JP2009544296A - バイオリアクター生産性を向上させるポジティブサイトモジュリン - Google Patents

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Abstract

本発明は、転写後のタンパク質へのｍＲＮＡ翻訳工程を制御することによるタンパク質合成の活性化に関する。前記タンパク質翻訳を活性化することができるポリペプチドが提供される。本発明の主要な産業上の用途は、バイオリアクターによる場合を含む培養細胞における組換えタンパク質生産の制御である。

Description

発明の背景
発明の属する技術分野
本発明は、転写後のタンパク質へのｍＲＮＡ翻訳工程を制御することによるタンパク質合成の活性化に関する。本発明の主要な産業上の用途は、バイオリアクターによるタンパク質生産の制御である。
背景技術
真核細胞を用いた組換えタンパク質の生産の向上は、特にバイオリアクターにおけるこれらの細胞の使用に、主として重要である。バイオリアクターによるタンパク質の生産は、２００３年〜２０１０年の間に約４倍に増加すると予想されている（製薬企業のArthur Doolittle Office−ＬＥＥＭによって２００４年に示された"Optimisation de l'attractivite de Ia France pour la production biologique"）。
細胞系による自然発生的in vivoタンパク質生産(The naturally occuring in vivo production of proteins)は、現在、当業者には周知である：プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）が核内でゲノム配列から転写される。次いで、それらはスプライシングプロセス、３’ポリアデニル化プロセスおよび５’キャッピングプロセスによってｍＲＮＡに成熟され、続いて細胞質に輸送され、そこでそれらは翻訳機構によって用いられて、タンパク質合成を命令する。
ｍＲＮＡの５’末端に付加されたキャップはメチル化グアノシン三リン酸である。細胞質において、この修飾ヌクレオチドは、ｍＲＮＡの５’末端への小さな４０Ｓリボソームサブユニットの補充に必要なタンパク質複合体ｅＩＦ４Ｆによって特異的に認識される。一度補充されたら、その４０Ｓリボソームサブユニットは、メチオニンコドン（ＡＵＧ）に遭遇するまでｍＲＮＡに沿って移動する。第二のリボソームサブユニット（６０Ｓ）の結合後にこのコドンにおいて翻訳が開始される。従って、この一連の事象の効率を増進するいずれの分子も翻訳効率を増進するであろう。少数の細胞ウイルスｍＲＮＡの場合、翻訳開始に５’キャップをショートカットするメカニズムを利用する。本発明の概念はこの翻訳開始モードを利用しないため、本明細書ではそのメカニズムを記載しない。前記複合体ｅＩＦ４Ｆは、５’キャップと結合するタンパク質ｅＩＦ４Ｅ、およびｅＩＦ４Ｇなどのいくつかの翻訳開始因子を含む(Wickens et al, 2000)。この後者の因子は、前記ｅＩＦ４Ｆ複合体の集合を可能にするプラットフォームとしての役割を果たす。前記タンパク質ｅＩＦ４Ｇは、いくつかの他のタンパク質、既に記述したｅＩＦ４Ｅ、およびｍＲＮＡの３’末端に付加されるポリアデノシン配列と結合するポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）と結合することができる（図１参照）。ＰＡＢＰとｅＩＦ４Ｇとの結合により、ｍＲＮＡの環状化、前記ｅＩＦ４Ｆ複合体の安定化およびキャップ依存性翻訳のシミュレーション(simulation)がもたらされる(Wickens et al., 2000)。前記ｅＩＦ４Ｆ複合体を不安定にするいずれの事象も翻訳減少を引き起こす。従って、ｍＲＮＡによる３’ポリ（Ａ）テールの喪失は、そのｍＲＮＡと結合するＰＡＢＰの喪失をもたらし、それがｍＲＮＡの翻訳減少に関連する(Kahvejian et al., 2001; Kahvejian et al., 2005)。それに対して、ｍＲＮＡの翻訳は、ポリ（Ａ）テールの長さが増加する（ｍＲＮＡと結合するＰＡＢＰ数の増加をもたらす事象）ときに刺激を受ける(Richter, 1999)。この場合、ポリ（Ａ）テールの長さの増加は、ｅＩＦ４Ｇと相互作用することが可能である結合ＰＡＢＰ数の増加につながり、それが次には翻訳を刺激すると
考えられる。注目すべきは、ＰＡＢＰとポリ（Ａ）テールとの結合が、上記した翻訳への影響の他に、ｍＲＮＡも安定化することである。ＰＡＢＰが枯渇した細胞では、翻訳が減少し、ｍＲＮＡの分解が増加する。
自然発生的in vivoタンパク質生産の多くの態様は周知であるが、この知識を産業上の利用に応用する、例えば組換えタンパク質の大量生産を推進する措置は、一般化された形で講じられていない。
本発明者らは、驚くべきことに、ロタウイルスに存在する非構造タンパク質３の使用が、真核生物組換えタンパク質生産の産業上の要件に応じることができることを見出した。
ロタウイルス（レオウイルス科(Reoviridae family)）は哺乳類細胞に感染し、内因性翻訳機構を利用して、ウイルスタンパク質を合成する(Padilla-Noriega et al., 2002)。ウイルスｍＲＮＡは５’キャップを有するが３’ポリ（Ａ）テールは有していない。その代わりに、ウイルスｍＲＮＡは、ウイルスｍＲＮＡの３’末端の特異的配列と、そしてタンパク質ｅＩＦ４Ｇと結合する、ＰＡＢＰのようなタンパク質ＮＳＰ３（非構造タンパク質３）をコードする(Piron et al., 1998)。ＮＳＰ３とｅＩＦ４Ｇとの相互作用は、ＰＡＢＰと相互作用するｅＩＦ４Ｇの同じドメインによって起こる(Piron et al., 1998)。加えて、ｅＩＦ４Ｇ−ＰＡＢＰ相互作用に関しては、複合体ＮＳＰ３−ｅＩＦ４ＧはｅＩＦ４ＧとｅＩＦ４Ｅとの相互作用を安定化し、その結果としてｅＩＦ４Ｅとキャップとの相互作用を安定化する(Vende et al., 2000)。従って、ＰＡＢＰを翻訳刺激因子としてのその役割においてタンパク質ＮＳＰ３に機能的に置き換えることができる。ＲＮＡおよびｅＩＦ４ＧとのＮＳＰ３の相互作用は２つの別のドメインによって起こる(Piron et al., 1999)。適当なリガンドと結合するこれらのドメイン各々の結晶構造は公開されている(Deo et al., 2002; Groft and Burley, 2002)。
本発明者らは、機能的に異なる２つの部分、ＲＮＡと特異的に相互作用することができるドメインおよびエフェクタードメインからなるハイブリッドタンパク質分子（本明細書においてキメラポリペプチドまたはタンパク質とも呼ぶ）であるサイトモジュリン概念（ポジティブサイトモジュリン、またはサイトブーストプロジェクト(cytoboost project)）を開発した。ＲＮＡ結合ドメインは、標的配列を含むｍＲＮＡと結合する。このドメインは、前記分子を標的ｍＲＮＡに特異的に結合するテザーとしての役割を果たす。第二のドメインはエフェクタードメインであり、サイトブーストプロジェクトでは、このエフェクタードメインが標的ｍＲＮＡの翻訳刺激を引き起こす。テザリング（ＲＮＡ結合）ドメインまたはエフェクタードメインのいずれかを変えることによって、それぞれ、サイトモジュリンのＲＮＡ標的または得られる効果を変えることができる。
図のように、サイトモジュリンは、機能的に異なる２つのドメイン：テザリングドメインおよびエフェクタードメインからなるハイブリッド分子である（図２参照）。
サイトモジュリンのテザリングドメインは、配列特異性を有するｍＲＮＡと結合する。これは、サイトモジュリンが翻訳調節因子としてのその機能を発現し、または標的とするｍＲＮＡの安定性を発現するのに必要である。テザリングドメインはいくつかの方法によって得ることができる。バイオリアクターによる生産を増加するためにサイトモジュリンを使用する本ケースでは、サイトモジュリンは、テザリングドメインおよび標的配列の選択においてより大きな自由を与える組換えｍＲＮＡを認識するものでなければならない。真核細胞、ウイルス、バクテリオファージおよび細菌などの多様な生物では、ある一定数のＲＮＡ結合タンパク質が報告されている。真核細胞で通常発現されるタンパク質由来のテザリングドメインの使用は、サイトモジュリンの特異性の問題を引き起こす。これらの分子は、組換え標的ｍＲＮＡと結合するだけでなく、そのタンパク質の内因性標的である細胞ｍＲＮＡとも結合するであろう。バクテリオファージのゲノムによってコードされるＲＮＡ結合タンパク質が選択されてきた。
