CN114127294A

CN114127294A - 非人类动物及其用途

Info

Publication number: CN114127294A
Application number: CN202080050921.2A
Authority: CN
Inventors: 钟卷将人; 林谦一郎; 北本直美; 相贺裕美子; 安岛理惠子
Original assignee: Research Institute Of University Common Use Organ Legal Person Information System; Kake Educational Institution
Current assignee: Research Institute Of University Common Use Organ Legal Person Information System; Kake Educational Institution
Priority date: 2019-07-16
Filing date: 2020-04-30
Publication date: 2022-03-01
Also published as: EP4026828A1; WO2021009990A1; JPWO2021009990A1; JP7458615B2; CN114144400A; EP4001414A4; US20220378024A1; US20220380782A1; WO2021009993A1; JPWO2021009993A1; EP4001414A1; EP4026828A4

Abstract

一种非人类动物，该非人类动物是经遗传修饰的非人类动物，其通过生长素降解决定子系统来控制生物体内的靶蛋白降解，该非人类动物具有包含第一核酸的染色体，所述第一核酸编码在生长素结合位点具有突变并与生长素类似物具有亲和性的突变型TIR1家族蛋白。

Description

非人类动物及其用途

技术领域

本发明涉及非人类动物、靶蛋白的功能分析方法及药物靶蛋白或药剂的评价方法。

本申请基于2019年7月16日于日本申请的日本特愿2019-131464号主张优先权，将其内容援引至此。

背景技术

本发明人等进行被称为生长素降解决定子(オーキシンデグロン)系统的蛋白降解控制技术的开发至今(例如参照专利文献1～3)。该系统通过将构成生长素响应性泛素连接酶的TIR1导入酵母、动物细胞等真核生物来源的细胞，调节生长素的添加的有无、时机，从而控制添加了降解标签(植物来源Aux/IAA家族蛋白或其部分蛋白；也称为降解决定子(デグロン))的靶蛋白的降解。

本发明人等所开发的控制靶蛋白的降解的方法(也称为生长素降解决定子法)已在细胞生物学研究中广为使用，也在进行在酵母、线虫、果蝇、斑马鱼等模型生物中的应用。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2008-187958号公报

专利文献2：国际公开第2010/125620号

专利文献3：国际公开第2013/073653号

发明内容

发明要解决的问题

如果利用现有的生长素降解决定子法，则通过添加生长素，可以迅速地将添加了降解标签(降解决定子)的靶蛋白降解。然而，现有的生长素降解决定子法在不添加生长素时也会发生靶蛋白的较弱的降解，因此难以进行严格的表达控制。此外，降解诱导使用100μM以上的较高浓度的生长素，特别是在多细胞动物中生长素自身的毒性影响令人担心。

本发明是鉴于上述情况而做出的，提供可以严格且自由地进行蛋白的降解控制的非人类动物、靶蛋白的功能分析方法及药物靶蛋白或药剂的评价方法。

用于解决问题的方案

本发明包括以下方案。

[1]一种试剂盒，其为控制非植物来源的真核细胞中的目标蛋白的降解的生长素降解决定子系统的试剂盒，所述试剂盒具有：第一核酸，其编码在生长素结合位点具有突变的突变型TIR1家族蛋白；生长素类似物，其与前述突变型TIR1家族蛋白具有亲和性；以及第二核酸，其编码包含至少一部分Aux/IAA家族蛋白并与前述突变型TIR1家族蛋白-前述生长素类似物复合物具有亲和性的降解标签。

[2]根据[1]所述的试剂盒，其还具有第三核酸，其编码连接在前述第二核酸的上游或下游的靶蛋白。

[3]根据[1]或[2]所述的试剂盒，其中，前述突变型TIR1家族蛋白为稻源蛋白。

[4]根据[1]～[3]中的任一项所述的试剂盒，其中，前述突变型TIR1家族蛋白为OsTIR1的第74位的F突变为A、G或S的蛋白。

[5]根据[1]～[4]中的任一项所述的试剂盒，其中，前述生长素类似物为下述通式(I)所示的化合物或其酯。

[化学式1]

(通式(I)中，R¹⁰为任选具有取代基的、成环的一部分碳原子任选被杂原子取代的环状的脂肪族烃基，或者任选具有取代基的、成环的一部分碳原子任选被杂原子取代的芳香族烃基。)

[6]根据[2]～[5]中的任一项所述的试剂盒，其还具有第四核酸，其编码连接在前述第一核酸与前述第二核酸及前述第三核酸之间的接头，使得以1个启动子控制多个基因。

[7]根据[2]～[6]中的任一项所述的试剂盒，其还具有转座子载体，所述转座子载体包含前述第一核酸和/或前述第二核酸及前述第三核酸。

[8]根据[1]～[7]中的任一项所述的试剂盒，其还含有编码内源性的目标蛋白的靶基因组DNA切割酶或编码前述酶的第五核酸。

[9]根据权利要求[1]～[8]中的任一项所述的试剂盒，其还具有在染色体上具有前述第一核酸的非植物来源的真核细胞。

[10]一种靶蛋白的降解方法，其使用[1]～[9]中的任一项所述的试剂盒。

[11]一种靶蛋白降解诱导剂，所述靶蛋白降解诱导剂用于对非植物来源的真核细胞中的靶蛋白的降解进行控制的生长素降解决定子系统，其含有下述通式(I)所示的化合物或其酯。

[化学式2]

[12]一种细胞，其为通过生长素降解决定子系统来控制生物体内的靶蛋白降解的、非植物来源的真核细胞，所述细胞具有包含第一核酸的染色体，所述第一核酸编码在生长素结合位点具有突变的突变型TIR1家族蛋白。

[13]根据[12]所述的细胞，前述突变型TIR1家族蛋白为稻源蛋白。

[14]根据[12]或[13]所述的细胞，其中，前述突变型TIR1家族蛋白为OsTIR1的第74位的F突变为A、G或S的蛋白。

[15]下述通式(II)所示的化合物。

[化学式3]

(通式(II)中，R³⁰表示氢原子、碳数1～6的烷基或卤素原子，R³¹表示氢原子或碳数1～6的烷基。其中，在R³⁰为氢原子或碳数1～6的烷基的情况下，R³¹为碳数1～6的烷基。)

[16]根据[12]～[15]中的任一项所述的细胞，其还具有包含第二核酸和第三核酸的染色体，所述第二核酸编码包含至少一部分Aux/IAA家族蛋白并与突变型TIR1家族蛋白-生长素类似物复合物具有亲和性的降解标签，所述第三核酸编码连接在前述第二核酸的上游或下游的靶蛋白。

[17]一种非人类动物，其通过移植而具有[12]～[16]中的任一项所述的细胞。

[18]一种药物靶蛋白或药剂的评价方法，其使用[12]～[17]中的任一项所述的非人类动物。

[19]一种经遗传修饰的非人类动物，所述经遗传修饰的非人类动物通过生长素降解决定子系统来控制生物体内的靶蛋白降解，其具有包含第一核酸的染色体，所述第一核酸编码在生长素结合位点具有突变并与生长素类似物具有亲和性的突变型TIR1家族蛋白。

[20]根据[19]所述的经遗传修饰的非人类动物，其中，前述突变型TIR1家族蛋白为稻源蛋白。

[21]根据[19]或[20]所述的经遗传修饰的非人类动物，其中，前述突变型TIR1家族蛋白为OsTIR1的第74位的F突变为A、G或S的蛋白。

[22]根据[19]～[21]中的任一项所述的经遗传修饰的非人类动物，其还具有包含第二核酸和第三核酸的染色体，所述第二核酸编码包含至少一部分Aux/IAA家族蛋白并与突变型TIR1家族蛋白-生长素类似物复合物具有亲和性的降解标签，所述第三核酸编码连接在前述第二核酸的上游或下游的靶蛋白。

[23]根据[19]～[22]中的任一项所述的经遗传修饰的非人类动物，其为病理模型。

[24]根据[19]～[23]中的任一项所述的经遗传修饰的非人类动物，其中，前述生长素类似物为下述通式(I)所示的化合物或其酯。

[化学式4]

[25]一种靶蛋白功能分析的体内方法，其使用[19]～[24]中的任一项所述的经遗传修饰的非人类动物。

[26]一种药物靶蛋白或药剂的评价方法，其使用[19]～[24]中的任一项所述的经遗传修饰的非人类动物。

[27]一种药物靶蛋白的评价方法，其包括：

步骤1，对非人类动物给药生长素类似物，

所述非人类动物是具有组织特异性疾病、通过生长素降解决定子系统来控制生物体内的靶蛋白降解的经遗传修饰的非人类动物，

所述非人类动物于全身的细胞中具有包含第一核酸的染色体以及包含第二核酸和第三核酸的染色体，

所述第一核酸编码在生长素结合位点具有突变并与生长素类似物具有亲和性的突变型TIR1家族蛋白，所述第二核酸编码包含至少一部分Aux/IAA家族蛋白并与突变型TIR1家族蛋白-生长素类似物复合物具有亲和性的降解标签，所述第三核酸编码连接在前述第二核酸的上游或下游的靶蛋白；

步骤2，在各细胞中，通过生长素降解决定子系统来诱导生物体内的靶蛋白降解；以及

步骤3，观察靶蛋白的降解所引起的对病变组织和正常组织的影响。

[28]根据[27]所述的药物靶蛋白的评价方法，其还包括步骤4，步骤3之后，中断生长素类似物的给药，观察靶蛋白的表达恢复所引起的对病变组织和正常组织的影响。

发明的效果

根据本发明，可以严格且自由地进行蛋白的降解控制。

附图说明

图1为在实施例1中对OsTIR1(F74G)/mAID-EGFP-NLS表达细胞中的靶蛋白的降解进行FACS分析的结果。

图2为在实施例2中对由添加多种生长素类似物所引起的OsTIR1(F74G)/mAID-EGFP-NLS表达细胞中的靶蛋白的降解进行FACS分析的结果。

图3为实施例3中的群落形成试验的结果。

图4的(A)为添加了5-Ph-IAA的OsTIR1(F74G)/DHC1-mAID-Clover表达细胞的显微镜像。图4的(B)为通过蛋白印迹对5-Ph-IAA依赖性的DHC1的降解进行确认的结果。

图5为靶蛋白降解系统的概念图。

图6的(A)为通过蛋白印迹对5-Ph-IAA依赖性的CENPH的降解进行确认的结果。图6的(B)为通过蛋白印迹对5-Ph-IAA依赖性的POLD1的降解进行确认的结果。

图7的(A)为示出5-Ph-IAA的给药时间表的图。图7的(B)为示出给药了5-Ph-IAA的小鼠的体重变化的图表。

图8的(A)为使用HCT116 CMV-OsTIR1(F74G)对mAID-BRD4的降解进行确认的结果。图8的(B)为使用HCT116 CMV-OsTIR1(F74G)对mAID-Clover-TOP2A-mAID-Clover(TOP2A-mAC)的降解进行确认的结果。图8的(C)为示出异种移植了表达OsTIR1(F74G)的HCT116细胞的裸鼠在5-Ph-IAA给药后的肿瘤的增殖的结果。图8的(D)为示出异种移植了表达OsTIR1(F74G)的HCT116细胞的裸鼠在5-Ph-IAA给药后的肿瘤的增殖的结果。图8的(E)为异种移植了表达OsTIR1(F74G)的HCT116细胞的裸鼠在5-Ph-IAA给药后所摘除的肿瘤的照片。

图9的(A)为示出异种移植了mAID-BRD4细胞的裸鼠在5-Ph-IAA给药后的肿瘤增殖的抑制的结果。图9的(B)为示出异种移植了mAID-BRD4细胞的裸鼠在5-Ph-IAA给药后的肿瘤增殖的抑制的结果。图9的(C)为异种移植了mAID-BRD4细胞的裸鼠在5-Ph-IAA给药后所摘除的肿瘤的照片。

图10的(A)为示出异种移植了TOP2A-mAID-Clover(TOP2A-mAC)细胞的裸鼠在5-Ph-IAA给药后的肿瘤增殖的抑制的结果。图10的(B)为示出异种移植了TOP2A-mAID-Clover(TOP2A-mAC)细胞的裸鼠在5-Ph-IAA给药后的肿瘤增殖的抑制的结果。

图11的(A)为尝试构建表达mAID-EGFP报告蛋白并且表达OsTIR1(WT)或OsTIR1(F74G)的转基因小鼠的结果。图11的(B)为对通过外科手术自未经处理的转基因小鼠取出的卵巢和输卵管中的报告蛋白的表达进行确认的照片。图11的(C)为对腹腔给药了5-Ph-IAA的转基因小鼠的内脏器官的报告蛋白表达进行确认的照片。图11的(D)为对胚胎中表达的报告蛋白随时间的消失进行确认的照片。

