JP2023030479A - オーキシンデグロンシステムのキット、及びその使用 - Google Patents

オーキシンデグロンシステムのキット、及びその使用 Download PDF

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Masahito Kanemaki
謙一郎 林
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Abstract

【課題】効率良く標的タンパク質の分解制御が可能な、オーキシンデグロンシステムのキットを提供する。【解決手段】本発明のキットは、非植物由来の真核細胞中の標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムのキットであって、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するオーキシンアナログと、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする第二の核酸と、を備える。【選択図】なし

Description

本発明は、オーキシンデグロンシステムのキット、及びその使用に関する。具体的には、本発明は、オーキシンデグロンシステムのキット、標的タンパク質の分解方法、標的タンパク質分解誘導剤、及び化合物に関する。
本発明者はこれまでに、オーキシン誘導性デグロン（ＡＩＤ）システムと呼ばれるタンパク質の分解制御技術の開発を行ってきた。このシステムでは、オーキシン応答性ユビキチンリガーゼを構成するＴＩＲ１を、酵母や動物細胞等の真核生物由来の細胞に導入し、オーキシンの添加の有無やタイミングを調整することで、分解タグ（植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質又はその部分タンパク質；デグロンともいう。）を付加した標的タンパク質の分解を制御する。
従来のオーキシンデグロン法を利用すると、オーキシンの添加により、分解タグ（デグロン）を付加した標的タンパク質を迅速に分解することが可能になる。しかしながら、従来のオーキシンデグロン法では、オーキシン非添加時にも標的タンパク質の弱い分解が起きるため、厳密な発現制御に困難があった。また、分解誘導に１００μＭ以上の比較的高濃度のオーキシンが使用されており、特に多細胞動物においてオーキシン自体の毒性影響が懸念されていた。
このような懸念に対し、本発明者は、変異型ＴＩＲ１と、前記変異型ＴＩＲ１に親和性を有するオーキシンアナログを組み合わせた、改良型オーキシン誘導性デグロン（ＡＩＤ）システム（ＡＩＤ２システムともいう。）を開発した（特許文献１参照。）。
国際公開第２０２１／００９９９０号
ＡＩＤ２システムでは標的タンパク質の分解効率が飛躍的に向上したが、一方で卵殻や血液脳関門におけるバリア機能により、オーキシン又はオーキシンアナログの膜透過性が損なわれるという問題があり、この課題に対する改善が求められている。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、効率良くタンパク質の分解制御が可能な、オーキシンデグロンシステムのキット、標的タンパク質の分解方法、標的タンパク質分解誘導剤、及び化合物を提供する。
本発明は、以下の態様を含む。
本発明は以下の態様を含む。
［１］非植物由来の真核細胞中の標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムのキットであって、
オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、
前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するオーキシンアナログと、
少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする第二の核酸と、を備え、
前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、オーキシンアナログとの複合体を介して、分解タグと結合して標的タンパク質を分解に導くタンパク質であり、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７９位がグリシンであるアミノ酸配列、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸番号７９位以外の部位において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸番号７９位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
前記オーキシンアナログは、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である、キット。
Figure 2023030479000001
（一般式（Ｉ）中、Ｒ１０は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい環状の脂肪族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい芳香族炭化水素基であり、Ｒ１１は、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２、－ＯＲ１２又は－Ｎ（Ｒ１３）２であり、ｎ１は、１～６の整数であり、Ｒ１２は、炭素数１～６のアルキル基であり、複数のＲ１３は、独立して水素原子若しくは炭素数１～６のアルキル基である。）
［２］更に、前記第二の核酸の上流又は下流に連結された標的タンパク質をコードする第三の核酸を備える、［１］に記載のキット。
［３］前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、シロイヌナズナ由来タンパク質である、［１］又は［２］に記載のキット。
［４］前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、ＡｔＴＩＲ１の７９番目のＦが、Ａ、Ｇ、又はＳに変異しているタンパク質である、［１］～［３］のいずれか一つに記載のキット。
［５］更に、前記第一の核酸を染色体上に有する非植物由来の真核細胞又は非ヒト動物を備える、［１］～［４］のいずれか一つに記載のキット。
［６］前記非植物由来の真核細胞又は非ヒト動物は、更に、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする第二の核酸と、前記第二の核酸の上流又は下流に連結された標的タンパク質をコードする第三の核酸と、を含む染色体を有する、［５］に記載のキット。
［７］［１］～［６］のいずれか一つに記載のキットを用いる、標的タンパク質の分解方法。
［８］非植物由来の真核細胞中の標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムに用いられる標的タンパク質分解誘導剤であって、下記一般式（Ｉ）で表される化合物を含有する、標的タンパク質分解誘導剤。
Figure 2023030479000002
（一般式（Ｉ）中、Ｒ１０は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい環状の脂肪族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい芳香族炭化水素基であり、Ｒ１１は、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２、－ＯＲ１２又は－Ｎ（Ｒ１３）２であり、ｎ１は、１～６の整数であり、Ｒ１２は、炭素数１～６のアルキル基であり、複数のＲ１３は、独立して水素原子若しくは炭素数１～６のアルキル基である。）
［９］下記一般式（Ｉ）で表される化合物。
Figure 2023030479000003
（一般式（Ｉ）中、Ｒ１０は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい環状の脂肪族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい芳香族炭化水素基であり、Ｒ１１は、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２、－ＯＲ１２又は－Ｎ（Ｒ１３）２であり、ｎ１は、１～６の整数であり、Ｒ１２は、炭素数１～６のアルキル基であり、複数のＲ１３は、独立して水素原子若しくは炭素数１～６のアルキル基である。）
本発明のオーキシンデグロンシステムのキットによれば、効率良くタンパク質の分解制御が可能である。
