JP2007508814A - ヒトb1ブラジキニン受容体タンパク質を選択的に発現するトランスジェニックげっ歯動物 - Google Patents
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Abstract
天然型ブラジキニンB1受容体についてのヌル表現型に対して非天然型のブラジキニンB1受容体遺伝子を組み込んだ、トランスジェニックマウスなどの非ヒトトランスジェニック動物を作製する。本発明の例示部分は、ヒトB1ブラジキニン受容体遺伝子をコードする導入遺伝子を含むターゲティング構築物が、天然マウスブラジキニンB1プロモーターの下流に挿入され、作動可能に連結されているトランスジェニックマウスを開示した。このターゲティング構築物はまた、loxPが導入された(floxed)ネオマイシン耐性遺伝子も含む。生じるトランスジェニック動物は、ブラジキニンB1受容体に関して「ヒト化」されており、天然の機能性B1受容体活性についてのヌルバックグラウンド上に有効に存在する。これらの動物は、loxPが導入されたマーカー遺伝子が存在しないトランスジェニック子孫を生産するためにCre欠失(deleter)系統と交配し得る。ここに記載のトランスジェニック動物は、・・・するモデルを提供する。本発明のトランスジェニックマウスは、げっ歯動物(例えばラット又はマウス)B1ブラジキニン受容体に比べて、ヒトB1ブラジキニン受容体に選択的である化合物の分析を可能にする動物モデルを提供する。
Description
本発明は、一部には、生物学的活性量の天然型B1ブラジキニン受容体の代わりに機能性非天然B1ブラジキニン受容体タンパク質を発現するトランスジェニック動物に関する。本発明のトランスジェニック動物は、非天然型のB1ブラジキニン受容体タンパク質をコードするヌクレオチド配列の組込みによって作製され、天然型受容体の発現を制御する領域に直接指向して、これを置換する。あるいは、非天然型B1ブラジキニン受容体タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ランダムに又は的を定めて、ヌルB1ブラジキニン受容体バックグラウンドへと差し向けられる。ここで例示する「ヒト化」マウスを含むがこれに限定されない、本発明のトランスジェニック動物は、インビトロ及びインビボアッセイの両方においてヒト選択的化合物の効果を評価するために有用である。
DrayとPerkins(1993,TINS 16:99−104)及びProudとKaplan(1988,Annual Review Immunology 6:49−83)は、2つの哺乳動物ブラジキニン受容体タンパク質サブタイプ、B1及びB2をこれらの薬理的性質に基づいて定義している。ノナペプチドブラジキニン(BK)及びデカペプチドLys−BK(カリジン)は、カリクレインのタンパク質分解作用によって高分子タンパク質前駆体キニノーゲンから放出される。BKとカリジンはどちらもB2受容体を活性化する。これらのB2受容体アゴニストは、次に、カルボキシペプチダーゼによって分解されてB1受容体アゴニストdes−Arg9BK及びdes−Arg10カリジンを産生するか又はアンギオテンシン変換酵素(ACE)によって分解されて不活性ペプチドを生じる。BKとカリジンは、B2ブラジキニン受容体サブタイプにおいて等能性アゴニストとして働く。これに対し、BKはB1ブラジキニン受容体サブタイプでは完全に不活性である。
B2及びB1ブラジキニン受容体はGタンパク質共役受容体のスーパーファミリーの成員である。以下のものを含む、数多くの哺乳動物B1及びB2受容体遺伝子が単離され、特性決定されている:
ヒトB1ブラジキニン−それぞれ1998年1月28日及び1999年10月12日にMenkeらに発行された米国特許第5,712,111号及び同第5,965,367号、並びにMenkeら(1994,J.Biol.Chem.269:21583−21586);
ウサギB1ブラジキニン−MacNeilら、1995,Biochem.Biophys.Acta 1264:223−228;
マウスB1ブラジキニン−Hessら、1996,Immunopharmacology 33:1−8;
ラットB2ブラジキニン−McEachernら、1991,Proc.Natl.Acad.Sci.88,7724−7728;
ヒトB2ブラジキニン−Hessら(1992,Biochem.Biophys.Res.Comm.184:260−268);及び
ラットB1ブラジキニン−Jonesら、1999,Eur.J.Pharmacol.374(3),423−433。
ヒトB1ブラジキニン−それぞれ1998年1月28日及び1999年10月12日にMenkeらに発行された米国特許第5,712,111号及び同第5,965,367号、並びにMenkeら(1994,J.Biol.Chem.269:21583−21586);
ウサギB1ブラジキニン−MacNeilら、1995,Biochem.Biophys.Acta 1264:223−228;
マウスB1ブラジキニン−Hessら、1996,Immunopharmacology 33:1−8;
ラットB2ブラジキニン−McEachernら、1991,Proc.Natl.Acad.Sci.88,7724−7728;
ヒトB2ブラジキニン−Hessら(1992,Biochem.Biophys.Res.Comm.184:260−268);及び
ラットB1ブラジキニン−Jonesら、1999,Eur.J.Pharmacol.374(3),423−433。
Hessら(1996,Immunopharmacology 33:1−8)は、B1受容体アゴニストの選択性が種特異的である、すなわちマウス、ヒト及びウサギB1受容体を比較したとき種特異的であることを示している。
BockとLongmore(2000,Current Opin.in Chem.Biol.4(4):401−407)は、B1及び/又はB2ブラジキニン受容体活性の公知の調節因子の最新情報を提示している。この著者らの総説に示されているように、B2受容体は正常組織で発現されるが、B1受容体は発現されないことは、学会において広く受け入れられている。炎症、疼痛、組織損傷を生じさせる生物学的過程は、B1受容体活性並びに細菌感染を速やかに誘導することができる。このような病的条件下でのB1受容体の見かけ上の誘導性は、抗炎症薬/鎮痛薬としてのB1受容体アンタゴニストの使用についての治療ウインドウを提供すると考えられ、したがって、B1受容体を魅力的な薬剤標的にしている。
国際公開広報第WO03/016495号は、天然型受容体と共にヒトB1ブラジキニン受容体を発現するトランスジェニックラットを開示する。
Pesqueroら(2000,Proc.Natl.Acad.Sci.,97(14):8140−8145)は、B1ブラジキニン受容体欠損マウスを開示している。著者らは、これらのB1受容体欠損マウスが健常であり、繁殖可能であることを示している。細菌性LPS誘導性低血圧の鈍化、炎症組織における多核白血球の蓄積減少、並びに脊髄反射の低下などの様々な表現型が開示されている。
このために、げっ歯動物(例えばラット又はマウス)B1ブラジキニン受容体と比較して、非天然型(例えばヒト)B1ブラジキニン受容体に選択的な化合物の分析を可能にし、したがって、例えばヒトB1ブラジキニン受容体に対する潜在的調節因子の特異性の薬力学的性質を評価するためのモデル系を提供する動物モデルへの需要がなおも存在する。本発明は、ヌル天然B1ブラジキニン受容体バックグラウンドでヒトB1ブラジキニン受容体タンパク質を発現する様々な「ヒト化」トランスジェニックマウスモデルを開示することにより、この現在も続く需要に応えるものである。
本発明は、天然型B1ブラジキニン受容体をコードする少なくとも1個の、好ましくは両方の対立遺伝子が非機能性になっており、非天然型B1ブラジキニン受容体タンパク質をコードする機能性導入遺伝子が標的動物の生殖細胞及び/又は体細胞に組み込まれている、非ヒト動物細胞に関する。このようなトランスジェニック非ヒト動物細胞の作製は、本発明のさらなる側面、すなわち、天然型B1ブラジキニン受容体をコードする少なくとも1個の、好ましくは両方の対立遺伝子が非機能性になっており、非天然型B1ブラジキニン受容体タンパク質をコードする機能性導入遺伝子で置換されている、非ヒトトランスジェニック胚、初期創始動物、同腹子、「loxPが導入された(floxed)」動物、並びにloxPが導入された領域が除去されている動物(ここでは「loxPが除去された(floxed−out)」動物と称する)及びこれらのトランスジェニックマウスの続く全ての子孫及び後代を含むがこれらに限定されない、非ヒトトランスジェニック動物を可能にする。
このために、本発明は、天然型B1ブラジキニン受容体をコードする少なくとも1個の、好ましくは両方の対立遺伝子が、(1)非機能性になっており、及び(2)プロモーターフラグメントに作動可能に連結された、ヒト型B1ブラジキニン受容体タンパク質をコードする機能性導入遺伝子で置換されている、非ヒトトランスジェニック動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び/又は非ヒトトランスジェニック創始動物、同腹子、loxPが導入された動物、loxPが除去された動物並びにありとあらゆる続く子孫及び後代に関する。本発明のトランスジェニックマウスは、げっ歯動物(例えばラット又はマウス)B1ブラジキニン受容体と比較して、ヒトB1ブラジキニン受容体に選択的な化合物の分析を可能にする動物モデルを提供する。
本発明はさらに、天然型B1ブラジキニン受容体をコードする少なくとも1個の、好ましくは両方の対立遺伝子が、(1)非機能性になっており、及び(2)プロモーターに作動可能に連結された、ヒト型B1ブラジキニン受容体タンパク質をコードする機能性導入遺伝子で置換されている、非ヒトトランスジェニック動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び/又は非ヒトトランスジェニック創始動物、同腹子、loxPが導入された動物、loxPが除去された動物並びにありとあらゆる続く子孫及び後代に関する。特定実施態様では、非天然ヒト化形態のB1ブラジキニン受容体は、内在性マウスB1ブラジキニンプロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結されている。
本発明のさらなる実施態様は、ここで開示するトランスジェニック動物に由来する細胞及び/又は組織、並びにこのようなトランスジェニック動物を、対象とする細胞系を生産するためのソースとして使用することによって生成される細胞系に関する。したがって、本発明の1つの実施態様は、好ましくは天然B1ブラジキニン受容体タンパク質についてのヌル表現型を担持し、機能性ヒトB1ブラジキニン受容体タンパク質をコードする導入遺伝子を含む、本発明のトランスジェニックマウスに由来する細胞、組織及び/又は細胞系に関する。
本発明は、機能性形態のヒトB1ブラジキニン受容体をコードする導入遺伝子が標的動物の生殖細胞及び/又は体細胞に安定に組み込まれており、好ましくは標的動物が最終的に天然型B1ブラジキニン受容体タンパク質に関してヌル表現型を示し、キメラマウスの作製及びヒトB1ブラジキニン受容体導入遺伝子についてホモ接合の動物を生産するための続く交配を可能にする、トランスジェニックげっ歯動物、すなわちトランスジェニックマウスを例示する。しかし、本発明は、トランスジェニックマウス、トランスジェニックラット、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックヤギ、チンパンジー、アカゲザル及びアフリカミドリザルなどのトランスジェニック非ヒト霊長動物、及びトランスジェニックウシなどの他の非ヒトトランスジェニック動物の作製を考慮する。トランスジェニックマウスが好ましく、ここで例示する。