图12为在OsTIR1(F74G)导入细胞中对5-Ph-IAA去除后的报告蛋白表达的恢复进行研究的结果。

图13的(A)为示出5-Ph-IAA的口服给药时间表的图。图13的(B)为示出异种移植了mAID-BRD4细胞的裸鼠在5-Ph-IAA给药后的肿瘤增殖的抑制的结果。

具体实施方式

生长素降解决定子系统的试剂盒

本发明的试剂盒为非植物来源的真核细胞中的对靶蛋白的降解进行控制的生长素降解决定子系统的试剂盒，其具有：第一核酸，其编码在生长素结合位点具有突变的突变型TIR1家族蛋白；生长素类似物，其与前述突变型TIR1家族蛋白具有亲和性；以及第二核酸，其编码包含至少一部分Aux/IAA家族蛋白并与前述突变型TIR1家族蛋白-前述生长素类似物复合物具有亲和性的降解标签。

“生长素降解决定子系统”是本发明人等所开发的蛋白降解的控制技术，其是将通过植物激素生长素来导入的植物特异性的蛋白降解系统应用于非植物来源的真核细胞的系统(例如参照专利文献1～3)。

具体而言，该系统为如下系统：通过将植物来源的TIR1家族蛋白(其为属于E3泛素化酶复合物(SCF复合物)的亚基的F-box蛋白)、以及植物来源的Aux/IAA家族蛋白或其部分序列组成的肽标记的靶蛋白导入非植物来源的真核细胞，从而使作为生长素受体的TIR1家族蛋白依赖于生长素地识别由Aux/IAA家族蛋白或其部分序列组成的肽，并利用非植物来源的真核细胞中的泛素/蛋白酶体降解系统来降解靶蛋白。

本发明人等在该系统中发现了靶蛋白会不依赖于生长素而降解的问题。针对该问题，本发明人等发现如下组合：在生长素结合位点具有突变的突变型TIR1家族蛋白，与前述突变型TIR1家族蛋白具有亲和性的生长素类似物，以及包含至少一部分Aux/IAA家族蛋白并与前述突变型TIR1家族蛋白-前述生长素类似物复合物具有亲和性的降解标签。

此外，本发明人等发现，可以以低浓度的生长素类似物诱导靶蛋白降解。

根据本发明，可以提供在不添加生长素时几乎不发生靶蛋白的降解、在添加生长素时靶蛋白的降解效率非常高的生长素降解决定子系统。

第一核酸

在本发明中，第一核酸编码在生长素结合位点具有突变的突变型TIR1家族蛋白。

TIR1家族蛋白是指，在泛素/蛋白酶体系统的蛋白降解中作为形成E3泛素化酶复合物(SCF复合物)的亚基之一的F-box蛋白，是植物特有的蛋白。已知TIR1家族蛋白构成属于生长激素的生长素的受体，通过接受生长素而识别生长素信息传递系统的抑制因子Aux/IAA家族蛋白，从而降解靶蛋白。

作为编码TIR1家族蛋白的基因，只要为对植物来源的TIR1家族蛋白进行编码的基因，则其种类不限。此外，作为来源的植物的种类也不限，例如可列举出：拟南芥、稻、百日草、松树、蕨类植物、小立碗藓等。作为编码TIR1家族蛋白的基因的具体例子，例如可列举出：TIR1基因、AFB1基因、AFB2基因、AFB3基因、FBX14基因、AFB5基因等。

当中，优选稻来源的TIR1基因，即OsTIR1基因。作为该基因，可列举出：登录于NCBI的登录号NM_001059194(GeneID：4335696)、Os04g0395600或登录号EAY93933、OsI_15707的基因，更具体而言，可列举出：由序列号1所示的碱基序列组成的基因。进一步地，优选由为了用于人类细胞而优化了密码子的序列号2所示的碱基序列组成的基因。

在本发明中，突变型TIR1家族蛋白在生长素结合位点具有突变。该突变蛋白只要与后述的生长素类似物具有亲和性，则没有特别限定，优选OsTIR1的第74位的F突变为A、G或S的蛋白，更优选突变为G的蛋白。

具体而言，突变型TIR1家族蛋白特别优选如下蛋白：由包含以下的(a)～(c)中的任一项的氨基酸序列的序列组成，并且经由与生长素类似物的复合物与降解标签结合、引导靶蛋白的降解。

(a)序列号3所示的氨基酸序列的氨基酸编号74位为甘氨酸的氨基酸序列；

(b)在前述(a)的除氨基酸编号74位以外的位点，缺失、插入、取代或添加了1～数个氨基酸的氨基酸序列；

(c)在前述(a)的除氨基酸编号74位以外的位点，具有80％以上的同一性的氨基酸序列

作为在(b)中缺失、插入、取代或添加的氨基酸数，优选为1～120个，更优选为1～60个，进一步优选为1～20个，特别优选为1～10个，最优选为1～5个。

为了在功能上与由包含(a)的氨基酸序列的序列组成的蛋白同等，需要具有80％以上的同一性。作为该同一性，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上，特别优选为95％以上，最优选为99％以上。

作为OsTIR1的F74A蛋白，可列举出由序列号4所示的氨基酸序列组成的蛋白，作为编码OsTIR1的F74A蛋白的基因，可列举出由序列号5所示的碱基序列组成的基因。

作为OsTIR1的F74G蛋白，可列举出由序列号6所示的氨基酸序列组成的蛋白，作为编码OsTIR1的F74G蛋白的基因，可列举出由序列号7所示的碱基序列组成的基因。

编码突变型TIR1家族蛋白的第一核酸可以为包含外显子和内含子的DNA，也可以为由外显子形成的cDNA。编码突变型TIR1家族蛋白的第一核酸例如可以为基因组DNA的全长序列或cDNA的全长序列。此外，编码突变型TIR1家族蛋白的第一核酸在所表达的蛋白发挥作为TIR1的功能的范围内，可以为基因组DNA中的部分序列或cDNA中的部分序列。

在本说明书中，“发挥作为TIR1家族蛋白的功能”是指，例如在生长素类似物的存在下识别降解标签(Aux/IAA家族蛋白的全长或部分蛋白)。这是由于，只要TIR1家族蛋白能够识别降解标签，则能够将用降解标签标记了的靶蛋白降解。

在本发明的试剂盒中，优选在编码TIR1家族蛋白的第一核酸的5’末端以可启动的方式连接有控制该第一核酸的转录的启动子序列。由此，能够更确实地表达TIR1家族蛋白。

在本说明书中，“以可启动的方式连接”是指，基因表达控制序列(例如启动子或一系列的转录因子结合位点)与想要表达的基因(编码TIR1家族蛋白的第一核酸)之间的功能性连接。在此，“表达控制序列”是指，指向其想要表达的基因(编码TIR1家族蛋白的第一核酸)的转录。

作为前述启动子，没有特别限定，例如可以根据细胞的种类等而适当确定。作为启动子的具体例子，可列举出：CMV启动子、SV40启动子、EF1a启动子、RSV启动子等。

在本发明的试剂盒中，编码TIR1家族蛋白的第一核酸及以可启动的方式连接在上游的启动子序列可以为被插入载体的形式。

作为载体，优选为表达载体。作为表达载体，没有特别限制，可以使用适合宿主细胞的表达载体。

载体可以在编码TIR1家族蛋白的第一核酸的5’末端或3’末端以可启动的方式连接有多聚腺苷酸化信号、NLS、荧光蛋白的标记基因等。

本发明的试剂盒可以具有在染色体上具有第一核酸的非植物来源的真核细胞。该细胞优选在安全港位点具有第一核酸。

“安全港位点”是指，持续且稳定地进行表达的基因区域，并且即使在该区域原本所编码的基因发生缺失或被修饰的情况下也可维持生命的区域。在使用CRISPR系统将外源DNA(在本实施方案中为编码TIR1的基因)插入安全港位点的情况下，优选在附近具有PAM序列。作为安全港位点，例如可列举出：GTP-结合蛋白10基因座、Rosa26基因座、beta-肌动蛋白基因座、AAVS1(AAV整合位点1)基因座等。这些当中，在为人类来源细胞的情况下，优选将外源DNA插入AAVS1基因座。

作为细胞，只要为非植物来源的真核细胞，则没有特别限定，可列举出动物、菌类、原生生物等的细胞。作为动物，例如可列举出：人类、小鼠、大鼠、兔子等哺乳类，斑马鱼、爪蟾等鱼类、两栖类，秀丽隐杆线虫(C.elegans)、果蝇等无脊椎动物。

此外，还可列举出：已建立的真核动物来源细胞、ES细胞、iPS细胞。作为真核细胞，具体而言，例如可列举出：已建立的人类来源细胞、已建立的小鼠来源细胞、已建立的鸡来源细胞、人类ES细胞、小鼠ES细胞、人类iPS细胞、小鼠iPS细胞等。具体可列举出：人类HCT116细胞、人类HT1080细胞、人类NALM6细胞、人类ES细胞、人类iPS细胞、小鼠ES细胞、小鼠iPS细胞、鸡DT40细胞等。

此外，作为菌类，例如可列举出：酿酒酵母、裂殖酵母等。

生长素类似物

在本发明中，生长素类似物只要与前述突变型TIR1家族蛋白具有亲和性则没有特别限定，优选为下述通式(I)所示的化合物或其酯。

[化学式5]

[环状的脂肪族烃基]

作为R¹⁰中的环状的脂肪族烃基，可以为单环式基团，也可以为多环式基团。

作为单环式的脂肪族烃，可列举出：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、甲基环己基、二甲基环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基。

作为多环式的脂环式烃基，可列举出：十氢萘基、金刚烷基、2-烷基金刚烷-2-基、1-(金刚烷-1-基)链烷-1-基、降冰片基、甲基降冰片基、异冰片基等。

环状的脂肪族烃基任选成环的一部分碳原子被杂原子取代。作为杂原子，可列举出：氧原子、硫原子、氮原子等。作为该杂环，可列举出：吡咯烷、四氢呋喃、四氢噻吩、哌啶、四氢吡喃、四氢噻喃、二噁烷、二氧戊环等。

作为取代基，可列举出：碳数1～6的烷基、碳数1～6的烷氧基、卤素原子、碳数6～30的芳基。

作为烷基，例如可列举出：甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、叔戊基、环戊基、2,3-二甲基丙基、1-乙基丙基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、正己基、异己基、环己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、1,1,2-三甲基丙基、3,3-二甲基丁基等。

作为烷氧基，可列举出-OR的R部分为与上述碳数1～6的烷基相同的基团。这些当中，作为碳数烷氧基，优选为甲氧基或乙氧基。

作为卤素原子，例如可列举出：氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等。这些当中，作为卤素原子，优选氟原子或氯原子。

作为芳基，可列举出：苯基、萘基、苄基、苯乙基、联苯基、并环戊二烯基、茚基、蒽基、并四苯基、并五苯基、芘基、苝基、芴基、菲基。

[芳香族烃基]

作为R¹⁰中的芳香族烃基，可列举出上述碳数6～30的芳基。

芳香族烃基任选成环的一部分碳原子被杂原子取代。作为杂原子，可列举出：氧原子、硫原子、氮原子等。作为该杂环，可列举出：吡咯、呋喃、噻吩、吡啶、咪唑、吡唑、噁唑、噻唑、哒嗪、嘧啶、吲哚、苯并咪唑、喹啉、异喹啉、色烯、异色烯等。

作为取代基，可列举出与[环状的脂肪族烃基]中所列举出的相同的基团。

通式(I)所示的化合物的酯为通式(I)的-COOH中的氢原子被烃基取代的化合物，优选被烷基取代的化合物。

作为该烷基，优选碳数1～6的烷基，可列举出：甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、叔戊基、环戊基、2,3-二甲基丙基、1-乙基丙基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、正己基、异己基、环己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、1,1,2-三甲基丙基、3,3-二甲基丁基等。

通式(I)所示的化合物中，作为R¹⁰为芳香族烃基的化合物，优选下述通式(I-1)所示的化合物或其酯。

[化学式6]

(通式(I-1)中，R¹为碳数1～6的烷基、碳数1～6的烷氧基、卤素原子或碳数6～30的芳基。n为0～5的整数，在n为2～5的整数的情况下，n个R¹可以彼此相同或不同。)

作为R¹的卤素原子，例如可列举出：氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等。这些当中，作为卤素原子，优选氟原子或氯原子。