ポジティブサイトモジュリンのエフェクタードメインは、翻訳が刺激を受けるように翻訳機構と相互作用しなければならない。この相互作用を達成するためには、前記エフェクタードメインが翻訳機構のリボ核タンパク質複合体の形成を安定化または支援すべきである。翻訳制御に関する調査の現状から、主として５’キャップの認識または４０Sリボソームサブユニットの補充のレベルにおいて調節が存在することが示されている。
本発明のポジティブサイトモジュリンは、３つのドメイン：
二量体としてＲＮＡと結合するＮ末端ドメイン；
その二量体化に重要であると思われる中央ドメイン；
ｅＩＦ４Ｇと結合するＣ末端ドメイン；
からなるタンパク質ＮＳＰ３由来のエフェクタードメインに基づく。
このようにして、本発明者らは、タンパク質翻訳を活性化することができる「ポジティブサイトモジュリン」（「サイトブーストプロジェクト」）または「ポジティブキメラポリペプチド」を得た。真核細胞における標的タンパク質の発現を特異的に増加させる活性分子（ポジティブサイトモジュリン）は本発明の対象である。これらの分子は、適当な構造修飾によって最大化したタンパク質生産のために、バイオリアクター条件に有効である。
適用するために対象となる遺伝子およびポジティブサイトモジュリンを安定的に発現する細胞系統を受け入れる発現プラスミドを含むキットの形で産業／経済開発が提案されている。
本発明において使用されるＮＳＰ３タンパク質は、鳥類ロタウイルスＡ、好ましくは鳥類ロタウイルスＡｖＲＶ−１、鳥類ロタウイルスＣｈ−１、鳥類ロタウイルスＰＯ−１３、鳥類ロタウイルスＲＫ３、鳥類ロタウイルスＴｙ−１、鳥類ロタウイルスＴｙ−２、または鳥類ロタウイルスＴｙ−３のＮＳＰ３から選択してよい。本発明において使用されるＮＳＰ３タンパク質は、ウシロタウイルスＡ（ウシロタウイルス９９３／８３またはウシロタウイルスＲＦなど）、ヤギロタウイルスＡ、ウマロタウイルスＡ、ヒトロタウイルスＡ、好ましくはヒトロタウイルス（血清型Ｐ１３／株１８４５）、ヒトロタウイルス１、ヒトロタウイルス２、ヒトロタウイルス４、ヒトロタウイルスＤＧ８、ヒトロタウイルスＧ１、Ｇ１０、Ｇ１２、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ６、Ｇ８、またはＧ９、ヒトロタウイルスＰ１Ｂ、ヒトロタウイルスＰ３、ヒトロタウイルスＲＭＣ３２１、あるいは型不明ヒトロタウイルスのＮＳＰ３タンパク質であってもよい。ＮＳＰ３タンパク質は、ウサギ(lapine)ロタウイルス（ウサギ(lapine)ロタウイルス株ＢＡＰ（野生型）、ウサギ(lapine)ロタウイルス株ＢＡＰ−２、ウサギ(lapine)ロタウイルス株Ｃ−１１、ウサギ(lapine)ロタウイルス株Ｒ−２、またはロタウイルス株ＡＬＡなど）、またブタロタウイルスＡ、好ましくはブタロタウイルスＡ株１３４／０４−１５、ウサギロタウイルス、好ましくはウサギロタウイルス（株ＡＬＡＢＡＭＡ）、およびロタウイルス５血清型Ｇ２、ロタウイルスＧ８、ロタウイルスサブグループ１、ロタウイルスサブグループ２、サルロタウイルスＡ／ＳＡ１１、サル１１ロタウイルス（血清型３／株ＳＡ１１−Ｐａｔｔｏｎ）、サル１１ロタウイルス（血清型３／株ＳＡ１１−Ｒａｍｉｇ）、サルロタウイルス、サルロタウイルスＡ／ＳＡ１１−４Ｆ、サルロタウイルスＡ／ＳＡ１１−ｂｏｔｈ、サルロタウイルスＡ／ＳＡ１１−Ｃ１４、サルロタウイルスＡ／ＳＡ１１−ＦＥＭ、サルロタウイルスＡ／ＳＡ１１−ＳＥＭ、ブタ(swine)ロタウイルス株Ｓ８、あるいは未分類ロタウイルスＡ（イヌロタウイルス、イヌロタウイルス血清型Ｐ１３／株Ｋ９、イヌロタウイルス株ＣＵ−１、子ヒツジロタウイルス、アカゲザルロタウイルス、ロタウイルスＧＢ−５０３、ロタウイルスＧＢ−５７３７、ロタウイルスＲａｔｔＧ１、ロタウイルス株１３２１、ロタウイルス株ＴＵＣＨ、およびロタウイルスＴＫ１５９など）のＮＳＰ３からさらに選択してよい。
よって、ＮＳＰ３タンパク質は、上記の非限定的なリストのあらゆる群Ａレトロウイルスから誘導してよい。
特に、本発明において使用されるＮＳＰ３は、群Ａウシロタウイルス株ＲＦのＮＳＰ３タンパク質であり、そのアミノ酸配列は、アドレスhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/においてＣＡＡ７９７５４およびＺ２１６３９（ヌクレオチド配列）という番号でオンラインでアクセス可能である。これらのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号４６および配列番号４７として本明細書において開示されている。
本発明において使用してよい別の好ましいＮＳＰ３は、群Ａロタウイルス株サルＳＡ１１、好ましくはサルロタウイルスＡ／ＳＡ１１−Ｃ１４のものであり、そのアミノ酸配列は、アドレスhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/においてＡＡＬ５８５３７およびＡＹ０６５８４３（ヌクレオチド配列）という番号でオンラインでアクセス可能である。これらのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号２９および配列番号３０として本明細書において開示されている。
さらに、本発明者らは、前記ＮＳＰ３タンパク質が他のタンパク質とも結合することを避けるために、本発明の翻訳ポジティブサイトモジュリン（「キメラポリペプチド」）の効果的な刺激に必要な最小領域を決定した。ポジティブサイトモジュリンの最大特異性はこのようにして決定された。
本発明者らは、群Ａウシロタウイルス株ＲＦのＮＳＰ３タンパク質のいくつかの特定の断片がタンパク質翻訳を活性化／刺激する能力を有することを示した。これらのペプチドは以下である：アミノ酸１０−３１３；１５０−３１３；２０６−３１３；２２９−３１３；２５０−３１３；２７２−３１３；２８３−３１３、およびアミノ酸６−３１３；１４６−３１３；２０２−３１３；２２５−３１３；２４６−３１３；２６８−３１３；２７９−３１３。これらの好ましいペプチド総ての構成概要を図６に示し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号３２〜配列番号４５に示している。前記配列番号３２〜４５の配列と少なくとも７０％、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する配列も本発明の範囲内である。
群Ａウシロタウイルス株ＲＦのＮＳＰ３タンパク質の別の断片は、配列番号４６の配列のアミノ酸１６３〜３１３に対応する。
同様に、群Ａサルロタウイルス株Ａ／ＳＡ１１−Ｃ１４のＮＳＰ３タンパク質のいくつかの特定の断片がタンパク質翻訳を活性化／刺激する能力を有する。これらのペプチドは以下である：アミノ酸１０−３１５；１５０−３１５；２０６−３１５；２２９−３１５；２５０−３１５；２７２−３１５；２８３−３１５、アミノ酸１０−３１３；１５０−３１３；２０６−３１３；２２９−３１３；２５０−３１３；２７２−３１３；２８３−３１３、アミノ酸６−３１５；１４６−３１５；２０２−３１５；２２５−３１５；２４６−３１５；２６８−３１５；２７９−３１５、およびアミノ酸６−３１３；１４６−３１３；２０２−３１３；２２５−３１３；２４６−３１３；２６８−３１３；２７９−３１３。サルロタウイルスＡ／ＳＡ１１−Ｃ１４株から誘導されたこれらペプチドの構成概要を図５に示し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号１〜配列番号２８に示している。前記配列番号１〜２８の配列と少なくとも７０％、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する配列も本発明の範囲内である。
下記表３では、一部のロタウイルス群Ａ ＮＳＰ３タンパク質についての同一性スコアを示している。
タンパク質生産を増加するのに必要な最小領域は、サイトモジュリンの効果の変調を目的とした修飾を行うために用いられる。バイオリアクターにおいて使用するには効率を高めることが重要である。ＮＳＰ３とｅＩＦ４Ｇとの界面またはその界面の構造形成のいずれかに関与するアミノ酸の部位特異的突然変異誘発は、これら２つのタンパク質の相互親和性に影響を及ぼし、それゆえに翻訳が刺激を受ける程度に影響を及ぼすはずである。
発明の具体的説明