ＡＩＤシステム及びＡＩＤ２システムを評価するための線虫の系統の代表的な画像である。各系統の遺伝子型を左側に示す。全てのスケールバーは、５０μｍを示す。 各系統におけるＧＦＰシグナルの平均強度の定量化の結果である。エラーバーは、標準偏差を示す。 各遺伝子型のＬ１幼虫を、リガンド（１ｍＭ ＩＡＡ又は５μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡ）又はその溶媒で処理した後、その子孫の数を計測した結果である（ｎ＝１０）。エラーバーは、標準偏差を示す。 リガンド処理前後の代表的な画像である。各幼虫を１ｍＭ ＩＡＡ（左）又は５μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡ（右）で１時間処理した。すべてのスケールバーは、５０μｍを示す。 リガンドで処理された幼虫における、ＧＦＰの平均強度の時間経過を示すグラフである。エラーバーは、標準偏差を示す。 異なる濃度のＩＡＡ又は５－Ｐｈ－ＩＡＡで１世代にわたって処理された各系統の幼虫におけるＧＦＰレベルの定量化の結果である。エラーバーは、標準偏差を示す。 ＤＭＳＯ（上のパネル）又は５μＭの５－Ｐｈ－ＩＡＡ（下のパネル）で４時間処理した後のＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）：： ｍＲｕｂｙを発現するＹｏｕｎｇ Ａｄｕｌｔ期の線虫におけるレポータータンパク質発現の代表的な画像である。スケールバーは、５０μｍを示す。 ５－Ｐｈ－ＩＡＡで４時間処理したＡｄｕｌｔ期の線虫のＧＦＰの平均強度の結果である。エラーバーは、標準偏差を示す。 上段：５－Ｐｈ－ＩＡＡの化学構造である。下段：５０μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡで処理した胚（ＡＩＤ＊：：ＧＦＰ;ＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）：：ｍＲｕｂｙ）のタイムラプス画像である。スケールバーは、２０μｍを示す。 ５０μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡで処理した１０個の胚（ＡＩＤ＊：：ＧＦＰ;ＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）：：ｍＲｕｂｙ）のＧＦＰ強度を示すグラフである。画像は３分間隔で取得された。 ５０μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡがレポーターの分解を引き起こす効果を示したグラフである。ＧＦＰ強度は０分と６０分で測定された（ｎ＝２３）。 上段：５－Ｐｈ－ＩＡＡ－ＡＭの化学構造である。下段：５０μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡで処理した胚（ＡＩＤ＊：：ＧＦＰ;ＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）：：ｍＲｕｂｙ）のタイムラプス画像である。スケールバーは、２０μｍを示す。 ＤＭＳＯ（ｎ＝５）又は５０μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡ－ＡＭ（ｎ＝４）で処理した胚（ＡＩＤ＊：：ＧＦＰ;ＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）：：ｍＲｕｂｙ）のＧＦＰ強度を示すグラフである。画像は３分間隔で取得された。 ５０μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡ－ＡＭＡがレポーターの分解を引き起こす効果を示したグラフである。ＧＦＰ強度は０分と６０分で測定された（ｎ＝２４）。
≪オーキシンデグロンシステムのキット≫
本発明のキットは、非植物由来の真核細胞中の標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムのキットであって、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するオーキシンアナログと、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする第二の核酸と、を備え、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、オーキシンアナログとの複合体を介して、分解タグと結合して標的タンパク質を分解に導くタンパク質であり、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７９位がグリシンであるアミノ酸配列、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸番号７９位以外の部位において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸番号７９位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
前記オーキシンアナログは、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である。
Figure 2023030479000004
（一般式（Ｉ）中、Ｒ１０は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい環状の脂肪族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい芳香族炭化水素基であり、Ｒ１１は、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２、－ＯＲ１２又は－Ｎ（Ｒ１３）２であり、ｎ１は、１～６の整数であり、Ｒ１２は、炭素数１～６のアルキル基であり、複数のＲ１３は、独立して水素原子若しくは炭素数１～６のアルキル基である。）
「オーキシンデグロンシステム」とは、本発明者らが開発したタンパク質の分解制御技術であり、植物ホルモンオーキシンによって導入される植物特異的なタンパク質分解系を、非植物由来の真核細胞に応用したシステムである。
具体的に、このシステムは、Ｅ３ユビキチン化酵素複合体（ＳＣＦ複合体）のサブユニットであるＦ－ｂｏｘタンパク質としての植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質と、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質又はその部分配列からなるペプチドで標識された標的タンパク質とを非植物由来の真核細胞に導入することにより、オーキシン受容体であるＴＩＲ１ファミリータンパク質が、オーキシン依存的に、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質又はその部分配列からなるペプチドを認識し、非植物由来の真核細胞におけるユビキチン／プロテアソーム分解系を利用して、標的タンパク質を分解するシステムである。
本発明者らは、係るシステムにおいて、卵殻や血液脳関門におけるバリア機能により、オーキシン又はオーキシンアナログの膜透過性が損なわれるという問題を見出した。係る問題に対して、本発明者らは、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質と、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するオーキシンアナログであって、膜透過性の改善されたオーキシンアナログと、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグの組み合わせを見出した。
本発明によれば、標的タンパク質の分解効率が非常に高いオーキシンデグロンシステムを提供できる。
＜第一の核酸＞
本発明において、第一の核酸は、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする。
ＴＩＲ１ファミリータンパク質とは、ユビキチン／プロテアソーム系のタンパク質分解において、Ｅ３ユビキチン化酵素複合体（ＳＣＦ複合体）を形成するサブユニットの一つであるＦ－ｂｏｘタンパク質であり、植物特有のタンパク質である。ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、成長ホルモンであるオーキシンの受容体となっており、オーキシンを受容することによって、オーキシン情報伝達系の抑制因子Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を認識して、標的タンパク質を分解することが知られている。
ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする遺伝子としては、植物由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする遺伝子であれば、その種類は限定されない。また、由来となる植物の種類も限定されず、例えば、シロイヌナズナ、イネ、ヒャクニチソウ、マツ、シダ、ヒメツリガネゴケ等が挙げられる。ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする遺伝子の具体例としては、例えば、ＴＩＲ１遺伝子、ＡＦＢ１遺伝子、ＡＦＢ２遺伝子、ＡＦＢ３遺伝子、ＦＢＸ１４遺伝子、ＡＦＢ５遺伝子等が挙げられる。
