CZ20014707A3

CZ20014707A3 - Izolovaná molekula nukleové kyseliny, způsob zjią»ování nukleové kyseliny, modulátoru, insekticidní sloučeniny a syntetické sloučeniny, genový konstrukt, rekombinantní polypeptid, buňka, syntetická sloučenina a komplex vázající hormon

Info

Publication number: CZ20014707A3
Application number: CZ20014707A
Authority: CZ
Inventors: Ronald Johnston Hill; Garry Noel Hannan
Original assignee: Commonwealth Scientific And Industrial Research Or
Priority date: 1999-07-01
Filing date: 2000-06-30
Publication date: 2002-06-12
Also published as: WO2001002436A1; AU5514100A; JP2003505019A; EP1203022A1; CA2377804A1; IL147295A0; ZA200200019B; AU771153B2; NZ516439A; EP1203022A4

Description

Izolovaná molekula nukleové kyseliny, způsob zjišťování nukleové kyseliny, modulátoru, insekticidní sloučeniny a syntetické sloučeniny, genový konstrukt, rekombinantní polypeptid, izolovaný polypeptid, buňka, syntetická sloučenina a komplex vázající hormon

Oblast techniky

Předložený vynález se obecně týká nových genetických sekvencí kódujících receptorové polypeptidy a jejich insekticidních forem, přičemž insekticidní formy jsou založeny na hmyzích hormonech, které nejsou polypeptidového typu, a na receptorech těchto hormonů. Přesněji řečeno, předložený vynález poskytuje izolované molekuly nukleové kyseliny, které kódují polypeptidy obsahující funkční steroidní hormon a receptory juvenilního hormonu, zvláště izolované molekuly nukleové kyseliny, které kódují polypeptidy obsahující receptory ekdysonu a receptory juvenilního hormonu od Ludlia čupřina (střeček ovčí), Myzus persicae (mšice) a Bemesia tabad (molice). Ve zvláště výhodném provedení se předložený vynález týká izolovaných molekul nukleové kyseliny, které kódují podjednotky EcR polypeptidu nebo jeho fragmenty od L. čupřina, M. persicae a B. tabad, nebo které kódují podjednotky proteinu sdruženého s EcR proteinem (USP polypeptid) u L. čupřina, M. persicae a B. tabad. Polypeptidy EcR a USP, které jsou zde popsány, se spojují a vytvářejí funkční heterodimemí receptory ekdysonu nebo analogy receptorů. Předložený vynález dále poskytuje vedle L. čupřina, M. persicae a B. tabad subjednotek proteinu sdruženého s EcR proteinem (USP polypeptid) receptorů pro ekdyson též L. čupřina, M. persicae a B. tabad EcR proteiny nebo jejich fragmenty a L. čupřina, M. persicae a B. tabad USP polypeptidy receptorů juvenilního hormonu těchto hmyzích druhů. Předložený vynález se dále týká produkce funkčních rekombinantních hmyzích receptorů a jejich rekombinantních polypeptidových podjednotek a jejich derivátů a analogů. Předložený vynález se dále týká použití rekombinantního receptorů a izolovaných molekul nukleové kyseliny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, při regulaci exprese genů. Předložený vynález se dále týká vyhledávacích systémů a metod zjišťování insekticidně aktivních činidel, která jsou schopna působit jako agonisté nebo antagonisté funkce hmyzích receptorů, jako jsou molekuly nebo ligandy, které se spojují s receptory steroidů nebo receptory juvenilních hormonů tak, že pozměňují afinitu uvedených receptorů pro jejich patřičné cis-elementy vyvolávající odezvu (např. odezvu vyvolávající elementy hmyzího steroidů, odezvu • · • · • · · · • · • · ··· ·· · ·«·· «···· · * · · · * vyvolávající elementy juvenilního hormonu) v genech, které regulují, nebo které popřípadě pozměňují afinitu uvedených receptorů k jejich buněčným podnětům (např. hmyzí steroidy nebo juvenilní hormony) nebo jejich analogům, nebo které popřípadě působí jako insekticidy na základě své schopnosti působit jako agonisté nebo antagonisté aktivity hmyzích hormonů, např. napodobením ligandu, který se váže k uvedenému receptoru nebo kjeho oblasti, která se k ligandu váže. Vynález také zahrnuje takové sloučeniny nebo ligandy.

Dosavadní stav techniky

Mezinárodní patentová přihláška WO 91/13 167 (přihlašovatel The Board of Trustees of Leyland Stanford University, zde označovaná jako WO 91/13 167) popisuje určování, charakterizaci, expresi a použití hmyzích receptorů steroidů a DNA sekvencí, které je kódují, zvláště určování, charakterizaci, expresi a použití receptoru octomilky obecné, Drosophila melanogaster.

Autory předloženého vynálezu bylo zjištěno, že omezená homologie mezi sekvencemi genu kódujícího receptor steroidů u D. melanogaster a sekvencemi kódujícími receptor steroidů, které pocházejí z jiných druhů hmyzu, zvláště těch, které pocházejí z dvoukřídlého hmyzu, jako je australský střeček ovčí L. čupřina] mšicí jako je mšice M. persicae, hmyzích druhů sajících na listech, jako je molice (B. tabaci), červců a rovnokřídlých; brouků; síťokřídlých; motýlů a mravenců, a rovněž z červů a prvoků, zabraňuje běžné izolaci DNA sekvencí, které kódují receptory steroidů nebo receptory juvenilních hormonů z těchto zmíněných organizmů.

Dále autoři předloženého vynálezu zjistili, že receptor steroidů D. melanogaster, popsaný ve WO 91/13 167, je citlivý ke zvýšené teplotě a vykazuje sníženou aktivitu při teplotách nad 30 °C, jako např. při teplotách asi 37 °C, zvláště při nízkých koncentracích receptoru. Proto receptor steroidů D. melanogaster, popsaný ve WO 91/13 167 má omezené použití při fyziologických teplotách, vhodných pro živočišné nebo bakteriální buňky. Navíc tam, kde je žádoucí produkovat biologicky aktivní receptor steroidů za použití in vivo nebo in vitro expresních systémů, které běžně využívají buněk nebo tkání, pěstovaných v teplotním rozmezí asi od 28 °C do 42 °C, má také receptor steroidů D. melanogaster omezené použití.

V práci která vedla k předloženého vynálezu, autoři vyvinuli nový vyhledávací postup, zahrnující použití vysoce degenerovaných oligonukleotidových sond a primerů, odvozených od aminokyselinových sekvencí domény, která se váže na DNA u polypeptidů receptoru pro ekdyson u D. melanogaster a Chironomus tentans, pro určování nukleotidových sekvencí, kódujících polypeptidy nových receptorů steroidu a polypeptidy nových hmyzích receptorů juvenilního hormonu. Autoři předloženého vynálezu dále určili v těchto polypeptidech specifické oblasti, které jsou vhodné k využití při přípravě polypeptidů překvapivé nové skupiny derivátů polypeptidů receptorů steroidu a derivátů polypeptidů receptorů hmyzího juvenilního hormonu. Polypeptidy nového receptoru steroidu a polypeptidy nových receptorů hmyzího juvenilního hormonu, které jsou předmětem tohoto vynálezu, a od nich odvozené polypeptidy, a sestavené receptory steroidů a receptory hmyzího juvenilního hormonu, odvozené od uvedených polypeptidů a derivátů, a molekuly nukleových kyselin kódující výše uvedené proteiny, poskytují prostředky pro vyvinutí široké oblasti insekticidně aktivních činidel, a rovněž metod pro regulovanou produkci biologicky aktivních molekul. Předložený vynález zvláště poskytuje možnosti pro vývoj specifických ligandů, které se vážou a/nebo působí agonisticky nebo antagonisticky na steroidní receptory nebo receptory juvenilního hormonu, a/nebo které se váží na polypeptidové subjednotky uvedených receptorů, které jsou zde popsány, čímž působí jako vysoce specifické insekticidy, které mají velký význam pro obchod a životní prostředí.

Autoři předloženého vynálezu byli překvapivě úspěšní při charakterizování receptoru pro ekdyson a receptoru pro juvenilní hormon, pocházejících z hmyzích druhů z řádů Diptera a Hemiptera, a jejich polypeptidových složek a funkčních derivátů uvedených polypeptidů a receptorů, zvláště ve světle extrémních obtíží při zacházení s těmito organizmy. Podstata těchto molekul byla před předloženým vynálezem neznámá.

Tento vynález z různých hledisek překonává problémy spojené s receptory pro ekdyson D. melanogaster, které postrádají teplotní stabilitu. Navíc tyto postupy vynálezu týkající se způsobů vyhledávání insekticidně aktivních činidel neobsahují kompetiční testy, které jsou obecně složité a často nepřesné nebo je obtížné je kalibrovat.

Podstata vynálezu

Tento popis obsahuje informaci o nukleotidových a aminokyselinových sekvencích, která byla připravena pomocí programu Patentln verze 2,0, uvedené zde • · · · • · ··· ·· · · · · · ····· ·· · ·· * • ·· ··· · · · · · ·

Λ ...........

Η ·· ·· ·· ·· ·· ···· v citacích. Každá nukleotidové nebo aminokyselinová sekvence je označena v seznamu sekvencí číselným ukazatelem <210>, který je následován číselným identifikátorem (např. <210>1, <2102 atd.). Délka, typ sekvence (DNA, protein (PRT) atd.) a zdrojový organizmus pro každou nukleotídovou nebo aminokyselinovou sekvenci jsou uvedeny v informaci, kterou poskytuje pole s číselným ukazatelem <211>, <212>, respektive <213>. Nukleotidové a aminokyselinové sekvence, na které je odkazováno v popisu, jsou definovány identifikátorem „SEQ ID NO:“ (sekvence číslo), za kterým následuje číselný identifikátor. Například SEQ ID NO: 1 se vztahuje k informaci poskytnuté v poli, které je označeno číselným ukazatelem <400> 1, atd.

Označení nukleotidových zbytků na které je zde odkazováno je takové, jaké je doporučeno komisí IUPAC-IUB pro biochemické názvosloví, kde A představuje adenin, C představuje cytozin, G představuje guanin, T představuje tymin, Y představuje pyrimidinový zbytek, R představuje purinový zbytek, M představuje adenin nebo cytozin, K představuje guanin nebo tymin, S představuje guanin nebo cytozin, W představuje adenin nebo tymin, H představuje nukleotid jiný než je guanin, B představuje nukleotid jiný než je adenin, V představuje nukleotid jiný než je tymin, D představuje nukleotid jiný než je cytozin a N představuje jakýkoli nukleotidový zbytek.

Bibliografické podrobnosti o publikacích na které je zde odkazováno, jsou souhrnně uvedeny na konci popisu. Zde uvedené odkazy na dosavadní stav techniky, včetně jakéhokoli jednoho nebo více dosud uveřejněných dokumentů, nemá být považováno za potvrzení nebo náznak toho, že uvedený dosavadní stav techniky je v Austrálii v obecném povědomí, nebo že je součástí běžných obecných znalostí v Austrálii.

V tomto popisu, pokud z kontextu nevyplývá jinak, slovo „obsahovat“, nebo variace jako „obsahuje“ nebo „obsahující“, má být chápáno že znamená zahrnutí uvedeného kroku, prvku nebo celku nebo skupiny kroků, prvků nebo celků, ale nikoli vyloučení jakéhokoli jiného kroku, prvku nebo celku nebo skupiny prvků nebo celků.

Zde používaný termín „odvozený z“ by měl být chápán jako označující, že specifický celek může být získán z určitého zdroje, třebaže nikoli nezbytně přímo z takového zdroje.

Osoby se zkušeností v oboru si budou plně vědomy, že zde popsaný vynález podléhá variacím a modifikacím, i jiným než jsou zde specificky popsány. Je třeba mít na paměti, že vynález zahrnuje všechny takové variace a modifikace. Vynález také zahrnuje všechny kroky, znaky, prostředky a sloučeniny na které se v tomto popisu ··· ·· · ···· ····· · · · ·· * poukazuje, jednotlivě nebo kolektivně, jakoukoli z možných kombinací nebo kombinaci jakýchkoli dvou nebo více uvedených kroků nebo znaků.

Předložený vynález není ve svém rozsahu omezen žádným zde popsaným provedením, tyto popisy jsou uváděny pouze pro názornost. Funkčně obdobné produkty, prostředky a metody patří zřetelně do rozsahu zde popsaného vynálezu.

Z jednoho hlediska poskytuje předložený vynález izolovanou molekulu nukleové kyseliny, která obsahuje buď nukleotidovou sekvenci, která kóduje nebo nukleotidovou sekvenci, která je komplementární k sekvenci kódující polypeptid receptoru steroidu nebo polypeptid receptoru juvenilního hormonu nebo jejich biologicky aktivní derivát nebo analog, přičemž uvedený polypeptid:

(i) je vybrán ze skupiny zahrnující polypeptid EcR receptoru steroidu, protein sdružený (USP polypeptid) s receptorem steroidu a USP polypeptid receptoru juvenilního hormonu; a (ii) obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň ze 40 % totožná s aminokyselinovou sekvencí, vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO. 40 a SEQ ID NO: 42.

V alternativním provedení poskytuje předložený vynález izolovanou molekulu nukleové kyseliny, která obsahuje buď nukleotidovou sekvenci která kóduje, nebo nukleotidovou sekvenci, která je komplementární k sekvenci kódující polypeptid receptoru steroidu nebo polypeptid receptoru juvenilního hormonu nebo jejich biologicky aktivní derivát nebo analog, přičemž uvedený polypeptid:

(i) je vybrán ze skupiny zahrnující polypeptid EcR receptoru steroidu, protein sdružený (USP polypeptid) s receptorem steroidu a USP polypeptid receptoru juvenilního hormonu; a (ii) obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň ze 40 % totožná s aminokyselinovou sekvencí kódovanou DNA hmyzích druhů, která je přítomna v plazmidu vybraném ze skupiny zahrnující AGAL přístupová čísla NM 99/04 565, NM 99/04 566, NM 99/04 567, NM 99/04 568, NM 00/12 580 a NM 00/12 581.

V dalším alternativním provedení poskytuje předložený vynález izolovanou molekulu nukleové kyseliny, která obsahuje bud nukleotidovou sekvenci která kóduje, nebo nukleotidovou sekvenci, která je komplementární k sekvenci kódující polypeptid « · • · receptorů steroidu nebo polypeptid receptorů juvenilního hormonu nebo jejich biologicky aktivní derivát nebo analog, přičemž uvedená nukleotidová sekvence je vybrána ze skupiny zahrnující:

(i) nukleotidovou sekvenci, která je alespoň ze 40 % shodná s nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 41 nebo nukleotidovou sekvenci komplementární ke kterékoli z uvedených sekvencí;

(ii) nukleotidovou sekvenci, která je alespoň za málo striktních podmínek hybridizace schopna hybridizovat s nukleotidovou sekvencí, vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 41 nebo nukleotidovou sekvenci komplementární ke kterékoli z uvedených sekvencí;

(iii) nukleotidovou sekvenci, která je alespoň za málo striktních podmínek hybridizace schopna hybridizovat s nukleotidovou sekvencí, která je přítomna v plazmidu vybraném ze skupiny zahrnující AGAL přístupová čísla NM 99/04 565, NM 99/04 566, NM 99/04 567, NM 99/04 568, NM 00/12 580 a NM 00/12 581;

(iv) nukleotidovou sekvenci, která má alespoň 40 % totožnost s nukleotidovou sekvencí, která je přítomna v plazmidu vybraném ze skupiny zahrnující AGAL přístupová čísla NM 99/04 565, NM 99/04 566, NM 99/04 567, NM 99/04 568, NM 00/12 580 a NM 00/12 581; a (v) nukleotidovou sekvenci, která je schopna se amplifikovat metodou PCR za pomoci primerů nukleové kyseliny, jejichž sekvence je vybrána ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31 a SEQ ID NO. 32.

V dalším alternativním provedení poskytuje předložený vynález izolovanou molekulu nukleové kyseliny, která kóduje EcR polypeptid steroidního receptorů a obsahuje nukleotidovou sekvenci, která je uvedena v SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 13.

V dalším alternativním provedení poskytuje předložený vynález izolovanou molekulu nukleové kyseliny, která kóduje USP polypeptid steroidního receptorů nebo polypeptid receptoru juvenilního hormonu a obsahuje nukleotidovou sekvenci, která je vybrána ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 41.

V dalším alternativním provedení poskytuje předložený vynález izolovanou molekulu nukleové kyseliny, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, která je vybrána ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 37 a SEQ ID NO: 41 nebo nukleotidovou sekvenci komplementární ke kterékoli z uvedených sekvencí.

V dalším alternativním provedení poskytuje předložený vynález izolovanou molekulu nukleové kyseliny, která obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31 a SEQ ID NO: 32 nebo nukleotidovou sekvenci komplementární ke kterékoli z uvedených sekvencí.

Z druhého hlediska poskytuje předložený vynález způsob určení izolované molekuly nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid receptoru steroidu nebo polypeptid receptoru juvenilního hormonu, který zahrnuje kroky:

(i) hybridizace genomové DNA, mRNA nebo cDNA s pro hybridizaci účinným množstvím jedné nebo více sond vybraných ze skupiny zahrnující:

(a) sondu obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů z nukleotidové sekvence vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11,

SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID

NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25,

SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID

NO. 32, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 39 a SEQ ID NO. 41 nebo nukleotidovou sekvenci komplementární ke kterékoli z uvedených sekvencí;

(b) sondu obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů z cDNA, která je přítomna v plazmidu vybraném ze skupiny zahrnující AGAL přístupová čísla NM 99/04 565, NM 99/04 566, NM 99/04 567, NM 99/04 568, NM 00/12 580 a NM 00/12 581; a (c) hybridizační sondu obsahující nukleotidové sekvence vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID • · · · · · · · ·· · · · ·

NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 37,

SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 41 nebo nukleotidovou sekvenci komplementární ke kterékoli z uvedených sekvencí, nebo homolog, analog nebo derivát kterékoli z uvedených sekvencí, nebo komplementární sekvence, které jsou alespoň ze 40 % s nimi shodné; a (ii) detekování hybridizace.

V alternativním provedení obsahuje vynalezená metoda kroky:

(i) teplotní hybridizace ke genomové DNA, mRNA nebo cDNA jednoho nebo více primerů vybraných ze skupiny zahrnující:

(a) primer obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů z nukleotidové sekvence vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11,

SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID

NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25,

SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID

NO: 32, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 41 nebo nukleotidovou sekvenci komplementární ke kterékoli z uvedených sekvencí;

(b) primer obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů z cDNA, která je přítomna v plazmidu vybraném ze skupiny zahrnující AGAL přístupová čísla NM 99/04 565, NM 99/04 566, NM 99/04 567, NM 99/04 568, NM 00/12 580 a NM 00/12 581; a (ii) amplifikaci nukleotidové sekvence, která kóduje polypeptid receptorů steroidu nebo polypeptid receptorů juvenilního hormonu pomocí polymerázové řetězové reakce.

V dalším alternativním provedení obsahuje vynalezená metoda kroky:

(i) amplifikaci nukleotidové sekvence, která kóduje polypeptid receptorů steroidu nebo polypeptid receptorů juvenilního hormonu polymerázovou řetězovou reakcí za pomoci jednoho nebo více PCR primerů vybraných ze skupiny zahrnující:

(a) primer obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů z nukleotidové sekvence vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, • · · · * · · · 9 · · · 9 · ··· ·· · ···· • 9 · · 9 ·· 9 ·· · • · · 9 · 9 · 9·· · « _ 9999 9··« ··· ·· ·· ·· ·· ·· 999 9

SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 41 nebo nukleotidovou sekvenci komplementární ke kterékoli z uvedených sekvencí; a (b) primer obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů z cDNA, která je přítomna v plazmidu vybraném ze skupiny zahrnující AGAL přístupová čísla NM 99/04 565, NM 99/04 566, NM 99/04 567, NM 99/04 568, NM 00/12 580 a NM 00/12 581;

(ii) hybridizaci amplifikované nukleotidové sekvence ke genomové DNA, mRNA nebo cDNA s pro hybridizaci účinným množstvím jedné nebo více sond vybraných ze skupiny zahrnující:

(a) sondu obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů z nukleotidové sekvence vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 41 nebo nukleotidovou sekvenci komplementární ke kterékoli z uvedených sekvencí;

(b) sondu obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů z cDNA, která je přítomna v plazmidu vybraném ze skupiny zahrnující AGAL přístupová čísla NM 99/04 565, NM 99/04 566, NM 99/04 567, NM 99/04 568, NM 00/12 580 a NM 00/12 581; a (c) hybridizační sondu obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů z nukleotidové sekvence vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 41, nebo nukleotidovou sekvenci komplementární ke kterékoli z uvedených sekvencí, nebo homolog, analog nebo derivát kterékoli z uvedených sekvencí, nebo komplementární sekvence, které jsou alespoň ze 40 % s nimi shodné; a (iii) detekování hybridizace.

• · · · · ·

Z třetího hlediska poskytuje předložený vynález genetickou konstrukci obsahující předmětnou izolovanou molekulu nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid receptoru steroidu nebo polypeptid receptoru juvenilního hormonu, operativně vázaný k promotorové sekvenci. Je výhodné, když předmětná molekula nukleové kyseliny je ve formě schopné exprese, tedy je schopna produkovat rekombinantní polypeptid.

Ze čtvrtého hlediska poskytuje tedy předložený vynález rekombinantní nebo izolovaný polypeptid obsahující polypeptid receptoru steroidu nebo polypeptid receptoru juvenilního hormonu nebo jejich biologicky aktivní derivát nebo analog, přičemž uvedený polypeptid:

(i) je vybrán ze skupiny zahrnující polypeptid EcR receptoru steroidu, protein sdružený (USP polypeptid) s receptorem steroidu a USP polypeptid receptoru juvenilního hormonu; a (ii) obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň ze 40 % totožná s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 42;

přičemž uvedený polypeptid je v podstatě zbaven složek hmyzích buněk, které jej přirozeně doprovázejí.

V alternativním provedení poskytuje předložený vynález rekombinantní nebo izolovaný polypeptid obsahující polypeptid receptoru steroidu nebo polypeptid receptoru juvenilního hormonu nebo jejich biologicky aktivní derivát nebo analog, přičemž uvedený polypeptid:

(i) je vybrán ze skupiny zahrnující polypeptid EcR receptoru steroidu, protein sdružený (USP polypeptid) s receptorem steroidu a USP polypeptid receptoru juvenilního hormonu; a (ii) obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň ze 40 % totožná s polypeptidem kódovaným cDNA, která je přítomna v plazmidu vybraném ze skupiny zahrnující AGAL přístupová čísla NM 99/04 565, NM 99/04 566, NM 99/04 567, NM 99/04 568, NM 00/12 580 a NM 00/12 581.

· ·»9 · • · · · • · · • · · « · • · · • · · • · · · • · ·· • · · · • · ·

Ze pátého hlediska poskytuje předložený vynález buňku obsahující předmětnou izolovanou molekulu nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid receptorů steroidu nebo polypeptid receptorů juvenilního hormonu.

Ve výhodném provedení buňka, která je předmětem tohoto vynálezu, exprimuje polypeptid kódovaný molekulou nukleové kyseliny.

Ve výhodném provedení buňka exprimuje polypeptid receptorů steroidu nebo jeho fragment, přičemž tento receptor je schopen se vázat k hmyzímu steroidu nebo jeho analogu, nebo ke kandidátu na insekticidně aktivní činidlo a vytváří aktivovaný komplex, a obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, kódující biologicky aktivní molekulu nebo molekulu zpravodaj, operativně vázanou k jednomu nebo více elementům, které jsou odezvou na hmyzí steroid, které vazbou uvedeného aktivovaného komplexu podporují transkripci sekvence nukleové kyseliny, přičemž uvedená buňka, vystavená hmyzímu steroidu nebo jeho analogu, reguluje expresi uvedené biologicky aktivní molekuly nebo umožní detekci uvedené molekuly zpravodaje.

Z dalšího hlediska poskytuje předložený vynález živočicha (jako je např. savec), mikroorganizmus, rostlinu nebo vodní organizmus, který obsahuje jednu nebo více buněk, které byly uvedeny výše.

Z dalšího hlediska poskytuje předložený vynález způsob pro zjištění modulátoru exprese genu, zprostředkované hmyzím receptorem steroidu nebo exprese genu, zprostředkované hmyzím receptorem juvenilního hormonu, který se skládá z:

(i) testování exprese genu zpravodaje v přítomnosti rekombinantního nebo izolovaného polypeptidu hmyzího receptorů steroidu nebo polypeptidu receptorů juvenilního hormonu, které jsou předmětem tohoto vynálezu, a potenciálního modulátoru; a (ii) testování exprese genu zpravodaje v přítomnosti rekombinantního nebo izolovaného polypeptidu hmyzího receptorů steroidu nebo polypeptidu receptorů juvenilního hormonu, které jsou předmětem tohoto vynálezu, bez potenciálního modulátoru; a (iii) porovnání exprese genu zpravodaje v přítomnosti potenciálního modulátoru s expresí genu zpravodaje v nepřítomnosti potenciálního modulátoru, přičemž uvedený gen zpravodaj je operativně umístěn pod kontrolu elementu vyvolávajícího reakci na steroid (SRE), k němuž se uvedený receptor hmyzího steroidu váže, nebo promotorové sekvence, která uvedený SRE obsahuje.

• · · « «·· ·· 4 · 4 · 4 • · · 4 4 4* 4 · · 4

Z ještě dalšího hlediska poskytuje předložený vynález způsob pro určení potenciální insekticidní sloučeniny, který se skládá z:

(i) přímého nebo nepřímého testování vazby rekombinantního nebo izolovaného polypeptidů hmyzího receptoru steroidu nebo polypeptidů receptoru juvenilního hormonu, které jsou předmětem tohoto vynálezu, k elementu odpovědi na steroid (SRE), k němuž se uvedený receptor hmyzího steroidu váže, v přítomnosti kandidátní sloučeniny; a (ii) přímého nebo nepřímého testování vazby rekombinantního nebo izolovaného polypeptidů hmyzího receptoru steroidu nebo polypeptidů receptoru juvenilního hormonu, které jsou předmětem tohoto vynálezu, k elementu reakce na steroid (SRE), k němuž se uvedený receptor hmyzího steroidu váže, v nepřítomnosti kandidátní sloučeniny; a (iii) porovnání vazby zjištěné v (i) a (ii), přičemž rozdíl v úrovni vazby naznačuje, že kandidátní sloučenina vykazuje potenciální insekticidní aktivitu.

Z ještě dalšího hlediska poskytuje předložený vynález způsob pro určení kandidáta na insekticidně aktivní činidlo, který se skládá z:

a) exprimování polypeptidů EcR receptoru steroidu nebo jeho fragmentu, který obsahuje oblast, která se váže k ligandu, popřípadě ve spojení s proteinem sdruženým s EcR proteinem (USP polypeptid) receptoru steroidu nebo jeho doménou, která se váže k ligandu, popřípadě ve spojení s hmyzím steroidem nebo jeho analogem tak, že vytvoří komplex;

b) vyčištění nebo vysrážení komplexu;

c) určení trojrozměrné struktury domény, která se v komplexu váže k ligandu; a

d) určení sloučenin, které se vážou nebo spojují s trojrozměrnou strukturou domény, která se váže k ligandu, přičemž uvedená sloučenina představuje kandidáta insekticidně aktivních činidel.

a) exprimování polypeptidů USP receptoru juvenilního hormonu nebo jeho fragmentu, který obsahuje oblast, která se váže k ligandu, popřípadě ve spojení s proteinem sdruženým s EcR polypeptidem receptoru steroidu nebo jeho doménou, která se váže k ligandu, popřípadě ve spojení s hmyzím steroidem nebo jeho analogem tak, že vytvoří komplex;

·· ··· ·

b) vyčištěni nebo vysrážení komplexu;

Z jiného hlediska se předložený vynález vztahuje k metodě nebo testu pro vyhledávání insekticidně aktivních sloučenin, který zahrnuje reakci kandidáta insekticidní sloučeniny s polypeptidem receptoru steroidů nebo jeho fragmentem, obsahujícím doménu, která se váže k ligandu, nebo jeho komplex se sdruženým proteinem nebo jeho fragmentem, obsahujícím doménu, která se váže k ligandu, a zjišťování přítomnosti nebo nepřítomnosti vazby uvedené sloučeniny tak, že je zjišťována insekticidní aktivita.

Z ještě dalšího hlediska poskytuje předložený vynález syntetickou sloučeninu, která reaguje s trojrozměrnou strukturou polypeptidů nebo proteinu, vybraného ze skupiny zahrnující:

(i) EcR polypeptid receptoru steroidů nebo jeho fragment;

(ii) protein sdružený s EcR polypeptidem (USP polypeptid) receptoru steroidů nebo jeho fragment;

(iii) USP polypeptid receptoru juvenilního hormonu; a (iv) funkční receptor nebo proteinový komplex vytvořený spojením (i) a (ii), přičemž uvedená sloučenina je schopna se vázat k uvedenému polypeptidů nebo proteinu tak, že působí agonisticky nebo antagonisticky na jeho vazebnou nebo biologickou aktivitu.

Je výhodné, když jsou syntetické sloučeniny odvozeny z trojrozměrné struktury hmyzích receptorů steroidů nebo receptorů juvenilního hormonu, přičemž se tyto sloučeniny vážou k uvedeným receptorům a mají ten účinek, že bud inaktivují receptory nebo posilují aktivitu receptorů. Ještě výhodnější je, když sloučeniny napodobují trojrozměrnou strukturu ligandu, který se váže k receptoru a ještě výhodnější je, když sloučeniny napodobují trojrozměrnou strukturu ligandu, který se váže kté oblasti uvedeného receptoru, která se váže k ligandu.

Z ještě dalšího hlediska předložený vynález poskytuje systém vyhledávání insekticidně aktivních činidel, která obsahují nukleotidovou sekvenci, kódující receptor steroidů nebo jeho fragment, a nukleotidovou sekvenci, kódující sdružený protein nebo • ttt • · · · t tu « · ·· ···· jeho fragment, který se spojuje s receptorem tak, že mu propůjčuje zvýšenou afinitu k elementům odezvy na hmyzí steroid, nebo zvýšenou afinitu ke hmyzím steroidům nebo jejich analogům nebo insekticidně aktivním činidlům, nebo termostabilitu nebo zvýšenou termostabilitu uvedenému receptoru, přičemž receptor a sdružený protein jsou schopny se vázat ke kandidátům insekticidně aktivního činidla tak, že vytvářejí aktivovaný komplex, a sekvenci nukleové kyseliny kódující biologicky aktivní molekulu nebo molekulu zpravodaj, operativně vázanou k jednomu nebo více elementům odezvy na hmyzí steroid, který vazbou uvedeného aktivovaného komplexu reguluje transkripci sekvence nukleové kyseliny, přičemž vystavení expresi uvedené biologicky aktivní molekuly nebo molekuly zpravodaje koreluje s insekticidní aktivitou.

