JPWO2017209122A1 - 標的mRNAからのタンパク質発現量を向上させるための融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】mRNAからのタンパク質発現量を向上させる機能ドメインと、標的mRNAに対してRNA塩基選択的に、または、RNA塩基配列特異的に結合可能なPPRタンパク質との融合タンパク質を提供する。
【選択図】なし
Description
前記融合タンパク質は、
(A)mRNAからのタンパク質発現量を向上させる、1または複数の機能ドメイン、および
(B)標的mRNAに対してRNA塩基選択的に、または、RNA塩基配列特異的に結合可能なポリペプチド部分、
を含み、
前記(B)のポリペプチド部分が、式1で表される30〜38アミノ酸長のポリペプチドからなるPPRモチーフを1個以上含む、ポリペプチド部分であり
Helix Aは、12アミノ酸長の、αヘリックス構造を形成可能な部分であって、式2で表され、
Xは、存在しないか、または、1〜9アミノ酸長からなる部分であり;
Helix Bは、11〜13アミノ酸長からなる、αヘリックス構造を形成可能な部分であり;
Lは、2〜7アミノ酸長の、式3で表される部分であり;
ただし、Liii〜Lviiは存在しない場合がある。)
A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせ、又はA4、Liiの2つのアミノ酸の組み合わせが、標的mRNAの塩基または塩基配列に対応したものとなっている、
融合タンパク質、に関する。
前記mRNAの翻訳開始または翻訳促進に関連するドメインが、eIF4EおよびeIF4Gからなる群から選択されるポリペプチドの全部または機能的な一部を含むドメインであり、
前記mRNAの核外への輸送に関連するドメインが、SLBP(Stem−loop binding protein)の全部または機能的な一部を含むドメインであり、
前記小胞体膜への結合に関連するドメインが、SEC61B、TRAP−alpha(Translocon associated protein alpha)、SR−alpha、Dia1(Cytochrome b5 reductase 3)、および、p180からなる群から選択されるポリペプチドの全部または機能的な一部を含むドメインであり、
前記小胞体保留シグナル(ER retention signal)配列は、KDEL(KEEL)配列を含むシグナル配列であり、または、
前記小胞体シグナル配列は、MGWSCIILFLVATATGAHS(配列番号22)を含むシグナル配列である、ことを特徴とする。
PPRモチーフの標的とする塩基がA(アデニン)である場合には、A1、A4、およびLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、(A1、A4、Lii)の順に、(バリン、トレオニン、アスパラギン)、(フェニルアラニン、セリン、アスパラギン)、(フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン)、(イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸)、または(トレオニン、トレオニン、アスパラギン)であり;
PPRモチーフの標的とする塩基がG(グアニン)である場合には、A1、A4、およびLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、(A1、A4、Lii)の順に、(グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸)、(バリン、トレオニン、アスパラギン酸)、(リジン、トレオニン、アスパラギン酸)、または(ロイシン、トレオニン、アスパラギン酸)であり;
PPRモチーフの標的とする塩基がU(ウラシル)である場合には、A1、A4、およびLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、(A1、A4、Lii)の順に、(バリン、アスパラギン、アスパラギン酸)、(イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン)、(イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸)、(イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸)、(フェニルアラニン、プロリン、アスパラギン酸)、または(チロシン、プロリン、アスパラギン酸)であり;または、
PPRモチーフの標的とする塩基がC(シトシン)である場合には、A1、A4、およびLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、(A1、A4、Lii)の順に、(バリン、アスパラギン、アスパラギン)、(イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン)、(バリン、アスパラギン、セリン)、または(イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸)である、ことを特徴とする。
PPRモチーフの標的とする塩基がA(アデニン)である場合には、A4およびLiiの2つのアミノ酸の組み合わせが、(A4、Lii)の順に、(トレオニン、アスパラギン)、
(セリン、アスパラギン)、または(グリシン、アスパラギン)であり;
