CN109415446A

CN109415446A - 用于提高靶mRNA的蛋白质表达水平的融合蛋白

Info

Publication number: CN109415446A
Application number: CN201780041619.9A
Authority: CN
Inventors: 中村崇裕; 八木祐介
Original assignee: Kyushu University NUC
Current assignee: Kyushu University NUC
Priority date: 2016-06-03
Filing date: 2017-05-30
Publication date: 2019-03-01
Anticipated expiration: 2037-05-30
Also published as: EP3466978A4; EP3466978A1; CN109415446B; JPWO2017209122A1; BR112018075010A2; EP3466978B1; US20190309029A1; PT3466978T; ES2874230T3; DK3466978T3; JP6928386B2; US11136361B2

Abstract

本发明解决了开发用于控制靶RNA的方法的问题。提供了融合蛋白，其包含：提高mRNA的蛋白质表达的功能结构域；和对于靶mRNA而言，能够选择性结合RNA碱基或特异性结合RNA碱基序列的PPR蛋白。

Description

用于提高靶mRNA的蛋白质表达水平的融合蛋白

技术领域

本发明涉及用于提高靶mRNA的蛋白质表达水平的融合蛋白。

背景技术

近年来建立并使用了通过多种分析显示的结合核酸的蛋白质因子与目的序列结合的技术。使用这种序列特异性结合在一定程度上能够除去靶DNA序列或能够调节(激活或失活)靶DNA序列下游存在的编码蛋白质的基因的表达。

虽然已知锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应核酸酶(TAL effector nuclease，TALEN)、Crispr-cas9等作为使用作用于DNA的蛋白质因子的技术，但使用特异性作用于RNA的蛋白质因子的技术的开发仍然是有限的。

本发明人已经提出了利用PPR蛋白(具有一个或更多个五肽重复区(pentatricopeptide repeat，PPR)基序的蛋白质)的特性设计可以特异性结合靶RNA序列的蛋白质的方法，所述PPR蛋白是主要存在于植物中的蛋白质(专利文献1)。

[引用列表]

[专利文献]

[专利文献1]

WO2013/058404

[发明内容]

[技术问题]

在根据专利文献1的公开内容中，鉴定了当PPR基序表现出RNA结合特性时起作用的氨基酸，并且显示了PPR基序的结构与靶碱基之间的关系，从而能够构建具有一个或更多个PPR基序并且可以与具有任何序列和长度的RNA结合的蛋白质。然而，尚未发现使用根据专利文献1的技术实际调节靶RNA的方法。

[问题的解决方案]

作为对使用PPR蛋白提高靶mRNA的蛋白质表达水平的方法的广泛研究的结果，本发明人发现预定功能结构域和PPR蛋白的融合蛋白提高了靶mRNA的蛋白质表达水平，并已经完成了本发明。

具体地，本发明的一个实施方案涉及用于提高靶mRNA的蛋白质表达水平的融合蛋白，所述融合蛋白包含：

(A)一种或更多种提高mRNA的蛋白质表达水平的功能结构域；和

(B)可以以RNA碱基选择性或RNA碱基序列特异性方式与靶mRNA结合的多肽部分，

其中多肽部分(B)是包含一个或更多个PPR基序的多肽部分，每个PPR基序包含长度上由30至38个氨基酸组成并且由式1表示的多肽：

[式1]

(螺旋A)-X-(螺旋B)-L (式1)

其中

螺旋A是长度上由12个氨基酸组成并且可以形成α-螺旋结构的部分，并且由式2表示：

[式2]

A₁-A₂-A₃-A₄-A₅-A₆-A₇-A₈-A₉-A₁₀-A₁₁-A₁₂ (式2)

其中A₁至A₁₂各自独立地表示氨基酸；

X不存在，或者是长度上由1至9个氨基酸组成的部分；

螺旋B是长度上由11至13个氨基酸组成并且可以形成α-螺旋结构的部分；

L是长度上由2至7个氨基酸组成并且由式3表示的部分：

[式3]

L_vli-L_vi-L_v-L_iv-L_iii-L_ii-L_i (式3)

其中所述氨基酸从C端起编号为“i”(-1)、“ii”(-2)、……并且L_iii至L_vii可以不存在，并且

三个氨基酸A₁、A₄和L_ii的组合或两个氨基酸A₄和L_ii的组合对应于所述靶mRNA的碱基或碱基序列。

在根据本发明的一个实施方案中，多肽部分(B)包含2至30个PPR基序，并且多个PPR基序被布置成特异性结合靶mRNA的碱基序列。

此外，在根据本发明的一个实施方案中，多肽部分(B)包含5至25个PPR基序。

此外，在根据本发明的一个实施方案中，一个或更多个功能结构域(A)各自结合至多肽部分(B)的N端侧和/或C端侧。

此外，在根据本发明的一个实施方案中，一个或更多个功能结构域(A)选自将核糖体引导至所述mRNA的结构域、与所述mRNA的翻译的起始或促进相关的结构域、与所述mRNA的核输出相关的结构域、与和内质网膜的结合相关的结构域、包含内质网驻留信号(ER驻留信号)序列的结构域和包含内质网信号序列的结构域。

此外，在根据本发明的一个实施方案中，所述将核糖体引导至所述mRNA的结构域是包含选自以下的多肽的全部或功能性部分的结构域：DENR(Density-regulatedprotein，密度调节蛋白)、MCT-1(Malignant T-cell amplified sequence 1，恶性T细胞扩增序列1)、TPT1(Translationally-controlled tumor protein，翻译控制的肿瘤蛋白)和Lerepo4(Zinc finger CCCH-domain，锌指CCCH结构域)，

所述与所述mRNA的翻译的起始或促进相关的结构域是包含选自以下的多肽的全部或功能性部分的结构域：eIF4E和eIF4G，

所述与所述mRNA的核输出相关的结构域是包含SLBP(Stem-loop bindingprotein，茎-环结合蛋白)的全部或功能性部分的结构域，

所述与和内质网膜的结合相关的结构域是包含选自以下的多肽的全部或功能性部分的结构域：SEC61B、TRAP-α(Translocon associated protein alpha，易位子相关蛋白α)、SR-α、Dial(Cytochrome b5 reductase 3，细胞色素b5还原酶3)和p180，

所述内质网驻留信号(ER驻留信号)序列是包含KDEL(KEEL)序列的信号序列，或者

所述内质网信号序列是包含MGWSCIILFLVATATGAHS(SEQ ID NO：22)的信号序列。

此外，在根据本发明的一个实施方案中，每个所述PPR基序中所述三个氨基酸A₁、A₄和L_ii的组合是：

如果所述PPR基序的靶碱基是A(腺嘌呤)，则按照(A₁，A₄，L_ii)的顺序为(缬氨酸，苏氨酸，天冬酰胺)、(苯丙氨酸，丝氨酸，天冬酰胺)、(苯丙氨酸，苏氨酸，天冬酰胺)、(异亮氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸)或(苏氨酸，苏氨酸，天冬酰胺)；

如果所述PPR基序的靶碱基是G(鸟嘌呤)，则按照(A₁，A₄，L_ii)的顺序为(谷氨酸，甘氨酸，天冬氨酸)、(缬氨酸，苏氨酸，天冬氨酸)、(赖氨酸，苏氨酸，天冬氨酸)或(亮氨酸，苏氨酸，天冬氨酸)；

如果所述PPR基序的靶碱基是U(尿嘧啶)，则按照(A₁，A₄，L_ii)的顺序为(缬氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸)、(异亮氨酸，天冬酰胺，天冬酰胺)、(异亮氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸)、(异亮氨酸，甲硫氨酸，天冬氨酸)、(苯丙氨酸，脯氨酸，天冬氨酸)或(酪氨酸，脯氨酸，天冬氨酸)；或者

如果所述PPR基序的靶碱基是C(胞嘧啶)，则按照(A₁，A₄，L_ii)的顺序为(缬氨酸，天冬酰胺，天冬酰胺)、(异亮氨酸，天冬酰胺，天冬酰胺)、(缬氨酸，天冬酰胺，丝氨酸)或(异亮氨酸，甲硫氨酸，天冬氨酸)。

此外，在根据本发明的一个实施方案中，每个所述PPR基序中所述两个氨基酸A₄和L_ii的组合是：

如果所述PPR基序的靶碱基是A(腺嘌呤)，则按照(A₄，L_ii)的顺序为(苏氨酸，天冬酰胺)、(丝氨酸，天冬酰胺)或(甘氨酸，天冬酰胺)；

如果所述PPR基序的靶碱基是G(鸟嘌呤)，则按照(A₄，L_ii)的顺序为(苏氨酸，天冬氨酸)或(甘氨酸，天冬氨酸)；

如果所述PPR基序的靶碱基是U(尿嘧啶)，则按照(A₄，L_ii)的顺序为(天冬酰胺，天冬氨酸)、(脯氨酸，天冬氨酸)、(甲硫氨酸，天冬氨酸)或(缬氨酸，苏氨酸)；或者

如果所述PPR基序的靶碱基是C(胞嘧啶)，则按照(A₄，L_ii)的顺序为(天冬酰胺，天冬酰胺)、(天冬酰胺，丝氨酸)或(亮氨酸，天冬氨酸)。

根据本发明的另一个实施方案涉及编码根据本发明的融合蛋白的核酸。

根据本发明的另一个实施方案涉及包含根据本发明的核酸的载体(优选表达载体)。

根据本发明的另一个实施方案涉及提高细胞内靶mRNA的蛋白质表达水平的方法，所述方法包括：

提供根据本发明的融合蛋白或根据本发明的载体的步骤；以及

将所述融合蛋白或载体引入细胞中的步骤。

此外，在根据本发明的一个实施方案中，细胞是真核细胞。

此外，在根据本发明的一个实施方案中，细胞是动物细胞。

此外，在根据本发明的一个实施方案中，动物细胞是人细胞。

具有上述本发明的一个或更多个特征的任意组合的发明也包括在本发明的范围内。

[附图简述]

[图1]图1示出了实施例中使用的效应质粒和报告质粒的示意图，以及实验概要的示意图。图1A示出了实施例中使用的效应质粒和报告质粒的示意图。从效应质粒中表达了PPR基序和eIF4G的融合蛋白。在实施例中，使用靶序列被很好地研究的CRR4蛋白。从报告质粒中，海肾萤光素酶(renilla luciferase，RLuc)和萤火虫萤光素酶(fireflyluciferase，FLuc)以双顺反子mRNA的形式转录。将PPR结合序列(此处为CRR4结合序列)插入到FLuc5’端的位点中。图1B示出了实施例的实验概要的示意图。无论PPR结合序列存在与否，RLuc以相似的水平翻译。因此，RLuc的活性值可以视为该报告系统中转染的对照。只有当PPR-eIF4G结合PPR结合序列并且翻译因子可以被eIF4G的作用吸引时，才开始Fluc的翻译。相反，如果不存在PPR结合序列，则FLuc的翻译保持在低水平，因此PPR-eIF4G不能结合PPR结合序列。

