JPWO2017029833A1 - 動物細胞ゲノム部位特異的外来ｄｎａ挿入方法及び前記挿入方法を用いて得られる細胞 - Google Patents
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Abstract
本発明は、次の工程を有する動物細胞ゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法である。（１）０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡの上流及び下流に、ゲノム上の挿入を行う部位と相同な配列を有する１００ｂｐ〜３００ｂｐのＤＮＡを結合したドナープラスミドを作成する工程。（２）得られたドナープラスミドを用いた相同組換え修復によるゲノム編集法により、ゲノムの目的とする部位に０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡを挿入する工程。
Description
本発明は、動物細胞のゲノム中に部位特異的に外来ＤＮＡを挿入する方法及び前記挿入方法を用いて得られる細胞に関する。
本願は、２０１５年８月２０日に、日本に出願された特願２０１５−１６２６１２号、及び２０１５年１２月１０日に、米国に出願された仮出願第６２／２６５，４２５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１５年８月２０日に、日本に出願された特願２０１５−１６２６１２号、及び２０１５年１２月１０日に、米国に出願された仮出願第６２／２６５，４２５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
近年の動物細胞のゲノム中に部位特異的改変を導入する技術、いわゆるゲノム編集技術は飛躍的に進歩した。すなわち、近年、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９等のゲノム編集技術が利用可能になったことにより、ＤＮＡ切断後の相同組換え修復（homology direct repair:HDR）を利用して、培養細胞のゲノム特定部位に外来ＤＮＡを挿入することが可能になった。この技術を利用することで、内在性遺伝子にＧＦＰ等のタグを付加できるようになった（非特許文献１〜７）。一方、単鎖オリゴＤＮＡに５０〜８０ｂの相同性領域を持たせることで、部位特異的配列を改変する方法も開発された（非特許文献７、８）。ハエＳ２細胞において、相同性を付加したプライマーを利用したＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を、そのまま利用した外来ＤＮＡ挿入法が開発された（非特許文献９）。一方、ゲノム編集によるゲノム切断後にＨＤＲ経路を利用せずに、別の修復経路であるmicro-homology end-joining (MMEJ)経路を利用してタグ付加を行う技術も開発された（非特許文献１０）。
Nat. Biotech.,vol.27, P851-857 (2009)
Nat. Biotech.,vol.29, P731-734 (2011)
Science, vol.339, P823-825 (2013)
Nat. Biotech.,vol.29, P143-148 (2011)
PLoS One, DOI: 10.1371/journal.pone.0095101（2014）
Sci Reports, DOI: 10.1038/srep09592 (2015)
Nat. Protocols, Vol.8 No.11, P2281-2307 (2013)
Cell,vol.153, P910-918 (2013)
Nuc. Acid. Res., Vol.42, e89, DOI: 10.1093/nar/gku289 (2014)
Nat. Commun., DOI: 10.1038/ncomms6560 (2014)
しかしながら、相同組換え修復（ＨＤＲ）を利用する方法は、ＨＤＲのテンプレートとなるプラスミド（ドナープラスミド）には、およそ左右各０．７ｋｂｐ以上（合計１．４ｋｂｐ以上）のゲノム上の挿入を行う部位と相同の配列をゲノムＤＮＡからクローニングする必要がある（非特許文献１〜７）。そのため、用途に応じた煩雑なクローニングを必要とするという問題があった。一方、単鎖オリゴＤＮＡを用いる方法では、１〜２０ｂｐ程度の外来配列しか挿入することができず、ＧＦＰ等のタグ付加には用いることができなかった。
従って、０．１ｋｂｐ以上の長い外来ＤＮＡを、ゲノムＤＮＡのクローニング操作を必要としない簡便な操作でゲノム上に挿入できるゲノム編集技術が望まれている。
そこで本発明者は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム等のゲノム編集技術を利用したＨＤＲ経路による外来ＤＮＡ挿入においては、ゲノム上の左右各０．７ｋｂｐ以上の相同配列のクローニングが必須であると考えられていたところ（非特許文献１〜７）、この相同配列をＰＣＲやＤＮＡ合成で得ることができる程度の短い配列にしてドナープラスミドを作製した。その結果、全く意外にもオリゴヌクレオチド又は遺伝子合成により合成可能な１００ｂｐ〜３００ｂｐという短い相同配列の間に０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐという大きな外来ＤＮＡを結合したドナープラスミドを用いたＨＤＲにより、十分な効率性でゲノム上の目的とする部位に０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡを挿入できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］次の工程を有する動物細胞ゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
（１）０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡの上流及び下流に、ゲノム上の挿入を行う部位と相同な配列を有する１００ｂｐ〜３００ｂｐのＤＮＡを結合したドナープラスミドを作成する工程。
（２）得られたドナープラスミドを用いたＨＤＲによるゲノム編集により、ゲノムの目的とする部位に０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡを挿入する工程。
［２］動物細胞が、株化されたヒト由来細胞、株化されたマウス由来細胞、株化されたニワトリ由来細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスＥＳ細胞及びマウスｉＰＳ細胞から選ばれる細胞である［１］に記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
［３］動物細胞が、ヒトＨＣＴ１１６細胞、ヒトＮＡＬＭ６細胞、ヒトＨＴ１０８０細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスＥＳ細胞、マウスｉＰＳ細胞及びニワトリＤＴ４０細胞から選ばれる細胞である［１］又は［２］に記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
［４］ＨＤＲによるゲノム編集法が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮシステム及びＺｎフィンガーヌクレアーゼシステムから選ばれるＨＤＲを利用した外来ＤＮＡ挿入法である［１］〜［３］のいずれか一つに記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
［５］ＨＤＲによるゲノム編集法が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９により誘発されるＨＤＲを利用した外来ＤＮＡ挿入法である［１］〜［４］のいずれか一つに記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
［６］前記１００ｂｐ〜３００ｂｐの相同性配列ＤＮＡが、ＰＣＲ又はＤＮＡ合成により得られるものである［１］〜［５］のいずれか一つに記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。［７］外来ＤＮＡが、タグ付加外来ＤＮＡ、プロモーター配列、転写終結配列、機能的遺伝子配列、薬剤選択マーカー遺伝子及びそれらの組み合わせから選ばれる外来ＤＮＡである［１］〜［６］のいずれか一つに記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
［８］セーフハーバー座位にｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ １（ＴＩＲ１）をコードする遺伝子を含む染色体を有することを特徴とする細胞。
［９］前記セーフハーバー座位がＡＡＶＳ１（ｔｈｅ ＡＡＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ １） ｌｏｃｕｓである［８］に記載の細胞。
［１０］さらに、前記染色体が前記ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結された、誘導性プロモーター、ウイルス性プロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、又は組織特異的プロモーターを含む［８］又は［９］に記載の細胞。
［１１］前記染色体が前記ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む、［１０］に記載の細胞。
［１２］前記誘導性プロモーターが、化学的誘導性プロモーター、熱ショック誘導性プロモーター、電磁気的誘導性プロモーター、核レセプター誘導性プロモーター及びホルモン誘導性プロモーターからなる群より選択される、［１１］に記載の細胞。
［１３］前記化学的誘導性プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーターである、［１２］に記載の細胞。
［１４］外来ＤＮＡの上流及び下流に連結されており、染色体上の挿入を行う部位と相同な配列を有する１００〜３００ｂｐのＤＮＡを利用して、前記外来ＤＮＡの挿入が行われた染色体を有することを特徴とする細胞。
［１５］さらに、前記染色体は、前記外来ＤＮＡの上流又は下流であって、前記１００〜３００ｂｐのＤＮＡに挟まれた領域に連結された薬剤選択マーカー遺伝子を含む、［１４］に記載の細胞。
［１６］目的タンパク質をコードする第一の遺伝子と、前記第一の遺伝子の上流又は下流に連結されたＭｉｎｉ−ａｕｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｄｅｇｒｏｎ（ｍＡＩＤ）をコードする第二の遺伝子と、を含む第一の染色体と、セーフハーバー座位にＴＩＲ１をコードする遺伝子を含む第二の染色体と、を有することを特徴とする細胞。
［１７］前記第一の染色体は、前記第一の遺伝子及び前記第二の遺伝子の上流及び下流に連結されており、染色体上の挿入が行う部位と相同な配列を有する１００〜３００ｂｐのＤＮＡを含む、［１６］に記載の細胞。
［１８］前記第一の染色体は、第一の遺伝子及び前記第二の遺伝子の上流又は下流であって、前記１００〜３００ｂｐのＤＮＡに挟まれた領域に連結された薬剤選択マーカー遺伝子を含む、［１６］又は［１７］に記載の細胞。
［１９］さらに、前記染色体が前記ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結された、誘導性プロモーター、ウイルス性プロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、又は組織特異的プロモーターを含む、［１６］〜［１８］のいずれか一つに記載の細胞。
［２０］前記染色体が前記ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む、［１９］に記載の細胞。
［２１］前記誘導性プロモーターが、化学的誘導性プロモーター、熱ショック誘導性プロモーター、電磁気的誘導性プロモーター、核レセプター誘導性プロモーター及びホルモン誘導性プロモーターからなる群より選択される、［２０］に記載の細胞。
［２２］前記化学的誘導性プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーターである、［２１］に記載の細胞。
［２３］［１６］〜［２２］のいずれか一つに記載の細胞を用いることを特徴とする目的タンパク質の分解方法。
［１］次の工程を有する動物細胞ゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
（１）０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡの上流及び下流に、ゲノム上の挿入を行う部位と相同な配列を有する１００ｂｐ〜３００ｂｐのＤＮＡを結合したドナープラスミドを作成する工程。
（２）得られたドナープラスミドを用いたＨＤＲによるゲノム編集により、ゲノムの目的とする部位に０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡを挿入する工程。
［２］動物細胞が、株化されたヒト由来細胞、株化されたマウス由来細胞、株化されたニワトリ由来細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスＥＳ細胞及びマウスｉＰＳ細胞から選ばれる細胞である［１］に記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
［３］動物細胞が、ヒトＨＣＴ１１６細胞、ヒトＮＡＬＭ６細胞、ヒトＨＴ１０８０細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスＥＳ細胞、マウスｉＰＳ細胞及びニワトリＤＴ４０細胞から選ばれる細胞である［１］又は［２］に記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
［４］ＨＤＲによるゲノム編集法が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮシステム及びＺｎフィンガーヌクレアーゼシステムから選ばれるＨＤＲを利用した外来ＤＮＡ挿入法である［１］〜［３］のいずれか一つに記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
［５］ＨＤＲによるゲノム編集法が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９により誘発されるＨＤＲを利用した外来ＤＮＡ挿入法である［１］〜［４］のいずれか一つに記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
［６］前記１００ｂｐ〜３００ｂｐの相同性配列ＤＮＡが、ＰＣＲ又はＤＮＡ合成により得られるものである［１］〜［５］のいずれか一つに記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。［７］外来ＤＮＡが、タグ付加外来ＤＮＡ、プロモーター配列、転写終結配列、機能的遺伝子配列、薬剤選択マーカー遺伝子及びそれらの組み合わせから選ばれる外来ＤＮＡである［１］〜［６］のいずれか一つに記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
［８］セーフハーバー座位にｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ １（ＴＩＲ１）をコードする遺伝子を含む染色体を有することを特徴とする細胞。
［９］前記セーフハーバー座位がＡＡＶＳ１（ｔｈｅ ＡＡＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ １） ｌｏｃｕｓである［８］に記載の細胞。
［１０］さらに、前記染色体が前記ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結された、誘導性プロモーター、ウイルス性プロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、又は組織特異的プロモーターを含む［８］又は［９］に記載の細胞。
［１１］前記染色体が前記ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む、［１０］に記載の細胞。
［１２］前記誘導性プロモーターが、化学的誘導性プロモーター、熱ショック誘導性プロモーター、電磁気的誘導性プロモーター、核レセプター誘導性プロモーター及びホルモン誘導性プロモーターからなる群より選択される、［１１］に記載の細胞。
［１３］前記化学的誘導性プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーターである、［１２］に記載の細胞。
［１４］外来ＤＮＡの上流及び下流に連結されており、染色体上の挿入を行う部位と相同な配列を有する１００〜３００ｂｐのＤＮＡを利用して、前記外来ＤＮＡの挿入が行われた染色体を有することを特徴とする細胞。
［１５］さらに、前記染色体は、前記外来ＤＮＡの上流又は下流であって、前記１００〜３００ｂｐのＤＮＡに挟まれた領域に連結された薬剤選択マーカー遺伝子を含む、［１４］に記載の細胞。
［１６］目的タンパク質をコードする第一の遺伝子と、前記第一の遺伝子の上流又は下流に連結されたＭｉｎｉ−ａｕｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｄｅｇｒｏｎ（ｍＡＩＤ）をコードする第二の遺伝子と、を含む第一の染色体と、セーフハーバー座位にＴＩＲ１をコードする遺伝子を含む第二の染色体と、を有することを特徴とする細胞。