PPRモチーフの標的とする塩基がG(グアニン)である場合には、A4およびLiiの2つのアミノ酸の組み合わせが、(A4、Lii)の順に、(トレオニン、アスパラギン酸)
または(グリシン、アスパラギン酸)であり;
PPRモチーフの標的とする塩基がU(ウラシル)である場合には、A4およびLiiの2つのアミノ酸の組み合わせが、(A4、Lii)の順に、(アスパラギン、アスパラギン酸)、(プロリン、アスパラギン酸)、(メチオニン、アスパラギン酸)、または(バリン、トレオニン)であり;
PPRモチーフの標的とする塩基がC(シトシン)である場合には、A4およびLiiの2つのアミノ酸の組み合わせが、(A4、Lii)の順に、(アスパラギン、アスパラギン)、
(アスパラギン、セリン)、または(ロイシン、アスパラギン酸)である、ことを特徴とする。
上記の本発明の融合タンパク質、または、上記の本発明のベクターを準備するステップ、および、
前記融合タンパク質、または、ベクターを細胞内へ導入するステップ、を含む、
方法、に関する。
本発明で「PPRモチーフ」というときは、特に記載した場合を除き、Web上のタンパク質ドメイン検索プログラムでアミノ酸配列を解析した際に、PfamにおいてPF01535、PrositeにおいてPS51375で得られるE値が所定値以下(望ましくはE−03)のアミノ酸配列をもつ30〜38アミノ酸で構成されるポリペプチドをいう。本発明で定義するPPRモチーフを構成するアミノ酸の位置番号は、PF01535とほぼ同義である一方で、PS51375のアミノ酸の場所から2引いた数(例;本発明の1番→PS51375の3番)に相当する。ただし、“ii”(−2)番のアミノ酸というときは、PPRモチーフを構成するアミノ酸の後ろ(C末端側)から2番目のアミノ酸、又は次のPPRモチーフの1番アミノ酸に対して2コN末端側、すなわち−2番目のアミノ酸とする。次のPPRモチーフが明確に同定されない場合、次のヘリックス構造の1番目のアミノ酸に対して、2コ前のアミノ酸を“ii”とする。Pfamについてはhttp://pfam.sanger.ac.uk/、Prositeについては、http://www.expasy.org/prosite/を参照することができる。
Helix Aは、12アミノ酸長の、αヘリックス構造を形成可能な部分であって、式2で表され、
Xは、存在しないか、または、1〜9アミノ酸長からなる部分であり;
Helix Bは、11〜13アミノ酸長からなる、αヘリックス構造を形成可能な部分であり;
Lは、2〜7アミノ酸長の、式3で表される部分であり;
ただし、Liii〜Lviiは存在しない場合がある。
PPRモチーフの、1、4、“ii”(−1)番の3つのアミノ酸の組み合わせ(A1、A4、Lii)、又は4、“ii”(−1)番の2つのアミノ酸の組み合わせ(A4、Lii)が、RNA塩基との選択的な結合のために重要であり、これらの組み合わせにより、結合するRNA塩基がいずれであるかを決定できる。
(3−1)A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、アスパラギン及びアスパラギン酸の場合、そのPPRモチーフは、Uに強く結合し、次にCに、その次にA又はGに対して結合するという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3−2)A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、トレオニン、アスパラギンの場合、そのPPRモチーフは、Aに強く結合し、次にGに、その次にCに対して結合するが、Uには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3−3)A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、アスパラギン、アスパラギンの場合、そのPPRモチーフは、Cに強く結合し、次にA又はUに対して結合するが、Gには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3−4)A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸の場合、そのPPRモチーフは、Gに強く結合するが、A、U及びCには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3−5)A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギンの場合、そのPPRモチーフは、Cに強く結合し、次にUに、その次にAに対して結合するが、Gには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3−6)A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、トレオニン、アスパラギン酸の場合、そのPPRモチーフは、Gに強く結合し、次にUに対して結合するが、AとCには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3−7)A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、リジン、トレオニン、アスパラギン酸、の場合、そのPPRモチーフは、Gに強く結合し、次にAに対して結合するが、U及びCには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