第一の態様において、本発明は、タンパク質翻訳を活性化することができる、配列番号３２のアミノ酸配列もしくは配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列、またはその断片のうちのいずれか１つを含んでなるまたはからなるポリペプチドを対象とする。
タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドとの用語は、アミノ酸配列またはアミノ酸配列を含むそれらの誘導体もしくは類似体を指すために、本明細書において区別せずに用いられる。同じように、核酸、ヌクレオチド酸、ポリヌクレオチドなどの表現は、核酸配列を指すために、本明細書において区別せずに用いられる。
本発明における２アミノ酸または核酸配列間の同一性パーセントとは、最良のアライメント後に得られた、比較する２配列間の同一アミノ酸残基またはヌクレオチドの割合を意味する；この割合は純粋に統計的であり、２配列間の違いはランダムに分布し、それらの全長にわたっている。最良のアライメントまたは最適アライメントは、例えば本明細書において後に算出される、比較する２配列間の最高の割合の同一性に対応するアライメントである。２核酸またはアミノ酸配列間の配列比較は、最適アライメント後にこれらの配列を比較することにより通常行われ、該比較は、配列類似性の局所領域を同定および比較するために、１つのセグメントについてまたは１つの「比較ウインドウ」について行われる。比較のための配列の最適アライメントは、手動でまたはSmith and Waterman (1981)の局所相同性のアルゴリズム(Ad. App. Math. 2:482)を利用して、Neddleman and Wunsch (1970)の局所相同性のアルゴリズム(J. Mol. Biol. 48:443)を利用して、Pearson and Lipman (1988)の類似性検索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444)を利用して、これらのアルゴリズムを用いたコンピューターソフトウェア（Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）を利用して行うことができる。
２つのアミノ酸または核酸配列の間の同一性パーセントは、「比較ウインドウ」（この比較ウインドウでは比較する該核酸またはアミノ酸配列の領域は、これらの２配列間での最適アライメントのための参照配列に関して付加または欠失を含んでなる可能性がある）を用いて最善の方法で、これらの２つのアライメントした配列を比較することにより決定される。これらの２配列間の同一性パーセントを得るためには、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が２配列間で同一である位置の数を決定し、この同一位置数を「比較ウインドウ」内の位置総数で割り、得られた結果に１００を掛けることによって同一性パーセントを算出する。
好ましい実施態様では、配列番号３２のアミノ酸配列もしくは配列番号３２と少なくとも７０％の同一性を有する配列の前記断片は、配列番号３３の配列、および配列番号３３と少なくとも７０％の同一性を有する配列の断片からなる群から選択される。
別の好ましい実施態様では、配列番号３２のアミノ酸配列もしくは配列番号３２と少なくとも７０％の同一性を有する配列の前記断片は、配列番号３４および配列番号３５の配列、ならびに配列番号３４および配列番号３５と少なくとも７０％の同一性を有する配列の断片からなる群から選択される。
別の好ましい実施態様では、配列番号３２のアミノ酸配列もしくは配列番号３２と少なくとも７０％の同一性を有する配列の前記断片は、配列番号３６および配列番号３７の配列、ならびに配列番号３６および配列番号３７と少なくとも７０％の同一性を有する配列の断片からなる群から選択される。
別の好ましい実施態様では、配列番号３２のアミノ酸配列もしくは配列番号３２と少なくとも７０％の同一性を有する配列の前記断片は、配列番号３８および配列番号３９の配列、ならびに配列番号３８および配列番号３９と少なくとも７０％の同一性を有する配列の断片からなる群から選択される。
別の好ましい実施態様では、配列番号３２のアミノ酸配列もしくは配列番号３２と少なくとも７０％の同一性を有する配列の前記断片は、配列番号４０および配列番号４１の配列、ならびに配列番号４０および配列番号４１と少なくとも７０％の同一性を有する配列の断片からなる群から選択される。
別の好ましい実施態様では、配列番号３２のアミノ酸配列もしくは配列番号３２と少なくとも７０％の同一性を有する配列の前記断片は、配列番号４２および配列番号４３の配列、ならびに配列番号４２および配列番号４３と少なくとも７０％の同一性を有する配列の断片からなる群から選択される。
別の好ましい実施態様では、配列番号３２のアミノ酸配列もしくは配列番号３２と少なくとも７０％の同一性を有する配列の前記断片は、配列番号４４および配列番号４５の配列、ならびに配列番号４４および配列番号４５と少なくとも７０％の同一性を有する配列の断片からなる群から選択される。
好ましくは、配列番号３２〜配列番号４５の配列のうちのいずれか１つと少なくとも７０％の同一性を有する前記配列は、次のロタウイルスのうちのいずれか１つに由来する：ウシロタウイルスＡ、ヤギロタウイルスＡ、ウマロタウイルスＡ、ヒトロタウイルスＡ、ウサギ(lapine)ロタウイルス、ブタロタウイルスＡ、ウサギロタウイルス、ロタウイルス５血清型Ｇ２、ロタウイルスＧ８、ロタウイルスサブグループ１、ロタウイルスサブグループ２、サルロタウイルスＡ／ＳＡ１１、サルロタウイルスＡ／ＳＡ１１−Ｃ１４およびブタ(swine)ロタウイルス株Ｓ８。好ましくは、前記配列はサルロタウイルスＡ／ＳＡ１１−Ｃ１４（受託番号：ＡＡＬ５８５３７）に由来し、対応する好ましい断片は上記および図５に開示されている。
上記に定義した活性化ポリペプチドは、好ましくは細胞系において、タンパク質翻訳を非特異的に活性化するために使用されるが、該活性化ポリペプチドは、例えばUCHIDA et al (2002)に記載されている従来の方法に従ってウサギ網状赤血球溶解物からなる細胞ｍＲＮＡ抽出物をインキュベートすることによるなど、無細胞系においてタンパク質翻訳を活性化するためにも使用され得る。
第二の態様において、本発明は、対象となる標的ポリヌクレオチドの翻訳を特異的に活性化することができるキメラポリペプチドであって、配列番号４６の配列もしくは配列番号４６と少なくとも７０％、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列の非構造タンパク質３（ＮＳＰ３）またはその断片のうちのいずれか１つを含んでなりまたはからなり、該ＮＳＰ３またはその断片のうちのいずれか１つがＲＮＡ結合タンパク質と融合したキメラポリペプチドに関する。
上記に定義したキメラポリペプチドは、対応するタンパク質において対象となる標的ポリヌクレオチドの翻訳を特異的に活性化するために使用される。
好ましくは、ＮＳＰ３タンパク質の前記断片は、配列番号３２のアミノ酸配列もしくは配列番号３２と少なくとも７０％の同一性を有する配列、またはその断片のうちのいずれか１つを含んでなるまたはからなる、本発明のポリペプチドである。好ましくは、前記断片は、配列番号３３〜配列番号４５の配列、および配列番号３３〜配列番号４５の配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列の断片からなる群から選択される。
本発明の別の好ましいキメラポリペプチドは、配列番号４８の配列または配列番号４８と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含んでなるまたはからなる。
本発明のキメラポリペプチドのＲＮＡ結合タンパク質は、下記表１に開示されるタンパク質のうちの１つであってよい：
よって、さらなる一実施態様では、本発明は、前記ＲＮＡ結合タンパク質がＭＳ２ＣＰ、Ｎ、ＩＲＰおよびＵｌＡからなる群から選択される、本発明のキメラポリペプチドに向けられる。好ましくは、前記ＲＮＡ結合タンパク質は、二量体化する能力を保有するが凝集を防止する突然変異すなわち欠失を含むＭＳ２ＣＰ(Peabody and Ely, 1992; Le Cuyer et al, 1995)または上記欠失突然変異を含むまたは含まない２つのＭＳ２ＣＰコード配列の遺伝子融合物(Peabody and Lim, 1996)である。
表１に記載されていない他のＲＮＡ結合タンパク質も本発明の範囲内である。
有利には、選択されたＲＮＡ結合タンパク質は前記キメラポリペプチドのＮ末端に局在するが、前記キメラポリペプチドのＣ末端に局在してもよい。