[图2]图2示出了使用HEK293T细胞的报告测定的实验程序。

[图3]图3示出了实施例1的实验结果。序列特异性翻译的激活取决于CRR4-eIF4G和PPR结合序列。该实验使用效应质粒和报告载体进行，该效应质粒中插入了CRR4-Flag(无翻译激活因子，白色)或CRR4-eIF4G(有翻译激活因子，灰色)，该报告载体具有或不具有插入的PPR结合序列。从结果可以证实，在PPR-eIF4G和PPR结合序列二者的存在下，特异性翻译活性提高了2.75倍。该值代表平均值和标准偏差(N＝3)。

[图4]图4示出了实施例2中的实验的概要。

[图5]图5示出了实施例2中的实验结果以及结构域的功能。

[图6]图6示出了实施例2中的实验结果以及结构域的功能。

[实施方案描述]

[PPR基序和PPR蛋白]

除非另有说明，否则本发明中使用的术语“PPR基序”表示由30至38个氨基酸构成并且具有等于或小于预定值的E值的氨基酸序列(理想地为E-03)的多肽，在网上用蛋白质结构域搜索程序分析氨基酸序列时，在Pfam以PF01535和在Prosite以PS51375获得E值。形成本发明中定义的PPR基序的氨基酸的位置编号基本上如PF01535所定义，而其对应于通过从PS51375中的氨基酸位置减去2获得的编号(例如，本发明中的位置1对应于PS51375中的位置3)。注意，术语第“ii”(-2)个氨基酸是指从形成一个PPR基序的氨基酸的尾端(C端侧)起第二个氨基酸，或靠近N端距离下一个PPR基序的第一个氨基酸两个氨基酸的氨基酸(即，-2个氨基酸)。如果未明确鉴定下一个PPR基序，则距离下一螺旋结构第一个氨基酸两个氨基酸的正向氨基酸被限定为“ii”。关于Pfam参见http：//pfam.sanger.ac.uk/；关于Prosite参见http：//wwW.expasy.org/prosite/。

尽管PPR基序的保守氨基酸序列在氨基酸水平上具有低保守特性，但是在二级结构上两个α-螺旋很好地保守。尽管典型的PPR基序由35个氨基酸构成，但其长度可在30至38个氨基酸变化。

更具体地，本发明中使用的术语PPR基序由长度为30至38个氨基酸并且由式1表示的多肽构成：

[式4]

(螺旋A)-X-(螺旋B)-L (式1)

其中

[式5]

A₁-A₂-A₃-A₄-A₅-A₆-A₇-A₈-A₉-A₁₀-A₁₁-A₁₂ (式2)

其中A₁至A₁₂各自独立地表示氨基酸；

X不存在，或者是长度上由1至9个氨基酸组成的部分；

螺旋B是长度上由11至13个氨基酸组成并且可以形成α-螺旋结构的部分；并且

L是长度上由2至7个氨基酸组成并且由式3表示的部分：

[式6]

L_vli-L_vi-L_v-L_iv-L_iii-L_ii-L_i (式3)

其中所述氨基酸从C端起编号为“i”(-1)、“ii”(-2)、……并且L_iii至L_vii可以不存在。

除非另有说明，否则本发明中使用的术语“PPR蛋白”表示包含一个或更多个上述PPR基序，优选两个或更多个上述PPR基序的PPR蛋白。除非另有说明，否则本文使用的术语“蛋白质”通常表示由多肽(通过肽键结合的几个氨基酸的链)组成的物质，还包括由相对低分子量的多肽组成的物质。本发明中使用的术语“氨基酸”可以表示通常的氨基酸分子，或者在某些情况下可以表示形成肽链的氨基酸残基。本领域技术人员从上下文清楚地理解该术语表示的情况。

除非另有说明，否则本发明中关于PPR基序与RNA碱基的结合特性的“选择性”表示PPR基序与RNA碱基之一的结合活性高于其与其它碱基的结合活性。本领域技术人员可以针对该选择性计划实验并对其进行验证，并且还可以通过计算确定。

除非另有说明，否则本发明中使用的术语“RNA碱基”表示形成RNA的核糖核苷酸的碱基，特别是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)。注意到尽管PPR蛋白可以对RNA中的碱基具有选择性，但它不与核酸单体结合。

PPR蛋白存在于许多植物中，并且在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中可以发现500种蛋白质，约5000种基序。具有多种氨基酸序列的PPR基序和PPR蛋白也存在于许多陆地植物中，例如稻属(Oryza)、杨属(Populus)和卷柏(Selaginella tamariscina)。在本发明中，可以使用自然界中存在的PPR基序和PPR蛋白，或者可以使用例如基于WO2013/058404中公开的方法设计的PPR基序和PPR蛋白。具体地，可以基于WO2013/058404中公开的以下信息设计所需的PPR基序和PPR蛋白。

(I)关于选择性结合所必需的氨基酸位置的信息

三个氨基酸，即PPR基序的第1个、第4个和第“ii”(-1)个氨基酸的组合(A1，A4，Lii)，或者两个氨基酸，即第4个和第“ii”(-1)个氨基酸的组合(A4，Lii)对于选择性结合RNA碱基是必需的，并且可以通过这些组合确定用于结合的靶RNA碱基。

本发明可以使用WO2013/058404中公开的关于三个氨基酸A1、A4和Lii的组合和/或两个氨基酸A4和Lii的组合的发现。

(II)关于三个氨基酸A1、A4和Lii的组合与RNA碱基的对应关系的信息

(3-1)如果三个氨基酸A1、A4和Lii的组合按照缬氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与U的结合最强，并且与C的结合第二强，随后是与A或G的结合。

(3-2)如果三个氨基酸A1、A4和Lii的组合按照缬氨酸、苏氨酸和天冬酰胺的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与A的结合最强，并且与G的结合第二强，随后是与C的结合而不与U结合。

(3-3)如果三个氨基酸A1、A4和Lii的组合按照缬氨酸、天冬酰胺和天冬酰胺的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与C的结合最强，并且与A或U的结合第二强，不与G结合。

(3-4)如果三个氨基酸A1、A4和Lii的组合按照谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与G的结合强，不与A、U或C结合。

(3-5)如果三个氨基酸A1、A4和Lii的组合按照异亮氨酸、天冬酰胺和天冬酰胺的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与C的结合最强，并且与U的结合第二强，随后是与A的结合，而不与G结合。

(3-6)如果三个氨基酸A1、A4和Lii的组合按照缬氨酸、苏氨酸和天冬氨酸的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与G的结合最强，并且与U的结合第二强，不与A或C结合。

(3-7)如果三个氨基酸A1、A4和Lii的组合按照赖氨酸、苏氨酸和天冬氨酸的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与G的结合最强，并且与A的结合第二强，不与U或C结合。

(3-8)如果三个氨基酸A1、A4和Lii的组合按照苯丙氨酸、丝氨酸和天冬酰胺的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与A的结合最强，并且与C的结合第二强，随后是与G和U的结合。

(3-9)如果三个氨基酸A1、A4和Lii的组合按照缬氨酸、天冬酰胺和丝氨酸的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与C的结合最强，并且与U的结合第二强，不与A或G结合。

(3-10)如果三个氨基酸A1、A4和Lii的组合按照苯丙氨酸、苏氨酸和天冬酰胺的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与A的结合强，不与G、U或C结合。

(3-11)如果三个氨基酸A1、A4和Lii的组合按照异亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与U的结合最强，并且与A的结合第二强，不与G或C结合。

(3-12)如果三个氨基酸A1、A4和Lii的组合按照苏氨酸、苏氨酸和天冬酰胺的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与A的结合强，不与G、U或C结合。

(3-13)如果三个氨基酸A1、A4和Lii的组合按照异亮氨酸、甲硫氨酸和天冬氨酸的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与U的结合最强，并且与C的结合第二强，不与A或G结合。

(3-14)如果三个氨基酸A1、A4和Lii的组合按照苯丙氨酸、脯氨酸和天冬氨酸的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与U的结合最强，并且与C的结合第二强，不与A或G结合。

(3-15)如果三个氨基酸A1、A4和Lii的组合按照酪氨酸、脯氨酸和天冬氨酸的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与U的结合强，不与A、G或C结合。

(3-16)如果三个氨基酸A1、A4和Lii的组合按照亮氨酸、苏氨酸和天冬氨酸的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与G的结合强，不与A、U或C结合。

(II)关于两个氨基酸A4和Lii的组合与RNA碱基的对应关系的信息(2-1)如果A4和Lii按照天冬酰胺和天冬氨酸的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与U的结合最强，并且与C的结合第二强，随后是与A和G的结合。

(2-2)如果A4和Lii按照天冬酰胺和天冬酰胺的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与C的结合最强，与U的结合第二强，随后是与A和G的结合。

(2-3)如果A4和Lii按照苏氨酸和天冬酰胺的顺序，则PPR基序具有选择性RNA碱基结合能力，其中与A的结合强，与G、U和C的结合弱。

(2-4)如果A4和Lii按照苏氨酸和天冬氨酸的顺序，则PPR基序具有选择性RNA碱基结合能力，其中与G结合强，与A、U和C的结合弱。

(2-5)如果A4和Lii按照丝氨酸和天冬酰胺的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与A的结合最强，与G、U和C的结合第二强。

(2-6)如果A4和Lii按照甘氨酸和天冬氨酸的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与G的结合最强，并且与U的结合第二强，随后是与A的结合，不与C结合。

(2-7)如果A4和Lii按照天冬酰胺和丝氨酸的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与C的结合最强，并且与U的结合第二强，随后是与A和G的结合。

(2-8)如果A4和Lii按照脯氨酸和天冬氨酸的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与U的结合最强，并且与G、C和C的结合是第二强，不与A结合。

(2-9)如果A4和Lii按照甘氨酸和天冬酰胺的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与A的结合最强，并且与G的结合第二强，不与C或U结合。

