val Met Leu Gln Ser Leu Gln Gln Leu Thr Gly Asp Asn
305 310 315 320
Tyr Phe Phe Tyr Tyr Gly Thr Thr Ile Phe Lys Ala Val Gly Leu Gln
325 330 335
Asp Ser Phe Gln Thr Ser Ile Ile Leu Gly Ile Val Asn Phe Ala Ser
340 345 350
Thr Phe Val Gly Ile Tyr Ala Ile Glu Arg Met Gly Arg Arg Leu Cys
355 360 365
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370 375 380
Leu Ile Gly Thr Gln His Leu Tyr Lys Asn Gly Phe Ser Asn Glu Pro
385 390 395 400
Ser Asn Thr Tyr Lys Pro Ser Gly Asn Ala Met Ile Phe Ile Thr Cys
405 410 415
Leu Tyr Ile Phe Phe Phe Ala Ser Thr Trp Ala Gly Gly Val Tyr Cys
420 425 430
Ile Val Ser Glu Ser Tyr Pro Leu Arg Ile Arg Ser Lys Ala Met Ser
435 440 445
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450 455 460
Thr Pro Phe Ile Thr Ser Ala Ile His Phe Tyr Tyr Gly Phe Val Phe
465 470 475 480
Thr Gly Cys Leu Ala Phe Ser Phe Phe Tyr Val Tyr Phe Phe Val Val
485 490 495
Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu Glu Glu Val Asp Ile Leu Tyr Ala Ser
500 505 510
Gly Thr Leu Pro Trp Lys Ser Ser Gly Trp Val Pro
515 520
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<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 delta-Gxf1p 的序列 （具有较短N-末端的Gxf1p的变体）
<400> 3
Met Ser Asp Phe Lys Thr Arg Phe Gly Glu Met Asn Ala Gln Gly Glu
1 5 10 15
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20 25 30
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50 55 60
Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ala Ser Thr Thr Lys Trp Tyr Gln Tyr Phe
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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225 230 235 240
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450
<210> 4
<211> 548
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 Gxf2p/Gal2p 的序列
<400> 4
Met Ser Ala Glu Gln Glu Gln Gln Val Ser Gly Thr Ser Ala Thr Ile
1 5 10 15
Asp Gly Leu Ala Ser Leu Lys Gln Glu Lys Thr Ala Glu Glu Glu Asp
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355 360 365
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435 440 445
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545
<210> 5
<211> 502
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 delta-Gxs1p/Delta-Hgt12p 的序列（具有较短N-末端的Gxs1p/Hgt12p的变体）
<400> 5
Met Gly Ile Phe Val Gly Val Phe Ala Ala Leu Gly Gly Val Leu Phe
1 5 10 15
Gly Tyr Asp Thr Gly Thr Ile Ser Gly Val Met Ala Met Pro Trp Val
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245 250 255
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260 265 270
Val Asn Phe Ile Phe Tyr Phe Gly Thr Thr Phe Phe Asn Ser Val Gly
275 280 285
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290 295 300
Ser Thr Ile Pro Gly Ile Leu Gly Val Glu Ile Phe Gly Arg Arg Lys
305 310 315 320
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000
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<211> 526
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 Gxs1p/Hgt12 的序列
<400> 7
Met Gly Leu Glu Ser Asn Lys Leu Ile Arg Lys Tyr Ile Asn Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Arg Ala Gly Ser Ser Gly Met Gly Ile Phe Val Gly Val Phe
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115 120 125
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Ile Pro Leu Tyr Gln Ser Glu Ala Leu Pro Lys Trp Ile Arg Gly Ala
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165 170 175
Ala Val Ile Asn Gln Gly Thr His Lys Ile Asn Ser Pro Ala Ser Tyr
180 185 190
Arg Ile Pro Leu Gly Ile Gln Met Ala Trp Gly Leu Ile Leu Gly Val
195 200 205
Gly Met Phe Phe Leu Pro Glu Thr Pro Arg Phe Tyr Ile Ser Lys Gly
210 215 220
Gln Asn Ala Lys Ala Ala Val Ser Leu Ala Arg Leu Arg Lys Leu Pro
225 230 235 240
Gln Asp His Pro Glu Leu Leu Glu Glu Leu Glu Asp Ile Gln Ala Ala
245 250 255
Tyr Glu Phe Glu Thr Val His Gly Lys Ser Ser Trp Ser Gln Val Phe
260 265 270
Thr Asn Lys Asn Lys Gln Leu Lys Lys Leu Ala Thr Gly Val Cys Leu
275 280 285
Gln Ala Phe Gln Gln Leu Thr Gly Val Asn Phe Ile Phe Tyr Phe Gly
290 295 300
Thr Thr Phe Phe Asn Ser Val Gly Leu Asp Gly Phe Thr Thr Ser Leu
305 310 315 320
Ala Thr Asn Ile Val Asn Val Gly Ser Thr Ile Pro Gly Ile Leu Gly
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340 345 350
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355 360 365
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Asn Leu Lys Ala Glu Ala Ile Ser Val Glu Asp Ala Ser Val
515 520 525
<210> 8
<211> 548
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 Hxt5p 的序列
<400> 8
Met Ser Ile Phe Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gly Val Ser Ser Thr Glu
1 5 10 15
Ser Leu Ser Asn Asp Val Arg Tyr Asp Asn Met Glu Lys Val Asp Gln
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100 105 110
Leu Asn Leu Thr Glu Arg Glu Ala Ser Leu Val Ser Ser Leu Met Pro
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145 150 155 160
Gly Ser Ala Leu Cys Ala Gly Ala Arg Asp His His Met Met Tyr Ala
165 170 175
Gly Arg Phe Ile Leu Gly Val Gly Val Gly Ile Glu Gly Gly Cys Val
180 185 190
Gly Ile Tyr Ile Ser Glu Ser Val Pro Ala Asn Val Arg Gly Ser Ile
195 200 205
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225 230 235 240
Val Gly Ser Ser Leu Val Phe Ser Thr Ile Leu Phe Ala Gly Leu Phe
245 250 255
Phe Leu Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Val His Lys Gly Arg Asn Gly
260 265 270
Met Ala Tyr Asp Val Trp Lys Arg Leu Arg Asp Ile Asn Asp Glu Ser
275 280 285
Ala Lys Leu Glu Phe Leu Glu Met Arg Gln Ala Ala Tyr Gln Glu Arg
290 295 300
Glu Arg Arg Ser Gln Glu Ser Leu Phe Ser Ser Trp Gly Glu Leu Phe
305 310 315 320
Thr Ile Ala Arg Asn Arg Arg Ala Leu Thr Tyr Ser Val Ile Met Ile
325 330 335
Thr Leu Gly Gln Leu Thr Gly Val Asn Ala Val Met Tyr Tyr Met Ser
340 345 350
Thr Leu Met Gly Ala Ile Gly Phe Asn Glu Lys Asp Ser Val Phe Met
355 360 365
Ser Leu Val Gly Gly Gly Ser Leu Leu Ile Gly Thr Ile Pro Ala Ile
370 375 380
Leu Trp Met Asp Arg Phe Gly Arg Arg Val Trp Gly Tyr Asn Leu Val
385 390 395 400
Gly Phe Phe Val Gly Leu Val Leu Val Gly Val Gly Tyr Arg Phe Asn
405 410 415
Pro Val Thr Gln Lys Ala Ala Ser Glu Gly Val Tyr Leu Thr Gly Leu
420 425 430
Ile Val Tyr Phe Leu Phe Phe Gly Ser Tyr Ser Thr Leu Thr Trp Val
435 440 445
Ile Pro Ser Glu Ser Phe Asp Leu Arg Thr Arg Ser Leu Gly Met Thr
450 455 460
Ile Cys Ser Thr Phe Leu Tyr Leu Trp Ser Phe Thr Val Thr Tyr Asn
465 470 475 480
Phe Thr Lys Met Ser Ala Ala Phe Thr Tyr Thr Gly Leu Thr Leu Gly
485 490 495
Phe Tyr Gly Gly Ile Ala Phe Leu Gly Leu Ile Tyr Gln Val Cys Phe
500 505 510
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515 520 525
Asn Arg Ser Ala Phe Ser Ile Ala Arg Glu Asn Ile Ser Asn Leu Lys
530 535 540
Lys Gly Ile Trp
545
<210> 9
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有S75L突变的 H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 Xyt1p 的序列
<400> 9
Met Gly Tyr Glu Glu Lys Leu Val Ala Pro Ala Leu Lys Phe Lys Asn
1 5 10 15
Phe Leu Asp Lys Thr Pro Asn Ile His Asn Val Tyr Val Ile Ala Ala
20 25 30
Ile Ser Cys Thr Ser Gly Met Met Phe Gly Phe Asp Ile Ser Ser Met
35 40 45
Ser Val Phe Val Asp Gln Gln Pro Tyr Leu Lys Met Phe Asp Asn Pro
50 55 60
Ser Ser Val Ile Gln Gly Phe Ile Thr Ala Leu Met Ser Leu Gly Ser
65 70 75 80
Phe Phe Gly Ser Leu Thr Ser Thr Phe Ile Ser Glu Pro Phe Gly Arg
85 90 95
Arg Ala Ser Leu Phe Ile Cys Gly Ile Leu Trp Val Ile Gly Ala Ala
100 105 110
Val Gln Ser Ser Ser Gln Asn Arg Ala Gln Leu Ile Cys Gly Arg Ile
115 120 125
Ile Ala Gly Trp Gly Ile Gly Phe Gly Ser Ser Val Ala Pro Val Tyr
130 135 140
Gly Ser Glu Met Ala Pro Arg Lys Ile Arg Gly Thr Ile Gly Gly Ile
145 150 155 160
Phe Gln Phe Ser Val Thr Val Gly Ile Phe Ile Met Phe Leu Ile Gly
165 170 175
Tyr Gly Cys Ser Phe Ile Gln Gly Lys Ala Ser Phe Arg Ile Pro Trp
180 185 190
Gly Val Gln Met Val Pro Gly Leu Ile Leu Leu Ile Gly Leu Phe Phe
195 200 205
Ile Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Ala Lys Gln Gly Tyr Trp Glu Asp
210 215 220
Ala Glu Ile Ile Val Ala Asn Val Gln Ala Lys Gly Asn Arg Asn Asp
225 230 235 240
Ala Asn Val Gln Ile Glu Met Ser Glu Ile Lys Asp Gln Leu Met Leu
245 250 255
Asp Glu His Leu Lys Glu Phe Thr Tyr Ala Asp Leu Phe Thr Lys Lys
260 265 270
Tyr Arg Gln Arg Thr Ile Thr Ala Ile Phe Ala Gln Ile Trp Gln Gln
275 280 285
Leu Thr Gly Met Asn Val Met Met Tyr Tyr Ile Val Tyr Ile Phe Gln
290 295 300
Met Ala Gly Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Leu Val Pro Ser Leu Ile Gln
305 310 315 320
Tyr Ile Ile Asn Met Ala Val Thr Val Pro Ala Leu Phe Cys Leu Asp
325 330 335
Leu Leu Gly Arg Arg Thr Ile Leu Leu Ala Gly Ala Ala Phe Met Met
340 345 350
Ala Trp Gln Phe Gly Val Ala Gly Ile Leu Ala Thr Tyr Ser Glu Pro
355 360 365
Ala Tyr Ile Ser Asp Thr Val Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asp His Lys
370 375 380
Ser Ala Ala Lys Gly Val Ile Ala Cys Cys Tyr Leu Phe Val Cys Ser
385 390 395 400
Phe Ala Phe Ser Trp Gly Val Gly Ile Trp Val Tyr Cys Ser Glu Val
405 410 415
Trp Gly Asp Ser Gln Ser Arg Gln Arg Gly Ala Ala Leu Ala Thr Ser
420 425 430
Ala Asn Trp Ile Phe Asn Phe Ala Ile Ala Met Phe Thr Pro Ser Ser
435 440 445
Phe Lys Asn Ile Thr Trp Lys Thr Tyr Ile Ile Tyr Ala Thr Phe Cys
450 455 460
Ala Cys Met Phe Ile His Val Phe Phe Phe Phe Pro Glu Thr Lys Gly
465 470 475 480
Lys Arg Leu Glu Glu Ile Gly Gln Leu Trp Asp Glu Gly Val Pro Ala
485 490 495
Trp Arg Ser Ala Lys Trp Gln Pro Thr Val Pro Leu Ala Ser Asp Ala
500 505 510
Glu Leu Ala His Lys Met Asp Val Ala His Ala Glu His Ala Asp Leu
515 520 525
Leu Ala Thr His Ser Pro Ser Ser Asp Glu Lys Thr Gly Thr Val
530 535 540
<210> 10
<211> 524
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 Hxt2.6p 的序列
<400> 10
Met Ser Ser Thr Thr Asp Thr Leu Glu Lys Arg Asp Thr Glu Pro Phe
1 5 10 15
Thr Ser Asp Ala Pro Val Thr Val His Asp Tyr Ile Ala Glu Glu Arg
20 25 30
Pro Trp Trp Lys Val Pro His Leu Arg Val Leu Thr Trp Ser Val Phe
35 40 45
Val Ile Thr Leu Thr Ser Thr Asn Asn Gly Tyr Asp Gly Ser Met Leu
50 55 60
Asn Gly Leu Gln Ser Leu Asp Ile Trp Gln Glu Asp Leu Gly His Pro
65 70 75 80
Ala Gly Gln Lys Leu Gly Ala Leu Ala Asn Gly Val Leu Phe Gly Asn
85 90 95
Leu Ala Ala Val Pro Phe Ala Ser Tyr Phe Cys Asp Arg Phe Gly Arg
100 105 110
Arg Pro Val Ile Cys Phe Gly Gln Ile Leu Thr Ile Val Gly Ala Val
115 120 125
Leu Gln Gly Leu Ser Asn Ser Tyr Gly Phe Phe Leu Gly Ser Arg Ile
130 135 140
Val Leu Gly Phe Gly Ala Met Ile Ala Thr Ile Pro Ser Pro Thr Leu
145 150 155 160
Ile Ser Glu Ile Ala Tyr Pro Thr His Arg Glu Thr Ser Thr Phe Ala
165 170 175
Tyr Asn Val Cys Trp Tyr Leu Gly Ala Ile Ile Ala Ser Trp Val Thr
180 185 190
Tyr Gly Thr Arg Asp Leu Gln Ser Lys Ala Cys Trp Ser Ile Pro Ser
195 200 205
Tyr Leu Gln Ala Ala Leu Pro Phe Phe Gln Val Cys Met Ile Trp Phe
210 215 220
Val Pro Glu Ser Pro Arg Phe Leu Val Ala Lys Gly Lys Ile Asp Gln
225 230 235 240
Ala Arg Ala Val Leu Ser Lys Tyr His Thr Gly Asp Ser Thr Asp Pro
245 250 255
Arg Asp Val Ala Leu Val Asp Phe Glu Leu His Glu Ile Glu Ser Ala
260 265 270
Leu Glu Gln Glu Lys Leu Asn Thr Arg Ser Ser Tyr Phe Asp Phe Phe
275 280 285
Lys Lys Arg Asn Phe Arg Lys Arg Gly Phe Leu Cys Val Met Val Gly
290 295 300
Val Ala Met Gln Leu Ser Gly Asn Gly Leu Val Ser Tyr Tyr Leu Ser
305 310 315 320
Lys Val Leu Asp Ser Ile Gly Ile Thr Glu Thr Lys Arg Gln Leu Glu
325 330 335
Ile Asn Gly Cys Leu Met Ile Tyr Asn Phe Val Ile Cys Val Ser Leu
340 345 350
Met Ser Val Cys Arg Met Phe Lys Arg Arg Val Leu Phe Leu Thr Cys
355 360 365
Phe Ser Gly Met Thr Val Cys Tyr Thr Ile Trp Thr Ile Leu Ser Ala
370 375 380
Leu Asn Glu Gln Arg His Phe Glu Asp Lys Gly Leu Ala Asn Gly Val
385 390 395 400
Leu Ala Met Ile Phe Phe Tyr Tyr Phe Phe Tyr Asn Val Gly Ile Asn
405 410 415
Gly Leu Pro Phe Leu Tyr Ile Thr Glu Ile Leu Pro Tyr Ser His Arg
420 425 430
Ala Lys Gly Leu Asn Leu Phe Gln Phe Ser Gln Phe Leu Thr Gln Ile
435 440 445
Tyr Asn Gly Tyr Val Asn Pro Ile Ala Met Asp Ala Ile Ser Trp Lys
450 455 460
Tyr Tyr Ile Val Tyr Cys Cys Ile Leu Phe Val Glu Leu Val Ile Val