作为R¹的烷基，例如可列举出：甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、叔戊基、环戊基、2,3-二甲基丙基、1-乙基丙基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、正己基、异己基、环己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、1,1,2-三甲基丙基、3,3-二甲基丁基等。这些当中，作为碳数1～6的烷基，优选为甲基或乙基。

作为R¹的烷氧基，可列举出-OR的R的部分与上述碳数1～6的烷基相同的基团。这些当中，作为碳数烷氧基，优选为甲氧基或乙氧基。

作为R¹的芳基，可列举出：苯基、萘基、苄基、苯乙基、联苯基、并环戊二烯基、茚基、蒽基、并四苯基、并五苯基、芘基、苝基、芴基、菲基。

R¹的n为0～5的整数，优选为0～3。在通式(I-1)所示的化合物具有多个R¹的情况下，可列举出以下的化合物或其酯。

[化学式7]

(通式(I-1-1)～(I-1-3)中，R¹～R³各自独立地为碳数1～6的烷基、碳数1～6的烷氧基、卤素原子或碳数6～30的芳基。)

通式(I-1-1)～(I-1-3)中的R¹～R³与通式(I-1)中的R¹相同。

此外，通式(I)所示的化合物中，优选以下所示的化合物或其酯。

下述式(I-1-4)所示的化合物(也称为5-(3-MeOPh)-IAA)。

下述式(I-1-5)所示的化合物(也称为5-Ph-IAA)。

下述式(I-1-6)所示的化合物(也称为5-(3,4-diMePh)-IAA)。

下述式(I-1-7)所示的化合物(也称为5-(3-MePh)-IAA)。

下述式(I-1-8)所示的化合物(也称为5-(3-ClPh)-IAA)。

[化学式8]

[化学式9]

此外，下述式(I-1-9)所示的化合物或其酯也是优选的。

[化学式10]

此外，作为R¹⁰为芳香族烃基的化合物，下述式(I-2)～(I-5)所示的化合物或其酯也是优选的。

[化学式11]

此外，作为R¹⁰为环状的脂肪族烃基的化合物，下述通式(I-6)所示的化合物或其酯也是优选的。

[化学式12]

(通式(I-6)中，R¹为碳数1～6的烷基、碳数1～6的烷氧基、卤素原子或碳数6～30的芳基。m为0～11的整数，在m为2～11的整数的情况下，m个R¹可以彼此相同或不同。)

R¹与通式(I-1)中所列举的基团相同。m优选为0～6，更优选为0～3。

此外，作为R¹⁰为环状的脂肪族烃基的化合物，下述式(I-7)所示的化合物或其酯也是优选的。

[化学式13]

第二核酸

在本发明中，第二核酸编码包含至少一部分Aux/IAA家族蛋白并与突变型TIR1家族蛋白-前述生长素类似物复合物具有亲和性的降解标签。

作为编码Aux/IAA家族蛋白的基因，只要为植物来源的Aux/IAA家族基因，则对其种类没有特别限定。作为编码Aux/IAA家族蛋白的基因的具体例子，例如可列举出：IAA1基因、IAA2基因、IAA3基因、IAA4基因、IAA5基因、IAA6基因、IAA7基因、IAA8基因、IAA9基因、IAA10基因、IAA11基因、IAA12基因、IAA13基因、IAA14基因、IAA15基因、IAA16基因、IAA17基因、IAA18基因、IAA19基因、IAA20基因、IAA26基因、IAA27基因、IAA28基因、IAA29基因、IAA30基因、IAA31基因、IAA32基因、IAA33基因、IAA34基因等。

本发明的试剂盒可以具有任一种前述编码Aux/IAA家族蛋白的基因的全长或部分序列，也可以具有两种以上。例如拟南芥来源的Aux/IAA家族基因的序列登录于TAIR(theArabidopsis Information Resource)，各基因的登录号如下。

IAA1基因(AT4G14560)、IAA2基因(AT3G23030)、IAA3基因(AT1G04240)、IAA4基因(AT5G43700)、IAA5基因(AT1G15580)、IAA6基因(AT1G52830)、IAA7基因(AT3G23050)、IAA8基因(AT2G22670)、IAA9基因(AT5G65670)、IAA10基因(AT1G04100)、IAA11基因(AT4G28640)、IAA12基因(AT1G04550)、IAA13基因(AT2G33310)、IAA14基因(AT4G14550)、IAA15基因(AT1G80390)、IAA16基因(AT3G04730)、IAA17基因(AT1G04250)、IAA18基因(AT1G51950)、IAA19基因(AT3G15540)、IAA20基因(AT2G46990)、IAA26基因(AT3G16500)、IAA27基因(AT4G29080)、IAA28基因(AT5G25890)、IAA29基因(AT4G32280)、IAA30基因(AT3G62100)、IAA31基因(AT3G17600)、IAA32基因(AT2G01200)、IAA33基因(AT5G57420)、IAA34基因(AT1G15050)。

这些当中，优选拟南芥IAA17基因。

降解标签只要与突变型TIR1家族蛋白-生长素类似物复合物结合、引导靶蛋白降解，则没有特别限定，Aux/IAA家族蛋白中，优选包含mAID的全长或部分蛋白的蛋白。

“mAID”是“Mini-auxin-inducible degron”的缩写，是指由Aux/IAA家族蛋白之一的拟南芥IAA17的部分序列组成的蛋白。该部分序列是指，由在Aux/IAA家族蛋白的结构域II区的N末端侧及C末端侧分别包含至少2个Lys残基的区域组成的序列，或者将2个以上该序列连接而成的序列。该mAID可以成为标记靶蛋白的降解标签。例如，mAID的氨基酸序列由序列号8表示。

第三核酸

在本发明的试剂盒中，在靶蛋白确定的情况下，可以具有连接在第二核酸的上游或下游的编码靶蛋白的第三核酸。第二核酸可以在第三核酸的5’侧或3’侧的任一侧相邻地配置。

由第二核酸和第三核酸形成的融合核酸与第一核酸相同，优选以可启动的方式连接有启动子序列，可以被整合入表达载体。

第四核酸

上述第一核酸及第二核酸或由第二核酸和第三核酸形成的融合核酸可以分别被整合入表达载体，但是，本发明的试剂盒也可以具有编码连接在第一核酸与由第二核酸和第三核酸形成的融合核酸之间的接头的第四核酸，使得1个启动子控制多个基因。

作为第四核酸，可列举出：编码通读(リードスルー)接头的核酸、编码非通读接头的核酸。

作为编码通读接头的核酸，可列举出编码基于内源性酶的切割序列的核酸，可列举出：编码T2A肽的核酸、编码P2A肽的核酸、编码F2A肽的核酸、编码E2A肽的核酸。

作为编码非通读接头的核酸，可列举出IRES。

转座子载体

本发明的试剂盒可以具有包含第一核酸和/或由第二核酸及前述第三核酸形成的融合核酸的转座子载体。

具体而言，本发明的试剂盒优选包含：具有在以可启动的方式连接有启动子序列的第一核酸和/或融合核酸的两端的转座子元件的载体，以及具有编码转座酶的核酸的载体。

第一核酸及融合核酸可以分别包含于单独的载体，然而，在包含于一个载体中的情况下，该载体优选包含上述第四核酸。

转座子的转移需要催化转座反应的酶(转座酶)和被该转座酶识别并转移的DNA(转座子元件)。本发明的试剂盒优选包含它们。

在本发明的试剂盒中，在编码转座酶的DNA及转座子元件以转座子DNA的形式连接而整合入一个表达系统的情况下，一旦转座子DNA导入细胞内，便可以自行表达转座酶并转移。

这种自主性转座子有可能从所转移的位置向另一位置转移。因此，为了更稳定将靶基因导入到染色体内，本发明的试剂盒优选将编码转座酶的DNA及转座子元件分别整合入单独的表达系统。

作为转座子，没有特别限定，可列举出：Sleeping Beauty、piggyBac、Tol2等。

第五核酸

由第二核酸和第三核酸形成的融合核酸可以通过同源重组而替换成内源性的第三核酸，但是在该融合核酸通过转座子等而整合入了任意的染色体的情况下，本发明的试剂盒优选包含编码内源性的靶蛋白的靶基因组DNA切割酶或编码前述酶的第五核酸。作为用于靶基因组DNA的双链切割的系统，可列举出：CRISPR-Cas9系统、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)系统及锌指核酸酶系统等。作为将这些系统导入细胞的方法，没有特别限定，可以将靶基因组DNA切割酶自身导入细胞，也可以将包含第五核酸的靶基因组DNA切割酶表达载体导入细胞。

例如，可列举出：在CRISPR-Cas9系统中，将Cas9表达载体、以及编码在想要切割的位点诱导Cas9的向导RNA的表达载体导入细胞的方法；将经表达纯化的重组Cas9蛋白、以及向导RNA导入细胞的方法等。向导RNA可以分成tracrRNA和crRNA这两个，也可以为连成了一条的sgRNA。

靶蛋白降解方法

本发明的靶蛋白的降解方法为使用上述本发明的试剂盒的方法。在生长素降解决定子系统中，通过使用上述试剂盒，可以严格且自由地进行靶蛋白的降解控制。

例如，作为使用上述试剂盒进行靶蛋白的降解控制的方法，可列举出以下方法等。

首先，在细胞内表达被降解标签标记的靶蛋白、以及TIR1家族蛋白。被降解标签标记的靶蛋白、以及TIR1家族蛋白优选稳定地表达。

接着，将生长素类似物添加至培养基。培养基中包含的生长素类似物的浓度不限，例如为1μM以上且小于0.1mM，优选为10nM以上且50μM以下。如后面在实施例中所述，通式(I)所示的化合物与OsTIR1(F74G)的组合能够以50nM的浓度充分诱导靶蛋白的降解。通过添加规定浓度的生长素类似物，形成突变型TIR1家族蛋白-生长素类似物复合物，该复合物识别被降解标签标记的靶蛋白，诱导靶蛋白的降解。

根据本发明的降解方法，能够生长素类似物特异性地诱导靶蛋白的降解。

化合物

本发明的化合物为下述通式(II)所示的化合物。

[化学式14]

作为R³⁰的卤素原子，例如可列举出：氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等。这些当中，作为卤素原子，优选氟原子或氯原子。

作为R³⁰及R³¹的烷基，例如各自独立地可列举出：甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、叔戊基、环戊基、2,3-二甲基丙基、1-乙基丙基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、正己基、异己基、环己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、1,1,2-三甲基丙基、3,3-二甲基丁基等。这些当中，作为碳数1～6的烷基，优选为甲基或乙基。

通式(II)所示的化合物中，优选下述式(II-1)～(II-4)所示的化合物。

[化学式15]

细胞

本发明的细胞为通过生长素降解决定子系统来控制生物体内的靶蛋白降解的非植物来源的真核细胞，其具有包含第一核酸的染色体，所述第一核酸编码在生长素结合位点具有突变的突变型TIR1家族蛋白。

本发明的细胞优选在安全港位点具有第一核酸。

作为细胞，与“生长素降解决定子系统的试剂盒”中所述的相同，只要为非植物来源的真核细胞，则没有特别限定，可列举出动物、菌类、原生生物等的细胞。

作为TIR1家族蛋白，与“生长素降解决定子系统的试剂盒”中所述的相同，为稻来源的TIR1蛋白，优选OsTIR1蛋白。

突变型TIR1家族蛋白与“生长素降解决定子系统的试剂盒”中所述的相同，优选为OsTIR1的第74位的F突变为A、G或S的蛋白，更优选突变为G的蛋白。

具体而言，突变型TIR1家族蛋白与“生长素降解决定子系统的试剂盒”中所述的相同，特别优选如下蛋白：由包含上述(a)～(c)中的任一项的氨基酸序列的序列组成，并且经由与生长素类似物的复合物与降解标签结合、引导靶蛋白的降解。

本发明的细胞优选还具有包含第二核酸和第三核酸的染色体，所述第二核酸编码包含至少一部分Aux/IAA家族蛋白并与突变型TIR1家族蛋白-生长素类似物复合物具有亲和性的降解标签，所述第三核酸编码连接在前述第二核酸的上游或下游的靶蛋白。

作为将第一核酸、第二核酸及第三核酸导入到染色体中的方法，没有特别限定，如“生长素降解决定子系统的试剂盒”中所述，可以使用CRISPR系统等基因组编辑技术来导入，也可以使用转座子载体来导入。

非人类动物

[第一实施方案]

本实施方案的非人类动物为通过移植而具有通过生长素降解决定子系统来控制生物体内的靶蛋白降解的细胞的非人类动物，前述细胞具有包含第一核酸的染色体，所述第一核酸编码在生长素结合位点具有突变并与生长素类似物具有亲和性的突变型TIR1家族蛋白。