(2-10)如果A4和Lii按照甲硫氨酸和天冬氨酸的顺序，则PPR基序具有选择性RNA碱基结合能力，其中与U的结合强，与A、G和C的结合弱。

(2-11)如果A4和Lii按照亮氨酸和天冬氨酸的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与C的结合最强，并且与U的结合第二强，不与A或G结合。

(2-12)如果A4和Lii按照缬氨酸和苏氨酸的顺序，则PPR基序具有如下选择性RNA碱基结合能力：与U的结合最强，并且与A的结合第二强，不与G或C结合。

[PPR基序和PPR蛋白的用途]

鉴定和设计：

一个PPR基序可以识别RNA的特定碱基。根据本发明，可以通过在PPR基序的特定位置中布置适当的氨基酸来选择或设计对A、U、G或C具有选择性的PPR基序。此外，含有适当系列的这种PPR基序的蛋白质可以识别其对应的特定序列。此外，根据上述发现，可以设计可选择性结合所需RNA碱基的PPR基序和具有多个可以序列特异性结合所需RNA的PPR基序的蛋白质。在设计中，天然存在的PPR基序的序列信息可以参考除了布置在PPR基序的重要位置中的氨基酸之外的部分。或者，可以通过使用天然存在的PPR基序作为整体并且用其他氨基酸替换仅重要位置中的氨基酸来设计PPR基序。PPR基序的重复数可以根据靶序列适当确定；例如，重复数可以是2或更多，或2至30。

如此设计的PPR基序或PPR蛋白可以通过本领域技术人员公知的方法制备。例如，编码设计的PPR基序或PPR蛋白的氨基酸序列的核酸序列可以从氨基酸序列中确定，并且可以被克隆以制备产生所需PPR基序或PPR蛋白的转化体(例如表达载体)。

融合蛋白的制备和用途：

本发明涉及上述PPR基序或PPR蛋白(即，可以RNA碱基选择性地或RNA碱基序列特异性地结合靶mRNA的多肽)与一个或更多个提高mRNA的蛋白质表达水平的功能结构域的融合蛋白。

可用于本发明的“提高mRNA的蛋白质表达水平的功能结构域”可以是例如直接或间接促进mRNA翻译的已知蛋白质的功能结构域的全部或功能性部分。更具体地，可用于本发明的功能结构域可以是例如将核糖体引导至mRNA的结构域、与mRNA的翻译的起始或促进相关的结构域、与mRNA的核输出相关的结构域、与和内质网膜的结合相关的结构域、包含内质网驻留信号(ER驻留信号)序列的结构域或包含内质网信号序列的结构域。

更具体地，将所述核糖体引导至所述mRNA的结构域可以是包含选自以下的多肽的全部或功能性部分的结构域：DENR(密度调节蛋白)、MCT-1(恶性T细胞扩增序列1)、TPT1(翻译控制的肿瘤蛋白)和Lerep04(锌指CCCH结构域)。所述与所述mRNA的翻译的起始或促进相关的结构域可以是包含选自以下的多肽的全部或功能性部分的结构域：eIF4E和eIF4G。所述与所述mRNA的核输出相关的结构域可以是包含SLBP(茎-环结合蛋白)的全部或功能性部分的结构域。所述与和内质网膜的结合相关的结构域可以是包含选自以下的多肽的全部或功能性部分的结构域：SEC61B、TRAP-α(易位子相关蛋白α)、SR-α、Dial(细胞色素b5还原酶3)和p180。所述内质网驻留信号(ER驻留信号)序列可以是包含KDEL(KEEL)序列的信号序列。所述内质网信号序列可以是包含MGWSCIILFLVATATGAHS(SEQ ID NO：22)的信号序列。

在根据本发明的融合蛋白中，功能结构域可以与PPR蛋白的N端侧融合，可以与PPR蛋白的C端侧融合，或者可以与其N端侧和C端侧二者融合。此外，根据本发明的融合蛋白可以包含数个功能结构域(例如，2至5个功能结构域)。此外，在根据本发明的融合蛋白中，功能结构域和PPR蛋白可以通过例如接头间接融合。

本发明还涉及编码上述融合蛋白的核酸，以及包含该核酸的载体(例如表达载体)。本文的表达载体是指，例如，按照从上游起的顺序包含具有启动子序列的DNA、编码所需蛋白质的DNA和具有终止子序列的DNA的载体。表达载体可以不按此顺序具有这些DNA，只要其表现出所需的功能即可。本领域技术人员通常可以使用的多种表达载体可用于本发明。

因为根据本发明的融合蛋白使用真核生物的RNA翻译机制，其可以在真核生物(例如动物、植物、微生物(例如酵母)和原生生物)的细胞中起作用。根据本发明的融合蛋白尤其可以在动物细胞(体外或体内)内起作用。可以引入根据本发明的融合蛋白或表达根据本发明的融合蛋白的载体的动物细胞的实例可以包括来源于人、猴、猪、牛、马、狗、猫、小鼠和大鼠的细胞。可以引入根据本发明的融合蛋白或表达根据本发明的融合蛋白的载体的培养细胞的实例可以包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS-1细胞、COS-7细胞、VERO(ATCCCCL-81)细胞、BHK细胞、狗肾来源MDCK细胞、仓鼠AV-12-664细胞、HeLa细胞、WI38细胞、293细胞、293T细胞和PER.C6细胞。

本文使用的术语(不包括那些特别定义的术语)用于说明具体实施方案，而并不旨在限制本发明。

除非上下文明确要求不同的理解，否则本文使用的术语“包括/包含”旨在表示存在所描述的条目(例如成员、步骤、组件或数字)，并且不旨在排除存在其他条目(例如成员、步骤、组件或数字)。

除非另有定义，否则本文使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域技术人员广泛理解的含义相同的含义。除非另有明确定义，否则本文使用的术语应被解释为具有与本文及其相关技术领域的含义一致的含义，并且不应被理解为理想化或过度正式的含义。

在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，本发明可以用多个方面实施，并且不应该被解释为限制于下面描述的实施例。

[实施例]

实施例1：通过PPR基序与eIF4G的融合蛋白提高靶mRNA的蛋白质表达水平

材料

(设备)

-用于分子生物学实验(例如用于构建质粒)的基本设施

-倒置显微镜(DM IL S40，Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)

-CO₂培养箱(KM-CC17RH2，Panasonic Healthcare，Tokyo，Japan)

-洁净工作台(MHE-S1300A2，Panasonic Healthcare，Tokyo，Japan)

-抽吸器(SP-30，Air Liquide Medical Systems，Bovezzo BS，Italy)

-离心机(水平转子)(LC-200，Tomy Seiko，Tokyo，Japan)

-超低温冷冻器(-80℃)(MDF-C8V，Panasonic Healthcare，Tokyo，Japan)

-读板器(EnSight Kaleido，PerkinElmer，Waltham，MA，USA)(细胞培养)

-HEK293T细胞系(见注释1)

-Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，富含葡萄糖)(见注释2)

-100×青霉素-链霉素溶液

-胎牛血清(FBS)(见注释3)

-EDTA-NaCl溶液：10mM EDTA和0.85％(w/v)NaCl，pH调节至7.2至7.4，高压灭菌，室温下储存

-100×20mm细胞培养培养皿(Greiner bio one，Frickenhausen，Germany)

-10mL一次性灭菌移液器

-15mL和50mL塑料离心管

-1.8mL冷冻管(Nunc；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)

-冷冻容器(Nalgene；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)

-Bambanker(Lymphotec，Tokyo，Japan)

(转染)

-效应质粒：使用pcDNA3.1(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)作为基本载体。将PPR和eIF4G的融合基因插入到表达盒中(100ng/μL)(参见注释4)。

-报告质粒：使用pcDNA3.1(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)作为基本载体。将萤光素酶基因插入表达盒中，并将PPR结合序列插入其5’-UTR中(100ng/μL)。

-包被有聚-L-赖氨酸的96孔板(AGC Techno glass，Shizuoka，Japan)

-1×磷酸盐缓冲盐水，PBS(-)：1.47mM KH₂PO₄，8.1mM Na₂HPO₄，137mM NaCl和2.7mM KCl。将pH调节至7.4，高压灭菌，在室温下储存

-血细胞计数器(用于对细胞数进行计数)(改进的Neubauer型细胞计数器板，Watson，Hyogo，Japan)

-转染试剂(HilyMax，Dojindo Molecular Technologies，Kumamoto，Japan)

(萤光素酶测定)

-Dual-Glo萤光素酶测定系统(Promega，Madison，WI，USA.)

-96孔光度计板(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)。

实验方法

(载体的构建)

报告测定需要效应质粒和报告质粒。这两种质粒均基于pcDNA3.1构建。效应质粒包含编码PPR蛋白和人eIF4G的部分结构域(SEQ ID NO：1)的融合基因(图1A)。使用的PPR蛋白部分是CRR4(SEQ ID NO：2)。报告质粒包含两个开放阅读框(ORF)，具体是海肾萤光素酶(RLuc)和萤火虫萤光素酶(FLuc)，它们被双顺反子转录(图1A)。RLuc基因位于FLuc基因的5’端侧，并且作为基因表达的对照使用。PPR结合区插入到FLuc的ORF的5’-UTR中，并且其由用四碱基序列(ATCG和GATC)中断的CRR4识别序列(5’-UAUCUUGUCUUUA-3’)(SEQ ID NO：3)的三个重复组成。为了表达融合的效应基因和报告基因二者，使用巨细胞病毒启动子(CMV)和牛生长激素基因来源多腺苷酸化信号。对于对照实验，通过将FLAG表位标签与PPR融合来构建不具有eIF4G的效应质粒。还构建了没有PPR结合区的对照报告质粒。

实施例中从细胞培养到报告测定的程序概述如图2所示。

(冷冻原种的细胞培养)

该步骤无菌地执行。所有工具都用70％乙醇初步杀菌。

1.将9mL DMEM培养基置于15mL离心管中(已灭菌)。

2.将冷冻管中的1mL冷冻HEK293T细胞在37℃的水浴中孵育以快速融化细胞。

3.将细胞置于含有9mL DMEM的15mL离心管中。

4.将离心管在室温和1100×g下离心2分钟，除去上清液。

5.将细胞在10mL DMEM(添加FBS以使得最终浓度为10％)中重悬。

6.将悬浮细胞转移到100mm培养皿中。将培养皿置于37℃和5％CO₂条件下的培养箱中。如果从冷冻原种开始培养，则在24小时后将培养细胞进行传代培养。

为了使细胞保持健康(见注释5)，培养皿表面上的细胞密度保持在10％至80％。传代基本上每三天进行一次(每周两次)，或者根据细胞的生长速率进行。此外，为了保持少的传代次数，每月一次从冷冻原种中新鲜培养细胞。保持少的传代次数并由此使细胞保持健康对有效的DNA转染是重要的。