465 470 475 480
Phe Phe Thr Phe Pro Glu Thr Ser Gly Tyr Thr Leu Glu Glu Val Ala
485 490 495
Gln Val Phe Gly Asp Glu Ala Pro Gly Leu His Asn Arg Gln Leu Asp
500 505 510
Val Ala Lys Glu Ser Leu Glu His Val Glu His Val
515 520
<210> 11
<211> 556
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 Qup2p 的序列
<400> 11
Met Gly Phe Arg Asn Leu Lys Arg Arg Leu Ser Asn Val Gly Asp Ser
1 5 10 15
Met Ser Val His Ser Val Lys Glu Glu Glu Asp Phe Ser Arg Val Glu
20 25 30
Ile Pro Asp Glu Ile Tyr Asn Tyr Lys Ile Val Leu Val Ala Leu Thr
35 40 45
Ala Ala Ser Ala Ala Ile Ile Ile Gly Tyr Asp Ala Gly Phe Ile Gly
50 55 60
Gly Thr Val Ser Leu Thr Ala Phe Lys Ser Glu Phe Gly Leu Asp Lys
65 70 75 80
Met Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ala Ile Glu Ala Asn Val Val Ser Val
85 90 95
Phe Gln Ala Gly Ala Tyr Phe Gly Cys Leu Phe Phe Tyr Pro Ile Gly
100 105 110
Glu Ile Trp Gly Arg Lys Ile Gly Leu Leu Leu Ser Gly Phe Leu Leu
115 120 125
Thr Phe Gly Ala Ala Ile Ser Leu Ile Ser Asn Ser Ser Arg Gly Leu
130 135 140
Gly Ala Ile Tyr Ala Gly Arg Val Leu Thr Gly Leu Gly Ile Gly Gly
145 150 155 160
Cys Ser Ser Leu Ala Pro Ile Tyr Val Ser Glu Ile Ala Pro Ala Ala
165 170 175
Ile Arg Gly Lys Leu Val Gly Cys Trp Glu Val Ser Trp Gln Val Gly
180 185 190
Gly Ile Val Gly Tyr Trp Ile Asn Tyr Gly Val Leu Gln Thr Leu Pro
195 200 205
Ile Ser Ser Gln Gln Trp Ile Ile Pro Phe Ala Val Gln Leu Ile Pro
210 215 220
Ser Gly Leu Phe Trp Gly Leu Cys Leu Leu Ile Pro Glu Ser Pro Arg
225 230 235 240
Phe Leu Val Ser Lys Gly Lys Ile Asp Lys Ala Arg Lys Asn Leu Ala
245 250 255
Tyr Leu Arg Gly Leu Ser Glu Asp His Pro Tyr Ser Val Phe Glu Leu
260 265 270
Glu Asn Ile Ser Lys Ala Ile Glu Glu Asn Phe Glu Gln Thr Gly Arg
275 280 285
Gly Phe Phe Asp Pro Leu Lys Ala Leu Phe Phe Ser Lys Lys Met Leu
290 295 300
Tyr Arg Leu Leu Leu Ser Thr Ser Met Phe Met Met Gln Asn Gly Tyr
305 310 315 320
Gly Ile Asn Ala Val Thr Tyr Tyr Ser Pro Thr Ile Phe Lys Ser Leu
325 330 335
Gly Val Gln Gly Ser Asn Ala Gly Leu Leu Ser Thr Gly Ile Phe Gly
340 345 350
Leu Leu Lys Gly Ala Ala Ser Val Phe Trp Val Phe Phe Leu Val Asp
355 360 365
Thr Phe Gly Arg Arg Phe Cys Leu Cys Tyr Leu Ser Leu Pro Cys Ser
370 375 380
Ile Cys Met Trp Tyr Ile Gly Ala Tyr Ile Lys Ile Ala Asn Pro Ser
385 390 395 400
Ala Lys Leu Ala Ala Gly Asp Thr Ala Thr Thr Pro Ala Gly Thr Ala
405 410 415
Ala Lys Ala Met Leu Tyr Ile Trp Thr Ile Phe Tyr Gly Ile Thr Trp
420 425 430
Asn Gly Thr Thr Trp Val Ile Cys Ala Glu Ile Phe Pro Gln Ser Val
435 440 445
Arg Thr Ala Ala Gln Ala Val Asn Ala Ser Ser Asn Trp Phe Trp Ala
450 455 460
Phe Met Ile Gly His Phe Thr Gly Gln Ala Leu Glu Asn Ile Gly Tyr
465 470 475 480
Gly Tyr Tyr Phe Leu Phe Ala Ala Cys Ser Ala Ile Phe Pro Val Val
485 490 495
Val Trp Phe Val Tyr Pro Glu Thr Lys Gly Val Pro Leu Glu Ala Val
500 505 510
Glu Tyr Leu Phe Glu Val Arg Pro Trp Lys Ala His Ser Tyr Ala Leu
515 520 525
Glu Lys Tyr Gln Ile Glu Tyr Asn Glu Gly Glu Phe His Gln His Lys
530 535 540
Pro Glu Val Leu Leu Gln Gly Ser Glu Asn Ser Asp
545 550 555
<210> 12
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 Aps1p/Hgt19p 的序列
<400> 12
Met Gly Tyr Glu Glu Lys Leu Val Ala Pro Ala Leu Lys Phe Lys Asn
1 5 10 15
Phe Leu Asp Lys Thr Pro Asn Ile His Asn Val Tyr Val Ile Ala Ala
20 25 30
Ile Ser Cys Thr Ser Gly Met Met Phe Gly Phe Asp Ile Ser Ser Met
35 40 45
Ser Val Phe Val Asp Gln Gln Pro Tyr Leu Lys Met Phe Asp Asn Pro
50 55 60
Ser Ser Val Ile Gln Gly Phe Ile Thr Ala Ser Met Ser Leu Gly Ser
65 70 75 80
Phe Phe Gly Ser Leu Thr Ser Thr Phe Ile Ser Glu Pro Phe Gly Arg
85 90 95
Arg Ala Ser Leu Phe Ile Cys Gly Ile Leu Trp Val Ile Gly Ala Ala
100 105 110
Val Gln Ser Ser Ser Gln Asn Arg Ala Gln Leu Ile Cys Gly Arg Ile
115 120 125
Ile Ala Gly Trp Gly Ile Gly Phe Gly Ser Ser Val Ala Pro Val Tyr
130 135 140
Gly Ser Glu Met Ala Pro Arg Lys Ile Arg Gly Thr Ile Gly Gly Ile
145 150 155 160
Phe Gln Phe Ser Val Thr Val Gly Ile Phe Ile Met Phe Leu Ile Gly
165 170 175
Tyr Gly Cys Ser Phe Ile Gln Gly Lys Ala Ser Phe Arg Ile Pro Trp
180 185 190
Gly Val Gln Met Val Pro Gly Leu Ile Leu Leu Ile Gly Leu Phe Phe
195 200 205
Ile Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Ala Lys Gln Gly Tyr Trp Glu Asp
210 215 220
Ala Glu Ile Ile Val Ala Asn Val Gln Ala Lys Gly Asn Arg Asn Asp
225 230 235 240
Ala Asn Val Gln Ile Glu Met Ser Glu Ile Lys Asp Gln Leu Met Leu
245 250 255
Asp Glu His Leu Lys Glu Phe Thr Tyr Ala Asp Leu Phe Thr Lys Lys
260 265 270
Tyr Arg Gln Arg Thr Ile Thr Ala Ile Phe Ala Gln Ile Trp Gln Gln
275 280 285
Leu Thr Gly Met Asn Val Met Met Tyr Tyr Ile Val Tyr Ile Phe Gln
290 295 300
Met Ala Gly Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Leu Val Pro Ser Leu Ile Gln
305 310 315 320
Tyr Ile Ile Asn Met Ala Val Thr Val Pro Ala Leu Phe Cys Leu Asp
325 330 335
Leu Leu Gly Arg Arg Thr Ile Leu Leu Ala Gly Ala Ala Phe Met Met
340 345 350
Ala Trp Gln Phe Gly Val Ala Gly Ile Leu Ala Thr Tyr Ser Glu Pro
355 360 365
Ala Tyr Ile Ser Asp Thr Val Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asp His Lys
370 375 380
Ser Ala Ala Lys Gly Val Ile Ala Cys Cys Tyr Leu Phe Val Cys Ser
385 390 395 400
Phe Ala Phe Ser Trp Gly Val Gly Ile Trp Val Tyr Cys Ser Glu Val
405 410 415
Trp Gly Asp Ser Gln Ser Arg Gln Arg Gly Ala Ala Leu Ala Thr Ser
420 425 430
Ala Asn Trp Ile Phe Asn Phe Ala Ile Ala Met Phe Thr Pro Ser Ser
435 440 445
Phe Lys Asn Ile Thr Trp Lys Thr Tyr Ile Ile Tyr Ala Thr Phe Cys
450 455 460
Ala Cys Met Phe Ile His Val Phe Phe Phe Phe Pro Glu Thr Lys Gly
465 470 475 480
Lys Arg Leu Glu Glu Ile Gly Gln Leu Trp Asp Glu Gly Val Pro Ala
485 490 495
Trp Arg Ser Ala Lys Trp Gln Pro Thr Val Pro Leu Ala Ser Asp Ala
500 505 510
Glu Leu Ala His Lys Met Asp Val Ala His Ala Glu His Ala Asp Leu
515 520 525
Leu Ala Thr His Ser Pro Ser Ser Asp Glu Lys Thr Gly Thr Val
530 535 540
<210> 13
<211> 1632
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 XYT1 的序列
<400> 13
atgggttacg aggaaaagct tgtagcgccc gcgttgaaat tcaaaaactt tcttgacaaa 60
acccccaata ttcacaatgt ctatgtcatt gccgccatct cctgtacatc aggtatgatg 120
tttggatttg atatctcgtc gatgtctgtc tttgtcgacc agcagccata cttgaagatg 180
tttgacaacc ctagttccgt gattcaaggt ttcattaccg cgctgatgag tttgggctcg 240
tttttcggct cgctcacatc cacgttcatc tctgagcctt ttggtcgtcg tgcatcgttg 300
ttcatttgtg gtattctttg ggtaattgga gcagcggttc aaagttcgtc gcagaacagg 360
gcccaattga tttgtgggcg tatcattgca ggatggggca ttggctttgg gtcatcggtg 420
gctcctgttt acgggtccga gatggctccg agaaagatca gaggcacgat tggtggaatc 480
ttccagttct ccgtcaccgt gggtatcttt atcatgttct tgattgggta cggatgctct 540
ttcattcaag gaaaggcctc tttccggatc ccctggggtg tgcaaatggt tcccggcctt 600
atcctcttga ttggactttt ctttattcct gaatctcccc gttggttggc caaacagggc 660
tactgggaag acgccgaaat cattgtggcc aatgtgcagg ccaagggtaa ccgtaacgac 720
gccaacgtgc agattgaaat gtcggagatt aaggatcaat tgatgcttga cgagcacttg 780
aaggagttta cgtacgctga ccttttcacg aagaagtacc gccagcgcac gatcacggcg 840
atctttgccc agatctggca acagttgacc ggtatgaatg tgatgatgta ctacattgtg 900
tacattttcc agatggcagg ctacagcggc aacacgaact tggtgcccag tttgatccag 960
tacatcatca acatggcggt cacggtgccg gcgcttttct gcttggatct cttgggccgt 1020
cgtaccattt tgctcgcggg tgccgcgttc atgatggcgt ggcaattcgg cgtggcgggc 1080
attttggcca cttactcaga accggcatat atctctgaca ctgtgcgtat cacgatcccc 1140
gacgaccaca agtctgctgc aaaaggtgtg attgcatgct gctatttgtt tgtgtgctcg 1200
tttgcattct cgtggggtgt cggtatttgg gtgtactgtt ccgaggtttg gggtgactcc 1260
cagtcgagac aaagaggcgc cgctcttgcg acgtcggcca actggatctt caacttcgcc 1320
attgccatgt tcacgccgtc ctcattcaag aatatcacgt ggaagacgta tatcatctac 1380
gccacgttct gtgcgtgcat gttcatacac gtgtttttct ttttcccaga aacaaagggc 1440
aagcgtttgg aggagatagg ccagctttgg gacgaaggag tcccagcatg gaggtcagcc 1500
aagtggcagc caacagtgcc gctcgcgtcc gacgcagagc ttgcacacaa gatggatgtt 1560
gcgcacgcgg agcacgcgga cttattggcc acgcactcgc catcttcaga cgagaagacg 1620
ggcacggtct aa 1632
<210> 14
<211> 1635
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 GXF1 的序列
<400> 14
atgtctcaag acgaacttca tacaaagtct ggtgttgaaa caccaatcaa cgattcgctt 60
ctcgaggaga agcacgatgt caccccactc gcggcattgc ccgagaagtc cttcaaggac 120
tacatttcca tttccatttt ctgtttgttt gtggcatttg gtggttttgt tttcggtttc 180
gacaccggta cgatttccgg tttcgtcaac atgtccgact tcaagaccag atttggtgag 240
atgaatgccc agggcgaata ctacttgtcc aatgttagaa ctggtttgat ggtttctatt 300
ttcaacgtcg gttgcgccgt tggtggtatc ttcctttgta agattgccga tgtttatggc 360
agaagaattg gtcttatgtt ttccatggtg gtttatgtcg ttggtatcat tattcagatt 420
gcctccacca ccaaatggta ccaatacttc attggccgtc ttattgctgg cttggctgtg 480
ggtactgttt ccgtcatctc gccacttttc atttccgagg ttgctcctaa acagctcaga 540
ggtacgcttg tgtgctgctt ccagttgtgt atcaccttgg gtatcttttt gggttactgc 600
acgacctacg gtacaaagac ttacactgac tccagacagt ggagaatccc attgggtatc 660
tgtttcgcgt gggctttgtt tttggtggcc ggtatgttga acatgcccga gtctcctaga 720
tacttggttg agaaatcgag aatcgacgat gccagaaagt ccattgccag atccaacaag 780
gtttccgagg aagaccccgc cgtgtacacc gaggtgcagc ttatccaggc tggtattgac 840
agagaggccc ttgccggcag cgccacatgg atggagcttg tgactggtaa gcccaaaatc 900
ttcagaagag tcatcatggg tgtcatgctt cagtccttgc aacaattgac tggtgacaac 960
tactttttct actacggaac cacgattttc aaggctgttg gcttgcagga ctctttccag 1020
acgtcgatta tcttgggtat tgtcaacttt gcctcgactt ttgtcggtat ttacgccatt 1080
gagagaatgg gcagaagatt gtgtttgttg accggatctg cgtgcatgtt tgtgtgtttc 1140
atcatctact cgctcattgg tacgcagcac ttgtacaaga acggcttctc taacgaacct 1200
tccaacacat acaagccttc cggtaacgcc atgatcttca tcacgtgtct ttacattttc 1260
ttctttgcct cgacctgggc cggtggtgtt tactgtatcg tgtccgagtc ttacccattg 1320
agaatcagat ccaaggccat gtctgtcgcc accgccgcca actggatgtg gggtttcttg 1380
atctcgttct tcacgccttt catcacctcc gccatccact tttactacgg ttttgttttc 1440
actggctgct tggcgttctc cttcttctac gtctacttct ttgtcgtgga gaccaagggt 1500
ctttccttgg aggaggttga cattttgtac gcttccggta cgcttccatg gaagtcctct 1560
ggctgggtgc ctcctaccgc ggacgaaatg gcccacaacg ccttcgacaa caagccaact 1620
gacgaacaag tctaa 1635
<210> 15
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 delta-GXF1 的序列 （具有较短N-末端的GXF1的变体）
<400> 15
atgtccgact tcaagaccag atttggtgag atgaatgccc agggcgaata ctacttgtcc 60
aatgttagaa ctggtttgat ggtttctatt ttcaacgtcg gttgcgccgt tggtggtatc 120
ttcctttgta agattgccga tgtttatggc agaagaattg gtcttatgtt ttccatggtg 180
gtttatgtcg ttggtatcat tattcagatt gcctccacca ccaaatggta ccaatacttc 240
attggccgtc ttattgctgg cttggctgtg ggtactgttt ccgtcatctc gccacttttc 300
atttccgagg ttgctcctaa acagctcaga ggtacgcttg tgtgctgctt ccagttgtgt 360
atcaccttgg gtatcttttt gggttactgc acgacctacg gtacaaagac ttacactgac 420
tccagacagt ggagaatccc attgggtatc tgtttcgcgt gggctttgtt tttggtggcc 480
ggtatgttga acatgcccga gtctcctaga tacttggttg agaaatcgag aatcgacgat 540
gccagaaagt ccattgccag atccaacaag gtttccgagg aagaccccgc cgtgtacacc 600
gaggtgcagc ttatccaggc tggtattgac agagaggccc ttgccggcag cgccacatgg 660
atggagcttg tgactggtaa gcccaaaatc ttcagaagag tcatcatggg tgtcatgctt 720
cagtccttgc aacaattgac tggtgacaac tactttttct actacggaac cacgattttc 780
aaggctgttg gcttgcagga ctctttccag acgtcgatta tcttgggtat tgtcaacttt 840
gcctcgactt ttgtcggtat ttacgccatt gagagaatgg gcagaagatt gtgtttgttg 900
accggatctg cgtgcatgtt tgtgtgtttc atcatctact cgctcattgg tacgcagcac 960
ttgtacaaga acggcttctc taacgaacct tccaacacat acaagccttc cggtaacgcc 1020
atgatcttca tcacgtgtct ttacattttc ttctttgcct cgacctgggc cggtggtgtt 1080
tactgtatcg tgtccgagtc ttacccattg agaatcagat ccaaggccat gtctgtcgcc 1140
accgccgcca actggatgtg gggtttcttg atctcgttct tcacgccttt catcacctcc 1200
gccatccact tttactacgg ttttgttttc actggctgct tggcgttctc cttcttctac 1260
gtctacttct ttgtcgtgga gaccaagggt ctttccttgg aggaggttga cattttgtac 1320
gcttccggta cgcttccatg gaagtcctct ggctgggtgc ctcctaccgc ggacgaaatg 1380
gcccacaacg ccttcgacaa caagccaact gacgaacaag tctaa 1425
<210> 16
<211> 1647
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 GXF2/GAL2 的序列
<400> 16
atgagtgccg aacaggaaca acaagtatcg ggcacatctg ccacgataga tgggctggcg 60
