JP6713691B2 - 動物細胞ゲノム部位特異的外来dna挿入方法及び前記挿入方法を用いて得られる細胞 - Google Patents
動物細胞ゲノム部位特異的外来dna挿入方法及び前記挿入方法を用いて得られる細胞 Download PDFInfo
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Description
本願は、2015年8月20日に、日本に出願された特願2015−162612号、及び2015年12月10日に、米国に出願された仮出願第62/265,425号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
[1]次の工程を有する動物細胞ゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
(1)0.1kbp〜10kbpの外来DNAの上流及び下流に、ゲノム上の挿入を行う部位と相同な配列を有する100bp〜300bpのDNAを結合したドナープラスミドを作成する工程。
(2)得られたドナープラスミドを用いたHDRによるゲノム編集により、ゲノムの目的とする部位に0.1kbp〜10kbpの外来DNAを挿入する工程。
[2]動物細胞が、株化されたヒト由来細胞、株化されたマウス由来細胞、株化されたニワトリ由来細胞、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞、マウスES細胞及びマウスiPS細胞から選ばれる細胞である[1]に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
[3]動物細胞が、ヒトHCT116細胞、ヒトNALM6細胞、ヒトHT1080細胞、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞、マウスES細胞、マウスiPS細胞及びニワトリDT40細胞から選ばれる細胞である[1]又は[2]に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
[4]HDRによるゲノム編集法が、CRISPR−Cas9システム、TALENシステム及びZnフィンガーヌクレアーゼシステムから選ばれるHDRを利用した外来DNA挿入法である[1]〜[3]のいずれか一つに記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
[5]HDRによるゲノム編集法が、CRISPR−Cas9により誘発されるHDRを利用した外来DNA挿入法である[1]〜[4]のいずれか一つに記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
[6]前記100bp〜300bpの相同性配列DNAが、PCR又はDNA合成により得られるものである[1]〜[5]のいずれか一つに記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
[7]外来DNAが、タグ付加外来DNA、プロモーター配列、転写終結配列、機能的遺伝子配列、薬剤選択マーカー遺伝子及びそれらの組み合わせから選ばれる外来DNAである[1]〜[6]のいずれか一つに記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
[8]セーフハーバー座位にtransport inhibitor response 1(TIR1)をコードする遺伝子を含む染色体を有することを特徴とする細胞。
[9]前記セーフハーバー座位がAAVS1(the AAV integration site 1) locusである[8]に記載の細胞。
[10]さらに、前記染色体が前記TIR1をコードする遺伝子に作動可能に連結された、誘導性プロモーター、ウイルス性プロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、又は組織特異的プロモーターを含む[8]又は[9]に記載の細胞。
[11]前記染色体が前記TIR1をコードする遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む、[10]に記載の細胞。
[12]前記誘導性プロモーターが、化学的誘導性プロモーター、熱ショック誘導性プロモーター、電磁気的誘導性プロモーター、核レセプター誘導性プロモーター及びホルモン誘導性プロモーターからなる群より選択される、[11]に記載の細胞。
[13]前記化学的誘導性プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーターである、[12]に記載の細胞。
[14]外来DNAの上流及び下流に連結されており、染色体上の挿入を行う部位と相同な配列を有する100〜300bpのDNAを利用して、前記外来DNAの挿入が行われた染色体を有することを特徴とする細胞。
[15]さらに、前記染色体は、前記外来DNAの上流又は下流であって、前記100〜300bpのDNAに挟まれた領域に連結された薬剤選択マーカー遺伝子を含む、[14]に記載の細胞。
[16]目的タンパク質をコードする第一の遺伝子と、前記第一の遺伝子の上流又は下流に連結されたMini−auxin−inducible degron(mAID)をコードする第二の遺伝子と、を含む第一の染色体と、セーフハーバー座位にTIR1をコードする遺伝子を含む第二の染色体と、を有することを特徴とする細胞。