(传代以维持细胞)

1.根据需要提供新的100mm培养皿。将8mL DMEM和1mL FBS预先置于每个培养皿上。

2.用抽吸器除去含有培养细胞的培养皿上的培养基(见注释6)。

3.将2mL EDTA-NaCl溶液温和地添加到培养皿表面上的贴壁细胞上，以免剥离细胞。转动培养皿以使溶液均匀分布在培养皿的整个表面。用抽吸器除去EDTA-NaCl溶液。轻拍培养皿以剥离细胞。

4.将10mL DMEM添加到培养皿中的细胞，通过轻轻吹吸将细胞悬浮。

5.将1mL悬浮细胞(10％培养细胞)添加到预先提供的培养皿，每个培养皿含有9mL培养基。转动每个培养皿以使细胞分布在其整个表面。

(冷冻储存细胞)

用Bambanker试剂和处于对数生长期的细胞密度达50％的培养细胞制备冷冻原液。Bambanker的使用提供了高回收率并有助于长期储存。

1.根据传代程序，自传代后第二天的细胞被剥离。添加5mL至10mL DMEM，并将细胞在50mL离心管中回收。

2.将离心管在室温和1100×g下离心2分钟，除去上清液。

3.每个培养皿添加1mL Bambanker以悬浮细胞。

4.将悬浮细胞快速分配到冷冻管中，并用它们的盖子盖住冷冻管。

5.将冷冻管置于专用冷冻容器中，并置于-80℃下持续12小时(见注释7)。

6.将冷冻管转移到标准样品盒中，并在-80℃下或液氮中储存。

(瞬时基因引入(转染))

1.在开始转染之前，根据需要提供自传代后第二天的各自含有细胞的培养皿，并检查细胞是否健康(正常)(见注释8)。作为估计，可以用一个培养皿进行约96次测定。

2.根据传代程序将自传代后第二天的细胞剥离，将悬浮细胞转移到50mL离心管中。

3.将离心管在室温和1100×g下离心2分钟，除去上清液。

4.将细胞簇在10mL DMEM(添加FBS以使得最终浓度为10％)中完全分散。

5.用血细胞计数器和倒置显微镜对细胞数进行计数。将细胞悬浮在适量的DMEM中(添加FBS以使得最终浓度为10％)，使得细胞数为1×10⁵至2×10⁵个细胞/mL。

6.提供96孔板。将每孔200μL悬浮培养细胞(2×10⁴至4×10⁴个细胞/mL)置于每个孔中，并将板在37℃，5％CO₂条件下置于培养箱中过夜。一个孔用于一次测定。

7.第二天，小心地从每个孔中取出培养基，并用100μL新DMEM(添加FBS以使得最终浓度为10％)替换。

8.将400ng效应质粒(4μL，100ng/μL)和100ng报告质粒(1μL，100ng/μL)置于新的96孔PCR板上的单孔(或0.2毫升管)中。

9.对于一次测定，用10μL无血清DMEM稀释1μL HilyMAX。

10.将11μL稀释的溶液置于含有质粒的每个孔中。通过吹吸使溶液与质粒充分混合。

11.将溶液在室温下放置15分钟。将混合物的总量置于含有培养细胞的孔中。将板在37℃，5％CO₂条件下置于培养箱中24小时。

(萤光素酶测定)

根据制造商的使用说明，除了一些修改之外，使用Dual-Glo萤光素酶测定系统进行双萤光素酶测定。

1.转染24小时后，用40μL1×PBS(-)替换每个孔的培养基。

2.将40μL Dual-Glo萤光素酶试剂置于每个孔中，并通过吹吸与培养基充分混合。

3.将混合物在室温下放置10分钟，并将其总量转移到96孔光度计板中。

4.用板读数器测量与FLuc基因表达有关的萤火虫萤光素酶的光发射。

5.使用Dual-Glo Stop&Glo缓冲液将Stop&Glo底物稀释100倍。每孔中添加40μL稀释溶液。

6.将板在室温下放置至少10分钟，然后测量与RLuc基因表达相关的海肾萤光素酶的光发射。

(数据分析)

1.计算FLuc/RLuc的值以校正测定之间的转染效率差异或实验误差。

2.在PPR结合区存在和其不存在的情况下，通过用使用根据本发明的质粒(编码CRR4和翻译激活结构域eIF4G的融合蛋白的质粒)获得的实验值除以使用对照质粒(编码CRR4和FLAG标签的融合蛋白的质粒)获得的实验值确定报告基因表达活性的提高。

实验结果

萤光素酶测定的结果示于图3中。如图3所示，在PPR-eIF4G和PPR结合序列二者的存在下特异性地验证了2.75倍的翻译活性。即，证明了PPR蛋白与提高mRNA的蛋白质表达水平的功能结构域的融合蛋白提高了靶mRNA的蛋白质表达水平。

注释

(注释1)HEK293T是表达SV40大T抗原的人胎来源肾细胞系。该细胞系易于培养，并且可以通过多种方法高效转染。HEK293T细胞可以从RIKEN BRC(ja.brc.riken.jp)或ATCC(www.atcc.org)获得。

(注释2)将1×青霉素-链霉素溶液添加到DMEM以避免被微生物污染。

(注释3)使用前，将FBS在56℃下灭活30分钟，并储存在4℃下。

(注释4)质粒的纯度对转染效率非常重要。应使用转染级试剂盒分离质粒。

(注释5)每日生长率是指示细胞健康的指标。为了避免抑制细胞生长，细胞应始终在足够的营养条件下在足够的空间中培养。

(注释6)当更换培养基时，应温和地处理HEK293T细胞，因为细胞很容易从培养的培养皿上剥离。

(注释7)专用冷冻容器是可以调节其冷冻速度(在-80℃下每分钟约-1℃)，并且使细胞能够冷冻储存在不可编程的-80℃冰箱中的盒子。

(注释8)在转染中，细胞以50％至80％的培养密度使用。然而，合适的细胞密度取决于转染试剂。此外，转染试剂(μL)与质粒DNA(μg)的比也应根据制造商的使用说明进行优化。本文描述的程序针对使用96孔板、HEK293T细胞和HilyMAX作为转染试剂的条件进行了优化。

实施例2：通过PPR与另一个功能结构域的融合蛋白提高靶mRNA的蛋白质表达水平

在使用细胞产生有用物质的情况下，应该精确控制由内源基因和外源基因合成的蛋白质的量。合成蛋白质的最终量由基因的插入位置、mRNA转录量、转录后调节(在RNA水平上的调节)、翻译后修饰等决定。由于这些原因，本发明人利用PPR蛋白序列特异性地结合靶RNA分子这一事实设计了增强mRNA翻译的方法(图4)。在真核生物中的mRNA的翻译中，mRNA经历翻译起始因子(真核起始因子；eIF)的作用。结果，核糖体在翻译起始点附近募集，然后开始mRNA的翻译。换言之，本发明人认为如果核糖体可以只募集到mRNA上，则可以人工增强mRNA的翻译。此外，通常在ER中进行mRNA向蛋白质的翻译。因此，本发明人认为通过有意地使靶mRNA定位于ER中，可以增强mRNA的翻译。

通过实验验证

为了验证上述想法，制备了使用动物培养细胞(HEK293T)的报告分析系统(除了使用不同的功能结构域之外，通过与实施例1中相同的方法进行实验)。使用已知与特定RNA序列(UAUCUUGUCUUUA)(SEQ ID NO：3)结合的CRR4蛋白(拟南芥PPR蛋白之一)构建该系统。首先，制备CRR4与候选蛋白质功能结构域的融合蛋白表达载体(效应质粒)。选择的候选结构域是(a)eIF蛋白(eIF4E和eIF4G)，(b)核糖体结合蛋白(DENR、MCT-1、TPT1和Lerepo4)，(c)促进转录mRNA从核运输到胞质的组蛋白的翻译调节因子(SLBP)，(d)ER锚蛋白(SEC61B、TRAP-α、SR-α、Dial和p180)，(e)ER驻留信号(KDEL)和(f)ER信号肽。克隆融合蛋白以便以HA-CRR4-XX或XX-CRR4-HA(HA：表位标签(SEQ ID NO：4)；XX：候选结构域)的形式表达。

报告质粒包括表达盒，其中海肾萤光素酶(RLuc)和萤火虫萤光素酶(Fluc)在CMV启动子的控制下以双顺反子mRNA的形式转录。将三个PPR结合序列(UAUCUUGUCUUUA)(SEQID NO：3)插入Fluc的5’端的位点中。

将效应质粒和报告质粒转染到HEK293T细胞中，测量RLUC和FLUC的光发射强度。将RLUC的光发射强度视为转染对照，并且将FLUC的光发射强度/RLUC的光发射强度的值视为翻译活性量。

结果

使用以下指数(A)和(B)检查图5和6中所示的结果。

(A)靶标的不存在与存在之间的比较

比较显示了翻译中序列特异性变化的量。

(B)靶标的存在与效应物的不存在(空)(黑色虚线)的比较

比较显示了由添加结构域引起的翻译变化量。

1.eIF4E与CRR4的C端侧融合。

(A)2.7倍

(B)1.6倍

2.eIF4G与CRR4的C端侧融合。

(A)4.5倍

(B)3.3倍

3.DENR与CRR4的N端侧融合。

(A)1.7倍

(B)1.3倍

4.DENR与CRR4的C端侧融合。

(A)2.4倍

(B)1.7倍

5.MCT-1与CRR4的N端侧融合。

(A)1.3倍

(B)1.0倍

6.MCT-1与CRR4的C端侧融合。

(A)2.0倍

(B)1.2倍

7.TPT-1与CRR4的N端侧融合。

(A)1.4倍

(B)1.0倍

8.TPT-1与CRR4的C端侧融合。

(A)2.4倍

(B)1.9倍

9.Lerepo4与CRR4的N端侧融合。

(A)3.0倍

(B)1.8倍

10.Lerepo4与CRR4的C端侧融合。

(A)3.3倍

(B)2.6倍

11.SLBP与CRR4的C端侧融合。

(A)4.1倍

(B)3.3倍

12.Sec61B与CRR4的C端侧融合。

(A)1.6倍

(B)1.6倍

13.Sec61BTM与CRR4的C端侧融合。(A)2.4倍

(B)1.9倍

14.TRAP-α与CRR4的C端侧融合。

(A)3.5倍

(B)4.5倍

15.TRAPTM与CRR4的C端侧融合。

(A)2.3倍

(B)1.6倍

16.SR-α与CRR4的N端侧融合。

(A)1.7倍

(B)1.5倍

17.Dial TM与CRR4的N端侧融合。

(A)1.8倍

(B)1.2倍

18.P180TM2R与CRR4的N端侧融合。

(A)2.1倍

(B)1.5倍

19.P180TMH与CRR4的N端侧融合。

(A)2.3倍

(B)2.5倍

20.P180TM2与CRR4的N端侧融合。

(A)3.0倍

(B)2.1倍

21.KDEL与CRR4的C端侧融合。

(A)1.8倍

(B)1.4倍

22.KEEL与CRR4的C端侧融合。

(A)2.3倍

(B)2.1倍

23.信号肽(SP)与CRR4的N端侧融合。

(A)1.4倍

(B)2.0倍

如上所示，在指数(A)和靶标(B)二者中的所有功能结构域中发现了翻译的增加。即，清楚地显示根据本发明的融合蛋白可以增强靶mRNA的翻译。

实施例中使用的功能结构域的氨基酸序列如下所示：

[表1]