3−8)A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、フェニルアラニン、セリン、アスパラギンの場合、そのPPRモチーフは、Aに強く結合し、次にCに、その次にG及びUに対して結合するという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3−9)A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、アスパラギン、セリンの場合、そのPPRモチーフは、Cに強く結合し、次にUに対して結合するが、A及びGには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3−10)A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギンの場合、そのPPRモチーフは、Aに強く結合するが、G、U及びCには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3−11)A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸の場合、そのPPRモチーフは、Uに強く結合し、次にAに対して結合するが、G及びCには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3−12)A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、トレオニン、トレオニン、アスパラギンの場合、そのPPRモチーフは、Aに強く結合するが、G、U及びCには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3−13)A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸の場合、そのPPRモチーフは、Uに強く結合し、次にCに対して結合するが、A及びGには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3−14)A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、フェニルアラニン、プロリン、アスパラギン酸の場合PPR、そのモチーフは、Uに強く結合し、次にCに対して結合するが、A及びGには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3−15)A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、チロシン、プロリン、アスパラギン酸の場合、そのPPRモチーフは、Uに強く結合するが、A、G及びCには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3−16)A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、ロイシン、トレオニン、アスパラギン酸の場合、そのPPRモチーフは、Gに強く結合するが、A、U及びCには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(2−1)A4、Liiが、順に、アスパラギン、アスパラギン酸の場合、そのPPRモチーフは、Uに強く結合し、次にC、その次にA及びGに対して結合するという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(2−2)A4、Liiが、順に、アスパラギン、アスパラギンの場合、そのPPRモチーフは、Cに強く結合し、次にU、その次にA及びGに対して結合するという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(2−3)A4、Liiが、順に、トレオニン、アスパラギンの場合、そのPPRモチーフは、Aに強く結合し、次にG、U及びCに対して弱く結合するという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(2−4)A4、Liiが、順に、トレオニン、アスパラギン酸の場合、そのPPRモチーフは、Gに強く結合し、次にA、U及びCに対して弱く結合するという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(2−5)A4、Liiが、順に、セリン、アスパラギンの場合、そのPPRモチーフは、Aに強く結合し、次にG、U及びCに対して結合するという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(2−6)A4、Liiが、順に、グリシン、アスパラギン酸の場合、そのPPRモチーフは、Gに強く結合し、次にU、その次にAと結合するが、Cに結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(2−7)A4、Liiが、順に、アスパラギン、セリンの場合、そのPPRモチーフは、Cに強く結合し、次にU、その次にA及びGに対して結合するという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(2−8)A4、Liiが、順に、プロリン、アスパラギン酸の場合、そのPPRモチーフは、Uに強く結合し、次にG、C及びCに対して結合するが、Aに結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