本实施方案的非人类动物通过移植而具有上述本发明的细胞。作为移植部位，没有特别限定，可列举出：皮下组织内、脾、尾静脉等。

作为非人类动物，例如可列举出：猫、狗、马、猴、牛、绵羊、猪、山羊、兔子、仓鼠、豚鼠、大鼠、小鼠等。这些当中，从药物评价的实际成绩的角度来看，优选啮齿类。作为啮齿类，可列举出：仓鼠、豚鼠、大鼠、小鼠等，优选大鼠、小鼠。

作为移植对象的动物，优选免疫缺陷的动物，可列举出：裸鼠、SCID小鼠、NOG小鼠等。

本发明的非人类动物可以适宜地用于使用异种移植模型的药物评价。例如，构建对抗癌药物的靶分子添加了降解决定子标签的细胞，构建将该细胞移植到裸鼠的皮下并形成有肿瘤的异种移植小鼠。如果对该小鼠给药生长素类似物，可以构建如下系统：生长素类似物会到达移植的细胞，将靶分子降解，并且细胞死亡，能够观察肿瘤的收缩。该系统作为对照，对相同的小鼠给药所制备的药剂，可以评价抗肿瘤效果。

作为生长素类似物的给药方法，没有特别限定，可列举出：腹腔给药、静脉给药、动脉给药、肌内给药、皮内给药、皮下给药、口服给药等。作为给药量，例如优选为每日0.1mg/kg～100mg/kg、更优选为0.2mg/kg～50mg/kg、进一步优选为0.5mg/kg～20mg/kg。作为给药期间，优选为1日～10日，更优选为3日～7日。

[第二实施方案]

本实施方案的非人类动物为经遗传修饰的非人类动物，其通过生长素降解决定子系统来控制生物体内的靶蛋白降解，其具有包含第一核酸的染色体，所述第一核酸编码在生长素结合位点具有突变并与生长素类似物具有亲和性的突变型TIR1家族蛋白。

作为TIR1家族蛋白，只要为植物来源的TIR1家族蛋白，则其种类不限。此外，作为来源的植物的种类也不限，例如可列举出：拟南芥、稻、百日草、松树、蕨类植物、小立碗藓等。这些当中，优选稻来源的TIR1蛋白，即OsTIR1蛋白。

在本发明中，突变型TIR1家族蛋白在生长素结合位点具有突变。该突变蛋白只要与后述的生长素类似物具有亲和性，则没有特别限定，但是，优选OsTIR1的第74位的F突变为A、G或S的蛋白，更优选突变为G的蛋白。

为了在功能上与由包含(a)的氨基酸序列的序列组成的蛋白相同，具有80％以上的同一性。作为该同一性，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上，特别优选为95％以上，最优选为99％以上。

本实施方案的非人类动物优选还具有包含第二核酸和第三核酸的染色体，所述第二核酸编码包含至少一部分Aux/IAA家族蛋白并与突变型TIR1家族蛋白-生长素类似物复合物具有亲和性的降解标签，所述第三核酸编码连接在前述第二核酸的上游或下游的靶蛋白。

第三核酸优选编码内源性的靶蛋白，详细而言，优选编码染色体上的内源性的靶蛋白的第三核酸通过同源重组而替换成由编码降解标签的第二核酸和第三核酸形成的融合核酸。

此外，该融合核酸在染色体上的取代与编码突变型TIR1家族蛋白的第一核酸相同，可以在制作本发明的经遗传修饰的非人类动物时进行，也可以在制作具有包含第一核酸的染色体的经遗传修饰的非人类动物后，另行通过使用载体的基因组编辑而进行。

本实施方案的非人类动物适合于生物体内的蛋白的功能分析。通过给药生长素类似物而使靶蛋白降解，可以根据癌变、组织发育不全等由降解所引起的表型分析来推测该蛋白在体内的功能。

此外，本实施方案的非人类动物优选为病理模型。以下对该病理模型的适宜使用方法进行说明。

第一，本发明的本实施方案的非人类动物由于通过给药生长素类似物而使靶蛋白降解，可以期待与基因敲除非人类动物相同的效果。例如，在由于基因的缺失而发生神经退行性疾病的情况下，在本发明的经遗传修饰的非人类动物中，通过降解靶蛋白，可以得到具有神经退行性疾病的表型的病理模型。此外，例如，在本发明的经遗传修饰的非人类动物中，通过以由抑癌基因编码的蛋白为靶，可以得到癌症的病理模型。

进而，本实施方案的非人类动物通过控制给药生长素类似物的时机，能够抑制胚胎致死，因此可以期待与条件基因敲除非人类动物相同的效果。

此外，通过利用组织特异性启动子等使突变型TIR1的表达局部化，或赋予生长素类似物以组织定位，或局部给药生长素类似物，可以诱导组织特异性的靶蛋白的降解。

第二，将现有的病理模型与本实施方案的非人类动物结合，可以制作具有生长素降解决定子系统的病理模型。作为现有的病理模型，优选为具有组织特异性疾病的病理模型，可列举出：大肠癌、胃癌、肺癌等癌症模型，阿尔茨海默氏病、帕金森病等神经退行性疾病模型，或者糖尿病、动脉硬化等生活方式疾病。

例如，在将大肠癌模型与本发明的经遗传修饰的非人类动物结合来制作出具有生长素降解决定子系统的大肠癌模型的情况下，可以研究给药生长素类似物来降解靶蛋白时的大肠癌的抗肿瘤效果，并且可以研究降解正常组织处的靶蛋白时的影响。

进而，一旦中断生长素类似物给药，靶蛋白的降解中断，其表达会恢复，因此可以期待与给药一定时间的药剂消失的情况相同的效果。

该病理模型适合于药剂靶分子的评价。

生长素类似物优选为下述通式(I)所示的化合物或其酯。

[化学式16]

本实施方案的非人类动物中使用的生长素类似物的详细情况与“生长素类似物”中所述的相同。

作为生长素类似物的给药方法，与第一实施方案中所述的相同，可列举出：腹腔给药、静脉给药、动脉给药、肌内给药、皮内给药、皮下给药、口服给药等。作为给药量，例如优选为每日0.1mg/kg～100mg/kg、更优选为0.2mg/kg～50mg/kg、进一步优选为0.5mg/kg～20mg/kg。作为给药期间，优选为1日～10日，更优选为3日～7日。

实施例

以下，通过实施例来说明本发明，但本发明并不限于以下实施例。

[实施例1]

1.合成生长素类似物

合成式(I-2)所示的化合物(也称为5-Ph-IAA)。

2.准备细胞

准备经由P2A序列编码OsTIR1(WT)基因或OsTIR1(F74G)基因和mAID-EGFP(绿色荧光蛋白)-NLS(核定位信号)基因的DNA通过转座子插入到染色体上的HCT116细胞(人结肠腺癌来源细胞)(以下称为“OsTIR1(WT)/mAID-EGFP-NLS表达细胞”或“OsTIR1(F74G)/mAID-EGFP-NLS表达细胞”)(参照图1)。

3.添加生长素类似物

向OsTIR1(F74G)/mAID-EGFP-NLS表达细胞添加生长素类似物(培养基中的浓度：0、200μM)，培养24小时。此外，作为对照，还准备向OsTIR1(WT)/mAID-EGFP-NLS表达细胞添加了生长素的细胞。

3.FACS分析

自添加生长素类似物起24小时后回收细胞，进行FACS分析。将结果示于图1。

根据图1，添加了生长素类似物的OsTIR1(F74G)/mAID-EGFP-NLS表达细胞与OsTIR1(WT)/mAID-EGFP-NLS表达细胞相比，降解诱导前的表达高且均匀。进而，添加了生长素类似物的OsTIR1(F74G)/mAID-EGFP-NLS表达细胞与添加了生长素的OsTIR1(WT)/mAID-EGFP-NLS表达细胞相比，观察到了更急剧的GFP的降解。

[实施例2]

1.合成生长素类似物

合成式(I-1-5)所示的化合物(也称为5-Ph-IAA)、式(I-1-6)所示的化合物(也称为5-(3,4-diMePh)-IAA)、式(I-1-7)所示的化合物(也称为5-(3-MePh)-IAA)、式(I-1-8)所示的化合物(也称为5-(3-ClPh)-IAA)。式(I-1-4)所示的化合物(也称为5-(3-MeOPh)-IAA)购自东京化成工业株式会社。

以下，示出所合成的化合物的合成方法。

[合成5-溴吲哚3-乙酸甲酯]

[化学式17]

将5-溴吲哚3-乙酸(500mg、1.97mmol)的甲醇溶液(25mL)装入100mL圆底烧瓶，边搅拌边滴加1mL乙酰氯。在室温下反应3小时。将反应液倒入100mL水，将其用50mL的乙酸乙酯萃取2次。将有机层用100mL饱和盐水洗涤后，用无水硫酸钠脱水，进行减压浓缩得到茶褐色油的5-溴吲哚3-乙酸甲酯(26mg、1.96mmol、收率99％)。

以下示出所得化合物基于¹H-NMR及¹³C-NMR的分析结果。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.17(s,1H),7.73(d,J＝1.8Hz,1H),7.28(dd,J＝7.6,5.7Hz,1H),7.20(dd,J＝13.5,4.8Hz,1H),7.16-7.10(m,1H),3.75-3.70(m,2H),3.71(s,3H),¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)δC 172.33,134.80,129.06,125.21,124.42,121.59,113.12,112.730,108.24,52.18,30.98.

[合成5-苯基-吲哚3-乙酸甲酯]

[化学式18]

将5-溴吲哚3-乙酸甲酯(540mg、2.01mmol)、苯硼酸(467mg、3.83mmol)、双(三苯基膦)二氯化钯(II)[PdCl₂(PPhe₃)₂：67mg、0.095mmol]加入装有5mL二甲基甲酰胺、5mL乙醇、2mL 3M碳酸钾水溶液的50mL的圆底烧瓶。对容器内进行氮气置换，在120℃下加热回流5小时。向反应液中加入10mL乙酸乙酯和20mL水，用15mL乙酸乙酯萃取3次。将有机层用20mL饱和盐水洗涤，接着用无水硫酸钠脱水后，进行减压浓缩。将该浓缩物用硅胶柱层析(洗脱溶剂、己烷:乙酸乙酯＝3:1)纯化，以橙色油的形式得到5-苯基-吲哚3-乙酸甲酯(134mg、0.50mmol、收率25.1％)。

以下示出所得化合物基于¹H-NMR及¹³C-NMR的分析结果。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.14(s,1H),7.82(s,1H),7.69-7.61(m,2H),7.43(t,J＝7.8Hz,3H),7.40-7.34(m,1H),7.34-7.28(m,1H),7.16(d,J＝10.1Hz,1H),4.17(qd,J＝7.1,4.0Hz,2H),3.81(s,3H),¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)δC 172.19,142.64,135.74,133.37,128.74,127.52,126.44,123.88,122.18,117.53,111.52,109.04,60.95,31.50.

[合成5-苯基-吲哚3-乙酸甲酯(式(I-1-5)所示的化合物(也称为5-Ph-IAA))]

[化学式19]

将5-苯基-吲哚3-乙酸甲酯(124mg、0.47mmol)取至10mL圆底烧瓶，加入1mL甲醇和1mL四氢呋喃。向其中滴加氢氧化锂水溶液(将23mg、0.96mmol溶解于1mL水)。将该反应液在室温下搅拌2小时进行水解。向反应液中加入5mL 1M稀盐酸和5mL乙酸乙酯，将产物萃取至乙酸乙酯层。进一步用5mL乙酸乙酯萃取3次。将该有机层用10mL饱和盐水洗涤后，加入无水硫酸钠脱水，进行减压浓缩。将浓缩物用硅胶柱层析(氯仿:丙酮＝95:5)纯化，以淡褐色粉末的形式得到5-苯基吲哚3-乙酸(98mg、0.39mmol、收率83.4％)。

以下示出所得化合物基于¹H-NMR及¹³C-NMR的分析结果。

¹H-NMR(400MHz,丙酮-d₆)δ10.61(s,1H),10.17(s,1H),7.89(s,1H),7.68-7.65(m,2H),7.48-7.46(m,1H),7.44-7.40(m,3H),7.34(d,J＝2.3Hz,1H),7.26(tt,J＝7.3,1.4Hz,1H),3.82(s,2H),¹³C-NMR(100MHz,丙酮-d₆)δ173.20,143.65,137.15,133.06,129.51,129.15,127.86,126.96,125.39,121.85,118.07,112.54,109.65,31.39

[合成5-苯基-吲哚3-乙酸甲酯]

[化学式20]

将5-溴吲哚3-乙酸(508mg、2.00mmol)的乙醇溶液(25mL)装入100mL圆底烧瓶，边搅拌边向其中滴加1mL乙酰氯。将该反应液在室温下搅拌3小时。将反应液倒入100mL水，将其用50mL的乙酸乙酯萃取2次。将有机层用100mL饱和盐水洗涤后，用无水硫酸钠脱水，进行减压浓缩，得到茶褐色油的5-溴吲哚3-乙酸乙酯(556mg、1.97mmol、收率99％)。

以下示出所得化合物基于¹H-NMR及¹³C-NMR的分析结果。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.23(s,1H),7.73(s,1H),7.24(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),7.15(d,J＝8.7Hz,1H),7.07(s,1H),4.18(q,J＝7.2Hz,2H),3.71(s,2H),1.28(t,J＝7.3Hz,3H),¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)δ172.07,134.82,129.05,125.08,124.49,121.64,112.99,112.77,108.21,61.11,31.31,14.32.