[17]前記第一の染色体は、前記第一の遺伝子及び前記第二の遺伝子の上流及び下流に連結されており、染色体上の挿入が行う部位と相同な配列を有する100〜300bpのDNAを含む、[16]に記載の細胞。
[18]前記第一の染色体は、第一の遺伝子及び前記第二の遺伝子の上流又は下流であって、前記100〜300bpのDNAに挟まれた領域に連結された薬剤選択マーカー遺伝子を含む、[16]又は[17]に記載の細胞。
[19]さらに、前記染色体が前記TIR1をコードする遺伝子に作動可能に連結された、誘導性プロモーター、ウイルス性プロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、又は組織特異的プロモーターを含む、[16]〜[18]のいずれか一つに記載の細胞。
[20]前記染色体が前記TIR1をコードする遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む、[19]に記載の細胞。
[21]前記誘導性プロモーターが、化学的誘導性プロモーター、熱ショック誘導性プロモーター、電磁気的誘導性プロモーター、核レセプター誘導性プロモーター及びホルモン誘導性プロモーターからなる群より選択される、[20]に記載の細胞。
[22]前記化学的誘導性プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーターである、[21]に記載の細胞。
[23][16]〜[22]のいずれか一つに記載の細胞を用いることを特徴とする目的タンパク質の分解方法。
本発明の動物細胞ゲノム部位特異的外来DNA挿入方法は、次の工程(1)及び(2)を有することを特徴とする。
(1)0.1kbp〜10kbpの外来DNAの上流及び下流に、ゲノム上の挿入を行う部位と相同な配列を有する100bp〜300bpのDNAを結合したドナープラスミドを作成する工程。 (2)得られたドナープラスミドを用いたHDRによるゲノム編集により、ゲノムの目的とする部位に0.1kbp〜10kbpの外来DNAを挿入する工程
ゲノム上の挿入を行う部位と相同な配列を有する100bp〜300bpのDNAは、100bp〜300bpと短いのでPCR又はDNA合成で容易に入手することができる。すなわち、従来のHDRを利用したゲノム編集法のように0.7kbp以上もの長い相同部位のクローニングは必要ではない。オリゴDNAとしては、125bp〜300bpが好ましく、125bp〜250bpがより好ましく、150bp〜250bpがさらに好ましく、170bp〜250bpが特に好ましい。 当該DNAの配列自体は、宿主動物に関するデータベースから適宜決定することができる。DNAの配列が決定できれば、当該DNAをDNA合成で合成するか、当該DNAを増幅するための合成プライマーに相同配列を付加し、これらを用いたPCRにより増幅させて作製することができる。
0.1kbp〜10kbpの外来DNAの上流及び下流に、前記相同性領域を有するDNAを結合させて、プラスミドにクローニングすることでドナープラスミドを作製する。用いられるプラスミドベクターとしては、対象とする動物細胞に導入可能なプラスミドベクターであればよい。そのようなプラスミドベクターとしては、例えばpBluescript、pUC57などが挙げられる。
工程(1)のストラテジーの一例を図1に示す。 本発明の特徴として、このようなPCRやDNA合成を利用した方法によりドナープラスミドを作成できる例を挙げることができる。
一方、CRISPR−Cas9システムは、細菌や古細菌が有する、外部から侵入した核酸(ウイルスDNA、ウイルスRNA、プラスミドDNA)に対する一種の獲得免疫として機能する座位を利用したシステムである。CRISPR−Cas9システムにより、前記プラスミドをゲノムの目的部位に挿入するには、ゲノム中の挿入部位を切断するためのCRISPR−Cas9ベクター作製を行う。そのためには、目的部位にCAS9を誘導するガイドRNAをコードする発現ベクター及びCAS9発現ベクターが必要である。これらベクターをドナーベクターと共導入することにより、目的部位が切断され、それに引き続きドナーベクターを利用したHDRにより、目的外来DNAが導入される。外来DNAに薬剤選択マーカーを持たせておくことにより、薬剤選択により外来DNA導入が起きた細胞を効率よく選択できる。
本発明の動物細胞ゲノム部位特異的外来DNA挿入方法により、以下に示すような細胞を作製することができる。
一実施形態において、本発明は、セーフハーバー座位にtransport inhibitor response 1(TIR1)をコードする遺伝子を含む染色体を有する細胞を提供する。
パク質分解において、E3ユビキチン化酵素複合体(SCF複合体)を形成するサブユニットの一つであるF−boxタンパク質であり、植物特有のタンパク質である。TIR1は、成長ホルモンであるオーキシンの受容体となっており、オーキシンを受容することによって、オーキシン情報伝達系の抑制因子Aux/IAAファミリータンパク質を認識して、前記タンパク質を分解することが知られている。