前記キメラポリペプチドでは、前記ＲＮＡ結合タンパク質は前記エフェクタードメインと直接融合されていてもよく、これは、
（ｉ）前記ＲＮＡ結合タンパク質が前記キメラポリペプチドのＮ末端部分に局在する場合には、前記ＲＮＡ結合タンパク質のＣ末端位置に局在する最後のアミノ酸は、前記エフェクタードメインのＮ末端位置に局在するアミノ酸と、好ましくは通常のペプチド結合により、化学的に結合し；または
（ｉｉ）前記ＲＮＡ結合タンパク質が前記キメラポリペプチドのＣ末端部分に局在する場合には、前記エフェクタードメインのＣ末端位置に局在するアミノ酸は、前記ＲＮＡ結合タンパク質のＮ末端位置に局在するアミノ酸と、好ましくは通常のペプチド結合により、化学的に結合する
ということを意味する。
別の実施態様では、前記ＲＮＡ結合タンパク質と前記エフェクタードメインは互いに直接結合しておらず、それどころか前記キメラポリペプチドでは好ましくは疎水性であるスペーサーアミノ酸配列または「リンカー」によって分離されている。前記スペーサーアミノ酸配列は、そのアミノ酸分子のフレキシブル領域を構成するのに十分なサイズを有し、前記ＲＮＡ結合タンパク質の相対移動を可能にする。前記スペーサー配列は３〜５０アミノ酸長間、好ましくは５〜３０アミノ酸長間、最も好ましくは５〜２０アミノ酸長間である。好ましくは、前記スペーサー配列またはスペーサーペプチドが疎水性である場合には、前記スペーサーペプチドは前記ポリペプチドが細胞膜を通るのを容易にする。かかる場合には、前記スペーサーペプチドは大半の疎水性アミノ酸（アミノ酸バリン、ロイシンまたはイソロイシンなど）を含む。
この実施態様では、前記スペーサーペプチドは、その配列中に好ましくは少なくとも５０％の疎水性アミノ酸、より好ましくは少なくとも６０％の疎水性アミノ酸、最も好ましくは少なくとも８０％の疎水性アミノ酸を含んでなる。
特定の実施態様では、前記スペーサーペプチドは、３〜５０個のアラニンアミノ酸、好ましくは５〜３０個のアラニンアミノ酸、より好ましくは５〜２０個のアラニンアミノ酸、最も好ましくは５〜１０個のアラニンアミノ酸を含んでなるポリ（アラニン）アミノ酸鎖である。
別の実施態様では、前記スペーサーペプチドは、３〜５０個のアミノ酸、最も好ましくは５〜１０個のアミノ酸からなり、その配列はサイトモジュリンの機能を修飾しない。例えば、前記スペーサーペプチドは配列番号５０の配列であってよい。
さらに別の実施態様では、前記スペーサーペプチドは、サンプル中に存在する前記キメラポリペプチドの検出または精製を可能にするタグである。例えば、前記スペーサーペプチドは配列番号３１の配列の「ＨＡ ＴＡＧ」ペプチドであってよい。
より好ましい実施態様では、配列番号３２〜配列番号４６の配列のうちのいずれか１つと少なくとも７０％の同一性を有する前記配列は、次のロタウイルスのうちのいずれか１つに由来する：ウシロタウイルスＡ、ヤギロタウイルスＡ、ウマロタウイルスＡ、ヒトロタウイルスＡ、ウサギ(lapine)ロタウイルス、ブタロタウイルスＡ、ウサギロタウイルス、ロタウイルス５血清型Ｇ２、ロタウイルスＧ８、ロタウイルスサブグループ１、ロタウイルスサブグループ２、サルロタウイルスＡ／ＳＡ１１、サルロタウイルスＡ／ＳＡ１１−Ｃ１４およびブタ(swine)ロタウイルス株Ｓ８。好ましくは、前記配列はサルロタウイルスＡ／ＳＡ１１−Ｃ１４（受託番号：ＡＡＬ５８５３７）に由来し、対応する好ましい断片は上記および図５に開示されている。
好ましくは、本発明において使用されるＮＳＰ３タンパク質は、鳥類ロタウイルスＡ、好ましくは鳥類ロタウイルスＡｖＲＶ−１、鳥類ロタウイルスＣｈ−１、鳥類ロタウイルスＰＯ−１３、鳥類ロタウイルスＲＫ３、鳥類ロタウイルスＴｙ−１、鳥類ロタウイルスＴｙ−２、または鳥類ロタウイルスＴｙ−３のＮＳＰ３から選択される。本発明において使用されるＮＳＰ３タンパク質は、ウシロタウイルスＡ（ウシロタウイルス９９３／８３など）、ヤギロタウイルスＡ、ウマロタウイルスＡ、ヒトロタウイルスＡ、好ましくはヒトロタウイルス（血清型Ｐ１３／株１８４５）、ヒトロタウイルス１、ヒトロタウイルス２、ヒトロタウイルス４、ヒトロタウイルスＤＧ８、ヒトロタウイルスＧ１、Ｇ１０、Ｇ１２、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ６、Ｇ８、またはＧ９、ヒトロタウイルスＰ１Ｂ、ヒトロタウイルスＰ３、ヒトロタウイルスＲＭＣ３２１、あるいは型不明ヒトロタウイルスのＮＳＰ３タンパク質であってもよい。ＮＳＰ３タンパク質は、ウサギ(lapine)ロタウイルス（ウサギ(lapine)ロタウイルス株ＢＡＰ（野生型）、ウサギ(lapine)ロタウイルス株ＢＡＰ−２、ウサギ(lapine)ロタウイルス株Ｃ−１１、ウサギ(lapine)ロタウイルス株Ｒ−２、またはロタウイルス株ＡＬＡなど）、またブタロタウイルスＡ、好ましくはブタロタウイルスＡ株１３４／０４−１５、ウサギロタウイルス、好ましくはウサギロタウイルス（株ＡＬＡＢＡＭＡ）、およびロタウイルス５血清型Ｇ２、ロタウイルスＧ８、ロタウイルスサブグループ１、ロタウイルスサブグループ２、サルロタウイルスＡ／ＳＡ１１、サル１１ロタウイルス（血清型３／株ＳＡ１１−Ｐａｔｔｏｎ）、サル１１ロタウイルス（血清型３／株ＳＡ１１−Ｒａｍｉｇ）、サルロタウイルス、サルロタウイルスＡ／ＳＡ１１−４Ｆ、サルロタウイルスＡ／ＳＡ１１−ｂｏｔｈ、サルロタウイルスＡ／ＳＡ１１−Ｃ１４、サルロタウイルスＡ／ＳＡ１１−ＦＥＭ、サルロタウイルスＡ／ＳＡ１１−ＳＥＭ、ブタ(swine)ロタウイルス株Ｓ８、あるいは未分類ロタウイルスＡ（イヌロタウイルス、イヌロタウイルス血清型Ｐ１３／株Ｋ９、イヌロタウイルス株ＣＵ−１、子ヒツジロタウイルス、アカゲザルロタウイルス、ロタウイルスＧＢ−５０３、ロタウイルスＧＢ−５７３７、ロタウイルスＲａｔｔＧ１、ロタウイルス株１３２１、ロタウイルス株ＴＵＣＨ、およびロタウイルスＴＫ１５９など）のＮＳＰ３からさらに選択してよい。
好ましくは、本発明のキメラポリペプチドは、該キメラポリペプチドのその標的細胞の原形質膜の通過を可能とする輸送シグナルをさらに含んでなる。前記輸送シグナルは当業者には周知である。前記輸送シグナルは、例えば上記のようなスペーサーペプチドであってよい。
第三の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるまたはからなる核酸に関する。好ましくは、前記核酸は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの制御のための誘導性調節ポリヌクレオチドをさらに含んでなる。
第四の態様において、本発明は、本発明のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるまたはからなる核酸に関する。有利な実施態様では、前記核酸は、配列番号４９の配列を含んでなるまたはからなる。好ましくは、前記核酸は、本発明のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの制御のための誘導性調節ポリヌクレオチドをさらに含んでなる。
本発明はまた、本明細書において定義したキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなり、誘導性調節ポリヌクレオチドとしても本明細書において開示されている、誘導シグナルまたは誘導剤の直接または間接作用に対して感受性が高い調節ポリヌクレオチドも含んでなる核酸にも関する。
実際には、本発明のポジティブキメラポリペプチドによるある特定の予定標的タンパク質の翻訳の制御とは、細胞培養の特定の時間においては、例えばバイオリアクターにおいて、その標的タンパク質は生産されないが、一方、別の時間においては、その生産が逆に求められるということを意味する。好ましい誘導性調節系を下記表２に記載している：
さらなる態様において、本発明は、本発明の核酸を含んでなるベクターに関する。
さらなる態様において、本発明は、キメラポリペプチドを安定的にまたは一時的に発現させる宿主細胞に関し、この宿主細胞は、該キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるもしくはからなる、本発明の核酸、または該核酸を含んでなるベクターを含んでなる。
好ましくは、前記宿主細胞は、対象となる標的ポリヌクレオチドをコードする発現プラスミドをさらに含んでなる。