[合成5-(3-甲基苯基)-吲哚3-乙酸乙酯]

[化学式21]

将5-溴吲哚3-乙酸甲酯(112mg、0.40mmol)、3-甲基苯硼酸(107mg、0.79mmol)、双(三苯基膦)二氯化钯(II)(PdCl₂(PPhe₃)₂：15mg、0.02mmol)加入装有1mL二甲基甲酰胺、1mL乙醇、0.5mL 3M碳酸钾水溶液的50mL的圆底烧瓶。对容器内进行氮气置换，在120℃下加热回流5小时。向反应液中加入10mL乙酸乙酯和20mL水，用15mL乙酸乙酯萃取3次。将有机层用20mL饱和盐水洗涤，接着用无水硫酸钠脱水后，进行减压浓缩。将该浓缩物用硅胶柱层析(洗脱溶剂、己烷:乙酸乙酯＝3:1)纯化，以黄色油的形式得到5-(3-甲基苯基)-吲哚3-乙酸乙酯(17mg、0.058mmol、收率14.6％)。

以下示出所得化合物基于¹H-NMR及¹³C-NMR的分析结果。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.10(s,1H),7.81(s,1H),7.49-7.42(m,3H),7.39(d,J＝8.2Hz,1H),7.32(t,J＝7.8,1H),7.19(d,J＝1.1Hz,1H),7.16-7.11(m,1H),4.18(q,J＝7.6,2H),3.82(s,2H),2.41(s,3H),1.27(t,J＝7.1Hz,3H),¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)δC172.12,142.59,138.23,135.68,133.51,128.62,128.32,127.84,127.19,124.61,123.74,122.24,117.51,111.39,109.13,60.91,31.49,21.67,14.34.

[合成5-(3-甲基苯基)-吲哚3-乙酸]

[化学式22]

将5-(3-甲基苯基)-吲哚3-乙酸乙酯((40mg、0.14mmol)取至5mL玻璃小瓶，加入0.25mL甲醇和0.25mL四氢呋喃。向其中滴加0.25mL 10％(W/V)氢氧化钾水溶液。将该反应液在室温下搅拌2小时进行水解。向反应液中加入1mL 1M稀盐酸和2mL乙酸乙酯进行萃取。进一步用2mL乙酸乙酯萃取3次。将该有机层用1mL饱和盐水洗涤后，加入无水硫酸钠脱水，进行减压浓缩。将浓缩物用硅胶柱层析(氯仿:丙酮＝95:5)纯化，以淡褐色粉末的形式得到5-(3-甲基苯基)-吲哚3-乙酸(29mg、0.11mmol、收率80.2％)。以下示出所得化合物基于¹H-NMR及¹³C-NMR的分析结果。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.05(s,1H),7.77(d,J＝1.4Hz,1H),7.48-7.40(m,3H),7.36(d,J＝8.7Hz,1H),7.30(t,J＝7.3Hz,1H),7.16-7.09(m,2H),3.82(s,2H),2.41(s,3H),¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)δC177.84,142.51,138.29,135.63,133.70,128.67,128.36,127.69,127.27,124.68,124.04,122.41,117.34,111.53,108.22,31.07,21.68.

[合成5-(3,4-二甲基苯基)-吲哚3-乙酸乙酯]

[化学式23]

将5-溴吲哚3-乙酸甲酯(113mg、0.40mmol)、3,4-二甲基苯硼酸(120mg、0.80mmol)、双(三苯基膦)二氯化钯(II)(PdCl₂(PPhe₃)₂：15mg、0.02mmol)加入装有1mL二甲基甲酰胺、1mL乙醇、0.5mL 3M碳酸钾水溶液的50mL的圆底烧瓶。对容器内进行氮气置换，在120℃下加热回流5小时。向反应液中加入10mL乙酸乙酯和20mL水，用15mL乙酸乙酯萃取3次。将有机层用20mL饱和盐水洗涤，接着用无水硫酸钠脱水后，进行减压浓缩。将该浓缩物用硅胶柱层析(洗脱溶剂、己烷:乙酸乙酯＝3:1)纯化，以黄色油的形式得到5-(3,4-二甲基苯基)-吲哚3-乙酸乙酯(36mg、0.12mmol、收率29.2％)。

以下示出所得化合物基于¹H-NMR及¹³C-NMR的分析结果。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.10(s,1H),7.79(d,J＝0.9Hz,1H),7.44(m,2H),7.38(m,2H),7.22-7.14(m,2H),4.17(q,J＝7.0Hz,2H),3.80(s,2H),2.35(s,3H),2.31(s,3H),1.25(t,J＝7.0Hz,3H),¹³C-NMR(100MHz CDCl₃)δC 172.17,140.24,136.80,135.55,134.75,133.44,130.30,128.80,127.83,124.85,123.70,122.15,117.23,111.37,109.04,60.89,31.49,20.04,19.46,14.35

[合成5-(3,4-二甲基苯基)-吲哚3-乙酸]

[化学式24]

将5-(3,4-二甲基苯基)-吲哚3-乙酸乙酯(30mg、0.098mmol)取至5mL玻璃小瓶，加入0.25mL甲醇和0.25mL四氢呋喃。向其中滴加0.25mL 10％(W/V)氢氧化钾水溶液。将该反应液在室温下搅拌2小时进行水解。向反应液中加入1mL 1M稀盐酸和2mL乙酸乙酯进行萃取。进一步用2mL乙酸乙酯萃取3次。将该有机层用1mL饱和盐水洗涤后，加入无水硫酸钠脱水，进行减压浓缩。将浓缩物用硅胶柱层析(氯仿:丙酮＝95:5)纯化，以淡褐色粉末的形式得到5-(3,4-二甲基苯基)-吲哚3-乙酸(20mg、0.0716mmol、收率73.4％)。

以下示出所得化合物基于¹H-NMR及¹³C-NMR的分析结果。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.06(s,1H),7.76(s,1H),7.46-7.40(m,2H),7.37(d,J＝8.2Hz,2H),7.22-7.14(m,2H),3.84(s,2H),2.33(s,3H),2.30(s,3H),¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)δC177.32,140.13,136.83,135.50,134.83,133.67,130.05,128.83,127.69,124.89,123.91,122.34,117.10,111.45,108.23,30.99,20.03,19.46.

[合成5-(3-氯苯基)-吲哚3-乙酸乙酯]

[化学式25]

将5-溴吲哚3-乙酸甲酯(113mg、0.40mmol)、3-氯苯硼酸(128mg、0.82mmol)、双(三苯基膦)二氯化钯(II)(PdCl₂(PPhe₃)₂：15mg、0.02mmol)加入装有1mL二甲基甲酰胺、1mL乙醇、0.5mL 3M碳酸钾水溶液的50mL的圆底烧瓶。对容器内进行氮气置换，在120℃下加热回流5小时。向反应液中加入10mL乙酸乙酯和20mL水，用15mL乙酸乙酯萃取3次。将有机层用20mL饱和盐水洗涤，接着用无水硫酸钠脱水后，进行减压浓缩。将该浓缩物用硅胶柱层析(洗脱溶剂、己烷:乙酸乙酯＝3:1)纯化，以黄色油的形式得到5-(3-氯苯基)-吲哚3-乙酸乙酯(25mg、0.79mmol、收率19.5％)。

以下示出所得化合物基于¹H-NMR及¹³C-NMR的分析结果。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.14(s,1H),7.80(s,1H),7.63(t,J＝1.8Hz,1H),7.53(dt,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.42(d,J＝1.4Hz,2H),7.36(t,J＝8.0Hz,1H),7.30-7.24(m,1H),7.23(d,J＝2.3Hz,1H),4.18(q,J＝7.2Hz,2H),3.81(s,2H),1.27(t,7.2Hz,3H),¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)δC171.99,144.48,135.96,134.54,131.96,129.90,127.98,127.52,126.38,125.59,123.99,121.98,117.68,111.61,109.29,60.95,31.45,14.34.

[合成5-(3-氯苯基)-吲哚3-乙酸(式(I-1-8)所示的化合物(也称为5-(3-ClPh)-IAA))]

[化学式26]

将5-(3-氯苯基)-吲哚3-乙酸乙酯(38mg、0.12mmol)取至5mL玻璃小瓶，加入0.25mL甲醇和0.25mL四氢呋喃。向其中滴加0.25mL 10％(W/V)氢氧化钾水溶液。将该反应液在室温下搅拌2小时进行水解。向反应液中加入1mL 1M稀盐酸和2mL乙酸乙酯进行萃取。进一步用2mL乙酸乙酯萃取3次。将该有机层用1mL饱和盐水洗涤后，加入无水硫酸钠脱水，进行减压浓缩。将浓缩物用硅胶柱层析(氯仿:丙酮＝95:5)纯化，以淡褐色粉末的形式得到5-(3-氯苯基)-吲哚3-乙酸(31mg、0.11mmol、收率89.6％)。

以下示出所得化合物基于¹H-NMR及¹³C-NMR的分析结果。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.13(s,1H),7.76(s,1H),7.61(t,J＝1.8Hz,1H),7.49(dt,J＝7.8,1.4Hz,1H),7.40(s,2H),7.34(t,J＝7.8Hz,1H),7.26-7.28(m,1H),7.20(d,J＝2.3Hz,1H),3.82(s,2H),¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)δC177.42,144.36,135.92,134.54,132.15,129.94,127.74,127.54,126.45,125.66,124.26,122.15,117.51,111.73,108.39,30.98.

2.准备细胞

准备导入有包含OsTIR1(WT)基因或OsTIR1(F74G)基因的质粒、在染色体上插入mAID-EGFP(绿色荧光蛋白)-NLS(核定位信号)基因的HCT116细胞(人结肠腺癌来源细胞)(以下称为“OsTIR1(WT)/mAID-EGFP-NLS表达细胞”或“OsTIR1(F74G)/mAID-EGFP-NLS表达细胞”)(参照图1)。

3.添加生长素类似物

向OsTIR1(F74G)/mAID-EGFP-NLS表达细胞添加生长素类似物(培养基中的浓度：0、50nM、100nM、500nM、1μM)，培养24小时。此外，作为对照，还准备向OsTIR1(WT)/mAID-EGFP-NLS表达细胞添加了生长素的细胞。

4.FACS分析

自添加各生长素类似物起24小时后回收细胞，进行FACS分析。将结果示于图2。在图2中，“对照(Control)”表示仅添加了作为生长素类似物溶剂的DMSO的细胞。

根据图2，添加了生长素类似物的OsTIR1(F74G)/mAID-EGFP-NLS表达细胞与添加了生长素的OsTIR1(WT)/mAID-EGFP-NLS表达细胞相比，在低浓度下观察到了GFP的降解。

[实施例3]

1.准备细胞

在HCT116细胞中，使用CRISPR/Cas系统在属于安全港位点的AAVS1基因座导入OsTIR1(WT)基因或OsTIR1(F74G)基因，构建OsTIR1(WT)表达HCT116细胞或OsTIR1(F74G)表达HCT116细胞。

2.群落形成试验

使用CRISPR/Cas9系统将具有mAID、Clover以及新霉素抗性基因、以及以夹着mAID和新霉素抗性基因的方式相对于DHC1基因具有相同序列的质粒载体导入OsTIR1(WT)表达HCT116细胞、或OsTIR1(F74G)表达HCT116细胞，与内源性的DHC1基因进行同源重组。接着，在基于G418的选择之后，使用结晶紫对所形成的群落进行染色。此外，“DHC1”是动力蛋白重链1(dynein heavy chain1)的缩写，表示动力蛋白重链1。将结果示于图3。