［１７］前記第一の染色体は、前記第一の遺伝子及び前記第二の遺伝子の上流及び下流に連結されており、染色体上の挿入が行う部位と相同な配列を有する１００〜３００ｂｐのＤＮＡを含む、［１６］に記載の細胞。
［１８］前記第一の染色体は、第一の遺伝子及び前記第二の遺伝子の上流又は下流であって、前記１００〜３００ｂｐのＤＮＡに挟まれた領域に連結された薬剤選択マーカー遺伝子を含む、［１６］又は［１７］に記載の細胞。
［１９］さらに、前記染色体が前記ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結された、誘導性プロモーター、ウイルス性プロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、又は組織特異的プロモーターを含む、［１６］〜［１８］のいずれか一つに記載の細胞。
［２０］前記染色体が前記ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む、［１９］に記載の細胞。
［２１］前記誘導性プロモーターが、化学的誘導性プロモーター、熱ショック誘導性プロモーター、電磁気的誘導性プロモーター、核レセプター誘導性プロモーター及びホルモン誘導性プロモーターからなる群より選択される、［２０］に記載の細胞。
［２２］前記化学的誘導性プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーターである、［２１］に記載の細胞。
［２３］［１６］〜［２２］のいずれか一つに記載の細胞を用いることを特徴とする目的タンパク質の分解方法。
ドナープラスミドを用いた本発明の方法によれば、ゲノム編集を利用したＨＤＲに必要なゲノムＤＮＡとの相同性配列の長さが１００ｂｐ〜３００ｂｐと短いので、クローニングする必要がなく、ＰＣＲやＤＮＡ合成で簡便に作製でき、数多くの遺伝子や標的ゲノム部位に網羅的に応用可能である。また、挿入可能な外来ＤＮＡとして蛍光タグ、精製タグ、デグロンタグ、薬剤選択マーカーなど大きな配列を挿入することができる。また、本発明の方法により外来ＤＮＡを任意の遺伝子に挿入し、該外来ＤＮＡを恒常的に発現する細胞を得ることができる。例えば、本発明の方法により得られる、目的タンパク質をコードする第一の遺伝子と、前記第一の遺伝子の下流に連結されたｍＡＩＤをコードする遺伝子を含む染色体と、セーフハーバー座位にｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ １（ＴＩＲ１）をコードする遺伝子を含む染色体とを有する細胞によれば、目的タンパク質の分解を効率良く誘導することができる。
＜＜動物細胞ゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法＞＞
本発明の動物細胞ゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法は、次の工程（１）及び（２）を有することを特徴とする。
（１）０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡの上流及び下流に、ゲノム上の挿入を行う部位と相同な配列を有する１００ｂｐ〜３００ｂｐのＤＮＡを結合したドナープラスミドを作成する工程。 （２）得られたドナープラスミドを用いたＨＤＲによるゲノム編集により、ゲノムの目的とする部位に０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡを挿入する工程
本発明の動物細胞ゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法は、次の工程（１）及び（２）を有することを特徴とする。
（１）０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡの上流及び下流に、ゲノム上の挿入を行う部位と相同な配列を有する１００ｂｐ〜３００ｂｐのＤＮＡを結合したドナープラスミドを作成する工程。 （２）得られたドナープラスミドを用いたＨＤＲによるゲノム編集により、ゲノムの目的とする部位に０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡを挿入する工程
本発明の方法において外来ＤＮＡ挿入の対象となる動物細胞は、株化された動物由来細胞やＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞であればよいが、株化されたヒト由来細胞、株化されたマウス由来細胞、株化されたニワトリ由来細胞、ヒトＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞及びマウスｉＰＳ細胞から選ばれる細胞が挙げられる。このうち、ゲノム上の挿入部位と相同な配列が１００ｂｐ〜３００ｂｐという短いＤＮＡであってもＨＤＲによるゲノム編集が効率良く進行する点から、ヒトＨＣＴ１１６細胞、ヒトＨＴ１０８０細胞、ヒトＮＡＬＭ６細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスＥＳ細胞、マウスｉＰＳ細胞及びニワトリＤＴ４０細胞から選ばれる細胞がより好ましく、ＨＣＴ１１６細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスＥＳ細胞及びマウスｉＰＳ細胞から選ばれる細胞が特に好ましい。
ゲノム上に挿入することができる外来ＤＮＡは、タグ付加の際の付加する遺伝子自体の大きさの点、機能的発現ユニットを挿入する点、薬剤選択マーカー遺伝子を付加する点から、０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの長さの外来ＤＮＡであり、１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡが好ましく、１ｋｂｐ〜８ｋｂｐの外来ＤＮＡがより好ましく、１ｋｂｐ〜５ｋｂｐの外来ＤＮＡがさらに好ましい。このような長さを有する外来ＤＮＡの例としては、タグ付加外来ＤＮＡ、プロモーター配列、転写終結配列、機能的遺伝子配列、薬剤選択マーカー遺伝子及びそれらの組み合わせ等が挙げられる。ここでタグの中には、蛍光タグ（ＧＦＰなど）、アフィニティータグ、デグロンタグ、局在タグ等が挙げられる。また、これらのタグの下流には、種々の機能を有する外来遺伝子（機能的遺伝子）を導入することができ、例えば薬剤選択マーカー遺伝子を導入することができる。
本発明において用いられる薬剤選択マーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ヒスティディノール耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン薬剤耐性遺伝子等が挙げられる。薬剤選択マーカー遺伝子を挿入することにより、該薬物を含む培地を用いて細胞を培養することで、外来ＤＮＡが導入された細胞を選択することができる。
まず、工程（１）では、挿入しようとする０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡの上流及び下流に、ゲノム上の挿入を行う部位と相同な配列を有する１００ｂｐ〜３００ｂｐのＤＮＡを結合したドナープラスミドを作成する。
ゲノム上の挿入を行う部位と相同な配列を有する１００ｂｐ〜３００ｂｐのＤＮＡは、１００ｂｐ〜３００ｂｐと短いのでＰＣＲ又はＤＮＡ合成で容易に入手することができる。すなわち、従来のＨＤＲを利用したゲノム編集法のように０．７ｋｂｐ以上もの長い相同部位のクローニングは必要ではない。オリゴＤＮＡとしては、１２５ｂｐ〜３００ｂｐが好ましく、１２５ｂｐ〜２５０ｂｐがより好ましく、１５０ｂｐ〜２５０ｂｐがさらに好ましく、１７０ｂｐ〜２５０ｂｐが特に好ましい。 当該ＤＮＡの配列自体は、宿主動物に関するデータベースから適宜決定することができる。ＤＮＡの配列が決定できれば、当該ＤＮＡをＤＮＡ合成で合成するか、当該ＤＮＡを増幅するための合成プライマーに相同配列を付加し、これらを用いたＰＣＲにより増幅させて作製することができる。
０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡの上流及び下流に、前記相同性領域を有するＤＮＡを結合させて、プラスミドにクローニングすることでドナープラスミドを作製する。用いられるプラスミドベクターとしては、対象とする動物細胞に導入可能なプラスミドベクターであればよい。そのようなプラスミドベクターとしては、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ５７などが挙げられる。
工程（１）のストラテジーの一例を図１に示す。 本発明の特徴として、このようなＰＣＲやＤＮＡ合成を利用した方法によりドナープラスミドを作成できる例を挙げることができる。
工程（２）は、得られたドナープラスミドをゲノム編集法により、ゲノムの目的とする部位に０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡを挿入する工程である。
ゲノム編集法としては、相同組換え修復（ＨＤＲ）を誘発するゲノム編集技術であればよく、例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼシステムが使用できる。このうちＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを用いるのがより好ましい。ＴＡＬＥＮシステムは、Transcription activator-like effector nuclease（ＴＡＬＥＮ）を用いるシステムであり、ＴＡＬＥＮはカスタム化された結合ドメインと非特異的なＦｏｋＩヌクレアーゼドメインとを融合させたものである。ＤＮＡ結合ドメインは、キサントモナスのプロテオバクテリアが分泌し宿主植物の遺伝子転写を変えさせる蛋白であるtranscription activator-like effectors（ＴＡＬＥ）由来の保存されたリピートからなっている。ＴＡＬＥＮシステムにより、前記プラスミドをゲノムの目的部位に挿入するには、ゲノム中の挿入部位に対するＴＡＬＥＮを作製し、挿入部位周辺に相同性をもつドナーベクターを作製する。これらベクターを共導入することにより、目的部位が切断され、それに引き続きドナーベクターを利用したＨＤＲにより、目的外来ＤＮＡが導入される。外来ＤＮＡに薬剤選択マーカーを持たせておくことにより、薬剤選択により外来ＤＮＡ導入が起きた細胞を効率よく選択できる。
一方、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、細菌や古細菌が有する、外部から侵入した核酸（ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ）に対する一種の獲得免疫として機能する座位を利用したシステムである。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムにより、前記プラスミドをゲノムの目的部位に挿入するには、ゲノム中の挿入部位を切断するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ベクター作製を行う。そのためには、目的部位にＣＡＳ９を誘導するガイドＲＮＡをコードする発現ベクター及びＣＡＳ９発現ベクターが必要である。これらベクターをドナーベクターと共導入することにより、目的部位が切断され、それに引き続きドナーベクターを利用したＨＤＲにより、目的外来ＤＮＡが導入される。外来ＤＮＡに薬剤選択マーカーを持たせておくことにより、薬剤選択により外来ＤＮＡ導入が起きた細胞を効率よく選択できる。
Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムは、ＺｎフィンガードメインとＤＮＡ切断ドメインからなる人工制限酵素を用いたゲノム編集である。一つのＺｎフィンガードメインは３塩基を認識するが、３〜５つのＺｎフィンガードメインを連結させることで、特定の９〜１５塩基配列を認識するＤＮＡ結合タンパク質を設計できる。このＤＮＡ結合タンパク質に、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを融合させることで、目的部位を切断する人工ヌクレアーゼＺＦＮを設計する。ＺＦＮシステムにより、前記プラスミドをゲノムの目的部位に挿入するには、ゲノム中の挿入部位に対するＺＦＮを作製し、挿入部位周辺に相同性をもつドナーベクターを作製する。これらベクターを共導入することにより、目的部位が切断され、それに引き続きドナーベクターを利用したＨＤＲにより、目的外来ＤＮＡが導入される。外来ＤＮＡに薬剤選択マーカーを持たせておくことにより、薬剤選択により外来ＤＮＡ導入が起きた細胞を効率よく選択できる。
本発明の方法によれば、ＰＣＲやＤＮＡ合成技術といった簡便な手段により作製したドナープラスミドを用いて、０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡを効率良く動物細胞のゲノム上に部位特異的に挿入することができる。また、二つの選択マーカーを同時に利用すれば、二つのアリル両方に一度に挿入できる。さらに、タグは、Ｃ末端だけでなく、Ｎ末端にも付加できる。また、ゲノム特定部位特異的な外来ＤＮＡの安定導入、内在性遺伝子コード領域に薬剤選択マーカー挿入を行うことによるノックアウト細胞の作製ができる。
＜＜動物細胞ゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法を用いて得られる細胞＞＞
本発明の動物細胞ゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法により、以下に示すような細胞を作製することができる。
本発明の動物細胞ゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法により、以下に示すような細胞を作製することができる。
また、以下に示す細胞は、動物細胞であればよく、動物細胞としては、上述の＜＜動物細胞ゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法＞＞において例示されたものと同様のもの等が挙げられる。
＜第１実施形態＞
一実施形態において、本発明は、セーフハーバー座位にｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ １（ＴＩＲ１）をコードする遺伝子を含む染色体を有する細胞を提供する。
一実施形態において、本発明は、セーフハーバー座位にｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ １（ＴＩＲ１）をコードする遺伝子を含む染色体を有する細胞を提供する。
本明細書において、「セーフハーバー座位」とは、恒常的且つ安定的に発現が行われている遺伝子領域であり、かつ当該領域に本来コードされている遺伝子が欠損又は改変された場合であっても、生命の維持が可能な領域を意味する。ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、外来ＤＮＡ（本実施形態においては、ＴＩＲ１をコードする遺伝子）をセーフハーバー座位に挿入する場合には、近傍にＰＡＭ配列を有することが好ましい。セーフハーバー座位としては、例えば、ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １０遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、ｂｅｔａ−Ａｃｔｉｎ遺伝子座、ＡＡＶＳ１（ｔｈｅ ＡＡＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ １）遺伝子座等が挙げられる。中でも、外来ＤＮＡ（本実施形態においては、ＴＩＲ１をコードする遺伝子）をＡＡＶＳ１遺伝子座に挿入することが好ましい。
本明細書において、「ＴＩＲ１」とは、ユビキチン／プロテアソーム系のタン
パク質分解において、Ｅ３ユビキチン化酵素複合体（ＳＣＦ複合体）を形成するサブユニットの一つであるＦ−ｂｏｘタンパク質であり、植物特有のタンパク質である。ＴＩＲ１は、成長ホルモンであるオーキシンの受容体となっており、オーキシンを受容することによって、オーキシン情報伝達系の抑制因子Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を認識して、前記タンパク質を分解することが知られている。
ＴＩＲ１をコードする遺伝子としては、植物由来のＴＩＲ１をコードする遺伝子であれば、その種類は限定されない。また、由来となる植物の種類も限定されず、例えば、シロイヌナズナ、イネ、ヒャクニチソウ、マツ、シダ、ヒメツリガネゴケ等が挙げられる。ＴＩＲ１をコードする遺伝子の具体例としては、例えば、ＴＩＲ１遺伝子、ＡＦＢ１遺伝子、ＡＦＢ２遺伝子、ＡＦＢ３遺伝子、ＦＢＸ１４遺伝子、ＡＦＢ５遺伝子等が挙げられる。
本実施形態の細胞は、いずれか一種類のＴＩＲ１をコードする遺伝子を有していてもよいし、二種類以上を有していてもよい。例えば、シロイヌナズナ由来のＴＩＲ１をコードする遺伝子の配列は、ＴＡＩＲウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／）に登録されており、各遺伝子のアクセッションナンバーは、下記表１の通りである。
パク質分解において、Ｅ３ユビキチン化酵素複合体（ＳＣＦ複合体）を形成するサブユニットの一つであるＦ−ｂｏｘタンパク質であり、植物特有のタンパク質である。ＴＩＲ１は、成長ホルモンであるオーキシンの受容体となっており、オーキシンを受容することによって、オーキシン情報伝達系の抑制因子Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を認識して、前記タンパク質を分解することが知られている。