tccttgaagc aagaaaaaac cgccgaggag gaagacgcct tcaagcctaa gcccgccacg 120
gcgtactttt tcatttcgtt cctctgtggc ttggtcgcct ttggcggcta cgttttcggt 180
ttcgataccg gtacgatttc cgggtttgtt aacatggacg actatttgat gagattcggc 240
cagcagcacg ctgatggcac gtattacctt tccaacgtga gaaccggttt gatcgtgtcg 300
atcttcaaca ttggctgtgc cgttggtggt cttgcgcttt cgaaagtcgg tgacatttgg 360
ggcagaagaa ttggtattat ggttgctatg atcatctaca tggtgggaat catcatccag 420
atcgcttcac aggataaatg gtaccagtac ttcattggcc gtttgatcac cggattgggt 480
gtcggcacca cgtccgtgct tagtcctctt ttcatctccg agtcggctcc gaagcatttg 540
agaggcaccc ttgtgtgttg tttccagctc atggtcacct tgggtatctt tttgggctac 600
tgcacgacct acggtaccaa gaactacact gactcgcgcc agtggcggat tcccttgggt 660
ctttgcttcg catgggctct tttgttgatc tcgggaatgg ttttcatgcc tgaatcccca 720
cgtttcttga ttgagcgcca gagattcgac gaggccaagg cttccgtggc caaatcgaac 780
caggtttcga ccgaggaccc cgccgtgtac actgaagtcg agttgatcca ggccggtatt 840
gaccgtgagg cattggccgg atccgctggc tggaaagagc ttatcacggg taagcccaag 900
atgttgcagc gtgtgatttt gggaatgatg ctccagtcga tccagcagct taccggtaac 960
aactactttt tctactatgg taccacgatc ttcaaggccg tgggcatgtc ggactcgttc 1020
cagacctcga ttgttttggg tattgtcaac ttcgcctcca cttttgtcgg aatctgggcc 1080
atcgaacgca tgggccgcag atcttgtttg cttgttggtt ccgcgtgcat gagtgtgtgt 1140
ttcttgatct actccatctt gggttccgtc aacctttaca tcgacggcta cgagaacacg 1200
ccttccaaca cgcgtaagcc taccggtaac gccatgattt tcatcacgtg tttgttcatc 1260
ttcttcttcg cctccacctg ggccggtggt gtgtacagta ttgtgtctga aacataccca 1320
ttgagaatcc gctctaaagg tatggccgtg gccaccgctg ccaactggat gtggggtttc 1380
ttgatttcgt tcttcacgcc tttcatcacc tcggccatcc acttctacta cgggtttgtg 1440
ttcacagggt gtcttatttt ctccttcttc tacgtgttct tctttgttag ggaaaccaag 1500
ggtctctcgt tggaagaggt ggatgagtta tatgccactg acctcccacc atggaagacc 1560
gcgggctgga cgcctccttc tgctgaggat atggcccaca ccaccgggtt tgccgaggcc 1620
gcaaagccta cgaacaaaca cgtttaa 1647
<210> 17
<211> 1509
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 delta-GXS1 /delta-HGT12 的序列 （具有较短N-末端的GXS1/HGT12的变体）
<400> 17
atgggcattt tcgttggcgt tttcgccgcg cttggcggtg ttctctttgg ctacgatacc 60
ggtaccatct ctggtgtgat ggccatgcct tgggtcaagg aacatttccc aaaagaccgt 120
gttgcattta gtgcttccga gtcgtcgttg attgtgtcta ttttatctgc aggaactttc 180
tttggagcca ttcttgctcc gctcttgacc gatacattgg gtagacgctg gtgtattatc 240
atctcttcgc tcgttgtgtt caatttgggt gctgctttgc agacggctgc cacggatatc 300
ccgctcttga ttgttggtcg tgtcattgcc ggtttagggg ttggtttgat ttcgctgacg 360
attccattgt accagtccga agcgcttccc aaatggatta gaggtgctgt tgtctcgtgc 420
taccaatggg ccattactat tggtatcttt ttggctgccg tgatcaacca gggcactcac 480
aagatcaaca gccctgcgtc gtacagaatt ccattgggta ttcagatggc atggggtctt 540
atcttgggtg tcggcatgtt cttcttgccc gagacgcctc gtttctacat ttccaagggc 600
cagaatgcga aggctgctgt ttcattggcg cgtttgagaa agcttccgca agatcacccg 660
gagttgttgg aggaattgga agatatccag gcggcatacg agtttgagac tgtccatggc 720
aagtcttcat ggctgcaggt tttcaccaac aagaacaaac aattgaagaa gttggccacg 780
ggcgtgtgct tgcaggcgtt ccaacaattg actggtgtga acttcatttt ctactttggc 840
acgactttct tcaacagtgt tgggcttgac ggattcacca cctccttggc caccaacatt 900
gtcaatgttg gctcgacgat ccctggtatt ttgggtgttg agattttcgg cagaagaaaa 960
gtgttgttga ccggcgctgc tggtatgtgt ctttcgcaat tcattgttgc cattgttggt 1020
gtagccaccg actccaaggc tgcgaaccaa gttcttattg ccttctgctg cattttcatt 1080
gcgttctttg cagccacctg gggccccacc gcatgggttg tttgtggcga gattttcccc 1140
ttgagaacca gagccaagtc gattgccatg tgcgctgctt cgaactggtt gttgaactgg 1200
gcaattgcat acgccacgcc atacttggtt gactccgata agggtaactt gggcaccaat 1260
gtgtttttca tttggggaag ctgtaacttc ttctgccttg tgtttgccta cttcatgatt 1320
tacgagacca agggtctttc cttggagcag gttgatgagc tttacgagaa ggttgccagc 1380
gccagaaagt cgcctggctt cgtgccaagc gagcacgctt tcagagagca cgccgatgtg 1440
gagaccgcca tgccagacaa cttcaacttg aaggcggagg cgatttctgt cgaggatgcc 1500
tctgtttaa 1509
<210> 18
<400> 18
000
<210> 19
<211> 1647
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 GXS1/HGT12 的序列
<400> 19
atgagcatct ttgaaggcaa agacgggaag ggggtatcct ccaccgagtc gctttccaat 60
gacgtcagat atgacaacat ggagaaagtt gatcaggatg ttcttagaca caacttcaac 120
tttgacaaag aattcgagga gctcgaaatc gaggcggcgc aagtcaacga caaaccttct 180
tttgtcgaca ggattttatc cctcgaatac aagcttcatt tcgaaaacaa gaaccacatg 240
gtgtggctct tgggcgcttt cgcagccgcc gcaggcttat tgtctggctt ggatcagtcc 300
attatttctg gtgcatccat tggaatgaac aaagcattga acttgactga acgtgaagcc 360
tcattggtgt cttcgcttat gcctttaggc gccatggcag gctccatgat tatgacacct 420
cttaatgagt ggttcggaag aaaatcatcg ttgattattt cttgtatttg gtataccatc 480
ggatccgctt tgtgcgctgg cgccagagat caccacatga tgtacgctgg cagatttatt 540
cttggtgtcg gtgtgggtat agaaggtggg tgtgtgggca tttacatttc cgagtctgtc 600
ccagccaatg tgcgtggtag tatcgtgtcg atgtaccagt tcaatattgc tttgggtgaa 660
gttctagggt atgctgttgc tgccattttc tacactgttc atggtggatg gaggttcatg 720
gtggggtctt ctttagtatt ctctactata ttgtttgccg gattgttttt cttgcccgag 780
tcacctcgtt ggttggtgca caaaggcaga aacggaatgg catacgatgt gtggaagaga 840
ttgagagaca taaacgatga aagcgcaaag ttggaatttt tggagatgag acaggctgct 900
tatcaagaga gagaaagacg ctcgcaagag tctttgttct ccagctgggg cgaattattc 960
accatcgcta gaaacagaag agcacttact tactctgtca taatgatcac tttgggtcaa 1020
ttgactggtg tcaatgccgt catgtactac atgtcgactt tgatgggtgc aattggtttc 1080
aacgagaaag actctgtgtt catgtccctt gtgggaggcg gttctttgct tataggtacc 1140
attcctgcca ttttgtggat ggaccgtttc ggcagaagag tttggggtta taatcttgtt 1200
ggtttcttcg ttggtttggt gctcgttggt gttggctacc gtttcaatcc cgtcactcaa 1260
aaggcggctt cagaaggtgt gtacttgacg ggtctcattg tctatttctt gttctttggt 1320
tcctactcga ccttaacttg ggtcattcca tccgagtctt ttgatttgag aacaagatct 1380
ttgggtatga caatctgttc cactttcctt tacttgtggt ctttcaccgt cacctacaac 1440
ttcaccaaga tgtccgccgc cttcacatac actgggttga cacttggttt ctacggtggc 1500
attgcgttcc ttggtttgat ttaccaggtc tgcttcatgc ccgagacgaa ggacaagact 1560
ttggaagaaa ttgacgatat cttcaatcgt tctgcgttct ctatcgcgcg cgagaacatc 1620
tccaacttga agaagggtat ttggtaa 1647
<210> 20
<211> 1647
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 HXT5 的序列
<400> 20
atgagcatct ttgaaggcaa agacgggaag ggggtatcct ccaccgagtc gctttccaat 60
gacgtcagat atgacaacat ggagaaagtt gatcaggatg ttcttagaca caacttcaac 120
tttgacaaag aattcgagga gctcgaaatc gaggcggcgc aagtcaacga caaaccttct 180
tttgtcgaca ggattttatc cctcgaatac aagcttcatt tcgaaaacaa gaaccacatg 240
gtgtggctct tgggcgcttt cgcagccgcc gcaggcttat tgtctggctt ggatcagtcc 300
attatttctg gtgcatccat tggaatgaac aaagcattga acttgactga acgtgaagcc 360
tcattggtgt cttcgcttat gcctttaggc gccatggcag gctccatgat tatgacacct 420
cttaatgagt ggttcggaag aaaatcatcg ttgattattt cttgtatttg gtataccatc 480
ggatccgctt tgtgcgctgg cgccagagat caccacatga tgtacgctgg cagatttatt 540
cttggtgtcg gtgtgggtat agaaggtggg tgtgtgggca tttacatttc cgagtctgtc 600
ccagccaatg tgcgtggtag tatcgtgtcg atgtaccagt tcaatattgc tttgggtgaa 660
gttctagggt atgctgttgc tgccattttc tacactgttc atggtggatg gaggttcatg 720
gtggggtctt ctttagtatt ctctactata ttgtttgccg gattgttttt cttgcccgag 780
tcacctcgtt ggttggtgca caaaggcaga aacggaatgg catacgatgt gtggaagaga 840
ttgagagaca taaacgatga aagcgcaaag ttggaatttt tggagatgag acaggctgct 900
tatcaagaga gagaaagacg ctcgcaagag tctttgttct ccagctgggg cgaattattc 960
accatcgcta gaaacagaag agcacttact tactctgtca taatgatcac tttgggtcaa 1020
ttgactggtg tcaatgccgt catgtactac atgtcgactt tgatgggtgc aattggtttc 1080
aacgagaaag actctgtgtt catgtccctt gtgggaggcg gttctttgct tataggtacc 1140
attcctgcca ttttgtggat ggaccgtttc ggcagaagag tttggggtta taatcttgtt 1200
ggtttcttcg ttggtttggt gctcgttggt gttggctacc gtttcaatcc cgtcactcaa 1260
aaggcggctt cagaaggtgt gtacttgacg ggtctcattg tctatttctt gttctttggt 1320
tcctactcga ccttaacttg ggtcattcca tccgagtctt ttgatttgag aacaagatct 1380
ttgggtatga caatctgttc cactttcctt tacttgtggt ctttcaccgt cacctacaac 1440
ttcaccaaga tgtccgccgc cttcacatac actgggttga cacttggttt ctacggtggc 1500
attgcgttcc ttggtttgat ttaccaggtc tgcttcatgc ccgagacgaa ggacaagact 1560
ttggaagaaa ttgacgatat cttcaatcgt tctgcgttct ctatcgcgcg cgagaacatc 1620
tccaacttga agaagggtat ttggtaa 1647
<210> 21
<211> 1632
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 XYT1 的序列，对于酿酒酵母（S.cerevisiae）中的表达进行了密码子优化
<400> 21
atgggatacg aagagaaatt agtggccccc gctttgaaat ttaagaactt tttggataag 60
accccaaata tacataacgt ttacgtaatt gcggcgatct cgtgtacctc aggtatgatg 120
ttcggtttcg atatatcgtc gatgtccgtg ttcgtggacc aacagccgta tttaaaaatg 180
tttgataacc ctagcagcgt gatacaaggg tttataactg cgttgatgtc tttggggagc 240
tttttcggat cgctaacgtc cacttttatt tcagaacctt ttggtagacg tgcctctttg 300
ttcatatgcg ggatcctttg ggtaattggg gcggcagttc aaagttcttc tcagaaccgt 360
gcgcagctta tttgtggccg aattattgca gggtggggca tcggattcgg ttctagcgtt 420
gcgccggtat acggttcaga aatggcccca cgcaaaatta gaggaacaat cggaggtatt 480
tttcaatttt ctgtcacggt cggaatattc ataatgttcc tgattggcta cggctgctca 540
tttatacaag gcaaggccag ttttagaatt ccgtggggag ttcaaatggt accaggtctc 600
attctgttga tcggactatt cttcattcct gaatccccaa gatggttagc caaacaaggc 660
tactgggaag acgctgagat catcgtagca aacgttcaag ctaagggtaa caggaacgat 720
gctaatgtgc aaattgaaat gtccgagata aaagatcagt taatgcttga cgagcattta 780
aaggagttta cttatgccga tttgtttacc aaaaaatacc ggcaaaggac gataacagct 840
atatttgccc aaatatggca acagctgaca ggtatgaatg tcatgatgta ctacatcgta 900
tatatatttc aaatggcagg ttattcaggt aatactaatt tagttccttc actcattcag 960
tatattataa atatggctgt tacggtcccc gcattgttct gtcttgatct gcttggcagg 1020
aggacaattt tattagctgg cgccgctttt atgatggcct ggcaatttgg tgttgctggc 1080
attttagcta cttattcaga gccagcctat atttcagata ccgtgagaat tacaattcca 1140
gatgaccata aaagtgccgc taagggtgtc atcgcttgct gctatttgtt tgtttgttcc 1200
ttcgcctttt cctggggtgt aggtatctgg gtttattgtt cagaagtgtg gggtgatagt 1260
caatccagac aaagaggtgc tgcattggca acttctgcta attggatctt caatttcgca 1320
attgcaatgt ttacaccttc ttctttcaaa aatatcactt ggaagactta tatcatttat 1380
gctacatttt gtgcttgtat gttcattcat gttttttttt ttttccctga aacaaagggt 1440
aagagactag aagaaattgg acagctatgg gatgaaggtg tcccagcatg gagatctgca 1500
aaatggcaac ccactgtccc actagcaagt gacgctgaat tagctcacaa aatggatgtt 1560
gcacacgctg aacacgcaga cttattggca acccattctc caagtagtga cgaaaaaact 1620
ggtaccgttt aa 1632
<210> 22
<211> 1575
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 HXT2.6 的序列
<400> 22
atgctgagca ctaccgatac cctcgaaaaa agggacaccg agcctttcac ttcagatgct 60
cctgtcacag tccatgacta tatcgcagag gagcgtccgt ggtggaaagt gccgcatttg 120
cgtgtattga cttggtctgt tttcgtgatc accctcacct ccaccaacaa cgggtatgat 180
ggcctgatgt tgaatggatt gcaatccttg gacatttggc aggaggattt gggtcaccct 240
gcgggccaga aattgggtgc cttggccaac ggtgttttgt ttggtaacct tgctgctgtg 300
ccttttgctt cgtatttctg cgatcgtttt ggtagaaggc cggtcatttg tttcggacag 360
atcttgacaa ttgttggtgc tgtattacaa ggtttgtcca acagctatgg attttttttg 420
ggttcgagaa ttgtgttggg ttttggtgct atgatagcca ctattccgct gccaacattg 480
atttccgaaa tcgcctaccc tacgcataga gaaacttcca ctttcgccta caacgtgtgc 540
tggtatttgg gagccattat cgcctcctgg gtcacatacg gcaccagaga tttacagagc 600
aaggcttgct ggtcaattcc ttcttatctc caggccgcct tacctttctt tcaagtgtgc 660
atgatttggt ttgtgccaga gtctcccaga ttcctcgttg ccaagggcaa gatcgaccaa 720
gcaagggctg ttttgtctaa ataccataca ggagactcga ctgaccccag agacgttgcg 780
ttggttgact ttgagctcca tgagattgag agtgcattgg agcaggaaaa attgaacact 840
cgctcgtcat actttgactt tttcaagaag agaaacttta gaaagagagg cttcttgtgt 900
gtcatggtcg gtgttgcaat gcagctttct ggaaacggct tagtgtccta ttacttgtcg 960
aaagtgctag actcgattgg aatcactgaa accaagagac agctcgagat caatggctgc 1020
ttgatgatct ataactttgt catctgcgtc tcgttgatga gtgtttgccg tatgttcaaa 1080
agaagagtat tatttctcac gtgtttctca ggaatgacgg tttgctacac gatatggacg 1140
attttgtcag cgcttaatga acagagacac tttgaggata aaggcttggc caatggcgtg 1200
ttggcaatga tcttcttcta ctattttttc tacaacgttg gcatcaatgg attgccattc 1260
ctatacatca ccgagatctt gccttactca cacagagcaa aaggcttgaa tttattccaa 1320
ttctcgcaat ttctcacgca aatctacaat ggctatgtga acccaatcgc catggacgca 1380
atcagctgga agtattacat tgtgtactgc tgtattctct tcgtggagtt ggtgattgtg 1440