TIR1をコードする遺伝子としては、植物由来のTIR1をコードする遺伝子であれば、その種類は限定されない。また、由来となる植物の種類も限定されず、例えば、シロイヌナズナ、イネ、ヒャクニチソウ、マツ、シダ、ヒメツリガネゴケ等が挙げられる。TIR1をコードする遺伝子の具体例としては、例えば、TIR1遺伝子、AFB1遺伝子、AFB2遺伝子、AFB3遺伝子、FBX14遺伝子、AFB5遺伝子等が挙げられる。
本実施形態の細胞は、いずれか一種類のTIR1をコードする遺伝子を有していてもよいし、二種類以上を有していてもよい。例えば、シロイヌナズナ由来のTIR1をコードする遺伝子の配列は、TAIRウェブサイト(http://www.arabidopsis.org/)に登録されており、各遺伝子のアクセッションナンバーは、下記表1の通りである。
本明細書において、「TIR1として機能する」とは、例えば、オーキシン類の存在下で、Aux/IAAファミリータンパク質を認識することを意味する。TIR1がAux/IAAファミリータンパク質を認識できれば、Aux/IAAファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を分解できるからである。
本実施形態の細胞は、TIR1をコードする遺伝子の転写を制御するプロモーター配列が作動可能に連結されていることが好ましい。これによって、より確実にTIR1を発現できる。
本明細書において、「作動可能に連結」とは、遺伝子発現制御配列(例えば、プロモーター又は一連の転写因子結合部位)と発現させたい遺伝子(本実施形態においては、TIR1をコードする遺伝子)との間の機能的連結を意味する。ここで、「発現制御配列」とは、その発現させたい遺伝子(本実施形態においては、TIR1をコードする遺伝子)の転写を指向するものを意味する。
誘導性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、化学的誘導性プロモーター、熱ショック誘導性プロモーター、電磁気的誘導性プロモーター、核レセプター誘導性プロモーター、ホルモン誘導性プロモーター等が挙げられる。中でも、本実施形態の細胞において、TIR1をコードする遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーターとしては、化学的誘導性プロモーターであることが好ましい。
ウイルス性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(CMV極初期プロモーター(例えば、米国特許第5168062号明細書、参照。)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来のプロモーター(例えば、HIV長末端リピート等)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター(例えば、RSV長末端リピート等) 、マウス乳腫瘍ウイルス(MMTV)プロモーター、HSVプロモーター(Lap2プロモーター又はヘルペスチミジンキナーゼプロモーターなど(Wagner e t al., Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 144−145,1981.参照) 、SV40又はエプスタイン バール ウイルス由来のプロモーター、アデノ随伴ウイルスプロモーター(例えば、p5プロモーター等)等が挙げられる。
ハウスキーピング遺伝子プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、GAPDH(glyceraldehyde−3−phosphate dehydrogenase)遺伝子プロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター、β2−マイクログロブリン遺伝子プロモーター、HPRT 1(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1)遺伝子プロモーター等が挙げられる。
組織特異的プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、黒色腫細胞又はメラニン細胞の場合は、チロシナーゼプロモーター又はTRP2プロモーター;乳房細胞又は乳癌の場合は、MMTVプロモーター又はWAPプロモーター;腸細胞又は腸癌の場合は、ビリンプロモーター又はFABPプロモーター;膵細胞の場合は、PDXプロモーター;膵ベータ細胞の場合は、RIPプロモーター;ケラチノサイトの場合は、ケラチンプロモーター;前立腺上皮の場合は、プロバシンプロモーター;中枢神経系(CNS)の細胞又は中枢神経系の癌の場合は、ネスチンプロモーター又はGFAPプロモーター;ニューロンの場合は、チロシンヒドロキシラーゼ、S100プロモーター又は神経フィラメントプロモーター;Edlundら、Science, 230:912-916(1985)に記載される、膵臓特異的プロモーター;肺癌の場合は、クラーラ細胞分泌タンパク質プロモーター;心細胞の場合は、αミオシンプロモーター等が挙げられる。
一実施形態において、本発明は、外来DNAの上流及び下流に連結されており、染色体上の挿入を行う部位と相同な配列を有する100〜300bpのDNAを利用して、前記外来DNAの挿入が行われた染色体を有する、細胞を提供する。