ＴＩＲ１をコードする遺伝子としては、植物由来のＴＩＲ１をコードする遺伝子であれば、その種類は限定されない。また、由来となる植物の種類も限定されず、例えば、シロイヌナズナ、イネ、ヒャクニチソウ、マツ、シダ、ヒメツリガネゴケ等が挙げられる。ＴＩＲ１をコードする遺伝子の具体例としては、例えば、ＴＩＲ１遺伝子、ＡＦＢ１遺伝子、ＡＦＢ２遺伝子、ＡＦＢ３遺伝子、ＦＢＸ１４遺伝子、ＡＦＢ５遺伝子等が挙げられる。
本実施形態の細胞は、いずれか一種類のＴＩＲ１をコードする遺伝子を有していてもよいし、二種類以上を有していてもよい。例えば、シロイヌナズナ由来のＴＩＲ１をコードする遺伝子の配列は、ＴＡＩＲウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／）に登録されており、各遺伝子のアクセッションナンバーは、下記表１の通りである。
ＴＩＲ１をコードする遺伝子は、例えば、植物から抽出した天然のＤＮＡでもよいし、遺伝子工学によって合成したＤＮＡであってもよい。また、ＴＩＲ１をコードする遺伝子は、例えば、エキソンとイントロンを含むＤＮＡでもよいし、エキソンからなるｃＤＮＡであってもよい。ＴＩＲ１をコードする遺伝子は、例えば、ゲノムＤＮＡにおける全長配列またはｃＤＮＡにおける全長配列であってもよい。また、ＴＩＲ１をコードする遺伝子は、発現したタンパク質が、ＴＩＲ１として機能する範囲において、ゲノムＤＮＡにおける部分配列またはｃＤＮＡにおける部分配列であってもよい。
本明細書において、「ＴＩＲ１として機能する」とは、例えば、オーキシン類の存在下で、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を認識することを意味する。ＴＩＲ１がＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を認識できれば、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を分解できるからである。
本明細書において、「ＴＩＲ１として機能する」とは、例えば、オーキシン類の存在下で、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を認識することを意味する。ＴＩＲ１がＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を認識できれば、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を分解できるからである。
［プロモーター］
本実施形態の細胞は、ＴＩＲ１をコードする遺伝子の転写を制御するプロモーター配列が作動可能に連結されていることが好ましい。これによって、より確実にＴＩＲ１を発現できる。
本明細書において、「作動可能に連結」とは、遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター又は一連の転写因子結合部位）と発現させたい遺伝子（本実施形態においては、ＴＩＲ１をコードする遺伝子）との間の機能的連結を意味する。ここで、「発現制御配列」とは、その発現させたい遺伝子（本実施形態においては、ＴＩＲ１をコードする遺伝子）の転写を指向するものを意味する。
本実施形態の細胞は、ＴＩＲ１をコードする遺伝子の転写を制御するプロモーター配列が作動可能に連結されていることが好ましい。これによって、より確実にＴＩＲ１を発現できる。
本明細書において、「作動可能に連結」とは、遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター又は一連の転写因子結合部位）と発現させたい遺伝子（本実施形態においては、ＴＩＲ１をコードする遺伝子）との間の機能的連結を意味する。ここで、「発現制御配列」とは、その発現させたい遺伝子（本実施形態においては、ＴＩＲ１をコードする遺伝子）の転写を指向するものを意味する。
前記プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、細胞の種類等に応じて適宜決定できる。プロモーターの具体例としては、例えば、誘導性プロモーター、ウイルス性プロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、組織特異的プロモーター等が挙げられる。中でも、本実施形態の細胞において、ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターとしては、誘導性プロモーターであることが好ましい。
（誘導性プロモーター）
誘導性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、化学的誘導性プロモーター、熱ショック誘導性プロモーター、電磁気的誘導性プロモーター、核レセプター誘導性プロモーター、ホルモン誘導性プロモーター等が挙げられる。中でも、本実施形態の細胞において、ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーターとしては、化学的誘導性プロモーターであることが好ましい。
誘導性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、化学的誘導性プロモーター、熱ショック誘導性プロモーター、電磁気的誘導性プロモーター、核レセプター誘導性プロモーター、ホルモン誘導性プロモーター等が挙げられる。中でも、本実施形態の細胞において、ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーターとしては、化学的誘導性プロモーターであることが好ましい。
化学的誘導性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、サリチル酸誘導性プロモーター（国際公開第９５／１９４３３号、参照。）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｇａｔｚら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２，３９７−４０４、参照。）、エタノール誘導性プロモーター、亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター等が挙げられる。中でも、本実施形態の細胞において、ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結された化学的誘導性プロモーターとしては、テトラサイクリン誘導性プロモーターであることが好ましい。
熱ショック誘導性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、熱誘導性プロモーター(米国特許出願第０５１８７２８７号明細書、参照。)、低温誘導性プロモーター(米国特許出願第０５８４７１０２号明細書、参照。)等が挙げられる。
電磁気的誘導性プロモーターとしては、初期増殖領域−１（ＥＧＲ−１）プロモーター（米国特許出願第米国特許５２０６１５２号明細書、参照。）、ｃ−Ｊｕｎプロモーター等が挙げられる。
核レセプター誘導性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、オーファン核受容体ニワトリ卵白アルブミン上流プロモーター等が挙げられる。
ホルモン誘導性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、グルココルチコイド誘導性プロモーター（Ｌｕ及びＦｅｄｅｒｏｆｆ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６，４１９−２８，１９９５．参照）、ＭＭＴＶプロモーター、成長ホルモンプロモーター等が挙げられる。
（ウイルス性プロモーター）
ウイルス性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ＣＭＶ極初期プロモーター（例えば、米国特許第５１６８０６２号明細書、参照。）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のプロモーター（例えば、ＨＩＶ長末端リピート等）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター（例えば、ＲＳＶ長末端リピート等） 、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＳＶプロモーター（Ｌａｐ２プロモーター又はヘルペスチミジンキナーゼプロモーターなど（Ｗａｇｎｅｒ ｅ ｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ７８， １４４−１４５，１９８１．参照） 、ＳＶ４０又はエプスタイン バール ウイルス由来のプロモーター、アデノ随伴ウイルスプロモーター（例えば、ｐ５プロモーター等）等が挙げられる。
ウイルス性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ＣＭＶ極初期プロモーター（例えば、米国特許第５１６８０６２号明細書、参照。）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のプロモーター（例えば、ＨＩＶ長末端リピート等）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター（例えば、ＲＳＶ長末端リピート等） 、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＳＶプロモーター（Ｌａｐ２プロモーター又はヘルペスチミジンキナーゼプロモーターなど（Ｗａｇｎｅｒ ｅ ｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ７８， １４４−１４５，１９８１．参照） 、ＳＶ４０又はエプスタイン バール ウイルス由来のプロモーター、アデノ随伴ウイルスプロモーター（例えば、ｐ５プロモーター等）等が挙げられる。
（ハウスキーピング遺伝子プロモーター）
ハウスキーピング遺伝子プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子プロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター、β２−マイクログロブリン遺伝子プロモーター、ＨＰＲＴ １（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）遺伝子プロモーター等が挙げられる。
ハウスキーピング遺伝子プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子プロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター、β２−マイクログロブリン遺伝子プロモーター、ＨＰＲＴ １（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）遺伝子プロモーター等が挙げられる。
（組織特異的プロモーター）
組織特異的プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、黒色腫細胞又はメラニン細胞の場合は、チロシナーゼプロモーター又はＴＲＰ２プロモーター；乳房細胞又は乳癌の場合は、ＭＭＴＶプロモーター又はＷＡＰプロモーター；腸細胞又は腸癌の場合は、ビリンプロモーター又はＦＡＢＰプロモーター；膵細胞の場合は、ＰＤＸプロモーター；膵ベータ細胞の場合は、ＲＩＰプロモーター；ケラチノサイトの場合は、ケラチンプロモーター；前立腺上皮の場合は、プロバシンプロモーター；中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞又は中枢神経系の癌の場合は、ネスチンプロモーター又はＧＦＡＰプロモーター；ニューロンの場合は、チロシンヒドロキシラーゼ、Ｓ１００プロモーター又は神経フィラメントプロモーター；Edlundら、Science, 230:912-916(1985)に記載される、膵臓特異的プロモーター；肺癌の場合は、クラーラ細胞分泌タンパク質プロモーター；心細胞の場合は、αミオシンプロモーター等が挙げられる。
組織特異的プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、黒色腫細胞又はメラニン細胞の場合は、チロシナーゼプロモーター又はＴＲＰ２プロモーター；乳房細胞又は乳癌の場合は、ＭＭＴＶプロモーター又はＷＡＰプロモーター；腸細胞又は腸癌の場合は、ビリンプロモーター又はＦＡＢＰプロモーター；膵細胞の場合は、ＰＤＸプロモーター；膵ベータ細胞の場合は、ＲＩＰプロモーター；ケラチノサイトの場合は、ケラチンプロモーター；前立腺上皮の場合は、プロバシンプロモーター；中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞又は中枢神経系の癌の場合は、ネスチンプロモーター又はＧＦＡＰプロモーター；ニューロンの場合は、チロシンヒドロキシラーゼ、Ｓ１００プロモーター又は神経フィラメントプロモーター；Edlundら、Science, 230:912-916(1985)に記載される、膵臓特異的プロモーター；肺癌の場合は、クラーラ細胞分泌タンパク質プロモーター；心細胞の場合は、αミオシンプロモーター等が挙げられる。
本実施形態において、ＴＩＲ１をコードする遺伝子は、該ＴＩＲ１をコードする遺伝子の下流（３’側）に、ｍＲＮＡの３’末端のポリアデニル化に必要なポリアデニル化シグナルが作動可能に連結されていてもよい。ポリアデニル化シグナルとしては、上記のウイルス由来、各種ヒト又は非ヒト動物由来の各遺伝子に含まれるポリアデニル化シグナル、例えば、ＳＶ４０の後期遺伝子又は初期遺伝子、ウサギβグロビン遺伝子、ウシ成長ホルモン遺伝子、ヒトＡ３アデノシン受容体遺伝子等のポリアデニル化シグナル等を挙げることができる。その他ＴＩＲ１をコードする遺伝子をさらに高発現させるために、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、イントロンの一部をプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間或いは翻訳領域の３’下流に連結してもよい。
本実施形態において、ＴＩＲ１をコードする遺伝子は、該ＴＩＲ１をコードする遺伝子の上流（５’側）又は下流（３’側）に、１つ又は複数の核局在化配列（ＮＬＳ）が作動可能に連結されていてもよい。
ＮＬＳとしては、例えば、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）を有する、ＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ;ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２）を有するヌクレオプラスミンの二分ＮＬＳ);アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３）又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号４）を有するｃ−ｍｙｃ ＮＬＳ;配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号５）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ;インポーチン−アルファ由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号６）;筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号７）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号８）;ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号９）;マウスｃ−ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１０）;インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号１１）及びＰＫＱＫＫＲ（配列番号１２）;肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１３）;マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１４）;ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１５）;ステロイドホルモンレセプター（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１６）等が挙げられ、これらに限定されない。
本実施形態において、ＴＩＲ１をコードする遺伝子は、該ＴＩＲ１をコードする遺伝子の上流（５’側）又は下流（３’側）に、１つ又は複数の蛍光タンパク質等のマーカー遺伝子が作動可能に連結されていてもよい。蛍光タンパク質としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（Ｂｌｕｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＦＰ）、シアン蛍光蛋白質（Ｃｙａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、赤色蛍光蛋白質（Ｒｅｄ ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）等が挙げられる。