根据图3，在没有CRISPR的情况下，由于抗性基因不工作，未确认到群落的形成。关于OsTIR1(WT)表达HCT116细胞，即使在进行了同源重组的细胞中，可能是由于进行了不依赖于生长素的降解诱导，未确认到群落的形成。另一方面，关于OsTIR1(F74G)表达HCT116细胞，在进行了同源重组的细胞中，确认到群落的形成。

3.降解诱导试验

使用在上述2中进行了同源重组的OsTIR1(F74G)表达HCT116细胞(以下称为“OsTIR1(F74G)/DHC1-mAID-Clover表达细胞”)，进行DHC1的降解诱导试验。

向OsTIR1(F74G)/DHC1-mAID-Clover表达细胞添加式(I-2)所示的化合物(也称为5-Ph-IAA)，观察24小时后的细胞的状态(图4的(A))。

如图4的(A)所示，通过添加5-Ph-IAA而使DHC1-mAID-Clover融合蛋白降解，由此观察到了分裂期的细胞的蓄積。

进而，通过蛋白印迹确认到DHC1的降解(图4的(B))。如图4的(B)所示，在进行同源重组所制作的全部克隆#1～3中，确认到依赖于5-Ph-IAA的DHC1及mAID的降解。

[实施例4]

为了构建内源性的靶蛋白降解系统，存在以下3个难点。(1)许多培养细胞发生了多倍体化，因此靶基因的等位基因有2个以上的拷贝。因此，难以用多种多样的培养细胞株构建该降解系统。(2)需要制作预先导入有OsTIR1(F74G)的母株。(3)构建多个降解系统并文库化要花很多工夫。

为了解决该问题，构建图5所示的新的靶蛋白降解系统。该降解系统包含：(1)OsTIR1(F74G)基因和mAID-靶基因由P2A接头基因连接的转座子载体，以及(2)包含gRNA和Cas9基因的、用于对内源性的靶基因进行基因敲除的CRISPR-KO载体。

该降解系统通过转座子载体在基因组中整合OsTIR1(F74G)基因和mAID-靶基因，另一方面，通过CRISPR-KO载体对内源性的靶基因进行基因敲除。

制作OsTIR1(F74G)基因和mAID-EGFP-CENPH或mAID-EGFP-POLD1靶基因由P2A接头基因连接的转座子载体，将该载体与以内源性CENPH或POLD1基因作为靶的CRISPR-KO载体一并导入HeLa细胞。向该细胞添加5-Ph-IAA，通过蛋白印迹确认到靶蛋白的降解(图6)。

图6的(A)示出使用抗CENPH抗体的蛋白印迹的结果。确认到内源性的CENPH基因被基因敲除，并且确认到依赖于5-Ph-IAA的mAID-EGFP-CENPH的降解。

图6的(B)示出使用抗POLD1抗体的蛋白印迹的结果。在克隆#1～3中，确认到内源性的POLD1基因被基因敲除，并且确认到依赖于5-Ph-IAA的mAID-EGFP-POLD1的降解。

[实施例5]

如实施例2所示，确认到本发明的生长素降解决定子系统(以下也称为AID2系统)在5-Ph-IAA的极低浓度下发挥功能。为了控制小鼠体内的蛋白表达，将该AID2系统应用于小鼠。

以1周的时间每日腹腔给药0、1、3、10mg/kg的5-Ph-IAA，对毒性进行评价。将给药时间表示于图7的(A)。如图7的(B)所示，未观察到经给药的小鼠的体重变化。

已知BRD4和TOP2A的抑制剂为潜在的抗癌药物。如图8的(A)～(B)所示，使用HCT116 CMV-OsTIR1(F74G)，确认到mAID-BRD4或TOP2A-mAID-Clover(TOP2A-mAC)的快速的降解。

接着，将mAID-BRD4细胞或TOP2A-mAC细胞移植至裸鼠的皮下，以1周的时间形成异种移植肿瘤。然后，进一步以1周的时间每日腹腔给药0、1、3、10mg/kg的5-Ph-IAA(第7～14天)。如图8的(C)～(E)所示，在异种移植了表达OsTIR1(F74G)的HCT116细胞的对照实验中，完全未观察到肿瘤抑制。另一方面，如图9的(A)～(C)所示，在5-Ph-IAA的全部给药用量下观察到mAID-BRD4异种移植片的显著的肿瘤抑制。如图10的(A)～(B)所示，在使用TOP2A-mAC异种移植片的情况下也看到相同的倾向。确认到通过使用AID2系统，mAID-BRD4及TOP2A-mAC在小鼠体内被顺利去除，引发了肿瘤抑制。

进而，对异种移植了mAID-BRD4细胞的裸鼠口服给药3mg/kg的5-Ph-IAA。图13的(A)为示出5-Ph-IAA的口服给药时间表的图。如图13的(B)所示，通过口服给药也观察到mAID-BRD4异种移植片的显著的肿瘤抑制。

[实施例6]

为了进一步确认AID2系统是否在小鼠体内发挥功能，尝试构建一起表达mAID-EGFP报告蛋白与OsTIR1(WT)或OsTIR1(F74G)的转基因小鼠。如图11的(A)所示，确认到OsTIR1(WT)会引发胚胎致死。对照性地，确认到表达OsTIR1(F74G)和报告蛋白的多个小鼠系统的构建(参照图11的(A))。

使用来源于相同TG系统的2只雌性成年转基因小鼠，在多个内脏器官去除报告蛋白。

最初，如图11的(B)所示，自未经处理的转基因小鼠确认到通过外科手术取出的卵巢及输卵管中的报告蛋白的表达。

接着，对1只小鼠假给药，对另1只腹腔给药10mg/kg的5-Ph-IAA。给药6小时后，研究内脏器官的报告蛋白表达，结果确认到，与对照相比，报告蛋白表达在卵巢、输卵管、小肠、心脏、膀胱及脑显著地减少(参照图11的(C))。用来源于相同TG系统的雄性的成年小鼠也得到了同样的数据。这些结果明确显示出，AID2系统能够在体内控制不同的内脏器官的蛋白表达。

最后，为了确认在体内的基于AID2系统的靶蛋白的去除速度，研究胚胎的报告蛋白表达。对具有E13.5胚胎的妊娠雌鼠腹腔给药5mg/kg的5-Ph-IAA。如图11的(D)所示，报告蛋白信号在给药后1小时以内消失，确认到在体内报告蛋白的快速的去除。

[实施例7]

为了确认使用OsTIR1(F74G)和5-Ph-IAA这一对的AID2系统的可逆性，向OsTIR1(F74A)/mAID-EGFP-NLS表达细胞添加5-Ph-IAA，诱发报告蛋白的降解后，交换成不含5-Ph-IAA的培养基，研究报告蛋白的表达。将结果示于图12。如图12所示，报告蛋白表达在3小时后完全恢复，显示出AID2系统的可逆性。