一実施形態において、本発明は、目的タンパク質をコードする第一の遺伝子と、前記第一の遺伝子の上流又は下流に連結されたMini−auxin−inducible degron(mAID)をコードする第二の遺伝子と、を含む第一の染色体と、セーフハーバー座位にTIR1をコードする遺伝子を含む第二の染色体と、を有する細胞を提供する。
本実施形態の細胞において、mAIDをコードする第二の遺伝子を有することにより、Aux/IAAファミリータンパク質全長やドメインII領域等を使用する場合に比べて、目的タンパク質の分解誘導能が向上し、かつ細胞の死亡が抑制され、安定した目的タンパク質分解誘導性が得られる。
これに対し、ドメインIIのN末端側とC末端側に少なくとも2個ずつのLys残基を含む領域であって、ドメインIを含まず、ドメインIIIは一部含んでいてもよい領域からなる配列からなるタンパク質を有することにより、目的タンパク質の分解誘導能が顕著に向上する。また、当該配列を2個以上連結した配列を使用すると、目的タンパク質の分解誘導能がさらに向上する。
本実施形態の細胞は、いずれか一種の前記Aux/IAAファミリータンパク質をコードする遺伝子の部分配列を有していてもよいし、二種類以上を有していてもよい。例えば、シロイヌナズナ由来のAux/IAAファミリー遺伝子の配列は、TAIR(the Arabidopsis Information Resource)に登録されており、各遺伝子のアクセッションナンバーは、次のとおりである。
IAA1遺伝子(AT4G14560)、IAA2遺伝子(AT3G23030)、IAA3遺伝子(AT1G04240)、IAA4遺伝子(AT5G43700)、IAA5遺伝子(AT1G15580)、IAA6遺伝子(AT1G52830)、IAA7遺伝子(AT3G23050)、IAA8遺伝子(AT2G22670)、IAA9遺伝子(AT5G65670)、IAA10遺伝子(AT1G04100)、IAA11遺伝子(AT4G28640)、IAA12遺伝子(AT1G04550)、IAA13遺伝子(AT2G33310)、IAA14遺伝子(AT4G14550)、IAA15遺伝子(AT1G80390)、IAA16遺伝子(AT3G04730)、IAA17遺伝子(AT1G04250)、IAA18遺伝子(AT1G51950)、IAA19遺伝子(AT3G15540)、IAA20遺伝子(AT2G46990)、IAA26遺伝子(AT3G16500)、IAA27遺伝子(AT4G29080)、IAA28遺伝子(AT5G25890)、IAA29遺伝子(AT4G32280)、IAA30遺伝子(AT3G62100)、IAA31遺伝子(AT3G17600)、IAA32遺伝子(AT2G01200)、IAA33遺伝子(AT5G57420)及びIAA34遺伝子(AT1G15050)。
(1)図2のストラテジーに従って、ドナープラスミドを作製し、ゲノム上の標的部位MCM8遺伝子に外来遺伝子を挿入した。外来遺伝子としては、図2記載のような、GFP−ネオマイシン遺伝子を用いた。
上記鋳型プラスミドおよびオリゴDNAを、PrimeSTAR DNAポリメラーゼ(タカラバイオ)を取扱説明書に準じてPCR増幅した。増幅されたDNAはおよそ3.5kbpである。
PCRで増幅したDNAをpCR BluntII−TOPOベクター(ライフテクノロジー社)に取扱説明書に準じてブラントエンドライゲーションによりクローニングした。
5’−caccGCCAGCTTCAAACTATGTAAA−3’(配列番号19)5’−aaacTTTACATAGTTTGAAGCTGGC−3’(配列番号20)
6ウェルプレートに増殖中のヒトHCT116細胞に、MCM8遺伝子の標的部分を切断するためのpX330を0.8μgと作製したドナーベクター1μgを混ぜ合わせ、FugeneHD(プロメガ社)を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションに際しては取扱説明書に準じてDNAとFugeneHDを混ぜ合わせて15分放置したのち、培地に滴下した。
トランスフェクション2日後、細胞を希釈しG418を700μg/mLを含む培地で13日間培養することで、ネオマイシン耐性になった細胞を選択するとともにコロニーを形成させた。
各コロニーを単離後、細胞を増やしたのちにゲノムDNAを精製しPCRによるDNA挿入の確認を行った。挿入確認に用いたプライマーは図3に示すAとB及びAとCの組み合わせを用いた。図3に示すように、プライマーAとBの組み合わせでは、挿入が起こらなかった場合は特異的なDNA増幅は見られない(左ゲル写真WT)。一方で、期待した挿入が1アリルにでも起きると0.75kbのDNAが増幅される(左ゲル写真heterozygousおよびhomozygous)。プライマーAとCの組み合わせでは、挿入が起こらなかったアリルから場合に0.6kbのDNAが増幅され、挿入があったアリルから3.6kbのDNAが増幅される。片アリルのみに挿入されたクローンからは、0.6kbpと3.6kbp両方のDNAが増幅される(右ゲル写真heterozygous)。両アリル挿入がある場合は3.6kbpのDNAのみ増幅される(右ゲル写真homozygous)。