中でも、シロイヌナズナ由来のＴＩＲ１遺伝子である、ＡｔＴＩＲ１遺伝子、又はイネ由来ＯｓＴＩＲ１が好ましい。係る遺伝子としては、ＮＣＢＩに登録されているアクセッション番号ＮＭ_１１６１６３（ＧｅｎｅＩＤ：８２５４７３）の遺伝子が挙げられ、より具体的には、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
本発明において、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、オーキシン結合部位に変異を有するものである。係る変異タンパク質は、後述するオーキシンアナログとの親和性を有するものであれば特に限定されないが、ＡｔＴＩＲ１の７９番目のＦが、Ａ、Ｇ、又はＳに変異しているものが好ましく、Ｇに変異しているものがより好ましい。
具体的には、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、オーキシンアナログとの複合体を介して、分解タグと結合して標的タンパク質を分解に導くタンパク質である。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７９位がグリシンであるアミノ酸配列、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸番号７９位以外の部位において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸番号７９位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（ｂ）において欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸の数としては、１ ～１２０個が好ましく、１～６０個がより好ましく、１～２０個が更に好ましく、１～１０個が特に好ましく、１～５個が最も好ましい。
（ａ）のアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質と機能的に同等であるためには８０％以上の同一性を有する。係る同一性としては、８５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
ＡｔＴＩＲ１のＦ７９Ｇタンパク質としては、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるものが挙げられる。
変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸は、エキソンとイントロンとを含むＤＮＡでもよいし、エキソンからなるｃＤＮＡであってもよい。変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡにおける全長配列又はｃＤＮＡにおける全長配列であってもよい。また、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸は、発現したタンパク質が、ＴＩＲ１として機能する範囲において、ゲノムＤＮＡにおける部分配列又はｃＤＮＡにおける部分配列であってもよい。
本明細書において、「ＴＩＲ１ファミリータンパク質として機能する」とは、例えば、オーキシンアナログの存在下で、分解タグ（Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質）を認識することを意味する。ＴＩＲ１ファミリータンパク質が分解タグを認識できれば、分解タグで標識化された標的タンパク質を分解できるからである。
本発明のキットにおいて、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸の５’末端に、該第一の核酸の転写を制御するプロモーター配列が作動可能に連結されていることが好ましい。これによって、より確実にＴＩＲ１ファミリータンパク質を発現できる。
本明細書において、「作動可能に連結」とは、遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター又は一連の転写因子結合部位）と発現させたい遺伝子（ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸）との間の機能的連結を意味する。ここで、「発現制御配列」とは、その発現させたい遺伝子（ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸）の転写を指向するものを意味する。
前記プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、細胞の種類等に応じて適宜決定できる。プロモーターの具体例としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＲＳＶプロモーター等が挙げられる。
本発明のキットにおいて、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸及び上流に作動可能に連結されたプロモーター配列は、ベクターに挿入された形であってもよい。
ベクターとしては、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては特に制限されず、宿主細胞に応じた発現ベクターを用いることができる。
ベクターは、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸の５’末端又は３’末端に、ポリアデニル化シグナル、ＮＬＳ、蛍光タンパク質のマーカー遺伝子等が作動可能に連結されていてもよい。
本発明のキットは、第一の核酸を染色体上に有する非植物由来の真核細胞又は非ヒト動物を備えてもよい。
係る細胞は、第一の核酸をセーフハーバー座位に有することが好ましい。
「セーフハーバー座位」とは、恒常的且つ安定的に発現が行われている遺伝子領域であり、かつ当該領域に本来コードされている遺伝子が欠損又は改変された場合であっても、生命の維持が可能な領域を意味する。ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、外来ＤＮＡ（本実施形態においては、ＴＩＲ１をコードする遺伝子）をセーフハーバー座位に挿入する場合には、近傍にＰＡＭ配列を有することが好ましい。セーフハーバー座位としては、例えば、ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １０遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、ｂｅｔａ－Ａｃｔｉｎ遺伝子座、ＡＡＶＳ１（ｔｈｅ ＡＡＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ １）遺伝子座等が挙げられる。中でも、ヒト由来細胞の場合は外来ＤＮＡをＡＡＶＳ１遺伝子座に挿入することが好ましい。
細胞としては、非植物由来の真核細胞であれば特に限定されず、動物、菌類、原生生物等の細胞があげられる。動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ等の哺乳類、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル等の魚類や両生類、Ｃ.ｅｌｅｇａｎｓやショウジョウバエ等の無脊椎動物が挙げられる。
また、株化された真核動物由来細胞やＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞も挙げられる。真核細胞として具体的には、例えば、株化されたヒト由来細胞、株化されたマウス由来細胞、株化されたニワトリ由来細胞、ヒトＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスｉＰＳ細胞等が挙げられる。具体的には、ヒトＨＣＴ１１６細胞、ヒトＨＴ１０８０細胞、ヒトＮＡＬＭ６細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスＥＳ細胞、マウスｉＰＳ細胞、ニワトリＤＴ４０細胞等が挙げられる。
また、菌類としては、例えば、出芽酵母、分裂酵母等が挙げられる。
第一の核酸を染色体上に有する非ヒト動物は、オーキシンデグロンシステムにより、生体内の標的タンパク質の分解が制御される、遺伝子改変された非ヒト動物である。非ヒト動物としては、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウス等が挙げられる。中でも、薬剤評価の実績という観点からは、齧歯類が好ましい。齧歯類としては、ハムスター、モルモット、ラット、マウス等が挙げられ、ラット、マウスが好ましい。
＜オーキシンアナログ＞
本発明において、オーキシンアナログは、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である。
Figure 2023030479000005