Z jiného hlediska předložený vynález poskytuje metodu regulování produkce biologicky aktivní molekuly nebo molekuly zpravodaje v buňce, přičemž uvedená metoda zahrnuje kroky, kterými jsou do uvedené buňky vneseny:

a) nukleotidové sekvence kódující receptor steroidů nebo jeho fragment, který je schopen se vázat k hmyzímu steroidů nebo jeho analogu tak, že vytváří aktivovaný komplex; a

b) nukleotidové sekvence kódující uvedenou biologicky aktivní molekulu nebo molekulu zpravodaj, operativně vázanou k jednomu nebo více elementům odezvy na hmyzí steroid, který vazbou uvedeného aktivovaného komplexu reguluje transkripci sekvence nukleové kyseliny, kódující uvedenou biologicky aktivní molekulu nebo molekulu zpravodaj, přičemž vystavení buňky hmyzímu steroidů nebo jeho analogu reguluje expresi biologicky aktivní molekuly nebo molekuly zpravodaje.

Podrobný popis výhodných provedení

Jedno provedení předloženého vynálezu poskytuje izolovanou molekulu nukleové kyseliny, která obsahuje buď nukleotidovou sekvenci která kóduje, nebo nukleotidovou sekvenci, která je komplementární k sekvenci kódující polypeptid receptoru steroidů nebo polypeptid receptoru juvenilního hormonu nebo jejich biologicky aktivní derivát nebo analog, přičemž uvedený polypeptid:

(i) je vybrán ze skupiny zahrnující polypeptid EcR receptoru steroidů, protein sdružený (USP polypeptid) s receptorem steroidů a USP polypeptid receptoru juvenilního hormonu; a (ii) obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň ze 40 % totožná s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, • · · · · · ·«· ····· ·· · ··

SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 42.

Proto izolovaná molekula nukleové kyseliny, která je předmětem tohoto vynálezu, může obsahovat fragment nukleotidové sekvence, kódující polypeptid receptoru v plné délce.

Je třeba mít na paměti, že „fragment“ nukleotidové sekvence kódující podjednotku EcR polypeptidu receptoru steroidu nebo proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) receptoru steroidu nebo USP polypeptid receptoru juvenilního hormonu, označuje nukleotidovou sekvenci kódující část fragmentu takového receptoru, která je schopna vazby nebo spojení s hmyzím steroidem nebo jeho analogem, nebo kandidátem na insekticidně aktivní sloučeninu. Fragmenty nukleotidové sekvence by obecně obsahovaly v nadbytku dvacetičlenné úseky po sobě následujících nukleotidů, odvozených ze základní sekvence a mohou kódovat jednu nebo více domén funkčního hmyzího receptoru steroidu nebo receptoru juvenilního hormonu.

Je výhodné, když izolovaná molekula nukleové kyseliny, která je předmětem tohoto vynálezu, kóduje polypeptid receptoru ekdysteroidu. Osoby se zkušeností v oboru si jsou vědomi toho, že receptory ekdysteroidu odvozené z hmyzích druhů, jsou heterodimerní receptory obsahující podjednotku EcR polypeptidu a protein sdružený s EcR (USP polypeptid) (viz též Jones a Sharp, 1997). V tomto ohledu autoři předloženého vynálezu zjistili, že USP polypeptid receptoru hmyzího juvenilního hormonu je strukturálně shodný s proteinem sdruženým s EcR receptoru ekdysteroidu, který je předmětem tohoto vynálezu, avšak receptory juvenilního hormonu obsahují monomery nebo multimery USP polypeptidu fungující bez podjednotky EcR polypeptidu, která je přítomna v receptorech ekdysteroidu. Předložený vynález se tedy vztahuje rovněž na nukleotidové sekvence kódující polypeptidy jak receptorú ekdysteroidu, tak polypeptidy hmyzích receptorú juvenilního hormonu.

Je výhodnější, když izolovaná molekula nukleové kyseliny, která je předmětem tohoto vynálezu, kóduje receptor ekdysteroidu, který je modulován jedním nebo více ekdysonovými steroidy, ponasteronem A nebo muristeronem, nebo analogem ekdysteroidu.

Izolovaná molekula nukleové kyseliny, která je předmětem tohoto vynálezu, může pocházet z jakéhokoli organizmu, který obsahuje receptory steroidu, které jsou schopny reagovat na ekdysteroidy nebo ekdysteroidům podobné sloučeniny nebo • · · · • · · · • · · ·

9· 999· juvenilní hormony, nebo analogy takových komplexů receptor-ligand. Proto tedy nesmí být předložený vynález omezován na jakékoli ze svých provedení, na určitý zdroj nukleové kyseliny nebo jí kódovaný polypeptid.

Je výhodné, když izolovaná molekula nukleové kyseliny, která je předmětem tohoto vynálezu, pochází mimo jiné z hmyzích druhů, červů (hlístice, tasemnice, motolice), prvoků a mravenců.

Je výhodnější, když izolovaná molekula nukleové kyseliny, která je předmětem tohoto vynálezu, pochází z hmyzích druhů vybraných ze skupiny zahrnující mimo jiné mouchy, ploštice, brouky, síťokřídlé, motýly a mravence. Ještě výhodnější je, když je izolovaná molekula nukleové kyseliny, která je předmětem tohoto vynálezu, odvozena ze mšic, červců, pidikřísků, „white fly“ a bzučivek jako je střeček ovčí.

Předložený vynález se nevztahuje na aminokyselinové sekvence obsahující kompletní polypeptid podjednotky EcR ekdysonového receptorů D. melanogaster, jak je popsán v WO 91/13 167. Avšak tato výjimka je učiněna na základě toho, že předložený vynález nezahrnuje chimerní geny a fúzní proteiny, které obsahují nukleotidové, respektive aminokyselinové sekvence D. melanogaster.

Ve zvláště výhodném provedení, izolovaná molekula nukleové kyseliny, která je předmětem tohoto vynálezu, je odvozena ze mšice M. persicae, popřípadě z australského střečka ovčího L. čupřina.

Receptor ekdysteroidu je s výhodou modulován jedním nebo více ekdysonovými steroidy, ponasteronem A nebo muristeronem, nebo analogem ekdysteroidu.

Zde používaný termín „analog ekdysteroidu“ označuje jakoukoli sloučeninu, která se váže k jedné nebo více polypeptidovým podjednotkám ekdysteroidového receptorů nebo k heterodimernímu holoreceptoru, který obsahuje stejné nebo různé podjednotky, která se váže k USP polypeptidu receptorů juvenilního hormonu, která se váže k biologicky aktivnímu derivátu nebo analogu uvedených polypeptidú nebo holoreceptoru. Termín „analog ekdysteroidu“ bude dále považován za označení jakékoli sloučeniny, která moduluje biologickou aktivitu jedné nebo více polypeptidových podjednotek ekdysteroidového receptorů nebo heterodimerního holoreceptoru, který obsahuje stejné nebo různé podjednotky, která moduluje biologickou aktivitu USP polypeptidu receptorů juvenilního hormonu, která moduluje biologickou aktivitu biologicky aktivního derivátu nebo analogu uvedených polypeptidú nebo holoreceptoru.

Rozsah předloženého vynálezu není omezen na specifické nukleotidové a aminokyselinové sekvence L. čupřina, M. persicae a B. tabaci, uvedené v přiloženém • · · · seznamu sekvencí, a osoby se zkušeností v oboru budou schopny snadno určit další podobné sekvence pocházející z jiných zdrojů za pomoci postupů v oboru známých, například za použití hybridizace nukleových kyselin a/nebo polymerázové řetězové reakce, v podstatě tak, jak bylo popsáno v Ausubel a kol. (1992) a/nebo McPherson a kol. (1991) a/nebo Sambrook a kol. (1989).

Proto předložený vynález samozřejmě zahrnuje izolované molekuly nukleových kyselin, které kódují, nebo jsou komplementární k izolovaným molekulám nukleových kyselin, které kódují předmětný EcR polypeptid receptoru steroidu nebo jeho fragment, nebo předmětný protein sdružený s EcR (USP polypeptid) receptoru steroidu nebo předmětný USP polypeptid receptoru juvenilního hormonu, vedle jejich derivátů, fragmentů a analogů, které obsahují aminokyselinové sekvence které jsou alespoň ze 40 % totožné s aminokyselinovou sekvencí, vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 42.

Předložený vynález dále samozřejmě zahrnuje izolované molekuly nukleových kyselin, které kódují, nebo jsou komplementární k izolovaným molekulám nukleových kyselin, které kódují předmětný EcR polypeptid receptoru steroidu nebo jeho fragment, nebo předmětný protein sdružený s EcR (USP polypeptid) receptoru steroidu nebo předmětný USP polypeptid receptoru juvenilního hormonu, vedle jejich derivátů, fragmentů a analogů, které obsahují aminokyselinové sekvence které jsou alespoň ze 40 % totožné s aminokyselinovou sekvencí, vybranou ze skupiny zahrnující AGAL přístupová čísla NM 99/04 565, NM 99/04 566, NM 99/04 567, NM 99/04 568, NM 00/12 580 a NM 00/12 581.

Pro účely názvosloví, plazmid pLcEcR obsahuje cDNA kódující podjednotku EcR polypeptidu ekdysonového receptoru Lucilia čupřina. Tento plazmid byl uložen 1. června 1999 v Australské státní analytické laboratoři na Suakin ul. 1, Pymble, New South Wales 2073, Austrálie, za podmínek budapešťské smlouvy o Mezinárodním potvrzení ukládání mikroorganizmů pro účely patentového jednání a bylo mu přiděleno AGAL přístupové číslo NM 99/04 566.

Pro účely názvosloví, plazmid pLcUSP obsahuje cDNA kódující podjednotku proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) ekdysonového receptoru Lucilia čupřina, nebo podjednotku USP polypeptidu receptoru juvenilního hormonu Lucilia čupřina. Tento plazmid byl uložen 1. června 1999 v Australské státní analytické laboratoři na • · · · ·· *· ·· ·· ·· ··'

Suakin ul. 1, Pymble, New South Wales 2073, Austrálie, za podmínek budapešťské smlouvy o Mezinárodním potvrzení ukládání mikroorganizmů pro účely patentového jednání a bylo mu přiděleno AGAL přístupové číslo NM 99/04 565.

Pro účely názvosloví, plazmid pMpEcR obsahuje cDNA kódující podjednotku EcR polypeptidů ekdysonového receptoru Myzus persicae. Tento plazmid byl uložen 1. června 1999 v Australské státní analytické laboratoři na Suakin ul. 1, Pymble, New South Wales 2073, Austrálie, za podmínek budapešťské smlouvy o Mezinárodním potvrzení ukládání mikroorganizmů pro účely patentového jednání a bylo mu přiděleno AGAL přístupové číslo NM 99/04 567.

Pro účely názvosloví, plazmid pMpUSP obsahuje první cDNA kódující podjednotku proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) ekdysonového receptoru Myzus persicae, nebo podjednotku USP polypeptidů receptoru juvenilního hormonu Myzus persicae. Tento plazmid byl uložen 1. června 1999 v Australské státní analytické laboratoři na Suakin ul. 1, Pymble, New South Wales 2073, Austrálie, za podmínek budapešťské smlouvy o Mezinárodním potvrzení ukládání mikroorganizmů pro účely patentového jednání a bylo mu přiděleno AGAL přístupové číslo NM 99/04 568.

Pro účely názvosloví, plazmid pMpUSP2 obsahuje druhou cDNA kódující podjednotku proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) ekdysonového receptoru Myzus persicae, nebo podjednotku USP polypeptidů receptoru juvenilního hormonu Myzus persicae. Tento plazmid byl uložen 21. června 2000 v Australské státní analytické laboratoři na Suakin ul. 1, Pymble, New South Wales 2073, Austrálie, za podmínek budapešťské smlouvy o Mezinárodním potvrzení ukládání mikroorganizmů pro účely patentového jednání a bylo mu přiděleno AGAL přístupové číslo NM 00/12 581.

Pro účely názvosloví, plazmid pBtUSP obsahuje cDNA kódující podjednotku proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) ekdysonového receptoru Bemesia tabaci, nebo podjednotku USP polypeptidů receptoru juvenilního hormonu Bemesia tabaci. Tento plazmid byl uložen 21. června 2000 v Australské státní analytické laboratoři na Suakin ul. 1, Pymble, New South Wales 2073, Austrálie, za podmínek budapešťské smlouvy o Mezinárodním potvrzení ukládání mikroorganizmů pro účely patentového jednání a bylo mu přiděleno AGAL přístupové číslo NM 00/12 580.

Uložené materiály, na které zde bylo odkazováno, budou udržovány za podmínek budapešťské smlouvy o Mezinárodním potvrzení ukládání mikroorganizmů pro účely patentového jednání. Tyto uložené materiály jsou poskytovány pouze za • · • · ··· ·· · ···· • · · · · ·· · · · · účelem poskytnutí příkladů a není přípustné, aby uložený materiál byl požadován podle 35USC §112. Pro získání, použití a prodej uložených materiálů nebo polypeptidů kódovaných jejich cDNA může být požadováno udělení oprávnění, a žádné takové oprávnění tímto není uděleno. Je třeba však mít na paměti, že uložené materiály se stanou veřejně dostupné po udělení patentu, týkajícího se právě popsaných objevů, pokud se bude tento patent týkat zde zmíněných uložených materiálů.

Je výhodné, když procento podobnosti s kteroukoli ze sekvencí SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 42, nebo s polypeptidem kódovaným cDNA, která je obsažena v plazmidech vybraných ze skupiny zahrnující AGAL přístupová čísla NM 99/04 565, NM 99/04 566, NM 99/04 567, NM 99/04 568, NM 00/12 580 a NM 00/12 581, je alespoň 60%, výhodnější je alespoň 80% a ještě výhodnější je alespoň 90% podobnost.

Při určování, zda dvě aminokyselinové sekvence spadají do těchto rozmezí procent nebo nikoli, osoby se zkušeností v oboru si budou vědomy, že je nezbytné provést vzájemná porovnání nebo provést mnohočetné seřazení sekvencí. Při takových porovnáních nebo seřazeních budou vznikat rozdíly na pozicích s rozdílnými zbytky, v závislosti na algoritmu použitém k provedení seřazení. Ve zdejším kontextu, odkaz na procento shody nebo podobnosti mezi dvěma nebo více aminokyselinovými sekvencemi, bude chápán tak, že označuje počet shodných, respektive podobných zbytků mezi uvedenými sekvencemi, který byl určen pomocí jakéhokoli standardního algoritmu, známého osobám se zkušeností v oboru. Například shody nebo podobnosti aminokyselinové sekvence mohou být počítány za použití programu GAP a/nebo porovnávány za použití programu PILEUP od Computer Genetics Group, lne., University Research Park, Madison, Wisconsin, Spojené státy americké (Devereaux a kol., 1984). Program GAP používá algoritmus od Needlemana a Wunsche (1970) pro maximalizování počtu totožných/podobných zbytků a pro minimalizování počtu a délky mezer v sekvenci při seřazení sekvencí. Alternativně nebo vedle tohoto programu, tam kde mají být porovnávány více než dvě aminokyselinové sekvence, je používán program ClustalW od Thompson a kol. (1994).

V alternativním provedení, izolovaná molekula nukleové kyseliny, která je předmětem tohoto vynálezu, kóduje nebo je komplementární k izolované molekule nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid receptorů steroidu nebo jeho fragment, nebo protein sdružený (USP) nebo jeho fragment, který přinejmenším obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je v podstatě shodná s aminokyselinovou sekvencí, vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 42, nebo která je v podstatě shodná s aminokyselinovou sekvencí polypeptidů, kódovaného cDNA, která je obsažena v plazmidech vybraných ze skupiny zahrnující AGAL přístupová čísla NM 99/04 565, NM 99/04 566, NM 99/04 567, NM 99/04 568, NM 00/12 580 a NM 00/12 581.

Zde používaný termín „v podstatě shodný“ nebo podobný termín by měl být chápán jako zahrnující jakoukoli sekvenci, která je alespoň z 95 % shodná, s výhodou alespoň z 99 % nebo 100 % shodná se stanovenou nukleotidovou nebo aminokyselinovou sekvencí, včetně jakéhokoli homologu, analogu nebo derivátu uvedené stanovené nukleotidové nebo aminokyselinové sekvence.

Osoby se zkušeností v oboru si budou vědomy, že varianty nukleotidových sekvencí, uvedených ve kterékoli ze sekvencí SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 nebo SEQ ID NO: 41 nebo varianty cDNA obsažené v kterémkoli z uložených plazmidu, přičemž tyto varianty kódují EcR polypeptidy hmyzích receptorů steroidu nebo jeho fragmenty, nebo proteiny sdružené s EcR (USP polypeptidy) nebo jejich fragmenty, nebo USP polypeptidy receptorů hmyzího juvenilního hormonu, mohou být izolovány pomocí hybridizace za málo striktních podmínek hybridizace, jak je zde uvedeno v příkladech.

Takové varianty zahrnují jakékoli genomové sekvence, sekvence cDNA, mRNA nebo jiné izolované molekuly nukleových kyselin, které jsou odvozeny od molekul nukleové kyseliny, které jsou zde uvedeny v seznamu sekvencí. Tím nejsou vyloučeny další varianty.

Ve zvláště výhodném provedení vynálezu, varianty nukleotidových sekvencí kódují fragment EcR polypeptidů hmyzího receptorů steroidu nebo fragment proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) hmyzího receptorů steroidu nebo fragment USP polypeptidů receptorů hmyzího juvenilního hormonu.

Výhodné fragmenty předmětných polypeptidů obsahují jednu nebo více oblastí nebo domén, které se účastní interakce nebo spojení mezi monomemími podjednotkami polypeptidů multimerního receptorů a/nebo které se účastní interakce nebo spojení mezi (i) příbuzným steroidem nebo ligandem receptorů nebo c/s-působící

4 4 4 4 4

4 4 · • 44 ·

444· 4

DNA sekvencí; a (ii) uvedenými podjednotkami monomerního polypeptidu nebo receptororu jako takového. Ve zvláště výhodném provedení obsahují fragmenty DNA vazebnou doménu, doménu spojovníku (doména D) nebo její část, nebo doménu, která váže ligand (např. doménu, která váže hormon) polypeptidu receptorů steroidu nebo polypeptidu receptorů juvenilního hormonu nebo holoenzymu receptorů. Jak je zde uvedeno na příkladu, tam kde je vyžadována biologická aktivita ekdysonového receptorů L. čupřina, je výhodné zahrnout z podjednotky EcR polypeptidu alespoň oblast, která váže ligand a obsahuje doménu, která váže ligand a alespoň část domény podjednotky EcR polypeptidu, která váže spojovník, volitelně ve spojení s oblastí subjednotky proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) uvedeného receptorů, která váže ligand a obsahuje alespoň doménu, která váže ligand a alespoň část domény, která váže spojovník. Tím nejsou vyloučeny další fragmenty.

Homology, analogy a deriváty nukleotidových sekvencí, které jsou zde uvedeny jako příklady, mohou být izolovány pomocí jejich hybridizace za alespoň málo striktních podmínek hybridizace, s výhodou za alespoň středně striktních podmínek hybridizace k nukleotidové sekvenci, vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 nebo SEQ ID NO: 41 nebo k řetězci komplementárnímu ke kterékoli z uvedených sekvencí nebo k cDNA, obsažené v kterémkoli jednom nebo více uložených plazmidů. Z tohoto hlediska je výhodnější, když je izolovaná molekula nukleové kyseliny schopna hybridizovat za alespoň vysoce striktních podmínek hybridizace k nukleotidové sekvenci, vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 nebo SEQ ID NO: 41 nebo k řetězci komplementárnímu ke kterékoli z uvedených sekvencí nebo k cDNA, obsažené v kterémkoli jednom nebo více uložených plazmidů.

Za účelem definování úrovně striktnosti podmínek hybridizace, podmínky s nízkou striktnosti jsou zde definovány jako provedení hybridizace nebo promývání v pufru 6x SSC, 0,1% (hmotnost/objem) SDS při teplotě 28 °C, popřípadě tak, jak je zde uvedeno na příkladu. Obecně striktnost podmínek hybridizace je zvýšena snížením koncentrace pufru SSC a/nebo zvýšením koncentrace SDS a/nebo zvýšením teploty hybridizace nebo promývání. Středně striktní podmínky hybridizace znamenají provedení hybridizace a/nebo promývání v pufru 0,2x SSC až 2x SSC, 0,1% • · · 1 (hmotnost/objem) SDS při teplotě 42 až 65 °C, zatímco velmi striktní podmínky hybridizace znamenají provedení hybridizace a/nebo promývání vpufru 0,1x SSC až 0,2x SSC, 0,1% (hmotnost/objem) SDS při teplotě alespoň 55 °C. Podmínky pro hybridizaci a promývání jsou dobře známy osobám s běžnou zkušeností v oboru. Pouze za účelem dalšího objasnění uvádíme, že odkazy na parametry ovlivňující hybridizaci mezi molekulami nukleové kyseliny je možno nalézt v práci Ausubel a kol. (1992), která je zde zahrnuta jako odkaz.

V ještě výhodnějším provedení vynálezu, hybridizující molekula nukleové kyseliny dále zahrnuje sekvenci nukleotidů, která je alespoň ze 40 % shodná s alespoň 10 po sobě následujícími nukleotidy, s výhodou alespoň s 50 po sobě následujícími nukleotidy, a ještě výhodněji alespoň se 100 po sobě následujícími nukleotidy, odvozenými z nukleotidové sekvence vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 41 nebo nukleotidovou sekvenci komplementární ke kterékoli z uvedených sekvencí, nebo nukleotidovou sekvenci cDNA, obsažené v kterémkoli jednom nebo více uložených plazmiddech, o kterých zde bylo pojednáno.

Při určování, zda dvě nukleotidové sekvence spadají do těchto rozmezí procent nebo nikoli, osoby se zkušeností v oboru si budou vědomy, že je nezbytné provést vzájemná porovnání nebo provést mnohočetné seřazení sekvencí. Při takových porovnáních nebo seřazeních budou vznikat rozdíly na pozicích s rozdílnými zbytky, v závislosti na algoritmu použitém k provedení seřazení. Ve zdejším kontextu, odkaz na procento shody nebo podobnosti mezi dvěma nebo více aminokyselinovými sekvencemi, bude chápán že označuje počet shodných, respektive podobných zbytků mezi uvedenými sekvencemi, který byl určen pomocí jakéhokoli standardního algoritmu, známého osobám se zkušeností v oboru. Například nukleotidové sekvence mohou být seřazeny a jejich shoda počítána za použití programu BESTFIT nebo jiného vhodného programu od Computer Genetics Group, lne., University Research Park, Madison, Wisconsin, Spojené státy americké (Devereaux a kol., 1984).

V alternativním provedení jsou nukleotidové sekvence kódující podjednotky EcR polypeptidu hmyzího receptoru steroidu nebo jeho fragmentů, nebo proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptidy) hmyzího receptoru steroidu nebo jeho fragmentů, nebo USP polypeptidů receptoru hmyzího juvenilního hormonu, amplifikovány pomocí polymerázové řetězové reakce. V tomto provedení jedna, dvě nebo více nukleových • · · · kyselin „molekul primeru“, odvozených ze zde uvedené nukleotidové sekvence, jako je například sekvence odvozená ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 41 nebo sekvenci komplementární ke kterékoli z uvedených sekvencí, nebo sekvenci cDNA, obsaženou v kterémkoli jednom nebo více uložených plazmidů, o kterých zde bylo pojednáno, je teplotně hybridizována nebo hybridizována s nukleovou kyselinou „molekulou matrice“, která obsahuje alespoň nukleotidovou sekvenci kódující podobnou genetickou sekvenci nebo její funkční část, a kopie molekul nukleové kyseliny molekuly matrice jsou pak amplifikovány pomocí termostabilního enzymu DNA polymerázy, jako jsou například mimo jiné Taql polymeráza nebo Pfu polymeráza.

Podrobněji řečeno, jedna z molekul primeru obsahuje po sobě následující nukleotidy, odvozené ze sekvence vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 41 nebo sekvenci cDNA, obsaženou v kterémkoli jednom nebo více uložených plazmidů, o kterých zde bylo pojednáno; a druhý z uvedených primerú obsahuje po sobě následující nukleotidy, které jsou komplementární k sekvenci vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 41 nebo alternativně z cDNA, obsažené v kterémkoli jednom nebo více uložených plazmidů, o kterých zde bylo pojednáno; stou podmínkou, že první a druhý primer nejsou vzájemně komplementární.

Ve výhodném provedení je každá molekula nukleové kyseliny primeru dlouhá alespoň 10 nukleotidů, výhodněji alespoň 20 nukleotidů dlouhá, ještě výhodněji alespoň 30 nukleotidů dlouhá, ještě výhodněji alespoň 40 nukleotidů dlouhá a ještě výhodněji alespoň 50 nukleotidů dlouhá.

Dále molekula nukleové kyseliny primeru obsahuje kombinaci jakýchkoli nukleotidů adeninu, cytidinu, guaninu, tymidinu nebo inozinu, nebo jejich funkčních analogů nebo derivátů, které jsou schopny být alespoň zabudovány do molekuly polynukleotidu bez toho, že by měly inhibiční účinek na hybridizaci uvedeného primeru k molekule matrice v prostředí, ve kterém je používána.

• · • » · · · · • · • · • ·

Dále jedna nebo obě molekuly nukleové kyseliny primerů mohou být obsaženy ve vodné směsi jiných molekul nukleových kyselin primerů, například ve směsi primerů s degenerovanými sekvencemi, které se od sebe vzájemně liší jednou nebo více substitucemi nukleotidů nebo delecemi nukleotidů. Alternativně může být jedna nebo obě molekuly nukleové kyseliny primerů ve značně čisté formě.

Ve zvláště výhodném provedení, které je zde uvedeno jako příklad, jsou dvě nukleotidové sekvence primerů použity pro amplifikování příbuzných sekvencí, přičemž uvedené primery obsahují nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 23 až SEQ ID NO: 30 včetně. Ještě výhodnější je, když jsou primery použity v kombinaci vybrané ze skupiny zahrnující (i) SEQ ID NO: 23 a SEQ ID NO: 24; (ii) SEQ ID NO: 25 a SEQ ID NO: 25; (iii) SEQ ID NO: 27 a SEQ ID NO: 28; a (iv) SEQ ID NO: 31 a SEQ ID NO: 32.

Molekula nukleové kyseliny matrice může být ve formě rekombinanty, jako virová částice, hmyzí buňka, částice bakteriofága, buňka kvasinky, živočišná buňka nebo rostlinná buňka. Je výhodné, když molekula nukleové kyseliny matrice pochází z hmyzích druhů.

Osoby se zkušeností v oboru si budou vědomy, že existuje velké množství známých variant základního postupu polymerázové řetězové reakce. Takové varianty jsou probírány například v práci McPherson a kol. (1991). Předložený vynález zahrnuje vedle těch postupů, které zde jsou uvedeny jako příklady, i použití všech takových dalších variant postupu při izolaci variant genů, kódujících hmyzí receptor steroidu nebo jeho fragmenty, a variant genů, kódujících sdružený protein nebo jeho fragmenty.

Izolovaná molekula nukleové kyseliny, která je předmětem tohoto vynálezu, včetně těch sekvencí, které zde byly uvedeny jako příklady a jakýchkoli jejich variant, může být klonována do molekuly plazmidu nebo bakteriofága, například pro usnadnění přípravy molekul primerů nebo hybridizačních sond, nebo pro přípravu produktů rekombinantních genů. Metody přípravy takových molekul rekombinantních plazmidů, kosmidů, bakteriofágů nebo jiných rekombinantních molekul jsou dobře známy osobám se zkušeností v oboru a mohou být provedeny bez nepřiměřeně velkého experimentování. Předložený vynález se proto vztahuje na jakoukoli molekulu rekombinantního plazmidu, bakteriofága, kosmidu nebo jinou rekombinantní molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, • · · · • · · · · ····· ·· · ·· 25 ·· ·· ·· ·· ·«* ·ί

SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 41 nebo sekvenci komplementární ke kterékoli z uvedených sekvencí, nebo homolog, analog nebo derivát kterékoli z uvedených sekvencí nebo k nim komplementárních sekvencí, nebo cDNA, obsaženou v kterémkoli jednom nebo více uložených plazmidech, o kterých zde bylo pojednáno.

Molekula nukleové kyseliny, která je předmětem tohoto vynálezu, je také užitečná pro vývoj genetických konstruktů, které obsahují a s výhodou i exprimují podjednotku EcR polypeptidu hmyzího receptorů steroidů a/nebo protein sdružený s EcR (USP polypeptid) receptorů steroidů nebo USP polypeptid receptorů juvenilního hormonu, čímž umožňuje produkci rekombinantních polypeptidů v izolovaných buňkách nebo v transformovaných tkáních.

V dalším provedení tedy předložený vynález poskytuje genetický konstrukt, obsahující předmětnou izolovanou molekulu nukleové kyseliny kódující polypeptid hmyzího receptorů steroidů nebo polypeptid receptor juvenilního hormonu, který je operativně vázán k sekvenci promotoru. Je výhodné, když předmětná molekula nukleové kyseliny je v exprimovatelném formátu, takže je z něho možno produkovat rekombinantní polypeptid.

Zde uvedený odkaz na „promotor“ by měl být chápán ve svém nejširším kontextu a zahrnuje transkripčně regulační sekvence klasického genu v genomu, včetně TATA boxu, který je vyžadován pro přesné započetí transkripce v eukaryotické buňce, buď s nebo bez sekvence CCAAT boxu nebo podobně, a Pribnowova boxu, který je vyžadován pro přesnou expresi v prokaryotických buňkách.