本発明の意味における用語ベクターまたはプラスミドとは、１本または２本鎖形態であることは関係なく、環状または線状のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味する。
本発明の組換えベクターは、好ましくは発現ベクターである。このベクターは細菌またはウイルス起源のベクターであってよい。
どんな場合でも、本発明のポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸は、細胞におけるその発現の調節シグナルを含む１つまたはいくつかの配列の制御下にある。
発現制御配列および発現ベクターの選択は、宿主の選択に応じたものとなる。種々の発現宿主/ベクター組合せを使用してよい。本発明の好ましい細菌ベクターは、例えばベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ Ｎ ３７０１７）あるいはｐＡＡ２２３−３(Pharmacia, Uppsala, Sweden)およびｐＧＥＭ１(PromegaBiotech, Madison, Wl, USA)などのベクターであってよい。他の市販のベクター、例えばベクターｐＱＥ７０、ｑＱＥ６０、Ｐｑｅ９(QUIAGEN)、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＡ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＭＨ１６Ａ、ｐＭＨ１８Ａ、ｐＭＨ４６Ａ、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴＩおよびｐＳＧ(Stratagene)も挙げてよい。
真核生物宿主に有用な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含んでなるベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターとしては、公知の細菌プラスミド、例えば大腸菌(E. coli)由来のプラスミド（ｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体を含む）、より幅広い宿主域のプラスミド、例えばＭ１３および糸状一本鎖ＤＮＡファージが挙げられる。好ましい大腸菌ベクターとしては、λファージｐＬプロモーターを含むｐＬベクター（米国特許第４，８７４，７０２号）、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターを含むｐＥＴベクター(Studier et al., Methods in Enzymology 185: 60-89, 1990)およびｐＳＰ７２ベクター(Kaelin et al., 前掲)が挙げられる。酵母細胞に有用な発現ベクターとしては、２．ｍｕ．プラスミドおよびその誘導体。が挙げられる。昆虫細胞に有用なベクターとしては、ｐＶＬ ９４１が挙げられる。植物細胞に有用な発現ベクターとしては、限定されるものではないが、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）が挙げられる。加えて、これらベクターには種々の発現制御配列のうちのいずれを使用してもよい。かかる有用な発現制御配列としては、前述の発現ベクターの構造遺伝子と関連する発現制御配列が挙げられる。有用な発現制御配列の例としては、例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期および後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、ファージλの主要オペレーターおよびプロモーター領域、例えばｐＬ、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母α−接合系のプロモーターおよび原核または真核細胞およびそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが分かっている他の配列、ならびにその様々な組合せが挙げられる。
本明細書に記載の本発明のポリペプチドを大量生産するためには、任意の好適な宿主を使用してよく、これらには、細菌、真菌（酵母を含む）、植物、昆虫、哺乳類、または他の適当な動物細胞もしくは細胞系統、ならびにトランスジェニック動物または植物が含まれる。さらに特には、これらの宿主には、周知の真核生物および原核生物宿主、例えば大腸菌、シュードモナス菌(Pseudomonas)、バチルス属細菌(Bacillus)、ストレプトミセス属の放線菌(Streptomyces)、真菌、酵母、昆虫細胞Spodoptera Frugiperda（ＳＦ９）など）、および動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、マウスＮＳ／Ｏ細胞、アフリカミドリザル細胞（ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、およびＢＭＴ１０など）、およびヒト細胞（ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）など））の株、ならびに植物組織培養細胞も含まれ得る。
当然、総てのベクターおよび発現制御配列が同様に十分に本発明のポリペプチドまたはポリペプチド複合体を発現する機能を果たすとは限らないことは理解されるべきである。総ての宿主が同じ発現系で同様に十分に機能を果たすとも限らない。しかしながら、当業者ならば、必要以上に試験を行わずにこれらのベクター、発現制御系および宿主の中から選択し得る。
ベクターへのポリヌクレオチド配列の挿入についての当技術分野で公知の方法のいずれを使用してもよい。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY (1992)（これらの両方が引用することにより本明細書の一部とされる）参照。従来のベクターは、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド複合体を生産するためにポリヌクレオチド配列に機能しうる形で連結された適当な転写／翻訳制御シグナルからなる。本発明のポリペプチドまたはポリペプチド複合体の発現を制御するために、プロモーター／エンハンサーも使用してよい。プロモーターの活性化は、組織特異的であり得るしまたは代謝産物もしくは投与する物質によって誘導可能であり得る。かかるプロモーター／エンハンサーとしては、限定されるものではないが、ネイティブＥ２Ｆプロモーター、サイトメガロウイルス最初期プロモーター／エンハンサー(Karasuyama et al., J. Exp. Med., 169: 13 (1989))；ヒトβ−アクチンプロモーター(Gunning et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84: 4831 (1987)；マウス乳腺癌ウイルス長末端反復配列（ＭＭＴＶ ＬＴＲ）中に存在するグルココルチコイド誘導性プロモーター(Klessig et al., Mol. Cell. Biol, 4: 1354 (1984))；モロニーマウス白血病ウイルスの長末端反復配列（ＭｕＬＶ ＬＴＲ）(Weiss et al., RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1985))；ＳＶ４０初期領域プロモーター(Bernoist and Chambon, Nature, 290:304 (1981))；ラウス肉腫ウイルスのプロモーター（ＲＳＶ）(Yamamoto et al., Cell, 22:787 (1980))；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78: 1441 (1981))；アデノウイルスプロモーター(Yamada et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82: 3567 (1985))が挙げられる。
哺乳類宿主細胞に適合する発現ベクターとしては、例えば、プラスミド；鳥類、ネズミおよびヒトレトロウイルスベクター；アデノウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクター；ならびに非複製ポックスウイルスが挙げられる。特に、複製欠損組換えウイルスは、複製欠損ウイルスしか産生しないパッケージング細胞系統において作製することができる。Current Protocols in Molecular Biology: Sections 9.10-9.14 (Ausubel et al., eds.), Greene Publishing Associcates, 1989参照。