ゲノムPCRによりMCM8−GFP挿入が確認されたクローンから、タンパク質を抽出し、MCM8抗体およびGFP抗体を用いてウェスタンブロットを行った。GFPの付加していないMCM8は93kDaに検出される。一方で、MCM8−GFP融合タンパク質は130kDaに検出される。図4に示すように、MCM8抗体を用いた場合、もとのHCT116細胞(WT)には93kDaのバンドが検出されるのに対し、片アリルもしくは両アリルにGFPが付加された場合140kDaのバンドが検出される。GFP抗体は140kDaの融合タンパク質しか検出しない。これらの結果から期待されたMCM8タンパク質へのGFP付加が起きたことが確認された。
(1)ドナーベクターの作製
図5に示すようにmAID(ミニAIDタグ)とClover(改変GFP)およびネオマイシンもしくはハイグロマイシン耐性遺伝子をもつプラスミドを鋳型として、RAD21遺伝子C末端コード領域と5’に180b(5’−GCTAAAACTGGAGCTGAATCTATCAGTTTGCTTGAGTTATGTCGAAATACGAACAGAAAACAAGCTGCCGCAAAGTTCTACAGCTTCTTGGTTCTTAAAAAGCAGCAAGCTATTGAGCTGACACAGGAAGAACCGTACAGTGACATCATCGCAACACCTGGACCAAGGTTCCATATTATAggatccggtgcaggcgcc−3’:配列番号29),3’に175b(5’−TCCCTCAAAGATGAAATTGACAAATTTAATGTACTGGAAAAAAATGAAGAAGGAAAAAGGCAAAGACTTTGTACAGACAAAAATCTAAGTTTTCTCAAAGGGTTCTGTGTCCCCTACACATGGGGGCAATTTGTAAGCACTAGTGAATCAAACACTAGCTATAATGCTTCTAGCTgcgcgcaattaaccctcactaaagg−3’:配列番号30)の相同領域をもつオリゴDNAをプライマーとして(大文字部分はRAD21との相同領域、小文字部分は鋳型DNAとの相同領域)、PrimeSTAR DNAポリメラーゼ(タカラバイオ)を取扱説明書に準じてPCR増幅した。増幅されたDNAはおよそ3.7kbpである。PCRで増幅したDNAをpCR BluntII−TOPOベクター(ライフテクノロジー社)に取扱説明書に準じてブラントエンドライゲーションによりクローニングすることで、ドナーベクターを作製した。
図5に示すようにRAD21遺伝子のC末端コード領域を切断する。CRISPR−Cas9発現用ベクターpX330のBbsIに認識部位を与えるため下記のオリゴDNAをハイブリダイズさせて導入した。
5’−caccgCCAAGGTTCCATATTATATA−3’(配列番号31)5’−aaacTATATAATATGGAACCTTGGc−3’(配列番号32)
(3)CRISPR−Cas9を用いたHCT116への挿入
今回の実験では野生型HCT116細胞とオーキシン誘導デグロン(AID)法に必要なOsTIR1が恒常的に発現する改変を施したHCT116細胞を材料とした。6ウェルプレートに増殖中の細胞を用意し、RAD21遺伝子の標的部分を切断するためのpX330を0.8μgと作製したネオマイシン及びハイグロマイシン耐性マーカーをもつドナーベクターを各0.6μg混ぜ合わせ、FugeneHD(プロメガ社)を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションに際しては取扱説明書に準じてDNAとFugeneHDを混ぜ合わせて15分放置したのち、培地に滴下した。
トランスフェクション2日後、細胞を希釈しG418 700μg/mLとハイグロマイシン100μg/mLを含む培地で13日間培養することで、ネオマイシンとハイグロマイシンの両方に耐性になった細胞を選択するとともにコロニーを形成させた。
各コロニーを単離後、細胞を増やしたのちにゲノムDNAを精製しPCRによるDNA挿入の確認を行った。挿入確認に用いたプライマーは図6に示すネオマイシン遺伝子とハイグロマイシン遺伝子を検出するそれぞれの組み合わせを用いた。図6左のゲル写真に示すように、挿入が起こらなかった場合は特異的なDNA増幅は見られない(左ゲル写真WT)。一方で、期待した挿入が起こったネオマイシン耐性遺伝子からは0.9kbpの産物、ハイグロマイシン耐性遺伝子からは1.5kbpの産物が増幅される。多くのクローンから両方のPCR産物が検出されている(図6左ゲル写真、各クローン)。このことは両アリルにそれぞれの耐性マーカーをもつ、タギングコンストラクトが挿入されていることを示している。
ゲノムPCRにより両アリル挿入が確認されたクローンから、タンパク質を抽出し、RAD21抗体およびmAID抗体を用いてウェスタンブロットを行った(図6右)。また、細胞を500μMオーキシン(3−indole aceticacid)で20時間処理した細胞からも同様にタンパク質を抽出し、ウェスタンブロットに用いた。mAID−Cloverの付加していないRAD21は105kDaに検出される。一方で、RAD21−mAID−Clover融合タンパク質は145kDaに検出される。図6右に示すように、RAD21抗体を用いた場合、もとのHCT116細胞(WT)には105kDaのバンドが検出されるのに対し、両アリルにmAID−Cloverが付加された場合145kDaのバンドが検出される。また、mAID抗体を用いた場合、mAID−Cloverが付加したRAD21タンパク質のみが検出される。さらに細胞をオーキシンで処理した場合、OsTIR1発現細胞においてRAD21−mAID−Cloverの消失が起きることから、AID法によるタンパク質分解が起きていることがわかる。