Promotory mohou být buněčně, tkáňově, orgánově nebo systémově specifické, nebo mohou být nespecifické. Za použití specifických promotorů může být na požadovaném místě buňky dosažena exprese biologicky aktivního činidla nebo jiného polypeptidu kódovaného strukturálním genem, k němuž je operativně připojen promotor. Například v transgenním živočichovi jako je ovce, může být počítáno s tím, že buňky transgenního živočicha mohou obsahovat gen kódující receptor steroidů, s výhodou receptor steroidů vázaný ke specifickému epidermálnímu promotoru a odlišný gen, kódující například epidermální růstový faktor (EFG), který je funkčně vázán k jednomu nebo více elementům odpovědi na hmyzí hormon, a může nebo nemusí být také vázán k elementům specifického epidermálního promotoru. Při podání vhodného hmyzího steroidního hormonu transgennímu živočichovi, aktivovaný komplex mezi hmyzím • · · · • · · · • · · · · · receptorem steroidu a hmyzím steroidem se může vázat k jednomu nebo více elementům odpovědi na hmyzí hormon, čímž bude indukovat produkci EFG pouze v epidermálních buňkách, což může vést ke ztrátě srsti. Je nutno mít na paměti, že tento aspekt předloženého vynálezu je nezávislý na stupni termostability hmyzího receptoru steroidu. Ty samé principy jsou aplikovány na expresi jakékoli biologicky aktivní molekuly nebo molekuly zpravodaje ve specifickém typu buněk, která je regulována přechodně aktivovaným komplexem mezi komplexem receptoru steroidu a vhodným hmyzím steroidem.

V tomto kontextu je také termín „promotor“ používán pro popis syntetické nebo fúzní molekuly nebo derivátu, který propůjčuje, aktivuje nebo posiluje expresi v buňkách, jako reakci na vnější podnět. Promotor tedy může obsahovat další regulační elementy (tj. aktivační sekvence umístěné proti směru přepisu, zesilovače trankripce a zeslabovače trankripce), které mění genovou expresi jako reakci na vývojové a/nebo vnější podněty, nebo tkáňově specifickým způsobem. Výhodné promotory mohou obsahovat kopie jednoho nebo více specifických regulačních elementů, zvláště elementů odpovědi na steroidy (SRE) nebo elementů odpovědi na hormony (HRE), aby tím dále zesílily expresi a/nebo pozměnily prostorové rozložení exprese a/nebo časové rozložení exprese.

Zde uvedený termín „elementy odpovědi ke steroidu“ má být považován za termín, který označuje jednu nebo více c/s-působících nukleotidových sekvencí, přítomných v přirozeně se vyskytujících nebo syntetických nebo rekombinantních genech, jejichž exprese je regulována hmyzím steroidem, jako je ekdysteroid, například ekdyson nebo ponasteron A, přičemž uvedená regulace výsledků exprese vyplývá z přímé nebo nepřímé interakce mezi receptorem steroidu a uvedenou c/s-púsobící nukleotidovou sekvencí elementu odpovědi. Příklady hmyzích elementů odpovědi ke steroidnímu hormonu zahrnují element odpovědi hsp27 k ekdysonu (EcRE) a jakoukoli jinou nukleotidovou sekvenci, která je schopna vázat se na receptory ekdysteroidu nebo jejich polypeptidové subjednotky nebo jejich fragmenty nebo analogy (jako ty, které jsou spojeny s E75, E74 nebo jinými časnými geny Drosophila), jak je popsáno například v Riddihough a Pelham (1987).

Například SRE nebo množství takových elementů může být operativně vázáno k promotoru, jako je promotor polyhedrinu, p10 promotor, MMTV promotor nebo SV40 promotor, aby byla zajištěna transkripce strukturního genu k němuž je promotor operativně vázán, jako odpověď na přítomnost steroidu vázaného na hmyzí receptor • · · · (který může působit jako transkripční faktor). Jeden nebo více hmyzích SRE může být umístěno uvnitř promotoru a mohou zaměnit sekvence uvnitř vybraného promotoru, který propůjčuje schopnost odpovídat na hormony nebo jiná činidla, která regulují aktivitu promotoru. Tam kde jsou elementy odpovědi rozdílné, mohou vést k přednostní vazbě různých hmyzích steroidů nebo jejich analogů tak, že promotor může být regulován rozdílně.

Zvláště výhodné SRE podle tohoto provedení zahrnují mimo jiné element odpovědi hsp27 kekdysonu, popsaný v Riddihough a Pelham (1987), nebo vněm obsažené palindromové jádro dlouhé 13 párů bází.

Promotor je obvykle, ale nikoli nezbytně, umístěn ve směru 5', tj. proti směru přepisu od strukturního genu, jehož expresi reguluje. Dále regulační elementy obsahující promotor jsou obvykle umístěny do 2000 bází od místa startu transkripce genu.

Umístění genu nebo izolované molekuly nukleové kyseliny pod operativní kontrolu promotorové sekvence znamená umístění uvedeného genu nebo izolované molekuly nukleové kyseliny tak, že jejich exprese je kontrolována promotorovou sekvencí. Promotory jsou obecně umístěny ve směru 5' (proti směru přepisu) od genů, které kontrolují. Při konstrukci heterologních kombinací promotor/strukturní gen je obecně výhodné umístit promotor v takové vzdálenosti od místa startu transkripce genu, která je přibližně stejná jako vzdálenost mezi tímto promotorem a genem, který kontroluje ve svém přirozeném uspořádání, tj. v genu, z něhož promotor pochází. Jak je z oboru známo, určité variace této vzdálenosti mohou být přijatelné bez ztráty funkce promotoru. Podobně, výhodné umístění sekvence regulačního elementu s ohledem na heterologní gen, který má být umístěn pod jeho kontrolu, je určováno umístěním elementu v jeho přirozeném uspořádání, tj. v genech, z nichž pochází. V oboru je opět známo, že může dojít k určitým variacím této vzdálenosti.

Osoby se zkušeností v oboru si budou vědomy, že pokud je vyžadována exprese, pak výběr promotoru bude záviset na povaze buňky, která bude transformována. Dále je v oboru dobře známo, že sekvence promotoru, použitá v expresním vektoru se také bude měnit v závislosti na úrovni požadované exprese a na tom, zda je plánována exprese konstitutivní nebo regulovatelná.

Pro expresi v eukaryotických buňkách obsahuje genetický konstrukt obecně, vedle molekuly nukleové kyseliny, která je předmětem tohoto vynálezu, promotor a volitelně ostatní regulační sekvence, které usnadní expresi uvedené molekuly nukleové • · · · • · « • 9 · «· · kyseliny. Promotor může pocházet zgenomového klonu, který normálně kóduje exprimovaný protein, nebo to alternativně může být heterologní promotor, pocházející z jiného genetického zdroje. Promotorové sekvence vhodné pro expresi genů v eukaryotických buňkách jsou v oboru dobře známé.

Promotory vhodné pro použití v eukaryotických expresních vektorech zahrnují ty, které jsou schopny regulovat expresi v savčích buňkách, hmyzích buňkách jako jsou například buňky Sf9 nebo Sf21 (Spodoptera frugiperda), kvasničných buňkách a rostlinných buňkách. Promotory výhodné pro expresi v eukaryotických buňkách zahrnují mimo jiné p10 promotor, MMTV promotor, polyhedrinový promotor, časný SV40 promotor a cytomegalovirový (CMV-IE) promotor, promotory pocházející z buněk produkujících imunoglobulin (viz patent US 4 663 281), promotory polyomaviru a LTR z různých retrovirů (jako jsou virus myší leukémie, virus myšího sarkomu nebo virus Rousova sarkomu a HIV) (viz Zesilovače transkripce a exprese eukaryotických genů, Cold Spring Harbor Press, New York, 1983, který je zde zahrnut jako odkaz). Příklady jiných kontrolních sekvencí pro expresi jsou zesilovače transkripce nebo promotory pocházející z virů jako je SV40, adenovirus, hovězí papillomavirus a podobně.

Tam kde je zamýšleno, že expresní vektor bude produkovat rekombinantní protein, promotor je vybírán tak, aby byl schopen regulovat expresi v buňce, která je schopna provádět jakékoli posttranslační úpravy polypeptidů, které mohou být vyžadovány, aby byl předmětný rekombinantní polypeptid funkční, jako je například Nglykosylace. Buňky vhodné pro tyto účely mohou být snadno určeny osobami se zkušeností v oboru. Jako příklad je možno uvést buňky z vaječníku čínského křečka (CHO), které mohou být použity k provádění glykosylace na N-konci a odštěpování signální sekvence v nich produkovaného rekombinantního polypeptidů. Alternativně je možno použít expresní vektor připravený z bakuloviru, jako je například vektor pFastBac dodávaný GibcoBRL, pro expresi rekombinantních polypeptidů v buňkách Sf9 (Spodoptera frugiperda) podle standardních protokolů.

Byly popsány četné expresní vektory vhodné pro tento účel a jsou snadno dostupné. Expresní vektor může být založen na vektoru pcDNA3, který je dodáván Medos Company Pty Ltd, Victoria, Austrálie, který obsahuje CMV promotorové a BGH terminační sekvence pro regulaci exprese rekombinantního polypeptidů, který je předmětem tohoto vynálezu, v eukaryotické buňce, když jsou sekvence izolované nukleové kyseliny, kódující tento polypeptid vloženy v pozitivní orientaci vzhledem k CMV promotoru do mnohočetného klonovacího místa uvedeného vektoru.

Alternativně je pro takové účely zvláště vhodný expresní vektor SG5 od Greene a kol. (1988), dodávaný Stratagene, nebo série vektorů pQE, dodávaná Qiagen, jak je zde uvedeno na příkladu.

Příklady eukaryotických buněk, které jsou zde považované za vhodné pro expresi, zahrnují savčí buňky, kvasinky, hmyzí buňky, rostlinné buňky nebo buněčné linie jako jsou COS, VĚRO, HeLa, myší C127, buňky zvaječníku čínského křečka (CHO), WI-38, buňky z ledvin novorozených křečků (BHK), MDCK, sf21 (hmyzí) nebo Sf9 (hmyzí). Takové buněčné linie jsou snadno dostupné pro osoby se zkušeností v oboru.

Předpokladem pro expresi v prokaryotických buňkách jako je Escherichia coli je použití silného promotoru s účinným vazebným místem pro ribozom. Mezi typickými promotory vhodnými pro expresi v bakteriálních buňkách jako je E. coli, jsou zahrnuty mimo jiné promotor lacZ , k teplotě citlivé promotory Al a Ar, T7 promotor nebo promotor tac indukovatelný IPTG. V oboru je dobře známa řada jiných vektorových systémů pro exprimování molekuly nukleové kyseliny, která je předmětem tohoto vynálezu, v E. coli, a tyto systémy jsou popsány například v Ausubel a kol. (1992).

Byly popsány četné vektory, které mají vhodné promotorové sekvence pro expresi v bakteriích, jako jsou mezi jinými například pKC30 (A_L: Shimatake a Rosenberg, 1981), pKK173-3 (tac: Amann a Brosius, 1985), pET-3 (T7: Studier a Moffat, 1986) nebo série expresních vektorů pQE (Qiagen, CA).

Vhodné prokaryotické buňky zahrnují mezi jinými korynebakterie, salmonely, Escherichia coli, Bacillus sp. a Pseudomonas sp. Bakteriální kmeny, které jsou vhodné pro zde uvedené účely jsou dobře známé v příslušném oboru (Ausubel a kol., 1992).

Zde popsané genetické konstrukty mohou dále obsahovat genetické sekvence odpovídající bakteriálnímu počátku replikace a/nebo genu selektovatelného markéru, jako je například gen rezistence k antibiotiku, vhodné pro udržování a replikaci uvedeného genetického konstruktu v prokaryotické nebo eukaryotické buňce, tkáni nebo organizmu. Takové sekvence jsou v oboru dobře známé.

Geny selektovatelných markérů zahrnují geny, které pokud jsou exprimovány, jsou schopny propůjčit buňce rezistenci ke sloučenině, která by v nepřítomnosti exprese uvedeného genu selektovatelného markéru zamezila nebo zpomalila množení buněk, nebo by měla za následek smrt buňky. Výhodné geny selektovatelných markérů zde uvažovaných, zahrnují mimo jiné geny rezistence k antibiotiku, jako jsou ty, které propůjčují rezistenci kampicilinu, Claforanu, gentamycinu, G-418, hygromycinu, ♦

•4 «4 « 1 · ♦4 · 4 • · · • « · · 4 • » % · » · · · ·· 4· rifampicinu, kanamycinu, neomycinu, spectinomycinu, tetracyklinu nebo jejich derivátům nebo příbuzným sloučeninám, nebo jakýmkoli jiným sloučeninám, které mohou být pro buňku toxické.

Počátek replikace nebo gen selektovatelného markéru bude prostorově oddělen od těch genetických sekvencí, které kódují polypeptid rekombinantního receptoru nebo fúzní polypeptid, který obsahuje polypeptid rekombinantního receptoru.

Je výhodné když genetické konstrukty, které jsou předmětem tohoto vynálezu, včetně jakéhokoli expresního vektoru, jsou schopny vnesení do in vitro buněčné kultury a exprese v ní, nebo vnesení do kultivované buňky, buněčné linie nebo transgenního živočicha, ať již dojde nebo nedojde k integraci do jejich genomu.

Ve zvláště výhodném provedení je expresní vektor vybrán ze skupiny zahrnující: pLcEcR (AGAL přístupové číslo NM 99/04 566); pLcUSP (AGAL přístupové číslo NM 99/04 565); pMpEcR (AGAL přístupové číslo NM 99/04 5676); pMpUSP (AGAL přístupové číslo NM 99/04 568); pMpUSP2 (AGAL přístupové číslo NM 00/12 581); a pBtUSP (AGAL přístupové číslo NM 00/12 580).

V dalším provedení poskytuje předložený vynález buňku, obsahující předmětnou izolovanou molekulu nukleové kyseliny, které kóduje polypeptid receptoru steroidů nebo polypeptid receptoru juvenilního hormonu.

Zde používané slovo „buňka“ je třeba chápat tak, že označuje jednu buňku nebo buněčný lyzát, nebo tkáň, orgán nebo celý organizmus obsahující stejné buňky, včetně tkáně, orgánu nebo celého organizmu, obsahujících klonované skupiny buněk nebo heterologní směs buněčných typů, které mohou být prokaryotické nebo eukaryotické buňky, jak je popsáno výše.

Ve výhodném provedení buňka, která je předmětem tohoto vynálezu, exprimuje izolovaný nebo rekombinantní polypeptid kódovaný molekulou nukleové kyseliny.

Ve výhodném provedení buňka exprimuje polypeptid receptoru steroidů nebo jeho fragment, přičemž tento receptor je schopen se vázat k hmyzímu steroidů nebo jeho analogu nebo ke kandidátu na insekticidně aktivní činidlo a vytvořit aktivovaný komplex, a obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, kódující biologicky aktivní molekulu nebo molekulu zpravodaje, operativně vázanou k jednomu nebo více elementům reakce na hmyzí steroid, které po navázání uvedeného aktivovaného komplexu podnítí transkripci sekvence nukleové kyseliny, přičemž uvedená buňka po vystavení hmyzímu steroidů nebo jeho analogu reguluje expresi uvedené biologicky aktivní molekuly nebo umožní detekování uvedené molekuly zpravodaje.

** 9φ • · ’

9 9 99 • ♦ ί « • 4 ·*« « ·· * « ·

9999

Pro přípravu buněk, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou hostitelské buňky transfekovány, současně transfekovány nebo transformovány nukleotidovými sekvencemi, které obsahují DNA segmenty o které se jedná (například gen hmyzího receptoru steroidu, rekombinantní elementy reakce na steroid, nebo obojí), pomocí dobře známých metod, které se liší v závislosti na typu hostitelské buňky. Například transfekce pomocí chloridu vápenatého je běžně používaná pro prokaryotické buňky, zatímco lipofekce nebo působení fosforečnanu vápenatého jsou často používány pro jiné buněčné hostitele. Obecně viz Sambrook a kol., (1989); Ausubel a kol., (1992) a Potrykus (1990). Jiné transformační techniky zahrnují elektroporaci, DEAE dextran, bombardování mikrostřelami, lipofekce, mikroinjekce a jiné.

Zde používaný termín „transformovaná buňka“ je míněn tak, že zahrnuje také potomstvo transformované buňky.

V dalším provedení poskytuje předložený vynález živočicha (jako je savec nebo hmyz), mikroorganizmus, rostlinu nebo vodní organizmus, obsahující jednu nebo více buněk, které byly zmíněny výše. Odkaz na rostliny, mikroorganizmy a vodní organizmy zahrnuje jakýkoli takový organizmus.

V tomto provedení předloženého vynálezu je třeba si být vědom, že podání hmyzího steroidu nebo jeho analogu organizmu bude indukovat expresi požadované biologicky aktivní molekuly, jako je polypeptid, s průvodními výhodami. Například indukovaný protein může mít terapeutický účinek zmírňující stav choroby nebo zabraňující citlivosti k nemoci, nebo může nějakým způsobem modifikovat fenotyp organizmu a vyvolat tak požadovaný účinek. U lidí mohou například buněčné transplantáty (jako jsou například jatemí buňky) pod vlivem působení hmyzích steroidů produkovat požadované hormony jako je inzulín, růstový hormon, růstové faktory a podobně.

V další provedení poskytuje předložený vynález rekombinantní nebo izolovaný polypeptid, který obsahuje polypeptid receptoru steroidu nebo polypeptid receptoru juvenilního hormonu pocházející z hmyzu, nebo jejich biologicky aktivní derivát nebo analog, přičemž uvedený polypeptid:

(i) je vybrán ze skupiny zahrnující polypeptid EcR receptoru steroidu, protein sdružený (USP polypeptid) s receptorem steroidu a USP polypeptid receptoru juvenilního hormonu; a (ii) obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň ze 40 % totožná s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, • · • · • · « · • ·

·..··..· ·..··..·

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 42;

V alternativním provedení poskytuje předložený vynález rekombinantní nebo izolovaný polypeptid obsahující polypeptid receptoru steroidu nebo polypeptid receptoru juvenilního hormonu, pocházející z hmyzu, nebo jejich biologicky aktivní derivát nebo analog, přičemž uvedený polypeptid:

(i) je vybrán ze skupiny zahrnující polypeptid EcR receptoru steroidu, protein sdružený (USP polypeptid) s receptorem steroidu a USP polypeptid receptoru juvenilního hormonu; a (ii) obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň ze 40 % totožná s aminokyselinovou sekvencíkódovanou cDNA, která je přítomna v plazmidu vybraném ze skupiny zahrnující AGAL přístupová čísla NM 99/04 565, NM 99/04 566, NM 99/04 567, NM 99/04 568, NM 00/12 580 a NM 00/12 581.

Odkaz zde na „v podstatě zbaven složek hmyzích buněk, které jej přirozeně doprovázejí“ označuje alespoň 80% čistotu, výhodněji více než 90% čistotu, a ještě výhodněji více než 95% čistotu. Běžně je čistota měřena na polyakrylamidovém gelu, kdy je homogenita určována barvením proteinových zón. V jiných případech může být vyžadována vysoká rozlišovací schopnost za pomoci HPLC nebo podobných postupů. Pro většinu účelů mohou být pro určování čistoty použity jednoduché chromatografické sloupce nebo polyakrylamidový gel. Protein který je chemicky syntetizován nebo syntetizován v buněčném systému, jiném než je hmyzí buňka, ze které přirozeně pochází, by měl být zbaven složek hmyzích buněk, které jej přirozeně doprovázejí.

Předložený vynález samozřejmě umožňuje izolaci podjednotek EcR polypeptidů a podjednotek proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) receptorú ekdysteroidu a USP polypeptidů receptorú juvenilního hormonu vedle prvoků a červů, také z různých organizmů třídy Hmyz, jak byly popsány výše.

Pro hmyzí receptory steroidu jsou charakteristické funkční domény, které se vážou k ligandu, a DNA vazebné domény, přičemž obojí interagují a ovlivňují změny v regulačním stavu genu, který je operativně vázán k DNA vazebnému místu • « • · • * · · holoreceptoru nebo polypeptidu nebo fragmentu jejich polypeptidu. Receptory hmyzích steroidů se tedy zdají být transkripční faktory, citlivé kligandúm. Dále receptory hmyzích steroidů obecně obsahují DNA vazebnou doménu (doména C) a doménu, která se váže k ligandu (doména E), které jsou oddělené a po stranách obklopené dalšími doménami, jak bylo zjištěno Krust a kol. (1986). Doména C převážně obsahuje „zinc-finger“ DNA vazebnou doménu, která je obvykle hydrofilní a má vysoký obsah cysteinu, lyzinu a argininu. Doména E převážně obsahuje hydrofobní aminokyselinové zbytky a dále jsou pro ní charakteristické oblasti E1, E2 a E3. Doména, která se váže k ligandu, se typicky u členů nadrodiny hmyzích receptorů steroidu nachází ve směru ke karboxylovému konci vzhledem k DNA vazebné doméně (Evans, 1988). Celá doména, která se váže k ligandu, je typicky dlouhá mezi 200 a 250 aminokyselin, ale může být potenciálně kratší. Tato doména má podoblasti s vysokou homologií, označené jako oblasti E1, E2 a E3 - které mohou být společně označeny jako „E oblast“. Aminokyselinové zbytky ve směru před C doménou obsahují oblast původně definovanou jako samostatné domény A a B. Oblast D odděluje konzervativnější domény C a E. Oblast D typicky obsahuje hydrofobní oblast, jejíž předpověděná sekundární struktura je bohatá na otáčky a závity. Oblast F se nachází od oblasti E směrem ke karboxylovému konci (viz výše Krust a kol.).

Polypeptidy receptoru, které jsou předmětem tohoto vynálezu, obsahují alespoň doménu, která se váže k ligandu a která je charakterizována svou sekvenční homologií s oblastmi E1, E2 a E3. Domény které se vážou k ligandu a které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou typicky charakteristické tím, že mají k těmto třem oblastem výraznou homologií v sekvenci a ve struktuře. Fragmenty hmyzích receptorů steroidu a sdružených proteinů, které jsou schopné vázat hmyzí steroidy, a kandidáti na insekticidně aktivní sloučeniny, obsahují oblast E nebo dostatečnou část oblasti E, aby byla vazba umožněna.

Je výhodné, když zde popsaná rekombinantní nebo izolovaná podjednotka EcR polypeptidu hmyzího receptoru steroidu nebo podjednotka proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) receptoru steroidu nebo USP polypeptid receptoru juvenilního hormonu, je termostabilní.

Výrazem „termostabilní“ je míněno, že stanovený celek nevykazuje sníženou aktivitu při bakteriálních, rostlinných nebo živočišných fyziologických teplotách nad 28 °C nebo nad 30 °C. Termostabilita receptorů hmyzích steroidních hormonů také označuje schopnost takových receptorů vázat se k doménám vázajícím ligand nebo k • · · · oblastem vázajícím ligand nebo transaktivovat geny, vázané na elementy odpovědi na hmyzí steroidní hormony při bakteriálních, rostlinných nebo živočišných fyziologických teplotách nad 28 °C nebo nad 30 °C.

Předložený vynález se zřetelně týká také variant uvedených polypeptidů, popsaných výše. Polypeptidy mohou být v podstatě zbaveny složek hmyzích buněk, které jej přirozeně doprovázejí, nebo mohou být ve spojení se sdruženým proteinem, který se spojuje s receptorem hmyzího steroidu tak, že mu udělí zvýšenou afinitu pro elementy odpovědi na hmyzí steroid, zvýšenou afinitu pro hmyzí steroidy nebo jejich analogy. Například aminokyselinové sekvence zde uvedené pro ilustraci, mohou být pozměněny deleci, substitucí nebo inzercí jedné nebo více aminokyselin.

V jednom provedení aminokyseliny polypeptidů, které jsou zde uvedené pro ilustraci, mohou být zaměněny jinými aminokyselinami, které mají podobné vlastnosti, například hydrofobnost, hydrofilnost, hydrofobní moment, náboj nebo antigenicitu a podobně.

Substituce zahrnuje změny aminokyselin, při nichž je aminokyselina základního polypeptidů zaměněna odlišným přirozeným nebo nepřirozeným aminokyselinovým zbytkem. Takové substituce mohou být klasifikovány jako „konzervativní“, a vtom případě je aminokyselinový zbytek, obsažený v základním polypeptidů, zaměněn za jinou přirozenou aminokyselinu s podobným charakterem, například Gly «-> Ala, val <-* lle <->Leu, Asp <-* Glu, Lys θ Arg, Asn <-> Gin nebo Phe *-> Trp <->Tyr.

Substituce zahrnuté v předloženém vynálezu mohou také být „nekonzervativní“, což je v případě, když je aminokyselinový zbytek obsažený v základním polypeptidů zaměněn za aminokyselinu, která má odlišné vlastnosti, jako např. přirozenou aminokyselinu z odlišné skupiny (např. záměna nabité nebo hydrofobní aminokyseliny za alanin), nebo v případě, když je přirozená aminokyselina zaměněna za nepřirozenou aminokyselinu.

Osoby se zkušeností v oboru si uvědomí, že je k dispozici několik způsobů, jak připravitt varianty uvedené podjednotky EcR polypeptidů hmyzího receptorů steroidu nebo podjednotky proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) receptorů steroidu nebo USP polypeptidů receptorů juvenilního hormonu, pokud máme k dispozici nukleotidovou sekvenci molekuly nukleové kyseliny, která kóduje uvedený polypeptid, mimo jiné například místně cílenou mutagenezi DNA a polymerázovou řetězovou reakci používající mutované oligonukleotidové primery.

« · • · · ·

Takové varianty polypeptidú, které jsou schopny vázat hmyzí steroidy, samozřejmě tvoří část předloženého vynálezu. Testy pro zjištění této vazby mohou být provedeny podle postupů, které jsou v oboru dobře známy.

Jedna taková varianta polypeptidu, zahrnutá v předloženém vynálezu, obsahuje fúzní polypeptid se spojitým čtecím rámcem, sestavený z různých oblastí polypeptidú různých hmyzích receptorů. Jak je zde uvedeno v příkladu, autoři předloženého vynálezu zjistili, že vytvářením syntetických genů, v nichž různé domény nukleotidové sekvence kódující základní receptor hmyzího steroidu, pocházející z prvního zdroje, jsou zaměněny nebo nahrazeny podobnými sekvencemi, pocházejícími z druhého zdroje (označováno jako „záměna domén“), je možné pozměňovat biologickou aktivitu jimi kódovaného receptorů hmyzího steroidu. Například biologická aktivita EcR polypeptidu eldysonového receptorů L. čupřina nebo M. persicae, který je zde uveden jako příklad, může být modulována zaměněním částí jeho sekvencí, nacházejících se na jeho C-konci nebo N-konci, za obdobné domény z EcR polypeptidu eldysonového receptorů D. melanogaster nebo alternativně, pomocí záměny oblastí EcR polypeptidú eldysonového receptorů L. čupřina nebo M. persicae jako takových.

Dalším vylepšením je, že takové změny v biologické funkci mohou být podobně ovlivněny pomocí specifických změn (např. adice, substituce nebo delece) pouze těch aminokyselin uvnitř každé domény, které jsou kritické pro určování příslušných katalytických funkcí (např. aktivita vazby k ligandu, aktivita DNA vazebného místa, atd.), pomocí místně cílené mutageneze.

Podle tohoto provedení je poskytnuta syntetická podjednotka EcR polypeptidu receptorů steroidu nebo syntetická podjednotka proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) receptorů steroidu nebo syntetický USP polypeptid receptorů juvenilního hormonu, nebo analog nebo derivát uvedených syntetických polypeptidú, přičemž uvedené syntetické polypeptidy obsahují aminokyselinovou sekvenci, která má následující vlastnosti:

(i) její aminokyselinová sekvence se odlišuje nebo vykazuje odlišné biologické vlastnosti ve srovnání s přirozenou podjednotkou polypeptidu EcR receptorů steroidu, nebo přirozenou podjednotkou proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) receptorů steroidu nebo přirozeným USP polypeptidem receptorů juvenilního hormonu;

(ii) obsahuje první sekvenci aminokyselin, která je alespoň ze 40 % totožná s částí aminokyselinové sekvence, vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID • · • · • · * · ·

• ·· ·

NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:

38, SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 42, nebo která je alespoň ze 40 % totožná s částí aminokyselinové sekvence, kódované kterýmkoli ze zde uvedených uložených plazmidů, která je kovalentně vázána ke druhé sekvenci aminokyselin, pocházející z podjednotky EcR polypeptidu receptorů steroidu, proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) receptorů steroidu nebo USP polypeptid receptorů juvenilního hormonu, přičemž první a druhá uvedená sekvence pocházejí z různých genomových zdrojů.

Je výhodné, když první sekvence aminokyselin je odvozena z podjednotky EcR polypeptidu receptorů steroidu, výhodnější je, když je odvozena z EcR polypeptidu ekdysonového receptorů L. čupřina nebo M. persicae, a ještě výhodnější je, když je odvozena z EcR polypeptidu ekdysonového receptorů L. čupřina.

V jednom provedení, syntetická podjednotka EcR polypeptidu receptorů steroidu nebo syntetická podjednotka proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) receptorů steroidu nebo syntetický USP polypeptid receptorů juvenilního hormonu obsahují fúzní polypeptid, ve kterém jsou oblasti vázající ligand a mající aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 42, ve spojitém čtecím rámci zaměněny oblastí vázající ligand, která pochází z polypeptidu odlišného receptorů.

Ve zvláště výhodném provedení je 5'-konec otevřeného čtecího rámce první nukleotidové sekvence, kódující N-koncovou část EcR polypeptidu prvního ekdysonového receptorů u konce DNA vazebné domény uvedeného polypeptidu, fúzován ve spojitém čtecím rámci s 3'-koncem otevřeného čtecího rámce druhé nukleotidové sekvence, kódující C-koncovou část EcR polypeptidu druhého ekdysonového receptorů, od D domény a domény vázající hormon ke karboxylovému konci.

Předložený vynález se tedy týká mnoha variant polypeptidů hmyzích receptorů, které zde byly zmiňovány, a genetických sekvencí, které je kódují, přičemž uvedené varianty pocházejí z polypeptidu receptorů, který zde byl popsán a vykazují zřetelnou vazebnou aktivitu kligandu a buď obsahují aminokyselinovou sekvenci, která se odlišuje od přirozeně se vyskytujícího polypeptidu receptorů, nebo vykazují biologickou aktivitu.

Jako u jiných provedení předloženého vynálezu, zde popsané varianty mohou být produkovány jako rekombinantní polypeptidy nebo v transgenních organizmech, když jsou předmětné syntetické geny vneseny do vhodných hostitelských buněk a exprimovány v nich.

V alternativním provedení je rekombinantní polypeptid receptorů, který je předmětem tohoto vynálezu, produkován jako polypeptid fúzovaný se zachovaným spojitým čtecím rámcem s druhým polypeptidem, například detekovatelným polypeptidem zpravodajem, jako je β-galaktozidáza, β-glukuronidáza, luciferáza nebo jiným enzymem, nebo FLAG peptidem, haptenem jako je polylyzin nebo polyhistidin nebo jinou polypeptidovou molekulou.