(2−9)A4、Liiが、順に、グリシン、アスパラギンの場合、そのPPRモチーフは、Aに強く結合し、次にGに対して結合するが、C及びUに結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(2−10)A4、Liiが、順に、メチオニン、アスパラギン酸の場合、そのPPRモチーフは、Uに強く結合し、次にA、G及びCに対して弱く結合するという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(2−11)A4、Liiが、順に、ロイシン、アスパラギン酸の場合、そのPPRモチーフは、Cに強く結合し、次にUに対して結合するが、A及びGに結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(2−12)A4、Liiが、順に、バリン、トレオニンの場合、そのPPRモチーフは、Uに強く結合し、次にAに対して結合するが、G及びCに結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
同定および設計:
一のPPRモチーフは、RNAの特定の塩基を認識しうる。そして、本発明に基づけば、特定の位置のアミノ酸を適切にすることで、A、U、G、Cそれぞれに選択的なPPRモチーフを選択または設計することができ、さらにはそのようなPPRモチーフの適切な連続を含むタンパク質は、対応する特異的な配列を認識しうる。さらに、上述の知見により、所望のRNA塩基に選択的に結合可能なPPRモチーフ、および所望のRNAに配列特異的に結合可能な、複数個のPPRモチーフを有するタンパク質を設計することができる。設計に際し、PPRモチーフ中の重要な位置のアミノ酸以外の部分は、天然型のPPRモチーフの配列情報を参考にしてもよい。また、全体として天然型を用い、前記の重要な位置のアミノ酸だけを置換することにより、設計してもよい。PPRモチーフの繰り返し数は、標的配列に応じ、適宜とすることができるが、例えば2個以上とすることができ、2〜30個とすることができる。
本発明は、上記に説明したPPRモチーフまたはPPRタンパク質(すなわち、標的mRNAに対してRNA塩基選択的に、または、RNA塩基配列特異的に結合可能なポリペプチド)と、mRNAからのタンパク質発現量を向上させる、1または複数の機能ドメインとの融合タンパク質に関する。
(装置)
・分子生物学実験のための基本的な施設(プラスミド構築のためなど)
・倒立顕微鏡(DM IL S40,Leica Microsystems,Wetzlar,Germany)
・CO2インキュベーター(KM−CC17RH2,Panasonic Healthcare,Tokyo,Japan)
・クリーンベンチ(MHE−S1300A2,Panasonic Healthcare,Tokyo,Japan)
・アスピレーター(SP−30,Air Liquide Medical Systems,Bovezzo BS,Italy)
・遠心機(スイングローター)(LC−200,Tomy Seiko,Tokyo,Japan)
・超低温フリーザー(−80°C)(MDF−C8V,Panasonic Healthcare,Tokyo,Japan)
・plateリーダー(EnSight Kaleido,PerkinElmer,Waltham,MA,USA)
・HEK293T細胞株(注釈1参照)
・Dulbecco’s modified Eagle’s培地(DMEM,高グルコース)(注釈2参照)
・100×penicillin−streptomycin溶液
・Fetal bovine serum(FBS)(注釈3参照)
・EDTA−NaCl溶液:10mM EDTA and 0.85%(w/v) NaCl、pHを7.2−7.4に調整、オートクレーブ滅菌、室温保存
・100×20mm細胞培養シャーレ(Greiner bio one,Frickenhausen,Germany)
・10mL使い捨て滅菌ピペット
・15mL and 50mL プラスチック遠沈管
・1.8mLクライオチューブ(Nunc;Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)
・フリーズコンテナ(Nalgene;Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)
・Bambanker(Lymphotec,Tokyo,Japan)
・エフェクタープラスミド:pcDNA3.1(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)を基本ベクターとして使用した。PPRとeIF4Gの融合遺伝子が発現カセットに挿入されている(100ng/μL)(注釈4参照)
・レポータープラスミド:pcDNA3.1(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)を基本ベクターとして使用した。ルシフェラーゼ遺伝子を発現カセットに挿入され、その5′−UTRにPPR結合配列が挿入されている(100ng/μL)
・Poly−L−lysineコーティングされた96−well plate(AGC Techno glass,Shizuoka,Japan)
・1×phosphate−buffered saline,PBS(−):1.47mM KH2PO4,8.1mM Na2HPO4,137mM NaCl,and 2.7mM KCl.pHを7.4に調整、オートクレーブ滅菌、室温保存