产业上的可利用性

根据本发明的生长素降解决定子系统，可以抑制不依赖于生长素的靶蛋白的降解，因此可以严格且自由地进行靶蛋白的降解控制。

序列表

<110> 大学共同利用机关法人信息系统研究机构

<120> 非人类动物及其用途

<130> PC29848

<150> JP2019-131464

<151> 2019-07-16

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1728

<212> DNA

<213> 稻（Oryza sativa）

<400> 1

atgacgtact tcccggagga ggtggtggag cacatcttca gcttcctgcc ggcgcagcgc 60

gaccgcaaca cggtctcgct cgtctgcaag gtgtggtacg agatcgagag gctgagccgc 120

cgcggcgtct tcgtgggcaa ctgctacgcc gtgcgcgccg gccgcgtcgc cgcgcggttc 180

cccaacgtgc gggcgctcac ggtgaagggg aagccccact tcgccgactt caacctcgtg 240

ccccccgact ggggcggcta cgcggggccg tggatcgagg cggccgcgag gggatgccac 300

ggcctggagg agctcaggat gaagcggatg gtggtgtccg acgagagcct cgagctgctg 360

gctcgctcgt tcccgcggtt cagggctctt gttcttatca gctgcgaggg gttcagcact 420

gacgggctag ccgccgtcgc gagccattgc aagcttctga gggagttgga tttgcaggaa 480

aatgaagtgg aggatcgagg gcctaggtgg ctttcctgct tccctgattc ctgcacatca 540

cttgtctcat tgaattttgc ctgcatcaaa ggggaggtta atgctggttc actggagaga 600

cttgttagca ggtccccaaa cctgcggagt ttgaggctga atcgatctgt atcggtagat 660

acacttgcaa agatactact gcgtacccct aacttggagg atttggggac agggaatttg 720

acagatgact tccaaactga gtcctacttt aagcttacca gtgctctgga gaaatgcaag 780

atgttgagga gtttgtctgg attctgggat gcttctcctg tttgcctgtc atttatctac 840

cccctgtgtg ctcaactgac aggattgaac ttgagctatg cccccacact tgatgcttct 900

gaccttacaa aaatgattag ccgctgtgtg aagctccaac gcctttgggt actggattgt 960

atctcggaca aaggcttgca agtggtggcc tccagttgca aagacttgca agaactcagg 1020

gtatttccat cagatttcta cgtagctggt tattctgcag tgacagagga gggacttgtt 1080

gcagtatcct tgggctgtcc aaaactgaac tcactactgt acttctgtca ccaaatgact 1140

aatgctgcac tagttactgt cgccaagaac tgtccaaatt tcacacgatt cagactttgt 1200

attcttgagc cagggaagcc tgatgttgtg acaagccaac cattagatga aggctttgga 1260

gctattgttc gtgagtgcaa gggattacaa cgtttgtcaa tatctggtct tctcacagac 1320

aaagttttca tgtatattgg gaaatatgca aaacaacttg agatgctttc tatagcattt 1380

gctggtgaca gtgataaggg tatgatgcat gttatgaatg gatgcaagaa tttaaggaaa 1440

ctggagataa gagatagccc gtttggtgat gctgcactct tggggaattt tgctaggtac 1500

gagacaatgc gatccctttg gatgtcatct tgcaatgtca cgttaaaggg gtgccaagtc 1560

cttgcgtcaa agatgccgat gctcaatgtt gaggtcataa atgagcggga tggtagcaat 1620

gaaatggagg aaaaccatgg agatctgcct aaagtggaga aattatatgt gtaccgcaca 1680

actgctgggg cgagggatga tgcaccaaat tttgttaaaa tcctatag 1728

<210> 2

<211> 1728

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 针对人密码子优化的OsTIR1 DNA

<400> 2

atgacatact ttcctgaaga ggtcgtcgaa cacattttta gcttcctgcc tgcacagaga 60

gatagaaaca cagtgagcct ggtctgcaaa gtgtggtacg agatcgaacg cctgagccgg 120

agaggagtgt tcgtcggcaa ctgctatgct gtgagagcag gcagggtcgc cgctaggttt 180

ccaaatgtgc gcgcactgac cgtcaagggg aaaccccact tcgccgactt taacctggtg 240

ccccctgatt ggggaggata cgccggccct tggatcgagg cagccgctcg cggctgtcat 300

ggactggagg aactgcgcat gaagcgaatg gtggtctctg acgaaagtct ggagctgctg 360

gctcggagct tccctaggtt tcgcgcactg gtgctgattt cttgcgaagg cttcagcacc 420

gatggactgg cagccgtggc ctcccactgt aagctgctgc gggagctgga cctccaggag 480

aatgaagtgg aggatagagg ccccagatgg ctgtcttgct tcccagactc atgtaccagc 540

ctggtgtccc tgaactttgc ctgcatcaaa ggcgaagtga atgctgggtc cctggagcgg 600

ctggtctcaa gaagccccaa cctgaggtct ctgcggctga accggagcgt gagcgtggac 660

actctggcta agattctgct gagaacccct aacctggagg atctgggaac cggcaatctg 720

acagacgatt tccagacaga atcctacttt aaactgactt ctgccctgga gaagtgtaaa 780

atgctgagga gtctgtcagg attctgggat gcttcacccg tgtgcctgag ctttatctac 840

cctctgtgtg cacagctgac aggcctgaac ctgagctatg caccaaccct ggacgccagt 900

gatctgacaa agatgatctc acgctgcgtg aaactccagc gactgtgggt gctggactgt 960

atttccgata aggggctcca ggtggtcgcc agctcctgca aggacctcca ggagctgaga 1020

gtgttcccat ctgattttta cgtggccgga tatagtgctg tcactgagga aggcctggtg 1080

gcagtctcac tgggatgccc aaagctgaac agcctgctgt atttctgtca tcagatgact 1140

aatgctgcac tggtgaccgt cgccaagaac tgccctaatt tcacccgatt tcggctgtgt 1200

attctggaac caggcaaacc cgacgtggtc acatcccagc cactggatga agggtttgga 1260

gctatcgtga gagagtgcaa gggactccag aggctgagca tttccggcct gctgacagac 1320

aaagtgttca tgtacatcgg caagtatgct aagcagctgg agatgctgag cattgcattt 1380

gccggagact ccgataaggg catgatgcac gtgatgaacg ggtgtaagaa tctgcgaaaa 1440

ctggaaatcc gggacagccc tttcggggat gccgctctgc tgggaaactt tgccagatac 1500

gagacaatga ggagcctgtg gatgtctagt tgcaatgtga ctctgaaggg ctgtcaggtc 1560

ctggctagta aaatgcctat gctgaacgtg gaagtcatta atgagcggga cgggtctaac 1620

gaaatggagg aaaatcatgg cgacctgcca aaggtggaga aactgtatgt gtatcggacc 1680

accgcagggg caagagatga tgctcccaac tttgtgaaga ttctgtga 1728

<210> 3

<211> 575

<212> PRT

<213> 稻（Oryza sativa）

<400> 3

Met Thr Tyr Phe Pro Glu Glu Val Val Glu His Ile Phe Ser Phe Leu

1 5 10 15

Pro Ala Gln Arg Asp Arg Asn Thr Val Ser Leu Val Cys Lys Val Trp

20 25 30

Tyr Glu Ile Glu Arg Leu Ser Arg Arg Gly Val Phe Val Gly Asn Cys

35 40 45

Tyr Ala Val Arg Ala Gly Arg Val Ala Ala Arg Phe Pro Asn Val Arg

50 55 60

Ala Leu Thr Val Lys Gly Lys Pro His Phe Ala Asp Phe Asn Leu Val

65 70 75 80

Pro Pro Asp Trp Gly Gly Tyr Ala Gly Pro Trp Ile Glu Ala Ala Ala

85 90 95

Arg Gly Cys His Gly Leu Glu Glu Leu Arg Met Lys Arg Met Val Val

100 105 110

Ser Asp Glu Ser Leu Glu Leu Leu Ala Arg Ser Phe Pro Arg Phe Arg

115 120 125

Ala Leu Val Leu Ile Ser Cys Glu Gly Phe Ser Thr Asp Gly Leu Ala

130 135 140

Ala Val Ala Ser His Cys Lys Leu Leu Arg Glu Leu Asp Leu Gln Glu

145 150 155 160

Asn Glu Val Glu Asp Arg Gly Pro Arg Trp Leu Ser Cys Phe Pro Asp

165 170 175

Ser Cys Thr Ser Leu Val Ser Leu Asn Phe Ala Cys Ile Lys Gly Glu

180 185 190

Val Asn Ala Gly Ser Leu Glu Arg Leu Val Ser Arg Ser Pro Asn Leu

195 200 205

Arg Ser Leu Arg Leu Asn Arg Ser Val Ser Val Asp Thr Leu Ala Lys

210 215 220

Ile Leu Leu Arg Thr Pro Asn Leu Glu Asp Leu Gly Thr Gly Asn Leu

225 230 235 240

Thr Asp Asp Phe Gln Thr Glu Ser Tyr Phe Lys Leu Thr Ser Ala Leu

245 250 255

Glu Lys Cys Lys Met Leu Arg Ser Leu Ser Gly Phe Trp Asp Ala Ser

260 265 270

Pro Val Cys Leu Ser Phe Ile Tyr Pro Leu Cys Ala Gln Leu Thr Gly

275 280 285

Leu Asn Leu Ser Tyr Ala Pro Thr Leu Asp Ala Ser Asp Leu Thr Lys

290 295 300

Met Ile Ser Arg Cys Val Lys Leu Gln Arg Leu Trp Val Leu Asp Cys

305 310 315 320

Ile Ser Asp Lys Gly Leu Gln Val Val Ala Ser Ser Cys Lys Asp Leu

325 330 335

Gln Glu Leu Arg Val Phe Pro Ser Asp Phe Tyr Val Ala Gly Tyr Ser

340 345 350

Ala Val Thr Glu Glu Gly Leu Val Ala Val Ser Leu Gly Cys Pro Lys

355 360 365

Leu Asn Ser Leu Leu Tyr Phe Cys His Gln Met Thr Asn Ala Ala Leu

370 375 380

Val Thr Val Ala Lys Asn Cys Pro Asn Phe Thr Arg Phe Arg Leu Cys

385 390 395 400

Ile Leu Glu Pro Gly Lys Pro Asp Val Val Thr Ser Gln Pro Leu Asp

405 410 415

Glu Gly Phe Gly Ala Ile Val Arg Glu Cys Lys Gly Leu Gln Arg Leu

420 425 430

Ser Ile Ser Gly Leu Leu Thr Asp Lys Val Phe Met Tyr Ile Gly Lys

435 440 445

Tyr Ala Lys Gln Leu Glu Met Leu Ser Ile Ala Phe Ala Gly Asp Ser

450 455 460

Asp Lys Gly Met Met His Val Met Asn Gly Cys Lys Asn Leu Arg Lys

465 470 475 480

Leu Glu Ile Arg Asp Ser Pro Phe Gly Asp Ala Ala Leu Leu Gly Asn

485 490 495

Phe Ala Arg Tyr Glu Thr Met Arg Ser Leu Trp Met Ser Ser Cys Asn

500 505 510

Val Thr Leu Lys Gly Cys Gln Val Leu Ala Ser Lys Met Pro Met Leu

515 520 525

Asn Val Glu Val Ile Asn Glu Arg Asp Gly Ser Asn Glu Met Glu Glu

530 535 540

Asn His Gly Asp Leu Pro Lys Val Glu Lys Leu Tyr Val Tyr Arg Thr

545 550 555 560

Thr Ala Gly Ala Arg Asp Asp Ala Pro Asn Phe Val Lys Ile Leu

565 570 575

<210> 4

<211> 575

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OsTIR1 F74A蛋白

<400> 4

Met Thr Tyr Phe Pro Glu Glu Val Val Glu His Ile Phe Ser Phe Leu

1 5 10 15

Pro Ala Gln Arg Asp Arg Asn Thr Val Ser Leu Val Cys Lys Val Trp

20 25 30

Tyr Glu Ile Glu Arg Leu Ser Arg Arg Gly Val Phe Val Gly Asn Cys

35 40 45

Tyr Ala Val Arg Ala Gly Arg Val Ala Ala Arg Phe Pro Asn Val Arg

50 55 60

Ala Leu Thr Val Lys Gly Lys Pro His Ala Ala Asp Phe Asn Leu Val

65 70 75 80

Pro Pro Asp Trp Gly Gly Tyr Ala Gly Pro Trp Ile Glu Ala Ala Ala

85 90 95

Arg Gly Cys His Gly Leu Glu Glu Leu Arg Met Lys Arg Met Val Val

100 105 110

Ser Asp Glu Ser Leu Glu Leu Leu Ala Arg Ser Phe Pro Arg Phe Arg

115 120 125

Ala Leu Val Leu Ile Ser Cys Glu Gly Phe Ser Thr Asp Gly Leu Ala

130 135 140

Ala Val Ala Ser His Cys Lys Leu Leu Arg Glu Leu Asp Leu Gln Glu

145 150 155 160

Asn Glu Val Glu Asp Arg Gly Pro Arg Trp Leu Ser Cys Phe Pro Asp

165 170 175

Ser Cys Thr Ser Leu Val Ser Leu Asn Phe Ala Cys Ile Lys Gly Glu

180 185 190

Val Asn Ala Gly Ser Leu Glu Arg Leu Val Ser Arg Ser Pro Asn Leu

195 200 205

Arg Ser Leu Arg Leu Asn Arg Ser Val Ser Val Asp Thr Leu Ala Lys

210 215 220

Ile Leu Leu Arg Thr Pro Asn Leu Glu Asp Leu Gly Thr Gly Asn Leu

225 230 235 240

Thr Asp Asp Phe Gln Thr Glu Ser Tyr Phe Lys Leu Thr Ser Ala Leu

245 250 255

Glu Lys Cys Lys Met Leu Arg Ser Leu Ser Gly Phe Trp Asp Ala Ser

260 265 270

Pro Val Cys Leu Ser Phe Ile Tyr Pro Leu Cys Ala Gln Leu Thr Gly

275 280 285

Leu Asn Leu Ser Tyr Ala Pro Thr Leu Asp Ala Ser Asp Leu Thr Lys

290 295 300

Met Ile Ser Arg Cys Val Lys Leu Gln Arg Leu Trp Val Leu Asp Cys

305 310 315 320

Ile Ser Asp Lys Gly Leu Gln Val Val Ala Ser Ser Cys Lys Asp Leu

325 330 335

Gln Glu Leu Arg Val Phe Pro Ser Asp Phe Tyr Val Ala Gly Tyr Ser

340 345 350

Ala Val Thr Glu Glu Gly Leu Val Ala Val Ser Leu Gly Cys Pro Lys

355 360 365

Leu Asn Ser Leu Leu Tyr Phe Cys His Gln Met Thr Asn Ala Ala Leu

370 375 380

Val Thr Val Ala Lys Asn Cys Pro Asn Phe Thr Arg Phe Arg Leu Cys

385 390 395 400

Ile Leu Glu Pro Gly Lys Pro Asp Val Val Thr Ser Gln Pro Leu Asp