ここで使用する、「機能性」という用語は、細胞内又はインビトロ系において存在するとき、天然又は未変化の状態又は環境にあるかのごとく正常に機能する遺伝子又はタンパク質を表わすために使用される。したがって、機能性でない(すなわち「非機能性」、「破壊された」、「変化した」等)遺伝子は、野生型、天然又は非変性タンパク質として機能しないタンパク質をコードするか、若しくは全くタンパク質をコードしない。このような非機能性遺伝子は、非機能性遺伝子を、機能性形態の遺伝子を含む標的染色体の領域に特異的に指向して、野生型又は天然遺伝子の「ノックアウト」を生じさせる、ここで述べる相同的組換え事象の産物であり得る。
ここで使用する、「調節因子」は、ヒトB1ブラジキニン受容体などの哺乳動物B2又はB1ブラジキニン受容体の発現又は活性の変化を生じさせる、又はそれぞれの受容体とこのリガンド、又はアンタゴニスト又はアゴニストのような他のタンパク質との相互作用の変化を生じさせる化合物である。
本発明のトランスジェニック動物に関してここで使用するとき、本発明者らは「導入遺伝子」及び「遺伝子」に言及する。遺伝子とは、タンパク質又は構造RNAをコードするヌクレオチド配列である。遺伝子及び/又は導入遺伝子はまた、当技術分野において公知の遺伝子調節エレメント及び/又は構造エレメントを含み得る。ここで使用し、例示するとき、導入遺伝子は、遺伝子を含む遺伝子構築物である。導入遺伝子は、ここで例示する、プラスミドに基づく遺伝子ターゲティング構築物を通した相同的組換えのような、当技術分野で公知の方法によって動物の細胞内の1又はそれ以上の染色体に組み込まれる。ひとたび組み込まれると、導入遺伝子は、トランスジェニック動物のゲノム内の少なくとも1つの位置、好ましくは染色体に担持される。対象導入遺伝子は、マウス又は他の哺乳動物の標的ゲノム内に取り込まれ、この後、安定に組み込まれて所望機能を実施することができるようにこれらの生殖細胞及び/又は体細胞に導入される。染色体は標的動物への導入遺伝子の安定な組込みのために好ましい標的であるが、「ゲノム」という用語は、核DNA(染色体又は染色体外DNA)並びに細胞質内に局在するミトコンドリアDNAを含む、生物のDNA相補物全体を指す。したがって、本発明のトランスジェニックマウスは、導入遺伝子(例えばヌル天然B1バックグラウンド上の機能性形態のヒトB1ブラジキニン遺伝子)の発現が、動物モデルをヒトB1受容体に対するB1受容体調節因子の特異性に関して試験するという所望作用を達成するように、げっ歯動物の生殖細胞又は体細胞のいずれか又は両方(好ましくは両方)に1又はそれ以上の導入遺伝子を安定に組み込んでいる。導入遺伝子を生殖細胞系に導入し、これによって子孫に情報を伝える能力を与えることが好ましい。実際に子孫が遺伝子情報の一部又は全部を有している場合、これらもまたトランスジェニック動物である。
ここで使用する、「動物」という用語は、トランスジェニック動物に言及するとき、この用語の使用はヒトを除外することを除いて、全ての哺乳動物を包含し得る。また、胚及び胎児段階を含む、全ての発達段階の個々の動物も包含する。「トランスジェニック動物」又はより詳細には「非ヒトトランスジェニック動物」は、微量注入、標的遺伝子送達(例えば、相同的組換え)又は組換えウイルスでの感染のような、細胞下レベルでの計画的な遺伝子操作によって直接又は間接的に受け入れた遺伝情報を担持する1又はそれ以上の細胞を含む非ヒト動物である。上記のように、この導入されたDNA分子(例えば遺伝子ターゲティング構築物内に含まれる導入遺伝子)は、染色体内に組み込まれ得るか、又は染色体外複製DNAであり得る。考慮される動物は、トランスジェニック創始動物、同腹子、loxPが導入された動物、loxPが除去された動物、これらの初期動物から産生される将来の子孫及び後代、及び言うまでもなく、意図する遺伝子ターゲティング戦略の遺伝子型結果及び/又は予想表現型を有する、この後産生される系統(近交系又は非近交系)を含むが、いかなる意味においてもこれらに限定されない。
ここで使用する、「げっ歯動物」は、噛むための一対の上顎切歯と下顎切歯を有し、歯は絶えず成長し、切歯と粉砕用臼歯の間の間隙が明らかである、げっ歯目の成員である種に関する。トランスジェニック動物の作製のための好ましい例は、トランスジェニックマウス(例えばハツカネズミ(Mus musculus))を含むが、これらに限定されない。
ここで使用する、「創始動物」は、微量注入された卵又は胚盤胞から発生するトランスジェニック動物を指す。創始動物は、遺伝子産物の何らかの適切なアッセイによって機能性遺伝子の発現に関して試験される。
ここで使用する、「loxPが導入された(floxed)」動物は、遺伝子、導入遺伝子及び/又は標的構築物を受容した動物であり、この受容した遺伝子等の領域の部分が、後の時点での側面配列の制御された除去を可能にする配列特異的部位が側面配置されている。loxPが導入された動物は、ここでは、トランスジェニック動物のゲノム内の側面配列の除去を生じさせるCreリコンビナーゼの生成と共に、対象とする配列(選択マーカー遺伝子など)に側面配置されているloxP部位の挿入を用いる、公知のCreリコンビナーゼ系の使用によって例示される。
ここで使用する、「loxPが除去された(floxed−out)」動物は、側面配列(pGK−neoカセットのCre仲介性欠失(又は除去)を受けた例示動物など)が、上記の項で述べたように、除去された動物である。
ここで使用する、「系統」という用語は、ある創始動物の直接の子孫であり、これらの生殖細胞系に安定に組み込まれた少なくとも1つの導入遺伝子座を担持する動物を指す。
ここで使用する、「近交系」という用語は、全ての内在性遺伝子座において遺伝的に同一である動物を指す。当技術分野において使用するとき、近交系は、ある動物から別の動物への再現性、動物の間での細胞又は組織を移入する能力、及び内在性遺伝子の役割を特定するための規定された遺伝子試験を実施する能力を与えるために使用され得る。このような近交系は、微量注入のために使用されるマウスが樹立近交系株の成員である系統から開発され得る。
ここで使用する、「遺伝子型」という用語は、生物の遺伝子構成である。
ここで使用する、「表現型」という用語は、遺伝子型と環境の相互作用から生じる、細胞又は生物が有する形態的、生理的及び/又は生化学的形質の集積である。表現型のこの定義は、非天然導入遺伝子が動物に導入され、この遺伝子型プロフィールを変化させて、これにより動物内でのこの導入遺伝子の発現が1又はそれ以上の化合物に対する新しい薬理的選択性を生じさせ、このような選択性が対象導入遺伝子の機能的発現に基づく、生化学的形質を含む。このために、「表現型発現」という用語は、産物、例えばポリペプチド又はタンパク質の生産をもたらす、若しくは接合体又は生物の天然表現型の発現を変化させる、1又はそれ以上の導入遺伝子の発現に関する。
B1ブラジキニン「ヒト化」マウスの作製はこれまで報告されておらず、このようなトランスジェニック動物がインビボでヒトB1ブラジキニン受容体の化合物選択性を模倣することは明らかではなかった。本発明の最重要点は、このようなヒト化トランスジェニック動物がこのような表現型を有することを明らかにし、天然マウス形態のヌル表現型に対するこのヒト受容体の機能的発現を示して、これによりここで述べる様々なアッセイを、ヒトB1ブラジキニン受容体の調節因子を選択する上で有用なものにすることに関する。以下の実施例は説明として提示するものであり、様々な他の実施態様が当業者には明白であるので、以下は本発明の範囲に対する限定と解釈されるべきではない。
本発明は、天然型B1ブラジキニン受容体をコードする少なくとも1個の、好ましくは両方の対立遺伝子が非機能性になっており、非天然型B1ブラジキニン受容体タンパク質をコードする機能性導入遺伝子が標的動物の生殖細胞及び/又は体細胞に組み込まれている、非ヒト動物細胞に関する。このようなトランスジェニック非ヒト動物細胞の作製は、本発明のさらなる側面、すなわち、天然型B1ブラジキニン受容体をコードする少なくとも1個の、好ましくは両方の対立遺伝子が非機能性になっており、非天然型B1ブラジキニン受容体タンパク質をコードする機能性導入遺伝子で置換されている、非ヒトトランスジェニック胚、初期創始動物、同腹子、「loxPが導入された(floxed)」動物、並びにfloxed領域が除去されている動物(ここでは「loxPが除去された(floxed−out)」動物と称する)及びこれらのトランスジェニックマウスの続く全ての子孫及び後代を含むがこれらに限定されない、非ヒトトランスジェニック動物を可能にする。
このために、本発明は、天然型B1ブラジキニン受容体をコードする少なくとも1個の、好ましくは両方の対立遺伝子が、(1)非機能性になっており、及び(2)内在性マウスB1ブラジキニン受容体プロモーターフラグメントに作動可能に連結された、ヒト型B1ブラジキニン受容体タンパク質をコードする機能性導入遺伝子で置換されている、非ヒトトランスジェニック動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び/又は非ヒトトランスジェニック創始動物、同腹子、loxPが導入された動物、loxPが除去された動物並びにありとあらゆる続く子孫及び後代に関する。本発明のトランスジェニックマウスは、げっ歯動物(例えばラット又はマウス)B1ブラジキニン受容体と比較して、ヒトB1ブラジキニン受容体に選択的な化合物の分析を可能にする動物モデルを提供する。
本発明はさらに、天然マウス型B1ブラジキニン受容体をコードする少なくとも1個の、好ましくは両方の対立遺伝子が、(1)非機能性になっており、及び(2)ヒト型B1ブラジキニン受容体タンパク質をコードする機能性導入遺伝子で置換されている、マウス起源の非ヒトトランスジェニック動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び/又は非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。特定実施態様では、非天然ヒト化形態のB1ブラジキニン受容体は、内在性マウスB1ブラジキニンプロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結されている。ここで使用するとき、「作動可能に連結された」は、互いに対する方向が変化し得る2つのエレメントの間の機能的連結を表わすために使用される。この特定の場合、プロモーターは、遺伝子構築物内でコード配列から様々な距離に置かれるが、コード配列の発現を指令するために遺伝子のコード配列に作動可能に連結され得ることは当技術分野において了解されている。「プロモーター」という用語は当技術分野において周知であり、ここで使用するとき、遺伝子の転写を開始させるRNAポリメラーゼの結合に関わる核酸配列又はフラグメントを表わすことが意図されている。ここで使用するプロモーターはまた、場合により、どちらの方向にも及びRNA転写を開始させる領域から上流又は下流で機能する能力を備えた、真核生物プロモーターの利用を上昇させる付加的なシス作用性核酸領域(例えばエンハンサー配列)を含み得る。
本発明のさらなる実施態様は、ここで開示するトランスジェニック動物に由来する細胞及び/又は組織、並びにこのようなトランスジェニック動物を、対象とする細胞系を生産するためのソースとして使用することによって生成される細胞系に関する。したがって、本発明の1つの実施態様は、好ましくは天然B1ブラジキニン受容体タンパク質についてヌル表現型を担持し、機能性ヒトB1ブラジキニン受容体タンパク質をコードする導入遺伝子を含む、本発明のトランスジェニックマウスに由来する細胞、組織及び/又は細胞系に関する。したがって、本発明の1つの実施態様は、天然B1ブラジキニン受容体タンパク質に関して非機能性であり、機能性ヒトB1ブラジキニン受容体タンパク質をコードする導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス;並びに機能性ヒトB1ブラジキニン受容体を発現するが、天然B1ブラジキニン受容体に関してヌル表現型を有する、初期創始動物、同腹子、loxPが導入された動物及び続く全ての子孫及び後代マウスを含む、後にトランスジェニックマウスを生じさせる関連トランスジェニックマウス細胞及び胚に関する。本発明のトランスジェニックマウスは、げっ歯動物(例えばラット又はマウス)B1ブラジキニン受容体と比較して、ヒトB1ブラジキニン受容体に選択的な化合物の分析を可能にする動物モデルを提供する。本発明の1つの特定実施態様では、このような動物モデルを、胚幹細胞における相同的組換えによって天然マウスB1ブラジキニン受容体コード領域をヒトB1ブラジキニン受容体で置換することによって作製した。正しい相同的組換え事象を有する胚幹細胞を使用して、ヒトB1ブラジキニン受容体を発現するが、機能的量のマウスB1ブラジキニン受容体タンパク質を発現しないマウスを開発した。ここで、ホモ接合B1ブラジキニン受容体ヒト化マウスの薬理学的及び分子学的分析は、マウス型受容体ではなくヒト型受容体に伴う性質を示すことを明らかにする。