・血球計算盤(細胞数カウントのため)(Improved Neubauer Type Cell counter plate,Watson,Hyogo,Japan)
・トランスフェクション試薬(HilyMax,Dojindo Molecular Technologies,Kumamoto,Japan)
・Dual−Glo Luciferase Assay System(Promega,Madison,WI,USA.)
・96−well luminometer plate(PerkinElmer,Waltham,MA,USA).
(ベクター構築)
レポーターアッセイには、エフェクタープラスミドとレポータープラスミドが必要であり、両プラスミドともpcDNA3.1をもとに構築されている。エフェクタープラスミド側はPPRタンパク質と、ヒトeIF4Gの部分的なドメイン(配列番号1)をコードする融合遺伝子を含む(図1A)。PPRタンパク質部分は、CRR4(配列番号2)を用いた。レポータープラスミド側には、ウミシイタケルシフェラーゼ(RLuc)とホタルルシフェラーゼ(FLuc)という2つのオープンリーディングフレーム(ORF)を含んでおり、これらはジシストロニックに転写される(図1A)。RLuc遺伝子はFLuc遺伝子の5’側に位置しており、遺伝子発現のコントロールとして用いた。PPR結合領域はFLucのORFの5’UTRに挿入され、4塩基配列(ATCGとGATC)によって中断されるCRR4認識配列(5’−UAUCUUGUCUUUA−3’)(配列番号3)の3回の繰り返しからなる。エフェクター融合遺伝子、レポーター遺伝子ともに、それら遺伝子発現には、サイトメガロウイルスプロモーター(CMV)とウシ成長ホルモン遺伝子由来ポリアデニレーションシグナルが使用した。コントロール実験のために、eIF4Gを有しないエフェクタープラスミドを、PPRにFLAGエピトープタグを融合することで構築した。また、PPR結合領域を持たないコントロール用のレポータープラスミドを構築した。
本工程は無菌的に実施する。あらかじめ、全ての器具は70%エタノールで消毒する。
1.15mL遠沈管(滅菌済)に9mLのDMEM培地を入れる。
2.クライオチューブ内の1mLのHEK293T凍結細胞を37℃ウォーターバスでインキュベートすることによって、素早く融解する。
3.その細胞を9mLのDMEMを含んだ15mL遠沈管に加える。
4.室温で、1100×g 、2分間の遠心を行い、上清を取り除く。
5.その細胞を、10mLのDMEM(最終濃度が10%になるようにFBS を添加)に再懸濁する。
6.懸濁された細胞を100mmシャーレに移した。そのシャーレを37℃、5%CO2条件下のインキュベーターに静置した。凍結ストックから培養を始めた時は、その培養細胞は24時間後に継代した。
1.必要枚数の新しい100mmシャーレを準備する。8mLのDMEMと1mLのFBSを各シャーレにあらかじめ添加する。
2.培養細胞を含むシャーレ上の培地をアスピレーターで取り除く(注釈6参照)。
3.2mLのEDTA−NaCl溶液を、シャーレ内の表面の接着細胞上に、細胞を剥がさないように、優しく加える。シャーレを旋回させて溶液を満遍なく全体に行き渡らせる。EDTA−NaCl溶液をアスピレーターで取り除く。シャーレをタッピングして細胞を剥がす。
4.DMEM10mLをシャーレ内の細胞に加え、緩やかにピペッティングして懸濁する。
5.事前に準備された9mLの培地を含むシャーレに、各1mLの懸濁細胞(10%の培養細胞)を加える。シャーレを旋回させ、全体に細胞を行き渡らせる。
凍結ストックはBambanker試薬と、対数増殖中の〜50%細胞密度の培養細胞を用いて作る。Bambankerの使用により、高回収率かつ長期保存が容易に可能となる。
1.継代後2日目の細胞を継代時の手順に従い、細胞を剥がす。5−10mLのDMEMを加え、50mLの遠沈管に細胞を回収する。
2.室温で、1100×g、2分間の遠心を行い、上清を取り除く。
3.1枚のシャーレあたり1mLのBambankerを加えて懸濁する。
4.懸濁細胞を素早くクライオチューブに分注し、蓋を閉める。
5.専用フリーズコンテナに入れ、−80℃で12時間静置する(注釈7参照)。
6.普通のサンプルボックスに移し、−80℃もしくは液体窒素内で保存する。
1.始める前に、継代後2日目の細胞を含むシャーレを、必要とされる枚数を準備し、その細胞が健全(正常)であるかを確かめる(注釈8参照)。おおよその見積りで、1枚のシャーレで96アッセイを行うことができる。
2.継代後2日目の細胞を継代時の手順に従い、細胞を剥がし、懸濁細胞を50mLの遠沈管に移す。
3.室温で、1100×g、2分間の遠心を行い、上清を取り除く。
4.10mLのDMEM(最終濃度が10%になるようにFBSを添加)内で、細胞塊を完全に分散させる。
5.血球計算盤と倒立顕微鏡を用いて、細胞数をカウントする。1−2×105個/mLになるように適量のDMEM(最終濃度が10%になるようにFBSを添加)内に懸濁する。
6.96−well plateを用意し、各wellあたり200μL(2−4×104個/mL)の懸濁培養細胞を加え、37℃、5%CO2条件下のインキュベーター内で一晩静置する。1wellが1アッセイに使用される。
7.翌日、各wellから慎重に培地を取り除き、100μLの新しいDMEM(最終濃度が10%になるようにFBSを添加)と交換する。
8.400ngのエフェクタープラスミド(100ng/μLを4μL)と100ngのレポータープラスミド(100ng/μLを1μL)を、新しい96−well PCR plate(もしくは0.2mLチューブ)上の単一well内に加える。