序列表

<110> KYUSHU UNIVERSITY, NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION

<120> 用于提高靶mRNA的蛋白质表达的融合蛋白

<130> EDFP1601F

<150> US62/345252

<151> 2016-06-03

<150> JP2016-120524

<151> 2016-06-17

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 993

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Glu Glu Lys Lys Arg Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Gly Phe Gln Phe

1 5 10 15

Ile Phe Ala Ser Met Gln Lys Pro Glu Gly Leu Pro His Ile Ser Asp

20 25 30

Val Val Leu Asp Lys Ala Asn Lys Thr Pro Leu Arg Pro Leu Asp Pro

35 40 45

Thr Arg Leu Gln Gly Ile Asn Cys Gly Pro Asp Phe Thr Pro Ser Phe

50 55 60

Ala Asn Leu Gly Arg Thr Thr Leu Ser Thr Arg Gly Pro Pro Arg Gly

65 70 75 80

Gly Pro Gly Gly Glu Leu Pro Arg Gly Pro Gln Ala Gly Leu Gly Pro

85 90 95

Arg Arg Ser Gln Gln Gly Pro Arg Lys Glu Pro Arg Lys Ile Ile Ala

100 105 110

Thr Val Leu Met Thr Glu Asp Ile Lys Leu Asn Lys Ala Glu Lys Ala

115 120 125

Trp Lys Pro Ser Ser Lys Arg Thr Ala Ala Asp Lys Asp Arg Gly Glu

130 135 140

Glu Asp Ala Asp Gly Ser Lys Thr Gln Asp Leu Phe Arg Arg Val Arg

145 150 155 160

Ser Ile Leu Asn Lys Leu Thr Pro Gln Met Phe Gln Gln Leu Met Lys

165 170 175

Gln Val Thr Gln Leu Ala Ile Asp Thr Glu Glu Arg Leu Lys Gly Val

180 185 190

Ile Asp Leu Ile Phe Glu Lys Ala Ile Ser Glu Pro Asn Phe Ser Val

195 200 205

Ala Tyr Ala Asn Met Cys Arg Cys Leu Met Ala Leu Lys Val Pro Thr

210 215 220

Thr Glu Lys Pro Thr Val Thr Val Asn Phe Arg Lys Leu Leu Leu Asn

225 230 235 240

Arg Cys Gln Lys Glu Phe Glu Lys Asp Lys Asp Asp Asp Glu Val Phe

245 250 255

Glu Lys Lys Gln Lys Glu Met Asp Glu Ala Ala Thr Ala Glu Glu Arg

260 265 270

Gly Arg Leu Lys Glu Glu Leu Glu Glu Ala Arg Asp Ile Ala Arg Arg

275 280 285

Arg Ser Leu Gly Asn Ile Lys Phe Ile Gly Glu Leu Phe Lys Leu Lys

290 295 300

Met Leu Thr Glu Ala Ile Met His Asp Cys Val Val Lys Leu Leu Lys

305 310 315 320

Asn His Asp Glu Glu Ser Leu Glu Cys Leu Cys Arg Leu Leu Thr Thr

325 330 335

Ile Gly Lys Asp Leu Asp Phe Glu Lys Ala Lys Pro Arg Met Asp Gln

340 345 350

Tyr Phe Asn Gln Met Glu Lys Ile Ile Lys Glu Lys Lys Thr Ser Ser

355 360 365

Arg Ile Arg Phe Met Leu Gln Asp Val Leu Asp Leu Arg Gly Ser Asn

370 375 380

Trp Val Pro Arg Arg Gly Asp Gln Gly Pro Lys Thr Ile Asp Gln Ile

385 390 395 400

His Lys Glu Ala Glu Met Glu Glu His Arg Glu His Ile Lys Val Gln

405 410 415

Gln Leu Met Ala Lys Gly Ser Asp Lys Arg Arg Gly Gly Pro Pro Gly

420 425 430

Pro Pro Ile Ser Arg Gly Leu Pro Leu Val Asp Asp Gly Gly Trp Asn

435 440 445

Thr Val Pro Ile Ser Lys Gly Ser Arg Pro Ile Asp Thr Ser Arg Leu

450 455 460

Thr Lys Ile Thr Lys Pro Gly Ser Ile Asp Ser Asn Asn Gln Leu Phe

465 470 475 480

Ala Pro Gly Gly Arg Leu Ser Trp Gly Lys Gly Ser Ser Gly Gly Ser

485 490 495

Gly Ala Lys Pro Ser Asp Ala Ala Ser Glu Ala Ala Arg Pro Ala Thr

500 505 510

Ser Thr Leu Asn Arg Phe Ser Ala Leu Gln Gln Ala Val Pro Thr Glu

515 520 525

Ser Thr Asp Asn Arg Arg Val Val Gln Arg Ser Ser Leu Ser Arg Glu

530 535 540

Arg Gly Glu Lys Ala Gly Asp Arg Gly Asp Arg Leu Glu Arg Ser Glu

545 550 555 560

Arg Gly Gly Asp Arg Gly Asp Arg Leu Asp Arg Ala Arg Thr Pro Ala

565 570 575

Thr Lys Arg Ser Phe Ser Lys Glu Val Glu Glu Arg Ser Arg Glu Arg

580 585 590

Pro Ser Gln Pro Glu Gly Leu Arg Lys Ala Ala Ser Leu Thr Glu Asp

595 600 605

Arg Asp Arg Gly Arg Asp Ala Val Lys Arg Glu Ala Ala Leu Pro Pro

610 615 620

Val Ser Pro Leu Lys Ala Ala Leu Ser Glu Glu Glu Leu Glu Lys Lys

625 630 635 640

Ser Lys Ala Ile Ile Glu Glu Tyr Leu His Leu Asn Asp Met Lys Glu

645 650 655

Ala Val Gln Cys Val Gln Glu Leu Ala Ser Pro Ser Leu Leu Phe Ile

660 665 670

Phe Val Arg His Gly Val Glu Ser Thr Leu Glu Arg Ser Ala Ile Ala

675 680 685

Arg Glu His Met Gly Gln Leu Leu His Gln Leu Leu Cys Ala Gly His

690 695 700

Leu Ser Thr Ala Gln Tyr Tyr Gln Gly Leu Tyr Glu Ile Leu Glu Leu

705 710 715 720

Ala Glu Asp Met Glu Ile Asp Ile Pro His Val Trp Leu Tyr Leu Ala

725 730 735

Glu Leu Val Thr Pro Ile Leu Gln Glu Gly Gly Val Pro Met Gly Glu

740 745 750

Leu Phe Arg Glu Ile Thr Lys Pro Leu Arg Pro Leu Gly Lys Ala Ala

755 760 765

Ser Leu Leu Leu Glu Ile Leu Gly Leu Leu Cys Lys Ser Met Gly Pro

770 775 780

Lys Lys Val Gly Thr Leu Trp Arg Glu Ala Gly Leu Ser Trp Lys Glu

785 790 795 800

Phe Leu Pro Glu Gly Gln Asp Ile Gly Ala Phe Val Ala Glu Gln Lys

805 810 815

Val Glu Tyr Thr Leu Gly Glu Glu Ser Glu Ala Pro Gly Gln Arg Ala

820 825 830

Leu Pro Ser Glu Glu Leu Asn Arg Gln Leu Glu Lys Leu Leu Lys Glu

835 840 845

Gly Ser Ser Asn Gln Arg Val Phe Asp Trp Ile Glu Ala Asn Leu Ser

850 855 860

Glu Gln Gln Ile Val Ser Asn Thr Leu Val Arg Ala Leu Met Thr Ala

865 870 875 880

Val Cys Tyr Ser Ala Ile Ile Phe Glu Thr Pro Leu Arg Val Asp Val

885 890 895

Ala Val Leu Lys Ala Arg Ala Lys Leu Leu Gln Lys Tyr Leu Cys Asp

900 905 910

Glu Gln Lys Glu Leu Gln Ala Leu Tyr Ala Leu Gln Ala Leu Val Val

915 920 925

Thr Leu Glu Gln Pro Pro Asn Leu Leu Arg Met Phe Phe Asp Ala Leu

930 935 940

Tyr Asp Glu Asp Val Val Lys Glu Asp Ala Phe Tyr Ser Trp Glu Ser

945 950 955 960

Ser Lys Asp Pro Ala Glu Gln Gln Gly Lys Gly Val Ala Leu Lys Ser

965 970 975

Val Thr Ala Phe Phe Lys Trp Leu Arg Glu Ala Glu Glu Glu Ser Asp

980 985 990

His

<210> 2

<211> 561

<212> PRT

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 2

Ala Phe Ala Ser Ser Arg Arg Pro Tyr Leu Ala Asp Phe Ala Arg Cys

1 5 10 15

Val Phe His Glu Tyr His Val Cys Ser Phe Ser Phe Gly Glu Val Glu

20 25 30

Asp Pro Phe Leu Trp Asn Ala Val Ile Lys Ser His Ser His Gly Lys

35 40 45

Asp Pro Arg Gln Ala Leu Leu Leu Leu Cys Leu Met Leu Glu Asn Gly

50 55 60

Val Ser Val Asp Lys Phe Ser Leu Ser Leu Val Leu Lys Ala Cys Ser

65 70 75 80

Arg Leu Gly Phe Val Lys Gly Gly Met Gln Ile His Gly Phe Leu Lys

85 90 95