本発明の1つの特定実施態様は、ヒトB1ブラジキニン受容体コード配列が、胚幹(ES)細胞における相同的組換えを通した指定遺伝子ターゲティングによって類似マウスB1ブラジキニン受容体コード領域を置換している、非ヒトトランスジェニック動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び/又は非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。指向性構築物の構築、ESにおける指定相同的組換え及び選択方法に関する一般原則は当技術分野において周知であり、数多くのソース、例えばいずれも参照によりここに組み込まれる、(1)Bradleyら、1992,Bio/Technology 10:534;及び(2)Gene Targeting:A Practical Approach,第2版;Joyner,A.L.(編集)Oxford University Press,2000において検討し得る。本発明の実施例では、2つの標的構築物を図1A及び1Bに示すように作製し、ヒトB1ブラジキニン受容体コード配列をマウスB1ブラジキニン受容体コード配列領域にノックインするための戦略を説明する。同じく図2では、非lox導入動物(pGK−neoカセットを含む)を、Creリコンビナーゼを発現するマウス系統に交配することにより、陽性選択マーカーを発現するコード領域が除去された、loxPが除去された動物を作製できることを示す。簡単に述べると、指向性構築物は、マウスB1ブラジキニン受容体イントロン配列の下流にヒトB1ブラジキニン受容体コード配列及びヒト又はマウスのいずれかのB1ブラジキニン3’UTR領域を含む。指向性構築物の3’UTR領域内に、ネオマイシンに対する耐性を付与する遺伝子(例えばG418)などの陽性選択マーカーが存在する。このコード配列は、トランスジェニックマウスの生成前又は生成後の何らかの時点でこの陽性選択マーカーの除去を可能にする、2つのLoxP部位が側面配置されている。ヒトB1ブラジキニンコード配列がマウスゲノム内のマウスB1ブラジキニンコード領域を置換する指定相同的組換え事象を促進するために、5’調節及び3’UTR領域に相同な2つの延長領域内にこの領域全体をクローニングする。最後に、この指向性ベクターは、予測する相同的組換え事象が起こった場合に組み込まれると予想される領域の外側に存在する陰性選択マーカー(TK遺伝子など)を含み得る。本発明のこの例示部分では、240Neor ESクローンをさらなる分析のために単離した。240クローンのうちの80個から6個の「ノックイン」クローンをさらなる分析のために特定し、2個のノックインESクローンを、ヒトB1ブラジキニンノックイン構築物の生殖細胞系伝達を含むキメラマウスを作製するために、雌性マウスへの移植用の胎盤胞に注入するために選択した。サザンブロット分析(図3A)及びPCR遺伝子型分類(図3B)、並びにDNA塩基配列分析は、ヘテロ接合交配からの対立遺伝子伝達の予想されるパターンを示す。
ここで開示する例示ノックインマウスは、実施例6で示すように、マウスではなくヒト型の受容体の薬理学的性質を示す。このデータは、マウスB1ブラジキニン機能又はこの生物学的等価形態のヒトによる置換に関してホモ接合のトランスジェニックマウスは、トランスジェニック動物が、今やヒトB1ブラジキニン受容体の選択的薬理特性を付与するように有効量の機能性導入遺伝子産物を発現する、定義可能な表現型を示すことを明らかにする。この表現型は、ヒトB1受容体の選択的アンタゴニストの作用を示す機能アッセイによって詳述する。2つの系統のヒトB1ブラジキニンノックインマウスは、des−Arg10カリジン(DAK)の存在下でB1受容体に拮抗する、予測された応答を示した。野生型マウスでは、実施例6に示すように、胃底のDAK応答はヒトB1選択的アンタゴニスト(ここでは「化合物No.1」と称する)に対して非感受性であるが、系統13のホモ接合置換マウスに関する結果は、B1応答が化合物No.1によってブロックされ(Kb=0.27nM)、したがってヒト受容体の性質を有することを指示する。したがって、ここで例示するヒト化マウスを含むがこれらに限定されない、本発明のトランスジェニックマウスは、インビトロ及びインビボアッセイの両方においてヒト選択的化合物の効果を評価するために有用である。内在性アゴニストの添加又は刺激から生じる内在性アゴニストの自然放出は、ヒト受容体を活性化し得る。受容体の活性化に拮抗するヒト選択的化合物の能力は、これらの動物モデルにおける化合物の効果の測定を可能にする。このために、ここで述べるようなヒト化B1トランスジェニックモデルは、ペプチド、タンパク質又は非タンパク質様有機又は無機分子を含むが、必ずしもこれらに限定されない、受容体活性の何らかの潜在的調節因子(例えばアンタゴニスト又はアゴニスト)をスクリーニングするために有用である。本発明のトランスジェニック動物は、B1受容体の発現に関してヒト化されたげっ歯動物などの、非ヒト動物モデルにおいてヒト選択的化合物の効果を評価するための改善されたモデルを提供する。外因性アゴニストの添加又は刺激から生じる内在性アゴニストの自然放出は、ヒト受容体を活性化し得る。受容体の活性化に拮抗するヒト選択的化合物の能力は、化合物の効果の測定を可能にする。このようなトランスジェニック動物は、ヒトB1受容体を選択的に(又は非選択的に)調節する低分子量分子の能力を検討するために野生型試験動物を使用することに伴う歴史的な問題を克服する。このようなアッセイは、野生型B1ブラジキニン発現を上昇させる物質(細菌リポ多糖類など)による試験動物の処置を考慮させたが、B1ブラジキニン発現が上昇し、血液−脳関門の性質を変化させる範囲で、変動する結果を与えた。成功した場合でも、ヒトに選択的な化合物の性質を評価することはできなかった。この問題を回避するために、それぞれの種の薬理学的性質がヒトB1ブラジキニン受容体に一致する種を特定するための試みが為された。難点は、ある種が、考慮する1つの化学物質シリーズに関してはヒトと類似の性質を有し得るが、必ずしも全ての化学物質シリーズに関してではないということである。また、遺伝的にヒトに密接に関連する種(非ヒト霊長動物など)が使用できる。しかし、この選択肢には化合物を検定する処理量が低いという難点がある。
ヒト化B1Rマウスは、完全フロイントアジュバント、カラゲナン、ホルマリン、ストレプトゾトシン又はリポ多糖による処置などの、炎症性疼痛についての動物モデルにおける機械的、熱又は化学的刺激に対する疼痛応答に関して評価し得る。加えて、ナイーブヒト化B1マウスは、熱及び化学的有害刺激、例えばカプサイシンに対する応答性に関して試験し得る。最後に、神経障害性疼痛、例えば神経結紮についての動物モデルにおける機械的、熱又は化学的刺激に対する応答性を評価することができる。B1R置換マウスの表現型が野生型マウスに類似しており、B1Rノックアウトマウスとは異なる場合は、マウスにおいてヒトB1Rが発現され、キニン系活性化に対して応答する。ヒト化B1Rマウスがこれらの刺激に対して適切に応答する場合は、ヒトB1Rに選択的に作用する試験化合物の能力を試験することができる。ヒト選択的化合物はヒト化マウスにおいて活性であり、野生型マウスでは活性でない。また、ヒト化B1RマウスがB1Rノックアウトマウスに類似し、野生型マウスには類似しない表現型を有する場合、これは、ヒトB1Rアゴニスト、des−Arg10カリジン及びマウスB1Rアゴニスト、des−Arg9ブラジキニンが応答を誘発する能力が測定されることを示唆する。des−Arg10カリジンは応答を誘発するが、des−Arg9ブラジキニンは応答を誘発しない場合、マウスにおいて発現されるヒトB1Rは応答の潜在能を有するが、げっ歯動物において生成されるキニンはヒト受容体を活性化する上で無効である。他方で、des−Arg10カリジン又はdes−Arg9ブラジキニンのいずれもが、マウスB1Rを誘導する物質で処置した動物において活性でない場合、ヒトB1Rの誘導は低下し得る。
ヒトB1Rマウスの誘導の分析は、組織から作製したRNAを用いる定量的PCRによって分子レベルで検討し得る。これらのデータと野生型及びヘテロ接合マウスとの比較は、ヒトB1Rが適切な組織及びレベルで発現されるかどうかを判定する。この受容体の誘導は、炎症性疼痛又は神経障害性疼痛についての動物モデルで同様に観測することができる。
ヒト化B1Rマウスがキニン系の活性化に対して適切に応答すれば、様々な動物モデルへのヒト選択的化合物の効果を試験するのに役立つ。これらは、アテローム性動脈硬化症に関連する血管炎症、敗血症性ショック、気道炎症、関節炎及び癌における血管新生などの末梢炎症過程のモデルを含む。加えて、B1Rは神経炎症応答に関与すると考えられ、したがって、B1Rマウスは、アルツハイマー病モデル、脳水腫、てんかん及びパーキンソン病モデルにおいてヒト選択的B1R調節因子の効果を試験するのに有用である。したがって、このモデルは、B1Rに作用する化合物が有効であると考えられる治療適応症のスペクトルを評価する上で大きな価値を持つ潜在的可能性を有する。
本発明の1つの好ましい実施態様は、キメラマウスの作製及びヒトB1ブラジキニン受容体導入遺伝子についてホモ接合の動物を生産するための続く交配を可能にする、機能性形態のヒトB1ブラジキニン受容体をコードする導入遺伝子が標的動物の生殖細胞及び/又は体細胞に安定に組み込まれた、トランスジェニックげっ歯動物、特にトランスジェニックマウスの作製である。しかし、本発明は、トランスジェニックマウス、トランスジェニックラット、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックヤギ、チンパンジー、アカゲザル及びアフリカミドリザルなどのトランスジェニック非ヒト霊長動物、及びトランスジェニックウシなどの他の非ヒトトランスジェニック動物の作製を考慮する。トランスジェニックマウスが好ましく、ここで例示する。