tttttcacgt tcccagaaac ttcgggatac actttggagg aggtcgccca ggtatttggt 1500
gatgaggctc ccgggctcca caacagacaa ttggatgttg cgaaagaatc actcgagcat 1560
gttgagcatg tttga 1575
<210> 23
<211> 1605
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 HXT2.6 的序列，对于酿酒酵母（S.cerevisiae）中的表达进行了密码子优化
<400> 23
atgagccagt ctaaagaaaa gtccaacgtt attaccaccg tcttgtctga agaattgcca 60
gttaagtact ccgaagaaat ctccgattac gtttaccatg atcaacattg gtggaagtac 120
aaccacttca gaaaattgca ttggtacatc ttcgttctga ctttgacttc taccaacaat 180
ggttacgatg gctctatgtt gaacggtcta caatctttgt ctacttggaa agatgctatg 240
ggtaatcctg aaggttacat tttgggtgct ttggctaatg gtactatttt cggtggtgtt 300
ttggctgttg cttttgcttc ttgggcttgt gatagatttg gtagaaagtt gactacctgc 360
ttcggttcta tcgttactgt tattggtgct atattgcaag gtgcctctac taattacgca 420
ttctttttcg tttcccgtat ggttattggt tttggtttcg gtctagcttc tgttgcttct 480
ccaactttga ttgctgaatt gtctttccca acttacagac caacttgtac tgccttgtac 540
aatgtttttt ggtacttggg tgctgttatt gctgcatggg ttacttatgg tactagaact 600
atcgtttctg cctactcttg gagaattcca tcttacttgc aaggtttgtt gccattggtt 660
caagtttgtt tggtttggtg ggttccagaa tctccaagat tcttggtttc taagggtaag 720
attgaaaagg ccagggaatt cttgattaag ttccatactg gtaacgacac ccaagaacaa 780
gctactagat tggtcgaatt tgagttgaaa gaaattgaag ccgccttgga gatggaaaag 840
attaactcta attctaagta caccgacttc atcaccatca agactttcag aaagagaatc 900
ttcttggttg ctttcactgc ttgtatgact caattgtctg gtaacggttt ggtgtcttac 960
tacttgtcca aggttttgat ctccattggt attaccggtg agaaagaaca attgcaaatc 1020
aacggttgcc tgatgatcta caacttggtt ttgtctttag ctgttgcctt cacctgttac 1080
ttgtttagaa gaaaggccct gttcatcttc tcttgctcat tcatgttgtt gtcctacgtt 1140
atttggacca ttctgtccgc tatcaatcaa cagagaaact tcgaacaaaa aggtctaggt 1200
caaggtgtct tggctatgat ttttatctac tacttggcct acaacatcgg tttgaatggt 1260
ttgccatact tgtacgttac cgaaatcttg ccatatactc atagagctaa gggcatcaac 1320
ttgtattcct tggttattaa catcaccctg atctataacg gtttcgttaa cgctattgct 1380
atggatgcta tttcctggaa gtactacatc gtttactgct gcattattgc cgttgaattg 1440
gttgttgtta tcttcaccta cgttgaaact ttcggttaca ccttggaaga agttgctaga 1500
gtttttgaag gtactgattc tttggccatg gacattaact tgaacggtac agtttccaac 1560
gaaaagatcg atatcgttca ctctgaaaga ggttcctctg cttaa 1605
<210> 24
<211> 1692
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 QUP2 的序列
<400> 24
atgggctttc gcaacttaaa gcgcaggctc tcaaatgttg gcgactccat gtcagtgcac 60
tctgtgaaag aggaggaaga cttctcccgc gtggaaatcc cggatgaaat ctacaactat 120
aagatcgtcc ttgtggcttt aacagcggcg tcggctgcca tcatcatcgg ctacgatgca 180
ggcttcattg gtggcacggt ttcgttgacg gcgttcaaac tggaatttgg cttggacaaa 240
atgtctgcga cggcggcttc tgctatcgaa gccaacgttg tttccgtgtt ccaggccggc 300
gcctactttg ggtgtctttt cttctatccg attggcgaga tttggggccg taaaatcggt 360
cttcttcttt ccggctttct tttgacgttt ggtgctgcta tttctttgat ttcgaactcg 420
tctcgtggcc ttggtgccat atatgctgga agagtactaa caggtttggg gattggcgga 480
tgtctgagtt tggccccaat ctacgtttct gaaatcgcgc ctgcagcaat cagaggcaag 540
cttgtgggct gctgggaagt gtcatggcag gtgggcggca ttgttggcta ctggatcaat 600
tacggagtct tgcagactct tccgattagc tcacaacaat ggatcatccc gtttgctgta 660
caattgatcc catcggggct tttctggggc ctttgtcttt tgattccaga gctgccacgt 720
tttcttgtat cgaagggaaa gatcgataag gcgcgcaaaa acttagcgta cttgcgtgga 780
cttagcgagg accaccccta ttctgttttt gagttggaga acattagtaa ggccattgaa 840
gagaacttcg agcaaacagg aaggggtttt ttcgacccat tgaaagcttt gtttttcagc 900
aaaaaaatgc tttaccgcct tctcttgtcc acgtcaatgt tcatgatgca gaatggctat 960
ggaatcaatg ctgtgacata ctactcgccc acgatcttca aatccttagg cgttcagggc 1020
tcaaacgccg gtttgctctc aacaggaatt ttcggtcttc ttaaaggtgc cgcttcggtg 1080
ttctgggtct ttttcttggt tgacacattc ggccgccggt tttgtctttg ctacctctct 1140
ctcccctgct cgatctgcat gtggtatatt ggcgcataca tcaagattgc caacccttca 1200
gcgaagcttg ctgcaggaga cacagccacc accccagcag gaactgcagc gaaagcgatg 1260
ctttacatat ggacgatttt ctacggcatt acgtggaatg gtacgacctg ggtgatctgc 1320
gcggagattt tcccccagtc ggtgagaaca gccgcgcagg ccgtcaacgc ttcttctaat 1380
tggttctggg ctttcatgat cggccacttc actggccagg cgctcgagaa tattgggtac 1440
ggatactact tcttgtttgc ggcgtgctct gcaatcttcc ctgtggtagt ctggtttgtg 1500
taccccgaaa caaagggtgt gcctttggag gccgtggagt atttgttcga ggtgcgtcct 1560
tggaaagcgc actcatatgc tttggagaag taccagattg agtacaacga gggtgaattc 1620
caccaacata agcccgaagt actcttacaa gggtctgaaa actcggacac gagcgagaaa 1680
agcctcgcct ga 1692
<210> 25
<211> 2049
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 QUP2 的序列，对于酿酒酵母（S.cerevisiae）中的表达进行了密码子优化
<400> 25
atgggtttca gaaacttgaa gagaagattg tctaacgttg gtgactccat gtctgttcac 60
tctgttaagg aagaagaaga cttctccaga gttgaaatcc cagatgaaat ctacaactac 120
aagatcgtct tggttgcttt gactgctgct tctgctgcta tcatcatcgg ttacgatgct 180
ggtttcattg gtggtactgt ttctttgact gctttcaagt ctgaattcgg tttggacaag 240
atgtctgcta ctgctgcttc tgctatcgaa atgggtttca gaaacttgaa gaggcgtttg 300
tctaatgttg gtgattccat gtctgttcac tccgtcaaag aagaagagga tttctccaga 360
gttgaaatcc cagacgaaat ctacaactac aagatcgttt tggttgcttt gactgctgct 420
tctgctgcta ttatcattgg ttatgatgct ggtttcatcg gtggtactgt ttctttgaca 480
gctttcaagt ctgaattcgg tttggataag atgtctgcta cagctgcttc agctattgaa 540
gctaatgttg tctctgtttt tcaagctggt gcttactttg gttgcctgtt tttttaccca 600
attggtgaaa tttggggtcg taagattggt ttgttgttgt ctggtttctt gttgactttt 660
ggtgctgcca tttccttgat ctctaattct tctagaggtt tgggtgctat ctatgctggt 720
agagttttga ctggtttagg tattggtggt tgttcttctt tagctcccat ctacgttagt 780
gaaattgctc cagctgcaat tagaggtaag ttagttggtt gttgggaagt ttcttggcaa 840
gttggtggta tcgttggtta ttggattaac tatggtgtct tgcaaaccct gccaatctct 900
tctcaacaat ggattattcc attcgccgtt caattgattc catctggttt gttttggggt 960
ttgtgcttgt tgattccaga atctccaaga ttcttggtgt ccaaaggtaa gattgataag 1020
gccagaaaga acttggctta cttgagaggt ttgtctgaag atcatccata ctccgttttt 1080
gagttggaga acatttccaa ggccatcgaa gaaaactttg aacaaacagg tagaggtttc 1140
ttcgacccat tgaaggcttt gtttttcagc aagaaaatgc tgtacaggct gctgttgtct 1200
acttctatgt ttatgatgca aaacggctac ggtattaacg ctgttactta ttactctccc 1260
accatcttta agtccttggg tgttcaaggt tctaatgccg gtttgttatc tactggtatt 1320
ttcggtttgt tgaaaggtgc cgcttctgtt ttttgggttt tcttcttggt tgataccttc 1380
ggtagaagat tctgtttgtg ctatttgtct ttgccatgct ctatctgcat gtggtatatt 1440
ggtgcctaca ttaagattgc taacccatct gctaaattgg ctgctggtga tactgctact 1500
actccagctg gtactgctgc taaagctatg ttgtatattt ggaccatctt ctacggtatc 1560
acttggaatg gtactacctg ggttatttgc gctgaaattt ttccacaatc tgttagaaca 1620
gctgctcaag ctgttaatgc ttcttctaat tggttttggg ccttcatgat tggtcatttt 1680
actggtcaag ctttggaaaa cattggttac ggttactact ttttgttcgc tgcttgttcc 1740
gctattttcc cagttgtagt ttggttcgtt tacccagaaa caaaaggtgt tccattggaa 1800
gctgttgaat acttgtttga agttagacca tggaaggctc attcttacgc tttagaaaag 1860
taccagatcg agtacaacga aggtgaattc catcaacata agccagaagt tttgttgcag 1920
ggttctgaaa actctgatac ctctgaaaag tctttggcct gaaacgaagg tgaattccac 1980
caacataagc cagaagtttt gttgcaaggt tctgaaaact ctgacacttc tgaaaagtct 2040
ttggcttaa 2049
<210> 26
<211> 1887
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 APS1/HGT19 的序列
<400> 26
atgtcagaaa agcctgttgt gtcgcacagc atcgacacga cgctgtctac gtcatcgaaa 60
caagtctatg acggtaactc gcttcttaag accctgaatg agcgcgatgg cgaacgcggc 120
aatatcttgt cgcagtacac tgaggaacag gccatgcaaa tgggccgcaa ctatgcgttg 180
aagcacaatt tagatgcgac actctttgga aaggcggccg cggtcgcaag aaacccatac 240
gagttcaatt cgatgagttt tttgaccgaa gaggaaaaag tcgcgcttaa cacggagcag 300
accaagaaat ggcacatccc aagaaagttg gtggaggtga ttgcattggg gtccatggcc 360
gctgcggtgc agggtatgga tgagtcggtg gtgaatggtg caacgctttt ctaccccacg 420
gcaatgggta tcacagatat caagaatgcc gatttgattg aaggtttgat caacggtgcg 480
ccctatcttt gctgcgccat catgtgctgg acatctgatt actggaacag gaagttgggc 540
cgtaagtgga ccattttctg gacatgtgcc atttctgcaa tcacatgtat ctggcaaggt 600
ctcgtcaatt tgaaatggta ccatttgttc attgcgcgtt tctgcttggg tttcggtatc 660
ggtgtcaagt ctgccaccgt gcctgcgtat gctgccgaaa ccaccccggc caaaatcaga 720
ggctcgttgg tcatgctttg gcagttcttc accgctgtcg gaatcatgct tggttacgtg 780
gcgtctttgg cattctatta cattggtgac aatggcattt ctggcggctt gaactggaga 840
ttgatgctag gatctgcatg tcttccagct atcgttgtgt tagtccaagt tccgtttgtt 900
ccagaatccc ctcgttggct catgggtaag gaaagacacg ctgaagcata tgattcgctc 960
cggcaattgc ggttcagtga aatcgaggcg gcccgtgact gtttctacca gtacgtgttg 1020
ttgaaagagg agggctctta tggaacgcag ccattcttca gcagaatcaa ggagatgttc 1080
accgtgagaa gaaacagaaa tggtgcattg ggcgcgtgga tcgtcatgtt catgcagcag 1140
ttctgtggaa tcaacgtcat tgcttactac tcgtcgtcga tcttcgtgga gtcgaatctt 1200
tctgagatca aggccatgtt ggcgtcttgg gggttcggta tgatcaattt cttgtttgca 1260
attccagcgt tctacaccat tgacacgttt ggccgacgca acttgttgct cactactttc 1320
cctcttatgg cggtattctt actcatggcc ggattcgggt tctggatccc gttcgagaca 1380
aacccacacg gccgtttggc ggtgatcact attggtatct atttgtttgc atgtgtctac 1440
tctgcgggcg agggaccagt tcccttcaca tactctgccg aagcattccc gttgtatatc 1500
cgtgacttgg gtatgggctt tgccacggcc acgtgttggt tcttcaactt cattttggca 1560
ttttcctggc ctagaatgaa gaatgcattc aagcctcaag gtgcctttgg ctggtatgcc 1620
gcctggaaca ttgttggctt cttcttagtg ttatggttct tgcccgagac aaagggcttg 1680
acgttggagg aattggacga agtgtttgat gtgcctttga gaaaacacgc gcactaccgt 1740
accaaagaat tagtatacaa cttgcgcaaa tacttcttga ggcagaaccc taagccattg 1800
ccgccacttt atgcacacca aagaatggct gttaccaacc cagaatggtt ggaaaagacc 1860
gaggtcacgc acgaggagaa tatctag 1887
<210> 27
<211> 1887
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 APS1/HGT19 的序列，对于酿酒酵母（S.cerevisiae）中的表达进行了密码子优化
<400> 27
atgtctgaaa agccagttgt ttctcactct atcgacacca cctcttctac ctcttctaag 60
caagtctacg acggtaactc tttgttgaag acctctaacg aaagagacgg tgaaagaggt 120
aacatcttgt ctcaatacac tgaagaacaa gcaatgcaaa tgggtagaaa ctacgctttg 180
aagcacaact tggacgctac cttgttcggt aaggctgctg ctgtcgctag aaacccatac 240
gagttcaact ctatgtcttt cttgaccgaa gaagaaaagg tcgctttgaa caccgaacaa 300
accaagaagt ggcacatccc aagaaagttg gttgaagtta ttgctttggg ttctatggct 360
gctgctgttc aaggtatgga cgaatctgtt gttaacggtg ctaccttgtt ctacccaacc 420
gctatgggta tcaccgacat caagaacgct gacttgattg aaggtttgat taacggtgcc 480
ccatacttgt gttgtgctat tatgtgttgg acctctgact actggaacag aaagttgggt 540
agaaagtgga ccattttctg gacctgtgct atttctgcta tcacctgtat ctggcaaggt 600
ttggtcaact tgaagtggta tcacttgttc attgctagat tctgtttggg tttcggtatc 660
ggtgtcaagt ctgctaccgt tccagcctac gctgctgaaa ccaccccagc caagattaga 720
ggttctttgg ttatgttgtg gcaattcttc accgctgtcg gtattatgtt gggttacgtt 780
gcttctttgg ctttctacta cattggtgac aacggtattt ctggtggttt gaactggaga 840
ttgatgttgg gttctgcttg tttgccagcc atcgttgttt tggtccaagt tccattcgtt 900
ccagaatctc caagatggtt gatgggtaag gaaagacacg ctgaagccta cgactctttg 960
agacaattga gattctctga aatcgaagcc gctagagact gtttctacca atacgttttg 1020
ttgaaggaag aaggttctta cggtactcaa ccattcttct ctagaatcaa ggaaatgttc 1080
accgttagaa gaaacagaaa cggtgctttg ggtgcttgga ttgttatgtt tatgcaacaa 1140
ttctgtggta tcaacgtcat tgcttactac tcttcttcta tcttcgttga atctaacttg 1200
tctgaaatca aggctatgtt ggcttcttgg ggtttcggta tgattaactt cttgttcgct 1260
attccagcct tctacaccat tgacaccttc ggtagaagaa acttgttgtt gactactttc 1320
ccattgatgg ctgttttctt gttgatggct ggtttcggtt tctggattcc attcgaaacc 1380
aacccacacg gtagattggc tgttatcact attggtatct acttgttcgc ttgtgtctac 1440
tctgctggtg aaggtccagt tccattcacc tactctgctg aagccttccc attgtacatc 1500
agagacttgg gtatgggttt cgctaccgct acctgttggt tcttcaactt cattttggct 1560
ttctcttggc caagaatgaa gaacgctttc aagcctcaag gtgctttcgg ttggtacgct 1620
gcttggaaca ttgttggttt cttcttggtt ttgtggttct tgccagaaac taagggtttg 1680
actttggaag aattggacga agttttcgac gttccattga gaaagcacgc tcactacaga 1740
actaaggaat tggtttacaa cttgagaaag tacttcttga gacaaaaccc aaagccattg 1800
ccaccattgt acgctcacca aagaatggct gttaccaacc cagaatggtt ggaaaagacc 1860
gaagtcaccc acgaagaaaa catctaa 1887
<210> 28
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Y10
<400> 28
gaaaaaactg gtaccgttta atcagtactg acaataaaaa gattcttgt 49
<210> 29
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Y10R
<400> 29
taatttctct tcgtatccca tggttgttta tgttcggatg tgatgtgag 49