（一般式（Ｉ）中、Ｒ１０は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい環状の脂肪族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい芳香族炭化水素基であり、Ｒ１１は、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２、－ＯＲ１２又は－Ｎ（Ｒ１３）２であり、ｎ１は、１～６の整数であり、Ｒ１２は、炭素数１～６のアルキル基であり、複数のＲ１３は、独立して水素原子若しくは炭素数１～６のアルキル基である。）
［環状の脂肪族炭化水素基］
Ｒ１０における環状の脂肪族炭化水素基としては、単環式基でも多環式基でもよい。
単環式の脂肪族炭化水素としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、メチルシクロヘキシル基、ジメチルシクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基が挙げられる。
多環式の脂環式炭化水素基としては、デカヒドロナフチル基、アダマンチル基、２－アルキルアダマンタン－２－イル基、１－（アダマンタン－１－イル）アルカン－１－イル基、ノルボルニル基、メチルノルボルニル基、イソボルニル基等が挙げられる。
環状の脂肪族炭化水素基は、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい。ヘテロ原子としては、酸素原子、硫黄原子、窒素原子等が挙げられる。係る複素環としては、ピロリジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、ピペリジン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロチオピラン、ジオキサン、ジオキソラン等が挙げられる。
置換基としては、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、ハロゲン原子、炭素数６～３０のアリール基が挙げられる。
アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、シクロペンチル基、２，３－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、シクロヘキシル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、１，１，２－トリメチルプロピル基、３，３－ジメチルブチル基等が挙げられる。
アルコキシ基としては、－ＯＲのＲの部分が、上述した炭素数１～６のアルキル基と同様のものが挙げられる。中でも、炭素数アルコキシ基としては、メトキシ基又はエトキシ基であることが好ましい。
ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。中でも、ハロゲン原子としては、フッ素原子又は塩素原子が好ましい。
アリール基としては、フェニル基、ナフチル基、ベンジル基、フェネチル基、ビフェニル基、ペンタレニル基、インデニル基、アントラニル基、テトラセニル基、ペンタセニル基、ピレニル基、ペリレニル基、フルオレニル基、フェナントリル基が挙げられる。
［芳香族炭化水素基］
Ｒ１０における芳香族炭化水素基としては、上述した炭素数６～３０のアリール基が挙げられる。
芳香族炭化水素基は、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい。ヘテロ原子としては、酸素原子、硫黄原子、窒素原子等が挙げられる。係る複素環としては、ピロール、フラン、チオフェン、ピリジン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾール、ピリダジン、ピリミジン、インドール、ベンゾイミダゾール、キノリン、イソキノリン、クロメン、イソクロメン等が挙げられる。
置換基としては、［環状の脂肪族炭化水素基］で挙げたものと同様のものが挙げられる。
一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｒ１０が芳香族炭化水素基であるものとして、下記一般式（Ｉ－１）で表される化合物が好ましい。
Figure 2023030479000006
（一般式（Ｉ－１）中、Ｒ１は、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、ハロゲン原子、又は炭素数６～３０のアリール基である。ｎは０～５の整数であり、ｎが２～５の整数である場合、ｎ個のＲ１は互いに同一でも異なっていてもよい。Ｒ１１は、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２、－ＯＲ１２又は－Ｎ（Ｒ１３）２であり、ｎ１は、１～６の整数であり、Ｒ１２は、炭素数１～６のアルキル基であり、複数のＲ１３は、独立して水素原子若しくは炭素数１～６のアルキル基である。）
Ｒ１のハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。中でも、ハロゲン原子としては、フッ素原子又は塩素原子が好ましい。
Ｒ１のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、シクロペンチル基、２，３－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、シクロヘキシル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、１，１，２－トリメチルプロピル基、３，３－ジメチルブチル基等が挙げられる。中でも、炭素数１～６のアルキル基としては、メチル基又はエチル基であることが好ましい。
Ｒ１のアルコキシ基としては、－ＯＲのＲの部分が、上述した炭素数１～６のアルキル基と同様のものが挙げられる。中でも、炭素数アルコキシ基としては、メトキシ基又はエトキシ基であることが好ましい。
Ｒ１のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基、ベンジル基、フェネチル基、ビフェニル基、ペンタレニル基、インデニル基、アントラニル基、テトラセニル基、ペンタセニル基、ピレニル基、ペリレニル基、フルオレニル基、フェナントリル基が挙げられる。
Ｒ１のｎは０～５の整数であり、０～３が好ましい。一般式（Ｉ－１）で表される化合物として、以下の化合物が挙げられる。
Figure 2023030479000007
（一般式（Ｉ－１－１）～（Ｉ－１－２）中、Ｒ１～Ｒ３は、それぞれ独立して、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、ハロゲン原子、又は炭素数６～３０のアリール基である。Ｒ１１は、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２、－ＯＲ１２又は－Ｎ（Ｒ１３）２であり、ｎ１は、１～６の整数であり、Ｒ１２は、炭素数１～６のアルキル基であり、複数のＲ１３は、独立して水素原子若しくは炭素数１～６のアルキル基である。）
一般式（Ｉ－１－１）～（Ｉ－１－２）における、Ｒ１～Ｒ３は、一般式（Ｉ－１）におけるＲ１と同様である。
一般式（Ｉ－１）で表される化合物として、以下の化合物も挙げられる。
Figure 2023030479000008
（一般式（Ｉ－１－３）～（Ｉ－１－８）中、Ｒ１１は、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２、－ＯＲ１２又は－Ｎ（Ｒ１３）２であり、ｎ１は、１～６の整数であり、Ｒ１２は、炭素数１～６のアルキル基であり、複数のＲ１３は、独立して水素原子若しくは炭素数１～６のアルキル基である。）
また、Ｒ１０が芳香族炭化水素基であるものとして、下記式（Ｉ－２）～（Ｉ－５）で示される化合物が挙げられる。
Figure 2023030479000009
（一般式（Ｉ－２）～（Ｉ－５）中、Ｒ１１は、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２、－ＯＲ１２又は－Ｎ（Ｒ１３）２であり、ｎ１は、１～６の整数であり、Ｒ１２は、炭素数１～６のアルキル基であり、複数のＲ１３は、独立して水素原子若しくは炭素数１～６のアルキル基である。）
また、Ｒ１０が環状の脂肪族炭化水素基であるものとして、下記一般式（Ｉ－６）で示される化合物が挙げられる。
Figure 2023030479000010
（一般式（Ｉ－６）中、Ｒ１は、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、ハロゲン原子、又は炭素数６～３０のアリール基である。ｍは０～１１の整数であり、ｍが２～１１の整数である場合、ｍ個のＲ１は互いに同一でも異なっていてもよい。Ｒ１１は、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２、－ＯＲ１２又は－Ｎ（Ｒ１３）２であり、ｎ１は、１～６の整数であり、Ｒ１２は、炭素数１～６のアルキル基であり、複数のＲ１３は、独立して水素原子若しくは炭素数１～６のアルキル基である。）
