JP2010524500A - Ｐｐｐ１ｒ１２ｃ座への標的化組込み - Google Patents
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Abstract
例えば、関心対象のポリペプチドの発現のための、外因性配列のヒトPPP1R12C 座への標的化組込みのための方法および組成物を本明細書で開示する。
Description
本開示は、ゲノム工学、特にヒトPPP1R12C（「p84」または「AAVS1」） 遺伝子への標的化組込みの分野に属する。
とりわけ多くのゲノムの完全なヌクレオチド配列の決定に鑑みて、ゲノム生物学における主な関心対象の領域は、関心対象の1つまたは複数の配列の所望の箇所への標的化組込みである。相同組換えという自然現象を利用することによって培養細胞中のゲノム配列を改変する試みがなされている。例えば、Capecchi (1989) Science 244:1288-1292；米国特許第6,528,313号および第6,528,314号を参照されたい。ポリヌクレオチドが、改変されるべき配列を含むゲノム領域に対する十分な相同性を有する場合、ポリヌクレオチドの配列の一部または全部が相同組換えによってゲノム配列に置き換わることが可能である。しかしながら、このような状況下での相同組み換えの頻度は極めて低い。その上、配列相同性を欠くゲノムの箇所での外因性ポリヌクレオチドの挿入の頻度は、標的化相同組換えの頻度を数桁上回る。Sedivy and Joyner (1992) Gene Targeting, Oxford University Press, Oxford。
外因性ポリヌクレオチドに対する相同性を持つゲノムの領域中で、ゲノムDNAに2本鎖破損を導入するにより、この部位での相同組換えが培養細胞中で数千倍刺激されることが示されている。Rouet et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:8096-8106; Choulika et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:1968-1973; Donoho et al. (1998) Mol. Cell. Biol. 18:4070-4078。Johnson et al. (2001) Biochem. Soc. Trans. 29:196-201；およびYanez et al. (1998) Gene Therapy 5:149-159も参照されたい。これらの方法において、所望のゲノム領域でのDNA切断は、メガヌクレアーゼ（すなわち、その認識配列があまりにも大きいために関心対象のゲノム中に生じないか、または稀にしか生じないエンドヌクレアーゼ）の認識部位を所望のゲノム領域に挿入することによって遂行された。
ゲノムDNAの標的化切断のための様々な方法および組成物が記載されている。そのような標的化切断事象を用いて、例えば、標的化突然変異生成を誘導し、細胞DNA配列の標的化欠失を誘導し、所定の染色体座での標的化組換えを促進することができる。例えば、米国特許公報第20030232410号；第20050208489号；第20050026157号；第20050064474号；および第20060188987号、ならびに国際公報国際公開第2007/014275号を参照されたく、その開示は、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により組み入れられる。
しかしながら、ゲノム内の安全港座、特に、非必須の内在性PPP1R12C（p84および／またはAAVS1としても知られる）遺伝子座への安定な標的化組込みのための組成物および方法に対する必要性が依然としてある。
本開示は、細胞内のPPP1R12C 遺伝子に組み込まれた外因性核酸配列の1つまたは複数の産物（すなわち、タンパク質またはRNA分子）を発現させるための方法および組成物を提供する。外因性核酸配列は、例えば、1つもしくは複数の遺伝子もしくはcDNA分子、または任意の種類のコード配列もしくは非コード配列だけでなく、1つまたは複数の制御エレメント（例えば、プロモーター）も含むことができる。さらに、外因性核酸配列は、1つまたは複数のRNA分子（例えば、小さいヘアピンRNA（shRNA）、阻害RNA（RNAi）、マイクロRNA（miRNA）など）を産生してもよい。外因性核酸配列は、第19番染色体にある、PPP1R12C遺伝子内の細胞のゲノムにそれが組み込まれるように細胞内に導入される。
外因性核酸配列のPPP1R12C遺伝子への組込みをPPP1R12C遺伝子内のゲノムの標的化2本鎖切断によって促進する。PPP1R12C内の配列に結合するように人工的に改変された、ジンクフィンガーDNA結合ドメイン、および切断ドメインまたは切断半ドメインを含む融合タンパク質の使用によって切断をPPP1R12C遺伝子に標的化する。そのような切断によって、切断部位または切断部位近くでの外因性ポリヌクレオチド配列の組込みが刺激される。外因性配列の組込みは、相同性依存的な機構および相同性非依存的な機構の両方を通じて進行することができる。