図7に示すように、RAD21−mAID−Clover融合タンパク質が発現している生細胞をデコンボリューション蛍光顕微鏡で観察した。細胞をオーキシン(3−indole aceticacid)で処理する前の細胞は、OsTIR1の発現の有無に関わらず、RAD21−mAID−Cloverが細胞核内に局在しているのが観察された。500μMオーキシンで細胞を処理し、90分後に観察したところ、OsTIR1を発現する細胞においてのみ、RAD21−mAID−Cloverが消失した。この結果からも、AID法によるRAD21−mAID−Cloverの分解が起きていることがわかる。
(1)ドナーベクターの作製
図8に示すようにmAID(ミニAIDタグ)とClover(改変GFP)およびネオマイシンもしくはハイグロマイシン耐性遺伝子をもつプラスミドを、BamHIを用いて制限酵素処理して、mAID(ミニAIDタグ)とClover(改変GFP)およびネオマイシンもしくはハイグロマイシン耐性遺伝子からなるコンストラクトを得た。続いて、遺伝子合成したDHC1遺伝子のホモロジーアームを遺伝子合成により作製し、pUC57のEcoRVsサイトにクローニングしたたものを作製した(GENEWIZ社)。ホモロジーアームの間にはあらかじめBamHIサイトが導入されているため、プラスミドを、BamHIにより制限酵素処理して、mAID(ミニAIDタグ)とClover(改変GFP)およびネオマイシンもしくはハイグロマイシン耐性遺伝子からなるコンストラクトを挿入し、ライゲーションさせて、ドナーベクターを作製した。得られたドナーベクターは、5’に180b(5’− -TCCAGTTTTCTTACTTTTCCCTTAAGCCACCAGTAAACCCCTCTGCTTCTGCAGGTAACCTTACCTGTCTACCTGAACTTCACCCGTGCAGACCTCATCTTCACCGTGGACTTCGAAATTGCTACAAAGGAGGATCCTCGCAGCTTCTATGAAAGGGGTGTCGCAGTCTTGTGCACAGAG−3’:配列番号33),3’に175b(5’− ACCACTCCCAACCGTCAGATTCCATTCAGCTTCCTCCAACCTCAGACCAACCACTTTCTTTTCACAAGCTCAGACCTTCCAAATATTTTAAAAATGAATAAATGTTAAATACCAACTTTCACTATTACAGAAAGGGGCAGCTAGAAAAGTTTACTCTGTGCACAAGACTGCGACA−3’:配列番号34)DHC1遺伝子に対して相同な領域を持っていた。
図8に示すようにDHC1遺伝子のC末端コード領域を切断する。CRISPR−Cas9発現用ベクターpX330のBbsIに認識部位を与えるため下記のオリゴDNAをハイブリダイズさせて導入した。
5’− caccgCCTCGCAGCTTCTACGAGCGGGG−3’(配列番号35)5’− aaacCCCCGCTCGTAGAAGCTGCGAGGc−3’(配列番号36)
(3)CRISPR−Cas9を用いたHCT116への挿入
今回の実験では野生型HCT116細胞とオーキシン誘導デグロン(AID)法に必要なOsTIR1が恒常的に発現する改変を施したHCT116細胞を材料とした。6ウェルプレートに増殖中の細胞を用意し、DHC1遺伝子の標的部分を切断するためのpX330を0.8μgと作製したネオマイシン及びハイグロマイシン耐性マーカーをもつドナーベクターを各0.6μg混ぜ合わせ、FugeneHD(プロメガ社)を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションに際しては取扱説明書に準じてDNAとFugeneHDを混ぜ合わせて15分放置したのち、培地に滴下した。
トランスフェクション2日後、細胞を希釈しG418 700μg/mLとハイグロマイシン100μg/mLを含む培地で13日間培養することで、ネオマイシンとハイグロマイシンの両方に耐性になった細胞を選択するとともにコロニーを形成させた。
各コロニーを単離後、細胞を増やしたのちにゲノムDNAを精製しPCRによるDNA挿入の確認を行った。挿入確認に用いたプライマーは図9に示すネオマイシン遺伝子とハイグロマイシン遺伝子を検出するそれぞれの組み合わせを用いた。図9のゲル写真に示すように、挿入が起こらなかった場合は特異的なDNA増幅は見られない(左ゲル写真WT)。一方で、期待した挿入が起こったネオマイシン耐性遺伝子からは0.9kbpの産物、ハイグロマイシン耐性遺伝子からは1.5kbpの産物が増幅される。多くのクローンから両方のPCR産物が検出されている(図9左ゲル写真、各クローン)。このことは両アリルにそれぞれの耐性マーカーをもつ、タギングコンストラクトが挿入されていることを示している。
ゲノムPCRにより両アリル挿入が確認されたクローンから、タンパク質を抽出し、DHC1抗体およびOsTIR抗体を用いてウェスタンブロットを行った(図10)。また、細胞を2μg/mLのドキシサイクリン及び500μMオーキシン(3−indole aceticacid)で2、4、6、8、10、24時間処理した細胞からも同様にタンパク質を抽出し、ウェスタンブロットに用いた。図10に示すように、DHC1抗体を用いた場合、mAID−Cloverが付加したDHC1タンパク質が経時的に消失した。一方、OsTIR抗体を用いた場合、OsTIRタンパク質が経時的に増加していた。このことから、AID法によるタンパク質分解が起きていることがわかった。