<210> 30
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Y15
<400> 30
acgccgccat ccagtgtcga aaacgagctt tgtcttgtaa agagtcttcg gtcattttta 60
<210> 31
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 31
gcggccgcat aggccactag tggatctgat caatacatac aagcatctca caatcacaag 60
<210> 32
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Y33
<400> 32
tttttcaccc acaacaaata atatcaaaag atgggttacg aggaaaagct tgtagcgccc 60
<210> 33
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Y33R
<400> 33
acgagaacac ccagctaaac gcggtgcgcg ttagaccgtg cccgtcttct cgtctgaaga 60
<210> 34
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Y41
<400> 34
cagagcagat tgtactgaga gtgcaccagg cgcgccccat ccagtgtcga accatcatta 60
aaagat 66
<210> 35
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Y41R
<400> 35
ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcactagac aatacataca agcatctcac 60
aatcacaa 68
<210> 36
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Y53
<400> 36
tcagtactga caataaaaag attcttgttt tcaagaac 38
<210> 37
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Y53R
<400> 37
ctcacatcac atccgaacat aaacaacc 28
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Y83
<400> 38
tatcccgtca cttccacatt cg 22
<210> 39
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Y83R
<400> 39
tattgatata gtgtttaagc gaatgacaga ag 32
<210> 40
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Y96i
<400> 40
atagaaagca aatagttata taatttttca tggacgtagg tctagagatc tgtttagctt 60
gc 62
<210> 41
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Y95Ri
<400> 41
aatgcaaaag cggctcctaa acagaaattc ttcagtcaat acatacaagc atctcacaat 60
cacaag 66
<210> 42
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Y93Ri
<400> 42
tcgtctatat caaaactgca tgtttctcta cgtctaatta agggttctcg agagctcg 58
<210> 43
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Y91i
<400> 43
acttcaatag acttcaatag aaagcaaata gttatatgcc ctgaggatgt atctgg 56
<210> 44
<211> 628
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 泛素-缺陷型 H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 Aps1p/Hgt19， 对于酿酒酵母（S. cerevisiae）中的表达进行了密码子优化（具有K4R；K20R；K30R和K93R突变）
<400> 44
Met Ser Glu Arg Pro Val Val Ser His Ser Ile Asp Thr Thr Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ser Ser Arg Gln Val Tyr Asp Gly Asn Ser Leu Leu Arg Thr Ser
20 25 30
Asn Glu Arg Asp Gly Glu Arg Gly Asn Ile Leu Ser Gln Tyr Thr Glu
35 40 45
Glu Gln Ala Met Gln Met Gly Arg Asn Tyr Ala Leu Lys His Asn Leu
50 55 60
Asp Ala Thr Leu Phe Gly Lys Ala Ala Ala Val Ala Arg Asn Pro Tyr
65 70 75 80
Glu Phe Asn Ser Met Ser Phe Leu Thr Glu Glu Glu Arg Val Ala Leu
85 90 95
Asn Thr Glu Gln Thr Lys Lys Trp His Ile Pro Arg Lys Leu Val Glu
100 105 110
Val Ile Ala Leu Gly Ser Met Ala Ala Ala Val Gln Gly Met Asp Glu
115 120 125
Ser Val Val Asn Gly Ala Thr Leu Phe Tyr Pro Thr Ala Met Gly Ile
130 135 140
Thr Asp Ile Lys Asn Ala Asp Leu Ile Glu Gly Leu Ile Asn Gly Ala
145 150 155 160
Pro Tyr Leu Cys Cys Ala Ile Met Cys Trp Thr Ser Asp Tyr Trp Asn
165 170 175
Arg Lys Leu Gly Arg Lys Trp Thr Ile Phe Trp Thr Cys Ala Ile Ser
180 185 190
Ala Ile Thr Cys Ile Trp Gln Gly Leu Val Asn Leu Lys Trp Tyr His
195 200 205
Leu Phe Ile Ala Arg Phe Cys Leu Gly Phe Gly Ile Gly Val Lys Ser
210 215 220
Ala Thr Val Pro Ala Tyr Ala Ala Glu Thr Thr Pro Ala Lys Ile Arg
225 230 235 240
Gly Ser Leu Val Met Leu Trp Gln Phe Phe Thr Ala Val Gly Ile Met
245 250 255
Leu Gly Tyr Val Ala Ser Leu Ala Phe Tyr Tyr Ile Gly Asp Asn Gly
260 265 270
Ile Ser Gly Gly Leu Asn Trp Arg Leu Met Leu Gly Ser Ala Cys Leu
275 280 285
Pro Ala Ile Val Val Leu Val Gln Val Pro Phe Val Pro Glu Ser Pro
290 295 300
Arg Trp Leu Met Gly Lys Glu Arg His Ala Glu Ala Tyr Asp Ser Leu
305 310 315 320
Arg Gln Leu Arg Phe Ser Glu Ile Glu Ala Ala Arg Asp Cys Phe Tyr
325 330 335
Gln Tyr Val Leu Leu Lys Glu Glu Gly Ser Tyr Gly Thr Gln Pro Phe
340 345 350
Phe Ser Arg Ile Lys Glu Met Phe Thr Val Arg Arg Asn Arg Asn Gly
355 360 365
Ala Leu Gly Ala Trp Ile Val Met Phe Met Gln Gln Phe Cys Gly Ile
370 375 380
Asn Val Ile Ala Tyr Tyr Ser Ser Ser Ile Phe Val Glu Ser Asn Leu
385 390 395 400
Ser Glu Ile Lys Ala Met Leu Ala Ser Trp Gly Phe Gly Met Ile Asn
405 410 415
Phe Leu Phe Ala Ile Pro Ala Phe Tyr Thr Ile Asp Thr Phe Gly Arg
420 425 430
Arg Asn Leu Leu Leu Thr Thr Phe Pro Leu Met Ala Val Phe Leu Leu
435 440 445
Met Ala Gly Phe Gly Phe Trp Ile Pro Phe Glu Thr Asn Pro His Gly
450 455 460
Arg Leu Ala Val Ile Thr Ile Gly Ile Tyr Leu Phe Ala Cys Val Tyr
465 470 475 480
Ser Ala Gly Glu Gly Pro Val Pro Phe Thr Tyr Ser Ala Glu Ala Phe
485 490 495
Pro Leu Tyr Ile Arg Asp Leu Gly Met Gly Phe Ala Thr Ala Thr Cys
500 505 510
Trp Phe Phe Asn Phe Ile Leu Ala Phe Ser Trp Pro Arg Met Lys Asn
515 520 525
Ala Phe Lys Pro Gln Gly Ala Phe Gly Trp Tyr Ala Ala Trp Asn Ile
530 535 540
Val Gly Phe Phe Leu Val Leu Trp Phe Leu Pro Glu Thr Lys Gly Leu
545 550 555 560
Thr Leu Glu Glu Leu Asp Glu Val Phe Asp Val Pro Leu Arg Lys His
565 570 575
Ala His Tyr Arg Thr Lys Glu Leu Val Tyr Asn Leu Arg Lys Tyr Phe
580 585 590
Leu Arg Gln Asn Pro Lys Pro Leu Pro Pro Leu Tyr Ala His Gln Arg
595 600 605
Met Ala Val Thr Asn Pro Glu Trp Leu Glu Lys Thr Glu Val Thr His
610 615 620
Glu Glu Asn Ile
625
<210> 45
<211> 548
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 泛素-缺陷型 H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 Hxt5p (具有 K7R; K10R,K29R; K43R 和 K58R 突变)
<400> 45
Met Ser Ile Phe Glu Gly Arg Asp Gly Arg Gly Val Ser Ser Thr Glu
1 5 10 15
Ser Leu Ser Asn Asp Val Arg Tyr Asp Asn Met Glu Arg Val Asp Gln
20 25 30
Asp Val Leu Arg His Asn Phe Asn Phe Asp Arg Glu Phe Glu Glu Leu
35 40 45
Glu Ile Glu Ala Ala Gln Val Asn Asp Arg Pro Ser Phe Val Asp Arg
50 55 60
Ile Leu Ser Leu Glu Tyr Lys Leu His Phe Glu Asn Lys Asn His Met
65 70 75 80
Val Trp Leu Leu Gly Ala Phe Ala Ala Ala Ala Gly Leu Leu Ser Gly
85 90 95
Leu Asp Gln Ser Ile Ile Ser Gly Ala Ser Ile Gly Met Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Asn Leu Thr Glu Arg Glu Ala Ser Leu Val Ser Ser Leu Met Pro
115 120 125
Leu Gly Ala Met Ala Gly Ser Met Ile Met Thr Pro Leu Asn Glu Trp
130 135 140
Phe Gly Arg Lys Ser Ser Leu Ile Ile Ser Cys Ile Trp Tyr Thr Ile
145 150 155 160
Gly Ser Ala Leu Cys Ala Gly Ala Arg Asp His His Met Met Tyr Ala
165 170 175
Gly Arg Phe Ile Leu Gly Val Gly Val Gly Ile Glu Gly Gly Cys Val
180 185 190
Gly Ile Tyr Ile Ser Glu Ser Val Pro Ala Asn Val Arg Gly Ser Ile
195 200 205
Val Ser Met Tyr Gln Phe Asn Ile Ala Leu Gly Glu Val Leu Gly Tyr
210 215 220
Ala Val Ala Ala Ile Phe Tyr Thr Val His Gly Gly Trp Arg Phe Met
225 230 235 240
Val Gly Ser Ser Leu Val Phe Ser Thr Ile Leu Phe Ala Gly Leu Phe
245 250 255
Phe Leu Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Val His Lys Gly Arg Asn Gly
260 265 270
Met Ala Tyr Asp Val Trp Lys Arg Leu Arg Asp Ile Asn Asp Glu Ser
275 280 285
Ala Lys Leu Glu Phe Leu Glu Met Arg Gln Ala Ala Tyr Gln Glu Arg
290 295 300
Glu Arg Arg Ser Gln Glu Ser Leu Phe Ser Ser Trp Gly Glu Leu Phe
305 310 315 320
Thr Ile Ala Arg Asn Arg Arg Ala Leu Thr Tyr Ser Val Ile Met Ile
325 330 335
Thr Leu Gly Gln Leu Thr Gly Val Asn Ala Val Met Tyr Tyr Met Ser
340 345 350
Thr Leu Met Gly Ala Ile Gly Phe Asn Glu Lys Asp Ser Val Phe Met
355 360 365
Ser Leu Val Gly Gly Gly Ser Leu Leu Ile Gly Thr Ile Pro Ala Ile
370 375 380
Leu Trp Met Asp Arg Phe Gly Arg Arg Val Trp Gly Tyr Asn Leu Val
385 390 395 400
Gly Phe Phe Val Gly Leu Val Leu Val Gly Val Gly Tyr Arg Phe Asn
405 410 415
Pro Val Thr Gln Lys Ala Ala Ser Glu Gly Val Tyr Leu Thr Gly Leu
420 425 430
Ile Val Tyr Phe Leu Phe Phe Gly Ser Tyr Ser Thr Leu Thr Trp Val
435 440 445
Ile Pro Ser Glu Ser Phe Asp Leu Arg Thr Arg Ser Leu Gly Met Thr
450 455 460
Ile Cys Ser Thr Phe Leu Tyr Leu Trp Ser Phe Thr Val Thr Tyr Asn
465 470 475 480
Phe Thr Lys Met Ser Ala Ala Phe Thr Tyr Thr Gly Leu Thr Leu Gly
485 490 495
Phe Tyr Gly Gly Ile Ala Phe Leu Gly Leu Ile Tyr Gln Val Cys Phe
500 505 510
Met Pro Glu Thr Lys Asp Lys Thr Leu Glu Glu Ile Asp Asp Ile Phe
515 520 525
Asn Arg Ser Ala Phe Ser Ile Ala Arg Glu Asn Ile Ser Asn Leu Lys
530 535 540
Lys Gly Ile Trp
545
<210> 46
<211> 548
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 Gxf2p/Gal2p (具有 K23R, K26R, K35R,K542R 和 K546R 突变)
<400> 46
Met Ser Ala Glu Gln Glu Gln Gln Val Ser Gly Thr Ser Ala Thr Ile
1 5 10 15
Asp Gly Leu Ala Ser Leu Arg Gln Glu Arg Thr Ala Glu Glu Glu Asp
20 25 30
Ala Phe Arg Pro Lys Pro Ala Thr Ala Tyr Phe Phe Ile Ser Phe Leu
35 40 45
Cys Gly Leu Val Ala Phe Gly Gly Tyr Val Phe Gly Phe Asp Thr Gly
50 55 60
Thr Ile Ser Gly Phe Val Asn Met Asp Asp Tyr Leu Met Arg Phe Gly
65 70 75 80
Gln Gln His Ala Asp Gly Thr Tyr Tyr Leu Ser Asn Val Arg Thr Gly
85 90 95
Leu Ile Val Ser Ile Phe Asn Ile Gly Cys Ala Val Gly Gly Leu Ala
100 105 110
Leu Ser Lys Val Gly Asp Ile Trp Gly Arg Arg Ile Gly Ile Met Val
115 120 125
Ala Met Ile Ile Tyr Met Val Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ala Ser Gln
130 135 140
Asp Lys Trp Tyr Gln Tyr Phe Ile Gly Arg Leu Ile Thr Gly Leu Gly
145 150 155 160
Val Gly Thr Thr Ser Val Leu Ser Pro Leu Phe Ile Ser Glu Ser Ala
165 170 175
Pro Lys His Leu Arg Gly Thr Leu Val Cys Cys Phe Gln Leu Met Val
180 185 190
Thr Leu Gly Ile Phe Leu Gly Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Thr Lys Asn
195 200 205
Tyr Thr Asp Ser Arg Gln Trp Arg Ile Pro Leu Gly Leu Cys Phe Ala
210 215 220
Trp Ala Leu Leu Leu Ile Ser Gly Met Val Phe Met Pro Glu Ser Pro
225 230 235 240
Arg Phe Leu Ile Glu Arg Gln Arg Phe Asp Glu Ala Lys Ala Ser Val
245 250 255
Ala Lys Ser Asn Gln Val Ser Thr Glu Asp Pro Ala Val Tyr Thr Glu
260 265 270
Val Glu Leu Ile Gln Ala Gly Ile Asp Arg Glu Ala Leu Ala Gly Ser
275 280 285
Ala Gly Trp Lys Glu Leu Ile Thr Gly Lys Pro Lys Met Leu Gln Arg
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Val Ile Leu Gly Met Met Leu Gln Ser Ile Gln Gln Leu Thr Gly Asn
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Asn Tyr Phe Phe Tyr Tyr Gly Thr Thr Ile Phe Lys Ala Val Gly Met
325 330 335
Ser Asp Ser Phe Gln Thr Ser Ile Val Leu Gly Ile Val Asn Phe Ala
340 345 350
Ser Thr Phe Val Gly Ile Trp Ala Ile Glu Arg Met Gly Arg Arg Ser
355 360 365
Cys Leu Leu Val Gly Ser Ala Cys Met Ser Val Cys Phe Leu Ile Tyr
370 375 380
Ser Ile Leu Gly Ser Val Asn Leu Tyr Ile Asp Gly Tyr Glu Asn Thr
385 390 395 400
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405 410 415
Cys Leu Phe Ile Phe Phe Phe Ala Ser Thr Trp Ala Gly Gly Val Tyr
420 425 430
Ser Ile Val Ser Glu Thr Tyr Pro Leu Arg Ile Arg Ser Lys Gly Met
435 440 445
Ala Val Ala Thr Ala Ala Asn Trp Met Trp Gly Phe Leu Ile Ser Phe
450 455 460
Phe Thr Pro Phe Ile Thr Ser Ala Ile His Phe Tyr Tyr Gly Phe Val
465 470 475 480
Phe Thr Gly Cys Leu Ile Phe Ser Phe Phe Tyr Val Phe Phe Phe Val
485 490 495
Arg Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu Glu Glu Val Asp Glu Leu Tyr Ala
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Asn Arg His Val
545
<210> 47
<211> 544
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 泛素-缺陷型 H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 Gxf1p (具有 K9R 和 K24R突变)
<400> 47
Met Ser Gln Asp Glu Leu His Thr Arg Ser Gly Val Glu Thr Pro Ile
1 5 10 15
Asn Asp Ser Leu Leu Glu Glu Arg His Asp Val Thr Pro Leu Ala Ala
20 25 30
Leu Pro Glu Lys Ser Phe Lys Asp Tyr Ile Ser Ile Ser Ile Phe Cys
35 40 45
Leu Phe Val Ala Phe Gly Gly Phe Val Phe Gly Phe Asp Thr Gly Thr
50 55 60
Ile Ser Gly Phe Val Asn Met Ser Asp Phe Lys Thr Arg Phe Gly Glu
65 70 75 80
Met Asn Ala Gln Gly Glu Tyr Tyr Leu Ser Asn Val Arg Thr Gly Leu
85 90 95
Met Val Ser Ile Phe Asn Val Gly Cys Ala Val Gly Gly Ile Phe Leu
100 105 110
Cys Lys Ile Ala Asp Val Tyr Gly Arg Arg Ile Gly Leu Met Phe Ser
115 120 125
Met Val Val Tyr Val Val Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ala Ser Thr Thr
130 135 140
Lys Trp Tyr Gln Tyr Phe Ile Gly Arg Leu Ile Ala Gly Leu Ala Val