B1ブラジキニン受容体について「ヒト化」された非ヒトトランスジェニック動物の作製における好ましい側面は、ここで例示するようなマウス遺伝子の指定置換、又はブラジキニン受容体マウスB1(−/−)バックグラウンドから単離して培養した標的ES細胞などの、マウスB1(−/−)バックグラウンドに対する標的導入遺伝子の可能な挿入である。したがって、ある実施態様では、内在性非ヒトB1対立遺伝子は、ヒトB1導入遺伝子の発現を妨げないために、内在的にコードされたマウスB1の発現を抑制する又は排除するように機能的に破壊する。ヌルバックグラウンドは、非機能性である変化した天然B1ブラジキニン遺伝子を有する動物、すなわちノックアウト、を生産することによって生成される。前記動物は、ヘテロ接合(すなわち二倍体ゲノムの一対の染色体の各々の上に異なる対立遺伝子を有する)、変化したB1ブラジキニン遺伝子に関してホモ接合(すなわち二倍体ゲノムの一対の染色体の各々の上に同一の対立遺伝子を有する)、ヘミ接合(すなわち二倍体ゲノムの一対の染色体の一方の上だけに存在する対立遺伝子を有する)、又はここで開示する例示的なヒト化B1ブラジキニンマウスなどの非天然B1ブラジキニン遺伝子についてホモ接合であり得る。導入遺伝子は、胚、胎児又は成体多能性幹細胞に組み込み得る(Capecchi,1991,Science 244:1288−1292、また、参照によりここに組み込まれる、米国特許第5,464,764号、同第5,487,992号、同第5,627,059号、同第5,631,153号及び同第6,204,061号も参照のこと)。導入遺伝子は、電気穿孔、微量注入及びリポフェクションを含む、当技術分野で公知の様々な方法によって胚幹細胞に導入することができる。導入遺伝子を担持する細胞を胚盤胞に注入することができ、次にこれを偽妊娠動物に移植する。代替的実施態様では、導入遺伝子標的胚幹細胞を受精卵又は桑実胚と同時インキュベートし、この後雌性動物に移植することができる。妊娠後、得られる動物はキメラ創始トランスジェニック動物である。創始動物は、ヒトB1ブラジキニン受容体に関してヘテロ接合のF1動物を生産するために野生型動物と交配する、さらなる実施態様において使用できる。さらなる実施態様では、これらのヘテロ接合動物を異種交配して、この体細胞及び生殖細胞がヒトB1ブラジキニン受容体コード配列についてホモ接合である成育可能なトランスジェニック胚を得ることができる。他の実施態様では、ヘテロ接合動物を使用した細胞系を生産することができる。例えば導入遺伝子を、標的ES細胞内の特定ゲノム部位に導入遺伝子を差し向けるために使用できる相同な腕(Cappecchi、前出参照)を有する、遺伝子ターゲティングベクター内に含め得る。このような異種DNAは、電気穿孔によって胚幹細胞に組み込むことができる。導入遺伝子を適切に担持する胚幹細胞を胚盤胞の内部細胞塊に注入する。キメラ動物を生産し、次にこれを異種交配して、全ての細胞が導入遺伝子を担持する動物を得る。以下で述べる微量注入と共に、ES細胞に基づく手法はトランスジェニックマウスを作製するための好ましい方法である。ここで例示するように、ES細胞における遺伝子ターゲティングによって遺伝子機能を破壊する一般的手順は、ES細胞ゲノム内の対応する染色体との相同的組換えを受けるように設計された指向性構築物を作製することである。指向性構築物は、典型的には、これらが陽性選択マーカーなどの付加的な配列を標的遺伝子のコードエレメントに挿入され、これによって標的遺伝子を機能的に破壊するように作製される。このために、本発明はまた、相同的組換えによって、第二の「ヒト化」指向性構築物をマウスゲノムの異なる領域(例えば参照によりここに組み込まれる米国特許第6,461,864号に述べられているRosa26遺伝子座などの、構成的発現を促進する領域)へと指向することを指令する、1個の遺伝子指向性構築物によって不活化された内在性B1遺伝子を有する非ヒト動物(例えば非霊長類哺乳動物)を生産する方法に関する。
本明細書全体を通じて述べるように、本発明の1つの側面は、天然B1ブラジキニン受容体のヌルバックグラウンド上に非天然遺伝子を含む導入遺伝子を有するトランスジェニック動物である。この方法は、その細胞が、機能性B1ブラジキニン受容体及び変化した天然B1ブラジキニン受容体をコードする天然遺伝子についてヘテロ接合である本発明のトランスジェニック動物を提供することを含む。これらの動物を、非天然B1ブラジキニン受容体遺伝子を含む導入遺伝子についてヘミ接合である本発明のトランスジェニック動物と交配して、変化した天然B1ブラジキニン受容体遺伝子についてヘテロ接合であり、及び非天然B1ブラジキニン受容体遺伝子についてヘミ接合である動物を得る。後者の動物を異種交配して、非天然B1ブラジキニン受容体遺伝子についてホモ接合又はヘミ接合であり、及び変化した天然B1ブラジキニン受容体遺伝子についてホモ接合又はヘテロ接合である動物を得る。特定実施態様では、前記方法の工程において生産されるいずれかの動物から細胞系を生産し、細胞を単離する。したがって、天然野生型遺伝子は、全能ES細胞(例えばここで述べるような)において選択的に不活化され、本発明のトランスジェニックマウスを作製するために使用される。特定の変化を染色体対立遺伝子に挿入するための標的相同的組換えを使用することにより、何らかの遺伝子領域を不活化する又は所望突然変異を生じさせるための手法が使用可能である(例えばPesqueroら、2000,Proc.Natl.Acad.Sci.97:8140−8145参照)。したがって、本発明は、B1ブラジキニン受容体タンパク質の産生欠損をもたらす破壊されたB1ブラジキニン受容体遺伝子についてヘテロ接合又はホモ接合であり、さらに内在性又は異種プロモーターのいずれかの制御下での非天然型ブラジキニンB1受容体遺伝子の付加のためのバックグラウンドとして役立つ、二倍体動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。前記細胞、胚及び非ヒトトランスジェニック動物は、B1ブラジキニン受容体対立遺伝子の少なくとも1個が、野生型レベル未満のB1ブラジキニン受容体活性が生じるように変異している、B1ブラジキニン受容体についての2個の染色体対立遺伝子を含む。破壊されたB1ブラジキニン受容体遺伝子についてホモ接合の二倍体マウス細胞、胚又は非ヒトトランスジェニックマウスは、野生型二倍体細胞と比較して、B1ブラジキニン受容体活性の少なくとも約50%から約100%の低下を示し得る。破壊されたB1ブラジキニン受容体遺伝子についてヘテロ接合の二倍体マウス細胞、胚又は非ヒトトランスジェニックマウスは、野生型二倍体細胞と比較して、B1ブラジキニン受容体活性の少なくとも約10%から約100%の低下を示し得る。
ここで使用する命名法及びトランスジェニックプロトコール、細胞培養、分子遺伝学及び分子生物学における実験手順は当技術分野において周知であり、一般に用いられている。組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、細胞培養及び導入遺伝子組込み(例えば電気穿孔、微量注入、リポフェクション)には標準手法を使用する。一般に酵素反応、オリゴヌクレオチド合成及び精製工程は製造者の仕様書に従って実施する。手法及び手順は、一般に、当技術分野における慣例的な方法及び本書類全体を通じて提供する様々な一般的参考文献に従って実施する。この中の手順は当技術分野において周知であると考えられ、読者の便宜のために提供するものである。この中に含まれる全ての情報は参照によりここに組み込まれる。
以下の実施例は説明として提示するものであり、様々な他の実施態様が当業者には明白であるので、以下は本発明の範囲に対する限定と解釈されるべきではない。例えば、(1)プラットフォームとしてマウスBK1機能を除去するためのブラジキニンB1ノックアウトの作製、及び次に一般的又は組織特異的プロモーターの制御下でRosa26遺伝子座に哺乳動物(例えばヒト)BK1Rを「ノックイン」すること、;(2)プラットフォームとしてマウスBK1機能を除去するためのブラジキニンB1ノックアウトの作製、及び次にBK1Rプロモーターの全ての必要なシス作用性領域を保持しながら、特定哺乳動物BK1R(例えばhBK1Rゲノムコード領域をマウスBAC上に組換えたヒトゲノムBAC又はマウスBAC)を含むBACを使用してそれぞれのBK1R遺伝子を「ノックイン」すること。この筋書きで、好ましい戦略は、ヒト遺伝子をマウスBACに組換え、これをB1ノックアウトに導入することである。やはり、当業者はブラジキニンB1及びB2受容体遺伝子と調節エレメントの近接性を考慮すべきである。B1プロモーターを含むBACクローンはまた、B2受容体遺伝子も含むと考えられる。当業者は、破壊される領域がB1受容体発現に影響を及ぼさないことが極めて確実であることを条件として、BACクローン内のB2遺伝子も破壊し得る。BAC導入遺伝子においてB2遺伝子を破壊しない場合、代替法は、ヒト化B1マウスBACをB1/B2二重ノックアウトに導入することである;(3)プラットフォームとしてマウスBK1機能を除去するためのブラジキニンB1ノックアウトの作製及び一般的又は組織特異的調節構築物を使用してそれぞれのBK1R cDNAを発現する、慣例的なトランスジェニック哺乳動物(例えばヒト)構築物の導入;及び(4)RNAiテクノロジーを使用して内在性マウスBK1Rをノックダウンすること及び次に(1)、(2)及び/又は(3)のアプローチを使用して対象導入遺伝子を導入すること、を含むがこれらに限定されない、他の方法を使用して本発明の「ヒト化」マウスを作製し得る。上述したように、このようなマウスを作製するための方法は当技術分野において公知であり、このような技術参考文献は参照によりここに組み込まれる。これらの付加的な方法の1つを実施するとき、当業者は、B2受容体遺伝子とB1プロモーターの間の近接性(B2受容体転写産物の終端とB1受容体導入遺伝子の開始点の間は10kb又はそれ以下)を理解することが重要である。したがって、気づかないうちにBK1R及び/又はBK2Rプロモーター領域の両方/いずれかについての調節機能を低下させることがないターゲティング戦略を選択することが重要である。
B1ブラジキニン「ヒト化」マウスの作製は報告されておらず、このようなトランスジェニック動物がヒトB1ブラジキニン受容体の化合物選択性をインビボで模倣することは明らかではなかった。本発明の最重要点は、このようなヒト化トランスジェニック動物がこのような表現型を有することを明らかにし、天然マウス形態のヌル表現型に対するこのヒト受容体の機能的発現を示して、これによりここで述べる様々なアッセイを、ヒトB1ブラジキニン受容体の調節因子を選択する上で有用なものにすることに関する。以下の実施例は説明として提示するものであり、様々な他の実施態様が当業者には明白であるので、以下は本発明の範囲に対する限定と解釈されるべきではない。
ヒトブラジキニンB1受容体置換構築物、pB1R−KI1の構築
染色体12番BACクローンRP23−158M23のGenBankアクセッション番号AC068459からのDNA配列を、ヒトB1受容体をマウスB1受容体で置換するための構築物の設計において使用した。この構築物は、プラスミドベクターへの前記DNAのクローニングを容易にするための制限エンドヌクレアーゼと共に個々の断片のオーバーラップエクステンションPCRによって構築する。構築物pB1R−KI1は、1.2kbの5’マウスゲノムDNA側面配置領域、ポリ(A)シグナルを含む3’非翻訳ゲノムDNAの126ヌクレオチドと1059bpのヒトB1受容体コード配列、Lox P部位が側面配置された、陽性選択のためのNeoカセット、7.4kbの3’マウスB1受容体側面配置DNA、及び陰性選択のためのTK遺伝子から成る。この構築物の作製において実施する工程を以下に述べる。図1Aは最終的なターゲティング構築物を示す。
染色体12番BACクローンRP23−158M23のGenBankアクセッション番号AC068459からのDNA配列を、ヒトB1受容体をマウスB1受容体で置換するための構築物の設計において使用した。この構築物は、プラスミドベクターへの前記DNAのクローニングを容易にするための制限エンドヌクレアーゼと共に個々の断片のオーバーラップエクステンションPCRによって構築する。構築物pB1R−KI1は、1.2kbの5’マウスゲノムDNA側面配置領域、ポリ(A)シグナルを含む3’非翻訳ゲノムDNAの126ヌクレオチドと1059bpのヒトB1受容体コード配列、Lox P部位が側面配置された、陽性選択のためのNeoカセット、7.4kbの3’マウスB1受容体側面配置DNA、及び陰性選択のためのTK遺伝子から成る。この構築物の作製において実施する工程を以下に述べる。図1Aは最終的なターゲティング構築物を示す。
工程1−マウスB1ゲノムDNA5’フランクの入手:1227ヌクレオチドの5’フランキング領域を、最初に正プライマー、MmHsB1F3 5’−CCTCCTACTATCCCTAAGAGCG−3’(配列番号1)及び逆プライマー、Hybrid Primer R 5’−GGGCCAGGATGATGCCATCCACAGGAACCTGA AATTGAC−3’(配列番号2)を用いて、マウスSV/J系統ゲノムDNAのPfuポリメラーゼを使用することによって入手した。Pfuポリメラーゼを使用するPCR条件は、50μlの容量で94℃、25秒間、60℃、25秒間及び72℃、2分間の25サイクルであった。pB1R−KI1の作製における全てのPCR工程に関して、PCR反応物の約1/10のアリコートをアガロースゲル電気泳動によって分析して、反応物の収率、産物の純度、及び産物が予想した大きさを示すかどうかを判定した。反応産物を精製し、一次反応物0.25μlを、プライマー、MmHsB1F1 5’−CCCT AAGAGCGAGTGAAAGG−3’(配列番号3)及び逆プライマー、Hybrid Primer R 5’−GGGCCAGGATGATGCCATCCACAGGAACCTGA AATTGAC−3’(配列番号2)を用いて一次反応と同じサイクリング条件で、25サイクルのPCRの2回目の半入れ子(semi−nested)ラウンドにおいて使用した。Hybrid Primer Rは、マウスB1受容体コード配列についての翻訳開始コドンのすぐ上流のマウスゲノムDNA配列に同一な24ヌクレオチド及び翻訳開始コドンを含む、ヒトB1受容体コード配列に同一な18ヌクレオチドを含む。