DHC1−mAID−Clover融合タンパク質が発現している生細胞を用いて、未処理、2μg/mLのドキシサイクリンのみ、又は2μg/mLのドキシサイクリン及び500μMオーキシンの処理から0時間における細胞数に対して、処理から24、48、72時間後における細胞の相対値を算出した(図11)。図11に示すように、2μg/mLのドキシサイクリン及び500μMオーキシンで処理した細胞では、処理から48時間後以降において、細胞の増殖が抑制されていることがわかった。
DHC1−mAID−Clover融合タンパク質が発現している生細胞を用いて、未処理、1μg/mLのテトラサイクリンのみ、又は1μg/mLのテトラサイクリン及び500μMオーキシンの処理から18、42時間後における有糸分裂細胞の割合を算出した(図12)。
また、未処理、又は1μg/mLのテトラサイクリン及び500μMオーキシンの処理から18時間後におけるDHC1−mAID−Clover融合タンパク質が発現している生細胞について、チューブリン抗体による免疫染色及びSiR Hoechstによる核染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した(図13)。
図12及び図13に示すように、1μg/mLのテトラサイクリン及び500μMオーキシンで処理した細胞では、染色体の構造異常が生じ、有糸分裂細胞が蓄積することが明らかとなった。
(1)ドナーベクターの作製
図14に示すようにmAID(ミニAIDタグ)、Clover(改変GFP)およびネオマイシン耐性遺伝子をもつプラスミドを、BamHIを用いて制限酵素処理して、mAID(ミニAIDタグ)、Clover(改変GFP)およびネオマイシン耐性遺伝子からなるコンストラクトを得た。続いて、遺伝子合成したMCM2遺伝子のホモロジーアームを遺伝子合成により作製し、pUC57のEcoRVsサイトにクローニングしたたものを作製した(GENEWIZ社)。ホモロジーアームの間にはあらかじめBamHIサイトが導入されているため、プラスミドをBamHIにより制限酵素処理して、mAID(ミニAIDタグ)とClover(改変GFP)およびネオマイシンもしくはハイグロマイシン耐性遺伝子からなるコンストラクトを挿入し、ライゲーションさせて、ドナーベクターを作製した。得られたドナーベクターは、5’に200b(5’− TCAGGTCTGGAGCTCTGAACCAACACAGCCCTTCCAGAGGTGAAGGCCGGCGTCTTCTCCTGCTAATGGCTCTGATGCTGTTCTTTCTCCAGGCCAGGCAGATCAATATTCACAACCTCTCTGCCTTCTACGACAGCGACCTCTTCAAATTCAACAAGTTCAGCCGTGACCTGAAACGCAAACTGATCCTACAGCAGTTC−3’:配列番号37),3’に200b(5’− ATGAGGCTCGGTCACCACGCTGAGCCTACGTCACTTCCCACTTCCACTGGGGCTTGGTGCCCTGTAGGGGTGGGAGGATGGCTTAATGCAGACCTTTACCTGTGAGCCCCTAGGCCAAGGCTGTAGCATTAAATGACTATTTATTCTTCTGCCCCCCTCTAGAGCACTCTTCTTGGCCAGACCCTCTGTCCAAGGCTCAT−3’:配列番号38)MCM2遺伝子に対して相同な領域を持っていた。
図14に示すようにMCM2遺伝子のC末端コード領域を切断する。CRISPR−Cas9発現用ベクターpX330のBbsIに認識部位を与えるため下記のオリゴDNAをハイブリダイズさせて導入した。
5’− caccgCGAGCCTCATTCAGACATAG−3’(配列番号39)5’− aaacCTATGTCTGAATGAGGCTCGc−3’(配列番号40)
(3)CRISPR−Cas9を用いたHCT116への挿入
今回の実験ではマウスES細胞を材料とした。6ウェルプレートに増殖中の細胞を用意し、MCM2遺伝子の標的部分を切断するためのpX330を0.8μgと作製したネオマイシン耐性マーカーをもつドナーベクターを各0.6μg混ぜ合わせ、FugeneHD(プロメガ社)を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションに際しては取扱説明書に準じてDNAとFugeneHDを混ぜ合わせて15分放置したのち、培地に滴下した。
トランスフェクション2日後、細胞を希釈しG418 700μg/mLとハイグロマイシン100μg/mLを含む培地で13日間培養することで、ネオマイシン耐性になった細胞を選択するとともにコロニーを形成させた。
各コロニーを単離後、細胞を増やしたのちにゲノムDNAを精製しPCRによるDNA挿入の確認を行った。挿入確認に用いたプライマーは図14に示すネオマイシン遺伝子を検出する組み合わせを用いた。図14下のゲル写真に示すように、挿入が起こらなかった場合は特異的なDNA増幅は見られない(下ゲル写真1,2等)。一方で、期待した挿入が起こったネオマイシン耐性遺伝子からは1.0kbpの産物が増幅される。多くのクローンからPCR産物が検出されている(図14下ゲル写真、各クローン)。このことは両アリルにそれぞれの耐性マーカーをもつ、タギングコンストラクトが挿入されていることが示された。