Lys Thr Gly Leu Trp Ser Asp Leu Phe Leu Gln Asn Cys Leu Ile Gly

100 105 110

Leu Tyr Leu Lys Cys Gly Cys Leu Gly Leu Ser Arg Gln Met Phe Asp

115 120 125

Arg Met Pro Lys Arg Asp Ser Val Ser Tyr Asn Ser Met Ile Asp Gly

130 135 140

Tyr Val Lys Cys Gly Leu Ile Val Ser Ala Arg Glu Leu Phe Asp Leu

145 150 155 160

Met Pro Met Glu Met Lys Asn Leu Ile Ser Trp Asn Ser Met Ile Ser

165 170 175

Gly Tyr Ala Gln Thr Ser Asp Gly Val Asp Ile Ala Ser Lys Leu Phe

180 185 190

Ala Asp Met Pro Glu Lys Asp Leu Ile Ser Trp Asn Ser Met Ile Asp

195 200 205

Gly Tyr Val Lys His Gly Arg Ile Glu Asp Ala Lys Gly Leu Phe Asp

210 215 220

Val Met Pro Arg Arg Asp Val Val Thr Trp Ala Thr Met Ile Asp Gly

225 230 235 240

Tyr Ala Lys Leu Gly Phe Val His His Ala Lys Thr Leu Phe Asp Gln

245 250 255

Met Pro His Arg Asp Val Val Ala Tyr Asn Ser Met Met Ala Gly Tyr

260 265 270

Val Gln Asn Lys Tyr His Met Glu Ala Leu Glu Ile Phe Ser Asp Met

275 280 285

Glu Lys Glu Ser His Leu Leu Pro Asp Asp Thr Thr Leu Val Ile Val

290 295 300

Leu Pro Ala Ile Ala Gln Leu Gly Arg Leu Ser Lys Ala Ile Asp Met

305 310 315 320

His Leu Tyr Ile Val Glu Lys Gln Phe Tyr Leu Gly Gly Lys Leu Gly

325 330 335

Val Ala Leu Ile Asp Met Tyr Ser Lys Cys Gly Ser Ile Gln His Ala

340 345 350

Met Leu Val Phe Glu Gly Ile Glu Asn Lys Ser Ile Asp His Trp Asn

355 360 365

Ala Met Ile Gly Gly Leu Ala Ile His Gly Leu Gly Glu Ser Ala Phe

370 375 380

Asp Met Leu Leu Gln Ile Glu Arg Leu Ser Leu Lys Pro Asp Asp Ile

385 390 395 400

Thr Phe Val Gly Val Leu Asn Ala Cys Ser His Ser Gly Leu Val Lys

405 410 415

Glu Gly Leu Leu Cys Phe Glu Leu Met Arg Arg Lys His Lys Ile Glu

420 425 430

Pro Arg Leu Gln His Tyr Gly Cys Met Val Asp Ile Leu Ser Arg Ser

435 440 445

Gly Ser Ile Glu Leu Ala Lys Asn Leu Ile Glu Glu Met Pro Val Glu

450 455 460

Pro Asn Asp Val Ile Trp Arg Thr Phe Leu Thr Ala Cys Ser His His

465 470 475 480

Lys Glu Phe Glu Thr Gly Glu Leu Val Ala Lys His Leu Ile Leu Gln

485 490 495

Ala Gly Tyr Asn Pro Ser Ser Tyr Val Leu Leu Ser Asn Met Tyr Ala

500 505 510

Ser Phe Gly Met Trp Lys Asp Val Arg Arg Val Arg Thr Met Met Lys

515 520 525

Glu Arg Lys Ile Glu Lys Ile Pro Gly Cys Ser Trp Ile Glu Leu Asp

530 535 540

Gly Arg Val His Glu Phe Phe Val Asp Ser Ile Glu Val Ser Ser Thr

545 550 555 560

Leu

<210> 3

<211> 13

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA

<400> 3

uaucuugucu uua 13

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 4

Met Ala Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 220

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Met Ala Thr Val Glu Pro Glu Thr Thr Pro Thr Pro Asn Pro Pro Thr

1 5 10 15

Thr Glu Glu Glu Lys Thr Glu Ser Asn Gln Glu Val Ala Asn Pro Glu

20 25 30

His Tyr Ile Lys His Pro Leu Gln Asn Arg Trp Ala Leu Trp Phe Phe

35 40 45

Lys Asn Asp Lys Ser Lys Thr Trp Gln Ala Asn Leu Arg Leu Ile Ser

50 55 60

Lys Phe Asp Thr Val Glu Asp Phe Trp Ala Leu Tyr Asn His Ile Gln

65 70 75 80

Leu Ser Ser Asn Leu Met Pro Gly Cys Asp Tyr Ser Leu Phe Lys Asp

85 90 95

Gly Ile Glu Pro Met Leu Glu Asp Glu Lys Asn Lys Arg Gly Gly Arg

100 105 110

Trp Leu Ile Thr Leu Asn Lys Gln Gln Arg Arg Ser Asp Leu Asp Arg

115 120 125

Phe Trp Leu Glu Thr Leu Leu Cys Leu Ile Gly Glu Ser Phe Asp Asp

130 135 140

Tyr Ser Asp Asp Val Cys Gly Ala Val Val Asn Val Arg Ala Lys Gly

145 150 155 160

Asp Lys Ile Ala Ile Trp Thr Thr Glu Cys Glu Asn Arg Glu Ala Val

165 170 175

Thr His Ile Gly Arg Val Tyr Lys Glu Arg Leu Gly Leu Pro Pro Lys

180 185 190

Ile Val Ile Gly Tyr Gln Ser His Ala Asp Thr Ala Thr Lys Ser Gly

195 200 205

Ser Thr Thr Lys Asn Arg Phe Val Val Gly Arg Tyr

210 215 220

<210> 6

<211> 198

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Met Ala Ala Asp Ile Ser Glu Ser Ser Gly Ala Asp Cys Lys Gly Asp

1 5 10 15

Pro Arg Asn Ser Ala Lys Leu Asp Ala Asp Tyr Pro Leu Arg Val Leu

20 25 30

Tyr Cys Gly Val Cys Ser Leu Pro Thr Glu Tyr Cys Glu Tyr Met Pro

35 40 45

Asp Val Ala Lys Cys Arg Gln Trp Leu Glu Lys Asn Phe Pro Asn Glu

50 55 60

Phe Ala Lys Leu Thr Val Glu Asn Ser Pro Lys Gln Glu Ala Gly Ile

65 70 75 80

Ser Glu Gly Gln Gly Thr Ala Gly Glu Glu Glu Glu Lys Lys Lys Gln

85 90 95

Lys Arg Gly Gly Arg Gly Gln Ile Lys Gln Lys Lys Lys Thr Val Pro

100 105 110

Gln Lys Val Thr Ile Ala Lys Ile Pro Arg Ala Lys Lys Lys Tyr Val

115 120 125

Thr Arg Val Cys Gly Leu Ala Thr Phe Glu Ile Asp Leu Lys Glu Ala

130 135 140

Gln Arg Phe Phe Ala Gln Lys Phe Ser Cys Gly Ala Ser Val Thr Gly

145 150 155 160

Glu Asp Glu Ile Ile Ile Gln Gly Asp Phe Thr Asp Asp Ile Ile Asp

165 170 175

Val Ile Gln Glu Lys Trp Pro Glu Val Asp Asp Asp Ser Ile Glu Asp

180 185 190

Leu Gly Glu Val Lys Lys

195

<210> 7

<211> 181

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Met Phe Lys Lys Phe Asp Glu Lys Glu Asn Val Ser Asn Cys Ile Gln

1 5 10 15

Leu Lys Thr Ser Val Ile Lys Gly Ile Lys Asn Gln Leu Ile Glu Gln

20 25 30

Phe Pro Gly Ile Glu Pro Trp Leu Asn Gln Ile Met Pro Lys Lys Asp

35 40 45

Pro Val Lys Ile Val Arg Cys His Glu His Ile Glu Ile Leu Thr Val

50 55 60

Asn Gly Glu Leu Leu Phe Phe Arg Gln Arg Glu Gly Pro Phe Tyr Pro

65 70 75 80

Thr Leu Arg Leu Leu His Lys Tyr Pro Phe Ile Leu Pro His Gln Gln

85 90 95

Val Asp Lys Gly Ala Ile Lys Phe Val Leu Ser Gly Ala Asn Ile Met

100 105 110

Cys Pro Gly Leu Thr Ser Pro Gly Ala Lys Leu Tyr Pro Ala Ala Val

115 120 125

Asp Thr Ile Val Ala Ile Met Ala Glu Gly Lys Gln His Ala Leu Cys

130 135 140

Val Gly Val Met Lys Met Ser Ala Glu Asp Ile Glu Lys Val Asn Lys

145 150 155 160

Gly Ile Gly Ile Glu Asn Ile His Tyr Leu Asn Asp Gly Leu Trp His

165 170 175

Met Lys Thr Tyr Lys

180

<210> 8

<211> 172

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Met Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Ile Ser His Asp Glu Met Phe Ser Asp