工程2−PCRオーバーラップエクステンションのためのヒトB1受容体コード配列の一部の入手:正プライマー、Hybridプライマー 5’GTCAATTTCAGGTTCCTGTGGATGGCATCATCCTGGCCC−3’(配列番号4)及び逆プライマー、MmHsB1R1 5’−AGGGAGCTGTTAGTGAAGGC−3’(配列番号5)を用いたPCRによるヒトB1受容体コード配列の一部を含む1083ヌクレオチドのPCRフラグメントを、前の項で述べた条件を用いて2回のPCRによって入手した。ブラジキニンB1受容体をコードするヒト遺伝子の単離及び特性決定は、参照によりここに組み込まれる、1998年1月27日発行の米国特許第5,712,111号に開示されている。HybridプライマーFは、マウスB1受容体コード配列についての翻訳開始コドンのすぐ上流のマウスゲノムDNA配列に同一な24ヌクレオチド及び翻訳開始コドンから始まる、ヒトB1受容体配列に同一な18ヌクレオチドを含む。
工程3−PCRによる工程1及び工程2の産物の連結:工程1からの1227ヌクレオチドの5’フランキング領域及び工程2からの1083ヌクレオチドのヒトB1受容体コード配列をQiaquickカラムで精製し、60μl溶出緩衝液中で溶出した。精製産物(各々1μl)を混合し、Pfuポリメラーゼと正プライマー、MmHsB1F1 5’−CCCT AAGAGCGAGTGAAAGG−3’(配列番号3)及び逆プライマー、MmHsB1R1 5’−AGGGAGCTGTTAGTGAAGGC−3’(配列番号5)を用いるPCR反応のための鋳型として使用した。PCR条件は、50μlの容量で、94℃、25秒間、60℃、25秒間及び72℃、3分間の30サイクルであった。生じた約2146ヌクレオチドの産物を精製し、TOPO blunt PCRクローニングベクターにサブクローニングした。いくつかのクローンを選択し、DNA塩基配列分析に供して、産物の配列を確認し、PCRの間に起こった可能性のある塩基変化を特定した。
工程4−内在性ポリ(A)シグナルを含むヒトB1受容体3’領域の入手:内在性ポリ(A)シグナルを含むヒトB1受容体3’非翻訳領域を、ヒトゲノムDNAを鋳型とし、正プライマー、HuB1pAF 5’−GGCCGAAGGATAGAAAGACC−3’(配列番号6)及び逆プライマー、HSB1pAR_NotI 5’−CGGCGGCCGCTCATCAAGTCCAGGGA TTAGG−3’(配列番号7)を用いるPCRによって入手した。TaqGoldポリメラーゼを使用したPCR条件は、50μlの容量で、94℃、25秒間、60℃、25秒間及び72℃、1分間の40サイクルであった。生じたPCRフラグメントをTopo Blunt PCRクローニングベクターにサブクローニングし、クローンのDNA塩基配列を確認した。この産物をヒトB1受容体コード配列の残りの部分に連結するために、ヒトB1受容体コード配列の818位のユニークEcoRI部位を利用した。クローン化したフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼEco RI及びNot IでTopo Bluntから切り出し、Eco RI及びNot Iで消化した哺乳動物発現ベクターpcDNA3内のヒトB1受容体と連結した。生じた構築物のクローンをDNA塩基配列分析によって確認した。
工程5−マウスB1 5’フランク/ヒトB1cdsとポリ(A)シグナルを含むヒトB1 3’領域の連結:工程3からのプラスミドDNA、ヒトB1受容体コード配列に連結したマウスB1受容体5’フランキングDNA、及び工程4からの内在性ポリAシグナルを含むヒトB1受容体3’非翻訳領域とヒトB1受容体コード配列をPCR反応において結合させた。正プライマー、MmHsB1F1 5’−CCCT AAGAGCGAGTGAAAGG−3’(配列番号3)及び逆プライマー、HSB1pAR−NheI 5’−GCGCTAGCTCATCAAGTCCAGGGATTAGG−3’(配列番号8)を使用させた。Pfu Turboポリメラーゼを使用するPCR条件は、50μlの容量で、94℃、25秒間、60℃、25秒間及び72℃、3分間の31サイクルであった。
工程6−工程5からのブラントxNheフラグメントのHpaIxNheI pBSNeoTKへの連結:約2.4kbの工程5からの産物を精製し、次に制限エンドヌクレアーゼNheIで消化した。次にこのフラグメントを、HpaI及びNheI消化したpBSNeoTKと連結した。連結物を細菌に形質転換し、プラスミドを作製して、所望制限パターンに関してスクリーニングした。
工程7−pBSNeoTK誘導体からのSalIフラグメントによるNotIのpBluescriptへの導入:4.4kbフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼNotI及びSalIでの消化によって工程6で得たプラスミド構築物から単離した。この4.4kbフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製し、NotI/SalI消化したpBlueScriptにサブクローニングした。
工程8−マウスB1受容体3’フランキングゲノムDNAの入手:7397ヌクレオチドの3’フランキング領域を、正プライマー、MR3fl_2f 5’gcgtcgacTGGTTATTCCTAC AGCAACGG−3’(配列番号9)及び逆プライマー、MR3Fl_1r 5’gcgtcgacTGTGAG ATGCACACGTCAGC−3’(配列番号10)を用いてSV/J系統からのマウスゲノムDNAからPCRによって入手した。生じたフラグメントを精製し、Topo Blunt PCRクローニングベクターにサブクローニングして、挿入物のDNA塩基配列を確認した。
工程9−マウスB1ゲノムDNA3’フランクの、SalI消化した工程7からのプラスミドDNAへのクローニング:工程8からの3’フランキング領域挿入物を有するクローンを制限エンドヌクレアーゼSalIで消化し、7.4kbフラグメントをアガロースゲル上で精製した。工程7からのプラスミドDNAをSalIで消化し、小エビアルカリホスファターゼで処理して、この後7.4kbの3’フランクと連結した。生じたクローンを、正しい方向に関して制限分析によってスクリーニングし、この後DNA塩基配列分析によって確認した。
工程10−チミジンキナーゼ(TK)遺伝子の付加:工程6で作製したプラスミド構築物を制限エンドヌクレアーゼClaI及びDraで消化した。消化したDNAをT4DNAポリメラーゼで処理して、ClaI部位に平滑末端を形成した。この平滑末端にNotIリンカーを連結し、この後DNAをQiaQuickカラムで精製した。精製したDNAを制限エンドヌクレアーゼNotIで消化し、アガロースゲル電気泳動によってフラグメントを分離した。約2153ヌクレオチドのバンドを切り出し、精製した。工程9からの構築物をNotI制限エンドヌクレアーゼで消化し、小エビアルカリホスファターゼで処理して、この後、TK遺伝子を含むNotI消化したフラグメントと連結した。連結混合物をXL−2Blue化学的コンピテント細胞に形質転換し、クローンを標準手法によって単離した。クローンを制限酵素地図作成によってスクリーニングし、正しいパターンを有するクローンを選択して、胚幹細胞に導入するDNAを提供するために大規模プラスミド生産を実施した。
ヒトブラジキニンB1受容体置換構築物2、pB1R−KI2の構築
染色体12番BACクローンRP23−158M23のGenBankアクセッション番号AC068459からのDNA配列を、ヒトB1受容体をマウスB1受容体で置換するために、pB1R−KI2の設計において使用した。この構築物は、プラスミドベクターへの前記DNAのクローニングを容易にするための制限エンドヌクレアーゼと共に個々の断片のオーバーラップエクステンションPCRによって構築する。構築物pB1R−KI2は、2.2kbの5’マウスゲノムDNAフランキング領域、1059bpのヒトB1受容体コード配列、内在性B1受容体ポリ(A)シグナルを含むマウスゲノムDNAの566ヌクレオチド、Lox P部位が側面配置された陽性選択のためのNeoカセット、3.6kbの3’マウスB1受容体側面配置DNA、及び陰性選択のためのTK遺伝子から成る。この構築物の作製において実施する工程を以下に述べる。図1Bは最終的なターゲティング構築物を示す。
染色体12番BACクローンRP23−158M23のGenBankアクセッション番号AC068459からのDNA配列を、ヒトB1受容体をマウスB1受容体で置換するために、pB1R−KI2の設計において使用した。この構築物は、プラスミドベクターへの前記DNAのクローニングを容易にするための制限エンドヌクレアーゼと共に個々の断片のオーバーラップエクステンションPCRによって構築する。構築物pB1R−KI2は、2.2kbの5’マウスゲノムDNAフランキング領域、1059bpのヒトB1受容体コード配列、内在性B1受容体ポリ(A)シグナルを含むマウスゲノムDNAの566ヌクレオチド、Lox P部位が側面配置された陽性選択のためのNeoカセット、3.6kbの3’マウスB1受容体側面配置DNA、及び陰性選択のためのTK遺伝子から成る。この構築物の作製において実施する工程を以下に述べる。図1Bは最終的なターゲティング構築物を示す。
工程1−マウスB1ゲノム5’フランキングDNAの入手:正プライマー、MmGB1_F5 5’−TTAGCCATGGT TCAGTCACG−3’(配列番号11)又はMmGB1_6F 5’−CACGACTCCTGTGAAT CAAGG−3’(配列番号12)と逆プライマー、MB1G_R 5’AAGGCTGTAGCTTCAGCGAG−3’(配列番号13)又はMB1G_R2 5’TTTCT GCTATGGTTAGGCGC−3’(配列番号14)を組み合わせて、マウスSvJ系統(〜50ng)からのPCRを実施した。PCR反応は、Expandポリメラーゼを用いて、50μlの容量で94℃、25秒間、60℃、25秒間及び68℃、3分間の35サイクルを実施した。2250又は2457ヌクレオチドの産物を精製した。pB1R−KI2の作製における全てのPCR工程に関して、PCR反応物の約1/10のアリコートをアガロースゲル電気泳動によって分析して、反応物の収率、産物の純度、及び産物が予想した大きさを示すかどうかを判定した。
工程2−内在性ポリ(A)シグナルを有するマウスB1受容体3’フランキングゲノムDNAの入手:正プライマー、MuBAC.1f 5’−AAGGATGGTGGAGTTGAACG−3’(配列番号15)及び逆プライマー、MuBAC.2r 5’−AAGCAGGTTGGATCCTACG−3’(配列番号16)を、マウスSV/JゲノムDNAの3177bpフラグメントのPCRのために使用した。PCR条件は、Expandポリメラーゼを用いて、50μlの容量で94℃、25秒間、60℃、25秒間及び68℃、9分間の40サイクルであった。PCR産物を精製した。