遺伝子導入系に用いる特定のウイルスベクターは、現在、十分に確立されている。例えば：Madzak et al., J. Gen . Virol, 73: 1533-36 (1992: パポーバウイルスＳＶ４０); Berkner et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 39-61 (1992: アデノウイルス); Moss et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 25-38 (1992: ワクシニアウイルス); Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 97-123 (1992: アデノ随伴ウイルス); Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 67-93 (1992: 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン−バーウイルス（ＨＢＶ）); Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 1-24 (1992: レトロウイルス); Brandyopadhyay et al., Mol. Cell. Biol., 4: 749-754 (1984: レトロウイルス); Miller et al., Nature, 357: 455-450 (1992: レトロウイルス); Anderson, Science, 256: 808-813 (1992: レトロウイルス)（これらの総ては引用することにより本明細書の一部とされる）参照。
本発明のポリペプチドをコードする核酸は、従来のトランスフェクション技術（例えば、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクションなど）により、in vitro培養下で増殖している真核細胞に導入することができる。核酸はまた、例えばin vivoでの細胞への核酸の導入に好適な送達メカニズム（例えばレトロウイルスベクター（例えば、Ferry, N et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381；およびKay, M. A. et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647参照）、アデノウイルスベクター（例えば、Rosenfeld, M. A. (1992) Cell 68:143-155；およびHerz, J. and Gerard, R. D. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816参照）、受容体媒介によるＤＮＡ取り込み（例えば、Wu, G. and Wu, C. H. (1988) J. Biol. Chem. 263:14621; Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:963-967；および米国特許第５，１６６，３２０号参照）、直接ＤＮＡ注入（例えば、Acsadi et al. (1991) Nature 332:815-818；およびWolff et al. (1990) Science 247: 1465-1468参照）または粒子衝撃（例えば、Cheng, L. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4455-4459；およびZelenin, A. V. et al. (1993) FEBS Letters 315:29-32参照））を適用することにより、in vivoで細胞に移入することもできる。組換え宿主細胞の培養および組換えタンパク質の生産に使用するのに適切な培養培地は当業者には周知である。
さらなる態様において、本発明は、本発明のキメラポリペプチド、または該キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるもしくはからなる、本発明の核酸、または該核酸を含んでなるベクター、または本発明の宿主細胞を含んでなる、対象となる標的ポリヌクレオチドのタンパク質翻訳制御系に関する。好ましくは、前記タンパク質翻訳制御系は、対象となる標的ポリヌクレオチドをコードする発現プラスミドをさらに含んでなる。
さらなる態様において、本発明は、対象となる標的ポリヌクレオチドの翻訳をin vitroで制御するための方法に関し、この方法は、次の工程：
（ａ）宿主細胞に対象となる該標的ポリヌクレオチドを導入する工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られた組換え宿主細胞を適切な培養培地で培養し、これにより該宿主細胞が対象となる該標的ポリヌクレオチドを安定的に発現することを可能とする工程；および
（ｃ）対象となる該標的ポリヌクレオチドの発現を活性化するために、該培養培地に本発明のキメラポリペプチドを加える工程
を含んでなる。
さらなる態様において、本発明は、対象となる標的ポリヌクレオチドの翻訳をin vitroで制御するための方法に関し、この方法は、次の工程：
（ａ）宿主細胞に、対象となる該標的ポリヌクレオチド、ならびに前記キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるもしくはからなる、本発明の核酸、または該核酸を含んでなるベクターを導入する工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られた組換え宿主細胞を適切な培養培地で培養し、これにより該宿主細胞が対象となる該標的ポリヌクレオチドを安定的に発現することを可能とする工程；および
（ｃ）該培養培地に該誘導性調節ポリヌクレオチドと相互作用することができる薬剤を加え、これにより該キメラポリペプチドをコードする核酸の発現の調節を可能とする工程
を含んでなる。
さらなる態様において、本発明は、本発明のキメラポリペプチド、または該キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるもしくはからなる、本発明の核酸、または該核酸を含んでなるベクターを含んでなる、対象となる標的ポリヌクレオチドの翻訳を制御するためのキットに関する。
好ましくは、前記キットは、対象となる標的ポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクターをさらに含んでなる。
さらなる態様において、本発明は、本発明の宿主細胞を含んでなる、対象となる標的ポリヌクレオチドの翻訳を制御するためのキットに関する。好ましくは、前記キットは、対象となる標的ポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクターをさらに含んでなる。
キットは、一般に、前記検出を行うためにまたは診断アッセイを行うために必要な２つ以上の成分を含んでなる。成分は、化合物、試薬、容器および／または装置であってよい。
さらなる態様において、本発明は、培養宿主細胞を含んでなるバイオリアクターにおいて対象となる標的ポリヌクレオチドの翻訳を活性化するための本発明のタンパク質翻訳制御系または本発明のキットの使用に関する。
本発明はまた、本発明のポリペプチドまたは本発明のキメラポリペプチドの生産のための方法にも関し、この方法は、
ａ）該ポリペプチドをコードする核酸を適切な発現ベクターに挿入する工程、
ｂ）適切な培養培地で、工程（ａ）において得られた組換えベクターで予め形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を培養する工程、
ｃ）該馴化培養培地を回収するか、または例えば音波処理によりもしくは浸透圧変化により該宿主細胞を溶解する工程、
ｄ）該培養培地から、あるいは工程（ｃ）において得られた細胞溶解物から、該ポリペプチドを分離および精製する工程、
ｅ）所望により、生産された組換えポリペプチドを特性評価する工程
を含んでなる。