Výraz „se spojitým čtecím rámcem“ znamená, že nukleotidová sekvence, která kóduje první polypeptid je umístěna (tj. klonována nebo ligována) v tomtéž otevřeném čtecím rámci s nukleotidovou sekvencí, která kóduje druhý polypeptid, přičemž mezi nimi nejsou vloženy žádné stop kodony, takže když je ligovaná molekula nukleové kyseliny exprimována, je produkován jediný fúzní polypeptid, který obsahuje sekvenci aminokyselin odpovídající součtu jednotlivých aminokyselinových sekvencí prvního a druhého polypeptidů.

Aby byl produkován fúzní polypeptid, je molekula nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, který je předmětem tohoto vynálezu, nebo jeho analog nebo derivát, klonována vedle druhé molekuly nukleové kyseliny kódující druhý polypeptid, volitelně je možno je oddělit molekulou nukleové kyseliny mezerníku, která kóduje jednu nebo více aminokyselin (mezi jinými např. polylyzin nebo polyhistidin) tak, že první kódující oblast a druhá kódující oblast mají tentýž otevřený čtecí rámec a mezi těmito dvěma oblastmi nejsou vloženy žádné stop kodony. Když je přeložen, takto připravený polypeptid obsahuje fúzi mezi polypeptidovými produkty první a druhé kódující oblasti. Pokud je v genetickém konstruktu použit molekula nukleové kyseliny mezerníku, může být u uvedeného mezerníku žádoucí, aby kódoval sekvenci alespoň 10 aminokyselin, která je štěpitelná, aby tak napomohla oddělení fúzovaných polypeptidových produktů první a druhé kódující oblasti, například může kódovat štěpné místo pro trombin.

Genový konstrukt kódující fúzní polypeptid dále obsahuje alespoň jeden startovní kodon a jeden stop kodon, které je schopen rozpoznat translační aparát buňky, ve které je exprese zamýšlena.

Genový konstrukt kódující fúzní polypeptid může být dále s výhodou modifikován tak, aby obsahoval genetickou sekvenci kódující směrující signál, umístěnou • · • · • · · · • a • · • · • · · · v souvislém čtecím rámci s kódující oblastí nukleotidové sekvence, která kóduje fúzní polypeptid, aby došlo k nasměrování exprimovaného rekombinantního polypeptidu do extracelulární matrix nebo jiného buněčného kompartmentu. Výhodnější je, když je genetická sekvence kódující směrující signál umístěna v souvislém čtecím rámci na 5'-konci nebo na 3'-konci, ale nejvýhodnější je na 5'-konci kódující oblasti nukleotidové sekvence, která kóduje fúzní polypeptid.

Metody pro přípravu fúzního polypeptidu jsou dobře známé osobám se zkušeností v oboru.

Rekombinantní podjednotka EcR polypeptidu hmyzího receptorů steroidů nebo proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) podjednotkou receptorů steroidů nebo USP polypeptidu receptorů juvenilního hormonu mohou být čištěny pomocí standardních technik, jako je sloupcová chromatografie (na různých matricích, které interagují s proteinovými produkty, jako je iontově výměnné matrice, hydrofobní matrice a podobně), afinitní chromatografie za použití protilátek specifických pro protein nebo jiné ligandy, jako jsou barviva nebo hmyzí steroidy, které se vážou k proteinu.

Když je rekombinantní polypeptid exprimován jako fúzní polypeptid, je také možno čistit fúzní polypeptid na základě jeho vlastností (např. velikost, rozpustnost, náboj atd.). Alternativně může být fúzní polypeptid čištěn na základě vlastností nereceptorové složky uvedeného fúzního polypeptidu, například na základě afinity k substrátu. Jakmile je vyčištěn, může být fúzní polypeptid štěpen, aby byl uvolněn celý polypeptid, který je předmětem tohoto vynálezu.

Alternativně mohou být proteiny syntetizovány pomocí standardních technik pro syntézu proteinů, které jsou v oboru dobře známé.

Ve výhodném provedení jsou rekombinantní nebo izolovaný polypeptid, který je předmětem tohoto vynálezu, poskytnuty ve formě sraženiny nebo v krystalické formě, získané pomocí standardních postupů, s výhodou pro určení krystalové struktury pomocí X paprsků.

Trojrozměrná struktura polypeptidu, který je předmětem tohoto vynálezu, nebo holoreceptoru, který jej obsahuje, nebo fragmentu uvedeného polypeptidu nebo holoreceptoru, je zvláště užitečná pro určení kandidáta insekticidních činidel, která napodobují ligandy tím, že se vážou na uvedenou trojrozměrnou strukturu a/nebo modulují schopnost hmyzích steroidů se k ní vázat a aktivovat receptor (viz například Von Itzstein a kol., 1993; a Bugg a kol., 1993).

• ·

Podle tohoto provedení EcR polypeptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, nebo jejich domény, které vážou ligand, nebo jejich komplexy s proteiny sdruženými s EcR nebo jejich domény vázajícími ligand, které propůjčují zvýšenou aktivitu pro elementy reakce na hmyzí steroid, nebo sdružené proteiny USP polypeptidy) nebo ligandy, jsou zvláště užitečné pro modelování trojrozměrné struktury oblasti vazby receptor-ligandu. Tímto způsobem mohou být připravovány insekticidní sloučeniny, které se vážou nebo jinak interagují s oblastí receptoru, která se váže k ligandu, a výhodně interferují s vazbou ligandu. Stejným způsobem mohou být vyvinuty sloučeniny, které vykazují silnější interakci s receptorem hmyzího steroidu než fyziologické hmyzí steroidy, které se k receptoru vážou.

V ještě dalším provedení tedy poskytuje předložený vynález způsob určování kandidáta insekticidně aktivního činidla, který zahrnuje kroky:

a) exprimování USP polypeptidů receptoru juvenilního hormonu nebo jeho fragmentu, který obsahuje oblast vázající ligand, volitelně ve spojení s EcR polypeptidem receptoru steroidu nebo jeho doménou, která váže ligand, tak že tvoří jeden komplex;

b) čištění nebo srážení komplexu;

c) určení trojrozměrné struktury domény komplexu, která váže ligand; a

d) určení sloučenin, které se vážou nebo asociují s trojrozměrnou strukturou domény, která váže ligand, přičemž uvedená sloučenina představuje kandidáta insekticidně aktivních činidel.

Pro určení trojrozměrné struktury polypeptidů receptoru, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou použity standardní postupy, například rentgenová krystalografie a/nebo analýza pomocí nukleární magnetické rezonance (viz například Bugg a kol., 1993; Von Itstein a kol., 1993).

Insekticidně aktivní činidla, která jsou zde uvažována, zahrnují syntetické chemikálie napodobující jeden nebo více ligandů holoreceptoru nebo jeho polypeptidové podjednotky, nebo oblast vázající ligand v uvedeném holoreceptoru nebo podjednotce, čímž moduluje vazbu steroidů k uvedenému holoreceptoru nebo podjednotce. Výhodná insekticidně aktivní činidla zahrnují bisacylhydraziny, iridoidové glykozidy nebo jiné nesteroidní modulátory ekdysteroidových receptorů nebo receptorů hmyzího juvenilního hormonu. Dále, protože podjednotky proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) hmyzích receptorů steroidu a USP polypeptidů receptorů hmyzího juvenilního hormonu vážou hmyzí juvenilní hormony, je také kandidáty na insekticidy • · • ·

..............

skupina seskviterpenoidních ligandů, které regulují vývojové přeměny u hmyzu (viz Jones a Sharp, 1997) a interferují s vazbou juvenilního hormonu.

V dalším provedení poskytuje předložený vynález způsob určování modulátoru genové exprese zprostředkované receptorem hmyzího steroidu nebo genové exprese zprostředkované receptorem hmyzího juvenilního hormonu, který zahrnuje kroky:

(i) testování exprese genu zpravodaje v přítomnosti rekombinantního nebo izolovaného polypeptidu hmyzího receptoru steroidu nebo polypeptidu receptoru juvenilního hormonu, který je předmětem tohoto vynálezu, a potenciálního modulátoru; a (ii) testování exprese genu zpravodaje v přítomnosti rekombinantního nebo izolovaného polypeptidu hmyzího receptoru steroidu nebo polypeptidu receptoru juvenilního hormonu, který je předmětem tohoto vynálezu, ale bez uvedeného potenciálního modulátoru; a (iii) porovnání exprese genu zpravodaje v přítomnosti potenciálního modulátoru s expresí genu zpravodaje v nepřítomnosti potenciálního modulátoru, přičemž uvedený gen zpravodaj je umístěn pod operativní kontrolu elementu odpovědi na steroid (SRE), k němuž se uvedený hmyzí receptor steroidu váže, nebo promotorové sekvence, která uvedený SRE obsahuje.

V tomto kontextu je „modulátor“ sloučenina nebo molekula, která působí agonisticky nebo antagonisticky na vazebné vlastnosti a/nebo biologickou aktivitu polypeptidu receptoru nebo holoreceptoru. Výhodné modulátory podle tohoto provedení vynálezu zahrnují ty syntetické sloučeniny, které jsou vhodné pro použití jako insekticidně aktivní činidla, popsaná výše.

Gen zpravodaj může být jakýkoli gen, jehož exprese může být snadno monitorována nebo testována. S výhodou je gen zpravodaj strukturální gen, který kóduje peptid, polypeptid nebo enzym, který je snadno testovatelný enzymatickým nebo imunologickým způsobem, například gen pro β-galaktozidázu, β-glukuronidázu, luciferázu nebo chloramfenikolacetyltransferázu (CAT). Alternativně může gen zpravodaj být gen, který kóduje protein zjistitelný imunologicky, například FLAG peptid, polylyzinový peptid nebo polyhistidinový peptid.

Pro testování exprese genu zpravodaje jsou používány standardní postupy.

Toto provedení vynálezu může být aplikováno přímo pro určování potenciálních insekticidně aktivních sloučenin, nebo popřípadě spíše než testování exprese genu zpravodaje, může být modifikováno pro účely testování vazby (přímé nebo nepřímé) • · • * · ·

rekombinantního nebo izolovaného polypeptidu hmyzího receptorů steroidů nebo polypeptidu receptorů juvenilního hormonu, který je předmětem tohoto vynálezu, k elementu odpovědi na steroid (SRE). Podle tohoto alternativního provedení je porovnávána úroveň vazby jejím testováním v přítomnosti nebo nepřítomnosti potenciálně insekticidně aktivní sloučeniny, přičemž rozdíl v úrovni vazby naznačuje, že kandidátní sloučenina má potenciální insekticidní aktivitu.

Dále mohou být sloučeniny s insekticidní aktivitou vyhledávány tak, že je hodnocena jejich schopnost vázat se in vivo nebo in vitro k ekdysonovému receptorů, popřípadě k oblastem vázajícím ligand v podjednotce EcR polypeptidu ekdysonového receptorů (např. SEQ ID NO. 2 nebo SEQ ID NO: 10 nebo SEQ ID NO: 14) nebo proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) ekdysonového receptorů (např. SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 6 nebo SEQ ID NO: 8 nebo SEQ ID NO: 16 nebo SEQ ID NO: 18 nebo SEQ ID NO. 20 nebo SEQ ID NO: 22 nebo SEQ ID NO: 38 nebo SEQ ID NO: 40 nebo SEQ ID NO: 42). Pro hodnocení insekticidní aktivity mohou být provedeny kompetiční pokusy, které zahrnují přirozené hmyzí steroidy.

Toto provedení může například zahrnovat navázání polypeptidu hmyzího receptorů steroidů k podkladu, jako je např. velké množství polymerních částic, po čemž polypeptid usazený na velkém množství polymerních částic je uveden do kontaktu s kandidátem prověřované insekticidní molekuly. Molekuly mezi kterými je vyhledáváno, mohou být značeny pomocí izotopu, což umožní snadné detekování vazby. Jinou možností je použití molekul zpravodajů, které se vážou na komplex hmyzího receptorů steroidů a molekuly kandidátní sloučeniny. Jinou možností je navázání prohledávaných sloučenin k pevnému podkladu, jako je např. velké množství polymerních částic, které potom reagují s termostabilním hmyzím receptorem steroidů nebo vytvoří komplex se sdruženým proteinem. Navázání může být například zjištěno opět pomocí izotopového označení receptorů nebo detekováním pomocí protilátek nebo jiných detekčních činidel.

V alternativním provedení jsou insekticidně aktivní činidla určována pomocí detailního projektu molekuly látky, exprimováním USP polypeptidu receptorů juvenilního hormonu nebo jejich fragmentu, který obsahuje oblast vázající ligand, volitelně ve spojení s EcR polypeptidem receptorů steroidů nebo jeho domény vázající ligand, a volitelně ve spojení s hmyzím steroidem nebo jeho analogem tak, že vytvoří komplex, určením trojrozměrné struktury domény vázající v tomto komplexu ligand, a určením sloučenin, které se vážou k trojrozměrné struktuře nebo asociují s trojrozměrnou • · · · strukturou domény vázající ligand, přičemž uvedené sloučeniny představují kandidáty insekticidně aktivních činidel.

Metody pro zjištění modulátorů genové exprese a insekticidních sloučenin, které jsou zde popsané, mohou být provedeny za použití prokaryotických nebo eukaryotických buněk, buněčných lyzátů nebo vodných roztoků.

V dalším ohledu se proto tento vynález vztahuje k syntetickým sloučeninám odvozeným od trojrozměrné struktury EcR polypeptidů nebo podjednotek proteinů sdružených s EcR (USP polypeptid) hmyzích receptorů steroidu nebo jejich fragmentů, nebo hmyzích receptorů steroidu nebo jejich fragmentů, nebo USP polypeptidů receptorů hmyzího juvenilního hormonu nebo jejich fragmentů, přičemž tyto sloučeniny jsou schopny se vázat na uvedené receptory, což má za následek bud inaktivaci receptorů (a tedy působí jako antagonisté) nebo zesilují aktivitu receptorů.

Termínem „pochází z“ je míněno, že sloučeniny jsou založeny na trojrozměrné struktuře výše zmiňovaných proteinů, tedy jsou syntetizovány aby se vázaly, asociovaly nebo interferovaly s vazbou hmyzího steroidu nebo vazbou juvenilního hormonu.

Sloučeniny se mohou vázat silně nebo nevratně k vazebnému místu ligandu nebo kjiné oblasti receptorů nebo USP a působí jako agonisté nebo antagonisté hmyzích steroidů nebo vazby juvenilního hormonu nebo jinak interferují s vazbou ligandu, jako ekdysteroidy nebo juvenilní hormony. Takové sloučeniny by mohly mít silnou insekticidní aktivitu díky klíčové roli hmyzích steroidů nebo juvenilního hormonu v hmyzí fyziologii a biochemii. Takové sloučeniny by také měly jedinečnou specifitu.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 graficky představuje funkci podjednotky EcR polypeptidu ekdysonového receptorů L. čupřina in vivo. Buňky CHO byly současně transfekovány:

(1) jedním z následujících expresních plazmidů: pSGDmEcR, pSGLcEcR nebo výchozím expresním plazmidem pSG5 jako kontrolou, v koncentraci 1 pg/ml;

(2) plazmidem p(EcRE)z-CAT (1 pg/ml); a (3) nezávislým plazmidem zpravodajem. pPGKLacZ, v koncentraci 1 pg/ml. Exprese CAT byla indukována pomocí Muristeronu A v koncentraci buď 10 pM nebo 50 pM, zatímco kontrolní buňky obdržely pouze ethanol, použitý jako nosič. Pro kvantifikování syntézy CAT a β-galaktozidázy v buněčných extraktech 48 hodin po • · • · ’··* *··’ ·· ·· ......

transfekci byly použity soupravy ELISA. Úroveň CAT byla normalizována vzhledem k úrovni β-galaktozidázy v tomtéž extraktu. Násobek indukce představuje normalizované hodnoty exprese CAT genu v buňkách transfekovaných pSGDmEcR, pSGLcEcR nebo pSG5 v přítomnosti hormonu, vzhledem k normalizovaným hodnotám exprese CAT genu v buňkách transfekovaných týmž plazmidem, ale v nepřítomnosti hormonu. Jsou uvedeny průměrné hodnoty ze tří nezávislých pokusů a čárkami je znázorněna standardní chyba průměru.

Obrázek 2 je grafickou reprezentací, ukazující aktivitu plazmidů pSGLD a pSGDL, obsahujících chimerní podjednotky EcR polypeptidu hmyzích ekdysonových receptorů, produkovaných tak, jak je popsáno v příkladech. Testy společné transfekce byly provedeny tak, jak je popsáno v příkladech, ve kterých byly používány plazmidy pSGLD, pSGDL a CAT plazmid zpravodaj p(EcRE)₇-CAT (1 pg/ml) a nezávislý zpravodaj pPGKLacZ, každý v koncentraci 1 pg/ml. CAT/p-Gal (%) označuje aktivitu CAT zpravodaje, vyjádřenou v procentech vzhledem k β-galaktozidázové aktivitě, která je produkována vnitřním kontrolním plazmidem zpravodajem pPGKLacZ.

Obrázek 3 je grafickou reprezentací, ukazující vazebnou aktivitu v extraktech buněk Sf9 a Sf21, které obsahují bakulovirus exprimující LcEcRDEF a LcUSPDEF, jak je popsáno v příkladech. Kontrolní buňky obsahovaly pouze bakulovirus exprimující βglukuronidázu a CAT.

Obrázek 4 je grafickou reprezentací, ukazující vazebné aktivity k ekdysteroidu u in vitro translatovaného EcR polypeptidu Myzus persicae (MpEcR), in vitro translatovaného USP polypeptidu Myzus persicae (MpUSP) a komplexu tvořeného in vitro translatovanými polypeptidy EcR a USP M. persicae.

Obrázek 5 je kopie grafické reprezentace, ukazující expresní aktivitu plazmidů pVPLcEcR, kódujícího chimerní EcR polypeptid L. čupřina a plazmidů pSGLcUSP, kódujícího protein sdružený s EcR polypeptidem (USP polypeptid) L. čupřina v buňkách CV1, podle popisu uvedeného v příkladu 18. CAT plazmid zpravodaj p(EcRE)7-CAT (1 pg/ml) a nezávislý plazmid zpravodaj pPGKLacZ (1 pg/ml) byly použity pro testování závislosti exprese genu na ekdysteroidu. Údaje naznačují expresi CAT genu zpravodaje vzhledem k úrovni exprese transfekční kontroly, β-galaktozidázového genu zpravodaje. Symboly + a - označují přítomnost respektive nepřítomnost plazmidů pVPLcEcR a pSGLcUSP, nebo přítomnost (+) nebo nepřítomnost (-) 1 pM Ponasterone A (PonA). Čárkami je znázorněna standardní chyba průměru.

• · • · · · ♦ · *· • · • ♦ • · · ·

Obrázek 6 je grafickou reprezentací, ukazující in vivo funkci podjednotky modifikovaného EcR polypeptidů ekdysonového receptoru M. persicae v buňkách CHO. Buňky CHO byly současně transfekovány plazmidem zpravodajem p(EcRE)7-CAT (1 pg/ml) a expresním plazmidem vybraným ze skupiny zahrnující pSGDmEcR, pSGMpEcR, pSGDM, pSGMD a pSG5 (popsáno v příkladech), také v koncentraci 1 pg/ml. Údaje ukazují expresi CAT genu zpravodaje, jak byla určena pomocí testu ELISA, pro buňky postrádající Muristerone A (prázdné sloupce) nebo obsahující 10 pM Muristerone A (plné sloupce). Úroveň exprese CAT je přímo úměrná koncentraci produktu enzymatické reakce v testu a byla měřena jako absorbance při 405 nm.

Obrázek 7 je kopie grafické reprezentace, ukazující vazbu [³H] ponasteronu A na extrakty buněk Sf9, které byly infikovány bakulovirem exprimujícím oblasti vázající se k ligandu (tj. domény D/E/F) z (i) EcR polypeptidů M. persicae a proteinu sdruženého s EcR polypeptidem L čupřina (USP polypeptid); (ii) EcR polypeptidů M. persicae a proteinu sdruženého s EcR polypeptidem M. persicae (USP polypeptid); a (iii) EcR polypeptidů L. čupřina a proteinu sdruženého s EcR polypeptidem L. čupřina (USP polypeptid). U všech tří testovaných konstruktů je zřejmá vysoce výrazná vazba (tj. nad pozadí) analogu ekdysteroidu.

Obrázek 8 je kopie grafické reprezentace, ukazující aktivitu plazmidu pSGDM (příklad 19), kódujícího chimerní EcR polypeptid M. persicae a plazmidu pBKMpUSPI, kódujícího protein sdružený s EcR polypeptidem M. persicae (USP polypeptid) v buňkách CV1. CAT plazmid zpravodaj p(EcRE)7-CAT (1 pg/ml) a vnitřní kontrolní plazmid zpravodaj pPopNLacZ (1 pg/ml) byly přítomny ve všech testech. Symboly + a označují přítomnost respektive nepřítomnost plazmidů označených v obrázku, nebo přítomnost (+) nebo nepřítomnost (-) 10 pM Ponasterone A. Údaje ukazují expresi CAT genu zpravodaje vzhledem k úrovni exprese nezávislého β-galaktozidázového genu zpravodaje. Čárkami je znázorněna standardní chyba průměru.

Příklady provedení vynálezu

Tento vynález je také popsán následujícími příklady, které nijak neomezují rozsah vynálezu.

Příklad 1: Konstrukce plazmidu (pSV40-EcR) exprimujícího podjednotku EcR polypeptidů ekdysonového receptoru D. melanogaster • ·

..............

Fragment Fspl-Hindlll dlouhý 3110 párů bází byl vyštěpen z cDNA kódující podjednotku EcR polypeptidu ekdysonového receptoru D. melanogaster (Koelle a kol., 1991), přičemž vyštěpená sekvence obsahovala kompletní kódující oblast dlouhou 2634 párů bází, 214 párů bází 5' vedoucí sekvence a 218 párů bází 3' sekvence nepřekládané do proteinu. Fragment byl ligován do BamHI místa expresního plazmidu pSV40-EcR, kde je podjednotka EcR polypeptidu ekdysonového receptoru Drosophila melanogaster umístěna pod operativní kontrolu promotorové sekvence SV40.

Příklad 2: Konstrukce plazmidu zpravodaje p(EcRE)7-CAT

Plazmid zpravodaj p(EcRE)₇-CAT byl zkonstruován vložením mnoha kopií (tj. 5 až 7 kopií) elementu hsp27 reakce na ekdyson, a obsahujícího centrální 13 párů bází dlouhý palindromický element (EcRE) reakce na ekdyson, odvozený z genu hsp27 (Riddihough a Pelham, 1987), do Hindlll místa plazmidu pMMTV-CAT (Hollenberg a Evans, 1988), 93 párů bází proti směru přepisu od počátku transkripce promotoru MMTV, čímž byla operativně napojena exprese strukturního genu pro chloramfenikolacetyltransferázu na regulaci hmyzím receptorem, který váže hsp27 element odpovědi na ekdyson.

Příklad 3: Buněčné kultury a dočasná transfekce

Buňky z vaječníku čínského křečka byly udržovány v 50% (objem) Dulbeccově médiu modifikovaném podle Eagla (DMEM) a 50% (objem) živné směsi Hamm F12 (GIBCO), doplněné 10 % (objem) fetálního hovězího séra. Transfekce byla provedena pomocí koprecipitační metody DNA-fosforečnan vápenatý (Ausubel a kol., 1992). Jeden den před transfekci plazmidy popsanými v příkladech 1 a/nebo 2 nebo jinými expresními plazmidy, byly buňky CHO vysety ve výše uvedeném médiu DMEM/F12 v množství 5 až 8x10⁵ buněk na kultivační misky o průměru 6 cm. Tři hodiny před přidáním koprecipitátu DNA-fosforečnan vápenatý byly buňky promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem (PBS; Sambrook a kol., 1989) a kultivovány v čerstvém DMEM s 10 % fetálního hovězího séra. Buňky byly inkubovány v přítomnosti koprecipitátu po dobu 18 hodin a poté byl nadbytek DNA odstraněn promytím PBS. Buňky byly potom kultivovány další den v médiu DMEM/F12 doplněném 10 % (objem) fetálního hovězího séra, buď s přidaným nebo bez přidaného Ponasterone A (PNA), a potom odebrány. Buňky byly promyty PBS, odebrány mechanickým seškrábáním v 0,25 M Tris-HCI (pH 7,8) a rozrušeny pomocí 3 cyklů zmražení a rozmražení.

λ a a a • ·

• · · · ♦ ·

Všechny transfekce zahrnovaly, vedle expresních plazmidů a plazmidů zpravodajů, plazmid exprimující β-galaktozidázu, označený pPgK-LacZ (McBurney a kol., 1991), který sloužil jako vnitřní kontrola účinnosti transfekce, a pUC18 DNA v množství postačujícím k produkci 10 pg celkové DNA na jednu kultivační misku.

Aktivity chloramfenikolacetyltransferázy (CAT) a β-galaktozidázy, kódované geny zpravodaji, přítomnými v plazmidu zpravodaji, byly testovány tak, jak je popsáno v Sambrook a kol. (1989). Buňky které byly současně transfekovány s p(EcRE)7-CAT a pSV40-EcR vykazovaly zřetelnou indukci CAT aktivity v přítomnosti PNA, a to 50 jednotek aktivity. Kontroly vykazovaly zanedbatelnou aktivitu.

Pozorovali jsme, že ekdysonový receptor může vést v některých typech buněk ke stimulaci exprese z promotoru odpovídajícího na ekdyson, například v buňkách CHO, ale nikoli v buňkách CV-1. I když to není spojováno s žádnou teorií o mechanizmu působení, může to odrážet rozložení alespoň jednoho jiného transkripčního faktoru závisející na typu buňky, podstatného pro vznik odpovědi k ekdysonu. Pro určení typů buněk, které jsou vhodné exprimování genů zpravodajů pod kontrolou receptoru steroidu, který je předmětem tohoto vynálezu, byla testována buněčná specifita exprese genu odpovídajícího na ekdyson, u bezbuněčných transkripčních lyzátů, odvozených z několika cílových buněčných linií. Dále, pomocí frakcionování a izolování jaderných proteinů z buněčných linií exprimujících geny zpravodaje a doplňováním lyzátů, odvozených z neexprimujících buněčných linií takovýmito frakcemi jaderných proteinů nebo izolovaných proteinů, byly definovány všechny doplňující faktory, a geny které je kódují byly klonovány. Současná transfekce geny kódujícími receptor a geny kódujícími tyto doplňující faktory odstraňuje omezení daná tím, že reakci na ekdyson je omezena na určité typy buněk.

Příklad 4: Testování vlivu teploty na dočasnou expresi

Pro určení, zda polypeptid ekdysonového receptororu D. melanogaster je stabilní při fyziologických teplotách nad 30 °C, byly buňky CHO transfekovány plazmidem pSV40-EcR a plazmidem zpravodajem p(EcRE)7-CAT, v přítomnosti PNA tak, jak bylo popsáno v příkladu 3, při 30 °C a při 37 °C.

Krátce řečeno, buňky CHO byly vysety při 37 °C šestnáct až dvacet hodin před transfekci. Po odmytí DNA byly buňky kultivovány po dobu 2 hodin v čerstvém médiu buď s hormonem nebo bez hormonu, a misky byly rozděleny do souborů se zdvojenými vzorky. Jeden soubor byl kultivován další den při teplotě 37 °C a poté byly buňky • · • · · ♦ · · ·* ·· »· ····· odebrány pro testování CAT aktivity a β-galaktozidázové aktivity. Druhý soubor byl před testováním těchto enzymatických aktivit kultivován po dobu 3 dnů při teplotě 30 °C. Výsledky naznačují snížení stupně indukce genové exprese regulované polypeptidem ekdysonového receptorů D. melanogaster při 37 °C, ve srovnání se stupně indukce při 30 °C, jak je ukázáno v tabulce 1.

Příklad 5: Pokusné prohledávání genomové DNA knihovny L. čupřina pro izolaci genů kódujících podjednotku EcR polypeptidů ekdysonového receptorů L čupřina

Byl izolován fragment Eco - Kpnl, dlouhý 627 párů bází, obsahující DNA vazebnou doménu z podjednotky EcR polypeptidů ekdysonového receptorů D. melanogaster, byl radioaktivně označen a použit pro prohledávání genomové knihovny L. čupřina konstruované ve fágu λ (připravena v CSIRO, oddělení entomologie, Canberra, Austrálie). V prvém kole prohledávání ukázalo 24 oblastí na plotnách potenciálně pozitivní hybridizaci se sondou D. melanogaster. Avšak druhé kolo prohledávání těchto 24 plaků, pozitivních v prvním kole, nedalo žádný plak, který by reprodukovatelně vykazoval pozitivní signál při hybridizaci se sondou D. melanogaster.

Tabulka 1

pSV40-EcR (pg/misku)	PNA (μΜ)	Indukce exprese
37 °C	30 °C
2,5	20	14x	35x
100	59x	54x
0,5	20	8x	26x
100	47x	33x
0,1	20	1,6x	25x
100	9,0x	39x

Příklad 6: Klonování a charakterizace cDNA molekuly kódující EcR polypeptid ekdysonového receptorů L. čupřina

Principy pro navrhování amplifikačních primerů

Nukleotidové sekvence primerů Rdna3 (SEQ ID NO: 23) a Rdna 4 (SEQ ID NO: 24) byly odvozeny z aminokyselinové sekvence konzervované mezi DNA vazebnými doménami podjednotek EcR polypeptidů ekdysonových receptorů D. melanogaster a C. tentans. Avšak aminokyselinové sekvence homologické se dvěma jinými členy ·« ··· · •· · » ·· ·· ·· ·«*· nadrodiny steroidního hormonu D. melanogaster, hormonového receptoru 3 Drosophila (DHR3; Koelle a kol., 1991) a časného genu Drosophila (E75; Segraves a Hogness, 1990) byly při navrhování primeru vyloučeny, aby se v průběhu PCR snížila možnost amplifikace homologů genů L. čupřina, které kódují DHR3 nebo E75.