145 150 155 160
Gly Thr Val Ser Val Ile Ser Pro Leu Phe Ile Ser Glu Val Ala Pro
165 170 175
Lys Gln Leu Arg Gly Thr Leu Val Cys Cys Phe Gln Leu Cys Ile Thr
180 185 190
Leu Gly Ile Phe Leu Gly Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Thr Lys Thr Tyr
195 200 205
Thr Asp Ser Arg Gln Trp Arg Ile Pro Leu Gly Ile Cys Phe Ala Trp
210 215 220
Ala Leu Phe Leu Val Ala Gly Met Leu Asn Met Pro Glu Ser Pro Arg
225 230 235 240
Tyr Leu Val Glu Lys Ser Arg Ile Asp Asp Ala Arg Lys Ser Ile Ala
245 250 255
Arg Ser Asn Lys Val Ser Glu Glu Asp Pro Ala Val Tyr Thr Glu Val
260 265 270
Gln Leu Ile Gln Ala Gly Ile Asp Arg Glu Ala Leu Ala Gly Ser Ala
275 280 285
Thr Trp Met Glu Leu Val Thr Gly Lys Pro Lys Ile Phe Arg Arg Val
290 295 300
Ile Met Gly Val Met Leu Gln Ser Leu Gln Gln Leu Thr Gly Asp Asn
305 310 315 320
Tyr Phe Phe Tyr Tyr Gly Thr Thr Ile Phe Lys Ala Val Gly Leu Gln
325 330 335
Asp Ser Phe Gln Thr Ser Ile Ile Leu Gly Ile Val Asn Phe Ala Ser
340 345 350
Thr Phe Val Gly Ile Tyr Ala Ile Glu Arg Met Gly Arg Arg Leu Cys
355 360 365
Leu Leu Thr Gly Ser Ala Cys Met Phe Val Cys Phe Ile Ile Tyr Ser
370 375 380
Leu Ile Gly Thr Gln His Leu Tyr Lys Asn Gly Phe Ser Asn Glu Pro
385 390 395 400
Ser Asn Thr Tyr Lys Pro Ser Gly Asn Ala Met Ile Phe Ile Thr Cys
405 410 415
Leu Tyr Ile Phe Phe Phe Ala Ser Thr Trp Ala Gly Gly Val Tyr Cys
420 425 430
Ile Val Ser Glu Ser Tyr Pro Leu Arg Ile Arg Ser Lys Ala Met Ser
435 440 445
Val Ala Thr Ala Ala Asn Trp Met Trp Gly Phe Leu Ile Ser Phe Phe
450 455 460
Thr Pro Phe Ile Thr Ser Ala Ile His Phe Tyr Tyr Gly Phe Val Phe
465 470 475 480
Thr Gly Cys Leu Ala Phe Ser Phe Phe Tyr Val Tyr Phe Phe Val Val
485 490 495
Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu Glu Glu Val Asp Ile Leu Tyr Ala Ser
500 505 510
Gly Thr Leu Pro Trp Lys Ser Ser Gly Trp Val Pro Pro Thr Ala Asp
515 520 525
Glu Met Ala His Asn Ala Phe Asp Asn Lys Pro Thr Asp Glu Gln Val
530 535 540
<210> 48
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 泛素-缺陷型 H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 Xyt1p (具有 K6R 和 S75L突变)
<400> 48
Met Gly Tyr Glu Glu Arg Leu Val Ala Pro Ala Leu Lys Phe Lys Asn
1 5 10 15
Phe Leu Asp Lys Thr Pro Asn Ile His Asn Val Tyr Val Ile Ala Ala
20 25 30
Ile Ser Cys Thr Ser Gly Met Met Phe Gly Phe Asp Ile Ser Ser Met
35 40 45
Ser Val Phe Val Asp Gln Gln Pro Tyr Leu Lys Met Phe Asp Asn Pro
50 55 60
Ser Ser Val Ile Gln Gly Phe Ile Thr Ala Leu Met Ser Leu Gly Ser
65 70 75 80
Phe Phe Gly Ser Leu Thr Ser Thr Phe Ile Ser Glu Pro Phe Gly Arg
85 90 95
Arg Ala Ser Leu Phe Ile Cys Gly Ile Leu Trp Val Ile Gly Ala Ala
100 105 110
Val Gln Ser Ser Ser Gln Asn Arg Ala Gln Leu Ile Cys Gly Arg Ile
115 120 125
Ile Ala Gly Trp Gly Ile Gly Phe Gly Ser Ser Val Ala Pro Val Tyr
130 135 140
Gly Ser Glu Met Ala Pro Arg Lys Ile Arg Gly Thr Ile Gly Gly Ile
145 150 155 160
Phe Gln Phe Ser Val Thr Val Gly Ile Phe Ile Met Phe Leu Ile Gly
165 170 175
Tyr Gly Cys Ser Phe Ile Gln Gly Lys Ala Ser Phe Arg Ile Pro Trp
180 185 190
Gly Val Gln Met Val Pro Gly Leu Ile Leu Leu Ile Gly Leu Phe Phe
195 200 205
Ile Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Ala Lys Gln Gly Tyr Trp Glu Asp
210 215 220
Ala Glu Ile Ile Val Ala Asn Val Gln Ala Lys Gly Asn Arg Asn Asp
225 230 235 240
Ala Asn Val Gln Ile Glu Met Ser Glu Ile Lys Asp Gln Leu Met Leu
245 250 255
Asp Glu His Leu Lys Glu Phe Thr Tyr Ala Asp Leu Phe Thr Lys Lys
260 265 270
Tyr Arg Gln Arg Thr Ile Thr Ala Ile Phe Ala Gln Ile Trp Gln Gln
275 280 285
Leu Thr Gly Met Asn Val Met Met Tyr Tyr Ile Val Tyr Ile Phe Gln
290 295 300
Met Ala Gly Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Leu Val Pro Ser Leu Ile Gln
305 310 315 320
Tyr Ile Ile Asn Met Ala Val Thr Val Pro Ala Leu Phe Cys Leu Asp
325 330 335
Leu Leu Gly Arg Arg Thr Ile Leu Leu Ala Gly Ala Ala Phe Met Met
340 345 350
Ala Trp Gln Phe Gly Val Ala Gly Ile Leu Ala Thr Tyr Ser Glu Pro
355 360 365
Ala Tyr Ile Ser Asp Thr Val Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asp His Lys
370 375 380
Ser Ala Ala Lys Gly Val Ile Ala Cys Cys Tyr Leu Phe Val Cys Ser
385 390 395 400
Phe Ala Phe Ser Trp Gly Val Gly Ile Trp Val Tyr Cys Ser Glu Val
405 410 415
Trp Gly Asp Ser Gln Ser Arg Gln Arg Gly Ala Ala Leu Ala Thr Ser
420 425 430
Ala Asn Trp Ile Phe Asn Phe Ala Ile Ala Met Phe Thr Pro Ser Ser
435 440 445
Phe Lys Asn Ile Thr Trp Lys Thr Tyr Ile Ile Tyr Ala Thr Phe Cys
450 455 460
Ala Cys Met Phe Ile His Val Phe Phe Phe Phe Pro Glu Thr Lys Gly
465 470 475 480
Lys Arg Leu Glu Glu Ile Gly Gln Leu Trp Asp Glu Gly Val Pro Ala
485 490 495
Trp Arg Ser Ala Lys Trp Gln Pro Thr Val Pro Leu Ala Ser Asp Ala
500 505 510
Glu Leu Ala His Lys Met Asp Val Ala His Ala Glu His Ala Asp Leu
515 520 525
Leu Ala Thr His Ser Pro Ser Ser Asp Glu Lys Thr Gly Thr Val
530 535 540
<210> 49
<211> 1887
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 泛素-缺陷型 H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 APS1/HGT19 (具有 K4R;K20R; K30R 和 K93R 突变)
<400> 49
atgtctgaaa gaccagttgt ttctcactct atcgacacca cctcttctac ctcttctaga 60
caagtctacg acggtaactc tttgttgagg acctctaacg aaagagacgg tgaaagaggt 120
aacatcttgt ctcaatacac tgaagaacaa gcaatgcaaa tgggtagaaa ctacgctttg 180
aagcacaact tggacgctac cttgttcggt aaggctgctg ctgtcgctag aaacccatac 240
gagttcaact ctatgtcttt cttgaccgaa gaagaaagag tcgctttgaa caccgaacaa 300
accaagaagt ggcacatccc aagaaagttg gttgaagtta ttgctttggg ttctatggct 360
gctgctgttc aaggtatgga cgaatctgtt gttaacggtg ctaccttgtt ctacccaacc 420
gctatgggta tcaccgacat caagaacgct gacttgattg aaggtttgat taacggtgcc 480
ccatacttgt gttgtgctat tatgtgttgg acctctgact actggaacag aaagttgggt 540
agaaagtgga ccattttctg gacctgtgct atttctgcta tcacctgtat ctggcaaggt 600
ttggtcaact tgaagtggta tcacttgttc attgctagat tctgtttggg tttcggtatc 660
ggtgtcaagt ctgctaccgt tccagcctac gctgctgaaa ccaccccagc caagattaga 720
ggttctttgg ttatgttgtg gcaattcttc accgctgtcg gtattatgtt gggttacgtt 780
gcttctttgg ctttctacta cattggtgac aacggtattt ctggtggttt gaactggaga 840
ttgatgttgg gttctgcttg tttgccagcc atcgttgttt tggtccaagt tccattcgtt 900
ccagaatctc caagatggtt gatgggtaag gaaagacacg ctgaagccta cgactctttg 960
agacaattga gattctctga aatcgaagcc gctagagact gtttctacca atacgttttg 1020
ttgaaggaag aaggttctta cggtactcaa ccattcttct ctagaatcaa ggaaatgttc 1080
accgttagaa gaaacagaaa cggtgctttg ggtgcttgga ttgttatgtt tatgcaacaa 1140
ttctgtggta tcaacgtcat tgcttactac tcttcttcta tcttcgttga atctaacttg 1200
tctgaaatca aggctatgtt ggcttcttgg ggtttcggta tgattaactt cttgttcgct 1260
attccagcct tctacaccat tgacaccttc ggtagaagaa acttgttgtt gactactttc 1320
ccattgatgg ctgttttctt gttgatggct ggtttcggtt tctggattcc attcgaaacc 1380
aacccacacg gtagattggc tgttatcact attggtatct acttgttcgc ttgtgtctac 1440
tctgctggtg aaggtccagt tccattcacc tactctgctg aagccttccc attgtacatc 1500
agagacttgg gtatgggttt cgctaccgct acctgttggt tcttcaactt cattttggct 1560
ttctcttggc caagaatgaa gaacgctttc aagcctcaag gtgctttcgg ttggtacgct 1620
gcttggaaca ttgttggttt cttcttggtt ttgtggttct tgccagaaac taagggtttg 1680
actttggaag aattggacga agttttcgac gttccattga gaaagcacgc tcactacaga 1740
actaaggaat tggtttacaa cttgagaaag tacttcttga gacaaaaccc aaagccattg 1800
ccaccattgt acgctcacca aagaatggct gttaccaacc cagaatggtt ggaaaagacc 1860
gaagtcaccc acgaagaaaa catctaa 1887
<210> 50
<211> 1647
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 泛素-缺陷型 H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 HXT5 (具有 K7R; K10R,K29R; K43R 和 K58R 突变)
<400> 50
atgtccattt tcgaaggtag ggatggtaga ggtgtttcct ctactgaatc cttgtctaac 60
gatgttagat acgacaacat ggaaagagtt gaccaagatg ttttgaggca caatttcaac 120
ttcgacagag agttcgaaga attggaaatt gaagctgccc aagttaacga tagaccatct 180
ttcgttgata ggatcttgtc tttggagtac aagttgcact tcgaaaacaa gaatcacatg 240
gtttggttgt tgggtgcttt tgctgctgct gcaggtttgt tgtctggttt ggatcaatct 300
attatttccg gtgcctctat cggtatgaac aaggctttga atttgaccga aagagaagcc 360
tctttggtca gttctttgat gccattgggt gctatggctg gttctatgat tatgactcca 420
ttgaatgaat ggttcggccg taaatcctcc ttgattattt cttgtatttg gtacaccatc 480
ggttctgctt tgtgtgctgg tgctagagat catcacatga tgtatgctgg tagattcatc 540
ttaggtgttg gtgttggtat tgaaggtggt tgcgttggta tctacatttc tgaatctgtt 600
ccagccaatg tcagaggttc tatcgtttct atgtaccagt tcaacattgc cttgggtgaa 660
gttttgggtt atgctgttgc tgctattttc tacactgttc atggtggttg gaggtttatg 720
gttggttctt ctttggtttt ctccaccatt ttgtttgccg gcttgttttt tttgccagaa 780
tctccaagat ggttggtcca taagggtaga aatggtatgg cttacgatgt ttggaagaga 840
ttgagagata tcaacgatga atccgccaag ttggaattct tggaaatgag acaagctgcc 900
taccaagaaa gagaaagaag atctcaagag tccttgtttt cttcatgggg tgagttgttt 960
accattgcta gaaatagaag ggctttgacc tactccgtta ttatgattac tttgggtcag 1020
ttgactggtg ttaacgctgt tatgtattac atgtctactt tgatgggtgc catcggtttt 1080
aacgaaaagg attctgtttt catgtccttg gttggtggtg gttctttgtt gattggtact 1140
attccagcta tcttgtggat ggatagattc ggtagaagag tttggggtta caatttggtt 1200
ggttttttcg tcggtttggt attggtcggt gttggttata gattcaaccc agttactcaa 1260
aaggctgctt ctgaaggtgt ttatttgact ggtttgatcg tctacttctt gttcttcggt 1320
tcttactcta cattgacctg ggttattcca tccgaatctt tcgatttgag aaccagatct 1380
ttgggtatga ccatttgctc tactttcttg tacttgtggt ctttcactgt cacttacaac 1440
ttcactaaga tgtctgctgc tttcacttac acaggtttga ctttgggttt ttacggtggt 1500
attgctttct tgggtttgat ctaccaagtt tgctttatgc cagaaactaa ggacaagacc 1560
ttggaagaaa tcgatgacat ctttaacaga tccgctttct ctattgccag ggaaaacatt 1620
agcaacttga agaaaggtat ctggtaa 1647
<210> 51
<211> 1647
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 泛素-缺陷型 H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 GXF2/GAL2 (具有 K23R,K26R, K35R, K542R 和 K546R 突变)
<400> 51
atgtccgctg aacaagaaca acaagtttct ggtacttctg ccactattga tggtttggct 60
tctttgaggc aagaaaggac tgctgaagaa gaagatgctt ttaggccaaa accagctact 120
gcctacttct tcatttcttt cttgtgtggt ttggttgctt tcggtggtta cgtttttggt 180
tttgataccg gtactatctc cggtttcgtt aacatggatg attacttgat gagattcggt 240
caacaacatg ctgatggtac ttactacttg tccaatgtta gaaccggttt gatcgtcagt 300
attttcaaca ttggttgtgc tgttggtggt ttggcattgt ctaaagttgg tgatatttgg 360
ggtagaagaa tcggtattat ggttgccatg atcatctaca tggttggtat cattattcaa 420
atcgcctccc aagacaagtg gtatcaatac tttattggta gattgatcac cggtttgggt 480
gttggtacta cttctgtttt gtctcctttg ttcatttccg aatccgctcc aaaacatttg 540
agaggtactt tggtttgctg cttccaattg atggtaacct tgggtatttt cttgggttac 600
tgtactactt acggtactaa gaactacacc gattctagac aatggagaat tccattgggt 660
ttgtgttttg cttgggcctt gttgttgatt tctggtatgg tttttatgcc agaatcccca 720
agattcttga tcgaaagaca aagattcgat gaagctaagg cttctgttgc caagtctaat 780
caagtttcta ctgaagatcc agccgtttac actgaagttg aattgattca agccggtatt 840
gatagagaag ctttggctgg ttctgctggt tggaaagaat tgattactgg taagccaaag 900
atgttgcaaa gagtcatttt gggtatgatg ttacaatcca tccaacaatt gaccggtaac 960
aattacttct tctactacgg tacaaccatc ttcaaagctg ttggtatgtc cgattctttt 1020
caaacctcta tagtcttggg tatcgttaac ttcgcttcta cctttgttgg tatttgggcc 1080
attgaaagaa tgggtagaag atcttgtttg ttggttggtt cagcttgtat gtctgtttgc 1140
ttcttgatct actctatctt gggttcagtc aacttgtaca tcgatggtta cgaaaacact 1200
ccatctaaca ctagaaagcc aactggtaac gccatgattt tcattacctg tttgttcatc 1260
tttttcttcg cctctacttg ggctggtggt gtttattcta tagtttctga aacctaccca 1320
ttgagaatca gatctaaagg tatggctgtt gctactgctg ctaattggat gtggggtttt 1380
ttgatctctt tctttacccc attcatcacc tccgctattc atttttacta cggttttgtt 1440
ttcaccggtt gcttgatctt ctcattcttt tacgtattct ttttcgtccg tgaaactaag 1500
ggtttgtcct tggaagaagt tgacgaatta tacgctactg atttgccacc atggaaaact 1560
gcaggttgga ctccaccatc agctgaagat atggctcata caactggttt tgctgaagct 1620
gctaggccta caaacagaca cgtttga 1647
<210> 52
<211> 1635
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 泛素-缺陷型 H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 GXF1 (具有 K9R 和 K24R 突变)
<400> 52
atgtctcaag atgaattgca caccagatct ggtgttgaaa ctccaatcaa cgactccttg 60
ttggaagaaa gacatgatgt tactccattg gctgctttgc cagaaaaatc tttcaaggac 120