Ｒ１は、一般式（Ｉ－１）で挙げられてものと同様である。ｍは０～６が好ましく、０～３がより好ましい。
また、Ｒ１０が環状の脂肪族炭化水素基であるものとして、下記式（Ｉ－７）で示される化合物も挙げられる。
Figure 2023030479000011
（一般式（Ｉ－７）中、Ｒ１１は、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２、－ＯＲ１２又は－Ｎ（Ｒ１３）２であり、ｎ１は、１～６の整数であり、Ｒ１２は、炭素数１～６のアルキル基であり、複数のＲ１３は、独立して水素原子若しくは炭素数１～６のアルキル基である。）
Ｒ１１は、膜透過性に寄与する置換基であり、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２、－ＯＲ１２又は－Ｎ（Ｒ１３）２である。
－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２において、Ｒ１２は、炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ１のアルキル基と同様のものが挙げられ、メチル基又はエチル基が好ましい。
－（ＣＨ２）ｍ－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２において、ｎ１は、１～６の整数であり、１が好ましい。
Ｒ１１が、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２の場合、以下の化合物が好ましい。
Figure 2023030479000012
Ｒ１１が、－ＯＲ１２の場合、Ｒ１２は、炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ１のアルキル基と同様のものが挙げられ、メチル基又はエチル基が好ましい。
Ｒ１１が、－ＯＲ１２の場合、以下の化合物が好ましい。
Figure 2023030479000013
Ｒ１１が、－Ｎ（Ｒ１３）２の場合、複数のＲ１３は、独立して水素原子若しくは炭素数１～６のアルキル基である。Ｒ１３のアルキル基としては、Ｒ１のアルキル基と同様のものが挙げられ、メチル基又はエチル基が好ましい。
［その他の化合物］
その他の化合物として、下記一般式で表される化合物も挙げられる。
Figure 2023030479000014
（一般式（ＩＩ－１１）～（ＩＩ－１２）中、Ｒ１～Ｒ３は、それぞれ独立して、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、ハロゲン原子、又は炭素数６～３０のアリール基である。
中でも下記化合物が好ましい。
Figure 2023030479000015
また、その他の化合物として、下記一般式で表される化合物も挙げられる。
Figure 2023030479000016
＜第二の核酸＞
本発明において、第二の核酸は、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする。
Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質をコードする遺伝子としては、植物由来のＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子であれば、その種類について特別な限定はない。Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質をコードする遺伝子の具体例としては、例えば、ＩＡＡ１遺伝子、ＩＡＡ２遺伝子、ＩＡＡ３遺伝子、ＩＡＡ４遺伝子、ＩＡＡ５遺伝子、ＩＡＡ６遺伝子、ＩＡＡ７遺伝子、ＩＡＡ８遺伝子、ＩＡＡ９遺伝子、ＩＡＡ１０遺伝子、ＩＡＡ１１遺伝子、ＩＡＡ１２遺伝子、ＩＡＡ１３遺伝子、ＩＡＡ１４遺伝子、ＩＡＡ１５遺伝子、ＩＡＡ１６遺伝子、ＩＡＡ１７遺伝子、ＩＡＡ１８遺伝子、ＩＡＡ１９遺伝子、ＩＡＡ２０遺伝子、ＩＡＡ２６遺伝子、ＩＡＡ２７遺伝子、ＩＡＡ２８遺伝子、ＩＡＡ２９遺伝子、ＩＡＡ３０遺伝子、ＩＡＡ３１遺伝子、ＩＡＡ３２遺伝子、ＩＡＡ３３遺伝子、ＩＡＡ３４遺伝子等が挙げられる。
本発明のキットは、いずれか一種の前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質をコードする遺伝子の全長又は部分配列を有していてもよいし、二種類以上を有していてもよい。例えば、シロイヌナズナ由来のＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の配列は、ＴＡＩＲ（ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）に登録されており、各遺伝子のアクセッションナンバーは、次のとおりである。
ＩＡＡ１遺伝子（ＡＴ４Ｇ１４５６０）、ＩＡＡ２遺伝子（ＡＴ３Ｇ２３０３０）、ＩＡＡ３遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４２４０）、ＩＡＡ４遺伝子（ＡＴ５Ｇ４３７００）、ＩＡＡ５遺伝子（ＡＴ１Ｇ１５５８０）、ＩＡＡ６遺伝子（ＡＴ１Ｇ５２８３０）、ＩＡＡ７遺伝子（ＡＴ３Ｇ２３０５０）、ＩＡＡ８遺伝子（ＡＴ２Ｇ２２６７０）、ＩＡＡ９遺伝子（ＡＴ５Ｇ６５６７０）、ＩＡＡ１０遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４１００）、ＩＡＡ１１遺伝子（ＡＴ４Ｇ２８６４０）、ＩＡＡ１２遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４５５０）、ＩＡＡ１３遺伝子（ＡＴ２Ｇ３３３１０）、ＩＡＡ１４遺伝子（ＡＴ４Ｇ１４５５０）、ＩＡＡ１５遺伝子（ＡＴ１Ｇ８０３９０）、ＩＡＡ１６遺伝子（ＡＴ３Ｇ０４７３０）、ＩＡＡ１７遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４２５０）、ＩＡＡ１８遺伝子（ＡＴ１Ｇ５１９５０）、ＩＡＡ１９遺伝子（ＡＴ３Ｇ１５５４０）、ＩＡＡ２０遺伝子（ＡＴ２Ｇ４６９９０）、ＩＡＡ２６遺伝子（ＡＴ３Ｇ１６５００）、ＩＡＡ２７遺伝子（ＡＴ４Ｇ２９０８０）、ＩＡＡ２８遺伝子（ＡＴ５Ｇ２５８９０）、ＩＡＡ２９遺伝子（ＡＴ４Ｇ３２２８０）、ＩＡＡ３０遺伝子（ＡＴ３Ｇ６２１００）、ＩＡＡ３１遺伝子（ＡＴ３Ｇ１７６００）、ＩＡＡ３２遺伝子（ＡＴ２Ｇ０１２００）、ＩＡＡ３３遺伝子（ＡＴ５Ｇ５７４２０）、ＩＡＡ３４遺伝子（ＡＴ１Ｇ１５０５０）。
これらの中でも、シロイヌナズナＩＡＡ１７遺伝子が好ましい。
分解タグは、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－オーキシンアナログ複合体と結合し、標的タンパク質を分解に導くものであれば特に限定されず、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のうち、ｍＡＩＤの全長若しくは部分タンパク質を含むもの、又はＡＩＤ＊の全長若しくは部分タンパク質を含むものが好ましい。
「ｍＡＩＤ」とは、「Ｍｉｎｉ－ａｕｘｉｎ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｄｅｇｒｏｎ」の略称であり、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の一つであるシロイヌナズナＩＡＡ１７の部分配列からなるタンパク質である。この部分配列とは、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインＩＩ領域のＮ末端側及びＣ末端側に少なくとも２個ずつのＬｙｓ残基を含む領域からなる配列、又は、該配列を２個以上連結してなる配列である。このｍＡＩＤは標的タンパク質を標識する分解タグとなり得る。例えば、ｍＡＩＤのアミノ酸配列は、配列番号４で表される。
「ＡＩＤ＊」は、ｍＡＩＤとは少し長さの違うＩＡＡ１７由来の配列からなり、４４ａａの短いアミノ酸配列からなるタンパク質である。例えば、ＡＩＤ＊のアミノ酸配列は、配列番号５で表される。
＜第三の核酸＞
本発明のキットにおいて、標的タンパク質が定まっている場合には、第二の核酸の上流又は下流に連結された標的タンパク質をコードする第三の核酸を備えていてもよい。第二の核酸は、第三の核酸の５’側又は３’側のどちらに隣接されて配置されてもよい。
第二の核酸と第三の核酸からなる融合核酸は、第一の核酸と同様に、プロモーター配列が作動可能に連結されていることが好ましく、発現ベクターに組み込まれたものであってもよい。
≪標的タンパク質分解方法≫
本発明の標的タンパク質の分解方法は、上述した本発明のキットを用いる方法である。オーキシンデグロンシステムにおいて、上述のキットを用いることで、効率よく標的タンパク質の分解制御が可能である。
例えば、上述のキットを用いて標的タンパク質の分解制御を行う方法としては、以下の方法等が挙げられる。