また、本実施形態の細胞に、目的タンパク質をコードする第一の遺伝子と、前記第一の遺伝子の下流に連結されたＭｉｎｉ−ａｕｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｄｅｇｒｏｎ（ｍＡＩＤ）をコードする第二の遺伝子と、前記第二の遺伝子の下流に連結された薬剤選択マーカー遺伝子とを含むベクターを導入することにより、目的タンパク質の分解評価系として用いることができる。
ｍＡＩＤの詳細については、後述の＜第３実施形態＞において、詳細に説明する。また、前記第一の遺伝子、前記第二遺伝子及び前記薬剤選択マーカー遺伝子を含むベクターとしては、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス、肝炎ウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
前記ベクターは、前記第一の遺伝子、前記第二遺伝子及び前記薬剤選択マーカー遺伝子の５’末端又は３’末端に、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、ＮＬＳ、蛍光タンパク質のマーカー遺伝子等が作動可能に連結されていてもよい。
＜第２実施形態＞
一実施形態において、本発明は、外来ＤＮＡの上流及び下流に連結されており、染色体上の挿入を行う部位と相同な配列を有する１００〜３００ｂｐのＤＮＡを利用して、前記外来ＤＮＡの挿入が行われた染色体を有する、細胞を提供する。
一実施形態において、本発明は、外来ＤＮＡの上流及び下流に連結されており、染色体上の挿入を行う部位と相同な配列を有する１００〜３００ｂｐのＤＮＡを利用して、前記外来ＤＮＡの挿入が行われた染色体を有する、細胞を提供する。
本実施形態において、「外来ＤＮＡ」としては、特別な限定はなく、上述の＜＜動物細胞ゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法＞＞において例示されたものと同様のもの等が挙げられる。
また、本実施形態において、ゲノム上の挿入を行う部位と相同な配列を有するＤＮＡの長さ（鎖長）としては、１００ｂｐ〜３００ｂｐであり、１２５ｂｐ〜３００ｂｐが好ましく、１２５ｂｐ〜２５０ｂｐがより好ましく、１５０ｂｐ〜２５０ｂｐがさらに好ましく、１７０ｂｐ〜２５０ｂｐが特に好ましい。
本実施形態の細胞において、外来ＤＮＡが挿入されている染色体としては、特別な限定はなく、例えば、上述の「セーフハーバー座位」であることが好ましい。「セーフハーバー座位」に挿入されることにより、外来ＤＮＡがコードするタンパク質を安定的且つ恒常的に発現することができる。
さらに、本実施形態の細胞において、前記染色体は、前記外来ＤＮＡの上流又は下流であって、前記１００〜３００ｂｐのＤＮＡに挟まれた領域に連結された薬剤選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。薬剤選択マーカー遺伝子としては、上述の＜＜動物細胞ゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法＞＞において例示されたものと同様のもの等が挙げられる。
＜第３実施形態＞
一実施形態において、本発明は、目的タンパク質をコードする第一の遺伝子と、前記第一の遺伝子の上流又は下流に連結されたＭｉｎｉ−ａｕｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｄｅｇｒｏｎ（ｍＡＩＤ）をコードする第二の遺伝子と、を含む第一の染色体と、セーフハーバー座位にＴＩＲ１をコードする遺伝子を含む第二の染色体と、を有する細胞を提供する。
一実施形態において、本発明は、目的タンパク質をコードする第一の遺伝子と、前記第一の遺伝子の上流又は下流に連結されたＭｉｎｉ−ａｕｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｄｅｇｒｏｎ（ｍＡＩＤ）をコードする第二の遺伝子と、を含む第一の染色体と、セーフハーバー座位にＴＩＲ１をコードする遺伝子を含む第二の染色体と、を有する細胞を提供する。
本実施形態の細胞において、「目的タンパク質」は、本実施形態の細胞を用いたタンパク質分解評価系において、分解を誘導したいタンパク質であれば、特別な限定はない。また、目的タンパク質は、挿入された外来遺伝子がコードするタンパク質であってもよく、細胞に内在するタンパク質であってもよい。
本明細書において、「ｍＡＩＤ」とは、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列からなるタンパク質であって、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインＩＩ領域のＮ末端側及びＣ末端側に少なくとも２個ずつのＬｙｓ残基を含む領域からなる配列、又は該配列を２個以上連結してなる配列からなるタンパク質を意味する。
本実施形態の細胞において、ｍＡＩＤをコードする第二の遺伝子を有することにより、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質全長やドメインＩＩ領域等を使用する場合に比べて、目的タンパク質の分解誘導能が向上し、かつ細胞の死亡が抑制され、安定した目的タンパク質分解誘導性が得られる。
本実施形態の細胞において、ｍＡＩＤをコードする第二の遺伝子を有することにより、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質全長やドメインＩＩ領域等を使用する場合に比べて、目的タンパク質の分解誘導能が向上し、かつ細胞の死亡が抑制され、安定した目的タンパク質分解誘導性が得られる。
一般的に、「Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質」とは、全長２５ＫＤａ程度のタンパク質であり、Ｎ末端側からドメインＩ、ドメインＩＩ、ドメインＩＩＩ及びドメインＩＶ等を有するタンパク質である。このうち、ドメインＩＩだけでも目的タンパク質の分解誘導能の向上はみられず、Ｎ末端からドメインＩＩまでの配列でも目的タンパク質の分解誘導能の向上はみられない。
これに対し、ドメインＩＩのＮ末端側とＣ末端側に少なくとも２個ずつのＬｙｓ残基を含む領域であって、ドメインＩを含まず、ドメインＩＩＩは一部含んでいてもよい領域からなる配列からなるタンパク質を有することにより、目的タンパク質の分解誘導能が顕著に向上する。また、当該配列を２個以上連結した配列を使用すると、目的タンパク質の分解誘導能がさらに向上する。
これに対し、ドメインＩＩのＮ末端側とＣ末端側に少なくとも２個ずつのＬｙｓ残基を含む領域であって、ドメインＩを含まず、ドメインＩＩＩは一部含んでいてもよい領域からなる配列からなるタンパク質を有することにより、目的タンパク質の分解誘導能が顕著に向上する。また、当該配列を２個以上連結した配列を使用すると、目的タンパク質の分解誘導能がさらに向上する。
Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質をコードする遺伝子としては、植物由来のＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子であれば、その種類について特別な限定はない。前記植物の種類について特別な限定はなく、シロイヌナズナＩＡＡ１７遺伝子が好ましい。Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質をコードする遺伝子の具体例としては、例えば、ＩＡＡ１遺伝子、ＩＡＡ２遺伝子、ＩＡＡ３遺伝子、ＩＡＡ４遺伝子、ＩＡＡ５遺伝子、ＩＡＡ６遺伝子、ＩＡＡ７遺伝子、ＩＡＡ８遺伝子、ＩＡＡ９遺伝子、ＩＡＡ１０遺伝子、ＩＡＡ１１遺伝子、ＩＡＡ１２遺伝子、ＩＡＡ１３遺伝子、ＩＡＡ１４遺伝子、ＩＡＡ１５遺伝子、ＩＡＡ１６遺伝子、ＩＡＡ１７遺伝子、ＩＡＡ１８遺伝子、ＩＡＡ１９遺伝子、ＩＡＡ２０遺伝子、ＩＡＡ２６遺伝子、ＩＡＡ２７遺伝子、ＩＡＡ２８遺伝子、ＩＡＡ２９遺伝子、ＩＡＡ３０遺伝子、ＩＡＡ３１遺伝子、ＩＡＡ３２遺伝子、ＩＡＡ３３遺伝子及びＩＡＡ３４遺伝子等が挙げられる。
本実施形態の細胞は、いずれか一種の前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質をコードする遺伝子の部分配列を有していてもよいし、二種類以上を有していてもよい。例えば、シロイヌナズナ由来のＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の配列は、ＴＡＩＲ（ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）に登録されており、各遺伝子のアクセッションナンバーは、次のとおりである。
ＩＡＡ１遺伝子（ＡＴ４Ｇ１４５６０）、ＩＡＡ２遺伝子（ＡＴ３Ｇ２３０３０）、ＩＡＡ３遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４２４０）、ＩＡＡ４遺伝子（ＡＴ５Ｇ４３７００）、ＩＡＡ５遺伝子（ＡＴ１Ｇ１５５８０）、ＩＡＡ６遺伝子（ＡＴ１Ｇ５２８３０）、ＩＡＡ７遺伝子（ＡＴ３Ｇ２３０５０）、ＩＡＡ８遺伝子（ＡＴ２Ｇ２２６７０）、ＩＡＡ９遺伝子（ＡＴ５Ｇ６５６７０）、ＩＡＡ１０遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４１００）、ＩＡＡ１１遺伝子（ＡＴ４Ｇ２８６４０）、ＩＡＡ１２遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４５５０）、ＩＡＡ１３遺伝子（ＡＴ２Ｇ３３３１０）、ＩＡＡ１４遺伝子（ＡＴ４Ｇ１４５５０）、ＩＡＡ１５遺伝子（ＡＴ１Ｇ８０３９０）、ＩＡＡ１６遺伝子（ＡＴ３Ｇ０４７３０）、ＩＡＡ１７遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４２５０）、ＩＡＡ１８遺伝子（ＡＴ１Ｇ５１９５０）、ＩＡＡ１９遺伝子（ＡＴ３Ｇ１５５４０）、ＩＡＡ２０遺伝子（ＡＴ２Ｇ４６９９０）、ＩＡＡ２６遺伝子（ＡＴ３Ｇ１６５００）、ＩＡＡ２７遺伝子（ＡＴ４Ｇ２９０８０）、ＩＡＡ２８遺伝子（ＡＴ５Ｇ２５８９０）、ＩＡＡ２９遺伝子（ＡＴ４Ｇ３２２８０）、ＩＡＡ３０遺伝子（ＡＴ３Ｇ６２１００）、ＩＡＡ３１遺伝子（ＡＴ３Ｇ１７６００）、ＩＡＡ３２遺伝子（ＡＴ２Ｇ０１２００）、ＩＡＡ３３遺伝子（ＡＴ５Ｇ５７４２０）及びＩＡＡ３４遺伝子（ＡＴ１Ｇ１５０５０）。
本実施形態の細胞は、いずれか一種の前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質をコードする遺伝子の部分配列を有していてもよいし、二種類以上を有していてもよい。例えば、シロイヌナズナ由来のＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の配列は、ＴＡＩＲ（ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）に登録されており、各遺伝子のアクセッションナンバーは、次のとおりである。
ＩＡＡ１遺伝子（ＡＴ４Ｇ１４５６０）、ＩＡＡ２遺伝子（ＡＴ３Ｇ２３０３０）、ＩＡＡ３遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４２４０）、ＩＡＡ４遺伝子（ＡＴ５Ｇ４３７００）、ＩＡＡ５遺伝子（ＡＴ１Ｇ１５５８０）、ＩＡＡ６遺伝子（ＡＴ１Ｇ５２８３０）、ＩＡＡ７遺伝子（ＡＴ３Ｇ２３０５０）、ＩＡＡ８遺伝子（ＡＴ２Ｇ２２６７０）、ＩＡＡ９遺伝子（ＡＴ５Ｇ６５６７０）、ＩＡＡ１０遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４１００）、ＩＡＡ１１遺伝子（ＡＴ４Ｇ２８６４０）、ＩＡＡ１２遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４５５０）、ＩＡＡ１３遺伝子（ＡＴ２Ｇ３３３１０）、ＩＡＡ１４遺伝子（ＡＴ４Ｇ１４５５０）、ＩＡＡ１５遺伝子（ＡＴ１Ｇ８０３９０）、ＩＡＡ１６遺伝子（ＡＴ３Ｇ０４７３０）、ＩＡＡ１７遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４２５０）、ＩＡＡ１８遺伝子（ＡＴ１Ｇ５１９５０）、ＩＡＡ１９遺伝子（ＡＴ３Ｇ１５５４０）、ＩＡＡ２０遺伝子（ＡＴ２Ｇ４６９９０）、ＩＡＡ２６遺伝子（ＡＴ３Ｇ１６５００）、ＩＡＡ２７遺伝子（ＡＴ４Ｇ２９０８０）、ＩＡＡ２８遺伝子（ＡＴ５Ｇ２５８９０）、ＩＡＡ２９遺伝子（ＡＴ４Ｇ３２２８０）、ＩＡＡ３０遺伝子（ＡＴ３Ｇ６２１００）、ＩＡＡ３１遺伝子（ＡＴ３Ｇ１７６００）、ＩＡＡ３２遺伝子（ＡＴ２Ｇ０１２００）、ＩＡＡ３３遺伝子（ＡＴ５Ｇ５７４２０）及びＩＡＡ３４遺伝子（ＡＴ１Ｇ１５０５０）。
本実施形態の細胞において、ｍＡＩＤを構成するアミノ酸数としては、３２〜８０アミノ酸残基が好ましく、５０〜８０アミノ酸残基がより好ましく、５０〜７５アミノ酸残基がさらに好ましく、５０〜７０アミノ酸残基がさらに好ましい。
また、ｍＡＩＤを構成するアミノ酸配列としては、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインＩＩ領域のＮ末端側及びＣ末端側に２〜５個ずつ、より好ましくは２〜４個ずつのＬｙｓ残基を含む３２〜８０アミノ酸残基からなる配列であることが好ましい。
また、本実施形態の細胞において、前記第一の染色体は、前記第一の遺伝子及び前記第二の遺伝子の上流及び下流に染色体上の挿入を行う部位と相同な配列を有する１００〜３００ｂｐのＤＮＡを含んでいてもよい。ゲノム上の挿入を行う部位と相同な配列を有するＤＮＡの長さ（鎖長）としては、１００ｂｐ〜３００ｂｐであり、１２５ｂｐ〜３００ｂｐが好ましく、１２５ｂｐ〜２５０ｂｐがより好ましく、１５０ｂｐ〜２５０ｂｐがさらに好ましく、１７０ｂｐ〜２５０ｂｐが特に好ましい。
本実施形態の細胞において、前記第一の染色体は、第一の遺伝子及び前記第二の遺伝子の上流又は下流であって、前記１００〜３００ｂｐのＤＮＡに挟まれた領域に連結された薬剤選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。薬剤選択マーカー遺伝子としては、上述の＜＜動物細胞ゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法＞＞において例示されたものと同様のもの等が挙げられる。
また、本実施形態の細胞において、ＴＩＲ１をコードする遺伝子としては、上述の＜第1実施形態＞において例示されたものと同様のもの等が挙げられる。
本実施形態の細胞は、ＴＩＲ１をコードする遺伝子の転写を制御するプロモーター配列が作動可能に連結されていることが好ましい。これによって、より確実にＴＩＲ１を発現できる。
前記プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、細胞の種類等に応じて適宜決定できる。プロモーターの具体例としては、例えば、誘導性プロモーター、ウイルス性プロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、組織特異的プロモーター等が挙げられる。中でも、本実施形態の細胞において、ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターとしては、誘導性プロモーターであることが好ましい。
誘導性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、化学的誘導性プロモーター、熱ショック誘導性プロモーター、電磁気的誘導性プロモーター、核レセプター誘導性プロモーター、ホルモン誘導性プロモーター等が挙げられる。中でも、本実施形態の細胞において、ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーターとしては、化学的誘導性プロモーターであることが好ましい。
化学的誘導性プロモーターとしては、特別な限定はなく、上述の＜第1実施形態＞において例示されたものと同様のもの等が挙げられる。中でも、本実施形態の細胞において、ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結された化学的誘導性プロモーターとしては、テトラサイクリン誘導性プロモーターであることが好ましい。
また、本実施形態の細胞において、熱ショック誘導性プロモーター、電磁気的誘導性プロモーター、核レセプター誘導性プロモーター、ホルモン誘導性プロモーター、イルス性プロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、及び組織特異的プロモーターとしては、上述の＜第1実施形態＞において例示されたものと同様のもの等が挙げられる。
本実施形態の細胞を用いることにより、目的のタンパク質を容易に分解することができる。本実施形態の細胞を用いて、目的のタンパク質を分解する方法としては、まず、本実施形態のオーキシン類を作用させる。オーキシン類を作用後、１５〜３０分でほぼ完全に目的のタンパク質は分解される。
オーキシン類の添加量は、制限されず、例えば、オーキシン類の種類に応じて適宜決定できる。具体例としては、１μＭ〜１ｍＭであり、好ましくは２０μＭ〜５００μＭ培地に添加する。