9.1アッセイあたり、1μLのHilyMAXを10μLの無血清DMEMで希釈する。
10.11μLの希釈溶液を、プラスミドを含む全てのwellに加える。ピペッティングでよく混合する。
11.室温で15分間静置する。培養細胞を含むwellに、全量の混合物を加える。37℃、5%CO2条件下のインキュベーター内で24時間静置する。
デュアルルシフェラーゼアッセイは、Dual−Glo Luciferase Assay Systemを使用して行われ、少しの変更点を除きメーカーの使用説明書に従って行う。
1.トランスフェクション24時間後、各wellの培地を、40μLの1×PBS(−)に交換する。
2.Dual−Glo luciferase試薬を、各wellに40μLずつ加え、ピペッティングでよく混合する。
3.室温で10分間静置し、全量を96−well luminometer plateに移す。
4.FLuc遺伝子発現に関するホタルルシフェラーゼによる発光をプレートリーダーで測定する。
5.Dual−Glo Stop&GloバッファーでStop&Glo基質を100倍希釈する。その希釈された溶液40μLを各wellに加える。
6.少なくとも室温で10分間静置し、それからRLuc遺伝子発現に関するウミシイタケルシフェラーゼによる発光を測定する。
1.アッセイ間のトランスフェクション効率の違いや実験誤差を補正するためにFLuc/RLuc値を計算する。
2.レポーター遺伝子発現の活性上昇を、PPR結合領域存在下、非存在下のそれぞれにおいて、本発明に係るプラスミド(CRR4と翻訳活性化ドメインeIF4Gとの融合タンパク質をコードするプラスミド)を用いて得られた実験値を、コントロールプラスミド(CRR4とFLAG−tagとの融合タンパク質をコードするプラスミド)を用いて得られた実験値で割り算することによって求める。
ルシフェラーゼアッセイの結果を図3に示した。図3に示すとおり、PPR−eIF4GとPPR結合配列の両方の存在下で特異的に2.75倍の翻訳活性が認められた。すなわち、PPRタンパク質と、mRNAからのタンパク質発現量を向上させる機能ドメインとの融合タンパク質は、標的mRNAからのタンパク質発現量を向上させることが示された。
(注釈1)HEK293Tは、SV40 large T antigen を発現しているヒト胎児由来腎臓細胞株である。この細胞株は培養が容易であり、様々な方法で高効率のトランスフェクションが可能である。HEK293T細胞はRIKEN BRC(ja.brc.riken.jp)もしくはATCC(www.atcc.org)で入手可能である。
(注釈2)DMEMは、微生物コンタミネーションを避けるために、1× penicillin−streptomycin溶液を添加する。
(注釈3)使用前に、FBSは56℃、30分間の非動化が行われ、4℃で保存する。
(注釈4)プラスミドの純度は、トランスフェクション効率に極めて重要である。プラスミドはトランスフェクショングレードのキットを用いることで単離すること。
(注釈5)日々の成長率が健全な細胞であることの指標となる。細胞の成長が抑制されることを回避するために、細胞は、常に十分なスペースと栄養条件下で培養すること。
(注釈6)HEK293T細胞は容易に培養シャーレから剥がれるので、培地を交換する際には、優しく扱うこと。
(注釈7)専用フリーズコンテナは凍結スピードを調節できる箱であり(−80℃で、およそ1分あたり−1℃)、そしてこれにより、非プログラム式の−80℃フリーザーでの凍結保存が可能である。
(注釈8)トランスフェクションに関して50−80%の培養密度での細胞を使用する。しかしながら、適切な細胞密度はトランスフェクション試薬に依存する。加えて、トランスフェクション試薬(μL)とプラスミドDNA(μg)の比率もメーカーの使用説明書に応じて、最適化するべきである。ここで記述された手順は、96−well plateで、HEK293T細胞、トランスフェクション試薬としてHilyMAXを用いた条件で最適化されている。
上記のアイデアを検証するために、動物培養細胞(HEK293T)を使ったレポーターアッセイシステムを作成した(用いた機能ドメインが異なること以外は、実施例1に記載の方法と同様の方法で実験を行った)。特定のRNA配列(UAUCUUGUCUUUA)(配列番号3)に結合することが分かっているCRR4タンパク質(シロイヌナズナPPRタンパク質の一つ)を使って系を構築した。まず、CRR4と候補タンパク質機能ドメインとの融合タンパク質発現ベクター(エフェクタープラスミド)を作成した。候補ドメインは、(a)eIFタンパク質(eIF4E,eIF4G)、(b)リボソーム結合タンパク質(DENR,MCT−1,TPT1,Lerepo4)、(c)転写されたmRNAの核から細胞質への輸送促進するHistonの翻訳制御因子(SLBP)、(d)ERアンカータンパク質(SEC61B,TRAP−alpha,SR−alpha,Dia1,p180)、(e)ER retention signal(KDEL)、(f)ER signal peptide、を選んだ。融合タンパク質は、HA−CRR4−XXもしくは、XX−CRR4−HAの形で発現するようにクローニングした(HA:エピトープタグ(配列番号4);XX:候補ドメイン)。
以下の(A)、(B)の指標を用いて、図5および図6に示す結果を検討した。
(A)標的非存在下と存在下との比較
配列特異的にどれくらい翻訳量変化があったのかが分かる。
(B)標的存在下、エフェクターなし(empty)と比較(黒色破線)