tacatctcca tctccatttt ctgtttgttt gttgctttcg gtggtttcgt tttcggtttt 180
gatactggta ctatttccgg tttcgttaac atgtctgatt tcaagactag gttcggtgaa 240
atgaatgctc agggtgaata ttacttgtcc aacgttagaa ctggcctgat ggtttctatt 300
ttcaatgttg gttgtgctgt cggtggtatt ttcttgtgta aaattgctga tgtctacggt 360
agaaggatcg gtttgatgtt ttctatggtt gtctacgttg tcggtatcat tattcaaatt 420
gcttctacca ccaagtggta tcagtacttc attggtagat tgattgctgg tttggctgtt 480
ggtactgttt ctgttatttc ccctttgttc atttccgaag ttgctccaaa acaattgaga 540
ggtactttgg tttgctgttt ccaattgtgt attaccttgg gtatcttctt gggttactgt 600
actacttacg gtactaagac ttacaccgat tctagacaat ggcgtattcc attgggtatt 660
tgttttgctt gggctttgtt tttggttgcc ggtatgttga atatgccaga atctccaaga 720
tacttggtcg aaaagtccag aattgatgat gccagaaagt ccattgctag gtctaacaaa 780
gtttccgaag aagatccagc tgtttacacc gaagttcaat tgattcaagc cggtattgat 840
agagaagctt tggctggttc tgctacttgg atggaattgg ttactggtaa gcctaagatc 900
tttagaagag ttatcatggg tgtcatgttg caatccttgc aacaattgac tggtgacaac 960
tactttttct actacggtac aaccattttc aaggctgtcg gtttacaaga ttctttccaa 1020
acctccatca ttttgggtat cgttaacttc gcttctacct tcgttggtat ctacgctatt 1080
gaaagaatgg gtagaagatt gtgtttgttg acaggttctg cttgtatgtt cgtttgcttc 1140
atcatctact cattgatcgg tactcagcac ttgtacaaaa acggtttttc taacgaaccc 1200
tccaacactt acaaaccatc tggtaatgcc atgatcttca ttacctgcct gtacattttc 1260
tttttcgctt caacttgggc tggtggtgtt tactgtatag tttctgaatc ttacccactg 1320
aggatcagat ctaaagctat gtctgttgct actgctgcaa attggatgtg gggttttttg 1380
atttctttct ttaccccatt catcacctcc gctatccatt tttactatgg ttttgttttc 1440
accggttgct tggctttctc tttcttttac gtttacttct tcgtcgtcga gactaagggt 1500
ttgtctttgg aagaggttga tatcttgtat gcctctggta ctttgccatg gaaatcttca 1560
ggttgggttc caccaactgc tgacgaaatg gctcataatg cttttgataa caaaccaacc 1620
gatgaacagg tttaa 1635
<210> 53
<211> 1632
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 泛素-缺陷型 H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 XYT1 (具有 K6R 和 S75L 突变)
<400> 53
atgggatacg aagagagatt agtggccccc gctttgaaat ttaagaactt tttggataag 60
accccaaata tacataacgt ttacgtaatt gcggcgatct cgtgtacctc aggtatgatg 120
ttcggtttcg atatatcgtc gatgtccgtg ttcgtggacc aacagccgta tttaaaaatg 180
tttgataacc ctagcagcgt gatacaaggg tttataactg cgttgatgtc tttggggagc 240
tttttcggat cgctaacgtc cacttttatt tcagaacctt ttggtagacg tgcctctttg 300
ttcatatgcg ggatcctttg ggtaattggg gcggcagttc aaagttcttc tcagaaccgt 360
gcgcagctta tttgtggccg aattattgca gggtggggca tcggattcgg ttctagcgtt 420
gcgccggtat acggttcaga aatggcccca cgcaaaatta gaggaacaat cggaggtatt 480
tttcaatttt ctgtcacggt cggaatattc ataatgttcc tgattggcta cggctgctca 540
tttatacaag gcaaggccag ttttagaatt ccgtggggag ttcaaatggt accaggtctc 600
attctgttga tcggactatt cttcattcct gaatccccaa gatggttagc caaacaaggc 660
tactgggaag acgctgagat catcgtagca aacgttcaag ctaagggtaa caggaacgat 720
gctaatgtgc aaattgaaat gtccgagata aaagatcagt taatgcttga cgagcattta 780
aaggagttta cttatgccga tttgtttacc aaaaaatacc ggcaaaggac gataacagct 840
atatttgccc aaatatggca acagctgaca ggtatgaatg tcatgatgta ctacatcgta 900
tatatatttc aaatggcagg ttattcaggt aatactaatt tagttccttc actcattcag 960
tatattataa atatggctgt tacggtcccc gcattgttct gtcttgatct gcttggcagg 1020
aggacaattt tattagctgg cgccgctttt atgatggcct ggcaatttgg tgttgctggc 1080
attttagcta cttattcaga gccagcctat atttcagata ccgtgagaat tacaattcca 1140
gatgaccata aaagtgccgc taagggtgtc atcgcttgct gctatttgtt tgtttgttcc 1200
ttcgcctttt cctggggtgt aggtatctgg gtttattgtt cagaagtgtg gggtgatagt 1260
caatccagac aaagaggtgc tgcattggca acttctgcta attggatctt caatttcgca 1320
attgcaatgt ttacaccttc ttctttcaaa aatatcactt ggaagactta tatcatttat 1380
gctacatttt gtgcttgtat gttcattcat gttttttttt ttttccctga aacaaagggt 1440
aagagactag aagaaattgg acagctatgg gatgaaggtg tcccagcatg gagatctgca 1500
aaatggcaac ccactgtccc actagcaagt gacgctgaat tagctcacaa aatggatgtt 1560
gcacacgctg aacacgcaga cttattggca acccattctc caagtagtga cgaaaaaact 1620
ggtaccgttt aa 1632
<210> 54
<211> 544
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 泛素-缺陷型 H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 Gxf1p (具有 K9R; K24R,K538R 突变)
<400> 54
Met Ser Gln Asp Glu Leu His Thr Arg Ser Gly Val Glu Thr Pro Ile
1 5 10 15
Asn Asp Ser Leu Leu Glu Glu Arg His Asp Val Thr Pro Leu Ala Ala
20 25 30
Leu Pro Glu Lys Ser Phe Lys Asp Tyr Ile Ser Ile Ser Ile Phe Cys
35 40 45
Leu Phe Val Ala Phe Gly Gly Phe Val Phe Gly Phe Asp Thr Gly Thr
50 55 60
Ile Ser Gly Phe Val Asn Met Ser Asp Phe Lys Thr Arg Phe Gly Glu
65 70 75 80
Met Asn Ala Gln Gly Glu Tyr Tyr Leu Ser Asn Val Arg Thr Gly Leu
85 90 95
Met Val Ser Ile Phe Asn Val Gly Cys Ala Val Gly Gly Ile Phe Leu
100 105 110
Cys Lys Ile Ala Asp Val Tyr Gly Arg Arg Ile Gly Leu Met Phe Ser
115 120 125
Met Val Val Tyr Val Val Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ala Ser Thr Thr
130 135 140
Lys Trp Tyr Gln Tyr Phe Ile Gly Arg Leu Ile Ala Gly Leu Ala Val
145 150 155 160
Gly Thr Val Ser Val Ile Ser Pro Leu Phe Ile Ser Glu Val Ala Pro
165 170 175
Lys Gln Leu Arg Gly Thr Leu Val Cys Cys Phe Gln Leu Cys Ile Thr
180 185 190
Leu Gly Ile Phe Leu Gly Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Thr Lys Thr Tyr
195 200 205
Thr Asp Ser Arg Gln Trp Arg Ile Pro Leu Gly Ile Cys Phe Ala Trp
210 215 220
Ala Leu Phe Leu Val Ala Gly Met Leu Asn Met Pro Glu Ser Pro Arg
225 230 235 240
Tyr Leu Val Glu Lys Ser Arg Ile Asp Asp Ala Arg Lys Ser Ile Ala
245 250 255
Arg Ser Asn Lys Val Ser Glu Glu Asp Pro Ala Val Tyr Thr Glu Val
260 265 270
Gln Leu Ile Gln Ala Gly Ile Asp Arg Glu Ala Leu Ala Gly Ser Ala
275 280 285
Thr Trp Met Glu Leu Val Thr Gly Lys Pro Lys Ile Phe Arg Arg Val
290 295 300
Ile Met Gly Val Met Leu Gln Ser Leu Gln Gln Leu Thr Gly Asp Asn
305 310 315 320
Tyr Phe Phe Tyr Tyr Gly Thr Thr Ile Phe Lys Ala Val Gly Leu Gln
325 330 335
Asp Ser Phe Gln Thr Ser Ile Ile Leu Gly Ile Val Asn Phe Ala Ser
340 345 350
Thr Phe Val Gly Ile Tyr Ala Ile Glu Arg Met Gly Arg Arg Leu Cys
355 360 365
Leu Leu Thr Gly Ser Ala Cys Met Phe Val Cys Phe Ile Ile Tyr Ser
370 375 380
Leu Ile Gly Thr Gln His Leu Tyr Lys Asn Gly Phe Ser Asn Glu Pro
385 390 395 400
Ser Asn Thr Tyr Lys Pro Ser Gly Asn Ala Met Ile Phe Ile Thr Cys
405 410 415
Leu Tyr Ile Phe Phe Phe Ala Ser Thr Trp Ala Gly Gly Val Tyr Cys
420 425 430
Ile Val Ser Glu Ser Tyr Pro Leu Arg Ile Arg Ser Lys Ala Met Ser
435 440 445
Val Ala Thr Ala Ala Asn Trp Met Trp Gly Phe Leu Ile Ser Phe Phe
450 455 460
Thr Pro Phe Ile Thr Ser Ala Ile His Phe Tyr Tyr Gly Phe Val Phe
465 470 475 480
Thr Gly Cys Leu Ala Phe Ser Phe Phe Tyr Val Tyr Phe Phe Val Val
485 490 495
Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu Glu Glu Val Asp Ile Leu Tyr Ala Ser
500 505 510
Gly Thr Leu Pro Trp Lys Ser Ser Gly Trp Val Pro Pro Thr Ala Asp
515 520 525
Glu Met Ala His Asn Ala Phe Asp Asn Arg Pro Thr Asp Glu Gln Val
530 535 540
<210> 55
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 泛素-缺陷型 H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 Xyt1p (具有 K6R, S75L,K517R, K539R 突变)
<400> 55
Met Gly Tyr Glu Glu Arg Leu Val Ala Pro Ala Leu Lys Phe Lys Asn
1 5 10 15
Phe Leu Asp Lys Thr Pro Asn Ile His Asn Val Tyr Val Ile Ala Ala
20 25 30
Ile Ser Cys Thr Ser Gly Met Met Phe Gly Phe Asp Ile Ser Ser Met
35 40 45
Ser Val Phe Val Asp Gln Gln Pro Tyr Leu Lys Met Phe Asp Asn Pro
50 55 60
Ser Ser Val Ile Gln Gly Phe Ile Thr Ala Leu Met Ser Leu Gly Ser
65 70 75 80
Phe Phe Gly Ser Leu Thr Ser Thr Phe Ile Ser Glu Pro Phe Gly Arg
85 90 95
Arg Ala Ser Leu Phe Ile Cys Gly Ile Leu Trp Val Ile Gly Ala Ala
100 105 110
Val Gln Ser Ser Ser Gln Asn Arg Ala Gln Leu Ile Cys Gly Arg Ile
115 120 125
Ile Ala Gly Trp Gly Ile Gly Phe Gly Ser Ser Val Ala Pro Val Tyr
130 135 140
Gly Ser Glu Met Ala Pro Arg Lys Ile Arg Gly Thr Ile Gly Gly Ile
145 150 155 160
Phe Gln Phe Ser Val Thr Val Gly Ile Phe Ile Met Phe Leu Ile Gly
165 170 175
Tyr Gly Cys Ser Phe Ile Gln Gly Lys Ala Ser Phe Arg Ile Pro Trp
180 185 190
Gly Val Gln Met Val Pro Gly Leu Ile Leu Leu Ile Gly Leu Phe Phe
195 200 205
Ile Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Ala Lys Gln Gly Tyr Trp Glu Asp
210 215 220
Ala Glu Ile Ile Val Ala Asn Val Gln Ala Lys Gly Asn Arg Asn Asp
225 230 235 240
Ala Asn Val Gln Ile Glu Met Ser Glu Ile Lys Asp Gln Leu Met Leu
245 250 255
Asp Glu His Leu Lys Glu Phe Thr Tyr Ala Asp Leu Phe Thr Lys Lys
260 265 270
Tyr Arg Gln Arg Thr Ile Thr Ala Ile Phe Ala Gln Ile Trp Gln Gln
275 280 285
Leu Thr Gly Met Asn Val Met Met Tyr Tyr Ile Val Tyr Ile Phe Gln
290 295 300
Met Ala Gly Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Leu Val Pro Ser Leu Ile Gln
305 310 315 320
Tyr Ile Ile Asn Met Ala Val Thr Val Pro Ala Leu Phe Cys Leu Asp
325 330 335
Leu Leu Gly Arg Arg Thr Ile Leu Leu Ala Gly Ala Ala Phe Met Met
340 345 350
Ala Trp Gln Phe Gly Val Ala Gly Ile Leu Ala Thr Tyr Ser Glu Pro
355 360 365
Ala Tyr Ile Ser Asp Thr Val Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asp His Lys
370 375 380
Ser Ala Ala Lys Gly Val Ile Ala Cys Cys Tyr Leu Phe Val Cys Ser
385 390 395 400
Phe Ala Phe Ser Trp Gly Val Gly Ile Trp Val Tyr Cys Ser Glu Val
405 410 415
Trp Gly Asp Ser Gln Ser Arg Gln Arg Gly Ala Ala Leu Ala Thr Ser
420 425 430
Ala Asn Trp Ile Phe Asn Phe Ala Ile Ala Met Phe Thr Pro Ser Ser
435 440 445
Phe Lys Asn Ile Thr Trp Lys Thr Tyr Ile Ile Tyr Ala Thr Phe Cys
450 455 460
Ala Cys Met Phe Ile His Val Phe Phe Phe Phe Pro Glu Thr Lys Gly
465 470 475 480
Lys Arg Leu Glu Glu Ile Gly Gln Leu Trp Asp Glu Gly Val Pro Ala
485 490 495
Trp Arg Ser Ala Lys Trp Gln Pro Thr Val Pro Leu Ala Ser Asp Ala
500 505 510
Glu Leu Ala His Arg Met Asp Val Ala His Ala Glu His Ala Asp Leu
515 520 525
Leu Ala Thr His Ser Pro Ser Ser Asp Glu Arg Thr Gly Thr Val
530 535 540
<210> 56
<211> 1635
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 泛素-缺陷型 H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 GXF1 (具有 K9R; K24R,K538R 突变)
<400> 56
atgtctcaag atgaattgca caccagatct ggtgttgaaa ctccaatcaa cgactccttg 60
ttggaagaaa gacatgatgt tactccattg gctgctttgc cagaaaaatc tttcaaggac 120
tacatctcca tctccatttt ctgtttgttt gttgctttcg gtggtttcgt tttcggtttt 180
gatactggta ctatttccgg tttcgttaac atgtctgatt tcaagactag gttcggtgaa 240
atgaatgctc agggtgaata ttacttgtcc aacgttagaa ctggcctgat ggtttctatt 300
ttcaatgttg gttgtgctgt cggtggtatt ttcttgtgta aaattgctga tgtctacggt 360
agaaggatcg gtttgatgtt ttctatggtt gtctacgttg tcggtatcat tattcaaatt 420
gcttctacca ccaagtggta tcagtacttc attggtagat tgattgctgg tttggctgtt 480
ggtactgttt ctgttatttc ccctttgttc atttccgaag ttgctccaaa acaattgaga 540
ggtactttgg tttgctgttt ccaattgtgt attaccttgg gtatcttctt gggttactgt 600
actacttacg gtactaagac ttacaccgat tctagacaat ggcgtattcc attgggtatt 660
tgttttgctt gggctttgtt tttggttgcc ggtatgttga atatgccaga atctccaaga 720
tacttggtcg aaaagtccag aattgatgat gccagaaagt ccattgctag gtctaacaaa 780
gtttccgaag aagatccagc tgtttacacc gaagttcaat tgattcaagc cggtattgat 840
agagaagctt tggctggttc tgctacttgg atggaattgg ttactggtaa gcctaagatc 900
tttagaagag ttatcatggg tgtcatgttg caatccttgc aacaattgac tggtgacaac 960
tactttttct actacggtac aaccattttc aaggctgtcg gtttacaaga ttctttccaa 1020
acctccatca ttttgggtat cgttaacttc gcttctacct tcgttggtat ctacgctatt 1080
gaaagaatgg gtagaagatt gtgtttgttg acaggttctg cttgtatgtt cgtttgcttc 1140
atcatctact cattgatcgg tactcagcac ttgtacaaaa acggtttttc taacgaaccc 1200
tccaacactt acaaaccatc tggtaatgcc atgatcttca ttacctgcct gtacattttc 1260
tttttcgctt caacttgggc tggtggtgtt tactgtatag tttctgaatc ttacccactg 1320
aggatcagat ctaaagctat gtctgttgct actgctgcaa attggatgtg gggttttttg 1380
atttctttct ttaccccatt catcacctcc gctatccatt tttactatgg ttttgttttc 1440
accggttgct tggctttctc tttcttttac gtttacttct tcgtcgtcga gactaagggt 1500
ttgtctttgg aagaggttga tatcttgtat gcctctggta ctttgccatg gaaatcttca 1560
ggttgggttc caccaactgc tgacgaaatg gctcataatg cttttgataa cagaccaacc 1620
gatgaacagg tttaa 1635
<210> 57
<211> 1632