オーキシンとしては、例えば、１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、インドール−３−酢酸等が挙げられる。また、この他にも、前記ＮＡＡ等と同様の生理活性を有する化合物群が挙げられ、例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、４−クロロフェノキシ酢酸、（２，４，５−トリクロロフェノキシ）酢酸、１−ナフタレンアセトアミド、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、４−パラクロロ酢酸等がある。例えば、代謝によってオーキシンの生理活性を有することとなる前躯体も使用できる。例えば、宿主細胞におけるエステラーゼやβ−酸化酵素によりオーキシン活性を有する物質に変換される物質が好ましい。具体例としては、例えば、インドール−３−酢酸メチルエステルやインドール−３−酪酸等が挙げられる。
オーキシン類の添加方法としては、例えば、本実施形態の細胞を含有する培地に対して行えばよい。
このように、オーキシン類の添加により目的タンパク質の分解が速やかに誘導できるので、オーキシン類を添加しない場合と対比することにより、目的タンパク質の影響を検討することができる。より具体的には、本実施形態の細胞にオーキシン類を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、前記オーキシン類を除去して、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する方法、又は本実施形態の細胞にオーキシン類を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、オーキシン阻害物質を添加して、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する方法等によって検討することができる。
以下、実施例及び比較例等を挙げて本発明をさらに詳述するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。
［実施例１］ＭＣＭ８へのＧＦＰ付加
（１）図２のストラテジーに従って、ドナープラスミドを作製し、ゲノム上の標的部位ＭＣＭ８遺伝子に外来遺伝子を挿入した。外来遺伝子としては、図２記載のような、ＧＦＰ−ネオマイシン遺伝子を用いた。
（１）図２のストラテジーに従って、ドナープラスミドを作製し、ゲノム上の標的部位ＭＣＭ８遺伝子に外来遺伝子を挿入した。外来遺伝子としては、図２記載のような、ＧＦＰ−ネオマイシン遺伝子を用いた。
（２）ＰＣＲの鋳型にはｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター（クローンテック社）を用いた。ＧＦＰ−ネオマイシン遺伝子を増幅させるために、以下の二つのオリゴＤＮＡを合成した。
５’−CATATTATTATTTGAGAGATTTATTTTAAAAGTAATATTTTGACATGTTACTTAATGGGCTAAACCTTTTGATGTTTTCTTCCAGGTTGCTGATTTTGAAAATTTTATTGGATCACTAAATGACCAGGGTTACCTCTTGAAAAAAGGCCCAAAAGTTTACCAGCTTCAAACTATGatggtgagcaagggcgaggagctgt−３’（配列番号１７）
５’−TATAATACTTTTGGGACATCATTTTTCAGAGAACAGTATTTGACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCTGTCTGTCTGTGCGTGCACGCATATCTTCACTGAGATGGCTTTAATCTGCAATAAACCCAGGAGGCCCTAACTTGGTGAAGTCCTaacgacccaacaccgtgcgttttat−３’（配列番号１８）
上記配列番号１及び配列番号２において、大文字部分は導入先のＭＣＭ８ゲノムとの相同性領域（１７５ｂ）、小文字部分はｐＥＧＦＰとの相同性部分である（２５ｂ）。
（３）ＰＣＲ
上記鋳型プラスミドおよびオリゴＤＮＡを、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）を取扱説明書に準じてＰＣＲ増幅した。増幅されたＤＮＡはおよそ３．５ｋｂｐである。
上記鋳型プラスミドおよびオリゴＤＮＡを、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）を取扱説明書に準じてＰＣＲ増幅した。増幅されたＤＮＡはおよそ３．５ｋｂｐである。
（４）ドナープラスミドの構築
ＰＣＲで増幅したＤＮＡをｐＣＲ ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（ライフテクノロジー社）に取扱説明書に準じてブラントエンドライゲーションによりクローニングした。
ＰＣＲで増幅したＤＮＡをｐＣＲ ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（ライフテクノロジー社）に取扱説明書に準じてブラントエンドライゲーションによりクローニングした。
（５）図２に示すように、ＭＣＭ８遺伝子のＣ末端コード領域を切断する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９発現用ベクターｐＸ３３０のＢｂｓＩに認識部位を与えるため下記のオリゴＤＮＡをハイブリダイズさせて導入した。
５’−caccGCCAGCTTCAAACTATGTAAA−３’（配列番号１９）５’−aaacTTTACATAGTTTGAAGCTGGC−３’（配列番号２０）
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９のｐＸ３３０プラスミド構築はNat. Protocols, Vol.8 No.11, P2281-2307(2013)の方法に従った。
（６）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いたＨＣＴ１１６への挿入
６ウェルプレートに増殖中のヒトＨＣＴ１１６細胞に、ＭＣＭ８遺伝子の標的部分を切断するためのｐＸ３３０を０．８μｇと作製したドナーベクター１μｇを混ぜ合わせ、ＦｕｇｅｎｅＨＤ（プロメガ社）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションに際しては取扱説明書に準じてＤＮＡとＦｕｇｅｎｅＨＤを混ぜ合わせて１５分放置したのち、培地に滴下した。
６ウェルプレートに増殖中のヒトＨＣＴ１１６細胞に、ＭＣＭ８遺伝子の標的部分を切断するためのｐＸ３３０を０．８μｇと作製したドナーベクター１μｇを混ぜ合わせ、ＦｕｇｅｎｅＨＤ（プロメガ社）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションに際しては取扱説明書に準じてＤＮＡとＦｕｇｅｎｅＨＤを混ぜ合わせて１５分放置したのち、培地に滴下した。
（７）細胞のクローニング
トランスフェクション２日後、細胞を希釈しＧ４１８を７００μｇ／ｍＬを含む培地で１３日間培養することで、ネオマイシン耐性になった細胞を選択するとともにコロニーを形成させた。
トランスフェクション２日後、細胞を希釈しＧ４１８を７００μｇ／ｍＬを含む培地で１３日間培養することで、ネオマイシン耐性になった細胞を選択するとともにコロニーを形成させた。
（８）ゲノムＰＣＲによる挿入の確認
各コロニーを単離後、細胞を増やしたのちにゲノムＤＮＡを精製しＰＣＲによるＤＮＡ挿入の確認を行った。挿入確認に用いたプライマーは図３に示すＡとＢ及びＡとＣの組み合わせを用いた。図３に示すように、プライマーＡとＢの組み合わせでは、挿入が起こらなかった場合は特異的なＤＮＡ増幅は見られない（左ゲル写真ＷＴ）。一方で、期待した挿入が１アリルにでも起きると０．７５ｋｂのＤＮＡが増幅される（左ゲル写真ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓおよびｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）。プライマーＡとＣの組み合わせでは、挿入が起こらなかったアリルから場合に０．６ｋｂのＤＮＡが増幅され、挿入があったアリルから３．６ｋｂのＤＮＡが増幅される。片アリルのみに挿入されたクローンからは、０．６ｋｂｐと３．６ｋｂｐ両方のＤＮＡが増幅される（右ゲル写真ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）。両アリル挿入がある場合は３．６ｋｂｐのＤＮＡのみ増幅される（右ゲル写真ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）。
各コロニーを単離後、細胞を増やしたのちにゲノムＤＮＡを精製しＰＣＲによるＤＮＡ挿入の確認を行った。挿入確認に用いたプライマーは図３に示すＡとＢ及びＡとＣの組み合わせを用いた。図３に示すように、プライマーＡとＢの組み合わせでは、挿入が起こらなかった場合は特異的なＤＮＡ増幅は見られない（左ゲル写真ＷＴ）。一方で、期待した挿入が１アリルにでも起きると０．７５ｋｂのＤＮＡが増幅される（左ゲル写真ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓおよびｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）。プライマーＡとＣの組み合わせでは、挿入が起こらなかったアリルから場合に０．６ｋｂのＤＮＡが増幅され、挿入があったアリルから３．６ｋｂのＤＮＡが増幅される。片アリルのみに挿入されたクローンからは、０．６ｋｂｐと３．６ｋｂｐ両方のＤＮＡが増幅される（右ゲル写真ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）。両アリル挿入がある場合は３．６ｋｂｐのＤＮＡのみ増幅される（右ゲル写真ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）。
（９）ウェスタンブロットによるＭＣＭ８−ＧＦＰ融合タンパク質発現の確認
ゲノムＰＣＲによりＭＣＭ８−ＧＦＰ挿入が確認されたクローンから、タンパク質を抽出し、ＭＣＭ８抗体およびＧＦＰ抗体を用いてウェスタンブロットを行った。ＧＦＰの付加していないＭＣＭ８は９３ｋＤａに検出される。一方で、ＭＣＭ８−ＧＦＰ融合タンパク質は１３０ｋＤａに検出される。図４に示すように、ＭＣＭ８抗体を用いた場合、もとのＨＣＴ１１６細胞（ＷＴ）には９３ｋＤａのバンドが検出されるのに対し、片アリルもしくは両アリルにＧＦＰが付加された場合１４０ｋＤａのバンドが検出される。ＧＦＰ抗体は１４０ｋＤａの融合タンパク質しか検出しない。これらの結果から期待されたＭＣＭ８タンパク質へのＧＦＰ付加が起きたことが確認された。
ゲノムＰＣＲによりＭＣＭ８−ＧＦＰ挿入が確認されたクローンから、タンパク質を抽出し、ＭＣＭ８抗体およびＧＦＰ抗体を用いてウェスタンブロットを行った。ＧＦＰの付加していないＭＣＭ８は９３ｋＤａに検出される。一方で、ＭＣＭ８−ＧＦＰ融合タンパク質は１３０ｋＤａに検出される。図４に示すように、ＭＣＭ８抗体を用いた場合、もとのＨＣＴ１１６細胞（ＷＴ）には９３ｋＤａのバンドが検出されるのに対し、片アリルもしくは両アリルにＧＦＰが付加された場合１４０ｋＤａのバンドが検出される。ＧＦＰ抗体は１４０ｋＤａの融合タンパク質しか検出しない。これらの結果から期待されたＭＣＭ８タンパク質へのＧＦＰ付加が起きたことが確認された。
（９）用いた相同配列の長さと挿入効率との関係を表２に示す。
表１より、相同部位の塩基量は１２５ｂｐ以上の長さで、効率良く外来ＤＮＡの挿入ができることがわかる。また、ＭＣＭ８遺伝子のゲノム切断用のｐＸ３３０ベクター無しの場合は、外来ＤＮＡの挿入は全く起こらないことから、挿入は部位特異的ゲノムＤＮＡ切断に依存していることがわかる。
なお、１７５ｂｐのＰＣＲに用いたプライマーを配列番号２１（５’−CATATTATTATTTGAGAGATTTATTTTAAAAGTAATATTTTGACATGTTACTTAATGGGCTAAACCTTTTGATGTTTTCTTCCAGGTTGCTGATTTTGAAAATTTTATTGGATCACTAAATGACCAGGGTTACCTCTTGAAAAAAGGCCCAAAAGTTTACCAGCTTCAAACTATGatggtgagcaagggcgaggagctgt−３’）と配列番号２２（５’−TATAATACTTTTGGGACATCATTTTTCAGAGAACAGTATTTGACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCTGTCTGTCTGTGCGTGCACGCATATCTTCACTGAGATGGCTTTAATCTGCAATAAACCCAGGAGGCCCTAACTTGGTGAAGTCCTaacgacccaacaccgtgcgttttat−３’）に、１５０ｂｐのＰＣＲに用いたプライマーを配列番号２３（５’−TTAAAAGTAATATTTTGACATGTTACTTAATGGGCTAAACCTTTTGATGTTTTCTTCCAGGTTGCTGATTTTGAAAATTTTATTGGATCACTAAATGACCAGGGTTACCTCTTGAAAAAAGGCCCAAAAGTTTACCAGCTTCAAACTATGatggtgagcaagggcgaggagctgt−３’）と配列番号２４（５’−TCAGAGAACAGTATTTGACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCTGTCTGTCTGTGCGTGCACGCATATCTTCACTGAGATGGCTTTAATCTGCAATAAACCCAGGAGGCCCTAACTTGGTGAAGTCCTaacgacccaacaccgtgcgttttat−３’）に、１２５ｂｐのＰＣＲに用いたプライマーを配列番号２５（５’−CTTAATGGGCTAAACCTTTTGATGTTTTCTTCCAGGTTGCTGATTTTGAAAATTTTATTGGATCACTAAATGACCAGGGTTACCTCTTGAAAAAAGGCCCAAAAGTTTACCAGCTTCAAACTATGatggtgagcaagggcgaggagctgt−３’）と配列番号２６（５’−TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCTGTCTGTCTGTGCGTGCACGCATATCTTCACTGAGATGGCTTTAATCTGCAATAAACCCAGGAGGCCCTAACTTGGTGAAGTCCTaacgacccaacaccgtgcgttttat−３’）に、８０ｂｐのＰＣＲに用いたプライマーを配列番号２７（５’−TTGAAAATTTTATTGGATCACTAAATGACCAGGGTTACCTCTTGAAAAAAGGCCCAAAAGTTTACCAGCTTCAAACTATGatggtgagcaagggcgagga−３’）と配列番号２８（５’−GTCTGTGCGTGCACGCATATCTTCACTGAGATGGCTTTAATCTGCAATAAACCCAGGAGGCCCTAACTTGGTGAAGTCCTaacgacccaacaccgtgcgt−３’）に示す。いずれのプライマーも大文字は挿入箇所周辺ゲノムとの相同領域、小文字はＰＣＲテンプレートとの相同領域である。
［実施例２］ダブルノックインによるＲＡＤ２１デグロン細胞の作製
（１）ドナーベクターの作製
図５に示すようにｍＡＩＤ（ミニＡＩＤタグ）とＣｌｏｖｅｒ（改変ＧＦＰ）およびネオマイシンもしくはハイグロマイシン耐性遺伝子をもつプラスミドを鋳型として、ＲＡＤ２１遺伝子Ｃ末端コード領域と５’に１８０ｂ（５’−GCTAAAACTGGAGCTGAATCTATCAGTTTGCTTGAGTTATGTCGAAATACGAACAGAAAACAAGCTGCCGCAAAGTTCTACAGCTTCTTGGTTCTTAAAAAGCAGCAAGCTATTGAGCTGACACAGGAAGAACCGTACAGTGACATCATCGCAACACCTGGACCAAGGTTCCATATTATAggatccggtgcaggcgcc−３’：配列番号２９），３’に１７５ｂ（５’−TCCCTCAAAGATGAAATTGACAAATTTAATGTACTGGAAAAAAATGAAGAAGGAAAAAGGCAAAGACTTTGTACAGACAAAAATCTAAGTTTTCTCAAAGGGTTCTGTGTCCCCTACACATGGGGGCAATTTGTAAGCACTAGTGAATCAAACACTAGCTATAATGCTTCTAGCTgcgcgcaattaaccctcactaaagg−３’：配列番号３０）の相同領域をもつオリゴＤＮＡをプライマーとして（大文字部分はＲＡＤ２１との相同領域、小文字部分は鋳型ＤＮＡとの相同領域）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）を取扱説明書に準じてＰＣＲ増幅した。増幅されたＤＮＡはおよそ３．７ｋｂｐである。ＰＣＲで増幅したＤＮＡをｐＣＲ ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（ライフテクノロジー社）に取扱説明書に準じてブラントエンドライゲーションによりクローニングすることで、ドナーベクターを作製した。
（１）ドナーベクターの作製