1 5 10 15

Ile Tyr Lys Ile Arg Glu Ile Ala Asp Gly Leu Cys Leu Glu Val Glu

20 25 30

Gly Lys Met Val Ser Arg Thr Glu Gly Asn Ile Asp Asp Ser Leu Ile

35 40 45

Gly Gly Asn Ala Ser Ala Glu Gly Pro Glu Gly Glu Gly Thr Glu Ser

50 55 60

Thr Val Ile Thr Gly Val Asp Ile Val Met Asn His His Leu Gln Glu

65 70 75 80

Thr Ser Phe Thr Lys Glu Ala Tyr Lys Lys Tyr Ile Lys Asp Tyr Met

85 90 95

Lys Ser Ile Lys Gly Lys Leu Glu Glu Gln Arg Pro Glu Arg Val Lys

100 105 110

Pro Phe Met Thr Gly Ala Ala Glu Gln Ile Lys His Ile Leu Ala Asn

115 120 125

Phe Lys Asn Tyr Gln Phe Phe Ile Gly Glu Asn Met Asn Pro Asp Gly

130 135 140

Met Val Ala Leu Leu Asp Tyr Arg Glu Asp Gly Val Thr Pro Tyr Met

145 150 155 160

Ile Phe Phe Lys Asp Gly Leu Glu Met Glu Lys Cys

165 170

<210> 9

<211> 412

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

Pro Pro Lys Lys Gln Ala Gln Ala Gly Gly Ser Lys Lys Ala Glu Gln

1 5 10 15

Lys Lys Lys Glu Lys Ile Ile Glu Asp Lys Thr Phe Gly Leu Lys Asn

20 25 30

Lys Lys Gly Ala Lys Gln Gln Lys Phe Ile Lys Ala Val Thr His Gln

35 40 45

Val Lys Phe Gly Gln Gln Asn Pro Arg Gln Val Ala Gln Ser Glu Ala

50 55 60

Glu Lys Lys Leu Lys Lys Asp Asp Lys Lys Lys Glu Leu Gln Glu Leu

65 70 75 80

Asn Glu Leu Phe Lys Pro Val Val Ala Ala Gln Lys Ile Ser Lys Gly

85 90 95

Ala Asp Pro Lys Ser Val Val Cys Ala Phe Phe Lys Gln Gly Gln Cys

100 105 110

Thr Lys Gly Asp Lys Cys Lys Phe Ser His Asp Leu Thr Leu Glu Arg

115 120 125

Lys Cys Glu Lys Arg Ser Val Tyr Ile Asp Ala Arg Asp Glu Glu Leu

130 135 140

Glu Lys Asp Thr Met Asp Asn Trp Asp Glu Lys Lys Leu Glu Glu Val

145 150 155 160

Val Asn Lys Lys His Gly Glu Ala Glu Lys Lys Lys Pro Lys Thr Gln

165 170 175

Ile Val Cys Lys His Phe Leu Glu Ala Ile Glu Asn Asn Lys Tyr Gly

180 185 190

Trp Phe Trp Val Cys Pro Gly Gly Gly Asp Ile Cys Met Tyr Arg His

195 200 205

Ala Leu Pro Pro Gly Phe Val Leu Lys Lys Asp Lys Lys Lys Glu Glu

210 215 220

Lys Glu Asp Glu Ile Ser Leu Glu Asp Leu Ile Glu Arg Glu Arg Ser

225 230 235 240

Ala Leu Gly Pro Asn Val Thr Lys Ile Thr Leu Glu Ser Phe Leu Ala

245 250 255

Trp Lys Lys Arg Lys Arg Gln Glu Lys Ile Asp Lys Leu Glu Gln Asp

260 265 270

Met Glu Arg Arg Lys Ala Asp Phe Lys Ala Gly Lys Ala Leu Val Ile

275 280 285

Ser Gly Arg Glu Val Phe Glu Phe Arg Pro Glu Leu Val Asn Asp Asp

290 295 300

Asp Glu Glu Ala Asp Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Gly Thr Gly Gly Asp

305 310 315 320

Glu Val Asp Asp Ser Val Ser Val Asn Asp Ile Asp Leu Ser Leu Tyr

325 330 335

Ile Pro Arg Asp Val Asp Glu Thr Gly Ile Thr Val Ala Ser Leu Glu

340 345 350

Arg Phe Ser Thr Tyr Thr Ser Asp Lys Asp Glu Asn Lys Leu Ser Glu

355 360 365

Ala Ser Gly Gly Arg Ala Glu Asn Gly Glu Arg Ser Asp Leu Glu Glu

370 375 380

Asp Asn Glu Arg Glu Gly Thr Glu Asn Gly Ala Ile Asp Ala Val Pro

385 390 395 400

Val Asp Glu Lys Ser Phe His Trp Arg Gly Phe Gly

405 410

<210> 10

<211> 269

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

Ala Cys Arg Pro Arg Ser Pro Pro Arg His Gln Ser Arg Cys Asp Gly

1 5 10 15

Asp Ala Ser Pro Pro Ser Pro Ala Arg Trp Ser Leu Gly Arg Lys Arg

20 25 30

Arg Ala Asp Gly Arg Arg Trp Arg Pro Glu Asp Ala Glu Glu Ala Glu

35 40 45

His Arg Gly Ala Glu Arg Arg Pro Glu Ser Phe Thr Thr Pro Glu Gly

50 55 60

Pro Lys Pro Arg Ser Arg Cys Ser Asp Trp Ala Ser Ala Val Glu Glu

65 70 75 80

Asp Glu Met Arg Thr Arg Val Asn Lys Glu Met Ala Arg Tyr Lys Arg

85 90 95

Lys Leu Leu Ile Asn Asp Phe Gly Arg Glu Arg Lys Ser Ser Ser Gly

100 105 110

Ser Ser Asp Ser Lys Glu Ser Met Ser Thr Val Pro Ala Asp Phe Glu

115 120 125

Thr Asp Glu Ser Val Leu Met Arg Arg Gln Lys Gln Ile Asn Tyr Gly

130 135 140

Lys Asn Thr Ile Ala Tyr Asp Arg Tyr Ile Lys Glu Val Pro Arg His

145 150 155 160

Leu Arg Gln Pro Gly Ile His Pro Lys Thr Pro Asn Lys Phe Lys Lys

165 170 175

Tyr Ser Arg Arg Ser Trp Asp Gln Gln Ile Lys Leu Trp Lys Val Ala

180 185 190

Leu His Phe Trp Asp Pro Pro Ala Glu Glu Gly Cys Asp Leu Gln Glu

195 200 205

Ile His Pro Val Asp Leu Glu Ser Ala Glu Ser Ser Ser Glu Pro Gln

210 215 220

Thr Ser Ser Gln Asp Asp Phe Asp Val Tyr Ser Gly Thr Pro Thr Lys

225 230 235 240

Val Arg His Met Asp Ser Gln Val Glu Asp Glu Phe Asp Leu Glu Ala

245 250 255

Cys Leu Thr Glu Pro Leu Arg Asp Phe Ser Ala Met Ser

260 265

<210> 11

<211> 95

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

Pro Gly Pro Thr Pro Ser Gly Thr Asn Val Gly Ser Ser Gly Arg Ser

1 5 10 15

Pro Ser Lys Ala Val Ala Ala Arg Ala Ala Gly Ser Thr Val Arg Gln

20 25 30

Arg Lys Asn Ala Ser Cys Gly Thr Arg Ser Ala Gly Arg Thr Thr Ser

35 40 45

Ala Gly Thr Gly Gly Met Trp Arg Phe Tyr Thr Glu Asp Ser Pro Gly

50 55 60

Leu Lys Val Gly Pro Val Pro Val Leu Val Met Ser Leu Leu Phe Ile

65 70 75 80

Ala Ser Val Phe Met Leu His Ile Trp Gly Lys Tyr Thr Arg Ser

85 90 95

<210> 12

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Val Gly Pro Val Pro Val Leu Val Met Ser Leu Leu Phe Ile Ala Ser

1 5 10 15

Val Phe Met Leu His Ile Trp

20

<210> 13

<211> 285

<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

Arg Leu Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Phe Pro Ala

1 5 10 15

Thr Val Leu Phe Arg Gly Gly Pro Arg Gly Leu Leu Ala Val Ala Gln

20 25 30

Asp Leu Thr Glu Asp Glu Glu Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Glu Asp

35 40 45

Glu Asp Asp Glu Ala Glu Val Glu Glu Asp Glu Pro Thr Asp Leu Val

50 55 60

Glu Asp Lys Glu Glu Glu Asp Val Ser Gly Glu Pro Glu Ala Ser Pro

65 70 75 80

Ser Ala Asp Thr Thr Ile Leu Phe Val Lys Gly Glu Asp Phe Pro Ala

85 90 95

Asn Asn Ile Val Lys Phe Leu Val Gly Phe Thr Asn Lys Gly Thr Glu

100 105 110

Asp Phe Ile Val Glu Ser Leu Asp Ala Ser Phe Arg Tyr Pro Gln Asp

115 120 125

Tyr Gln Phe Tyr Ile Gln Asn Phe Thr Ala Leu Pro Leu Asn Thr Val

130 135 140

Val Pro Pro Gln Arg Gln Ala Thr Phe Glu Tyr Ser Phe Ile Pro Ala

145 150 155 160

Glu Pro Met Gly Gly Arg Pro Phe Gly Leu Val Ile Asn Leu Asn Tyr

165 170 175

Lys Asp Leu Asn Gly Asn Val Phe Gln Asp Ala Val Phe Asn Gln Thr

180 185 190

Val Thr Val Ile Glu Arg Glu Asp Gly Leu Asp Gly Glu Thr Ile Phe

195 200 205

Met Tyr Met Phe Leu Ala Gly Leu Gly Leu Leu Val Ile Val Gly Leu

210 215 220

His Gln Leu Leu Glu Ser Arg Lys Arg Lys Arg Pro Ile Gln Lys Val

225 230 235 240

Glu Met Gly Thr Ser Ser Gln Asn Asp Val Asp Met Ser Trp Ile Pro

245 250 255

Gln Glu Thr Leu Asn Gln Ile Asn Lys Ala Ser Pro Arg Arg Leu Pro

260 265 270

Arg Lys Arg Ala Gln Lys Arg Ser Val Gly Ser Asp Glu

275 280 285

<210> 14

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Thr Ile Phe Met Tyr Met Phe Leu Ala Gly Leu Gly Leu Leu Val Ile