まず、細胞内において、分解タグで標識された標的タンパク質、及びＴＩＲ１ファミリータンパク質を発現させる。分解タグで標識された標的タンパク質、及びＴＩＲ１ファミリータンパク質は、定常的に発現していることが好ましい。
次いで、オーキシンアナログを培地に添加する。培地に含まれるオーキシンアナログの濃度は、限定されず、例えば、１μＭ以上０．１ｍＭ未満であり、１０ｎＭ以上１００μＭ以下であることが好ましい。実施例で後述するように、５－Ｐｈ－ＩＡＡ－ＡＭとＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）の組み合わせでは、効率よく標的タンパク質の分解を誘導できる。所定濃度のオーキシンアナログの添加により、細胞内に取り込まれた後、Ｒ１１が分解を受け、親水性となり、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－オーキシンアナログ複合体が形成され、この複合体が分解タグによって標識された標的タンパク質を認識し、標的タンパク質の分解が誘導される。
また、非ヒト動物を用いる場合には、オーキシンアナログを投与することにより標的タンパク質が分解される。
オーキシンアナログの投与方法としては、特に限定されず、腹腔内投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与等が挙げられる。投与量としては、例えば１日あたり０．１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇが好ましく、０．２ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇがより好ましく、０．５ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇが更に好ましい。投与期間としては、１日～１０日が好ましく、３日～７日がより好ましい。
［阻害剤］
また、リガンド未添加時の標的タンパク質の基底分解をより制御するために、ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤を用いてもよい。
ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤としては、下記一般式で表される化合物が挙げられる。
Figure 2023030479000017
（一般式（ＩＩＩ）中、Ｒ１４は、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基である。Ｒ１５ａ、及びＲ１５ｂは、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１～６のアルキル基である。Ｒ１６は、水素原子、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい環状の脂肪族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい芳香族炭化水素基である。）
Ｒ１４、Ｒ１５ａ、Ｒ１５ｂ、及びＲ１６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、シクロペンチル基、２，３－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、シクロヘキシル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、１，１，２－トリメチルプロピル基、３，３－ジメチルブチル基等が挙げられる。
Ｒ１６の置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい環状の脂肪族炭化水素基としては、Ｒ１０と同様のものが挙げられ、単環式、又は多環式の脂肪族炭化水素基が好ましく、炭素数１～１０のシクロアルキル基、又はアダマンチル基がより好ましく、シクロヘキシル基、又はアダマンチル基が特に好ましい。
Ｒ１６の置換基を有していてもよく、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい芳香族炭化水素基としては、Ｒ１０と同様のものが挙げられ、炭素数６～３０のアリール基が好ましく、フェニル基がより好ましい。
好ましいＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤としては、下記一般式で表される化合物が挙げられる。
Figure 2023030479000018
（一般式（ＩＩＩ－１）～（ＩＩＩ－２）中、Ｒ１４は、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基である。Ｒ１５ａ、及びＲ１５ｂは、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１～６のアルキル基である。Ｒ１７は、炭素数１～６のアルキル基である。）
Ｒ１７のアルキル基としては、Ｒ１６のアルキル基と同様のものが挙げられる。
好ましいＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤としては、下記式で表される化合物が挙げられる。
Figure 2023030479000019
上記ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤は、ＴＩＲ１ファミリータンパク質への結合能を要するが、分解誘導ペプチド（特に、ｍＡＩＤ）への結合能を有さないものである。これにより、ＴＩＲ１ファミリータンパク質と、分解誘導ペプチド（特に、ｍＡＩＤ）との結合を阻害することができる。
本発明の分解方法において、上記ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤を用いる場合、以下の方法が挙げられる。
まず、真核細胞内において、分解誘導ペプチドで標識された目的タンパク質及びＴＩＲ１ファミリータンパク質を、ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤存在下で発現させる。これにより、目的タンパク質の基底分解を抑制することができる。
次いで、ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤を含む培地を、上述したオーキシンアナログを含む培地に交換する。これにより、ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤が除去され、代わりにオーキシンアナログが存在することで、分解誘導ペプチドで標識された目的タンパク質がＴＩＲ１ファミリータンパク質により分解される。
本発明の分解方法によれば、オーキシンアナログ特異的に標的タンパク質の分解を誘導できる。
≪化合物≫
本発明の化合物は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である。
Figure 2023030479000020
（一般式（Ｉ）中、Ｒ１０は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい環状の脂肪族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい芳香族炭化水素基であり、Ｒ１１は、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２、－ＯＲ１２又は－Ｎ（Ｒ１３）２であり、ｎ１は、１～６の整数であり、Ｒ１２は、炭素数１～６のアルキル基であり、複数のＲ１３は、独立して水素原子若しくは炭素数１～６のアルキル基である。）
一般式（Ｉ）において、Ｒ１１は、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２の場合、以下の合成方法が挙げられる。
Figure 2023030479000021
（一般式（Ｖ）及び（Ｖ－Ａ）中、Ｒ１０は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい環状の脂肪族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい芳香族炭化水素基である。一般式（Ａ）中、Ｘはハロゲンである。一般式（Ａ）及び（Ｖ－Ａ）中、ｎ１は、１～６の整数であり、Ｒ１２は、炭素数１～６のアルキル基である。）
ＤＭＦ中の一般式（Ｖ）で表される化合物及びトリメチルアミンの溶液に、一般式（Ａ）で表される化合物を滴下して加え、室温で撹拌する。反応混合物を水に加え、ＥｔＯＡｃで抽出し、有機層を洗浄・乾燥し、残渣を精製して、一般式（Ｖ－Ａ）で表される化合物が得られる。
一般式（Ａ）中、ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
一般式（Ｖ－Ａ）で表される化合物において、好ましい化合物は、＜オーキシンアナログ＞において挙げたものと同様のものが挙げられる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
［５－Ｐｈ－ＩＡＡの合成］