図５に示すようにｍＡＩＤ（ミニＡＩＤタグ）とＣｌｏｖｅｒ（改変ＧＦＰ）およびネオマイシンもしくはハイグロマイシン耐性遺伝子をもつプラスミドを鋳型として、ＲＡＤ２１遺伝子Ｃ末端コード領域と５’に１８０ｂ（５’−GCTAAAACTGGAGCTGAATCTATCAGTTTGCTTGAGTTATGTCGAAATACGAACAGAAAACAAGCTGCCGCAAAGTTCTACAGCTTCTTGGTTCTTAAAAAGCAGCAAGCTATTGAGCTGACACAGGAAGAACCGTACAGTGACATCATCGCAACACCTGGACCAAGGTTCCATATTATAggatccggtgcaggcgcc−３’：配列番号２９），３’に１７５ｂ（５’−TCCCTCAAAGATGAAATTGACAAATTTAATGTACTGGAAAAAAATGAAGAAGGAAAAAGGCAAAGACTTTGTACAGACAAAAATCTAAGTTTTCTCAAAGGGTTCTGTGTCCCCTACACATGGGGGCAATTTGTAAGCACTAGTGAATCAAACACTAGCTATAATGCTTCTAGCTgcgcgcaattaaccctcactaaagg−３’：配列番号３０）の相同領域をもつオリゴＤＮＡをプライマーとして（大文字部分はＲＡＤ２１との相同領域、小文字部分は鋳型ＤＮＡとの相同領域）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）を取扱説明書に準じてＰＣＲ増幅した。増幅されたＤＮＡはおよそ３．７ｋｂｐである。ＰＣＲで増幅したＤＮＡをｐＣＲ ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（ライフテクノロジー社）に取扱説明書に準じてブラントエンドライゲーションによりクローニングすることで、ドナーベクターを作製した。
（２）ＲＡＤ２１遺伝子切断ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の設計
図５に示すようにＲＡＤ２１遺伝子のＣ末端コード領域を切断する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９発現用ベクターｐＸ３３０のＢｂｓＩに認識部位を与えるため下記のオリゴＤＮＡをハイブリダイズさせて導入した。
図５に示すようにＲＡＤ２１遺伝子のＣ末端コード領域を切断する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９発現用ベクターｐＸ３３０のＢｂｓＩに認識部位を与えるため下記のオリゴＤＮＡをハイブリダイズさせて導入した。
５’−caccgCCAAGGTTCCATATTATATA−３’（配列番号３１）５’−aaacTATATAATATGGAACCTTGGc−３’（配列番号３２）
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９のｐＸ３３０プラスミド構築はNat. Protocols, Vol.8 No.11, P2281-2307(2013)の方法に従った。
（３）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いたＨＣＴ１１６への挿入
今回の実験では野生型ＨＣＴ１１６細胞とオーキシン誘導デグロン（ＡＩＤ）法に必要なＯｓＴＩＲ１が恒常的に発現する改変を施したＨＣＴ１１６細胞を材料とした。６ウェルプレートに増殖中の細胞を用意し、ＲＡＤ２１遺伝子の標的部分を切断するためのｐＸ３３０を０．８μｇと作製したネオマイシン及びハイグロマイシン耐性マーカーをもつドナーベクターを各０．６μｇ混ぜ合わせ、ＦｕｇｅｎｅＨＤ（プロメガ社）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションに際しては取扱説明書に準じてＤＮＡとＦｕｇｅｎｅＨＤを混ぜ合わせて１５分放置したのち、培地に滴下した。
（４）細胞のクローニング
トランスフェクション２日後、細胞を希釈しＧ４１８ ７００μｇ／ｍＬとハイグロマイシン１００μｇ／ｍＬを含む培地で１３日間培養することで、ネオマイシンとハイグロマイシンの両方に耐性になった細胞を選択するとともにコロニーを形成させた。
トランスフェクション２日後、細胞を希釈しＧ４１８ ７００μｇ／ｍＬとハイグロマイシン１００μｇ／ｍＬを含む培地で１３日間培養することで、ネオマイシンとハイグロマイシンの両方に耐性になった細胞を選択するとともにコロニーを形成させた。
（５）ゲノムＰＣＲによる挿入の確認
各コロニーを単離後、細胞を増やしたのちにゲノムＤＮＡを精製しＰＣＲによるＤＮＡ挿入の確認を行った。挿入確認に用いたプライマーは図６に示すネオマイシン遺伝子とハイグロマイシン遺伝子を検出するそれぞれの組み合わせを用いた。図６左のゲル写真に示すように、挿入が起こらなかった場合は特異的なＤＮＡ増幅は見られない（左ゲル写真ＷＴ）。一方で、期待した挿入が起こったネオマイシン耐性遺伝子からは０．９ｋｂｐの産物、ハイグロマイシン耐性遺伝子からは１．５ｋｂｐの産物が増幅される。多くのクローンから両方のＰＣＲ産物が検出されている（図６左ゲル写真、各クローン）。このことは両アリルにそれぞれの耐性マーカーをもつ、タギングコンストラクトが挿入されていることを示している。
各コロニーを単離後、細胞を増やしたのちにゲノムＤＮＡを精製しＰＣＲによるＤＮＡ挿入の確認を行った。挿入確認に用いたプライマーは図６に示すネオマイシン遺伝子とハイグロマイシン遺伝子を検出するそれぞれの組み合わせを用いた。図６左のゲル写真に示すように、挿入が起こらなかった場合は特異的なＤＮＡ増幅は見られない（左ゲル写真ＷＴ）。一方で、期待した挿入が起こったネオマイシン耐性遺伝子からは０．９ｋｂｐの産物、ハイグロマイシン耐性遺伝子からは１．５ｋｂｐの産物が増幅される。多くのクローンから両方のＰＣＲ産物が検出されている（図６左ゲル写真、各クローン）。このことは両アリルにそれぞれの耐性マーカーをもつ、タギングコンストラクトが挿入されていることを示している。
（６）ウェスタンブロットによるＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒ融合タンパク質発現の確認
ゲノムＰＣＲにより両アリル挿入が確認されたクローンから、タンパク質を抽出し、ＲＡＤ２１抗体およびｍＡＩＤ抗体を用いてウェスタンブロットを行った（図６右）。また、細胞を５００μＭオーキシン（３−ｉｎｄｏｌｅ ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）で２０時間処理した細胞からも同様にタンパク質を抽出し、ウェスタンブロットに用いた。ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒの付加していないＲＡＤ２１は１０５ｋＤａに検出される。一方で、ＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒ融合タンパク質は１４５ｋＤａに検出される。図６右に示すように、ＲＡＤ２１抗体を用いた場合、もとのＨＣＴ１１６細胞（ＷＴ）には１０５ｋＤａのバンドが検出されるのに対し、両アリルにｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒが付加された場合１４５ｋＤａのバンドが検出される。また、ｍＡＩＤ抗体を用いた場合、ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒが付加したＲＡＤ２１タンパク質のみが検出される。さらに細胞をオーキシンで処理した場合、ＯｓＴＩＲ１発現細胞においてＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒの消失が起きることから、ＡＩＤ法によるタンパク質分解が起きていることがわかる。
ゲノムＰＣＲにより両アリル挿入が確認されたクローンから、タンパク質を抽出し、ＲＡＤ２１抗体およびｍＡＩＤ抗体を用いてウェスタンブロットを行った（図６右）。また、細胞を５００μＭオーキシン（３−ｉｎｄｏｌｅ ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）で２０時間処理した細胞からも同様にタンパク質を抽出し、ウェスタンブロットに用いた。ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒの付加していないＲＡＤ２１は１０５ｋＤａに検出される。一方で、ＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒ融合タンパク質は１４５ｋＤａに検出される。図６右に示すように、ＲＡＤ２１抗体を用いた場合、もとのＨＣＴ１１６細胞（ＷＴ）には１０５ｋＤａのバンドが検出されるのに対し、両アリルにｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒが付加された場合１４５ｋＤａのバンドが検出される。また、ｍＡＩＤ抗体を用いた場合、ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒが付加したＲＡＤ２１タンパク質のみが検出される。さらに細胞をオーキシンで処理した場合、ＯｓＴＩＲ１発現細胞においてＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒの消失が起きることから、ＡＩＤ法によるタンパク質分解が起きていることがわかる。
（７）蛍光顕微鏡観察によるＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒ融合タンパク質発現の観察
図７に示すように、ＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒ融合タンパク質が発現している生細胞をデコンボリューション蛍光顕微鏡で観察した。細胞をオーキシン（３−ｉｎｄｏｌｅ ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）で処理する前の細胞は、ＯｓＴＩＲ１の発現の有無に関わらず、ＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒが細胞核内に局在しているのが観察された。５００μＭオーキシンで細胞を処理し、９０分後に観察したところ、ＯｓＴＩＲ１を発現する細胞においてのみ、ＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒが消失した。この結果からも、ＡＩＤ法によるＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒの分解が起きていることがわかる。
図７に示すように、ＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒ融合タンパク質が発現している生細胞をデコンボリューション蛍光顕微鏡で観察した。細胞をオーキシン（３−ｉｎｄｏｌｅ ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）で処理する前の細胞は、ＯｓＴＩＲ１の発現の有無に関わらず、ＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒが細胞核内に局在しているのが観察された。５００μＭオーキシンで細胞を処理し、９０分後に観察したところ、ＯｓＴＩＲ１を発現する細胞においてのみ、ＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒが消失した。この結果からも、ＡＩＤ法によるＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒの分解が起きていることがわかる。
［実施例３］ダブルノックインによるＤＨＣ１（ｄｙｎｅｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ １）デグロン細胞の作製
（１）ドナーベクターの作製
図８に示すようにｍＡＩＤ（ミニＡＩＤタグ）とＣｌｏｖｅｒ（改変ＧＦＰ）およびネオマイシンもしくはハイグロマイシン耐性遺伝子をもつプラスミドを、ＢａｍＨＩを用いて制限酵素処理して、ｍＡＩＤ（ミニＡＩＤタグ）とＣｌｏｖｅｒ（改変ＧＦＰ）およびネオマイシンもしくはハイグロマイシン耐性遺伝子からなるコンストラクトを得た。続いて、遺伝子合成したＤＨＣ１遺伝子のホモロジーアームを遺伝子合成により作製し、ｐＵＣ５７のＥｃｏＲＶsサイトにクローニングしたたものを作製した（ＧＥＮＥＷＩＺ社）。ホモロジーアームの間にはあらかじめＢａｍＨＩサイトが導入されているため、プラスミドを、ＢａｍＨＩにより制限酵素処理して、ｍＡＩＤ（ミニＡＩＤタグ）とＣｌｏｖｅｒ（改変ＧＦＰ）およびネオマイシンもしくはハイグロマイシン耐性遺伝子からなるコンストラクトを挿入し、ライゲーションさせて、ドナーベクターを作製した。得られたドナーベクターは、５’に１８０ｂ（５’− -TCCAGTTTTCTTACTTTTCCCTTAAGCCACCAGTAAACCCCTCTGCTTCTGCAGGTAACCTTACCTGTCTACCTGAACTTCACCCGTGCAGACCTCATCTTCACCGTGGACTTCGAAATTGCTACAAAGGAGGATCCTCGCAGCTTCTATGAAAGGGGTGTCGCAGTCTTGTGCACAGAG−３’：配列番号３３），３’に１７５ｂ（５’− ACCACTCCCAACCGTCAGATTCCATTCAGCTTCCTCCAACCTCAGACCAACCACTTTCTTTTCACAAGCTCAGACCTTCCAAATATTTTAAAAATGAATAAATGTTAAATACCAACTTTCACTATTACAGAAAGGGGCAGCTAGAAAAGTTTACTCTGTGCACAAGACTGCGACA−３’：配列番号３４）ＤＨＣ１遺伝子に対して相同な領域を持っていた。
（１）ドナーベクターの作製
図８に示すようにｍＡＩＤ（ミニＡＩＤタグ）とＣｌｏｖｅｒ（改変ＧＦＰ）およびネオマイシンもしくはハイグロマイシン耐性遺伝子をもつプラスミドを、ＢａｍＨＩを用いて制限酵素処理して、ｍＡＩＤ（ミニＡＩＤタグ）とＣｌｏｖｅｒ（改変ＧＦＰ）およびネオマイシンもしくはハイグロマイシン耐性遺伝子からなるコンストラクトを得た。続いて、遺伝子合成したＤＨＣ１遺伝子のホモロジーアームを遺伝子合成により作製し、ｐＵＣ５７のＥｃｏＲＶsサイトにクローニングしたたものを作製した（ＧＥＮＥＷＩＺ社）。ホモロジーアームの間にはあらかじめＢａｍＨＩサイトが導入されているため、プラスミドを、ＢａｍＨＩにより制限酵素処理して、ｍＡＩＤ（ミニＡＩＤタグ）とＣｌｏｖｅｒ（改変ＧＦＰ）およびネオマイシンもしくはハイグロマイシン耐性遺伝子からなるコンストラクトを挿入し、ライゲーションさせて、ドナーベクターを作製した。得られたドナーベクターは、５’に１８０ｂ（５’− -TCCAGTTTTCTTACTTTTCCCTTAAGCCACCAGTAAACCCCTCTGCTTCTGCAGGTAACCTTACCTGTCTACCTGAACTTCACCCGTGCAGACCTCATCTTCACCGTGGACTTCGAAATTGCTACAAAGGAGGATCCTCGCAGCTTCTATGAAAGGGGTGTCGCAGTCTTGTGCACAGAG−３’：配列番号３３），３’に１７５ｂ（５’− ACCACTCCCAACCGTCAGATTCCATTCAGCTTCCTCCAACCTCAGACCAACCACTTTCTTTTCACAAGCTCAGACCTTCCAAATATTTTAAAAATGAATAAATGTTAAATACCAACTTTCACTATTACAGAAAGGGGCAGCTAGAAAAGTTTACTCTGTGCACAAGACTGCGACA−３’：配列番号３４）ＤＨＣ１遺伝子に対して相同な領域を持っていた。
（２）ＤＨＣ１遺伝子切断ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の設計
図８に示すようにＤＨＣ１遺伝子のＣ末端コード領域を切断する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９発現用ベクターｐＸ３３０のＢｂｓＩに認識部位を与えるため下記のオリゴＤＮＡをハイブリダイズさせて導入した。
図８に示すようにＤＨＣ１遺伝子のＣ末端コード領域を切断する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９発現用ベクターｐＸ３３０のＢｂｓＩに認識部位を与えるため下記のオリゴＤＮＡをハイブリダイズさせて導入した。
５’− caccgCCTCGCAGCTTCTACGAGCGGGG−３’（配列番号３５）５’− aaacCCCCGCTCGTAGAAGCTGCGAGGc−３’（配列番号３６）
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９のｐＸ３３０プラスミド構築はNat. Protocols, Vol.8 No.11, P2281-2307(2013)の方法に従った。
（３）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いたＨＣＴ１１６への挿入
今回の実験では野生型ＨＣＴ１１６細胞とオーキシン誘導デグロン（ＡＩＤ）法に必要なＯｓＴＩＲ１が恒常的に発現する改変を施したＨＣＴ１１６細胞を材料とした。６ウェルプレートに増殖中の細胞を用意し、ＤＨＣ１遺伝子の標的部分を切断するためのｐＸ３３０を０．８μｇと作製したネオマイシン及びハイグロマイシン耐性マーカーをもつドナーベクターを各０．６μｇ混ぜ合わせ、ＦｕｇｅｎｅＨＤ（プロメガ社）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションに際しては取扱説明書に準じてＤＮＡとＦｕｇｅｎｅＨＤを混ぜ合わせて１５分放置したのち、培地に滴下した。
（４）細胞のクローニング
トランスフェクション２日後、細胞を希釈しＧ４１８ ７００μｇ／ｍＬとハイグロマイシン１００μｇ／ｍＬを含む培地で１３日間培養することで、ネオマイシンとハイグロマイシンの両方に耐性になった細胞を選択するとともにコロニーを形成させた。
トランスフェクション２日後、細胞を希釈しＧ４１８ ７００μｇ／ｍＬとハイグロマイシン１００μｇ／ｍＬを含む培地で１３日間培養することで、ネオマイシンとハイグロマイシンの両方に耐性になった細胞を選択するとともにコロニーを形成させた。
（５）ゲノムＰＣＲによる挿入の確認