Amplifikační primery a podmínky PCR

DNA fragment dlouhý 105 párů bází, kódující DNA vazebnou doménu podjednotky EcR polypeptidů ekdysonového receptoru L. čupřina, byl amplifikován z genomu metodou PCR za použití následujících degenerovaných primerů:

Rdna3 (32mer s rozpoznávacím místem pro EcoRI):

5'-CGGAATTCCGCCTCTGGTTA(C/T)CA(C/T)TA(C/T)AA(C/T)GC-3' (tj. SEQ ID NO: 23); a

Rdna4 (32mer s rozpoznávacím místem pro BamHI):

5'-CGCGGATCC(G/A)CACTCCTGACACTTTCG(C/T)CTCA-3' (tj. SEQ ID NO: 24)

V amplifikační reakci byla použita Taql DNA polymeráza (Promega) a následující amplifikační podmínky:

cyklus 1: 97 °C/5 minut, 50 °C trvale; přidat polymerázu 50 °C/5 minut;

cykly 2 až 3: 72 °C/3 minuty, 94 °C/1 minuta, 50 °C/1 minuta;

cykly 4 až 43: 72 °C/3 minuty, 94 °C/1 minuta, 55 °C/1 minuta; cyklus 44: 72 °C/10 minut.

Aby bylo usnadněno klonování amplifikovaných fragmentů pro použití jako hybridizační sondy, primer Rdna3 obsahoval na 5'-konci rozpoznávací místo pro EcoRI a primer Rdna4 obsahoval na 5'-konci rozpoznávací místo pro BamHI. Amplifikované fragmenty genu L. čupřina byly klonovány do pBluescript SK+ po štěpení pomocí enzymů EcoRI a BamHI, vyčištění rozštěpené DNA pomocí elektroforézy v agarózovém gelu a elektroeluci proužku produktu.

Příprava hybridizační sondy

Pro přípravu sondy byl z vektoru pBluescript SK+ vyštěpen inzert pomocí EcoRI a BamHI, a označen ³²P pomocí soupravy GIGAprime DNA Labeling Kit (Bresatec Limited, Adelaide, Austrálie), v podstatě podle návodu výrobce, s výjimkou toho, že náhodné primery byly zaměněny za specifické primery Rdna 3 a Rdna 4 (viz výše). Neinkorporovaný radioaktivní materiál byl odstraněn vylučovací chromatografii na Biogel-P60 (Biorad Ltd., Sydney, Austrálie). Sonda byla použita v hybridizacích v koncentraci 10⁶ cpm/ml.

Konstrukce a prohledávání cDNA knihoven L. čupřina • 9 4 4 4 4

Μ 44 • · · · · • · · · · · · • · · · · · · • · 4 · ··

4444 44

Pomocí náhodných primerů, respektive oligo-dT primerů, byly připraveny dvě nezávislé cDNA knihovny L. čupřina, odvozené z pozdního třetího instaru larev L. čupřina, a klonovány do BamHI místa vektoru Lambda/Zapll (Stratagene). Vytvořené primární knihovny byly následně amplifikovány za pomoci standardních protokolů podle návodu výrobce.

Obě vytvořené cDNA knihovny předčí existující knihovny L. čupřina pokud se týká hodnot jejich titrů fága (tj. pfu/ml) i velikosti inzertů (v obou případech 500 až 4000 párů bází). Zvláště primární knihovna, připravená pomocí oligo-dT primerů, obsahovala 4,7x10⁶ pfu, zatímco amplifikovaná knihovna, připravená pomocí oligo-dT primerů, obsahovala 7,5x10¹⁰ pfu/ml; primární knihovna, připravená pomocí náhodných primerů, obsahovala 1,3x10⁶ pfu, zatímco amplifikovaná knihovna, připravená pomocí náhodných primerů, obsahovala 3,4x10¹⁰ pfu/ml.

Připravené cDNA knihovny byly prohledávány přenesením 500 000 plaků z každé knihovny ve dvou exemplářích na membrány Hybond N (Amersham) a jejich hybridizací za málo striktních podmínek s amplifikovaným produktem připraveným pomocí primerů Rdna3 a Rdna4 (viz výše) a označeným ³²P . Přesněji byla hybridizace prováděna po dobu 24 hodin při teplotě 37 °C v hybridizačním roztoku obsahujícím 42% (hmotnost/objem) formamid; 5x SSPE roztok; 5x Denhardtův roztok; a 0,1% (hmotnost/objem) dodecylsulfát sodný, v podstatě tak, jak bylo popsáno v Ausubel a kol., (1992) nebo Sambrook a kol., (1989). Membrány byly potom promyty při teplotě 37 °C v2x SSC roztoku, který obsahoval 0,1% (hmotnost/objem) dodecylsulfát sodný. Po promývání byly pozitivní plaky detekovány autoradiografií pomocí filmu XOMAT-AR (Kodak) po dobu 2 až 3 dnů při teplotě -70 °C.

Při prohledávání knihovny připravené pomocí náhodných primerů byly získány dva pozitivně hybridizující plaky (které obsahovaly cDNA inzerty dlouhé 561 párů bází, respektive 1600 párů bází) a z knihovny připravené pomocí oligo-dT primerů byl získán jeden pozitivně hybridizující plak (který obsahoval cDNA inzert dlouhý přibližně 3400 párů bází). Z těchto pozitivních plaků byly in vivo pomocí systému Exassist Helper Phage systém (Stratagene) vyštěpeny pBluescript fágomidy obsahující cDNA inzerty.

Nukleotidové sekvence izolovaných cDNA klonů byly získány pomocí soupravy USB Sequenase Version 2,5 Kit. Získané sekvenční údaje ukazovaly, že 561 a 1600 párů bází dlouhé cDNA inzerty kódují aminokyselinové sekvence, které obsahují důležitou DNA vazebnou doménu a hormon vázající doménu podjednotky EcR polypeptidů ekdysonového receptoru L čupřina, zatímco cDNA dlouhá 3400 párů bází ·♦ ·» • · · • · * ·* • · · · ·· ·· • · ·* obsahuje celý 2274 párů bází dlouhý otevřený čtecí rámec, kódující podjednotku EcR polypeptidů ekdysonového receptoru L. čupřina. Proto 3400 párů bází dlouhá cDNA je cDNA klon plné délky. Nukleotidové sekvence otevřeného čtecího rámce a nepřekládaná 3'-oblast je zde uvedena jako SEQ ID NO: 1. Odvozená aminokyselinová sekvence podjednotky EcR polypeptidů ekdysonového receptoru L. čupřina, kódovaná tímto otevřeným čtecím rámcem je zde uvedena jako SEQ ID NO: 2.

Příklad 7: První pokus o klonování a charakterizaci cDNA molekuly kódující EcR polypeptid ekdysonového receptoru M. persicae.

Přímé prohledávání cDNA knihovny M. persicae nebylo úspěšné pro izolaci cDNA, kódující plnou délku EcR polypeptidů ekdysonového receptoru M. persicae. DNA kódující DNA vazebnou doménu EcR polypeptidů ekdysonového receptoru M. persicae byla úspěšně izolována pomocí amplifikace, jak bylo popsáno v příkladu 6 pro amplifikaci homologního fragmentu L. čupřina. Amplifikovaná DNA byla klonována do pBluescript SK+ a nukleotidové sekvence klonovaného inzertu byla získána pomocí soupravy USB Sequenase Version 2,0 Kit tak, jak bylo popsáno v příkladu 6.

Na základě nukleotidové sekvence amplifikovaného DNA fragmentu byly syntetizovány dva následující původní primery:

Mdnal (23 mer): 5'-GCCTCGGGGTATCACTATAACGC-3' (tj. SEQ ID NO: 25); a Mdna2 (23 mer): 5'-GCACTCCTGACACT7TCGTCTCA-3' (tj. SEQ ID NO: 26). Příprava hybridizační sondy

Pro přípravu sondy pro M. persicae, byl pomocí EcoRI a BamHI z vektoru pBluescript SK+ vyštěpen inzert dlouhý 105 párů bází, označen ³²P pomocí soupravy GIGAprime DNA Labeing Kit (Bresatec Limited, Adelaide, Austrálie), v podstatě podle návodu výrobce, s výjimkou toho, že náhodné primery byly zaměněny za specifické primery Mdnal a Mdna2 (viz výše). Neinkorporovaný radioaktivní materiál byl odstraněn vylučovací chromatografii na Biogel-P60 (Biorad Ltd., Sydney, Austrálie). Sonda byla použita v hybridizacích v koncentraci 10⁶ cpm/ml.

Konstrukce a prohledávání cDNA knihoven M. persicae

Pomocí náhodných primerů, respektive oligo-dT primerů, byly připraveny dvě nezávislé cDNA knihovny M. persicae, odvozené z pozdního třetího instaru larev L. čupřina, a klonovány do BamHI místa vektoru Lambda/Zapll (Stratagene). Vytvořené primární knihovny byly následně amplifikovány za pomoci standardních protokolů podle návodu výrobce.

»· ·* • · * « » » 99 > · < * · • · · · ·« *♦ ·· «· « · · » » * · • · * • * * «· « *· ·

Obě vytvořené cDNA knihovny předčí existující knihovny M. persicae pokud se týká hodnot jejich titrů fága (tj. pfu/ml) a velikostí inzertů (v obou případech 500 až 4000 párů bází). Zvláště primární knihovna, připravená pomocí oligo-dT primerů, obsahovala 1x10⁷ pfu, zatímco amplifikovaná knihovna, připravená pomocí oligo-dT primerů, obsahovala 1x10¹⁰ pfu/ml; primární knihovna, připravená pomocí náhodných primerů, obsahovala 1x10® pfu, zatímco amplifikovaná knihovna, připravená pomocí náhodných primerů, obsahovala 2x10¹¹ pfu/ml.

Další cDNA knihovna byla připravena v inzerčním vektoru Lambda ZAP Express (Stratagene). Pro vytvoření této knihovny byla z pozdního třetího instaru larev L. čupřina pomocí oligo-dT primerů připravena cDNA a přímo klonována do vektorové DNA štěpené EcoRI-Xhol. Primární knihovna obsahovala 1x10⁶ pfu, zatímco amplifikovaná knihovna, připravená pomocí oligo-dT primerů, obsahovala 1x10⁹ pfu/ml, s inzerty dlouhými 500 až >4000 párů bází.

Fágová cDNA knihovna M. persicae, připravená pomocí náhodných primerů, byla prohledávána tak, jak bylo popsáno v příkladu 6, pomocí hybridizační sondy M. persicae, která byla připravena jak bylo popsáno výše.

Byl izolován jeden pozitivně hybridizující plak, a ten byl sekvenován pomocí standardních postupů. Nukleotidová sekvence tohoto klonu je zde uvedena jako SEQ ID NO. 9. Tento cDNA klon obsahuje 585 párů bází dlouhou sekvenci kódující DNA vazebnou doménu EcR polypeptidu předpokládaného M. persicae ekdysonového receptoru. Aminokyselinová sekvence kódovaná tímto částečným cDNA klonem je zde uvedena jako SEQ ID NO: 6.

Příklad 8: Druhý pokus o klonování a charakterizaci cDNA molekuly kódující EcR polypeptid ekdysonového receptoru M. persicae.

Příprava hybridizační sondy

Další hybridizační sondy specifické pro EcR polypeptid ekdysonového receptoru M. persicae byly připraveny z knihovny Lambda ZAPII, připravené pomocí oligo-dT primerů, pomocí PCR za použití primerů AP1 a AP2. Přímý primer AP1 byl navržen tak, aby hybridizoval k nukleotidovým sekvencím částečné cDNA (SEQ ID NO: 9), kódující část prvního „zinc-finger motivu, který je přítomen v DNA vazebné doméně. Zpětný primer AP2 byl adaptován zdegenerovaných primerů, a byl navržen tak, aby hybridizoval k nukleotidovým sekvencím, které jsou komplementárním k sekvencím, » ·

........

kódujícím v EcR doménu, která váže ligand (Kamimura a kol., 1996). Nukleotidové sekvence primerů AP1 a AP2 jsou následující:

Primer AP1: 5 -TCGTCCGGTTACCATTACAACGC-3' (SEQ ID NO: 27); a Primer AP2: 5'-TAGACCTTTGGC(A/G)AA(C/T)TC(A/G/C/T)ACAAT-3' (SEQ ID NO: 28).

PCR reakční směs obsahovala 4 μΙ každého primerů (50 pm/μΙ), 5 μΙ směsi deoxyribonukleotidtrifosfátú (2 mM), 1 μΙ DNA z Lambda ZAPII cDNA knihovny mšice, připravené pomocí oligo-dT primerů, 1 μΙ rekombinantní Pfu DNA polymerázy (5 jednotek/μΙ, Stratagene®), 5 μΙ 10x Pfu pufru (Stratagene®) a 30 μΙ MilliQ vody. Pfu polymeráza byla v této reakci použita protože vykazuje korekční aktivitu, která snižuje nesprávnou inkorporaci nukleotidů. Podmínky PCR reakce byly: 42 cyklů, každý cyklus obsahoval teplotní hybridizaci při 55 °C, syntézu při 72 °C a denaturaci při 94 °C.

Hlavní amplifikační produkt, získaný v této reakci, byl vyčištěn na gelu, kinázován a ligován do Smál místa pUC18.

Pro prohledávání cDNA knihoven M. persicae, byl klonovaný amplifikační produkt štěpen, aby se vytvořily dvě nepřekrývající se sondy označené „sonda EcR 1“ (tj. SEQ ID NO: 11) a „sonda EcR 2“ (tj. SEQ ID NO: 12). V tomto ohledu, štěpení klonovaného produktu pomocí Sphl vytvořilo DNA fragment, obsahující nukleotídovou sekvenci specifickou pro oblast kódující DNA vazebnou doménu (sonda EcR 1; SEQ ID NO: 11), zatímco štěpení pomocí Sphl/EcoRI vytvořilo DNA fragment obsahující nukleotídovou sekvenci, která vykazuje homologii s oblastí kódující doménu předpokládaného spojovníku, označenou doména D, a s 5'-koncem předpokládané domény vázající hormon, přítomné v EcR polypeptidu hmyzích ekdysonových receptorů (sonda EcR 2, SEQ ID NO. 12).

Sonda EcR 1 a sonda EcR 2 byly označeny pomocí [a-³²P]dATP v reakci katalyzované Klenowovým fragmentem. Všechny reagencie byly složkami soupravy GIGAprime DNA Labeing Kit (Bresatec Limited, Adelaide, Austrálie), s výjimkou toho, že náhodné primery byly zaměněny za specifické oligonukleotidy syntetizované tak, aby byly komplementární ke koncům sondy EcR 1 a sondy EcR 2.

Prohledávání cDNA knihoven M. persicae

Pomocí sondy EcR 1 bylo výše popsaným postupem prohledáváno 480 000 plaků z Lambda Zap Express cDNA knihovny (příklad 7), která byl připravena pomocí oligo-dT primerů. Tímto přístupem bylo získáno asi 300 pozitivních klonů. Pozitivně hybridizující klony byly spojeny a znovu prohledány pomocí jednotlivých sond EcR 1 a • · · · • · · · · · • · « · • · · · · * ·· ·· · * · · · · · · ·

EcR 2. Byly zjištěny pouze 4 plaky, které hybridizovaly s oběma sondami. Sekvenováním bylo zjištěno, že jeden z nich obsahuje celou délku cDNA kódující EcR polypeptid ekdysonového receptorů M. persicae. Nukleotidová sekvence otevřeného čtecího rámce této cDNA je zde uvedena jako SEQ ID NO: 9. Odvozená aminokyselinová sekvence podjednotky EcR polypeptidů ekdysonového receptorů M. persicae, kódované tímto otevřeným čtecím rámcem, je zde uvedena jako SEQ ID NO: 10.

Příklad 10: Funkce rekombinantních EcR polypeptidů ekdysonového receptorů L. čupřina in vivo Konstrukce plazmidu pF3

Plazmid pF3 byl konstruován ve čtyřech následujících krocích:

Zaprvé byl plazmid p5S1, obsahující celou délku cDNA kódující EcR polypeptid ekdysonového receptorů L. čupřina, štěpen Earl, a takto vzniklý 3' Earl cDNA fragment, kódující C-koncovou část EcR polypeptidů ekdysonového receptorů L. čupřina, byl na koncích doplněn a překlonován do Hindlll místa pUC19, čímž byl zkonstruován plazmid pEAR. V plazmidu pEAR byl 3'-konec cDNA orientován směrem ke Kpnl místu vektoru pUC19.

Za druhé byl také plazmid p5S1 odděleně štěpen:

(1) Apol a Pstl, kvůli izolaci 5'-konce cDNA jako 179 párů bází dlouhý fragment (fragment A);

(2) Pstl a Spěl, kvůli izolaci 1600 párů bází dlouhého fragmentu cDNA (fragment B); a (3) Spěl a Bglll, kvůli izolaci 203 párů bází dlouhého fragmentu (fragment C).

Za třetí byl plazmid pEAR štěpen Bglll a Kpnl, kvůli izolaci 3'-konce klonované cDNA jako 313 párů bází dlouhý fragment (fragment D).

Za čtvrté byl každý z fragmentů A, B, C a D izolován pomocí agarózové elektroforézy a byly společně ligovány do pBluescriptSK+, který byl štěpen EcoRI a Kpnl, čímž byl vytvořen plazmid pF3.

Plazmid pF3 tedy obsahuje kompletní otevřený čtecí rámec cDNA kódující EcR polypeptid ekdysonového receptorů L. čupřina jako 2368 párů bází dlouhý fragment, umístěný mezi dvěma BamHI místy.

Konstrukce plazmidu pSGLcEcR a plazmidu pLcK8 • ti» • · · · · ·

Plazmid pSGLcEcR byl konstruován klonováním BamHI fragmentu z pF3, dlouhého 2368 párů bází, do BamHI místa savčího expresního vektoru pSG5 (Stratagene). Plazmid pLcK8 je klon pSGLcEcR.

Konstrukce plazmidu pSGDmEcR

Plazmid pSGDmEcR je totožný s plazmidem pSV40-EcR (příklad 1), obsahujícím EcR polypeptid ekdysonového receptoru D. melanogaster, umístěný pod operativní kontrolu promotoru SV40.

Transfekce buněk CHO

Buňky CHO byly současně transfekovány směsí, která obsahovala následující DNA, lyžovány a testovány na enzymatickou aktivitu CAT a β-galaktozidázy tak, jak to bylo popsáno v předchozích příkladech:

(1) jeden z expresních plazmidů označených pSGDmEcR nebo pSGLcEcR nebo výchozí expresní plazmid pSG5 jako negativní kontrola, v koncentraci 1 pg/ml; a (2) CAT plazmid zpravodaj p(EcRE)7-CAT v koncentraci 1 pg/ml; a (3) nezávislý LacZ plazmid zpravodaj pPGKLacZ v koncentraci 1 pg/ml, použitý jako kontrola pro monitorování účinnosti transfekce.

Exprese CAT genu zpravodaje byla indukována pomocí 10 pM nebo 50 pM Muristerone A. V kontrolních vzorcích obdržely buňky namísto Muristerone A pouze nosič ethanol.

Pro kvantifikaci syntézy CAT a β-galaktozidázy v extraktech buněk, připravených 48 hodin po transfekci, byi použit test ELISA. Variabilita mezi pokusy byla vzata v úvahu tím, že úroveň enzymu CAT byla normalizována vzhledem k úrovni enzymu βgalaktozidázy, přítomné v tomtéž extraktu. Násobek indukce představuje normalizované hodnoty exprese genu CAT v buňkách transfekovaných pSGDmEcR, pSGLcEcR a pSG5 v přítomnosti hormonu, dělené normalizovanými hodnotami exprese genu CAT v buňkách transfekovaných týmž plazmidem, ale v nepřítomnosti hormonu. V obrázku 1 jsou uvedeny průměrné hodnoty ze tří nezávislých pokusů, přičemž čárkami je znázorněna standardní chyba průměru.

Údaje ukázané v obrázku 1 naznačují, že EcR polypeptid ekdysonového receptoru L. čupřina z příkladu 3 je in vivo biologicky aktivní. Indukce CAT je pozorována jak při 50 pM tak při 10 pM steroidu (Muristerone A), přičemž dochází k asi 30 násobné, respektive 15 násobné indukci. Vzhledem ktomu, že podle tohoto protokolu byla získána in vivo aktivita EcR polypeptidu ekdysonového receptoru L.

• · · · · • · · · · « · e čupřina, potenciálně insekticidní sloučeniny působící tak, že interagují s receptorem hmyzího steroidu, jako je ekdysonový receptor, byly hledány tím způsobem, že byly přidávány do zde popsaného in vivo testu. Sloučeniny byly přidávány v množství od 0,05 μΜ do 100 μΜ. Kandidáti insekticidních sloučenin jsou určováni podle jejich schopnosti modulovat expresi genu zpravodaje, přičemž tato modulace je následkem transaktivace EcR polypeptidem ekdysonového receptoru L čupřina.

Příklad 10: Chimerní EcR polypeptidy hmyzích ekdysonových receptorů

Jsou vytvářeny chimerní ekdysonové receptory, obsahující oblasti odvozené z EcR polypeptidů ekdysonových receptorů různých druhů, a jsou testovány na zvýšenou aktivitu. Ve zvláště výhodném provedení je vytvořen chimerní ekdysonový receptor za pomoci ekdysonových receptorů D. melanogaster, M. persicae a L. čupřina.

V jednom příkladu tohoto provedení jsou připraveny plazmidy pSGLD a pSGDL, které obsahují kódující oblasti odvozené od z EcR polypeptidů ekdysonových receptorů

D. melanogaster a L. čupřina. V plazmidu pSGLD je fúzován 5'-konec otevřeného čtecího rámce sekvence D. melanogaster, kódující N-koncovou část DNA vazebné domény tohoto polypeptidů, s 3'-koncem otevřeného čtecího rámce sekvence L. čupřina, kódující C-koncovou část EcR polypeptidů ekdysonového receptoru L. čupřina, od D domény a domény vázající hormon, ke karboxylovému konci. V plazmidu pSGDL je fúzován 5'-konec otevřeného čtecího rámce sekvence L. čupřina, kódující Nkoncovou část EcR polypeptidů ekdysonového receptoru L. čupřina ke konci DNA vazebné domény tohoto polypeptidů, s 3'-koncem otevřeného čtecího rámce sekvence D. melanogaster, kódující C-koncovou část EcR polypeptidů ekdysonového receptoru D. melanogaster, od D domény a domény vázající hormon, ke karboxylovému konci. Tyto plazmidy tedy kódují chimerní EcR polypeptidy, které jsou variantami ekdysonového receptoru.

Jak je ukázáno na obrázku 2, chimerní EcR polypeptidy ekdysonových receptorů L čupřina a D. melanogaster, obsahující fúzní polypeptidy mezi DNA vazebnými doménami a doménami vázajícími hormon v původních L. čupřina a D. melanogaster polypeptidech, vykazují biologickou aktivitu, když jsou měřeny pomocí výše popsaného CAT testu. Při obou koncentracích 10 μΜ a 50 μΜ Muristerone A je pozorována výrazná biologická aktivita chimerních EcR polypeptidů, kódovaných plazmidy pSGLD a pSGDL, porovnatelná s biologickou aktivitou původního EcR polypeptidů D. melanogaster.

φ · · ·

Φ· «·

Příklad 11: Izolace a charakterizace celé cDNA kódující protein sdružený s EcR (USP polypeptid) ekdysonového receptorů L. čupřina

Podjednotka proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) ekdysonového receptorů L. čupřina sama také funguje jako USP polypeptid L. čupřina receptorů juvenilního hormonu. cDNA kódující obě aktivity polypeptidu receptorů byla izolována pomocí PCR a hybridizace následujícím způsobem.

Příprava hybridizační sondy

Sonda 150 párů bází dlouhá, specifická pro genové sekvence kódující podjednotku proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) hmyzích ekdysonových receptorů nebo pro podjednotku USP polypeptidu hmyzích receptorů juvenilního hormonu (SEQ ID NO: 21), byla izolována pomocí PCR z genomové DNA L. čupřina za použití degenerovaných primerů popsaných vTzertzinis a kol., (1994). Podmínky PCR reakce byly stejné, jak byly popsány v příkladu 6, s tou výjimkou, že namísto Taql polymerázy byla použita Pfu polymeráza.

Amplifikovaný DNA fragment byl překlonován do vektoru pBluescript SK+ (Stratagene) dvojitě štěpeného EcoRI a Clal poté, co byl uvedený fragment vyštěpen současným působením enzymů EcoRI a Clal, čištěn na agarózové elektroforéze a zóna produktu byla izolována pomocí elektroeluce. Nukleotidové sekvence sondy byla zjištěna pomocí soupravy USB Sequenase version 2,0 Kit (SEQ ID NO: 21).

Pro přípravu sondy byl amplifikovaný DNA fragment L. čupřina vyštěpen z vektoru pomocí EcoRI a Sall, vyčištěn na gelu a označen ³²P pomocí soupravy GIGAprime DNA Labeing Kit (Bresatec Limited, Adelaide, Austrálie), v podstatě podle návodu výrobce, s výjimkou toho, že náhodné primery byly zaměněny za dva degenerované primery popsané vTzertzinis a kol., (1994) (viz výše). Neinkorporovaný radioaktivní materiál byl odstraněn vylučovací chromatografií na Biogel-P60 (Biorad Ltd., Sydney, Austrálie). Sonda byla použita v hybridizacích v koncentraci 10⁶ cpm/ml. Prohledávání cDNA knihoven L. čupřina

Výše popsaná cDNA knihovna L. čupřina (příklad 6) byla prohledávána pomocí amplifikované sondy tak, jak bylo popsáno v příkladu 6. Z jednoho pozitivního plaku byl odvozen plazmid pLSP4, obsahující inzert dlouhý 3800 párů bází. Sekvenováním bylo zjištěno, že část na 5'-konci pLSP4 kóduje protein sdružený s EcR (USP polypeptid) ekdysonového receptorů L. čupřina, následovaný dlouhou (2400 párů bází), očividně nepřekládanou oblastí (UTR). Byl izolován 2453 párů bází dlouhý EcoRI fragment • ·

plazmidu pLSP4 a překlonován do pBluescriptSK+ (Stratagene), čímž byl připraven plazmid pBLU1 obsahující celou délku cDNA sekvence. Nukleotidová sekvence celé délky cDNA, obsažené v pBLU1 a jí kódovaná aminokyselinová sekvence jsou zde uvedeny jako SEQ ID NO: 3 respektive SEQ ID NO: 4.

Otevřený čtecí rámec (ORF) SEQ ID NO: 3 kóduje polypeptid obsahující 467 aminokyselin. Startovní kodon ATG je umístěn uvnitř okolí velmi příznivého pro translační start (tj. 5'-GAAAATG-3'), který má 75% shodu s konvenční sekvencí (tj. 5'C/AAAAATG-3') pro sekvence mRNA D. melanogaster (Cavener a kol., 1987). Dále odvozená aminokyselinová sekvence proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) L. čupřina obsahuje domény A/B, C, D a E/F, které jsou charakteristické pro jaderné receptory hormonů (Evans, 1988; Forman a Samuels, 1990).

Nukleotidové sekvence 5'-nepřekládané oblasti a kódující oblasti cDNA, obsažené v plazmidu pLSP5 a jí kódovaná aminokyselinová sekvence, jsou zde uvedeny jako SEQ ID NO: 5 respektive SEQ ID NO: 6. Nukleotidové sekvence 5'nepřekládané oblasti a kódující oblasti cDNA, obsažené v plazmidu pLSP12 a jí kódovaná aminokyselinová sekvence, jsou zde uvedeny jako SEQ ID NO: 7 respektive SEQ ID NO: 8.

Analýzy nukleotidových sekvencí ukázaly odchylky v 5'-nepřekládaných oblastech pLSP4, pLSP5 a pLSP12, avšak kódující oblasti se zdály být totožné, což naznačuje možnou sestřihovou variabilitu. Tento závěr je podporován skutečností, že cDNA z pLSP4, pLSP5 a pLSP12 obsahovaly totožné nukleotidové sekvence ve svých 5'-nepřekládaných oblastech, avšak lišily se vložením nebo deleci určitých sekvencí. Zvláště 13 nukleotidů na 5'-konci bylo ve všech třech cDNA totožných, stejně jako byla nukleotidová sekvence obklopující translační startovní kodon (tj. 5'-AAAATG-3'). Klon pLSP5 (SEQ ID NO: 5) se lišil od klonu pLSP4 (SEQ ID NO: 3) natolik, že obsahoval další 5'-nepřekládanou sekvenci dlouhou 176 párů bází, vloženou mezi nukleotidy 13 a 14 v pLSP4. Klon pLSP12 (SEQ ID NO: 7) se také lišil od pLSP4 (SEQ ID NO: 3) natolik, že obsahoval další 5'-nepřekládanou sekvenci dlouhou 116 párů bází, vloženou mezi nukleotidy 13 a 14 v pLSP4. Klony pLSP5 (SEQ ID NO: 5) a pLSP12 (SEQ ID NO: 7) se lišily natolik, že pLSP5 obsahoval další 5'-nepřekládanou sekvenci dlouhou 60 párů bází, vloženou mezi nukleotidy 13 a 14 v pLSP12.

Startovní ATG kodony obou klonů pLSP5 a pLSP12 leží uvnitř sekvencí majících souvislost se startem translace (tj. 5'-CAAAATG-3'), která je zcela totožná s konvenční • · sekvencí (tj. 5'-C/AAAAATG-3') pro m RNA sekvence D. melanogaster (Cavener a kol., 1987).

Příklad 12: Izolace a charakterizace části cDNA kódující protein sdružený s EcR (USP polypeptid) ekdysonového receptorů M. persicae

Podjednotka proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) ekdysonového receptorů M. persicae sama také funguje jako USP polypeptid L. čupřina receptorů juvenilního hormonu. Pro izolaci části cDNA, kódující obě aktivity polypeptidu receptorů, byla z genomové DNA M. persicae amplifikována pomocí dvou degenerovaných primerů, popsaných v Tzertzinis a kol., (1994) (viz předchozí příklad), 140 párů bází dlouhá sonda. Podmínky PCR reakce byly stejné, jak byly popsány v příkladu 6, s tou výjimkou, že namísto Taql polymerázy byla použita Pfu polymeráza.

Amplifikovaný DNA fragment byl překlonován do vektoru pBluescript SK+ (Stratagene) současně štěpeného EcoRI a Clal poté, co byl uvedený fragment současně vyštěpen enzymy EcoRI a Clal, čištěn na agarózové elektroforéze a zóna produktu byla izolována pomocí elektroeluce.

Nukleotidové sekvence inzertu ve vektoru pBluescript SK+ byla zjištěna pomocí automatického sekvenování za použití fluorescenčních barevných terminátorů (SUPAMAC, Sydney Austrálie).