工程3−ヒトB1cdsとマウスB1受容体3’ゲノムDNAの連結:工程2からの精製PCR産物を、MrpA_OF 5’−CTTCCAACTTTTCTGGCGGAATTAAGTGATGCACCTCTTTATAA−3’(配列番号17)と逆プライマー、MrpA_1r 5’−gcgctagcCAAACTTGGCA AATCAGAGC−3’(配列番号18)の組合せを用いたPCR反応における鋳型として、598ヌクレオチドフラグメントを得た。正プライマー、MrpA_OFは、終結コドンを含む、ヒトB1受容体コード配列に同一の25ヌクレオチド、及びマウスB1受容体についての終結コドンを含む、マウスゲノムDNAに同一の22ヌクレオチドを含む。逆プライマー、MrpA_1rは、マウスゲノムDNAに同一の20ヌクレオチド及びNheI制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。ヒトB1受容体コード配列は、正プライマー、Hybrid Primer F 5’GTCAATTTCAGGTTCCTGTGGATGGCATCATCCTGGCCC−3’(配列番号4)及び逆プライマー、MrpA_OR 5’−TTATAAAGAGGTGCATCACTTAATTCCGCCAGAAAAGTTGGAAG−3’(配列番号19)を使用するPCRによって入手し、1102ヌクレオチドフラグメントを得た。正プライマー、Hybrid Primer Fは、コード配列の開始部のすぐ上流のマウスゲノムDNA配列に同一な24bp、及びこれに続く、翻訳開始コドンを含む、ヒトB1受容体に同一な18bpを含む。PCRのための鋳型は、pB1R−KI1構築の工程6からのヒトB1受容体コード配列を含むプラスミドDNAであった。PCR条件は、Pfuポリメラーゼを用いて、50μlの容量で94℃、25秒間、60℃、25秒間及び68℃、1分30秒間の20サイクルであった。精製したPCR産物(各々3ng)を、正プライマー、Hybrid Primer F 5’GTCAATTTCAGGTTCCTGTGGATGGCAT CATCCTGGCCC−3’(配列番号4)及び逆プライマー、MrpA_1r 5’−gcgctagcCAAACTTGGCAAATCAGAGC−3’(配列番号20)を使用する2回目のPCR反応において混合し、1657bpの産物を得た。PCR条件は、Pfuポリメラーゼを用いて50μlの容量で、94℃、25秒間、60℃、25秒間及び68℃、3分間の20サイクルであった。
工程4−ヒトB1受容体コード配列/マウスB1受容体 3’ゲノムDNAを有するマウスB1受容体5’ゲノムDNAのクローニング:工程1からの精製したPCR産物を、正プライマー、MmGB1_6F 5’−CACGACTCCTGTGAATCAAGG−3’(配列番号21)及び逆プライマー、Hybrid Primer R 5’−GGGCCAGGATGATGCCATCCACAGGAACCTGA AATTGAC−3’(配列番号2)で再び増幅した。この産物を精製し、工程3からの最終PCR産物と混合した。(各々4ng)正プライマー、MmGB1_6F 5’−CACGACTCCTGTGAATCAAGG−3’(配列番号21)及び逆プライマー、MrpA_1r 5’−gcgctagcCAAACTTGGCAAATCAGAGC−3’(配列番号20)を有するオーバーラップエクステンションPCRは、3852bpの産物をもたらした。PCR条件は、Pfuポリメラーゼを用いて50μlの容量で、94℃、25秒間、60℃、25秒間及び68℃、4分30秒間の18サイクルであった。
工程5−マウスB1受容体5’ゲノムDNA/ヒトB1受容体コード配列/マウスB1受容体 3’ゲノムDNAのpBSNeoTKへのクローニング:工程4からの3852ヌクレオチドの最終PCR産物を制限エンドヌクレアーゼNheIで消化した。ベクターpBSNeoTKを制限エンドヌクレアーゼHpaI及びNheIで消化し、NheI消化したPCR産物(このPCR産物の他方の末端は、Pfuポリメラーゼを使用する結果として平滑であり、したがってHpaIと適合性である)と連結した。生じたプラスミドのクローンを、制限酵素地図作成を用いて正しい方向に関してスクリーニングし、正しいクローンをDNA塩基配列分析によって分析して方向を確認し、PCR誘導の変異を特定した。
工程6−pBSNeoTK誘導体からのSalIフラグメントによるNotIのpBlueScriptへの導入:5.8kbフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼNotI及びSalIでの消化によって工程5からのプラスミド構築物から単離した。この5.8kbフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製し、NotI/SalI消化したpBluescriptにサブクローニングした。
工程7−マウスB1受容体3’フランキングゲノムDNAの入手:Expandポリメラーゼを使用したマウスSv/JゲノムDNAに関するPCRを、正プライマー、mg3_F1 5’−ggtcgacTGGTTATTCCTACAGCAACGG−3’(配列番号22)及び逆プライマー、mg3_R2 5’−ggtcgacTGAACCAAGGCCACACTCTC−3’(配列番号23)を用いて実施した。PCRは3628ヌクレオチドのフラグメントを生じ、これをTopoBluntにサブクローニングした。
工程8−マウスB1受容体3’フランキングゲノムDNAと工程6からのプラスミドDNAの連結:工程7からのPCR産物を、制限エンドヌクレアーゼSalIでTopoBluntから切り出し、アガロースゲル電気泳動によって精製した。工程6で生産したプラスミドをSalIで消化し、小エビアルカリホスファターゼで処理して、マウスB1受容体3’フランキングDNAを含むSalIフラグメントと連結した。クローンを単離し、マウスB1受容体フランキングDNAの正しい方向に関して制限酵素地図作成によってスクリーニングした。クローンのDNA塩基配列分析を実施して構築物を確認し、PCR誘導のエラーを特定した。
工程9−チミジンキナーゼ(TK)遺伝子の付加:実施例1の工程6で作製したプラスミド構築物を制限エンドヌクレアーゼClaI及びDraで消化した。消化したDNAをT4DNAポリメラーゼで処理して、ClaI部位に平滑末端を形成した。この平滑末端にNotIリンカーを連結し、この後DNAをQiaQuickカラムで精製した。精製したDNAを制限エンドヌクレアーゼNotIで消化し、アガロースゲル電気泳動によってフラグメントを分離した。約2153ヌクレオチドのバンドを切り出し、精製した。工程8からの構築物をNotI制限エンドヌクレアーゼで消化し、小エビアルカリホスファターゼで処理して、この後、TK遺伝子を含むNotI消化したフラグメントと連結した。連結混合物をXL−2Blue化学的コンピテント細胞に形質転換し、クローンを標準手法によって単離した。クローンを制限酵素地図作成によってスクリーニングし、正しいパターンを有するクローンを選択して、胚幹細胞に導入するDNAを提供するために大規模プラスミド生産を実施した。
ヒトブラジキニンB1受容体ノックイン(KI)マウスの作製
実験材料及び方法−ES細胞のトランスフェクション:V6.5マウスES細胞(Egganら、2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6209−6214)を、ミトマイシンC処理したネオマシン耐性初代支持線維芽細胞上に1,000単位/ml ESGROを含む15%FBSを添加したES細胞適格DMEM中で記述されているように(Joyner,A.L.(編集),2000,Gene Targeting:A Practical Approach(Oxford University Press,New York)培養した(全てのES細胞培養試薬はCell & Molecular Technologies,New Jersey,USAから入手した)。記述されているように(Joyner,A.L.(編集),2000,Gene Targeting:A Practical Approach(Oxford University Press,New York)NotI線状pB1R−KI2ターゲティングベクター20μg及び約6×106ES細胞を使用して電気穿孔を実施した。ネオマイシン耐性及びチミジンキナーゼ(TK)陰性コロニーの選択を、30分後及びこの後7日間にわたって250μg/mlゲネチシン(Invitrogen,California,USA)及び2μMガンシクロビール(Novagen,Wisconsin,USA)で実施した(ターゲティング工程の総説については図2参照)。ESコロニーを採取し、ゲノムDNAを記述されているように(Lairdら、1991,Nucleic Acids Res.19:4293)単離した。標的ESコロニーを、2個のプライマー(5’プライマー: 5’−CTCAACAAACCCTGGACATC−3’[配列番号24]及び3’プライマー: 5’−GAAGTCTGAGGAGA GAAGTG−3’[配列番号25])を用いたマウスゲノムDNAからのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって作製した1.1kbの5’外側プローブを使用して、EcoRIで消化したゲノムDNAのサザンブロット分析によって特定し、直接DNA塩基配列決定によって確認した。野生型及び標的対立遺伝子をそれぞれ8.2kb及び4.5kbと特定した。分析した80個のESクローンのうちで、6個を単一の相同的組換えノックイン対立遺伝子を担持する標的と特定し、特性決定した。
実験材料及び方法−ES細胞のトランスフェクション:V6.5マウスES細胞(Egganら、2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6209−6214)を、ミトマイシンC処理したネオマシン耐性初代支持線維芽細胞上に1,000単位/ml ESGROを含む15%FBSを添加したES細胞適格DMEM中で記述されているように(Joyner,A.L.(編集),2000,Gene Targeting:A Practical Approach(Oxford University Press,New York)培養した(全てのES細胞培養試薬はCell & Molecular Technologies,New Jersey,USAから入手した)。記述されているように(Joyner,A.L.(編集),2000,Gene Targeting:A Practical Approach(Oxford University Press,New York)NotI線状pB1R−KI2ターゲティングベクター20μg及び約6×106ES細胞を使用して電気穿孔を実施した。ネオマイシン耐性及びチミジンキナーゼ(TK)陰性コロニーの選択を、30分後及びこの後7日間にわたって250μg/mlゲネチシン(Invitrogen,California,USA)及び2μMガンシクロビール(Novagen,Wisconsin,USA)で実施した(ターゲティング工程の総説については図2参照)。ESコロニーを採取し、ゲノムDNAを記述されているように(Lairdら、1991,Nucleic Acids Res.19:4293)単離した。標的ESコロニーを、2個のプライマー(5’プライマー: 5’−CTCAACAAACCCTGGACATC−3’[配列番号24]及び3’プライマー: 5’−GAAGTCTGAGGAGA GAAGTG−3’[配列番号25])を用いたマウスゲノムDNAからのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって作製した1.1kbの5’外側プローブを使用して、EcoRIで消化したゲノムDNAのサザンブロット分析によって特定し、直接DNA塩基配列決定によって確認した。野生型及び標的対立遺伝子をそれぞれ8.2kb及び4.5kbと特定した。分析した80個のESクローンのうちで、6個を単一の相同的組換えノックイン対立遺伝子を担持する標的と特定し、特性決定した。
微量注入及び動物交配:ここで使用する全ての動物プロトコールは、Merck Research Laboratories Animal Care and Use Committee in West Point,PAによって承認された。ES細胞を、記述されているように(Joyner,A.L.(編集),2000,Gene Targeting:A Practical Approach(Oxford University Press,New York)C57BL/6(Taconic Farms,New York,USA)宿主胎盤胞に注入してキメラを作製し、この後、生殖細胞系伝達されたB1ノックイン対立遺伝子を担うマウスを誘導するためにC57BL/6マウスと交配した。記述されているように(Lairdら、同上)ゲノムDNAを単離し、上述したようにサザンブロット分析によって遺伝子型分類を実施した(図3A参照)。ノックイン対立遺伝子についてのヘテロ接合のマウスを交雑させ、ホモ接合ノックイン子孫を生産した。