各コロニーを単離後、細胞を増やしたのちにゲノムＤＮＡを精製しＰＣＲによるＤＮＡ挿入の確認を行った。挿入確認に用いたプライマーは図９に示すネオマイシン遺伝子とハイグロマイシン遺伝子を検出するそれぞれの組み合わせを用いた。図９のゲル写真に示すように、挿入が起こらなかった場合は特異的なＤＮＡ増幅は見られない（左ゲル写真ＷＴ）。一方で、期待した挿入が起こったネオマイシン耐性遺伝子からは０．９ｋｂｐの産物、ハイグロマイシン耐性遺伝子からは１．５ｋｂｐの産物が増幅される。多くのクローンから両方のＰＣＲ産物が検出されている（図９左ゲル写真、各クローン）。このことは両アリルにそれぞれの耐性マーカーをもつ、タギングコンストラクトが挿入されていることを示している。
各コロニーを単離後、細胞を増やしたのちにゲノムＤＮＡを精製しＰＣＲによるＤＮＡ挿入の確認を行った。挿入確認に用いたプライマーは図９に示すネオマイシン遺伝子とハイグロマイシン遺伝子を検出するそれぞれの組み合わせを用いた。図９のゲル写真に示すように、挿入が起こらなかった場合は特異的なＤＮＡ増幅は見られない（左ゲル写真ＷＴ）。一方で、期待した挿入が起こったネオマイシン耐性遺伝子からは０．９ｋｂｐの産物、ハイグロマイシン耐性遺伝子からは１．５ｋｂｐの産物が増幅される。多くのクローンから両方のＰＣＲ産物が検出されている（図９左ゲル写真、各クローン）。このことは両アリルにそれぞれの耐性マーカーをもつ、タギングコンストラクトが挿入されていることを示している。
（６）ウェスタンブロットによるＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒ融合タンパク質発現の確認
ゲノムＰＣＲにより両アリル挿入が確認されたクローンから、タンパク質を抽出し、ＤＨＣ１抗体およびＯｓＴＩＲ抗体を用いてウェスタンブロットを行った（図１０）。また、細胞を２μｇ／ｍＬのドキシサイクリン及び５００μＭオーキシン（３−ｉｎｄｏｌｅ ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）で２、４、６、８、１０、２４時間処理した細胞からも同様にタンパク質を抽出し、ウェスタンブロットに用いた。図１０に示すように、ＤＨＣ１抗体を用いた場合、ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒが付加したＤＨＣ１タンパク質が経時的に消失した。一方、ＯｓＴＩＲ抗体を用いた場合、ＯｓＴＩＲタンパク質が経時的に増加していた。このことから、ＡＩＤ法によるタンパク質分解が起きていることがわかった。
ゲノムＰＣＲにより両アリル挿入が確認されたクローンから、タンパク質を抽出し、ＤＨＣ１抗体およびＯｓＴＩＲ抗体を用いてウェスタンブロットを行った（図１０）。また、細胞を２μｇ／ｍＬのドキシサイクリン及び５００μＭオーキシン（３−ｉｎｄｏｌｅ ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）で２、４、６、８、１０、２４時間処理した細胞からも同様にタンパク質を抽出し、ウェスタンブロットに用いた。図１０に示すように、ＤＨＣ１抗体を用いた場合、ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒが付加したＤＨＣ１タンパク質が経時的に消失した。一方、ＯｓＴＩＲ抗体を用いた場合、ＯｓＴＩＲタンパク質が経時的に増加していた。このことから、ＡＩＤ法によるタンパク質分解が起きていることがわかった。
（７）ドキシサイクリン及びオーキシンの処理による細胞数の変化
ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒ融合タンパク質が発現している生細胞を用いて、未処理、２μｇ／ｍＬのドキシサイクリンのみ、又は２μｇ／ｍＬのドキシサイクリン及び５００μＭオーキシンの処理から０時間における細胞数に対して、処理から２４、４８、７２時間後における細胞の相対値を算出した（図１１）。図１１に示すように、２μｇ／ｍＬのドキシサイクリン及び５００μＭオーキシンで処理した細胞では、処理から４８時間後以降において、細胞の増殖が抑制されていることがわかった。
ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒ融合タンパク質が発現している生細胞を用いて、未処理、２μｇ／ｍＬのドキシサイクリンのみ、又は２μｇ／ｍＬのドキシサイクリン及び５００μＭオーキシンの処理から０時間における細胞数に対して、処理から２４、４８、７２時間後における細胞の相対値を算出した（図１１）。図１１に示すように、２μｇ／ｍＬのドキシサイクリン及び５００μＭオーキシンで処理した細胞では、処理から４８時間後以降において、細胞の増殖が抑制されていることがわかった。
（８）テトラサイクリン処理による有糸分裂細胞の割合の測定
ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒ融合タンパク質が発現している生細胞を用いて、未処理、１μｇ／ｍＬのテトラサイクリンのみ、又は１μｇ／ｍＬのテトラサイクリン及び５００μＭオーキシンの処理から１８、４２時間後における有糸分裂細胞の割合を算出した（図１２）。
また、未処理、又は１μｇ／ｍＬのテトラサイクリン及び５００μＭオーキシンの処理から１８時間後におけるＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒ融合タンパク質が発現している生細胞について、チューブリン抗体による免疫染色及びＳｉＲ Ｈｏｅｃｈｓｔによる核染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した（図１３）。
図１２及び図１３に示すように、１μｇ／ｍＬのテトラサイクリン及び５００μＭオーキシンで処理した細胞では、染色体の構造異常が生じ、有糸分裂細胞が蓄積することが明らかとなった。
ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒ融合タンパク質が発現している生細胞を用いて、未処理、１μｇ／ｍＬのテトラサイクリンのみ、又は１μｇ／ｍＬのテトラサイクリン及び５００μＭオーキシンの処理から１８、４２時間後における有糸分裂細胞の割合を算出した（図１２）。
また、未処理、又は１μｇ／ｍＬのテトラサイクリン及び５００μＭオーキシンの処理から１８時間後におけるＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒ融合タンパク質が発現している生細胞について、チューブリン抗体による免疫染色及びＳｉＲ Ｈｏｅｃｈｓｔによる核染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した（図１３）。
図１２及び図１３に示すように、１μｇ／ｍＬのテトラサイクリン及び５００μＭオーキシンで処理した細胞では、染色体の構造異常が生じ、有糸分裂細胞が蓄積することが明らかとなった。
［実施例４］ダブルノックインによるＭＣＭ２デグロンマウスＥＳ細胞の作製
（１）ドナーベクターの作製
図１４に示すようにｍＡＩＤ（ミニＡＩＤタグ）、Ｃｌｏｖｅｒ（改変ＧＦＰ）およびネオマイシン耐性遺伝子をもつプラスミドを、ＢａｍＨＩを用いて制限酵素処理して、ｍＡＩＤ（ミニＡＩＤタグ）、Ｃｌｏｖｅｒ（改変ＧＦＰ）およびネオマイシン耐性遺伝子からなるコンストラクトを得た。続いて、遺伝子合成したＭＣＭ２遺伝子のホモロジーアームを遺伝子合成により作製し、ｐＵＣ５７のＥｃｏＲＶsサイトにクローニングしたたものを作製した（ＧＥＮＥＷＩＺ社）。ホモロジーアームの間にはあらかじめＢａｍＨＩサイトが導入されているため、プラスミドをＢａｍＨＩにより制限酵素処理して、ｍＡＩＤ（ミニＡＩＤタグ）とＣｌｏｖｅｒ（改変ＧＦＰ）およびネオマイシンもしくはハイグロマイシン耐性遺伝子からなるコンストラクトを挿入し、ライゲーションさせて、ドナーベクターを作製した。得られたドナーベクターは、５’に２００ｂ（５’− TCAGGTCTGGAGCTCTGAACCAACACAGCCCTTCCAGAGGTGAAGGCCGGCGTCTTCTCCTGCTAATGGCTCTGATGCTGTTCTTTCTCCAGGCCAGGCAGATCAATATTCACAACCTCTCTGCCTTCTACGACAGCGACCTCTTCAAATTCAACAAGTTCAGCCGTGACCTGAAACGCAAACTGATCCTACAGCAGTTC−３’：配列番号３７），３’に２００ｂ（５’− ATGAGGCTCGGTCACCACGCTGAGCCTACGTCACTTCCCACTTCCACTGGGGCTTGGTGCCCTGTAGGGGTGGGAGGATGGCTTAATGCAGACCTTTACCTGTGAGCCCCTAGGCCAAGGCTGTAGCATTAAATGACTATTTATTCTTCTGCCCCCCTCTAGAGCACTCTTCTTGGCCAGACCCTCTGTCCAAGGCTCAT−３’：配列番号３８）ＭＣＭ２遺伝子に対して相同な領域を持っていた。
（１）ドナーベクターの作製
図１４に示すようにｍＡＩＤ（ミニＡＩＤタグ）、Ｃｌｏｖｅｒ（改変ＧＦＰ）およびネオマイシン耐性遺伝子をもつプラスミドを、ＢａｍＨＩを用いて制限酵素処理して、ｍＡＩＤ（ミニＡＩＤタグ）、Ｃｌｏｖｅｒ（改変ＧＦＰ）およびネオマイシン耐性遺伝子からなるコンストラクトを得た。続いて、遺伝子合成したＭＣＭ２遺伝子のホモロジーアームを遺伝子合成により作製し、ｐＵＣ５７のＥｃｏＲＶsサイトにクローニングしたたものを作製した（ＧＥＮＥＷＩＺ社）。ホモロジーアームの間にはあらかじめＢａｍＨＩサイトが導入されているため、プラスミドをＢａｍＨＩにより制限酵素処理して、ｍＡＩＤ（ミニＡＩＤタグ）とＣｌｏｖｅｒ（改変ＧＦＰ）およびネオマイシンもしくはハイグロマイシン耐性遺伝子からなるコンストラクトを挿入し、ライゲーションさせて、ドナーベクターを作製した。得られたドナーベクターは、５’に２００ｂ（５’− TCAGGTCTGGAGCTCTGAACCAACACAGCCCTTCCAGAGGTGAAGGCCGGCGTCTTCTCCTGCTAATGGCTCTGATGCTGTTCTTTCTCCAGGCCAGGCAGATCAATATTCACAACCTCTCTGCCTTCTACGACAGCGACCTCTTCAAATTCAACAAGTTCAGCCGTGACCTGAAACGCAAACTGATCCTACAGCAGTTC−３’：配列番号３７），３’に２００ｂ（５’− ATGAGGCTCGGTCACCACGCTGAGCCTACGTCACTTCCCACTTCCACTGGGGCTTGGTGCCCTGTAGGGGTGGGAGGATGGCTTAATGCAGACCTTTACCTGTGAGCCCCTAGGCCAAGGCTGTAGCATTAAATGACTATTTATTCTTCTGCCCCCCTCTAGAGCACTCTTCTTGGCCAGACCCTCTGTCCAAGGCTCAT−３’：配列番号３８）ＭＣＭ２遺伝子に対して相同な領域を持っていた。
（２）ＭＣＭ２遺伝子切断ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の設計
図１４に示すようにＭＣＭ２遺伝子のＣ末端コード領域を切断する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９発現用ベクターｐＸ３３０のＢｂｓＩに認識部位を与えるため下記のオリゴＤＮＡをハイブリダイズさせて導入した。
図１４に示すようにＭＣＭ２遺伝子のＣ末端コード領域を切断する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９発現用ベクターｐＸ３３０のＢｂｓＩに認識部位を与えるため下記のオリゴＤＮＡをハイブリダイズさせて導入した。
５’− caccgCGAGCCTCATTCAGACATAG−３’（配列番号３９）５’− aaacCTATGTCTGAATGAGGCTCGc−３’（配列番号４０）
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９のｐＸ３３０プラスミド構築はNat. Protocols, Vol.8 No.11, P2281-2307(2013)の方法に従った。
（３）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いたＨＣＴ１１６への挿入
今回の実験ではマウスＥＳ細胞を材料とした。６ウェルプレートに増殖中の細胞を用意し、ＭＣＭ２遺伝子の標的部分を切断するためのｐＸ３３０を０．８μｇと作製したネオマイシン耐性マーカーをもつドナーベクターを各０．６μｇ混ぜ合わせ、ＦｕｇｅｎｅＨＤ（プロメガ社）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションに際しては取扱説明書に準じてＤＮＡとＦｕｇｅｎｅＨＤを混ぜ合わせて１５分放置したのち、培地に滴下した。
（４）細胞のクローニング
トランスフェクション２日後、細胞を希釈しＧ４１８ ７００μｇ／ｍＬとハイグロマイシン１００μｇ／ｍＬを含む培地で１３日間培養することで、ネオマイシン耐性になった細胞を選択するとともにコロニーを形成させた。
トランスフェクション２日後、細胞を希釈しＧ４１８ ７００μｇ／ｍＬとハイグロマイシン１００μｇ／ｍＬを含む培地で１３日間培養することで、ネオマイシン耐性になった細胞を選択するとともにコロニーを形成させた。
（５）ゲノムＰＣＲによる挿入の確認
各コロニーを単離後、細胞を増やしたのちにゲノムＤＮＡを精製しＰＣＲによるＤＮＡ挿入の確認を行った。挿入確認に用いたプライマーは図１４に示すネオマイシン遺伝子を検出する組み合わせを用いた。図１４下のゲル写真に示すように、挿入が起こらなかった場合は特異的なＤＮＡ増幅は見られない（下ゲル写真１，２等）。一方で、期待した挿入が起こったネオマイシン耐性遺伝子からは１．０ｋｂｐの産物が増幅される。多くのクローンからＰＣＲ産物が検出されている（図１４下ゲル写真、各クローン）。このことは両アリルにそれぞれの耐性マーカーをもつ、タギングコンストラクトが挿入されていることが示された。
各コロニーを単離後、細胞を増やしたのちにゲノムＤＮＡを精製しＰＣＲによるＤＮＡ挿入の確認を行った。挿入確認に用いたプライマーは図１４に示すネオマイシン遺伝子を検出する組み合わせを用いた。図１４下のゲル写真に示すように、挿入が起こらなかった場合は特異的なＤＮＡ増幅は見られない（下ゲル写真１，２等）。一方で、期待した挿入が起こったネオマイシン耐性遺伝子からは１．０ｋｂｐの産物が増幅される。多くのクローンからＰＣＲ産物が検出されている（図１４下ゲル写真、各クローン）。このことは両アリルにそれぞれの耐性マーカーをもつ、タギングコンストラクトが挿入されていることが示された。
（６）蛍光顕微鏡観察によるＭＣＭ２−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒ融合タンパク質発現の観察
図１５に示すように、ＭＣＭ２−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒ融合タンパク質が発現しているマウスＥＳ細胞をデコンボリューション蛍光顕微鏡で観察した。ＭＣＭ２−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒが細胞核内に局在しているのが観察された。
以上のことから、マウスＥＳ細胞の両アリルにおいて、耐性マーカーをもつ、タギングコンストラクトが挿入されていることが示された。
図１５に示すように、ＭＣＭ２−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒ融合タンパク質が発現しているマウスＥＳ細胞をデコンボリューション蛍光顕微鏡で観察した。ＭＣＭ２−ｍＡＩＤ−Ｃｌｏｖｅｒが細胞核内に局在しているのが観察された。
以上のことから、マウスＥＳ細胞の両アリルにおいて、耐性マーカーをもつ、タギングコンストラクトが挿入されていることが示された。
ドナープラスミドを用いた本発明の方法によれば、ゲノム編集を利用したＨＤＲに必要なゲノムＤＮＡとの相同性配列の長さが１００ｂｐ〜３００ｂｐと短いので、クローニングする必要がなく、ＰＣＲやＤＮＡ合成で簡便に作製でき、数多くの遺伝子や標的ゲノム部位に網羅的に応用可能である。また、挿入可能な外来ＤＮＡとして蛍光タグ、精製タグ、デグロンタグ、薬剤選択マーカーなど大きな配列を挿入することができる。また、本発明の方法により外来ＤＮＡを任意の遺伝子に挿入し、該外来ＤＮＡを恒常的に発現する細胞を得ることができる。例えば、本発明の方法により得られる、目的タンパク質をコードする第一の遺伝子と、前記第一の遺伝子の下流に連結されたｍＡＩＤをコードする遺伝子を含む染色体と、セーフハーバー座位にｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ １（ＴＩＲ１）をコードする遺伝子を含む染色体とを有する細胞によれば、目的タンパク質の分解を効率良く誘導することができる。
【０００３】
を利用したＨＤＲ経路による外来ＤＮＡ挿入においては、ゲノム上の左右各０．７ｋｂｐ以上の相同配列のクローニングが必須であると考えられていたところ（非特許文献１〜７）、この相同配列をＰＣＲやＤＮＡ合成で得ることができる程度の短い配列にしてドナープラスミドを作製した。その結果、全く意外にもオリゴヌクレオチド又は遺伝子合成により合成可能な１００ｂｐ〜３００ｂｐという短い相同配列の間に０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐという大きな外来ＤＮＡを結合したドナープラスミドを用いたＨＤＲにより、十分な効率性でゲノム上の目的とする部位に０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡを挿入できることを見出し、本発明を完成した。
［０００７］
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］次の工程を有する動物細胞ゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