405 410 415

Glu Gly Phe Gly Ala Ile Val Arg Glu Cys Lys Gly Leu Gln Arg Leu

420 425 430

Ser Ile Ser Gly Leu Leu Thr Asp Lys Val Phe Met Tyr Ile Gly Lys

435 440 445

Tyr Ala Lys Gln Leu Glu Met Leu Ser Ile Ala Phe Ala Gly Asp Ser

450 455 460

Asp Lys Gly Met Met His Val Met Asn Gly Cys Lys Asn Leu Arg Lys

465 470 475 480

Leu Glu Ile Arg Asp Ser Pro Phe Gly Asp Ala Ala Leu Leu Gly Asn

485 490 495

Phe Ala Arg Tyr Glu Thr Met Arg Ser Leu Trp Met Ser Ser Cys Asn

500 505 510

Val Thr Leu Lys Gly Cys Gln Val Leu Ala Ser Lys Met Pro Met Leu

515 520 525

Asn Val Glu Val Ile Asn Glu Arg Asp Gly Ser Asn Glu Met Glu Glu

530 535 540

Asn His Gly Asp Leu Pro Lys Val Glu Lys Leu Tyr Val Tyr Arg Thr

545 550 555 560

Thr Ala Gly Ala Arg Asp Asp Ala Pro Asn Phe Val Lys Ile Leu

565 570 575

<210> 5

<211> 1728

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OsTIR1 F74A DNA

<400> 5

atgacatact ttcctgaaga ggtcgtcgaa cacattttta gcttcctgcc tgcacagaga 60

gatagaaaca cagtgagcct ggtctgcaaa gtgtggtacg agatcgaacg cctgagccgg 120

agaggagtgt tcgtcggcaa ctgctatgct gtgagagcag gcagggtcgc cgctaggttt 180

ccaaatgtgc gcgcactgac cgtcaagggg aaaccccacg ccgccgactt taacctggtg 240

ccccctgatt ggggaggata cgccggccct tggatcgagg cagccgctcg cggctgtcat 300

ggactggagg aactgcgcat gaagcgaatg gtggtctctg acgaaagtct ggagctgctg 360

gctcggagct tccctaggtt tcgcgcactg gtgctgattt cttgcgaagg cttcagcacc 420

gatggactgg cagccgtggc ctcccactgt aagctgctgc gggagctgga cctccaggag 480

aatgaagtgg aggatagagg ccccagatgg ctgtcttgct tcccagactc atgtaccagc 540

ctggtgtccc tgaactttgc ctgcatcaaa ggcgaagtga atgctgggtc cctggagcgg 600

ctggtctcaa gaagccccaa cctgaggtct ctgcggctga accggagcgt gagcgtggac 660

actctggcta agattctgct gagaacccct aacctggagg atctgggaac cggcaatctg 720

acagacgatt tccagacaga atcctacttt aaactgactt ctgccctgga gaagtgtaaa 780

atgctgagga gtctgtcagg attctgggat gcttcacccg tgtgcctgag ctttatctac 840

cctctgtgtg cacagctgac aggcctgaac ctgagctatg caccaaccct ggacgccagt 900

gatctgacaa agatgatctc acgctgcgtg aaactccagc gactgtgggt gctggactgt 960

atttccgata aggggctcca ggtggtcgcc agctcctgca aggacctcca ggagctgaga 1020

gtgttcccat ctgattttta cgtggccgga tatagtgctg tcactgagga aggcctggtg 1080

gcagtctcac tgggatgccc aaagctgaac agcctgctgt atttctgtca tcagatgact 1140

aatgctgcac tggtgaccgt cgccaagaac tgccctaatt tcacccgatt tcggctgtgt 1200

attctggaac caggcaaacc cgacgtggtc acatcccagc cactggatga agggtttgga 1260

gctatcgtga gagagtgcaa gggactccag aggctgagca tttccggcct gctgacagac 1320

aaagtgttca tgtacatcgg caagtatgct aagcagctgg agatgctgag cattgcattt 1380

gccggagact ccgataaggg catgatgcac gtgatgaacg ggtgtaagaa tctgcgaaaa 1440

ctggaaatcc gggacagccc tttcggggat gccgctctgc tgggaaactt tgccagatac 1500

gagacaatga ggagcctgtg gatgtctagt tgcaatgtga ctctgaaggg ctgtcaggtc 1560

ctggctagta aaatgcctat gctgaacgtg gaagtcatta atgagcggga cgggtctaac 1620

gaaatggagg aaaatcatgg cgacctgcca aaggtggaga aactgtatgt gtatcggacc 1680

accgcagggg caagagatga tgctcccaac tttgtgaaga ttctgtga 1728

<210> 6

<211> 575

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OsTIR1 F74G蛋白

<400> 6

Met Thr Tyr Phe Pro Glu Glu Val Val Glu His Ile Phe Ser Phe Leu

1 5 10 15

Pro Ala Gln Arg Asp Arg Asn Thr Val Ser Leu Val Cys Lys Val Trp

20 25 30

Tyr Glu Ile Glu Arg Leu Ser Arg Arg Gly Val Phe Val Gly Asn Cys

35 40 45

Tyr Ala Val Arg Ala Gly Arg Val Ala Ala Arg Phe Pro Asn Val Arg

50 55 60

Ala Leu Thr Val Lys Gly Lys Pro His Gly Ala Asp Phe Asn Leu Val

65 70 75 80

Pro Pro Asp Trp Gly Gly Tyr Ala Gly Pro Trp Ile Glu Ala Ala Ala

85 90 95

Arg Gly Cys His Gly Leu Glu Glu Leu Arg Met Lys Arg Met Val Val

100 105 110

Ser Asp Glu Ser Leu Glu Leu Leu Ala Arg Ser Phe Pro Arg Phe Arg

115 120 125

Ala Leu Val Leu Ile Ser Cys Glu Gly Phe Ser Thr Asp Gly Leu Ala

130 135 140

Ala Val Ala Ser His Cys Lys Leu Leu Arg Glu Leu Asp Leu Gln Glu

145 150 155 160

Asn Glu Val Glu Asp Arg Gly Pro Arg Trp Leu Ser Cys Phe Pro Asp

165 170 175

Ser Cys Thr Ser Leu Val Ser Leu Asn Phe Ala Cys Ile Lys Gly Glu

180 185 190

Val Asn Ala Gly Ser Leu Glu Arg Leu Val Ser Arg Ser Pro Asn Leu

195 200 205

Arg Ser Leu Arg Leu Asn Arg Ser Val Ser Val Asp Thr Leu Ala Lys

210 215 220

Ile Leu Leu Arg Thr Pro Asn Leu Glu Asp Leu Gly Thr Gly Asn Leu

225 230 235 240

Thr Asp Asp Phe Gln Thr Glu Ser Tyr Phe Lys Leu Thr Ser Ala Leu

245 250 255

Glu Lys Cys Lys Met Leu Arg Ser Leu Ser Gly Phe Trp Asp Ala Ser

260 265 270

Pro Val Cys Leu Ser Phe Ile Tyr Pro Leu Cys Ala Gln Leu Thr Gly

275 280 285

Leu Asn Leu Ser Tyr Ala Pro Thr Leu Asp Ala Ser Asp Leu Thr Lys

290 295 300

Met Ile Ser Arg Cys Val Lys Leu Gln Arg Leu Trp Val Leu Asp Cys

305 310 315 320

Ile Ser Asp Lys Gly Leu Gln Val Val Ala Ser Ser Cys Lys Asp Leu

325 330 335

Gln Glu Leu Arg Val Phe Pro Ser Asp Phe Tyr Val Ala Gly Tyr Ser

340 345 350

Ala Val Thr Glu Glu Gly Leu Val Ala Val Ser Leu Gly Cys Pro Lys

355 360 365

Leu Asn Ser Leu Leu Tyr Phe Cys His Gln Met Thr Asn Ala Ala Leu

370 375 380

Val Thr Val Ala Lys Asn Cys Pro Asn Phe Thr Arg Phe Arg Leu Cys

385 390 395 400

Ile Leu Glu Pro Gly Lys Pro Asp Val Val Thr Ser Gln Pro Leu Asp

405 410 415

Glu Gly Phe Gly Ala Ile Val Arg Glu Cys Lys Gly Leu Gln Arg Leu

420 425 430

Ser Ile Ser Gly Leu Leu Thr Asp Lys Val Phe Met Tyr Ile Gly Lys

435 440 445

Tyr Ala Lys Gln Leu Glu Met Leu Ser Ile Ala Phe Ala Gly Asp Ser

450 455 460

Asp Lys Gly Met Met His Val Met Asn Gly Cys Lys Asn Leu Arg Lys

465 470 475 480

Leu Glu Ile Arg Asp Ser Pro Phe Gly Asp Ala Ala Leu Leu Gly Asn

485 490 495

Phe Ala Arg Tyr Glu Thr Met Arg Ser Leu Trp Met Ser Ser Cys Asn

500 505 510

Val Thr Leu Lys Gly Cys Gln Val Leu Ala Ser Lys Met Pro Met Leu

515 520 525

Asn Val Glu Val Ile Asn Glu Arg Asp Gly Ser Asn Glu Met Glu Glu

530 535 540

Asn His Gly Asp Leu Pro Lys Val Glu Lys Leu Tyr Val Tyr Arg Thr

545 550 555 560

Thr Ala Gly Ala Arg Asp Asp Ala Pro Asn Phe Val Lys Ile Leu

565 570 575

<210> 7

<211> 1728

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OsTIR1 F74G DNA

<400> 7

atgacatact ttcctgaaga ggtcgtcgaa cacattttta gcttcctgcc tgcacagaga 60

gatagaaaca cagtgagcct ggtctgcaaa gtgtggtacg agatcgaacg cctgagccgg 120

agaggagtgt tcgtcggcaa ctgctatgct gtgagagcag gcagggtcgc cgctaggttt 180

ccaaatgtgc gcgcactgac cgtcaagggg aaaccccacg gcgccgactt taacctggtg 240

ccccctgatt ggggaggata cgccggccct tggatcgagg cagccgctcg cggctgtcat 300

ggactggagg aactgcgcat gaagcgaatg gtggtctctg acgaaagtct ggagctgctg 360

gctcggagct tccctaggtt tcgcgcactg gtgctgattt cttgcgaagg cttcagcacc 420

gatggactgg cagccgtggc ctcccactgt aagctgctgc gggagctgga cctccaggag 480

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actctggcta agattctgct gagaacccct aacctggagg atctgggaac cggcaatctg 720

acagacgatt tccagacaga atcctacttt aaactgactt ctgccctgga gaagtgtaaa 780

atgctgagga gtctgtcagg attctgggat gcttcacccg tgtgcctgag ctttatctac 840

cctctgtgtg cacagctgac aggcctgaac ctgagctatg caccaaccct ggacgccagt 900

gatctgacaa agatgatctc acgctgcgtg aaactccagc gactgtgggt gctggactgt 960

atttccgata aggggctcca ggtggtcgcc agctcctgca aggacctcca ggagctgaga 1020

gtgttcccat ctgattttta cgtggccgga tatagtgctg tcactgagga aggcctggtg 1080

gcagtctcac tgggatgccc aaagctgaac agcctgctgt atttctgtca tcagatgact 1140

aatgctgcac tggtgaccgt cgccaagaac tgccctaatt tcacccgatt tcggctgtgt 1200

attctggaac caggcaaacc cgacgtggtc acatcccagc cactggatga agggtttgga 1260

gctatcgtga gagagtgcaa gggactccag aggctgagca tttccggcct gctgacagac 1320

aaagtgttca tgtacatcgg caagtatgct aagcagctgg agatgctgag cattgcattt 1380

gccggagact ccgataaggg catgatgcac gtgatgaacg ggtgtaagaa tctgcgaaaa 1440

ctggaaatcc gggacagccc tttcggggat gccgctctgc tgggaaactt tgccagatac 1500

gagacaatga ggagcctgtg gatgtctagt tgcaatgtga ctctgaaggg ctgtcaggtc 1560

ctggctagta aaatgcctat gctgaacgtg gaagtcatta atgagcggga cgggtctaac 1620

gaaatggagg aaaatcatgg cgacctgcca aaggtggaga aactgtatgt gtatcggacc 1680

accgcagggg caagagatga tgctcccaac tttgtgaaga ttctgtga 1728

<210> 8

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 迷你生长素可诱导的降解决定子

<400> 8

Lys Glu Lys Ser Ala Cys Pro Lys Asp Pro Ala Lys Pro Pro Ala Lys

1 5 10 15

Ala Gln Val Val Gly Trp Pro Pro Val Arg Ser Tyr Arg Lys Asn Val

20 25 30

Met Val Ser Cys Gln Lys Ser Ser Gly Gly Pro Glu Ala Ala Ala Phe

35 40 45

Val Lys Val Ser Met Asp Gly Ala Pro Tyr Leu Arg Lys Ile Asp Leu

50 55 60

Arg Met Tyr Lys

65

Claims

1.一种非人类动物，该非人类动物是通过生长素降解决定子系统来控制生物体内的靶蛋白降解的经遗传修饰的非人类动物，

该非人类动物具有包含第一核酸的染色体，所述第一核酸编码在生长素结合位点具有突变并与生长素类似物具有亲和性的突变型TIR1家族蛋白。

2.根据权利要求1所述的非人类动物，其还具有包含第二核酸和第三核酸的染色体，所述第二核酸编码包含至少一部分Aux/IAA家族蛋白并与突变型TIR1家族蛋白-生长素类似物复合物具有亲和性的降解标签，所述第三核酸编码连接在所述第二核酸的上游或下游的靶蛋白。

3.一种非人类动物，该非人类动物通过移植而具有通过生长素降解决定子系统来控制生物体内的靶蛋白降解的非植物来源的真核细胞，

所述细胞具有包含第一核酸的染色体，所述第一核酸编码在生长素结合位点具有突变并与生长素类似物具有亲和性的突变型TIR1家族蛋白。

4.根据权利要求3所述的非人类动物，其中，所述细胞还具有包含第二核酸和第三核酸的染色体，所述第二核酸编码包含至少一部分Aux/IAA家族蛋白并与突变型TIR1家族蛋白-生长素类似物复合物具有亲和性的降解标签，所述第三核酸编码连接在所述第二核酸的上游或下游的靶蛋白。

5.根据权利要求1～4中的任一项所述的非人类动物，其中，所述突变型TIR1家族蛋白为稻源蛋白。

6.根据权利要求1～5中的任一项所述的非人类动物，其中，所述突变型TIR1家族蛋白为OsTIR1的第74位的F突变为A、G或S的蛋白。

7.根据权利要求1～6中的任一项所述的非人类动物，其为病理模型。

8.根据权利要求1～7中的任一项所述的非人类动物，其中，所述生长素类似物为下述通式(I)所示的化合物或其酯：

[化学式1]

通式(I)中，R¹⁰为任选具有取代基的、成环的一部分碳原子任选被杂原子取代的环状的脂肪族烃基，或者任选具有取代基的、成环的一部分碳原子任选被杂原子取代的芳香族烃基。

9.一种靶蛋白功能分析的体内方法，其使用权利要求1～8中的任一项所述的非人类动物。

10.一种药物靶蛋白或药剂的评价方法，其使用权利要求1～8中的任一项所述的非人类动物。

11.一种药物靶蛋白的评价方法，其包括：

步骤1，对非人类动物给药生长素类似物，

所述第一核酸编码在生长素结合位点具有突变并与生长素类似物具有亲和性的突变型TIR1家族蛋白，所述第二核酸编码包含至少一部分Aux/IAA家族蛋白并与突变型TIR1家族蛋白-生长素类似物复合物具有亲和性的降解标签，所述第三核酸编码连接在所述第二核酸的上游或下游的靶蛋白；

12.根据权利要求11所述的药物靶蛋白的评价方法，其还包括：步骤4，步骤3之后，中断生长素类似物的给药，观察靶蛋白的表达恢复所引起的对病变组织和正常组织的影响。