結果−ヒトB1受容体ノックイン対立遺伝子を担持するマウスの作製:2つの独立した標的ESクローンを微量注入し、両方のクローンから、生殖細胞系を通してノックイン対立遺伝子を伝達されたキメラを誘導した。ノックイン対立遺伝子についてヘテロ接合のマウスは概ね正常であり、予想された割合で対立遺伝子を伝達した。ノックイン対立遺伝子についてホモ接合のマウスも、正常な成長と挙動を示す。
ヒトB1置換マウスについてのPCR遺伝子型分類アッセイ
野生型マウスB1受容体に特異的なプライマーセット及びヒトB1受容体に特異的な2番目のセットを開発した。正プライマー、MmB1f 5’−TTCTAACCAAAGCCAGCAGG−3’(配列番号26)及び逆プライマーMmB1r 5’−GGCAGAGGTCACTTCCAAAG−3’(配列番号27)を使用したマウス特異的反応は、マウスB1受容体染色体に特異的な319bp産物を生じる。正プライマー、HsB1f 5’−TCTTATTCCAGGTGCAAGCAG−3’(配列番号28)及び逆プライマーHsB1r 5’−GGGATGAAGATATTGGAGCAAGAC−3’(配列番号29)を使用したヒト特異的反応は、ヒトB1受容体コード配列が存在する染色体に特異的な203bpの産物を生じる(図3B)。TaqGoldポリメラーゼを使用する20μl容量でのPCR条件は、94℃で10分間、この後94℃、30秒間、60℃、30秒間及び72℃、1分間の35サイクルであった。プライマー濃度は反応当り10pmoleであり、マウスゲノムDNA鋳型は約50ng/反応、及びMgCl2は1.5mMの最終濃度である。遺伝子型分類アッセイは単一又は多重反応のいずれかで使用することができ、反応産物を2%NuSieveアガロースゲルで分析する。
野生型マウスB1受容体に特異的なプライマーセット及びヒトB1受容体に特異的な2番目のセットを開発した。正プライマー、MmB1f 5’−TTCTAACCAAAGCCAGCAGG−3’(配列番号26)及び逆プライマーMmB1r 5’−GGCAGAGGTCACTTCCAAAG−3’(配列番号27)を使用したマウス特異的反応は、マウスB1受容体染色体に特異的な319bp産物を生じる。正プライマー、HsB1f 5’−TCTTATTCCAGGTGCAAGCAG−3’(配列番号28)及び逆プライマーHsB1r 5’−GGGATGAAGATATTGGAGCAAGAC−3’(配列番号29)を使用したヒト特異的反応は、ヒトB1受容体コード配列が存在する染色体に特異的な203bpの産物を生じる(図3B)。TaqGoldポリメラーゼを使用する20μl容量でのPCR条件は、94℃で10分間、この後94℃、30秒間、60℃、30秒間及び72℃、1分間の35サイクルであった。プライマー濃度は反応当り10pmoleであり、マウスゲノムDNA鋳型は約50ng/反応、及びMgCl2は1.5mMの最終濃度である。遺伝子型分類アッセイは単一又は多重反応のいずれかで使用することができ、反応産物を2%NuSieveアガロースゲルで分析する。
ヒトB1置換染色体のDNA塩基配列分析
2匹の12系統及び13系統の置換マウスにおけるヒトB1受容体の完全性をDNA塩基配列分析によって確認した。正プライマー、Mf_1f 5’−CTGGTCTGCCATCATAACG−3’(配列番号30)及び逆プライマー、Mf_2r 5’−CAGGATCAGCCTAATCTCCG−3’(配列番号31)は、ヒトB1受容体コード配列の側面に位置するマウスゲノムDNA配列に基づき、1481ヌクレオチドの産物を生じる。50μlの反応容量でExpandポリメラーゼを使用してマウスゲノムDNA約100ngからフラグメントを増幅した。94℃で1分間のプレインキュベーション後、94℃、30秒間、60℃、30秒間及び70℃、1分30秒間の35サイクルを実施した。PCR産物をアガロースゲル上で評価し、次にQiaQuickカラムを使用して精製した。PCR産物を標準サイクルシーケンシングプロトコールによって配列決定し、ABI377で分析した。予想されたように、ホモ接合置換マウスからの産物は、側面位置マウスゲノムDNAの一部及び完全なヒトB1受容体コード配列を含んだ。加えて、マウス/ヒト接合部では、ヘテロ接合マウスのDNA配列が混合していた。これらのデータは、遺伝子ターゲティング及びヒトB1受容体コード配列の完全性を確認する。
2匹の12系統及び13系統の置換マウスにおけるヒトB1受容体の完全性をDNA塩基配列分析によって確認した。正プライマー、Mf_1f 5’−CTGGTCTGCCATCATAACG−3’(配列番号30)及び逆プライマー、Mf_2r 5’−CAGGATCAGCCTAATCTCCG−3’(配列番号31)は、ヒトB1受容体コード配列の側面に位置するマウスゲノムDNA配列に基づき、1481ヌクレオチドの産物を生じる。50μlの反応容量でExpandポリメラーゼを使用してマウスゲノムDNA約100ngからフラグメントを増幅した。94℃で1分間のプレインキュベーション後、94℃、30秒間、60℃、30秒間及び70℃、1分30秒間の35サイクルを実施した。PCR産物をアガロースゲル上で評価し、次にQiaQuickカラムを使用して精製した。PCR産物を標準サイクルシーケンシングプロトコールによって配列決定し、ABI377で分析した。予想されたように、ホモ接合置換マウスからの産物は、側面位置マウスゲノムDNAの一部及び完全なヒトB1受容体コード配列を含んだ。加えて、マウス/ヒト接合部では、ヘテロ接合マウスのDNA配列が混合していた。これらのデータは、遺伝子ターゲティング及びヒトB1受容体コード配列の完全性を確認する。
機能アッセイ:ホモ接合ヒトB1ノックアウト(KO)マウス
ヒトB1受容体遺伝子によるマウスB1遺伝子の置換についてホモ接合のマウス系統、13系統におけるB1受容体活性を評価するため、ホモ接合ヒトb1マウス胃底及び回腸組織に関して機能アッセイを2回実施した。選択的ヒトB1受容体化合物(化合物No.1)を、これらのノックインマウスからの受容体に対するアンタゴニスト活性に関して試験した。詳細には、2匹のホモ接合マウスをCO2で安楽死させた。これらの胃と回腸を切除し、胃底部分を大弯に沿って切開して半分に分割した。正中切開に沿って切断して約1mm×0.6cmの内側縦細片を得た。各々の胃から2つの胃底細片を得た。回腸は、盲腸から約4cmで切断した。各々の回腸を2つの断片に分け、全筋肉を使用した。組織を、クレブス緩衝液(118mM NaCl、4.7mM KCl、2.5mM CaCl2、1.2mM MgSO4、1.2mM KH2PO4、25mM NaHCO3及び11.1mMデキストロース)を含む5mlジャックホルダー(jacked holders)に入れ、37℃で5%CO2/95%O2を通気した。回腸の各々の断片を、絹糸4−0によって一方の端をガラス棒に、他方の端をStatham−Gould力変換器に結びつけた。各々の組織に1グラムの圧力を適用し、Hewlett−Packard7758レコーダーによって収縮を記録した。最大応答のために1時間の平衡終了時に全ての組織に50mM KClを与える。組織を20分ごとに1時間にわたって洗浄した。化合物No.1 30nMを、2つの処理回腸又は2つの処理胃底組織に添加し、1時間インキュベートした。DAK投与の30分前にMK−422 0.1μM及びチオルファン1μMを浴に添加する。プレインキュベーション後、DAK(10−10M−3×10−5M)の累積用量−反応を実施する。
ヒトB1受容体遺伝子によるマウスB1遺伝子の置換についてホモ接合のマウス系統、13系統におけるB1受容体活性を評価するため、ホモ接合ヒトb1マウス胃底及び回腸組織に関して機能アッセイを2回実施した。選択的ヒトB1受容体化合物(化合物No.1)を、これらのノックインマウスからの受容体に対するアンタゴニスト活性に関して試験した。詳細には、2匹のホモ接合マウスをCO2で安楽死させた。これらの胃と回腸を切除し、胃底部分を大弯に沿って切開して半分に分割した。正中切開に沿って切断して約1mm×0.6cmの内側縦細片を得た。各々の胃から2つの胃底細片を得た。回腸は、盲腸から約4cmで切断した。各々の回腸を2つの断片に分け、全筋肉を使用した。組織を、クレブス緩衝液(118mM NaCl、4.7mM KCl、2.5mM CaCl2、1.2mM MgSO4、1.2mM KH2PO4、25mM NaHCO3及び11.1mMデキストロース)を含む5mlジャックホルダー(jacked holders)に入れ、37℃で5%CO2/95%O2を通気した。回腸の各々の断片を、絹糸4−0によって一方の端をガラス棒に、他方の端をStatham−Gould力変換器に結びつけた。各々の組織に1グラムの圧力を適用し、Hewlett−Packard7758レコーダーによって収縮を記録した。最大応答のために1時間の平衡終了時に全ての組織に50mM KClを与える。組織を20分ごとに1時間にわたって洗浄した。化合物No.1 30nMを、2つの処理回腸又は2つの処理胃底組織に添加し、1時間インキュベートした。DAK投与の30分前にMK−422 0.1μM及びチオルファン1μMを浴に添加する。プレインキュベーション後、DAK(10−10M−3×10−5M)の累積用量−反応を実施する。
表1は、DAK及び化合物No.1に関する試料希釈を示す。DAKはクレブス溶液に希釈する。250μl中に25μlを添加することによって完全な対数希釈を実施する。化合物No.1はDMSOに希釈する。
結果−(実験No.1):系統No.13のホモ接合マウスは、野生型におけるように完全なDAK収縮応答を示した。しかし、これらのマウスは、ラットB1活性の代わりにヒトブラジキニンB1受容体活性を示した。化合物No.1についてのKbは、胃底では0.27nM、回腸では0.11nMであった。これらのデータは結合データ(hb1=0.04nM、ラットb1=591nM)と一致する。代表的データを以下の表2並びに図4A及び4Bに示す。
結果−(実験No.2):系統No.13のホモ接合マウスは、野生型におけるように完全なDAK収縮応答を示した。実験No.1におけるように、これらのB1受容体ヒト化マウスは、ラットB1活性の代わりにヒトブラジキニンB1を示した。化合物No.1についてのKbは、胃底では0.23nM、回腸では0.21nMであった。これらのデータは結合データ(hb1=0.04nM、ラットb1=591nM)と一致する。代表的データを以下の表3並びに図5に示す。
Creを介した組換えによるpGKneoの除去
ヒトB1R受容体についてヘテロ接合又はホモ接合であるマウスをRosa−SA−Creマウスに交配した。ヒトB1R受容体についてヘテロ接合であるCre陽性子孫を異種交配した。ヒトB1R+/−、Cre+異系交配の子孫からゲノムDNAを作製し、PCRによってヒトB1R遺伝子に連結されたpGKneoの存在に関して試験した。Neo遺伝子の存在を調べるために、neo遺伝子内に位置する正プライマー、Neo2f 5’−CTGACCGCTTCCTCCT GACCGCTTCCTCGTGCTTTAC−3’(配列番号32)を、マウスゲノムDNAに位置する逆プライマー、Neo2r 5’−CGGAGGACA GAGTAATCGG−3’(配列番号33)と組み合わせて使用した。TaqGoldポリメラーゼを使用したPCR条件は、マウスゲノムDNA50ngを鋳型として、95℃、10分間に続いて、95℃、30秒間、60℃、30秒間及び72℃、1分間の35サイクルであった。937ヌクレオチドの産物の増幅は、Neo遺伝子の存在の指標である。
ヒトB1R受容体についてヘテロ接合又はホモ接合であるマウスをRosa−SA−Creマウスに交配した。ヒトB1R受容体についてヘテロ接合であるCre陽性子孫を異種交配した。ヒトB1R+/−、Cre+異系交配の子孫からゲノムDNAを作製し、PCRによってヒトB1R遺伝子に連結されたpGKneoの存在に関して試験した。Neo遺伝子の存在を調べるために、neo遺伝子内に位置する正プライマー、Neo2f 5’−CTGACCGCTTCCTCCT GACCGCTTCCTCGTGCTTTAC−3’(配列番号32)を、マウスゲノムDNAに位置する逆プライマー、Neo2r 5’−CGGAGGACA GAGTAATCGG−3’(配列番号33)と組み合わせて使用した。TaqGoldポリメラーゼを使用したPCR条件は、マウスゲノムDNA50ngを鋳型として、95℃、10分間に続いて、95℃、30秒間、60℃、30秒間及び72℃、1分間の35サイクルであった。937ヌクレオチドの産物の増幅は、Neo遺伝子の存在の指標である。