1 5 10 15

Val Gly Leu His Gln Leu Leu

20

<210> 15

<211> 609

<212> PRT

<213> 智人

<400> 15

Leu Asp Phe Phe Thr Ile Phe Ser Lys Gly Gly Leu Val Leu Trp Cys

1 5 10 15

Phe Gln Gly Val Ser Asp Ser Cys Thr Gly Pro Val Asn Ala Leu Ile

20 25 30

Arg Ser Val Leu Leu Gln Val Gly Phe Gln Lys Ile Leu Thr Leu Thr

35 40 45

Tyr Val Asp Lys Leu Ile Asp Asp Val His Arg Leu Phe Arg Asp Lys

50 55 60

Tyr Arg Thr Glu Ile Gln Gln Gln Ser Ala Leu Ser Leu Leu Asn Gly

65 70 75 80

Thr Phe Asp Phe Gln Asn Asp Phe Leu Arg Leu Leu Arg Glu Ala Glu

85 90 95

Glu Ser Ser Lys Ile Arg Ala Pro Thr Thr Met Lys Lys Phe Glu Asp

100 105 110

Ser Glu Lys Ala Lys Lys Pro Val Arg Ser Met Ile Glu Thr Arg Gly

115 120 125

Glu Lys Pro Lys Glu Lys Ala Lys Asn Ser Lys Lys Lys Gly Ala Lys

130 135 140

Lys Glu Gly Ser Asp Gly Pro Leu Ala Thr Ser Lys Pro Val Pro Ala

145 150 155 160

Glu Lys Ser Gly Leu Pro Val Gly Pro Glu Asn Gly Val Glu Leu Ser

165 170 175

Lys Glu Glu Leu Ile Arg Arg Lys Arg Glu Glu Phe Ile Gln Lys His

180 185 190

Gly Arg Gly Met Glu Lys Ser Asn Lys Ser Thr Lys Ser Asp Ala Pro

195 200 205

Lys Glu Lys Gly Lys Lys Ala Pro Arg Val Trp Glu Leu Gly Gly Cys

210 215 220

Ala Asn Lys Glu Val Leu Asp Tyr Ser Thr Pro Thr Thr Asn Gly Thr

225 230 235 240

Pro Glu Ala Ala Leu Ser Glu Asp Ile Asn Leu Ile Arg Gly Thr Gly

245 250 255

Ser Gly Gly Gln Leu Gln Asp Leu Asp Cys Ser Ser Ser Asp Asp Glu

260 265 270

Gly Ala Ala Gln Asn Ser Thr Lys Pro Ser Ala Thr Lys Gly Thr Leu

275 280 285

Gly Gly Met Phe Gly Met Leu Lys Gly Leu Val Gly Ser Lys Ser Leu

290 295 300

Ser Arg Glu Asp Met Glu Ser Val Leu Asp Lys Met Arg Asp His Leu

305 310 315 320

Ile Ala Lys Asn Val Ala Ala Asp Ile Ala Val Gln Leu Cys Glu Ser

325 330 335

Val Ala Asn Lys Leu Glu Gly Lys Val Met Gly Thr Phe Ser Thr Val

340 345 350

Thr Ser Thr Val Lys Gln Ala Leu Gln Glu Ser Leu Val Gln Ile Leu

355 360 365

Gln Pro Gln Arg Arg Val Asp Met Leu Arg Asp Ile Met Asp Ala Gln

370 375 380

Arg Arg Gln Arg Pro Tyr Val Val Thr Phe Cys Gly Val Asn Gly Val

385 390 395 400

Gly Lys Ser Thr Asn Leu Ala Lys Ile Ser Phe Trp Leu Leu Glu Asn

405 410 415

Gly Phe Ser Val Leu Ile Ala Ala Cys Asp Thr Phe Arg Ala Gly Ala

420 425 430

Val Glu Gln Leu Arg Thr His Thr Arg Arg Leu Ser Ala Leu His Pro

435 440 445

Pro Glu Lys His Gly Gly Arg Thr Met Val Gln Leu Phe Glu Lys Gly

450 455 460

Tyr Gly Lys Asp Ala Ala Gly Ile Ala Met Glu Ala Ile Ala Phe Ala

465 470 475 480

Arg Asn Gln Gly Phe Asp Val Val Leu Val Asp Thr Ala Gly Arg Met

485 490 495

Gln Asp Asn Ala Pro Leu Met Thr Ala Leu Ala Lys Leu Ile Thr Val

500 505 510

Asn Thr Pro Asp Leu Val Leu Phe Val Gly Glu Ala Leu Val Gly Asn

515 520 525

Glu Ala Val Asp Gln Leu Val Lys Phe Asn Arg Ala Leu Ala Asp His

530 535 540

Ser Met Ala Gln Thr Pro Arg Leu Ile Asp Gly Ile Val Leu Thr Lys

545 550 555 560

Phe Asp Thr Ile Asp Asp Lys Val Gly Ala Ala Ile Ser Met Thr Tyr

565 570 575

Ile Thr Ser Lys Pro Ile Val Phe Val Gly Thr Gly Gln Thr Tyr Cys

580 585 590

Asp Leu Arg Ser Leu Asn Ala Lys Ala Val Val Ala Ala Leu Met Lys

595 600 605

Ala

<210> 16

<211> 18

<212> PRT

<213> 智人

<400> 16

Ser Thr Leu Gly His Met Val Leu Phe Pro Val Trp Phe Leu Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Leu

<210> 17

<211> 261

<212> PRT

<213> 智人

<400> 17

Asp Ile Tyr Asp Thr Gln Thr Leu Gly Val Val Val Phe Gly Gly Phe

1 5 10 15

Met Val Val Ser Ala Ile Gly Ile Phe Leu Val Ser Thr Phe Ser Met

20 25 30

Lys Glu Thr Ser Tyr Glu Glu Ala Leu Ala Asn Gln Arg Lys Glu Met

35 40 45

Ala Lys Thr His His Gln Lys Val Glu Lys Lys Lys Lys Glu Lys Thr

50 55 60

Val Glu Lys Lys Gly Lys Thr Lys Lys Lys Glu Glu Lys Pro Asn Gly

65 70 75 80

Lys Ile Pro Asp His Asp Pro Ala Pro Asn Val Thr Val Leu Leu Arg

85 90 95

Glu Pro Val Arg Ala Pro Ala Val Ala Val Ala Pro Thr Pro Val Gln

100 105 110

Pro Pro Ile Ile Val Ala Pro Val Ala Thr Val Pro Ala Met Pro Gln

115 120 125

Glu Lys Leu Ala Ser Ser Pro Lys Asp Lys Lys Lys Lys Glu Lys Lys

130 135 140

Val Ala Lys Val Glu Pro Ala Val Ser Ser Val Val Asn Ser Ile Gln

145 150 155 160

Val Leu Thr Ser Lys Ala Ala Ile Leu Glu Thr Ala Pro Lys Glu Gly

165 170 175

Arg Asn Thr Asp Val Ala Gln Ser Pro Glu Ala Pro Lys Gln Glu Ala

180 185 190

Pro Ala Lys Lys Lys Ser Gly Ser Lys Lys Lys Gly Pro Pro Asp Ala

195 200 205

Asp Gly Pro Leu Tyr Leu Pro Tyr Lys Thr Leu Val Ser Thr Val Gly

210 215 220

Ser Met Val Phe Asn Glu Gly Glu Ala Gln Arg Leu Ile Glu Ile Leu

225 230 235 240

Ser Glu Lys Ala Gly Ile Ile Gln Asp Thr Trp His Lys Ala Thr Gln

245 250 255

Lys Gly Asp Pro Val

260

<210> 18

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人

<400> 18

Leu Gly Val Val Val Phe Gly Gly Phe Met Val Val Ser Ala Ile Gly

1 5 10 15

Ile Phe Leu Val Ser Thr Phe

20

<210> 19

<211> 30

<212> PRT

<213> 智人

<400> 19

Asp Ile Tyr Asp Thr Gln Thr Leu Gly Val Val Val Phe Gly Gly Phe

1 5 10 15

Met Val Val Ser Ala Ile Gly Ile Phe Leu Val Ser Thr Phe

20 25 30

<210> 20

<211> 4

<212> PRT

<213> 智人

<400> 20

Lys Asp Glu Leu

1

<210> 21

<211> 4

<212> PRT

<213> 智人

<400> 21

Lys Glu Glu Leu

1

<210> 22

<211> 19

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser

Claims

1.用于提高靶mRNA的蛋白质表达水平的融合蛋白，所述融合蛋白包含：

(A)一个或更多个提高mRNA的蛋白质表达水平的功能结构域；和

(B)能够以RNA碱基选择性或RNA碱基序列特异性方式与靶mRNA结合的多肽部分，

[式1]

(螺旋A)-X-(螺旋B)-L (式1)

其中

螺旋A是长度上由12个氨基酸组成并且能够形成α-螺旋结构的部分，并且由式2表示：

[式2]

A₁-A₂-A₃-A₄-A₅-A₆-A₇-A₈-A₉-A₁₀-A₁₁-A₁₂ (式2)

其中A₁至A₁₂各自独立地表示氨基酸；

X不存在，或者是长度上由1至9个氨基酸组成的部分；

螺旋B是长度上由11至13个氨基酸组成并且能够形成α-螺旋结构的部分；

L是长度上由2至7个氨基酸组成并且由式3表示的部分：

[式3]

L_vli-L_vi-L_v-L_iv-L_iii-L_ii-L_i (式3)

其中所述氨基酸从C端起编号为“i”(-1)、“ii”(-2)、……并且

L_iii至L_vii可以不存在，并且

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中多肽部分(B)包含2至30个PPR基序，并且所述多个PPR基序被布置成特异性结合所述靶mRNA的碱基序列。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，多肽部分(B)包含5至25个PPR基序。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中一个或更多个功能结构域(A)各自结合至多肽部分(B)的N端和/或C端。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白，其中一个或更多个功能结构域(A)选自将核糖体引导至所述mRNA的结构域、与所述mRNA的翻译的起始或促进相关的结构域、与所述mRNA的核输出相关的结构域、与和内质网膜的结合相关的结构域、包含内质网驻留信号(ER驻留信号)序列的结构域和包含内质网信号序列的结构域。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白，

其中所述将核糖体引导至所述mRNA的结构域是包含选自以下的多肽的全部或功能性部分的结构域：DENR(密度调节蛋白)、MCT-1(恶性T细胞扩增序列1)、TPT1(翻译控制的肿瘤蛋白)和Lerepo4(锌指CCCH结构域)，

所述与所述mRNA的核输出相关的结构域是包含SLBP(茎-环结合蛋白)的全部或功能性部分的结构域，

所述与和内质网膜的结合相关的结构域是包含选自以下的多肽的全部或功能性部分的结构域：SEC61B、TRAP-α(易位子相关蛋白α)、SR-α、Dial(细胞色素b5还原酶3)和p180，

所述内质网信号序列是包含MGWSCIILFLVATATGAHS的信号序列。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白，其中每个所述PPR基序中所述三个氨基酸A₁、A₄和L_ii的组合是：

8.根据权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白，其中每个所述PPR基序中所述两个氨基酸A₄和L_ii的组合是：

9.核酸，其编码根据权利要求1至8中任一项所述的融合蛋白。

10.载体，其包含根据权利要求9所述的核酸。

11.根据权利要求10所述的载体，其中所述载体是表达载体。

12.提高细胞内靶mRNA的蛋白质表达水平的方法，所述方法包括：

提供根据权利要求1至8中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求10或11所述的载体的步骤；以及

将所述融合蛋白或所述载体引入细胞中的步骤。

13.根据权利要求12所述的方法，

其中所述细胞是真核细胞。

14.根据权利要求13所述的方法，

其中所述细胞是动物细胞。

15.根据权利要求14所述的方法，

其中所述动物细胞是人细胞。