図15に示すように、MCM2−mAID−Clover融合タンパク質が発現しているマウスES細胞をデコンボリューション蛍光顕微鏡で観察した。MCM2−mAID−Cloverが細胞核内に局在しているのが観察された。
以上のことから、マウスES細胞の両アリルにおいて、耐性マーカーをもつ、タギングコンストラクトが挿入されていることが示された。
Claims (12)
- 次の工程を有する動物細胞ゲノム部位特異的外来DNA挿入方法であって、前記動物細胞が、ヒトHCT116細胞、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞、マウスES細胞及びマウスiPS細胞から選ばれる細胞である、ゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
(1)0.1kbp〜5kbpの外来DNAの上流及び下流に、ゲノム上の挿入を行う部位と相同な配列を有する125bp〜200bpのDNAを結合したドナープラスミドを作製する工程。
(2)得られたドナープラスミドを用いたCRISPR−Cas9システムにより誘発される相同組換えによるゲノム編集により、ゲノムの目的とする部位に0.1kbp〜5kbpの外来DNAを挿入する工程。 - 前記動物細胞が、ヒトHCT116細胞、及びマウスES細胞から選ばれる細胞である、請求項1に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
- 前記外来DNAは、Aux/IAAファミリータンパク質の少なくとも部分配列からなり、目的タンパク質の分解誘導能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含み、
前記工程(2)において、目的タンパク質をコードする遺伝子の上流又は下流に、Aux/IAAファミリータンパク質の少なくとも部分配列からなり、目的タンパク質の分解誘導能を有するタンパク質をコードする遺伝子を挿入する、請求項1又は2に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。 - 前記Aux/IAAファミリータンパク質の少なくとも部分配列からなり、目的タンパク質の分解誘導能を有するタンパク質は、mAIDである、請求項3に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
- 前記工程(1)において、前記外来DNAを、前記相同配列DNAを含むプライマーで増幅した後、Topoクローニングによって、前記ドナープラスミドを作製する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
- 前記動物細胞は、セーフハーバー座位にtransport inhibitor response 1(TIR1)をコードする遺伝子を含む染色体を有する請求項1〜5のいずれか一項に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
- 前記セーフハーバー座位がAAVS1(the AAV integration site 1)遺伝子座である請求項6に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
- 前記外来DNAが、プロモーター配列、転写終結配列、機能的遺伝子配列、薬剤選択マーカー遺伝子及びそれらの組み合わせから選ばれる少なくとも一つを含む請求項1〜7のいずれか一項に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
- さらに、前記動物細胞の前記染色体が前記TIR1をコードする遺伝子に作動可能に連結された、誘導性プロモーター、ウイルス性プロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、又は組織特異的プロモーターを含む、請求項6〜8のいずれか一項に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
- 前記染色体が前記TIR1をコードする遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む、請求項9に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
- 前記誘導性プロモーターが、化学的誘導性プロモーター、熱ショック誘導性プロモーター、電磁気的誘導性プロモーター、核レセプター誘導性プロモーター及びホルモン誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項10に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
- 前記化学的誘導性プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーターである、請求項11に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
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