第二プライマーセットによるPCRは、Creを介したpGKneoカセットの欠失の指標であった。正プライマー、Flox1f 5’−GAGGACAGAGTAATCGG−3’(配列番号34)及び逆プライマー、Flox1r 5’−GCTCCCTGTTCCGAGTTAGG GCTCCCTGTTCCGAGTTAGG−3’(配列番号35)を、マウスゲノムDNA50ng及びTaqGoldポリメラーゼによる以下の条件を用いたPCR反応において使用した:95℃、10分間に続いて、95℃、30秒間、60℃、30秒間及び72℃、1分間の35サイクル。Flox1f×Flox1rプライマーセットは、野生型マウス染色体から579ヌクレオチド産物を増幅し、Creを介したpGKneo遺伝子の欠失を受けた染色体から688ヌクレオチド産物を増幅する。pGKneoを含む染色体の増幅は、2447ヌクレオチド産物を生じる。アッセイにおいて使用したPCR条件では、この産物は効率よく増幅されない。野生型マウス染色体と、pGKneoのCre仲介性欠失を受けたヒトB1受容体コード配列を含む染色体との間の109ヌクレオチドの差は、34ヌクレオチドのLoxP部位の存在及びマウスゲノムDNAを最初の構築物に導入するために使用したクローニング部位とLoxP部位の間に位置する配列から生じる。この差は、ホモ接合野生型染色体、579ヌクレオチドの単一バンド、ヘテロ接合マウス、579及び688ヌクレオチドの2つのバンド、及び、ホモ接合ヒト化B1R置換マウス、688ヌクレオチドの単一バンド、についての効率的な診断パターンとして役立つ。
ブラジキニンB1受容体mRNAレベルの定量
TaqManテクノロジー(Applied Biosystems,Foster City CA)を使用したリアルタイムPCRによってブラジキニンB1受容体mRNAの量を測定した。マウスB1受容体mRNAを検出するのに特異的なプライマーセット及びプローブを開発した。マウス特異的正プライマーは 5’−AGCTGTGAG CTCTTTGTTTTTCTGT−3’(配列番号36)の配列を有し、逆プライマーは 5−TTTGGTTAGAAGGCTGTAGCTTCA−3’(配列番号37)の配列を有しており、このプライマーセットは、イントロン/エクソン境界部に及ぶ82塩基対の産物を増幅する。マウス特異的産物をプローブ 6FAM−GGACGCCATCCACAGGA ACCCA−TAMRA(配列番号38)で検出する。ヒトB1受容体mRNAに特異的なプライマー/プローブセットは、1個のエクソン内のマウス5’UTRと2番目のエクソン上に存在するヒトB1受容体コード配列との間のハイブリッドである転写産物を検出する。ヒトブラジキニンB1受容体ヌクレオチド配列の存在の指標である、このキメラ転写産物は、イントロン/エクソン境界部に及ぶ82塩基対の産物を増幅する正プライマー 5’−GCTGAAGCTGTGAGCTCTTTGTT−3’(配列番号39)及び逆プライマー 5’−GGTTGGAGGATTGGAGCTCTAGA−3’(配列番号40)で検出する。マウス/ヒト産物は蛍光プローブ 6FAM−TGCCATCCACAGGAACCCAGACAG−TAMRA(配列番号41)で検出する。
TaqManテクノロジー(Applied Biosystems,Foster City CA)を使用したリアルタイムPCRによってブラジキニンB1受容体mRNAの量を測定した。マウスB1受容体mRNAを検出するのに特異的なプライマーセット及びプローブを開発した。マウス特異的正プライマーは 5’−AGCTGTGAG CTCTTTGTTTTTCTGT−3’(配列番号36)の配列を有し、逆プライマーは 5−TTTGGTTAGAAGGCTGTAGCTTCA−3’(配列番号37)の配列を有しており、このプライマーセットは、イントロン/エクソン境界部に及ぶ82塩基対の産物を増幅する。マウス特異的産物をプローブ 6FAM−GGACGCCATCCACAGGA ACCCA−TAMRA(配列番号38)で検出する。ヒトB1受容体mRNAに特異的なプライマー/プローブセットは、1個のエクソン内のマウス5’UTRと2番目のエクソン上に存在するヒトB1受容体コード配列との間のハイブリッドである転写産物を検出する。ヒトブラジキニンB1受容体ヌクレオチド配列の存在の指標である、このキメラ転写産物は、イントロン/エクソン境界部に及ぶ82塩基対の産物を増幅する正プライマー 5’−GCTGAAGCTGTGAGCTCTTTGTT−3’(配列番号39)及び逆プライマー 5’−GGTTGGAGGATTGGAGCTCTAGA−3’(配列番号40)で検出する。マウス/ヒト産物は蛍光プローブ 6FAM−TGCCATCCACAGGAACCCAGACAG−TAMRA(配列番号41)で検出する。
各々の遺伝子型、すなわち、実施例4で述べたようにマウスゲノムDNAの遺伝子型分析によって判定した、マウスB1受容体DNA配列について野生型、ヒトB1受容体DNA配列についてヘテロ接合又はホモ接合の3匹のマウスから組織を切除した。試料採取した組織は、脳、脊髄、回腸、胃、心臓、肺及び脾臓を含んだ。加えて、B1受容体機能を試験するために、実施例6で述べたB1受容体mRNAの誘導を生じさせるようにインキュベートしておいた組織から、回腸及び胃底からの試料を入手した。これらの試料を誘導胃底又は誘導回腸と称した。ポリトロンを使用してQiagen Buffer RLTにおいて組織を均質化した。Qiagen RNeasyミディプレップキットを使用し、製造者(USA−Qiagen,Valencia CA)の述べているプロトコールに従って全RNAを調製した。Qiagen Oligotex手順を用いて全RNAをさらにmRNAに精製した。mRNA試料をAgilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies Inc.,Palo Alto,CA)で分析して、純度と量を判定した。このmRNAを使用して、製造者の指示に従ってInvitrogen Superscript Choice cDNA Synthesis System(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)でcDNAを作製した。cDNAを精製し、Qiaquickスピンカラム(USA−Qiagen,Valencia CA)を用いて濃縮して、1ng/μlに希釈した後、TaqMan分析に供した。
TaqMan反応は、1ng/μlのcDNA5μl及び最終濃度200nMのプライマープローブ混合物5μlから成った。プライマー/プローブ混合物は、マウス特異的正及び逆プライマーとマウス特異的プローブ又はマウス/ヒトハイブリッド特異的正及び逆プライマーとヒト特異的プローブから成った。全ての反応について、最終濃度200nMのGAPDHプライマー/プローブセット(Applied Biosystems,Foster City,CA)を内部対照としてプライマー/プローブ混合物に含めた。2X Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems,Foster City,CA)10μlで総反応容量を20μlとした。反応は、96穴様式で、Applied Biosystems PRISM 7000 Sequence Detection Systemにおいて、又は384穴様式で、Applied Biosystems PRISM 7900HT Sequence Detection Systemにおいて実施した。各々の試料を3回試験した。各々の実験の一部として、げっ歯動物GAPDHを含むプラスミドDNA及びマウスB1受容体又はキメラマウス/ヒトB1受容体のいずれかを含むプラスミドDNAの、各々の穴に付き100,000コピーから出発する10倍連続希釈を実施することにより、各々のプライマー/プローブセットに関する5点標準曲線を作成した。まず適切な転写産物についての標準曲線に基準化し、次に各々の穴で検出されたGAPDHの量に基準化することによってデータを解析した。各遺伝子型についての3匹の個々の動物の結果を合わせて、図6AからCに示すように平均値と標準誤差をグラフで表わした。これらの結果は、マウス/ヒトB1受容体転写産物の発現のパターン及びレベルが内在性マウスB1受容体のものに類似することを示す。さらに、マウス/ヒトハイブリッド転写産物が内在性マウスB1受容体と同様にして誘導できることは明らかである。
Claims (12)
- ヒトブラジキニンB1受容体タンパク質又はこの機能的等価物をコードする導入遺伝子の少なくとも1コピーを含むゲノムを有し、及びトランスジェニック動物がヒト化B1ブラジキニン受容体結合プロフィールを示すように、天然型ブラジキニンB1受容体に関してヌル表現型を示す、非ヒトトランスジェニック動物。
- 前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項1に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
- ヒトブラジキニンB1受容体タンパク質又はこの部分をコードする前記導入遺伝子が、天然型ブラジキニンB1をコードする遺伝子を直接置換する、請求項1に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
- 前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項3に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
- ヒトブラジキニンB1受容体タンパク質又はこの部分をコードする前記導入遺伝子が、天然型ブラジキニンB1をコードする遺伝子を直接置換し、及び前記ヒトB1ブラジキニン遺伝子が天然ブラジキニンB1受容体タンパク質に作動可能に融合している、請求項3に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
- 前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項5に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
- 少なくとも、ヒトブラジキニンB1受容体タンパク質又はこの機能的等価物をコードするヌクレオチド配列及びloxPが導入された(floxed)マーカー遺伝子を含む遺伝子ターゲティング構築物を含み、及びトランスジェニック動物がヒト化B1ブラジキニン受容体結合プロフィールを示すように、天然型ブラジキニンB1受容体に関してヌル表現型を示す、非ヒトトランスジェニック動物。
- 前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項7に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
- 前記遺伝子ターゲティング構築物を、天然型ブラジキニンB1をコードする遺伝子を直接置換するようにトランスジェニック動物のゲノムに挿入した、請求項7に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
- 前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項9に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
- 前記loxPが導入された遺伝子が除去された、請求項8に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
- 前記loxPが導入された遺伝子が除去された、請求項10に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
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