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 泛素-缺陷型 H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 XYT1 (具有 K6R, S75L,K517R, K539R 突变)
<400> 57
atgggatacg aagagagatt agtggccccc gctttgaaat ttaagaactt tttggataag 60
accccaaata tacataacgt ttacgtaatt gcggcgatct cgtgtacctc aggtatgatg 120
ttcggtttcg atatatcgtc gatgtccgtg ttcgtggacc aacagccgta tttaaaaatg 180
tttgataacc ctagcagcgt gatacaaggg tttataactg cgttgatgtc tttggggagc 240
tttttcggat cgctaacgtc cacttttatt tcagaacctt ttggtagacg tgcctctttg 300
ttcatatgcg ggatcctttg ggtaattggg gcggcagttc aaagttcttc tcagaaccgt 360
gcgcagctta tttgtggccg aattattgca gggtggggca tcggattcgg ttctagcgtt 420
gcgccggtat acggttcaga aatggcccca cgcaaaatta gaggaacaat cggaggtatt 480
tttcaatttt ctgtcacggt cggaatattc ataatgttcc tgattggcta cggctgctca 540
tttatacaag gcaaggccag ttttagaatt ccgtggggag ttcaaatggt accaggtctc 600
attctgttga tcggactatt cttcattcct gaatccccaa gatggttagc caaacaaggc 660
tactgggaag acgctgagat catcgtagca aacgttcaag ctaagggtaa caggaacgat 720
gctaatgtgc aaattgaaat gtccgagata aaagatcagt taatgcttga cgagcattta 780
aaggagttta cttatgccga tttgtttacc aaaaaatacc ggcaaaggac gataacagct 840
atatttgccc aaatatggca acagctgaca ggtatgaatg tcatgatgta ctacatcgta 900
tatatatttc aaatggcagg ttattcaggt aatactaatt tagttccttc actcattcag 960
tatattataa atatggctgt tacggtcccc gcattgttct gtcttgatct gcttggcagg 1020
aggacaattt tattagctgg cgccgctttt atgatggcct ggcaatttgg tgttgctggc 1080
attttagcta cttattcaga gccagcctat atttcagata ccgtgagaat tacaattcca 1140
gatgaccata aaagtgccgc taagggtgtc atcgcttgct gctatttgtt tgtttgttcc 1200
ttcgcctttt cctggggtgt aggtatctgg gtttattgtt cagaagtgtg gggtgatagt 1260
caatccagac aaagaggtgc tgcattggca acttctgcta attggatctt caatttcgca 1320
attgcaatgt ttacaccttc ttctttcaaa aatatcactt ggaagactta tatcatttat 1380
gctacatttt gtgcttgtat gttcattcat gttttttttt ttttccctga aacaaagggt 1440
aagagactag aagaaattgg acagctatgg gatgaaggtg tcccagcatg gagatctgca 1500
aaatggcaac ccactgtccc actagcaagt gacgctgaat tagctcacag aatggatgtt 1560
gcacacgctg aacacgcaga cttattggca acccattctc caagtagtga cgaaagaact 1620
ggtaccgttt aa 1632
<210> 58
<211> 548
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 泛素-缺陷型 H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 Gxf2p/Gal2p (具有 K23R,K26R, 和 K35R 突变)
<400> 58
Met Ser Ala Glu Gln Glu Gln Gln Val Ser Gly Thr Ser Ala Thr Ile
1 5 10 15
Asp Gly Leu Ala Ser Leu Arg Gln Glu Arg Thr Ala Glu Glu Glu Asp
20 25 30
Ala Phe Arg Pro Lys Pro Ala Thr Ala Tyr Phe Phe Ile Ser Phe Leu
35 40 45
Cys Gly Leu Val Ala Phe Gly Gly Tyr Val Phe Gly Phe Asp Thr Gly
50 55 60
Thr Ile Ser Gly Phe Val Asn Met Asp Asp Tyr Leu Met Arg Phe Gly
65 70 75 80
Gln Gln His Ala Asp Gly Thr Tyr Tyr Leu Ser Asn Val Arg Thr Gly
85 90 95
Leu Ile Val Ser Ile Phe Asn Ile Gly Cys Ala Val Gly Gly Leu Ala
100 105 110
Leu Ser Lys Val Gly Asp Ile Trp Gly Arg Arg Ile Gly Ile Met Val
115 120 125
Ala Met Ile Ile Tyr Met Val Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ala Ser Gln
130 135 140
Asp Lys Trp Tyr Gln Tyr Phe Ile Gly Arg Leu Ile Thr Gly Leu Gly
145 150 155 160
Val Gly Thr Thr Ser Val Leu Ser Pro Leu Phe Ile Ser Glu Ser Ala
165 170 175
Pro Lys His Leu Arg Gly Thr Leu Val Cys Cys Phe Gln Leu Met Val
180 185 190
Thr Leu Gly Ile Phe Leu Gly Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Thr Lys Asn
195 200 205
Tyr Thr Asp Ser Arg Gln Trp Arg Ile Pro Leu Gly Leu Cys Phe Ala
210 215 220
Trp Ala Leu Leu Leu Ile Ser Gly Met Val Phe Met Pro Glu Ser Pro
225 230 235 240
Arg Phe Leu Ile Glu Arg Gln Arg Phe Asp Glu Ala Lys Ala Ser Val
245 250 255
Ala Lys Ser Asn Gln Val Ser Thr Glu Asp Pro Ala Val Tyr Thr Glu
260 265 270
Val Glu Leu Ile Gln Ala Gly Ile Asp Arg Glu Ala Leu Ala Gly Ser
275 280 285
Ala Gly Trp Lys Glu Leu Ile Thr Gly Lys Pro Lys Met Leu Gln Arg
290 295 300
Val Ile Leu Gly Met Met Leu Gln Ser Ile Gln Gln Leu Thr Gly Asn
305 310 315 320
Asn Tyr Phe Phe Tyr Tyr Gly Thr Thr Ile Phe Lys Ala Val Gly Met
325 330 335
Ser Asp Ser Phe Gln Thr Ser Ile Val Leu Gly Ile Val Asn Phe Ala
340 345 350
Ser Thr Phe Val Gly Ile Trp Ala Ile Glu Arg Met Gly Arg Arg Ser
355 360 365
Cys Leu Leu Val Gly Ser Ala Cys Met Ser Val Cys Phe Leu Ile Tyr
370 375 380
Ser Ile Leu Gly Ser Val Asn Leu Tyr Ile Asp Gly Tyr Glu Asn Thr
385 390 395 400
Pro Ser Asn Thr Arg Lys Pro Thr Gly Asn Ala Met Ile Phe Ile Thr
405 410 415
Cys Leu Phe Ile Phe Phe Phe Ala Ser Thr Trp Ala Gly Gly Val Tyr
420 425 430
Ser Ile Val Ser Glu Thr Tyr Pro Leu Arg Ile Arg Ser Lys Gly Met
435 440 445
Ala Val Ala Thr Ala Ala Asn Trp Met Trp Gly Phe Leu Ile Ser Phe
450 455 460
Phe Thr Pro Phe Ile Thr Ser Ala Ile His Phe Tyr Tyr Gly Phe Val
465 470 475 480
Phe Thr Gly Cys Leu Ile Phe Ser Phe Phe Tyr Val Phe Phe Phe Val
485 490 495
Arg Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu Glu Glu Val Asp Glu Leu Tyr Ala
500 505 510
Thr Asp Leu Pro Pro Trp Lys Thr Ala Gly Trp Thr Pro Pro Ser Ala
515 520 525
Glu Asp Met Ala His Thr Thr Gly Phe Ala Glu Ala Ala Lys Pro Thr
530 535 540
Asn Lys His Val
545
<210> 59
<211> 1647
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 泛素-缺陷型 H0 梅奇酵母（Metschnikowia） 种 Gxf2p/Gal2p (具有 K23R,K26R, 和 K35R 突变)
<400> 59
atgtccgctg aacaagaaca acaagtttct ggtacttctg ccactattga tggtttggct 60
tctttgaggc aagaaaggac tgctgaagaa gaagatgctt ttaggccaaa accagctact 120
gcctacttct tcatttcttt cttgtgtggt ttggttgctt tcggtggtta cgtttttggt 180
tttgataccg gtactatctc cggtttcgtt aacatggatg attacttgat gagattcggt 240
caacaacatg ctgatggtac ttactacttg tccaatgtta gaaccggttt gatcgtcagt 300
attttcaaca ttggttgtgc tgttggtggt ttggcattgt ctaaagttgg tgatatttgg 360
ggtagaagaa tcggtattat ggttgccatg atcatctaca tggttggtat cattattcaa 420
atcgcctccc aagacaagtg gtatcaatac tttattggta gattgatcac cggtttgggt 480
gttggtacta cttctgtttt gtctcctttg ttcatttccg aatccgctcc aaaacatttg 540
agaggtactt tggtttgctg cttccaattg atggtaacct tgggtatttt cttgggttac 600
tgtactactt acggtactaa gaactacacc gattctagac aatggagaat tccattgggt 660
ttgtgttttg cttgggcctt gttgttgatt tctggtatgg tttttatgcc agaatcccca 720
agattcttga tcgaaagaca aagattcgat gaagctaagg cttctgttgc caagtctaat 780
caagtttcta ctgaagatcc agccgtttac actgaagttg aattgattca agccggtatt 840
gatagagaag ctttggctgg ttctgctggt tggaaagaat tgattactgg taagccaaag 900
atgttgcaaa gagtcatttt gggtatgatg ttacaatcca tccaacaatt gaccggtaac 960
aattacttct tctactacgg tacaaccatc ttcaaagctg ttggtatgtc cgattctttt 1020
caaacctcta tagtcttggg tatcgttaac ttcgcttcta cctttgttgg tatttgggcc 1080
attgaaagaa tgggtagaag atcttgtttg ttggttggtt cagcttgtat gtctgtttgc 1140
ttcttgatct actctatctt gggttcagtc aacttgtaca tcgatggtta cgaaaacact 1200
ccatctaaca ctagaaagcc aactggtaac gccatgattt tcattacctg tttgttcatc 1260
tttttcttcg cctctacttg ggctggtggt gtttattcta tagtttctga aacctaccca 1320
ttgagaatca gatctaaagg tatggctgtt gctactgctg ctaattggat gtggggtttt 1380
ttgatctctt tctttacccc attcatcacc tccgctattc atttttacta cggttttgtt 1440
ttcaccggtt gcttgatctt ctcattcttt tacgtattct ttttcgtccg tgaaactaag 1500
ggtttgtcct tggaagaagt tgacgaatta tacgctactg atttgccacc atggaaaact 1560
gcaggttgga ctccaccatc agctgaagat atggctcata caactggttt tgctgaagct 1620
gctaagccta caaacaaaca cgtttga 1647

Claims (48)

1.包含至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白具有至少89％的同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物，其包括编码至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个或者至少七个木糖转运蛋白的外源核酸。
3.根据权利要求1或2所述的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与所述梅奇酵母木糖转运蛋白具有至少90％，至少95％，至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白是梅奇酵母木糖转运蛋白。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述梅奇酵母木糖转运蛋白选自Xyt1p、Gxf1p、ΔGxf1p、Gxf2p/Gal2p、Gxs1p/Hgt12p、ΔGxs1p/ΔHgt12p、Hxt5p、Hxt2.6p、Qup2p和Aps1p/Hgt19p。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述梅奇酵母木糖转运蛋白来自H0梅奇酵母种。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述梅奇酵母木糖转运蛋白具有选自SEQ ID NO：1-5和7-12的氨基酸序列。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含外源核酸，所述外源核酸选自SEQ ID NO：13-17和19-27。
9.根据权利要求7所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物具有至少一个编码SEQID NO：1的外源核酸。
10.根据权利要求7所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物具有至少一个编码SEQ ID NO：12的外源核酸。
11.根据权利要求1-6中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白是泛素-缺陷型的。
12.根据权利要求11所述的非天然存在的微生物，其中所述梅奇酵母木糖转运蛋白在至少两个赖氨酸残基处具有氨基酸替代。
13.根据权利要求11所述的非天然存在的微生物，其中所述梅奇酵母木糖转运蛋白具有SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述外源核酸是密码子-优化的以在所述微生物中产生所述木糖转运蛋白。
15.包含至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1p具有至少74％的同一性的氨基酸序列。
16.包含至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf1p具有至少85％的同一性的氨基酸序列。
17.包含至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)种的ΔGxf1p具有至少89％的同一性的氨基酸序列。
18.包含至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxf2p/Gal2p具有至少71％的同一性的氨基酸序列。
19.包含至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)种的Gxs1p/Hgt12p具有至少71％的同一性的氨基酸序列。
20.包含至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt5p具有至少60％的同一性的氨基酸序列。
21.包含至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)种的Hxt2.6p具有至少84％的同一性的氨基酸序列。
22.包含至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)种的Qup2p具有至少50％的同一性的氨基酸序列。
23.包含至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述木糖转运蛋白具有与梅奇酵母(Metschnikowia)种的Aps1p/Hgt19p具有至少74％的同一性的氨基酸序列。
24.根据权利要求15-23中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述梅奇酵母木糖转运蛋白来自H0梅奇酵母种。
25.根据权利要求1-23中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
26.根据权利要求1-23中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物处于好氧培养基中。
27.根据权利要求1-23中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物处于基本厌氧培养基中。
28.根据权利要求1-23中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物是细菌或酵母种。
29.根据权利要求28所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物是酵母种，其选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、白假丝酵母(Candida albicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、汉氏德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、米根霉(Rhizobus oryzae)、里氏木霉(Trichodermareesei)和解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)。
30.根据权利要求29所述的非天然存在的微生物，其中所述酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
31.根据权利要求29所述的非天然存在的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有至少一个编码SEQ ID NO：1的外源核酸。
32.根据权利要求29所述的非天然存在的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有至少一个编码SEQ ID NO：12的外源核酸。
33.根据权利要求29所述的非天然存在的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有SEQ ID NO：21所示的外源核酸。
34.根据权利要求29所述的非天然存在的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有SEQ ID NO：27所示的外源核酸。
35.根据权利要求28所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物是细菌种，其选自大肠杆菌(Escherichia coli)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)、产琥珀酸曼海姆氏菌(Mannheimia succiniciproducens)、菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、乳发酵短杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、醋酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridiumacetobutylicum)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物还包括能够从木糖产生生物衍生化合物的代谢途径。
37.根据权利要求36所述的非天然存在的微生物，其中所述生物衍生化合物选自木糖醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、异丙醇、阿糖醇、乙酸乙酯、苯基-乙醇、2-甲基-丁醇和3-甲基-丁醇。
38.产生生物衍生化合物的方法，其包括：
将权利要求36或37所述的非天然存在的微生物在一定条件下培养足够的一段时间以产生所述生物衍生化合物，和
其中所述微生物包括能够从木糖产生生物衍生化合物的途径。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述条件包括在包含木糖和选自纤维二糖、半纤维素、甘油、半乳糖和葡萄糖或它们的组合的共基质的培养基中培养所述微生物。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述共基质为葡萄糖。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述培养包括分批培养、补料-分批培养或连续培养。
42.根据权利要求38-41中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将所述生物衍生化合物与培养物中的其它组分分离。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述分离包括提取、连续液-液萃取、渗透气化、膜滤法、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、提取过滤、离子交换色谱、吸附色谱或超滤。
44.通过根据权利要求38-43中任一项所述的方法所产生的生物衍生化合物。
45.根据权利要求44所述的生物衍生化合物作为杂质包括甘油、乙醛、乙酸酯、甘油醛或它们的组合。
46.包括根据权利要求44或45所述的生物衍生木糖醇的组合物。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述组合物是培养基。
48.根据权利要求47所述的组合物，其中所述组合物是从中已除去了所述微生物的培养基。
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