ドメイン付加による翻訳量変化が分かる。
(A)2.7倍
(B)1.6倍
2.CRR4のC末側にeIF4Gを融合
(A)4.5倍
(B)3.3倍
3.CRR4のN末側にDENRを融合
(A)1.7倍
(B)1.3倍
4.CRR4のC末側にDENRを融合
(A)2.4倍
(B)1.7倍
5.CRR4のN末側にMCT−1を融合
(A)1.3倍
(B)1.0倍
6.CRR4のC末側にMCT−1を融合
(A)2.0倍
(B)1.2倍
7.CRR4のN末側にTPT−1を融合
(A)1.4倍
(B)1.0倍
8.CRR4のC末側にTPT−1を融合
(A)2.4倍
(B)1.9倍
9.CRR4のN末側にLerepo 4を融合
(A)3.0倍
(B)1.8倍
10.CRR4のC末側にLerepo 4を融合
(A)3.3倍
(B)2.6倍
11.CRR4のC末側にSLBPを融合
(A)4.1倍
(B)3.3倍
12.CRR4のC末側にSec61Bを融合
(A)1.6倍
(B)1.6倍
13.CRR4のC末側にSec61BTMを融合
(A)2.4倍
(B)1.9倍
14.CRR4のC末側にTRAP‐alphaを融合
(A)3.5倍
(B)4.5倍
15.CRR4のC末側にTRAPTMを融合
(A)2.3倍
(B)1.6倍
16.CRR4のN末側にSR‐alphaを融合
(A)1.7倍
(B)1.5倍
17.CRR4のN末側にDia1TMを融合
(A)1.8倍
(B)1.2倍
18.CRR4のN末側にP180TM2Rを融合
(A)2.1倍
(B)1.5倍
19.CRR4のN末側にP180TMHを融合
(A)2.3倍
(B)2.5倍
20.CRR4のN末側にP180TM2を融合
(A)3.0倍
(B)2.1倍
21.CRR4のC末側にKDELを融合
(A)1.8倍
(B)1.4倍
22.CRR4のC末側にKEELを融合
(A)2.3倍
(B)2.1倍
23.CRR4のN末側にSignal peptide(SP)を融合
(A)1.4倍
(B)2.0倍
Claims (15)
- 標的mRNAからのタンパク質発現量を向上させるための融合タンパク質であって、
前記融合タンパク質は、
(A)mRNAからのタンパク質発現量を向上させる、1または複数の機能ドメイン、および
(B)標的mRNAに対してRNA塩基選択的に、または、RNA塩基配列特異的に結合可能なポリペプチド部分、
を含み、
前記(B)のポリペプチド部分が、式1で表される30〜38アミノ酸長のポリペプチドからなるPPRモチーフを1個以上含む、ポリペプチド部分であり
Helix Aは、12アミノ酸長の、αヘリックス構造を形成可能な部分であって、式2で表され、
Xは、存在しないか、または、1〜9アミノ酸長からなる部分であり;
Helix Bは、11〜13アミノ酸長からなる、αヘリックス構造を形成可能な部分であり;
Lは、2〜7アミノ酸長の、式3で表される部分であり;
ただし、Liii〜Lviiは存在しない場合がある。)
A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせ、又はA4、Liiの2つのアミノ酸の組み合わせが、標的mRNAの塩基または塩基配列に対応したものとなっている、
融合タンパク質。 - 請求項1に記載の融合タンパク質であって、前記(B)のポリペプチド部分は、前記PPRモチーフを2〜30個含み、前記複数のPPRモチーフが、標的mRNAの塩基配列に特異的に結合するように配置されている、
融合タンパク質。 - 請求項2に記載の融合タンパク質であって、前記(B)のポリペプチド部分は、前記PPRモチーフを5〜25個含む、
融合タンパク質。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合タンパク質であって、前記(A)の機能ドメインは、前記(B)のポリペプチド部分のN末端側および/またはC末端側に結合されている、
融合タンパク質。 - 請求項1〜4のいずれか1項に記載の融合タンパク質であって、前記(A)の機能ドメインが、mRNAへリボソームを誘導するドメイン、mRNAの翻訳開始または翻訳促進に関連するドメイン、mRNAの核外への輸送に関連するドメイン、小胞体膜への結合に関連するドメイン、小胞体保留シグナル(ER retention signal)配列を含むドメイン、および、小胞体シグナル配列を含むドメイン、からなる群から選択される、
融合タンパク質。 - 請求項5に記載の融合タンパク質であって、
前記mRNAへリボソームを誘導するドメインは、DENR(Density−regulated protein)、MCT−1(Malignant T−cell amplified sequence 1)、TPT1(Translationally−controlled tumor protein)、および、Lerepo4(Zinc finger CCCH−domain)からなる群から選択されるポリペプチドの全部または機能的な一部を含むドメインであり、
前記mRNAの翻訳開始または翻訳促進に関連するドメインは、eIF4EおよびeIF4Gからなる群から選択されるポリペプチドの全部または機能的な一部を含むドメインであり、
前記mRNAの核外への輸送に関連するドメインは、SLBP(Stem−loop binding protein)の全部または機能的な一部を含むドメインであり、
前記小胞体膜への結合に関連するドメインは、SEC61B、TRAP−alpha(Translocon associated protein alpha)、SR−alpha、Dia1(Cytochrome b5 reductase 3)、および、p180からなる群から選択されるポリペプチドの全部または機能的な一部を含むドメインであり、