下記式（ＶＩ）で示される化合物（５－Ｐｈ－ＩＡＡともいう。）を合成した。
Figure 2023030479000022
［線虫（Ｃ.ｅｌｅｇａｎｓ）におけるＡＩＤ２システムの構築］
以下のとおり、本発明に係る分解システム（ＡＩＤ２システムともいう。）を構築した。
オーキシンとの親和性向上のためのＤ１７０Ｅ及びＭ４７３Ｌの変異を含む、線虫のＡｔＴＩＲ１遺伝子に、Ｆ７９Ｇ変異を導入した。尚、Ｆ７９Ｇ変異は、ＯｓＴＩＲ１では、Ｆ７４Ｇに相当する。このＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）と赤色蛍光タンパク質との融合タンパク質（ＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）：： ｍＲｕｂｙ）をコードする遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を介したノックインにより、ｔｔＴｉ５６０５遺伝子座（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ＩＩ： ｐｏｓｉｔｉｏｎ ８，４２０，２０４）へ挿入した。
ＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）：： ｍＲｕｂｙの発現は、ｅｆｔ３２７７プロモーターにより駆動され、すべての体細胞で遍在する発現を達成した。
ＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）：：ｍＲｕｂｙを発現する系統と、ＧＦＰレポーターが融合したＡＩＤ＊（配列番号５参照。）（ＡＩＤ＊：：ＧＦＰ）を発現する系統とかけ合わせた。
基底分解のレベルをモニターするために、ＡｔＴＩＲ１：：ｍＲｕｂｙ又はＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）：：ｍＲｕｂｙを発現する幼虫のＡＩＤ＊：：ＧＦＰの強度を測定した。
ＡｔＴＩＲ１：：ｍＲｕｂｙを発現する株では、レポーター強度は、導入遺伝子のない親株と比較して７３％に減少し、リガンド未添加時の基底分解を示した（図１Ａ及び図１Ｂ参照。）。対照的に、レポーター強度は、ＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）：：ｍＲｕｂｙを発現する幼虫では、全く影響を受けなかった（図１Ａ及び図１Ｂ参照。）。このことは、線虫において、ＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）の基底分解が、低レベルであることを示した。
次いで、５－Ｐｈ－ＩＡＡが、線虫に対してＩＡＡより安全であることを確認するため、ＡＩＤ＊：：ＧＦＰを発現するＬ１幼虫を、それぞれ１ｍＭ ＩＡＡ又は５μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡの存在下で、ＡｔＴＩＲ１又はＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）とともに成長させた。
図２に示す様に、１ｍＭ ＩＡＡで処理された線虫は、子孫の数が減少することが確認された。対照的に、５μＭの５－Ｐｈ－ＩＡＡで処理された線虫は違いを示さなかった。この結果から、線虫を５μＭの５－Ｐｈ－ＩＡＡで処理する方が１ｍＭ ＩＡＡで処理するよりも安全であることが確認された。
ＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）と５－Ｐｈ－ＩＡＡの組み合わせが、ＡＩＤ＊：：ＧＦＰレポーターの分解を誘発できるかどうかをテストするために、１ｍＭ ＩＡＡ又は５μＭ ５ＰｈＩＡＡを含むプレート上で、ＡｔＴＩＲ１又はＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）を含む幼虫を処理した。
処理前、レポーターの蛍光強度は、ＡｔＴＩＲ１を発現する幼虫よりもＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）を発現する幼虫で高かった（図３Ａ及び図３Ｂ参照。）。１ｍＭ ＩＡＡの処理は、ＡｔＴＩＲ１を発現する幼虫のレポーターレベルを１６．８分の半減期で減少させた。 ５μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡの処理により、リガンド濃度が５００倍低かったにもかかわらず、ＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）を発現する幼虫の半減期が、１５．５分でレポーターレベルが同様に低下した（図３Ａ及び図３Ｂ参照。）。更に、１μＭ及び１０μＭの５－Ｐｈ－ＩＡＡで処理をした結果、半減期はそれぞれ３３．６分及び１５．１分だった（図３Ｂ参照。）。
これらの結果は、５μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡで処理すると、除去速度がほぼ最大に達することを示した。基底分解のレベルが低いため、ＡｔＴＩＲ１と１ｍＭ ＩＡＡを備えた従来のＡＩＤシステムと比較して、ＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）と５μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡの組み合わせでより鋭い分解を達成できた。
次に、異なる濃度のリガンドを含むプレート上でＬ１幼虫を成長させた。成虫から生まれた幼虫（第２世代）のＡＩＤ＊：：ＧＦＰレポーターの強度をモニターした。５．０μＭの５－Ｐｈ－ＩＡＡで処理した幼虫のレポーター発現が最も低かったことを観察した（図３Ｃ参照。）。さらに、この発現レベルは、１ｍＭ ＩＡＡで処理されたＡｔＴＩＲ１発現幼虫の発現レベルよりも低かった（ｐ＝１．７×１０－５）。
推定ＤＣ５０値（５０％分解に必要なリガンド濃度）は、ＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）と組み合わせた５－Ｐｈ－ＩＡＡ、及びＡｔＴＩＲ１と組み合わせたＩＡＡにおいて、それぞれ４．５ｎＭ及び５９μＭであった。この結果は、５－Ｐｈ－ＩＡＡを使用するＡＩＤ２システムは、長時間の処理において、従来のＡＩＤシステムよりも約１，３００倍低いリガンド濃度を必要とすることを示している。さらに、成虫におけるＡＩＤ２システムの有効性をテストした。成虫を５μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡで４時間処理すると、レポーターの喪失が観察された（図３Ｄ及び図３Ｅ参照。）。これらの結果は、ＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）と５－Ｐｈ－ＩＡＡの組み合わせが、リガンド感受性を改善し、線虫の幼虫と成虫における標的タンパク質をさらに急速に除去させることを明確に示した。
［実施例２］
［胚における５－Ｐｈ－ＩＡＡの効果の検討］
胚における急速な標的の除去は、胚発生におけるタンパク質の役割を分析するのに役立つ。最初に、５－Ｐｈ－ＩＡＡを使用して胚におけるタンパク質除去の有効性をテストした。ＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）：：ｍＲｕｂｙ及びＡＩＤ＊：：ＧＦＰを発現する産卵胚を５０μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡを含むＭ９バッファーの液滴に入れ、その後レポーター強度をモニターした（図４Ａ参照。）。
５０μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡで処理すると、一部の胚（７８％、１８/２３胚）で蛍光強度が急速に低下することが確認された（図４Ｂ及び図４Ｃ参照）。また、高濃度の１００μＭの５－Ｐｈ－ＩＡＡをテストしたところ、ほぼ同じ結果（８０％、１６/２０）が観察された。
５０μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡで分解が誘導されると、レポーターの分解は、１５～３０分以内に最大に達した（図４Ａ及び図４Ｂ参照。）。しかし、処理に反応しなかった胚がいくつかあった（図４Ａ、上部の胚参照。）。これは、Ｃ.ｅｌｅｇａｎｓの胚が卵殻内で発生し、卵殻が、多くの化合物の透過性をブロックするためと考えられる。
卵殻への透過性を改善すべく、アセトキシメチル基を有する５－Ｐｈ－ＩＡＡ－ＡＭを合成した（図４Ｄ参照。）。
［５－Ｐｈ－ＩＡＡ ＡＭ エステルの合成］
１Ｈ及び１３ＣＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬ ＥＣＺ４００ＮＭＲ分光計で記録された（ＪＥＯＬ、日本）ケミカルシフトは、インターナルレファレンスとして、ＴＭＳからのδ値として示される。ピーク多重度は、Ｈｚで表示される。カラムクロマトグラフィーは、Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０（２３０～４００メッシュ、Ｍｅｒｃｋ、日本）を用いて行った。すべての化学薬品は、東京化成工業ジャパン（東京、日本）から購入した。
