JP2006217871A - 遺伝子の転写調節方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】転写調節対象の遺伝子のプロモーター領域と三重鎖核酸を安定に形成する第一の領域と、所定のRNA結合ドメインに特異的に結合する第二の領域とを有する融合RNAと、そのRNA結合ドメインと転写活性化ドメインとを有する融合ポリペプチドを、転写調節対象の遺伝子のプロモーターに作用させる。
【選択図】 図1
Description
Annual Review of Physiology vol.66, pp647-63, 2004
本発明の転写調節マシーナリーの一つ目の構成分子である三重鎖核酸形成RNAは、転写調節させる対象遺伝子のプロモーター領域と三重鎖核酸を形成する第一の領域と、所定のRNA結合ドメインに特異的に結合する第二の領域とを有する。
本発明の転写調節マシーナリーの二つ目の構成分子である転写調節ペプチドは、上記三重鎖核酸形成RNAの第二の領域に特異的に結合するRNA結合ドメインと、転写調節対象である遺伝子の転写を活性化または抑制するための活性化ドメインまたは抑制ドメインを有する。
上記三重鎖核酸形成RNA及び上記転写調節ペプチドを、調節対象となる遺伝子のプロモーターに作用させる(図1参照)。作用させる場所は、in vivoでもin vitroでも構わない。
MS2ファージのコートタンパク質(MS2 coat protein)は、配列特異的に19塩基長のRNA(5'-ACAUGAGGAUUACCCAUGU-3')に高親和性をもって結合することが知られている(RNA. 7: 1616-27, 2001)。そこで、 本実施例では、転写調節ペプチドとして、単純ヘルペスウイルスVP16の転写活性化ドメインとMS2ファージのコートタンパク質のRNA結合ドメインを融合させたVP16−MS2融合タンパク質を用いた。
本実施例では、三重鎖核酸形成RNAとして、酵母ADHプロモーター配列に対し三重鎖核酸を形成し得ると考えられた配列であるTFOの配列と、MS2ファージのコートタンパク質のRNA結合配列を融合させた融合RNAである「TFO−MS2RNA」を用いた。TFOの配列としては、以下に示すTFO1〜5までの配列を用いた。図2に、酵母ADHプロモーター上で、各TFO配列の基になったプロモーター領域を示す。
TFO2:5'-AAAAAAGGAAA-3'(配列番号2、11b)
TFO3:5'-GAAAAAGGAAGGAAG-3'(配列番号3、15b)
TFO4:5'-GGAAGGAAGG-3'(配列番号4:10b)
TFO5:5'-AAGGGAAAGAAGGAATAAAGAAAAAGA-3'(配列番号5、27b)
これらのTFO−MS2RNAを細胞内で発現させるため、TFO−MS2RNAをコードする発現ベクターを以下のように構築した。
レポーターとして、酵母ADHプロモーターの下流にLacZマーカーを有するプラスミドを以下のように構築した。
プライマー2:5'-AAAACTGCAGTTATTATTATTTTTGACACCAGACCAACTGGTAATGG-3'(配列番号7)
Ura-Trp-Leu要求性である酵母FY23株に、表1のような組み合わせで、上記プラスミドを導入した。選択培地プレートでコロニーを選択し、成長したシングルコロニーをピックアップして選択液体培地で培養した。培地の濁度OD600が1程度になったら集菌し、pH調整用リン酸バッファーに懸濁した。これをクロロホルムとSDSで処理し、β-Galの基質であるONPGを添加し、10分後に1M NaHCO3を加え、反応を停止させた。これを遠心して上清を回収し、OD420を測定し、以下のミラーの式よりβ-Gal活性(unit/ml)とした。
結果を表1に示す。
Claims (14)
- 遺伝子の転写調節方法であって、
前記遺伝子のプロモーター領域と三重鎖核酸を形成する第一の領域と、
所定のRNA結合ドメインに特異的に結合する第二の領域と、
を有するRNAと、
前記RNA結合ドメインと、
転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインと
を有するポリペプチドと、
を、前記遺伝子に作用させることを特徴とする方法。 - 前記第一の領域が16塩基以上の長さであり、プリンまたはピリミジンのうち、どちらか一方から成ることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記第一の領域が34塩基以上であることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記RNA結合ドメインがMS2ファージのコートタンパク質のRNA結合ドメインを含み、前記第二の領域がMS2ファージのコートタンパク質のRNA結合配列を含むことを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記転写活性化ドメインが単純ヘルペスウイルスVP16転写活性化ドメインを含むことを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 転写調節させる遺伝子のプロモーター領域と三重鎖核酸を形成する第一の領域と、
所定のRNA結合ドメインに特異的に結合する第二の領域と、
を有するRNA。 - 前記第一の領域が16塩基以上の長さであり、プリンまたはピリミジンのうち、どちらか一方から成ることを特徴とする請求項6に記載のRNA。
- 前記第一の領域が34塩基以上であることを特徴とする請求項7に記載のRNA。
- 前記第二の領域がMS2ファージのコートタンパク質のRNA結合配列を含むことを特徴とする請求項6〜8のいずれかに記載のRNA。
- 所定のRNA領域に特異的に結合するRNA結合ドメインと、
転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインと
を有するポリペプチド。 - 前記RNA結合ドメインがMS2ファージのコートタンパク質のRNA結合ドメインを含むことを特徴とする請求項10に記載のポリペプチド。
- 前記転写活性化ドメインが単純ヘルペスウイルスVP16転写活性化ドメインを含むことを特徴とする請求項10または11に記載のポリペプチド。
- 請求項6〜9のいずれかに記載のRNAをコードするDNA。
- 請求項10〜12のいずれかに記載のポリペプチドをコードするDNA。
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