Příprava hybridizační sondy a prohledávání knihovny

Pro přípravu sondy byl amplifikovaný DNA fragment M. persicae vyštěpen z vektoru pBluescript SK+ pomocí EcoRI a Salt, vyčištěn na gelu a označen ³²P pomocí soupravy GIGAprime DNA Labeing Kit (Bresatec Limited, Adelaide, Austrálie), v podstatě podle návodu výrobce, s výjimkou toho, že náhodné primery byly zaměněny za dva degenerované primery popsané v Tzertzinis a kol., (1994) (viz předchozí příklad). Neinkorporovaný radioaktivní materiál byl odstraněn vylučovací chromatografií na Biogel-P60 (Biorad Ltd., Sydney, Austrálie). Sonda byla použita v koncentraci 10⁶cpm/ml v hybridizacích při prohledávání cDNA knihovny M. persicae stejně, jak bylo popsáno v příkladech 7 a 8.

Pozitivně hybridizující klony byly plakově purifikovány a sekvenovány pomocí zde popsaných standardních postupů. Nukleotidové sekvence otevřeného čtecího rámce cDNA, kódujícího celou podjednotku sdruženého proteinu (USP polypeptid) ekdysonového receptorů M. persicae nebo USP polypeptid juvenilního hormonu M.

• ·

............

persicae, je zde uvedena jako SEQ ID NO: 15. Odvozená aminokyselinová sekvence tohoto otevřeného čtecího rámce je zde uvedena jako SEQ ID NO: 16.

Příklad 13: Konstrukt pro bakulovirem řízenou současnou expresi funkčních oblastí vázajících ligand v EcR polypeptidu a sdruženém proteinu (USP polypeptid) ekdysonového receptoru D. melanogaster

Byl připraven vektor, umožňující bakulovirem řízenou současnou expresi funkčních oblastí vázajících ligand v EcR polypeptidu a sdruženém proteinu (USP polypeptid) ekdysonového receptoru D. melanogaster, jehož proteinové produkty se při současné expresi spojují a vytvářejí funkční komplex, který váže hormon. Spojené proteiny jsou potom použity ve vysokokapacitních testech nebo pro analýzu trojrozměrné struktury. Bylo zjištěno, že doména vázající ligand spolu s větší částí domény spojovníku z podjednotky EcR polypeptidu a proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid), jsou postačující ke spojení a vytvoření funkčního komplexu, který váže hormon.

1. Izolace oblasti vázající ligand v EcR polypeptidu ekdysonového receptoru D. melanogaster

Fragment Sacl-Hindlll, kódující většinu spojovníku (doména D) a celou doménu vázající ligand (domény E a F) v EcR polypeptidu ekdysonového receptoru Drosophila melanogaster, byl vyštěpen z plazmidu obsahujícího DNA kódující celý EcR polypeptid (Koelle a kol., 1991). Vyštěpený produkt byl klonován do expresního vektoru pQE31 (Qiagen) štěpeného Sacl-Hindlll, čímž byl vytvořen plazmidový vektor pQE31DmECR.

2. Konstrukce bakuloviru exprimujícího oblasti vázající ligand v polypeptidech EcR a USP

Bakulovirus pro současnou expresi v hmyzích buňkách byl zkonstruován z:

(i) cDNA oblasti obsahující nukleotidovou sekvenci kódující alespoň oblast vázající ligand spolu s větší částí domény spojovníku EcR polypeptidu ekdysonového receptoru D. melanogaster, která byla izolována tak, jak bylo popsáno výše v odstavci (1); a (ii) cDNA oblasti obsahující nukleotidovou sekvenci kódující alespoň oblast vázající ligand spolu s větší částí domény spojovníku sdruženého peptidu (USP polypeptid) ekdysonového receptoru D. melanogaster.

Pro vytvoření tohoto bakuloviru byl zpQE31DmECR vyštěpen fragment EcoRIHindlll, který kóduje značku oligo-His a většinu domény spojovníku, spolu s celou • · • · • · · ·

............

doménou vázající ligand v EcR polypeptidu. Tento EcoRI-HindlII fragment byl ligován do pFastBac.DUAL štěpeného EcoRI-HindlII, čímž byl připraven plazmid pDmEcR.DUAL. Pro vložení genových sekvencí specifických pro sdružený protein (USP polypeptid), byl z plazmidu pZ7-1 (poskytnutý od Vince Henricha), obsahujícího celý klon cDNA, vyštěpen fragment Hindill-Nsil, kódující většinu domény spojovníku, spolu s celou doménou vázající ligand ve sdruženém proteinu (USP polypeptid), a ligován do pDmEcR.DUAL, štěpeného Ncol-Nsil. Poté byla ligováním do jedinečného Smál místa zabudována proti směru přepisu ve stejném čtecím rámci nukleotidové sekvence kódující „FLAG“ peptid a ve stejném čtecím rámci i nukleotidové sekvence, kódující oblast vázající ligand ve sdruženém proteinu (USP polypeptid), čímž byl připraven plazmid pDmEcR.USP.DUÁL. Plazmidy obsahující nukleotidovou sekvenci kódující FLAG protein ve správné orientaci, byly určovány pomocí sekvenování.

Segment pDmEcR. USP.DUÁL, kódující označenou oblast vázající ligand v EcR polypeptidu a ve sdruženém proteinu (USP polypeptid), umístěný pod operativní kontrolu polyhedrinového, respektive p10 promotoru, byl rekombinován do genomu bakuloviru pomocí Tn7 transpozičního systému (Luckow a kol., 1993). Polypeptidové produkty byly potom v hmyzích buňkách Sf21 a Sf9 exprimovány současně a spojovaly se do funkčního komplexu.

Exprese označené oblasti vázající ligand v EcR polypeptidu a sekvence sdruženého proteinu (USP polypeptid) byla testována pomocí imunoblotové analýzy extraktů, pocházejících z hmyzích buněk Sf21, které byly infikovány rekombinantním bakulovirem, přičemž byly použity protilátky proti oligo-His a značkám FLAG. Touto analýzou byly imunoblotovou analýzou detekovány zóny, které měly přibližně takovou velikost, která byla předpovězena pro označené exprimované oblasti vázající ligand v EcR polypeptidu a sdruženém proteinu (USP polypeptid).

Protein detekovaný anti-oligo-His-protilátkami byl obohacen pomocí afinitní purifikace na pryskyřici nikl-NTA (Qiagen) a protein označený FLAG byl čištěn afinitní purifikací pomocí gelu FLAG M2 Affinity Gel (Kodak). Dále bylo ukázáno, že EcR polypeptid označený oligo-His a protein sdružený s EcR (USP polypeptid) se vážou na FLAG M2 Affinity Gel (Kodak) ve formě heterodimerního komplexu.

Vazebné pokusy, provedené pomocí modifikované metody Yund a kol., (1978) dále ukázaly v buňkách infikovaných rekombinantním bakulovirem, ve srovnání s vazbou přirozeného ekdysonového holoreceptoru L. čupřina, vysoce významné zvýšení vazby značeného ekdysonového analogu, [³H]-ponasteronu A. Naopak buňky • · · ·

.. .. .. .· ·· ··· infikované kontrolním virem nevykazovaly ani zóny pozitivně reagující s protilátkami při analýze pomocí westernového přenosu, ani specifickou vazbu [³H]-ponasteronu A nad úroveň pozadí. Tyto údaje naznačují, že došlo ke správnému prostorovému uspořádání a spojení variantních polypeptidů, obsahujících oblasti vázající ligand v EcR polypeptidu D. melanogaster a sdruženém proteinu (USP polypeptid) D. melanogaster. Správně prostorově uspořádaný a spojený komplex, vytvořený zkráceným EcR polypeptidem a zkráceným proteinem sdruženým s EcR (USP polypeptid), byl použit pro rentgenovou strukturní analýzu a NMR strukturní analýzu a pro vysokokapacitní prohledávání.

Příklad 14: Konstrukt pro bakulovirem řízenou současnou expresi funkčních oblastí vázajících ligand v EcR polypeptidu a sdruženém proteinu (USP polypeptid) ekdysonového receptorů L. čupřina

Vektor pro bakulovirem řízenou současnou expresi funkčních domén pocházejících z EcR polypeptidu a sdruženého proteinu (USP polypeptid) ekdysonového receptorů L. čupřina byl připraven v podstatě tak, jak bylo popsáno v předchozím příkladě.

1. Izolace oblasti vázající ligand v EcR polypeptidu ekdysonového receptorů L. čupřina

Fragment Sphl-Kpnl, kódující většinu spojovníku (doména D) a celou doménu vázající ligand (domény E a F) v EcR polypeptidu ekdysonového receptorů L. čupřina, byl vyštěpen z cDNA klonu, kódujícího celý EcR polypeptid a klonován do expresního vektoru pQE32 (Qiagen) štěpeného Sphl-Kpnl, čímž byl vytvořen plazmid pQE31LcECR.

2. Izolace oblasti vázající ligand ve sdruženém proteinu (USP polypeptid) ekdysonového receptorů L. čupřina

DNA fragment, kódující většinu domény spojovníku a celou doménu vázající ligand ve sdruženém proteinu (USP polypeptid) ekdysonového receptorů L. čupřina byl překlonován, a tak byl vytvořen plazmid pBLU1.

3. Konstrukce bakuloviru exprimujícího oblasti vázající ligand v polypeptidech EcR a USP L. čupřina

Bakulovirus pro současnou expresi v hmyzích buňkách byl zkonstruován z:

(i) cDNA oblasti obsahující nukleotidovou sekvenci kódující alespoň oblast vázající ligand spolu s větší částí domény spojovníku EcR polypeptidu ekdysonového receptorů L. čupřina, která byla izolována tak, jak bylo popsáno výše v odstavci (1); a • « • · · ·

(ii) cDNA oblasti obsahující nukleotidovou sekvenci kódující alespoň doménu vázající ligand spolu s větší částí domény spojovníku sdruženého peptidu (USP polypeptid) ekdysonového receptorů L čupřina, která byla izolována tak, jak bylo popsáno výše v odstavci (2).

Pro vytvoření tohoto bakuloviru byl fragment EcoRI-Pstl, pocházející z plazmidů pQE32LcECR, který kóduje značku oligo-His a většinu domény spojovníku, spolu s celou doménou vázající ligand v EcR polypeptidu L. čupřina, ligován do pFastBac.DUAL štěpeného EcoRI-Pstl, čímž byl připraven plazmid pLcEcR.DUAL. Fragment Avall-EcoRI, který kóduje většinu spojovníku a celou doménu vázající ligand ve sdruženém proteinu L. čupřina (USP polypeptid) byl vyštěpen z plazmidů pBLUí a ligován spolu se sekvencí kódující „FLAG“ do Pvull místa pLcEcR.DUAL, čímž byl připraven plazmid pLcEcR. USP.DUÁL.

Segment pLcEcR. USP. DUÁL kódující označenou oblast vázající ligand v EcR polypeptidu a sdruženém proteinu (USP polypeptid), umístěný pod operativní kontrolu polyhedrinového, respektive p10 promotoru, byl rekombinován do genomu bakuloviru pomocí transpozičního systému Tn7 (Luckow a kol., 1993). Polypeptidové produkty bylo potom v hmyzích buňkách Sf21 a Sf9 exprimovány současně a spojovaly se do funkčního komplexu.

Exprese byla testována pomocí imunoblotové analýzy. Protilátkami proti oligoHis a značkám FLAG byly imunoblotovou analýzou v extraktech z hmyzích buněk Sf21, které byly infikovány rekombinantním bakulovirem, detekovány zóny, které měly přibližně takovou velikost, která byla předpovězena pro exprimované oblasti EcR polypeptidu, respektive USP polypeptidu. Protein detekovaný anti-oligo-His-protilátkami byl velmi obohacen pomocí pryskyřice nikl-NTA (Qiagen) a protein označený FLAG byl čištěn pomocí gelu FLAG M2 Affinity Gel (Kodak). Dále bylo imunoblotovou analýzou ukázáno, že zkrácený EcR polypeptid L. čupřina označený oligo-His a zkrácený protein sdružený s EcR L. čupřina (USP polypeptid) se vážou jako heterodimemí komplex na FLAG M2 Affinity Gel (Kodak).

Vazebné pokusy, provedené pomocí modifikované metody Yund a kol., (1978) dále ukázaly v buňkách infikovaných rekombinantním bakulovirem, vysoce významné zvýšení vazby ekdysonového analogu ponasteronu A značeného tritiem, což naznačuje, že došlo ke správnému prostorovému uspořádání a spojení dvou proteinových podjednotkek (obrázek 3), větších než jsou podjednotky ekdysonového holoreceptoru embryí L. čupřina. Buňky infikované kontrolním virem nevykazovaly ani

Λ · • · · · zóny pozitivně reagující s protilátkami při analýze pomocí westernového přenosu, ani specifickou vazbu hormonu značeného tritiem, nad úroveň pozadí.

Exprese označené oblasti vázající ligand v EcR polypeptidu a sekvence sdruženého proteinu (USP polypeptid) byla testována pomocí imunoblotové analýzy extraktů, pocházejících z hmyzích buněk Sf21, které byly infikovány rekombinantním bakulovirem, přičemž byly použity protilátky proti oligo-His a značkám FLAG. Tímto byly pomocí imunoblotové analýzy detekovány zóny, které měly přibližně takovou velikost, která byla předpovězena pro označené exprimované oblasti vázající ligand v EcR polypeptidu L. čupřina a sdruženém proteinu (USP polypeptid).

Protein detekovaný anti-oligo-His-protilátkami byl obohacen pomocí afinitní purifikace na pryskyřici nikl-NTA (Qiagen) a protein označený FLAG byl čištěn afinitní purifikací pomocí gelu FLAG M2 Affinity Gel (Kodak).

Vazebné pokusy, provedené pomocí modifikované metody Yund a kol., (1978) dále ukázaly v buňkách infikovaných rekombinantním bakulovirem, ve srovnání s vazbou pozorovanou u přirozeného ekdysonového holoreceptoru embryí L čupřina (obrázek 3), vysoce významné zvýšení vazby značeného ekdysonového analogu, [³H]ponasteronu A. Naopak buňky infikované kontrolním virem nevykazovaly ani zóny pozitivně reagující s protilátkami při analýze pomocí westernového přenosu, ani specifickou vazbu [³H]-ponasteronu A nad úroveň pozadí.

Tyto údaje naznačují, že došlo ke správnému prostorovému uspořádání a spojení variantních polypeptidů, obsahujících oblasti vázající ligand v EcR polypeptidu L. čupřina a sdruženém proteinu (USP polypeptid) L. čupřina. Správně prostorově uspořádaný a spojený komplex, vytvořený zkráceným EcR polypeptidem a zkráceným proteinem sdruženým s EcR (USP polypeptid), byl použit pro rentgenovou strukturní analýzu a NMR strukturní analýzu a pro vysokokapacitní prohledávání.

Příklad 15: Konstrukt pro expresi ligand vázající oblasti USP polypeptidu receptoru juvenilního hormonu L čupřina

Zdrojový plazmid pLcEcR.USP.DUAL (Příklad 14) byl štěpen BssHII a Pstl, aby byl odstraněn ten jeho segment, kódující EcR polypeptid L. čupřina, a tedy byla ponechána nukleotidová sekvence, která kóduje označenou oblast vázající ligand v USP polypeptidu L. čupřina. U štěpeného plazmidu byly pomocí T4 DNA polymerázy a Klenowova fragmentu zarovnány konce, byl izolován pomocí čištění na gelu a na závěr opět ligován, čímž byl připraven plazmid pLcUSP.SINGLE.

4

4· ·· · ·

Pro vytvoření rekombinantního bakuloviru, schopného exprimovat označenou oblast vázající ligand v USP polypeptidů, byly segment pLcUSP.SINGLE kódující tento polypeptid a sekvence promotoru, k němuž je uvedený segment operativně připojen, rekombinovány do genomu bakuloviru pomocí transpozičního systému Tn7 (Luckow a kol., 1993). Polypeptidový produkt byl potom exprimován a vytvářel funkční polypeptid vázající juvenilní hormon, a s výhodou modulátor receptoru juvenilního hormonu. Správně prostorově uspořádaný zkrácený USP polypeptid byl použit pro rentgenovou strukturní analýzu a NMR strukturní analýzu a pro vysokokapacitní prohledávání.

Příklad 16: Prohledávání in vitro za účelem detekce insekticidních sloučenin

Protein sdružený s EcR (USP polypeptid) hmyzího ekdysonového receptoru a

USP polypeptid receptoru hmyzího juvenilního hormonu, které jsou předmětem tohoto vynálezu, volitelně spojené s EcR polypeptidy hmyzích ekdysonových receptorů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jak jsou popsány v předchozích příkladech, byly připojeny k podkladu podle postupu Geysen a kol., (1987), a reagovaly s kandidáty na insekticidní sloučeniny, jejichž koncentrace byly obecně v rozmezí od 0,05 μΜ do 100 μΜ. Vazba sloučenin byla detekována pomocí standardních postupů a byly tak určeny sloučeniny, které mají insekticidní aktivitu. Je výhodné, když tyto sloučeniny vykazují insekticidní aktivitu proti skupině hmyzích druhů, zahrnující mimo jiné dvoukřídlé, ploštice, brouky, mravence a můry. Je výhodnější, když tyto sloučeniny vykazují insekticidní aktivitu mimo jiné proti L. čupřina, M. persicae, D. melanogaster, červcům, „white fly“ a cikádám. Ve zvláště výhodném provedení jsou insekticidní sloučeniny specifické k L. čupřina nebo M. persicae a jejich blízkým příbuzným.

Příklad 17: Klonovaný komplex Ecr/USP Myzus persicae váže in vitro ponasteron A

Produkty in vitro translace, polypeptid EcR Myzus persicae (MpEcR) a polypeptid

USP Myzus persicae (MpUSP) byly připraveny pomocí systému Promega TNT-Coupled Reticulocyte Lysáte Systém a označené pomocí [³⁵S]metioninu. Každá dávka lyzátu obsahovala 100 až 200 mg/ml endogenních proteinů (jako standard byl použit BSA). Produkty byly analyzovány pomocí SDS-PAGE elektroforézy a autoradiografie. Výsledky potvrdily, že klonované cDNA kódují proteiny o velikostech předpověděných podle délky předpokládaných otevřených čtecích rámců cDNA, přítomných v plazmidech pMpEcR a pMpUSP. Jak bylo zjištěno pomocí SDS-PAGE elektroforézy, byly výtěžky EcR a USP podobné.

• * • » * · • » • · • · · · · • · · ·· · · · • · · · · · · ·· · · · · ··

V rámci funkčních testů byly DNA plazmidy pMpEcR (AGAL přístupové číslo NM 99/04 567; 1 mg) nebo pMpUSP (AGAL přístupové číslo NM 99/04 568; 1 mg) nebo pMpUSP2 (AGAL přístupové číslo NM 00/12 581; 1 mg), které byly konstruovány pomocí vektoru pBK-CMV, a 1 ml vhodné TNT RNA polymerázy, přidány do 48 ml reakční směsi obsahující lyzát TNT, TNT reakční pufr, směs aminokyselin, inhibitor ribonukleázy Rnasin a vodu bez přítomných nukleáz, v objemech určených protokolem výrobce. V kontrolních reakcích byla na místo pMpEcR nebo pMpUSP použita kontrolní DNA Luciferase 3 (Promega). T7 RNA polymeráza byla použita pro transkripci M. persicae EcR RNA z plazmidu pMpEcR, zatímco pro transkripci M. persicae USP RNA z plazmidu pMpUSP a kontrolní DNA Luciferase 3 byla použita T3 RNA polymeráza. Reakce probíhaly po dobu 90 minut při teplotě 30 °C.

Kontrolní reakce produkovala v 50 ml reakci 150 až 200 ng luciferázy.

U in vitro translatovaného M. persicae ECR polypeptidu (MpEcR) a in vitro translatovaného komplexu M. persicae ECR a USP polypeptidů, vznikajících z RNA pomocí systému TNT-Coupled Reticulocyte Lysáte System (Promega), byla zjištěna vazebná aktivita k ekdysteroidu. Směsi byly uloženy při teplotě -20 °C přes noc.

Po rozmražení produktů translace byly 15 ml alikvoty reakční směsi, obsahující M. persicae polypeptidy EcR a USP, spojeny aby došlo k vytvoření EcR/USP komplexu. Pro analýzu jednotlivých proteinů bylo 15 ml reakční směsi, obsahující M. persicae EcR polypeptid, nebo 15 ml reakční směsi, obsahující M. persicae USP polypeptid, spojeno s 15 ml kontrolní reakční směsi s proteinem luciferázou. Každý ze vzorků byl zředěn na 435 ml pufrem EcR40 [40 mM KCI, 25 mM HEPES pH 7,0, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, BSA (0,5 mg/ml), 10% glycerol], aby bylo možno provést test vazby ligandu ve třech paralelách. Alikvot (140 ml) každého zředěného vzorku byl inkubován s ponasteronem A značeným tritiem (DuPont NEN, číslo šarže 3 281 108) v konečné koncentraci 2,2 nM, po dobu 90 minut při teplotě místnosti. Po inkubaci byly reakce, testující vazbu ligandu, umístěny na led. Vzorky byly pipetovány na filtry Whatman GF/C a inkubovány po dobu 30 sekund. Filtry byly potom umístěny na sintrovou podložku s vakuem, promyty 10 ml pufru EcR40 a přeneseny do scintilačních lahviček. Po přidání 7 ml InstaGel Plus do každé lahvičky, byl obsah promíchán na vortexu a ponechán na při teplotě místnosti, dokud se filtry nestaly průsvitné. Ligand vázaný receptorem byl kvantifikován pomocí scintilačního měřiče radioaktivity TriCarb 2100TR.

Výsledky ukázané na obrázku 4 naznačují, že ke komplexu se vážou daleko větší množství ponasteronu A, než k samotným polypeptidům USP nebo EcR

9 9 9

99 ·9 · ··

9 9· * * • 9 · 9 9 9 • · 99 99 9«

Příklad 18: In vitro funkce chimerního ekdysonového receptorů L. čupřina a proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) L. čupřina Konstrukce plazmidu pSGLcUSP

Fragment dlouhý 2453 párů bází z 5'-konce klonu pLSP4 (příklad 11), obsahující nukleotidovou sekvenci kódující protein sdružený s EcR (USP polypeptid) L. čupřina, byl překlonován do EcoRI místa savčího expresního vektoru pGS5 (Stratagene), čímž byl připraven pSGLcUSP.

Konstrukce plazmidu pVPLcEcR

Plazmid pVPLcEcR byl konstruován následujícím způsobem.

Aby byl zkonstruován plazmid pMOD31, byl plazmid pNLV16 (dar od Dr. G. Muscata) štěpen Sall a Xbal a opět ligován za použití dvojřetězcového oligonukleotidového spojovníku, vytvořeného teplotní hybridizaci následujících komplementárních oligonukleotidů:

SPX5: 5 -TCGACATATAACTTCGCTGCAGATGCATCCGAGCTCT-3' (SEQ ID NO: 29);

XPS3: 5'-CTAGAGCTCGGATGCATCTGCAGCGAAGTTATATG-3'(SEQ ID NO: 30).

Doména A/B z pSGLcEcR byla z cDNA kódující EcR odstraněna štěpením pomocí restrikčních enzymů BamHI a Pstl, a na její místo byl ligován 263 párů bází dlouhý fragment Bglll/Pstl z plazmidu pMOD31, obsahující aktivační doménu VP16 (Triezenberg a kol., 1988), čímž byl zkonstruován plazmid pVPLcEcR. Plazmid pVPLcEcR tedy obsahuje nukleotidové sekvence kódující oblast vázající ligand z EcR polypeptidů L. čupřina, operativně spojené s aktivační doménou VP16.

Transfekce buněk CV1

Buňky CV1 byly současně transfekovány (i) plazmidem pSGLcUSP nebo nemodifikovaným plazmidem pSG5 v koncentracích 1 pg/ml; (ii) plazmidem pVPLcEcR nebo nemodifikovaným plazmidem pSG5 v koncentracích 0,2 pg/ml; (iii) CAT plazmidem zpravodajem p(EcRE)7-CAT (příklad 9) v koncentraci 1 pg/ml; a (iv) nezávislým LacZ plazmidem zpravodajem pPGKLacZ (příklad 9) v koncentraci 1 pg/ml, který byl použit jako kontrola účinnosti transfekce.

Při indukčních pokusech byl k buňkám 6 hodin po transfekci přidáván analog ekdysonu, 1 mM ponasteron A. V kontrolních pokusech bylo na buňky působeno pouze nosičem ethanolem.

• · ·· • « · · • · · • · ♦

Μ *4 • · · • · · · » ·· »· · · · · * ·

Aktivity CAT a β-galaktozidázy, přítomné v extraktech buněk, byly měřeny 48 hodin po transfekci tak, jak bylo popsáno dříve (Hannan a Hill, 1997). Variabilita mezi pokusy byla kontrolována tím, že úroveň CAT byla ve všech extraktech normalizována vzhledem k úrovni β-galaktozidázy.

Údaje uvedené na obrázku 5 naznačují, že protein sdružený s EcR (USP polypeptid) L. čupřina může interagovat s chimerním EcR polypeptidem L. čupřina a vytvořit v savčích buňkách transkripční faktor závislý na ekdysteroidu. Působení ekdysteroidu na buňky CV1, zvláště 1mM ponasteronu A, indukovalo výrazné úrovně exprese CAT genu zpravodaje, ve srovnání s indukcí exprese genu β-galaktozidázy, která ukazuje na účinnost transfekce. Pokud byly do buněk CV1 transfekovány oba plazmidy pSGLcUSP a pVPLcEcR, bylo dosaženo 73násobné indukce exprese CAT genu zpravodaje, vzhledem k dosažené expresi β-galaktozidázy (sloupec 8 na obrázku 5).

Naopak samotný plazmid pVPLcEcR indukoval pouze 4násobné zvýšení exprese CAT genu vzhledem k expresi β-galaktozidázy (sloupec 4 na obrázku 5). Předpokládá se, že tato nízká úroveň aktivity je způsobena tvorbou aktivního komplexu chimerního EcR polypeptidu L čupřina a endogenního RXR, přítomného v buňkách CV1.

Exprese CAT genu zpravodaje byla v nepřítomnosti vnějšího hormonu pozorována pouze na úrovni pozadí (sloupce 1, 3, 5 a 7 na obrázku 5), a v nepřítomnosti EcR polypeptidu L. čupřina nebyla pozorována žádná významná indukce exprese genu (sloupce 1, 2, 5 a 6 na obrázku 5).

Všeobecně tyto údaje podporují závěr, že zde popsaný klon cDNA kóduje celý neporušený protein sdružený s EcR (USP polypeptid) L. čupřina, který je funkční in vivo.

Příklad 19: In vivo funkce chimerního EcR polypeptidu ekdysonového receptoru M. persicae

Oba plazmidy pSGDM a pSGMD obsahují nukleotidové sekvence kódující chimerní EcR polypeptidy ekdysonového receptoru D. melanogaster a M. persicae. Zvláště plazmid pSGDM obsahuje chimerní cDNA sekvenci, která se skládá z nukleotidové sekvence kódující doménu A/B EcR polypeptidu D. melanogaster, ligovanou k nukleotidové sekvenci kódující DNA vazebnou doménu, doménu spojovníku a doménu vázající ligand v EcR polypeptidu M. persicae. Plazmid pSGMD obsahuje chimerní cDNA sekvenci, která se skládá z nukleotidové sekvence kódující doménu A/B »9 • · · · φ · »·· · » » · · · · • * · · »9 * · W *

EcR polypeptidů M. persicae, ligovanou k nukleotidové sekvenci kódující DNA vazebnou doménu, doménu spojovníku a doménu vázající ligand v EcR polypeptidů D. melanogaster.

Konstrukce plazmidu pSGDM cDNA kódující EcR polypeptid M. persicae v savčím expresním vektoru pSG5 (Stratagene) byla štěpena enzymem Sapl, který štěpí jedinečné restrikční místo velmi blízko u 3 -konce nukleotidové sekvence kódující A/B doménu proteinu (Vektorl). Byly syntetizovány dva oligonukleotidy A a B, které obsahují restrikční místa Sacll, EcoRI a BamHI, byly čištěny a teplotně hybridizovány, aby vytvořily dvouřetězcovou DNA (Linkerl), který má kohezní konce kompatibilní se Sapl:

A: 5'-TCCAGAACCGCGGARAGATATCTGGGATCCTC-3'(SEQ ID NO: 31); a B: 5'-GGAGAGGATCCCAGATATCTATCCGCGGTTCT-3'(SEQ ID NO: 32)

Linkerl byl ligován do Vektoru 1 a výsledný plazmid byl štěpen EcoRV, čímž byl připraven Vektor 2.

Fragment cDNA dlouhý 940 párů bází, kódující A/B doménu celého EcR polypeptidů D. melanogaster, byl izolován z plazmidu pSGDmEcR a ligován do EcoRV místa Vektoru 2, za použití spojovníku-primeru ze soupravy cDNA Synthesis Kit od Stratagene, čímž byl připraven Vektor 3. Sekvence cDNA kódující A/B doménu EcR polypeptidů M. persicae byla odstraněna z Vektoru 3 štěpením Sacll a zkrácený plazmid byl opětně ligován, čímž byl připraven plazmid pSGDM.

Konstrukce plazmidu pSGMD cDNA fragment EcoRI/BamHI dlouhý 2200 párů bází, kódující DNA vazebnou doménu a doménu vázající ligand v EcR polypeptidů D. melanogaster byl izolován z plazmidu pSGDmEcR, jeho konce byly doplněny a byl ligován do EcoRV místa Vektoru 2 (viz výše), čímž byl připraven Vektor 4. Sekvence cDNA kódující DNA vazebnou doménu a doménu vázající ligand v EcR polypeptidů M. persicae byla vyštěpena z Vektoru 4 štěpením pomocí BamHI a zkrácený plazmid byl opětně ligován, čímž byl připraven plazmid pSGMD.

Biologické testy

Plazmidy pSGDM a pSGMD obsahují DNA sekvence kódující celé funkční EcR polypeptidy, jak bylo ukázáno pomocí SDS/PAGE in vitro translačních produktů a pomocí testů biologické aktivity, provedených in vivo za použití buněk CHO následujícím způsobem:

1. Transfekce buněk CHO ···*

CHO buňky byly transfekovány směsí obsahující následující plazmidy:

(i) expresní plazmid vybraný ze skupiny zahrnující pSGDmEcR, pSGMpEcR, pSGDM, pSGMD a pSG5, přičemž každý plazmid byl v koncentraci 1 pg/ml; a (ii) CAT plazmid zpravodaj p(EcRE)₇-CAT v koncentraci 1 pg/ml Transfekované buňky byly inkubovány po dobu 2 dnů při teplotě 37 °C buď v přítomnosti nebo nepřítomnosti 10 pM Muristeronu A. V kontrolních vzorcích bez Muristeronu A bylo k buňkám přidáno rozpouštědlo ethanol. Aktivita enzymu CAT byla zjišťována pomocí testu ELISA.