Figure 2023030479000023
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の５－フェニルインドール－３－酢酸（５００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）及びトリメチルアミン（４０２ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ブロモメチルアセテート（３００ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を滴下して加え、室温で１８時間撹拌した。
反応混合物を水（１００ｍＬ）に加え、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を１Ｍ ＨＣｌ、１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３水溶液、ブラインで洗浄し、次にＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝ ７：３）で精製して、５－フェニルインドール３－酢酸アセトキシメチルエステルを結晶として得た（４４２ｍｇ、収率６９％）。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.18 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.64 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.44-7.41 (m, 3H), 7.32 (t, J = 9.1 Hz, 2H), 7.09 (s, 1H), 5.76 (s, 2H), 3.84 (s, 2H), 1.97 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 170.7, 169.7, 142.4, 135.6, 133.3, 128.6, 127.5, 127.3, 126.4, 124.0, 122.1, 117.2, 111.5, 107.6, 79.4, 31.0, 20.5. TOF－MS m/z 346.1 [M+Na]+
［胚における５－Ｐｈ－ＩＡＡ ＡＭ エステルの効果の検討］
ＡｔＴＩＲ１（Ｆ７９Ｇ）：：ｍＲｕｂｙ及びＡＩＤ＊：：ＧＦＰを発現する産卵胚を５０μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡ－ＡＭを含むＭ９バッファーの液滴に入れ、その後レポーター強度をモニターした（図４Ｄ参照。）。ＤＭＳＯで処理した胚とは対照的に、５０μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡ－ＡＭが、ＡＩＤ＊：：ＧＦＰレポーターの急速な除去を効果的に引き起こしたことが確認された（図４Ｅ参照。）。５－Ｐｈ－ＩＡＡとは対照的に、５－Ｐｈ－ＩＡＡ－ＡＭは、すべての胚において、急速な分解を引き起こした（図４Ｆ参照。）。この結果は、５－Ｐｈ－ＩＡＡ－ＡＭが胚のタンパク質を標的とするより優れたリガンドであることを示している。
本発明のオーキシンデグロンシステムによれば、効率良く、標的タンパク質の分解制御が可能である。

Claims (9)

  1. 非植物由来の真核細胞中の標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムのキットであって、
    オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、
    前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するオーキシンアナログと、
    少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする第二の核酸と、を備え、
    前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、オーキシンアナログとの複合体を介して、分解タグと結合して標的タンパク質を分解に導くタンパク質であり、
    （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７９位がグリシンであるアミノ酸配列、
    （ｂ）前記（ａ）のアミノ酸番号７９位以外の部位において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
    （ｃ）前記（ａ）のアミノ酸番号７９位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
    前記オーキシンアナログは、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である、キット。
    Figure 2023030479000024
     （一般式（Ｉ）中、Ｒ１０は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい環状の脂肪族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい芳香族炭化水素基であり、Ｒ１１は、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２、－ＯＲ１２又は－Ｎ（Ｒ１３）２であり、ｎ１は、１～６の整数であり、Ｒ１２は、炭素数１～６のアルキル基であり、複数のＲ１３は、独立して水素原子若しくは炭素数１～６のアルキル基である。）
  2. 更に、前記第二の核酸の上流又は下流に連結された標的タンパク質をコードする第三の核酸を備える、請求項１に記載のキット。
  3. 前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、シロイヌナズナ由来タンパク質である、請求項１又は２に記載のキット。
  4. 前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、ＡｔＴＩＲ１の７９番目のＦが、Ａ、Ｇ、又はＳに変異しているタンパク質である、請求項１～３のいずれか一項に記載のキット。
  5. 更に、前記第一の核酸を染色体上に有する非植物由来の真核細胞又は非ヒト動物を備える、請求項１～４のいずれか一項に記載のキット。
  6. 前記非植物由来の真核細胞又は非ヒト動物は、更に、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする第二の核酸と、前記第二の核酸の上流又は下流に連結された標的タンパク質をコードする第三の核酸と、を含む染色体を有する、請求項５に記載のキット。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載のキットを用いる、標的タンパク質の分解方法。
  8. 非植物由来の真核細胞中の標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムに用いられる標的タンパク質分解誘導剤であって、
    下記一般式（Ｉ）で表される化合物を含有する、標的タンパク質分解誘導剤。
    Figure 2023030479000025
     （一般式（Ｉ）中、Ｒ１０は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい環状の脂肪族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい芳香族炭化水素基であり、Ｒ１１は、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２、－ＯＲ１２又は－Ｎ（Ｒ１３）２であり、ｎ１は、１～６の整数であり、Ｒ１２は、炭素数１～６のアルキル基であり、複数のＲ１３は、独立して水素原子若しくは炭素数１～６のアルキル基である。）
  9. 下記一般式（Ｉ）で表される化合物。
    Figure 2023030479000026
     （一般式（Ｉ）中、Ｒ１０は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい環状の脂肪族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい芳香族炭化水素基であり、Ｒ１１は、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２、－ＯＲ１２又は－Ｎ（Ｒ１３）２であり、ｎ１は、１～６の整数であり、Ｒ１２は、炭素数１～６のアルキル基であり、複数のＲ１３は、独立して水素原子若しくは炭素数１～６のアルキル基である。）
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