前記小胞体保留シグナル(ER retention signal)配列は、KDEL(KEEL)配列を含むシグナル配列であり、または、
前記小胞体シグナル配列は、MGWSCIILFLVATATGAHSを含むシグナル配列である、
融合タンパク質。 - 請求項1〜6のいずれか1項に記載の融合タンパク質であって、前記の各PPRモチーフにおけるA1、A4、およびLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが;
PPRモチーフの標的とする塩基がA(アデニン)である場合には、A1、A4、およびLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、(A1、A4、Lii)の順に、(バリン、トレオニン、アスパラギン)、(フェニルアラニン、セリン、アスパラギン)、(フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン)、(イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸)、または(トレオニン、トレオニン、アスパラギン)であり;
PPRモチーフの標的とする塩基がG(グアニン)である場合には、A1、A4、およびLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、(A1、A4、Lii)の順に、(グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸)、(バリン、トレオニン、アスパラギン酸)、(リジン、トレオニン、アスパラギン酸)、または(ロイシン、トレオニン、アスパラギン酸)であり;
PPRモチーフの標的とする塩基がU(ウラシル)である場合には、A1、A4、およびLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、(A1、A4、Lii)の順に、(バリン、アスパラギン、アスパラギン酸)、(イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン)、(イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸)、(イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸)、(フェニルアラニン、プロリン、アスパラギン酸)、または(チロシン、プロリン、アスパラギン酸)であり;または、
PPRモチーフの標的とする塩基がC(シトシン)である場合には、A1、A4、およびLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、(A1、A4、Lii)の順に、(バリン、アスパラギン、アスパラギン)、(イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン)、(バリン、アスパラギン、セリン)、または(イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸)である、
融合タンパク質。 - 請求項1〜6のいずれか1項に記載の融合タンパク質であって、前記の各PPRモチーフにおけるA4およびLiiの2つのアミノ酸の組み合わせが;
PPRモチーフの標的とする塩基がA(アデニン)である場合には、A4およびLiiの2つのアミノ酸の組み合わせが、(A4、Lii)の順に、(トレオニン、アスパラギン)、
(セリン、アスパラギン)、または(グリシン、アスパラギン)であり;
PPRモチーフの標的とする塩基がG(グアニン)である場合には、A4およびLiiの2つのアミノ酸の組み合わせが、(A4、Lii)の順に、(トレオニン、アスパラギン酸)
または(グリシン、アスパラギン酸)であり;
PPRモチーフの標的とする塩基がU(ウラシル)である場合には、A4およびLiiの2つのアミノ酸の組み合わせが、(A4、Lii)の順に、(アスパラギン、アスパラギン酸)、(プロリン、アスパラギン酸)、(メチオニン、アスパラギン酸)、または(バリン、トレオニン)であり;
PPRモチーフの標的とする塩基がC(シトシン)である場合には、A4およびLiiの2つのアミノ酸の組み合わせが、(A4、Lii)の順に、(アスパラギン、アスパラギン)、
(アスパラギン、セリン)、または(ロイシン、アスパラギン酸)である、
融合タンパク質。 - 請求項1〜8のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
- 請求項9に記載の核酸を含む、ベクター。
- ベクターが発現ベクターである、請求項10に記載のベクター。
- 細胞内で標的mRNAからのタンパク質発現量を向上させる方法であって、
請求項1〜8のいずれか1項に記載の融合タンパク質、または、請求項10または11に記載のベクターを準備するステップ、および、
前記融合タンパク質、または、ベクターを細胞内へ導入するステップ、を含む、
方法。 - 請求項12に記載の方法であって、
前記細胞が、真核生物の細胞である、
方法。 - 請求項13に記載の方法であって、
前記細胞が、動物細胞である、
方法。 - 請求項14に記載の発明であって、
前記動物細胞が、ヒト細胞である、
方法。
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