Údaje uvedené v obrázku 6 ukazují, že modifikovaná podjednotka ekdysonového receptoru M. persicae je in vivo biologicky aktivní. EcR polypeptid M. persicae, který má doménu A/B pocházející z D. melanogaster, propůjčuje citlivost na ekdyson expresi CAT genu zpravodaje v buňkách CHO, který je pod kontrolou promotorové sekvence obsahující elementy hsp27 odpovědi na ekdyson D. melanogaster, které jsou v plazmidu p(EcRE)₇-CAT přítomné.

Příklad 20: Při současné expresi oblasti vázající ligand v EcR polypeptidu M. persicae a oblasti vázající ligand v proteinu sdruženém s EcR (USP polypeptid) L. čupřina je vytvářen aktivní heterodimerní komplex.

Vektor pro bakulovirem řízenou současnou expresi oblastí vázajících ligand, pocházejících z EcR proteinu a proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) ekdysonového receptoru Myzus persicae, byl připraven ve dvou krocích:

Zaprvé, cDNA kódující oblast spojovníku (doména D) a oblast vázající ligand, (domény E a F) v EcR polypeptidu M. persicae byla klonována do mnohočetného klonovacího místa plazmidu pLcUSP.SINGLE (příklad 15), přičemž byl operativně spojen se sekvencí polyhedrinového promotoru. Plazmid pLcUSP.SINGLE obsahuje cDNA kódující spojovník a doménu vázající ligand proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) L. čupřina, který byl operativně spojen se sekvencí promotoru p10. Aby toho bylo dosaženo, byl pLcUSP.SINGLE linearizován pomocí restrikčních enzymů BamHI a Hindlll a ligován k syntetickému spojovníku (tj. Linker 1), který byl konstruován teplotní hybridizací následujících oligonukleotidů:

Oligonukleotid A.

5-GATCCATGGGACACCATCACCATCACCATAGGCCTTCCGAACGCGGTGAATTCCGACA-3' (SEQ ID NO: 33) • · • · • · · · • « « · • · · · · · • · · · * • · · · · · • · · · · * ·· ·· · · · ·

Oligonukleotid Β:

5-AGCTTGTCGGAATTCACCGCGTTCGGAAGGCCTATGGTGATGGTGATGGTGTCCCATG-3' (SEQ ID NO: 34).

Linker 1 obsahuje BamHI a Hindlll kohezní konce pro usnadnění klonování, vnitřní restrikční místa Stul a EcoRI a nukleotidovou sekvenci kódující značku oligo-His.

Fragment cDNA dlouhý 1900 párů bází, kódující spojovník a doménu vázající ligand v ECR polypeptidů M. persicae, byl poté ligován do restrikčního místa Stul uvnitř sekvence Linkeru 1, čímž byl vytvořen plazmid pMpEcR. LcUSP. DUÁL, obsahující nukleotidové sekvence kódující označenou sekvenci Linkeru 1 a domény D, E a F EcR polypeptidů M. persicae a spojovník s doménou vázající ligand (tj. domény D/E/F) proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) L. čupřina, které byly umístěny pod operativní kontrolu polyhedrinového, respektive p10 promotoru.

Za druhé, plazmid pMpEcR. LcUSP. DUÁL byl štěpen Xmal a Kpnl, aby byla vystřižena sekvence kódující spojovník a doménu vázající ligand proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) L. čupřina, čímž byl připraven Vektor 1B.

Linker 2 byl konstruován teplotní hybridizací následujících oligonukleotidů: Oligonukleotid C:

-CCGGGATCTCGAGATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGCC-3' (SEQ ID NO:

35) ; a

Oligonukleotid d:

-CATGGGCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCATCTCGAGATC-3' (SEQ ID NO:

36) .

Linker 2 obsahuje konce kompatibilní s Xmal a Ncol a sekvenci kódující „FLAG“.

Linker 2 byl ligován do 1200 párů bází dlouhého DNA fragmentu Kpnl/Ncol ve Vektoru 1B, kódujícího spojovník a doménu vázající ligand v proteinu sdruženém s EcR (USP polypeptid) M. persicae, čímž byl vytvořen plazmid pMpEcR.USP.DUÁL, obsahující nukleotidové sekvence kódující označenou sekvenci spojovníku a domény D, E a F EcR polypeptidů M. persicae a spojovník s doménami vázajícími ligand proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) M. persicae, které byly umístěny pod operativní kontrolu polyhedrinového, respektive p10 promotoru.

Plazmidy pMpEcR. LcUSP. DUÁL a pMpEcR. USP.DUÁL byly sekvenovány, aby byla potvrzena přítomnost otevřených čtecích rámců.

Segment pMpEcR.LcUSP.DUÁL a pMpEcR.USP.DUÁL, kódující chimerní označené oblasti vázající ligand u polypeptidů receptoru, byly rekombinovány do • · • · · · • « • · • · · · genomu bakuloviru pomocí Tn7 transpozičního systému (Luckow a kol., 1993). Chimemí oblasti vázající ligand rekombinantních ekdysonových receptoru byly potom exprimovány ve hmyzích buňkách Sf9, kde se spojovaly do funkčních komplexů.

Exprese heterologního ekdysonového receptoru M. persicaelL. čupřina [tj. obsahujícího označený spojovník a domény D/E/F EcR polypeptidu M. persicae a spojovník a domény vázající ligand v proteinu sdruženém s EcR (USP polypeptid) L. čupřina], a exprese homologního ekdysonového receptoru M. persicae [tj. obsahujícího označený Linker 2 a domény a D/E/F EcR polypeptidu M. persicae a spojovník a domény vázající ligand v proteinu sdruženém s EcR (USP polypeptid) M. persicae], byly pro provedení kvantifikace testovány pomocí imunoblotové analýzy extraktů pocházejících z hmyzích buněk Sf9, infikovaných jednotlivými rekombinantními bakuloviry, za použití protilátek namířených proti značkám oligo-His a Flag. Touto analýzou byly detekovány zóny o velikostech předpověděných pro exprimované polypeptidy.

Dále vazebné testy, provedené pomocí modifikované metody Yund a kol., (1978) ukázaly v buňkách, infikovaných rekombinantními bakuloviry, vysoce významné zvýšení vazby tritiovaného ekdysonového analogu ponasteronu A (obrázek 7). Údaje uvedené na obrázku 7 naznačují, že došlo ke správnému prostorovému uspořádání a spojení složek jak heterologního, tak homologního zkráceného ekdysonového receptoru. Tyto údaje dále naznačují, že je možné produkovat funkční heterologní chimemí receptory, ve kterých jsou kombinovány oblasti vázající ligand v EcR polypeptidech a v proteinech sdružených s EcR, z různých druhů hmyzu. Takovétto chimemí receptory mají, ve srovnání s jejich přirozenými partnery, odlišné specifity pro ekdysteroidy.

Příklad 21: In vivo funkce heterodimemího receptoru obsahujícího chimemí EcR polypeptid M. persicae a rekombinantní protein sdružený s EcR (USP polypeptid) M. persicae

Aby byla testována funkce izolovaného klonu cDNA, kódujícího protein sdružený s EcR (USP polypeptid) M. persicae, testovali jsme schopnost exprimovaného polypeptidu doplnit chimemí EcR polypeptid M. persicae v buňkách CV1.

Stručně řečeno, buňky CV1 byly současně transfekovány následujícími konstrukty plazmidů:

(i) plazmid pBKMpUSPI, obsahující cDNA klon kódující M. persicae protein sdružený s EcR (USP polypeptid), operativně vázaný k CMV promotoru

9

9·· v pBK-CMV, při koncentraci 2 pg/ml; nebo alternativně negativní kontrolní genový konstrukt, plazmid pBSK+, při koncentraci 2 pg/ml; a (ii) plazmid pSGDM, obsahující chimerní cDNA sekvenci, která se skládá z nukleotidové sekvence kódující doménu a/B EcR polypeptidu D. melanogaster, ligovanou k nukleotidové sekvenci kódující DNA vazebnou doménu, spojovník a domény vázající ligand v EcR polypeptidu M. persicae (příklad 19), při koncentraci 1 pg/ml; a (iii) konstrukt CAT genu zpravodaje, plazmid p(EcRE)₇-CAT, obsahující CAT gen zpravodaj, umístěný pod operativní kontrolu promotorové sekvence obsahující mnohočetné kopie elementů citlivost k ekdysonu hsp27 D. melanogaster, které jsou v plazmidu přítomné, při koncentraci 1 pg/ml; a (iv) konstrukt β-galaktozidázového genu zpravodaje pro kontrolu účinnosti transfekce, označený jako plazmid pPopNLacZ, a popsaný v Hannan a kol., (1993), při koncentraci 0,5 pg/ml.

Pro indukci exprese CAT genu zpravodaje prostřednictvím chimemího rekombinantního ekdysonového receptorů, byl k buňkám 6 hodin po transfekci přidán 10 mM ponasteron A (dar od Dr. Denise Homa). V kontrolních pokusech bylo na buňky místo ponasteronu A působeno ethanolem. Enzymové aktivity CAT a β-galaktozidázy byly měřeny v buněčných extraktech 48 hodin po transfekci tak, jak bylo popsáno dříve (Hannan a Hill, 1997). Pro každý extrakt byla určena relativní úroveň poměru CAT/βgalaktozidáza, aby byl pokus normalizován vzhledem k variabilitě účinnosti transfekce mezi vzorky.

Údaje uvedené na obrázku 8 naznačují, že izolovaná cDNA kóduje funkční protein sdružený s EcR (USP polypeptid) M. persicae. Když byly buňky CV1 současně transfekovány pBKMpUSPI a pSGDM, byla pozorována 2,6násobná indukce relativní exprese CAT genu v přítomnosti 10 mM ponasteronu A, vzhledem k expresi pozorované při použití plazmidu pSGDM v nepřítomnosti pBKMpUSPI. Předpokládá se, že základní hladina exprese genu (pozadí), pozorovaná u buněk exprimujících plazmid pSGDM v nepřítomnosti pBKMpUSPI, je způsobena vytvářením aktivního komplexu mezi chimerním polypeptidem MpEcR a endogenními proteiny RXR, přítomnými v buňkách CV1. Indukce exprese CAT pomocí ponasteronu v buňkách transfekovaných oběma plazmidy pBKMpUSPI a pSGDM naznačuje, že exprimovaný protein sdružený s EcR (USP polypeptid) M. persicae může interagovat s chimerním EcR polypeptidem, a vytvářet v savčích buňkách transkripční faktor závislý na • · • · • · · · · · · · ··· ·· ·· · * ·· ·· ···· ekdysteroidu. Tyto údaje tedy naznačují, že exprimovány rekombinantní protein sdružený s EcR (USP polypeptid) M. persicae je in vivo funkční.

Příklad 22: Izolace a charakterizace cDNA kódující protein sdružený s EcR (USP polypeptid) ekdysonového receptorů Bemesia tabaci Konstrukce a prohledávání cDNA knihoven B. tabaci

Pomocí oligo-dT primerů byly připraveny dvě nezávislé cDNA knihovny B. tabaci, pocházející ze stadia červenooké nymfy tohoto druhu, a klonovány do EcoRI místa vektoru Lambda/Zapll (Stratagene). Titry obou připravených primárních knihoven byly 1,9x10⁶ pfu a 3,5x10⁶ pfu. Testy ukázaly, že rozsah délky inzertů v těchto knihovnách byl 700 až 7600 párů bází.

Vytvořené primární knihovny byly následně amplifikovány za pomoci standardních protokolů podle návodu výrobce, a bylo dosaženo konečných titrů 1,5x10⁹pfu/ml a 2,5x10⁹ pfu/ml.

Připravené cDNA knihovny byly prohledávány přenesením 500 000 plaků z každé amplifikované cDNA knihovny ve dvou exemplářích na membrány Hybond N (Amersham) a jejich hybridizací za málo striktních podmínek s radioaktivně značenými sondami, uvedenými dále. Přesněji řečeno, hybridizace byla prováděna přes noc při teplotě 37 °C v hybridizačním roztoku obsahujícím 42% (hmotnost/objem) formamid; 5x SSPE roztok; 5x Denhardtův roztok; a 0,1% (hmotnost/objem) dodecylsulfát sodný, v podstatě tak, jak bylo popsáno v Ausubel a kol., (1992) nebo Sambrook a kol., (1989). Membrány byly potom promyty při teplotě 37 °C v2x SSC roztoku obsahujícím 0,1% (hmotnost/objem) dodecylsulfát sodný. Po promývání byly pozitivní plaky detekovány autoradiografií pomocí filmu XOMAT-AR (Kodak) po dobu 2 až 3 dnů při teplotě -70 °C. Pozitivně hybridizující plaky byly plakově purifikovány, získány nazpět jako plazmidy, a jejich cDNA inzerty byly analyzovány určením sekvence nukleotidů.

Příprava hybridizační sondy

Podjednotka proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) ekdysonového receptorů B. tabaci také funguje v nepřítomnosti EcR polypeptidu jako USP polypeptid receptorů juvenilního hormonu B. tabaci.

Pro izolaci cDNA kódující obě aktivity receptorů, z cDNA knihovny B. tabaci, byla pomocí dvou degenerovaných primerů popsaných v Tzertzinis a kol., (1994) a v předcházejících příkladech, z genomové DNA B. tabaci amplifikována 140 párů bází dlouhá sonda. PCR reakce byla provedena za použití 1 jednotky Taql polymerázy • · • · · ·

4 • ·

(Boehringer Mannheim), 1 mM každého primeru v reakčním objemu 50 μΙ, v podstatě za podmínek doporučených výrobcem (Boehringer Mannheim).

Amplifikovaný DNA fragment byl překlonován do míst EcoRI a Clal linearizovaného vektoru pBluescript SK+ (Stratagene). Nukleotidové sekvence inzertu ve vektoru pBluescript SK+ byla získána pomocí automatického sekvenování s terminátory označenými fluorescenční barvičkou (Zařízení pro automatickou DNA analýzu při Univerzitě NSW, Sydney, Austrálie) a je zde uvedena jako SEQ ID NO: 37. Tento fragment kóduje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 38.

Pro přípravu hybridizační sondy pro prohledávání cDNA knihoven byla amplifikované DNA B. tabaci vyštěpena z vektoru pBluescript SK+ dvojitým štěpením pomocí enzymů EcoRI a Sall, izolována na agarózové elektroforéze a vyčištěna pomocí elektroeluce. DNA byla potom označena [³²P] pomocí soupravy GIGAprime DNA Labeing Kit (Bresatec Limited, Adelaide, Austrálie), v podstatě podle návodu výrobce, s výjimkou toho, že náhodné primery byly zaměněny za degenerované primery popsané vTzertzinis a kol., (1994). Neinkorporovaný radioaktivní materiál byl odstraněn vylučovací chromatografii na Biogel-P60 (Biorad Ltd., Sydney, Austrálie). Sonda byla použita tak, jak bylo zde výše popsáno v příkladech 7 a 8, pro prohledávání cDNA knihovny B. tabaci.

Pozitivně hybridizující klony byly plakově purifikovány, a sekvenovány pomocí zde popsaných standardních postupů.

Byla získána nukleotidové sekvence jednoho klonu a je zde uvedena jako SEQ ID NO: 39. Aminokyselinová sekvence proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) je uvedena v SEQ ID NO: 40.

Příklad 23: Klonování a charakterizování cDNA molekuly kódující EcR polypeptid ekdysonového receptoru B. tabaci Příprava hybridizační sondy

DNA fragment dlouhý 101 párů bází, kódující DNA vazebnou doménu podjednotky EcR polypeptidů ekdysonového receptoru B. tabaci, byl amplifikován z genomové DNA B. tabaci pomocí PCR za použití degenerovaných primerů Rdna3 (SEQ ID NO: 23) a Rdna4 (SEQ ID NO: 24), v podstatě tak, jak zde bylo výše popsáno. Stručně řečeno, v amplifikačních reakcích byla použita Taql polymeráza (Boehringer Mannheim) a následující amplifikační podmínky:

cykly 1 až 2: 97 °C po dobu 2 min.; 50 °C po dobu 1 min.; 72 °C po dobu 1 min.;

• · • · · · • · • · • > · · ♦

• Λ · · · ♦	·· · · ·«··
	75
cykly 3 až 30:	72 °C po dobu 7 min.; a
cyklus 44:	72 °C po dobu 7 min.
Amplifi kovaný fragment genu B. tabaci byl klonován do	pBluescript SK+

(Stratagene), potom následovalo štěpení pomocí enzymů EcoRI a BamHI, čištění štěpené DNA na agarózové gelové elektroforéze a nakonec čištění zóny produktu pomocí BresaClean (Bresatec), jak zde bylo výše popsáno.

Nukleotidová sekvence amplifikované hybridizační sondy byla získána pomocí automatického sekvenování s terminátory označenými fluorescenční barvičkou (Zařízení pro automatickou DNA analýzu při Univerzitě NSW, Sydney, Austrálie) a je zde uvedena jako SEQ ID NO: 41. Odvozená aminokyselinová sekvence tohoto fragmentu genu je uvedena v SEQ ID NO: 42. V aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO: 42 existuje 16 aminokyselin, které jsou konzervovány v aminokyselinové sekvenci proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) M. persicae, která je zde uvedena jako SEQ ID NO. 16 (srv. SEQ ID NO: 42 se zbytky 63 až 95 ze SEQ ID NO: 16), což naznačuje že amplifikovaná sonda kóduje část proteinu sdruženého s EcR (USP polypeptid) B. tabaci.

Pro přípravu sondy byl inzert z pBluescript SK+ vyštěpen pomocí EcoRI a BamHI, označen a použit pro prohledávání cDNA knihovny B. tabaci, jak bylo popsáno v předchozím příkladu.

• · a · • ·

ODKAZY

1. Amann and Brosius (1985).Gene 40: 183.

2. Ausubel, et al (1992), Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York

3. Bugg, et al (1993) Scientific American, December Issue: pp 60-66.

4. ' Cavener et al. (1987) Nud. Acids Res. 15:1353-136.

5. ₍Devereux, J„ et al. (1984). Nud. Acids Res. 12:387-395.

6. Evans (1988) Science, 240: 889-895.

7. Geysen et al (1987) J. Immunol Methods, 102. 259-274.

8. Greene eř al. (1988) Nucleic Acids Res. 15:369.

9. Hannan et al (1993) Gene 130 : 233-239

10. Hollenberd and Evans (1988) Ce//55: 899-906.

11. Hollenberg eř a/ (1991) Cell, 67, 59-77.

12. Jones, G and Sharp, P, (1997) Proč. Nat. Acad. Sci. USA 94:13499-13503.

13. Kamimura et al (1996) Comp. Biochem. Physiol. 113, 341-347.

14. Koelle eř a/(1991) Ce//, 67:59-77

15. Krust et al (1986) EMBO. J., 5: 891-897.

16. Luckow et al, (1993) J. Virol. 67: 4566.

17. McBurney et al (1991), Nucleic Acids Res., 19. 5755-5761.

18. McPherson, M.J., Quirke, P. and Taylor, G.R. (1991) PCR a Practical Approach. IRL Press, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom.

19. Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453.

20. Potrykus (1990) Bio/Technology 8: 535-542.

21. Riddihough, G., and Pelham, H. R. B„ (1987), EMBOJ., 6, 3729-3734

22. Sambrook et a/(1989), Molecular Cloning: a Laboratory Manual, CSH Lab. Press

23. Segraves and Hogness (1990) Genes Devel. 4: 204-219.

24. Shimatake and Rosenberg (1981) Nátuře 292: 128

25. Studier and Moffat (1986) J. Mol. Biol. 189:113

26. Thompson,et al., (1994) Nud. Acids Res. 22:4673-4680.

27. Tzertzinis eř al (1994) J. Mol. Biol, 258. 479-486.

28. Von Itzstein eř al (1993) Nátuře Vol. 363: 418-423.

29. Yund, eř al. (1978) Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 24: 6039-6043.

• ·

Popis k seznamu sekvencí

SEQ ID NO: 1: Nukleotidová sekvence otevřeného čtecího rámce cDNA molekuly, která kóduje podjednotku EcR polypeptidů ekdysonového receptorů L. čupřina a její aminokyselinová sekvence.

SEQ ID NO: 2: Aminokyselinová sekvence podjednotky EcR polypeptidů ekdysonového receptorů L čupřina.

SEQ ID NO: 3: Nukleotidová sekvence cDNA molekuly obsažené v plazmidu pBLU1, která kóduje podjednotku proteinu sdruženého s EcR polypeptidem (USP polypeptid) ekdysonového receptorů L. čupřina nebo která kóduje podjednotku USP polypeptidů receptorů juvenilního hormonu L. čupřina a její aminokyselinová sekvence.

SEQ ID NO: 4: Aminokyselinová sekvence podjednotky proteinu sdruženého s EcR polypeptidem (USP polypeptid) ekdysonového receptorů L. čupřina nebo aminokyselinová sekvence podjednotky USP polypeptidů receptorů juvenilního hormonu L čupřina, který je kódován SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 5. Nukleotidová sekvence cDNA molekuly z plazmidu pLSP5, která kóduje podjednotku proteinu sdruženého s EcR polypeptidem (USP polypeptid) ekdysonového receptorů L. čupřina nebo která kóduje podjednotku USP polypeptidů receptorů juvenilního hormonu L. čupřina a její aminokyselinová sekvence.

SEQ ID NO: 6: Aminokyselinová sekvence podjednotky proteinu sdruženého s EcR polypeptidem (USP polypeptid) ekdysonového receptorů L čupřina nebo aminokyselinová sekvence podjednotky USP polypeptidů receptorů juvenilního hormonu L. čupřina, který je kódován SEQ ID NO. 5.

SEQ ID NO: 7: Nukleotidová sekvence cDNA molekuly z plazmidu pLSP12, která kóduje podjednotku proteinu sdruženého s EcR polypeptidem (USP polypeptid) ekdysonového receptorů L. čupřina nebo která kóduje podjednotku USP polypeptidů receptorů juvenilního hormonu L. čupřina a její aminokyselinová sekvence.

SEQ ID NO: 8: Aminokyselinová sekvence podjednotky proteinu sdruženého s EcR polypeptidem (USP polypeptid) ekdysonového receptorů L. čupřina nebo aminokyselinová sekvence podjednotky USP polypeptidů receptorů juvenilního hormonu L. čupřina, který je kódován SEQ ID NO: 7.

SEQ ID NO: 9: Nukleotidové sekvence cDNA molekuly, která kóduje část podjednotky EcR polypeptidu ekdysonového receptorů M. persicae a její aminokyselinová sekvence.

SEQ ID NO: 10: Aminokyselinová sekvence části podjednotky EcR polypeptidu ekdysonového receptorů M. persicae.

SEQ ID NO: 11: Nukleotidové sekvence sondy EcR 1, která je specifická pro genové sekvence kódující podjednotku EcR polypeptidu ekdysonových receptorů mšic, zvláště podjednotky EcR polypeptidu ekdysonového receptorů M. persicae.

SEQ ID NO: 12: Nukleotidové sekvence sondy EcR 2, která je specifická pro genové sekvence kódující podjednotku EcR polypeptidu ekdysonových receptorů mšic, zvláště podjednotky EcR polypeptidu ekdysonového receptorů M. persicae.

SEQ ID NO: 13: Nukleotidové sekvence otevřeného čtecího rámce molekuly cDNA, která kóduje podjednotku EcR polypeptidu ekdysonového receptorů M. persicae a její aminokyselinová sekvence.

SEQ ID NO: 14: Aminokyselinová sekvence podjednotky EcR polypeptidu ekdysonového receptorů M. persicae.

SEQ ID NO: 15: Nukleotidové sekvence otevřeného čtecího rámce první molekuly cDNA, která kóduje podjednotku proteinu sdruženého s EcR polypeptidem (USP polypeptid) ekdysonového receptorů M. persicae nebo podjednotku USP polypeptidu receptorů juvenilního hormonu M. persicae a její aminokyselinová sekvence.

SEQ ID NO: 16: Aminokyselinová sekvence podjednotky proteinu sdruženého s EcR polypeptidem (USP polypeptid) ekdysonového receptorů M. persicae nebo aminokyselinová sekvence podjednotky USP polypeptidu receptorů juvenilního hormonu M. persicae, který je kódován SEQ ID NO: 15.

SEQ ID NO: 17: Nukleotidové sekvence otevřeného čtecího rámce druhé molekuly cDNA, která kóduje podjednotku proteinu sdruženého s EcR polypeptidem (USP polypeptid) ekdysonového receptorů M. persicae • · ·

• · • 999 nebo podjednotku USP polypeptidu receptoru juvenilního hormonu M.

persicae a její aminokyselinová sekvence.

SEQ ID NO: 18: Aminokyselinová sekvence podjednotky proteinu sdruženého s EcR polypeptidem (USP polypeptid) ekdysonového receptoru M. persicae nebo aminokyselinová sekvence podjednotky USP polypeptidu receptoru juvenilního hormonu M. persicae, který je kódován SEQ ID NO: 17.

SEQ ID NO: 19: Nukleotidová sekvence otevřeného čtecího rámce třetí molekuly cDNA, která kóduje podjednotku proteinu sdruženého s EcR polypeptidem (USP polypeptid) ekdysonového receptoru M. persicae nebo podjednotku USP polypeptidu receptoru juvenilního hormonu M. persicae a její aminokyselinová sekvence.

SEQ ID NO: 20: Aminokyselinová sekvence podjednotky proteinu sdruženého s EcR polypeptidem (USP polypeptid) ekdysonového receptoru M. persicae nebo aminokyselinová sekvence podjednotky USP polypeptidu receptoru juvenilního hormonu M. persicae, který je kódován SEQ ID NO: 19.

SEQ ID NO: 21: Nukleotidová sekvence sondy dlouhé 150 párů bází, která je specifická pro genové sekvence kódující podjednotku proteinu sdruženého s EcR polypeptidem (USP polypeptid) ekdysonového receptoru L. čupřina nebo podjednotku USP polypeptidu receptoru juvenilního hormonu L. čupřina a její aminokyselinová sekvence.

SEQ ID NO: 22: Aminokyselinová sekvence kódovaná nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 21, obsahující aminokyselinové zbytky 108 až 149 podjednotky proteinu sdruženého s EcR polypeptidem (USP polypeptid) ekdysonového receptoru L. čupřina nebo aminokyselinové zbytky 108 až 149 z aminokyselinové sekvence podjednotky USP polypeptidu receptoru juvenilního hormonu L. čupřina, uvedené zde jako SEQ ID NO: 4.

SEQ ID NO: 23: Nukleotidová sekvence degenerovaného primeru Rdna3.

SEQ ID NO: 24: Nukleotidová sekvence degenerovaného primeru Rdna4.

SEQ ID NO: 25: Nukleotidová sekvence primeru Mdnal.

SEQ ID NO: 26: Nukleotidová sekvence primeru Mdna2.

SEQ ID NO: 27: Nukleotidová sekvence primeru AP1.

• ·

SEQ ID NO: 28: Nukleotidové sekvence degenerovaného primerů AP2.

SEQ ID NO: 29: Sekvence oligonukleotidu SPX5, použitého pro konstruování plazmidu pVPLcEcR.

SEQ ID NO: 30: Sekvence oligonukleotidu XPS5, použitého pro konstruování plazmidu pVPLcEcR.

SEQ ID NO: 31: Nukleotidové sekvence oligonukleotidu A, použitého pro konstruování plazmidu pSGDM.

SEQ ID NO: 32: Nukleotidové sekvence oligonukleotidu B, použitého pro konstruování plazmidu pSGDM.

SEQ ID NO: 33: Sekvence oligonukleotidu A, použitého pro konstruování expresního plazmidu pMpEcP.LcUSP.DUAL.

SEQ ID NO: 34: Sekvence oligonukleotidu B, použitého pro konstruování expresního plazmidu pMpEcP.LcUSP.DUAL.

SEQ ID NO: 35: Sekvence oligonukleotidu C, použitého pro konstruování expresního plazmidu pMpEcP.USP.DUÁL.

SEQ ID NO: 36: Sekvence oligonukleotidu D, použitého pro konstruování expresního plazmidu pMpEcP.USP.DUAL.

SEQ ID NO: 37: Nukleotidové sekvence sondy, která je specifická pro genové sekvence kódující podjednotku proteinu sdruženého s EcR polypeptidem (USP polypeptid) ekdysonového receptorů B. tabaci nebo pro podjednotku USP polypeptidu receptorů juvenilního hormonu B. tabaci a její aminokyselinová sekvence.

SEQ ID NO: 38: Aminokyselinová sekvence kódovaná nukleotídovou sekvencí SEQ ID NO: 37.

SEQ ID NO: 39: Nukleotidové sekvence otevřeného čtecího rámce molekuly cDNA, která kóduje podjednotku proteinu sdruženého s EcR polypeptidem (USP polypeptid) ekdysonového receptorů B. tabaci nebo podjednotku USP polypeptidu receptorů juvenilního hormonu B. tabaci, a její aminokyselinová sekvence.

SEQ ID NO: 40: Aminokyselinová sekvence podjednotky proteinu sdruženého s EcR polypeptidem (USP polypeptid) ekdysonového receptorů B. tabaci nebo aminokyselinová sekvence podjednotky USP polypeptidu receptorů juvenilního hormonu B. tabaci, který je kódován SEQ ID NO: 39.

SEQ ID NO: 41: Nukleotidové sekvence sondy, která je specifická pro genové sekvence kódující podjednotku EcR polypeptidů ekdysonového receptoru β. tabad, a její aminokyselinová sekvence.