本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドに向けられる抗体を最初に固定しておいたイムノアフィニティークロマトグラフィーカラム上への固着により特性評価してよい。
別の態様において、本発明のポリペプチドまたは本発明のキメラポリペプチドは、AUSUBEL et al. (1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience N. Y.)に記載されている周知の方法に従って、一連のクロマトグラフィーカラムでの移動により精製してよい。前記ポリペプチドは、均質溶液中または固相中での古典的化学合成技術により調製してもよい。例示例として、本発明のポリペプチドまたは本発明のキメラポリペプチドは、HOUBEN WEILにより開示されている均質溶液中での技術(1974, In methode der Oganischen Chemie, E.Wunshed., volume 15-1 etl5-li, Thieme, Stuttgart)によりあるいはMERRIFIELDにより開示されている固相合成技術(1965a, Nature, vol. 207 (996) : 522-523; 1965b Science, vol. 150 (693) : 178-185)により調製してよい。
最後に、本発明は、本発明のキメラポリペプチドを含んでなる医薬組成物に関する。
次の実施例および図面により本発明をさらに具体化する。
本発明者らは、ポジティブサイトモジュリンを得た。このポジティブサイトモジュリンは、ファージタンパク質ＭＳ２ＣＰを含むＲＮＡ結合ドメインまたはテザリングドメインおよびウイルスタンパク質ＮＳＰ３由来のエフェクタードメインからなる。第一の証明では、リポータータンパク質の発現に対するこのサイトモジュリンの効果を、ヒト黒色人種子宮頸類上皮癌(a Human Negroid cervix epitheloid carcinoma)由来の確立された標準的ヒト細胞系統であるＨｅＬａ細胞において研究した。これらの細胞におけるタンパク質発現に対するポジティブサイトモジュリンの効果を、これまでに記載されている、ヒトタンパク質ＣＵＧ−ＢＰ１と融合された同じテザリングタンパク質（ＭＳ２−ＣＰ）由来のネガティブサイトモジュリン（ペプチドタンパク質翻訳阻害剤およびタンパク質翻訳制御のためのその使用ＷＯ２００５０１００３８−２００５−０２−０３）の存在によってもたらされるものと比較した。さらなる対照として、リポータータンパク質発現に対する前記テザリングタンパク質単独（Ｃ末端ＨＡタグと融合したもの）発現の効果も判定した。前記リポータータンパク質（ウミシイタケ(Renila)ルシフェラーゼ）をコードするｍＲＮＡを、トランスフェクトしたプラスミド内の双方向性ＣＭＶプロモーター(a bidirectonal CMV promotor)から転写した。このｍＲＮＡでは、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼコード領域に続く３’非翻訳領域に、前記テザリングタンパク質についての複数の結合部位が含まれた。ホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子もこの同じ双方向性ＣＭＶプロモーターから発現された。このｍＲＮＡには前記テザリングタンパク質の結合部位がないため、トランスフェクション効率の正規化を可能にした。よって、データをウミシイタケ(Renila)ルシフェラーゼ活性とホタルルシフェラーゼ活性の比（Ｌｕｃ Ｒ／Ｌｕｃ Ｆ）として表している。
図３では、ポジティブサイトモジュリン（ＭＳ２ＣＰ／ＮＳＰ３）でのＨｅＬａ細胞の２つの別のトランスフェクションについて、ネガティブサイトモジュリンＭＳ２−ＣＰ／ＣＵＧ−ＢＰ１でトランスフェクトした細胞について、およびＨＡタグ付き形態のＭＳ２ＣＰでトランスフェクトした細胞について得られたデータを示している。ベースラインとしてＨＡタグ付きＭＳ２ＣＰの存在下でウミシイタケルシフェラーゼの正規化した発現を得ると、ウミシイタケルシフェラーゼについての発現は、予測通りにネガティブサイトモジュリンの存在下で減少した。それに対して、ウミシイタケルシフェラーゼの発現は、ポジティブサイトモジュリン（ＭＳ２ＣＰ／ＮＳＰ３）も発現させた細胞において強く増強された。
ポジティブサイトモジュリンのこの刺激効果がＨｅＬａ細胞に限定されないことを確認するために、ＨＥＫ ２９３細胞を使用してこれらの測定を繰り返した。ＨＥＫ ２９３細胞も上皮形態を有し、ヒト胎児腎臓に由来するものであった。この第二の証明に関する結果は図４に示し、この図ではＨＥＫ ２９３細胞のデータをＨｅＬａ細胞のものと比較している。図４に示したＨｅＬａ細胞についてのデータは、図３に示したものとは異なっており、新しい試験の結果得られたものである。両方の細胞種について、各々のエフェクタープラスミドで３つの独立したトランスフェクションを行った。この場合も、両方の細胞種でネガティブサイトモジュリンを発現させたときにウミシイタケルシフェラーゼ活性の予測された減少が観察された。さらに、ポジティブサイトモジュリンはＨＥＫ ２９３細胞におけるウミシイタケルシフェラーゼの発現も刺激し、これはその効果が単細胞種に限定されないことを示している。
参照文献
キャップ依存性翻訳。因子ｅＩＦ４Ｇ（白抜き楕円）はプラットフォームの役割を果たし、このプラットフォームにおいて、ｍＲＮＡの５’末端においてキャップ（黒色点）と結合している因子ｅＩＦ４Ｅ（斜交平行線模様）と、３’ポリ（Ａ）テールと結合しているＰＡＢＰ（斜線平行線模様）とが結合することができる。４０Ｓおよび６０Ｓリボソームサブユニット（灰色楕円）、開始（ＡＵＧ）および終止（ＳＴＯＰ）コドン（黒色正方形）を示している。 サイトモジュリンの一般構造。ポジティブ（サイトブースト）効果またはネガティブ（抗ウイルス）効果を有するサイトモジュリンを、それぞれ、左側または右側に楕円により示した。テザリングドメイン（斜交平行線模様）およびエフェクタードメイン（白色）を区別している。原則として、ポジティブサイトモジュリンおよびネガティブサイトモジュリンの両方において同じテザリングドメインが使用され得る。この可能性を利用して、エフェクタードメインを試験する。 プロトタイプサイトモジュリンによる翻訳の刺激。ＨｅＬａ細胞を、サイトモジュリンをコードするプラスミドと、ウミシイタケルシフェラーゼおよびホタルルシフェラーゼを個別にコードする２つのリポーターｍＲＮＡが該プラスミドから転写される第二のプラスミドで同時トランスフェクトした。発現したサイトモジュリンの識別をグラフの下に示している。リポータープラスミドでは、ウミシイタケルシフェラーゼをコードするリーディングフレームが、サイトモジュリン中に存在するＭＳ２ＣＰタンパク質によって認識されるＭＳ２ステムループ配列に続いている。ホタルルシフェラーゼの活性によりトランスフェクション効率に関する正規化が可能である。阻害性サイトモジュリンのプロトタイプであるサイトモジュリンＭＳ２ＣＰ／ＣＵＧ−ＢＰ１をここでは陰性対照として使用する。ＭＳ２ＣＰＮＳＰ３サイトモジュリンについての２つのバーは２つの別の試験に対応する。これらの試験では、ポジティブサイトモジュリンを、ウシＮＳＰ３ ＲＦ株のアミノ酸１６３〜３１３（配列番号４８の配列参照）が続く２つのＭＳ２−ＣＰ配列の遺伝子インフレーム融合物によりコードした。ルシフェラーゼ活性はウミシイタケ活性とホタル活性の比として表している。示した値は、個別トランスフェクション試験における三連アッセイの平均±標準偏差である。 プロトタイプサイトモジュリンによる翻訳の刺激：ＨｅＬａ細胞およびＨＥＫ ２９３細胞における効果の比較。図面の下に示すように、ＨｅＬａ細胞またはＨＥＫ ２９３細胞を、サイトモジュリンをコードするプラスミドと、ウミシイタケルシフェラーゼおよびホタルルシフェラーゼを個別にコードする２つのリポーターｍＲＮＡが該プラスミドから転写される第二のプラスミドで同時トランスフェクトした。発現したサイトモジュリンの識別をグラフの右側に示している。リポーターｍＲＮＡおよびサイトモジュリンをコードするプラスミドは、図３の凡例に記載したものと同じである。ルシフェラーゼ活性はウミシイタケ活性とホタル活性の比（Ｌｕｃ Ｒ／Ｌｕｃ Ｆ）として、ＭＳ２ＣＰ単独を含むサイトモジュリンについて観察されたこの比と比べて表している。示した値は、３つの別の試験（ｎ＝３）で得られたデータの平均±標準偏差である。 群Ａロタウイルス株サルＳＡ１１のＮＳＰ３タンパク質由来のペプチドの構成概要。 群Ａウシロタウイルス株ＲＦのＮＳＰ３タンパク質由来のペプチドの構成概要。