（１）０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡの上流及び下流に、ゲノム上の挿入を行う部位と相同な配列を有する１２５ｂｐ〜２５０ｂｐのＤＮＡを結合したドナープラスミドを作成する工程であって、前記１２５ｂｐ〜２５０ｂｐの相同性配列ＤＮＡが、ＰＣＲ又はＤＮＡ合成により得られるものである工程。
（２）得られたドナープラスミドを用いたＨＤＲによるゲノム編集により、ゲノムの目的とする部位に０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡを挿入する工程。
［２］動物細胞が、株化されたヒト由来細胞、株化されたマウス由来細胞、株化されたニワトリ由来細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスＥＳ細胞及びマウスｉＰＳ細胞から選ばれる細胞である［１］に記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
［３］動物細胞が、ヒトＨＣＴ１１６細胞、ヒトＮＡＬＭ６細胞、ヒトＨＴ１０８０細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスＥＳ細胞、マウスｉＰＳ細胞及びニワトリＤＴ４０細胞から選ばれる細胞である［１］又は［２］に記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
［４］ＨＤＲによるゲノム編集法が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮシステム及びＺｎフィンガーヌクレアーゼシステムから選ばれるＨＤＲを利用した外来ＤＮＡ挿入法である［１］〜［３］のいずれか一つに記載のゲノム
を利用したＨＤＲ経路による外来ＤＮＡ挿入においては、ゲノム上の左右各０．７ｋｂｐ以上の相同配列のクローニングが必須であると考えられていたところ（非特許文献１〜７）、この相同配列をＰＣＲやＤＮＡ合成で得ることができる程度の短い配列にしてドナープラスミドを作製した。その結果、全く意外にもオリゴヌクレオチド又は遺伝子合成により合成可能な１００ｂｐ〜３００ｂｐという短い相同配列の間に０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐという大きな外来ＤＮＡを結合したドナープラスミドを用いたＨＤＲにより、十分な効率性でゲノム上の目的とする部位に０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡを挿入できることを見出し、本発明を完成した。
［０００７］
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］次の工程を有する動物細胞ゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
（１）０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡの上流及び下流に、ゲノム上の挿入を行う部位と相同な配列を有する１２５ｂｐ〜２５０ｂｐのＤＮＡを結合したドナープラスミドを作成する工程であって、前記１２５ｂｐ〜２５０ｂｐの相同性配列ＤＮＡが、ＰＣＲ又はＤＮＡ合成により得られるものである工程。
（２）得られたドナープラスミドを用いたＨＤＲによるゲノム編集により、ゲノムの目的とする部位に０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡを挿入する工程。
［２］動物細胞が、株化されたヒト由来細胞、株化されたマウス由来細胞、株化されたニワトリ由来細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスＥＳ細胞及びマウスｉＰＳ細胞から選ばれる細胞である［１］に記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
［３］動物細胞が、ヒトＨＣＴ１１６細胞、ヒトＮＡＬＭ６細胞、ヒトＨＴ１０８０細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスＥＳ細胞、マウスｉＰＳ細胞及びニワトリＤＴ４０細胞から選ばれる細胞である［１］又は［２］に記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
［４］ＨＤＲによるゲノム編集法が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮシステム及びＺｎフィンガーヌクレアーゼシステムから選ばれるＨＤＲを利用した外来ＤＮＡ挿入法である［１］〜［３］のいずれか一つに記載のゲノム
【０００４】
部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
［５］ＨＤＲによるゲノム編集法が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９により誘発されるＨＤＲを利用した外来ＤＮＡ挿入法である［１］〜［４］のいずれか一つに記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
［７］外来ＤＮＡが、タグ付加外来ＤＮＡ、プロモーター配列、転写終結配列、機能的遺伝子配列、薬剤選択マーカー遺伝子及びそれらの組み合わせから選ばれる外来ＤＮＡである［１］〜［５］のいずれか一つに記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
［８］ＡＡＶＳ１（ｔｈｅ ＡＡＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ １） ｌｏｃｕｓにｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ １（ＴＩＲ１）をコードする遺伝子を含む染色体を有し、前記染色体が前記ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結されたテトラサイクリン誘導性プロモーターを含むことを特徴とする動物細胞。
［１４］外来ＤＮＡの上流及び下流に連結されており、染色体上の挿入を行う部位と相同な配列を有する１２５ｂｐ〜２５０ｂｐのＤＮＡを利用して、前記外来ＤＮＡの挿入が行われた染色体を有し、前記１２５ｂｐ〜２５０ｂｐのＤＮＡが、ＰＣＲ又はＤＮＡ合成により得られたことを特徴とする細胞。
［１５］さらに、前記染色体は、前記外来ＤＮＡの上流又は下流であって、前記１２５ｂｐ〜２５０ｂｐのＤＮＡに挟まれた領域に連結された薬剤選択マーカー遺伝子を含む、［１４］に記載の細胞。
［１６］目的タンパク質をコードする第一の遺伝子と、前記第一の遺伝子の上流又は下流に連結されたＭｉｎｉ−ａｕｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｄｅｇｒｏ
部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
［５］ＨＤＲによるゲノム編集法が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９により誘発されるＨＤＲを利用した外来ＤＮＡ挿入法である［１］〜［４］のいずれか一つに記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
［７］外来ＤＮＡが、タグ付加外来ＤＮＡ、プロモーター配列、転写終結配列、機能的遺伝子配列、薬剤選択マーカー遺伝子及びそれらの組み合わせから選ばれる外来ＤＮＡである［１］〜［５］のいずれか一つに記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
［８］ＡＡＶＳ１（ｔｈｅ ＡＡＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ １） ｌｏｃｕｓにｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ １（ＴＩＲ１）をコードする遺伝子を含む染色体を有し、前記染色体が前記ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結されたテトラサイクリン誘導性プロモーターを含むことを特徴とする動物細胞。
［１４］外来ＤＮＡの上流及び下流に連結されており、染色体上の挿入を行う部位と相同な配列を有する１２５ｂｐ〜２５０ｂｐのＤＮＡを利用して、前記外来ＤＮＡの挿入が行われた染色体を有し、前記１２５ｂｐ〜２５０ｂｐのＤＮＡが、ＰＣＲ又はＤＮＡ合成により得られたことを特徴とする細胞。
［１５］さらに、前記染色体は、前記外来ＤＮＡの上流又は下流であって、前記１２５ｂｐ〜２５０ｂｐのＤＮＡに挟まれた領域に連結された薬剤選択マーカー遺伝子を含む、［１４］に記載の細胞。
［１６］目的タンパク質をコードする第一の遺伝子と、前記第一の遺伝子の上流又は下流に連結されたＭｉｎｉ−ａｕｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｄｅｇｒｏ
【０００５】
ｎ（ｍＡＩＤ）をコードする第二の遺伝子と、を含む第一の染色体と、セーフハーバー座位にＴＩＲ１をコードする遺伝子を含む第二の染色体と、を有し、前記第一の染色体は、前記第一の遺伝子及び前記第二の遺伝子の上流及び下流に連結されており、染色体上の挿入が行う部位と相同な配列を有する１２５ｂｐ〜２５０ｐのＤＮＡと、第一の遺伝子及び前記第二の遺伝子の上流又は下流であって、前記１２５ｂｐ〜２５０ｐのＤＮＡに挟まれた領域に連結された薬剤選択マーカー遺伝子と、を含み、前記染色体が前記ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結されたテトラサイクリン誘導性プロモーターを含むことを特徴とする動物細胞。
ｎ（ｍＡＩＤ）をコードする第二の遺伝子と、を含む第一の染色体と、セーフハーバー座位にＴＩＲ１をコードする遺伝子を含む第二の染色体と、を有し、前記第一の染色体は、前記第一の遺伝子及び前記第二の遺伝子の上流及び下流に連結されており、染色体上の挿入が行う部位と相同な配列を有する１２５ｂｐ〜２５０ｐのＤＮＡと、第一の遺伝子及び前記第二の遺伝子の上流又は下流であって、前記１２５ｂｐ〜２５０ｐのＤＮＡに挟まれた領域に連結された薬剤選択マーカー遺伝子と、を含み、前記染色体が前記ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結されたテトラサイクリン誘導性プロモーターを含むことを特徴とする動物細胞。
Claims (23)
-
次の工程を有する動物細胞ゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
（１）０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡの上流及び下流に、ゲノム上の挿入を行う部位と相同な配列を有する１００ｂｐ〜３００ｂｐのＤＮＡを結合したドナープラスミドを作成する工程。 （２）得られたドナープラスミドを用いた相同組換え修復によるゲノム編集により、ゲノムの目的とする部位に０．１ｋｂｐ〜１０ｋｂｐの外来ＤＮＡを挿入する工程。 - 動物細胞が、株化されたヒト由来細胞、株化されたマウス由来細胞、株化されたニワトリ由来細胞、ヒトＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞及びマウスｉＰＳ細胞から選ばれる細胞である請求項１に記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
- 動物細胞が、ヒトＨＣＴ１１６細胞、ヒトＨＴ１０８０細胞、ヒトＮＡＬＭ６細胞、ニワトリＤＴ４０細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスＥＳ細胞及びマウスｉＰＳ細胞から選ばれる細胞である請求項１又は２に記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
- 相同組換え修復によるゲノム編集法が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮシステム又はＺｎフィンガーヌクレアーゼシステムから選ばれる相同組換え修復を利用した外来ＤＮＡ挿入法である請求項１〜３のいずれか一項に記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
- 相同組換え修復によるゲノム編集法が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムにより誘発される相同組換え修復を利用した外来ＤＮＡ挿入法である請求項１〜４のいずれか一項に記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
- 前記挿入ゲノム部位との相同配列ＤＮＡが、ＰＣＲ又はＤＮＡ合成により得られるものである請求項１〜５のいずれか一項に記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
- 外来ＤＮＡが、タグ付加外来ＤＮＡ、プロモーター配列、転写終結配列、機能的遺伝子配列、薬剤選択マーカー遺伝子及びそれらの組み合わせから選ばれる外来ＤＮＡである請求項１〜６のいずれか一項に記載のゲノム部位特異的外来ＤＮＡ挿入方法。
- セーフハーバー座位にｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ １（ＴＩＲ１）をコードする遺伝子を含む染色体を有することを特徴とする細胞。
- 前記セーフハーバー座位がＡＡＶＳ１（ｔｈｅ ＡＡＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ １）遺伝子座である請求項８に記載の細胞。
- さらに、前記染色体が前記ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結された、誘導性プロモーター、ウイルス性プロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、又は組織特異的プロモーターを含む請求項８又は９に記載の細胞。
- 前記染色体が前記ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む、請求項１０に記載の細胞。
- 前記誘導性プロモーターが、化学的誘導性プロモーター、熱ショック誘導性プロモーター、電磁気的誘導性プロモーター、核レセプター誘導性プロモーター及びホルモン誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項１１に記載の細胞。
- 前記化学的誘導性プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーターである、請求項１２に記載の細胞。
- 外来ＤＮＡの上流及び下流に連結されており、染色体上の挿入を行う部位と相同な配列を有する１００〜３００ｂｐのＤＮＡを利用して、前記外来ＤＮＡの挿入が行われた染色体を有することを特徴とする細胞。
- さらに、前記染色体は、前記外来ＤＮＡの上流又は下流であって、前記１００〜３００ｂｐのＤＮＡに挟まれた領域に連結された薬剤選択マーカー遺伝子を含む、請求項１４に記載の細胞。
- 目的タンパク質をコードする第一の遺伝子と、
前記第一の遺伝子の上流又は下流に連結されたＭｉｎｉ−ａｕｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｄｅｇｒｏｎ（ｍＡＩＤ）をコードする第二の遺伝子と、
を含む第一の染色体と、
セーフハーバー座位にＴＩＲ１をコードする遺伝子を含む第二の染色体と、
を有することを特徴とする細胞。 - 前記第一の染色体は、前記第一の遺伝子及び前記第二の遺伝子の上流及び下流に連結されており、染色体上の挿入が行う部位と相同な配列を有する１００〜３００ｂｐのＤＮＡを含む、請求項１６に記載の細胞。
- 前記第一の染色体は、第一の遺伝子及び前記第二の遺伝子の上流又は下流であって、前記１００〜３００ｂｐのＤＮＡに挟まれた領域に連結された薬剤選択マーカー遺伝子を含む、請求項１６又は１７に記載の細胞。
- さらに、前記染色体が前記ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結された、誘導性プロモーター、ウイルス性プロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、又は組織特異的プロモーターを含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記染色体が前記ＴＩＲ１をコードする遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む、請求項１９に記載の細胞。
- 前記誘導性プロモーターが、化学的誘導性プロモーター、熱ショック誘導性プロモーター、電磁気的誘導性プロモーター、核レセプター誘導性プロモーター及びホルモン誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項２０に記載の細胞。
- 前記化学的誘導性プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーターである、請求項２１に記載の細胞。
- 請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の細胞を用いることを特徴とする目的タンパク質の分解方法。
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