SEQ ID NO: 42: Aminokyselinová sekvence kódovaná nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 37.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaná molekula nukleové kyseliny, kódující člena ze skupiny zahrnující:

a) protein sdružený s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) nebo polypeptid receptoru juvenilního hormonu L. čupřina, uvedený v SEQ ID NO. 4 nebo SEQ ID NO: 6 nebo SEQ ID NO: 8;

b) sekvence proteinu sdruženého s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) nebo sekvence polypeptidů receptoru juvenilního hormonu, kódovaná DNA L. čupřina, která je obsažena v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 99/04 565;

c) EcR polypeptid ekdysteroidového receptoru M. persicae, uvedený v SEQ ID NO: 14;

d) sekvence EcR polypeptidů ekdysteroidového receptoru M. persicae, kódovaná DNA M. persicae, která je obsažena v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 99/04 567;

e) sekvence proteinu sdruženého s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) nebo sekvence polypeptidů receptoru juvenilního hormonu, uvedená v SEQ ID NO: 16 nebo SEQ ID NO: 18 nebo SEQ ID NO: 20;

f) sekvence proteinu sdruženého s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) nebo sekvence polypeptidů receptoru juvenilního hormonu, kódovaná DNA M. persicae, která je obsažena v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 99/04 568 nebo AGAL přístupovým číslem NM 00/12 581;

g) hmyzí protein sdružený s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) nebo polypeptid receptoru juvenilního hormonu, který má alespoň 90% shodu s fragmentem proteinu sdruženého s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) B. tabaci, který je uveden v SEQ ID NO: 38, nebo alespoň 80% shodu s proteinem sdruženým s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) B. tabaci, který je uveden v SEQ ID NO: 40,

h) hmyzí protein sdružený s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) nebo polypeptid receptoru juvenilního hormonu, který má alespoň 80% shodu se sekvencí proteinu sdruženého s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) B. tabaci, který je kódován DNA B. tabaci, obsaženou v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 00/12 580;

• ·· ·

i) protein sdružený s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) B. tabaci nebo polypeptid receptoru juvenilního hormonu B. tabaci, který je kódován nukleovou kyselinou, schopnou hybridizovat za alespoň mírných striktních podmínek s DNA B. tabaci, obsaženou v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 00/12 580;

j) EcR polypeptid ekdysteroidového receptoru B. tabaci, obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 42;

k) EcR polypeptid ekdysteroidového receptoru B. tabaci, který je kódován nukleovou kyselinou, schopnou hybridizovat za alespoň mírných striktních podmínek se sekvencí komplementární k SEQ ID NO: 41;

l) aminokyselinová sekvence obsahující oblast vázající ligand v kterémkoli z bodů

i) až xi), přičemž uvedená oblast vázající ligand obsahuje alespoň doménu vázající hormon a/nebo část domény spojovníku z kteréhokoli z bodů i) až xi); a

m) fúzní polypeptid mezi oblastí vázající ligand u ekdysteroidového EcR polypeptidů a oblastí vázající ligand u proteinu sdruženého s ekdysteroidem (USP polypeptid), kdy alespoň jedna z uvedených oblastí vázajících ligand obsahuje alespoň doménu vázající hormon a/nebo část domény spojovníku z kteréhokoli z bodů i) až xi).
2. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, kde oblast vázající ligand obsahuje doménu spojovníku uvedeného EcR polypeptidů nebo proteinu sdruženého (USP polypeptid).
3. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, kde oblast vázající ligand obsahuje doménu vázající hormon uvedeného EcR polypeptidů nebo proteinu sdruženého (USP polypeptid).
4. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, kde oblast vázající ligand obsahuje alespoň část domény spojovníku a celou doménu vázající hormon uvedeného EcR polypeptidů nebo proteinu sdruženého (USP polypeptid).
5. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, kde oblast vázající ligand je oblast vázající ligand z EcR polypeptidů ekdysteroidového receptoru M. persicae se SEQ ID NO. 14.
6. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, kde oblast vázající ligand je oblast vázající ligand z EcR polypeptidu ekdysteroidového receptorů B. tabaci, přičemž uvedený EcR polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 42 neboje kódován nukleovou kyselinou, která hybridizuje za alespoň mírně striktních podmínek se sekvenci komplementární k SEQ ID NO: 41,
7. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, kde oblast vázající ligand je oblast vázající ligand ze sdruženého proteinu ekdysteroidového receptorů L. čupřina (USP polypeptid), obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: 8.
8. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, kde oblast vázající ligand je oblast vázající ligand ze sdruženého proteinu ekdysteroidového receptorů B. tabaci (USP polypeptid), obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 40.
9. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, kde oblast vázající ligand je oblast vázající ligand ze sdruženého proteinu ekdysteroidového receptorů M. persicae (USP polypeptid), uvedená v SEQ ID NO: 16.
10. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, kde oblast vázající ligand je oblast vázající ligand ze sdruženého proteinu ekdysteroidového receptorů M. persicae (USP polypeptid), uvedená v SEQ ID NO: 18.
11. Izolovaná molekula nukleové kyseliny obsahující sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, sekvenci DNA L. čupřina, která je obsažena v plazmidů uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 99/04 565, sekvenci DNA M. persicae, která je obsažena v plazmidů uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 99/04 567, sekvenci DNA M. persicae, která je obsažena v plazmidů uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 99/04 568, sekvenci DNA M. persicae, která je obsažena v plazmidů uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 00/12 581, sekvenci DNA B. tabaci, která je obsažena vplazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 00/12 580, sekvenci, která má alespoň 80% shodu se SEQ ID NO: 37, sekvenci, která má alespoň 60% shodu se SEQ ID NO: 39, sekvenci, která má alespoň 90% shodu se SEQ ID NO: 41, sekvenci, která má alespoň 80% shodu s DNA B. tabacai, která je obsažena vplazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 00/12 580, a sekvenci B. tabacai, která hybridizuje za mírně striktních podmínek s DNA B. tabacai, která je obsažena v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 00/12 580 nebo se sekvencí komplementární k SEQ ID NO: 37 nebo SEQ ID NO: 39 nebo SEQ ID NO: 41.
12. Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující sdružený protein ekdysteroidového receptorů (USP polypeptid) nebo polypeptid receptorů juvenilního hormonu nebo ligand vázající oblast uvedeného polypeptidu, přičemž uvedená nukleová kyselina obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující:

i) sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 5 nebo SEQ ID NO: 7; a ii) sekvenci DNA L. čupřina, která je obsažena v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 99/04 565.
13. Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující EcR polypeptid ekdysteroidového receptorů M. persicae nebo ligand vázající oblast uvedeného polypeptidu, přičemž uvedená nukleová kyselina obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující:

i) sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 13; a ii) sekvenci DNA M. persicae, která je obsažena v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 99/04 567.
14. Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující protein sdružený s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) M. persicae nebo polypeptid receptorů juvenilního hormonu nebo ligand vázající oblast uvedeného polypeptidu, přičemž uvedená nukleová kyselina obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující:

i) sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 15 nebo SEQ ID NO: 17 nebo SEQ ID NO: 19; a • 4 ·· · ·· · • · ii) sekvenci DNA M. persicae, která je obsažena v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 99/04 568 nebo AGAL přístupovým číslem NM 00/12 581.
15. Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující protein sdružený s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) B. tabacai nebo receptor juvenilního hormonu nebo ligand vázající oblast uvedeného polypeptidu, přičemž uvedená nukleová kyselina obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující:

i) sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 37 nebo SEQ ID NO: 39; a ii) sekvenci DNA B. tabacai, která je obsažena v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 00/12 580.
16. Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující EcR polypeptid ekdysteroidového receptoru B. tabacai nebo ligand vázající oblast uvedeného polypeptidu, přičemž tato nukleová kyselina obsahuje sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 41.
17. Způsob zjišťování nukleové kyseliny kódující polypeptid hmyzího ekdysteroidového receptoru, v y z n a č u j í c í se t í m, ž e se skládá z kroků:

i) hybridizace genomové DNA, mRNA nebo cDNA hmyzu s hybridizačně účinným množstvím jedné nebo více hybridizačních sond vybraných ze skupiny zahrnující.

a) sondu obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů z nukleotidové sekvence, vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 41;

b) sondu obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů z cDNA obsažené v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 00/12 580;

c) sondu obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů ze zbytků 1 až 450 ze SEQ ID NO: 13; a

d) sondu obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů ze SEQ ID NO: 15 nebo SEQ ID NO: 17 nebo SEQ ID NO: 19, která nezahrnuje nukleotidy 192 až 323 ze SEQ ID NO: 15; a

e) sondu která je sekvenčně komplementární k jakékoli sekvenci uvedené v bodech a) až d); a • 44 4

i) detekování hybridizace.
18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že krok detekování hybridizace zahrnuje detekování molekuly zpravodaje, který je kovalentně vázán k sondě.
19. Způsob zjišťování nukleové kyseliny kódující polypeptid hmyzího ekdysteroidového receptoru, vyznačující se tím, že se skládá z kroků:

i) teplotní hybridizace ke genomové DNA, mRNA nebo cDNA jednoho nebo více PCR primerů vybraných ze skupiny zahrnující:

a) primer obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů z nukleotidové sekvence, vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO. 39 a SEQ ID NO. 41,

b) primer obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů z cDNA obsažené v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 00/12 580;

c) primer obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů ze zbytků 1 až 450 ze SEQ ID NO: 13; a

d) primer obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů ze SEQ ID NO: 15 nebo SEQ ID NO: 17 nebo SEQ ID NO: 19, který nezahrnuje nukleotidy 192 až 323 ze SEQ ID NO: 15; a

e) primer který je sekvenčně komplementární k jakémukoli primeru uvedenému v bodech a) až d); a ii) amplifikace nukleotidové sekvence, která kóduje polypeptid receptoru steroidu nebo polypeptidů receptor juvenilního hormonu pomocí polymerázové řetězové reakce.
20. Způsob zjišťování nukleové kyseliny kódující polypeptid hmyzího receptoru steroidu nebo polypeptidů receptoru juvenilního hormonu, vyznačující se tím, že se skládá z kroků:

i) amplifikace nukleové kyseliny pomocí jednoho nebo více PCR primerů vybraných ze skupiny zahrnující:

9 * 9 99 9

9 * ttt ti I « · » · · · »

a) primer obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů z nukleotidové sekvence, vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 41;

b) primer obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů z cDNA obsažené v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 00/12 580;

c) primer obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů ze zbytků 1 až 450 ze SEQ ID NO: 13; a

d) primer obsahující alespoň 10 po sobě následujících nukleotidů ze SEQ ID NO. 15 nebo SEQ ID NO: 17 nebo SEQ ID NO: 19, který nezahrnuje nukleotidy 192 až 323 ze SEQ ID NO: 15; a ii) hybridizace amplifikované nukleové kyseliny s genomovou DNA, mRNA nebo cDNA hmyzu; a iii) detekování hybridizace.
21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že detekování hybridizace zahrnuje detekování molekuly zpravodaje, který je kovalentně vázán k amplifikované nukleové kyselině.
22. Způsob podle kteréhokoli z nároků 17 až 21, vyznačující se tím, že dále obsahuje izolaci zjištěné molekuly nukleové kyseliny.
23. Genový konstrukt, vyznačující se tím, že obsahuje izolovanou molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 1 až 16, operativně vázanou k sekvenci promotoru.
24. Genový konstrukt podle nároku 23, vyznačující se tím, že promotor je vybrán ze skupiny zahrnující SV40 promotor, polyhedrinový promotor a promotor p10.
25. Rekombinantní nebo izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující:

« · · * 4 • · • · · · ···· B · * ·· »· ·· «· ···**·

i) sekvence proteinu sdruženého s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) nebo polypeptidu receptorů juvenilního hormonu L. čupřina, uvedená v SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 6 nebo SEQ ID NO: 8;

ii) sekvence proteinu sdruženého s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) nebo polypeptidu receptorů juvenilního hormonu, kódovaná DNA L. čupřina, která je obsažena v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 99/04 565;

iii) sekvence EcR polypeptidu ekdysteroidového receptorů M. persicae, uvedená v SEQ ID NO: 14;

iv) sekvence EcR polypeptidu ekdysteroidového receptorů M. persicae, kódovaná DNA M. persicae, která je obsažena v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 99/04 567;

v) sekvence M. persicae proteinu sdruženého s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) nebo polypeptidu receptorů juvenilního hormonu, uvedená v SEQ ID NO: 16 nebo SEQ ID NO: 18 nebo SEQ ID NO: 20;

vi) sekvence M. persicae proteinu sdruženého s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) nebo polypeptidu receptorů juvenilního hormonu, kódovaná DNA M. persicae, která je obsažena v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 99/04 568 nebo AGAL přístupovým číslem NM 00/12 581;

vii) sekvence polypeptidu hmyzího proteinu sdruženého s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) nebo polypeptidová sekvence receptorů juvenilního hormonu, která má alespoň 90% shodu s proteinem sdruženým s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) B. tabacai, který je uveden v SEQ ID NO: 38, nebo alespoň 80% shodu s proteinem sdruženým s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) B. tabacai, který je uveden v SEQ ID NO: 40;

viii) polypeptid hmyzího proteinu sdruženého s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) nebo polypeptid receptorů juvenilního hormonu, který má alespoň 80% shodu se sekvencí proteinu sdruženého s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) B. tabacai, která je kódována DNA B. tabacai, obsaženou v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 00/12 580;

ix) protein sdružený s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) B. tabacai nebo polypeptid receptorů juvenilního hormonu B. tabacai, který je kódován

0·> ··· · »· ·*·*

DNA schopnou hybridizovat za alespoň mírných striktních podmínek s DNA B.

tabacai, obsaženou v plazmidů uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM

00/12 580;

x) EcR polypeptid ekdysteroidového receptorů B. tabacai, obsahující sekvenci B. tabacai uvedenou v SEQ ID NO: 42, xi) EcR polypeptid ekdysteroidového receptorů B. tabacai kódovaný nukleovou kyselinou, která je schopna hybridizovat za alespoň mírných striktních podmínek se sekvencí komplementární k SEQ ID NO: 41;

xii) oblast vázající ligand v kterémkoli z bodů i) až xi), přičemž uvedená oblast vázající ligand obsahuje alespoň doménu vázající hormon a/nebo část domény spojovníku z kteréhokoli z bodů i) ažxi); a xiii) fúzní polypeptid mezi oblastí vázající ligand v EcR polypeptidu ekdysteroidu a oblastí vázající ligand v proteinu sdruženého s ekdysteroidem (USP polypeptid), kdy alespoň jedna z uvedených oblastí vázajících ligand obsahuje alespoň doménu vázající hormon a/nebo část domény spojovníku z kteréhokoli z bodů i) až xi).
26. Izolovaný nebo rekombinantní polypeptid podle nároku 25, přičemž ligand vázající oblast obsahuje doménu spojovníku uvedeného EcR polypeptidu nebo sdruženého proteinu (USP polypeptid).
27. Izolovaný nebo rekombinantní polypeptid podle nároku 25, přičemž ligand vázající oblast obsahuje doménu vázající hormon uvedeného EcR polypeptidu nebo sdruženého proteinu (USP polypeptid).
28. Izolovaný nebo rekombinantní polypeptid podle nároku 25, přičemž ligand vázající oblast obsahuje alespoň část domény spojovníku a celou doménu vázající hormon uvedeného EcR polypeptidu nebo sdruženého proteinu (USP polypeptid).
29. Izolovaný nebo rekombinantní polypeptid podle kteréhokoli z nároků 25 až 28, přičemž ligand vázající oblast je ligand vázající oblastí EcR polypeptidu ekdysteroidového receptorů M. persicae, který má SEQ ID NO: 14.

• · • · • · « ·
30. Izolovaný nebo rekombinantní polypeptid podle kteréhokoli z nároků 25 až 28, přičemž ligand vázající oblast je ligand vázající oblastí EcR polypeptidu ekdysteroidového receptoru B. tabacai, obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 42 nebo kódovaná nukleovou kyselinou, která hybridizuje za alespoň mírně striktních podmínek se sekvencí komplementární k SEQ ID NO: 41.
31. Izolovaný nebo rekombinantní polypeptid podle kteréhokoli z nároků 25 až 28, přičemž ligand vázající oblast je ligand vázající oblastí proteinu sdruženého s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) L. čupřina, obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: 8.
32. Izolovaný nebo rekombinantní polypeptid podle kteréhokoli z nároků 25 až 28, přičemž ligand vázající oblast je ligand vázající oblastí proteinu sdruženého s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) B. tabacai, obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 40.
33. Izolovaný nebo rekombinantní polypeptid podle kteréhokoli z nároků 25 až 28, přičemž ligand vázající oblast je ligand vázající oblastí proteinu sdruženého s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) M. persicae, uvedená v SEQ ID NO: 16.
34. Izolovaný nebo rekombinantní polypeptid podle kteréhokoli z nároků 25 až 28, přičemž ligand vázající oblast je ligand vázající oblastí proteinu sdruženého s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) M. persicae, uvedená v SEQ ID NO: 18.
35. Rekombinantní nebo izolovaný protein sdružený s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) L. čupřina nebo polypeptid receptoru juvenilního hormonu nebo ligand vázající oblast uvedeného polypeptidu, obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující:

i) sekvence uvedená v SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 6 nebo SEQ ID NO: 8;

ii) sekvence oblasti vázající ligand z bodu i); a • · · · • · iii) sekvence kódovaná DNA L. čupřina, která je obsažena v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 99/04 565.
36. Rekombinantní nebo izolovaný ekdysteroidový EcR polypeptid nebo ligand vázající oblast uvedeného polypeptidu, obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující:

i) sekvence uvedená v SEQ ID NO: 14;

ii) sekvence oblasti vázající ligand z bodu i); a iii) sekvence kódovaná DNA M. persicae, která je obsažena v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 99/04 567.
37. Rekombinantní nebo izolovaný protein sdružený s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) M. persicae nebo polypeptid receptoru juvenilního hormonu nebo ligand vázající oblast uvedeného polypeptidu, obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující:

i) sekvence uvedená v SEQ ID NO: 16 nebo SEQ ID NO: 18 nebo SEQ ID NO: 20;

ii) sekvence oblasti vázající ligand z bodu i); a iii) sekvence kódovaná DNA M. persicae, která je obsažena v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 99/04 568 nebo AGAL přístupovým číslem NM 00/12 581.
38. Rekombinantní nebo izolovaný protein sdružený s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) B. tabacai nebo polypeptid receptoru juvenilního hormonu nebo ligand vázající oblast uvedeného polypeptidu, obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující:

i) sekvence uvedená v SEQ ID NO: 40;

ii) sekvence oblasti vázající ligand z bodu i); a iii) sekvence kódovaná DNA B. tabacai, která je obsažena v plazmidu uloženém pod AGAL přístupovým číslem NM 00/12 580.
39. Rekombinantní nebo izolovaný EcR polypeptid ekdysteroidového receptoru B. tabacai nebo ligand vázající oblast uvedeného polypeptidu, obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující:

• · • φ * · φ » · ·

i) sekvence obsahující sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 42; a ii) sekvence oblasti vázající ligand z bodu i).
40. Buňka vyznačující se tím, že obsahuje izolovanou molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 1 až 16 nebo genový konstrukt podle nároků 23 nebo 24.
41. Buňka podle nároku 40, vyznačující se tím, že je prokaryotickou nebo eukaryotickou buňkou.
42. Buňka podle nároku 41, vyznačující se tím, že eukaryotická buňka je hmyzí nebo savčí buňka.
43. Buňka podle nároku 42, vyznačující se tím, že hmyzem je Spodoptera frugiperda nebo savčí buňkou je buňka CHO.
44. Buňka vyznačující se tím, že exprimuje izolovaný nebo rekombinantní polypeptid podle kteréhokoli z nároků 25 až 39.
45. Buňka podle nároku 44, vyznačující se tím, že je hmyzí buňkou nebo savčí buňkou.
46. Buňka podle nároku 45, v y z n a č u j í c í se t í m, ž e je hmyzí buňkou pocházející ze Spodoptera frugiperda nebo je savčí buňkou CHO.
47. Způsob zjišťování modulátoru genové exprese zprostředkované receptorem steroidu nebo genové exprese zprostředkované receptorem juvenilního hormonu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

i) testování exprese genu zpravodaje v přítomnosti rekombinantního nebo izolovaného polypeptidů podle kteréhokoli z nároků 25 až 39 a potenciálního modulátoru;

ii) testování exprese genu zpravodaje v přítomnosti rekombinantního nebo izolovaného polypeptidů podle kteréhokoli z nároků 25 až 39 ale bez uvedeného potenciálního modulátoru; a • · • · • · • · « · • · · · • · · « • · · • · · • · · « · « · · · iii) porovnání exprese genu zpravodaje v bodech i) a ii), přičemž exprese uvedeného genu zpravodaje je ovlivněna vázáním uvedeného polypeptidů na element citlivosti ke steroidnímu hormonu (SRE) nebo na promotorovou sekvenci obsahující uvedený SRE, a kde odlišné hladiny exprese v bodě iii) naznačují, že uvedený potenciální modulátor je modulátorem genové exprese zprostředkované receptorem steroidu.
48. Způsob podle nároku 47, vyznačující se tím, že SRE je hsp27 element citlivosti k ekdysonu nebo jeho 13 párů bází dlouhý centrální palindrom.
49. Způsob podle nároku 47, vyznačující se tím, že promotorem je SV40 promotor, MMTV promotor, p10 promotor nebo polyhedrinový promotor.
50. Způsob podle kteréhokoli z nároků 47 až 49, vy z n a č u j i c i se t i m, ž e gen zpravodaj je CAT gen nebo β-galaktozidázový gen.
51. Způsob podle nároku 47, vyznačující se tím, že modulátor genové exprese zprostředkované receptorem steroidu nebo genové exprese zprostředkované receptorem hormonu je antagonista receptorů steroidu nebo antagonista receptorů juvenilního hormonu.
52. Způsob podle nároku 47, vyznačující se tím, že modulátor genové exprese zprostředkované receptorem steroidu nebo genové exprese zprostředkované receptorem hormonu je agonista receptorů steroidu nebo agonista receptorů juvenilního hormonu.
53. Způsob podle nároků 51 nebo 52, vyznačující se tím, že agonista nebo antagonista je syntetická chemikálie, která napodobuje strukturu ligandu uvedeného receptorů, čímž moduluje vazbu ligandu k receptorů.
54. Způsob podle nároku 53, vyznačující se tím, že syntetická chemikálie je insekticid bisacylhydrazin, iridoidglykosid nebo jiný nesteroidní modulátor ekdysteroidového receptorů nebo receptorů juvenilního hormonu.

• · « · « · « · • # • ·
55. Způsob zjišťování potenciální insekticidní sloučeniny, vyznačující se tím, ž e zahrnuje kroky:

i) přímé nebo nepřímé testování vazby rekombinantního nebo izolovaného polypeptidu podle kteréhokoli z nároků 25 až 39 k elementu citlivosti ke steroidu (SRE), k němuž se uvedený polypeptid váže, v přítomnosti kandidátní sloučeniny;

ii) přímé nebo nepřímé testování vazby rekombinantního nebo izolovaného polypeptidu podle kteréhokoli z nároků 25 až 39 k elementu citlivosti ke steroidu (SRE), k němuž se uvedený polypeptid váže, v nepřítomnosti kandidátní sloučeniny; a iii) porovnání vazby testované v bodech i) a ii), přičemž rozdíl v úrovni vazby naznačuje, že kandidátní sloučenina vykazuje potenciální insekticidní aktivitu.
56. Způsob podle nároku 55, vyznačující se tím, že vazba je testována nepřímo zjišťováním úrovně exprese genu zpravodaje, který je umístěn pod operativní kontrolu elementu citlivosti ke steroidu (SRE), k němuž se izolovaný nebo rekombinantní polypeptid váže nebo pod operativní kontrolu promotorové sekvence, obsahující uvedený SRE.
57. Způsob podle nároku 56, vyznačující se tím, že SRE je hsp27 element citlivosti k ekdysonu nebo jeho 13 párů bází dlouhý centrální palindrom.
58. Způsob podle nároku 56, vyznačující se tím, že promotorem je SV40 promotor, MMTV promotor, p10 promotor nebo polyhedrinový promotor.
59. Způsob podle kteréhokoli z nároků 56 až 58, vyznačující se tím, že gen zpravodaj je CAT gen nebo β-galaktozidázový gen.
60. Způsob podle kteréhokoli z nároků 55 až 59, vyznačující se tím, že potenciálně insekticidní sloučeninou je antagonista hmyzího receptoru steroidu nebo antagonista hmyzího receptoru juvenilního hormonu.

• · « · a ·
61. Způsob podle kteréhokoli z nároků 55 až 59, vyznačující se tím, že potenciálně insekticidní sloučeninou je agonista hmyzího receptoru steroidu nebo agonista hmyzího receptoru juvenilního hormonu.
62. Způsob podle nároků 60 nebo 61, vyznačující se tím, že agonista nebo antagonista je syntetická chemikálie, která napodobuje strukturu ligandu hmyzího receptoru steroidu nebo receptoru juvenilního hormonu, čímž moduluje vazbu uvedeného ligandu k receptoru.
63. Způsob podle nároku 62, v y zn a č u j í c í se t í m, ž e syntetická chemikálie je insekticid bisacylhydrazin, iridoidglykosid nebo jiný nesteroidní modulátor hmyzího ekdysteroidového receptoru nebo hmyzího receptoru juvenilního hormonu.
64. Způsob zjišťování kandidáta na insekticidně aktivní sloučeninu, vyznačující se t í m, ž e zahrnuje kroky.

i) exprese rekombinantního nebo izolovaného polypeptidů podle nároku 25, přičemž uvedený polypeptid je EcR polypeptid nebo oblast vázající ligand, obsahující alespoň doménu vázající hormon a část domény spojovníku uvedeného EcR polypeptidů, volitelně ve spojení se sdruženým proteinem (USP polypeptid) hmyzího ekdysteroidového receptoru nebo jeho oblastí vázající ligand, takže tvoří funkční komplex vázající hormon;

ii) čištění nebo srážení EcR polypeptidů nebo oblasti vázající ligand nebo komplexu vázajícího hormon;

iii) zjištění trojrozměrné struktury domény vázající ligand v polypeptidů nebo komplexu; a iv) určení sloučeniny, která se váže na trojrozměrnou strukturu oblasti vázající ligand nebo s ní asociuje, přičemž uvedená sloučenina představuje kandidáta na insekticidně aktivní činidlo.
65. Způsob podle nároku 64, vyznačující se tím, že kandidát na insekticidně aktivní činidlo je syntetická chemikálie, která napodobuje strukturu ligandu hmyzího receptoru steroidu nebo receptoru juvenilního hormonu, čímž moduluje vazbu uvedeného ligandu k receptoru.

• · • · • · · · a · t ·
66. Způsob podle nároku 65, vyznačující se tím, že syntetická chemikálie je insekticid bisacylhydrazin, iridoidglykosid nebo jiný nesteroidní modulátor hmyzího ekdysteroidového receptorů nebo hmyzího receptorů juvenilního hormonu.
67. Způsob zjišťování kandidáta na insekticidně aktivní činidlo, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

i) exprese rekombinantního nebo izolovaného polypeptidů podle nároku 25, přičemž uvedený polypeptid je sdružený protein (USP polypeptid) nebo oblast vázající ligand, obsahující alespoň doménu vázající hormon a část domény spojovníku uvedeného sdruženého proteinu (USP polypeptid), volitelně ve spojení s EcR polypeptidem hmyzího ekdysteroidového receptorů nebo jeho oblastí vázající ligand, takže tvoří funkční komplex vázající hormon;

ii) čištění nebo srážení sdruženého proteinu (USP polypeptid) nebo oblasti vázající ligand nebo komplexu vázajícího hormon;

iii) zjištění trojrozměrné struktury domény vázající ligand v polypeptidů nebo komplexu; a iv) určení sloučeniny, která se váže na trojrozměrnou strukturu oblasti vázající ligand nebo s ní asociuje, přičemž uvedená sloučenina představuje kandidáta na insekticidně aktivní činidlo.
68. Způsob podle nároku 67, vyznačující se tím, že kandidát na insekticidně aktivní činidlo je syntetická chemikálie, která napodobuje strukturu ligandu hmyzího receptorů steroidu nebo receptorů juvenilního hormonu, čímž moduluje vazbu uvedeného ligandu k receptorů.
69. Způsob podle nároku 68, v y z n a č u j i c i se t í m, ž e syntetická chemikálie je insekticid bisacylhydrazin, iridoidglykosid nebo jiný nesteroidní modulátor hmyzího ekdysteroidového receptorů nebo hmyzího receptorů juvenilního hormonu.
70. Syntetická sloučenina, která interaguje s trojrozměrnou strukturou izolovaného nebo rekombinantního polypeptidů podle kteréhokoli z nároků 25 až 39, přičemž uvedená sloučenina je schopna se vázat k uvedenému polypeptidů nebo proteinu, čímž působí agonisticky nebo antagonisticky na jeho vazebnou aktivitu nebo biologickou aktivitu.

« ·
71. Způsob zjišťování syntetické sloučeniny vykazující insekticidní aktivitu, vyznačující se t í m, ž e zahrnuje: uvedení do kontaktu rekombinantního nebo izolovaného polypeptidů podle kteréhokoli z nároků 25 až 39 s uvedenou sloučeninou po dobu a za podmínek dostatečných pro to, aby došlo k vazbě, a detekování uvedené vazby pomocí detekčních postupů, přičemž uskutečnění vazby je známkou potenciální insekticidní aktivity této sloučeniny.
72. Komplex vázající hormon, vyznačující se tím, že váže hmyzí ekdysteroid nebo váže syntetickou chemikálii, která napodobuje strukturu uvedeného ekdysteroidu, přičemž uvedený komplex vázající hormon obsahuje:

i) oblast vázající ligand proteinu sdruženého s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) podle kteréhokoli z nároků 25 až 28 nebo podle kteréhokoli z nároků 31 až 35 nebo nároku 37 nebo 38; a ii) EcR polypeptid hmyzího ekdysteroidového receptoru nebo jeho oblast vázající ligand.
73. Komplex vázající hormon, vyznačující se tím, že váže hmyzí ekdysteroid nebo váže syntetickou chemikálii, která napodobuje strukturu uvedeného ekdysteroidu, přičemž uvedený komplex vázající hormon obsahuje:

i) oblast vázající ligand EcR polypeptidů podle kteréhokoli z nároků 25 až 30 nebo nároku 36 nebo 39; a ii) protein sdružený s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) hmyzího ekdysteroidového receptoru nebo jeho oblast vázající ligand.
74. Komplex vázající hormon, vyznačující se tím, že váže hmyzí ekdysteroid nebo váže syntetickou chemikálii, která napodobuje strukturu uvedeného ekdysteroidu, přičemž uvedený komplex obsahuje:

i) oblast vázající ligand EcR polypeptidů podle kteréhokoli z nároků 25 až 30 nebo nároku 36 nebo 39; a ii) oblast vázající ligand proteinu sdruženého s ekdysteroidovým receptorem (USP polypeptid) podle kteréhokoli z nároků 25 až 28 nebo podle kteréhokoli z nároků 31 až 35 nebo nároku 37 nebo 38.