Claims (30)

  1. タンパク質翻訳を活性化することができる、配列番号３２のアミノ酸配列もしくは配列番号３２と少なくとも７０％の同一性を有する配列、またはその断片のうちのいずれか１つを含んでなる、ポリペプチド。
  2. 前記断片が、配列番号３３の配列、もしくは配列番号３３と少なくとも７０％の同一性を有する配列の断片からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記断片が、配列番号３４および配列番号３５の配列、ならびに配列番号３４および配列番号３５と少なくとも７０％の同一性を有する配列の断片からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 前記断片が、配列番号３６および配列番号３７の配列、ならびに配列番号３６および配列番号３７と少なくとも７０％の同一性を有する配列の断片からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
  5. 前記断片が、配列番号３８および配列番号３９の配列、ならびに配列番号３８および配列番号３９と少なくとも７０％の同一性を有する配列の断片からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
  6. 前記断片が、配列番号４０および配列番号４１の配列、ならびに配列番号４０および配列番号４１と少なくとも７０％の同一性を有する配列の断片からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
  7. 前記断片が、配列番号４２および配列番号４３の配列、ならびに配列番号４２および配列番号４３と少なくとも７０％の同一性を有する配列の断片からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
  8. 前記断片が、配列番号４４および配列番号４５の配列、ならびに配列番号４４および配列番号４５と少なくとも７０％の同一性を有する配列の断片からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
  9. 配列番号３２〜配列番号４５の配列のうちのいずれか１つと少なくとも７０％の同一性を有する前記配列が、次のロタウイルス：ウシロタウイルスＡ、ヤギロタウイルスＡ、ウマロタウイルスＡ、ヒトロタウイルスＡ、ウサギロタウイルス、ブタロタウイルスＡ、ウサギロタウイルス、ロタウイルス５血清型Ｇ２、ロタウイルスＧ８、ロタウイルスサブグループ１、ロタウイルスサブグループ２、サルロタウイルスＡ／ＳＡ１１、サルロタウイルスＡ／ＳＡ１１−Ｃ１４およびブタロタウイルス株Ｓ８のうちのいずれか１つに由来するものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  10. 対象となる標的ポリヌクレオチドの翻訳を特異的に活性化することができるキメラポリペプチドであって、配列番号４６の配列もしくは配列番号４６と少なくとも７０％の同一性を有する配列の非構造タンパク質３（ＮＳＰ３）またはその断片のうちのいずれか１つを含んでなり、該ＮＳＰ３またはその断片のうちのいずれか１つがＲＮＡ結合タンパク質と融合した、キメラポリペプチド。
  11. 前記ＮＳＰ３タンパク質断片が請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドである、請求項１０に記載のキメラポリペプチド。
  12. その配列が配列番号４８の配列を含んでなる、請求項１０に記載のキメラポリペプチド。
  13. 前記ＲＮＡ結合タンパク質が、ＭＳ２ＣＰ、Ｎ、ＩＲＰおよびＵｌＡからなる群から選択される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
  14. 前記キメラポリペプチドの標的細胞の原形質膜の通過を可能とする輸送シグナルをさらに含んでなる、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
  15. 請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる、核酸。
  16. 請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる、核酸。
  17. 配列番号４９のポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１６に記載の核酸。
  18. 請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの制御のための誘導性調節ポリヌクレオチドをさらに含んでなる、請求項１６または請求項１７に記載の核酸。
  19. 請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
  20. 請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の核酸または請求項１９に記載のベクターを含んでなる、キメラポリペプチドを安定的にまたは一時的に発現させる宿主細胞。
  21. 対象となる標的ポリヌクレオチドをコードする発現プラスミドをさらに含んでなる、請求項２０に記載の宿主細胞。
  22. 請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の核酸、または請求項１９に記載のベクター、または請求項２０もしくは２１に記載の宿主細胞を含んでなる、対象となる標的ポリヌクレオチドのタンパク質翻訳制御系。
  23. 対象となる標的ポリヌクレオチドの翻訳をin vitroで制御するための方法であって、
    （ａ）宿主細胞に対象となる該標的ポリヌクレオチドを導入する工程；
    （ｂ）工程（ａ）において得られた組換え宿主細胞を適切な培養培地で培養し、これにより該宿主細胞が対象となる該標的ポリヌクレオチドを安定的に発現することを可能とする工程；および
    （ｃ）対象となる該標的ポリヌクレオチドの発現を活性化するために、該培養培地に請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドを加える工程
    を含んでなる、方法。
  24. 前記キメラポリペプチドが、該キメラポリペプチドの前記標的細胞の原形質膜の通過を可能とする輸送シグナルをさらに含んでなる、請求項２３に記載の方法。
  25. 対象となる標的ポリヌクレオチドの翻訳をin vitroで制御するための方法であって、
    （ａ）宿主細胞に、対象となる該標的ポリヌクレオチド、ならびに請求項１８に記載の核酸または該核酸を含んでなる請求項１９に記載のベクターを導入する工程；
    （ｂ）工程（ａ）において得られた組換え宿主細胞を適切な培養培地で培養し、これにより該宿主細胞が対象となる該標的ポリヌクレオチドを安定的に発現することを可能とする工程；および
    （ｃ）該培養培地に該誘導性調節ポリヌクレオチドと相互作用することができる薬剤を加え、これにより該キメラポリペプチドをコードする核酸の発現の調節を可能とする工程
    を含んでなる、方法。
  26. 請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド、または請求項１９に記載のベクターを含んでなる、対象となる標的ポリヌクレオチドの翻訳を制御するためのキット。
  27. 対象となる前記標的ポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクターをさらに含んでなる、請求項２６に記載のキット。
  28. 請求項２０または２１に記載の宿主細胞を含んでなる、対象となる標的ポリヌクレオチドの翻訳を制御するためのキット。
  29. 培養宿主細胞を含んでなるバイオリアクターにおいて対象となる標的ポリヌクレオチドの翻訳を活性化するための、請求項２２に記載のタンパク質翻訳制御系または請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のキットの使用。
  30. 請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドを含んでなる、医薬組成物。
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