1つの局面において、PPP1R12C遺伝子内の標的部位に結合する人工ジンクフィンガータンパク質、例えば、表1に示された認識ヘリックスを含む人工ジンクフィンガータンパク質のいずれかを本明細書において開示する。ある態様において、人工ジンクフィンガータンパク質は、N末端からC末端にかけてF1〜F4と表わされ、かつF1〜F4が以下の配列：F1: YNWHLQR（配列番号：16）；F2: RSDHLTT（配列番号：8）；F3: HNYARDC（配列番号：9）；およびF4: QNSTRIG（配列番号：15）を含むことを特徴とする、4つのジンクフィンガーを含む。その他の態様において、人工ジンクフィンガータンパク質は、F1〜F4と表わされた4つのジンクフィンガーを含み、その場合、F1はQSSNLAR（配列番号：3）を含み；F2はRTDYLVD（配列番号：11）を含み；F3はYNTHLTR（配列番号：12）を含み；かつF4はQGYNLAG（配列番号：13）を含む。
またさらなる態様において、本開示は、表1に示されたZFNの認識ヘリックスを有する2つまたは3つのジンクフィンガーを含む人工ジンクフィンガータンパク質を含む。例えば、N末端からC末端にかけてF1〜F4と表わされ、タンパク質が、表1に示されたZFNのいずれかのF1、F2、およびF3；またはF1、F3、F4；またはF1、F2、F4；またはF2、F3、およびF4；またはF1およびF2；またはF1およびF3；またはF1およびF4；またはF2およびF3；またはF2およびF4；またはF3およびF4を含むことを特徴とし、かつ残りのフィンガーが、表1に示された個々のフィンガー配列とは異なる配列を含むことを特徴とする、4つのジンクフィンガーを含む人工ジンクフィンガータンパク質を本明細書において提供する。本明細書に記載されたジンクフィンガータンパク質はいずれも、機能ドメイン、例えば、切断ドメインまたは切断半ドメインをさらに含んでもよい（例えば、切断半ドメインは、FokIまたはStsIなどのIIS型制限エンドヌクレアーゼ由来である）。
別の局面において、外因性核酸配列の産物を細胞内で発現させるための方法であって、（a）第1のジンクフィンガー結合ドメインが細胞のゲノムのPPP1R12C遺伝子内の第1の標的部位に結合するように人工的に改変されていることを特徴とする、第1のジンクフィンガー結合ドメインおよび第1の切断半ドメインを含む、第1の融合タンパク質を細胞内で発現させる工程；（b）第2のジンクフィンガー結合ドメインが細胞のゲノムのPPP1R12C遺伝子内の第2の標的部位に結合することを特徴とし、第2の標的部位が第1の標的部位と異なることを特徴とする、第2のジンクフィンガー結合ドメインおよび第2の切断半ドメインを含む、第2の融合タンパク質を細胞内で発現させる工程；ならびに（c）外因性核酸配列およびPPP1R12C遺伝子内の第1の配列に相同である第1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと細胞を接触させる工程を含み；細胞のゲノムがPPP1R12C遺伝子内で切断され、それによりPPP1R12C遺伝子内の細胞のゲノムへの外因性配列の組込みおよび外因性配列の産物の発現がもたらされるように第1の融合タンパク質の第1の標的部位への結合、および第2の融合タンパク質の第2の標的部位への結合が切断半ドメインの位置を定めることを特徴とする方法を本明細書において開示する。
外因性核酸配列は、1つもしくは複数のプロモーターを含むかもしくは含まない、1つまたは複数の機能ポリペプチドをコードする配列（例えば、cDNA）であってもよいし、かつ／または1つもしくは複数のRNA配列を（例えば、1つもしくは複数のshRNA発現カセットを介して）産生してもよい。ある態様において、核酸配列は、抗体、抗原、酵素、成長因子、受容体（細胞表面または核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーター、上記のいずれかの機能断片、および上記の組み合わせをコードするプロモーターレス配列を含む。その後、組み込まれた配列の発現を、内在性PPP1R12C プロモーターによって駆動される転写によって確実にする。その他の態様において、カセットの第1の構成要素が上記のようなプロモーターレス配列と、それに続く転写終結配列を含み、第2の配列が自律的発現カセットをコードする、「タンデム」カセットをこのやり方でPPP1R12C座に組み込む。
ある態様において、ポリヌクレオチドは、PPP1R12C遺伝子内の第2の配列に相同である第2のヌクレオチド配列をさらに含む。第2のヌクレオチド配列は、PPP1R12C遺伝子内の第2の配列と同一であってもよい。さらに、第1および第2のヌクレオチド配列を含む態様において、第1のヌクレオチド配列は、PPP1R12C遺伝子内の第1の配列と同一であってもよく、第2のヌクレオチド配列は、PPP1R12C遺伝子内の第2の配列と相同ではあるが、同一でなくてもよい。本明細書に記載された方法のいずれかにおいて、第1および第2のヌクレオチド配列は外因性配列に隣接する。
ある態様において、ポリヌクレオチドはプラスミドである。その他の態様において、ポリヌクレオチドは線状DNA分子である。
別の局面において、外因性配列を細胞のゲノム中のPPP1R12C遺伝子に組み込むための方法であって、（a）第1のジンクフィンガー結合ドメインが細胞のゲノム中のPPP1R12C座の第1の標的部位に結合するように人工的に改変されていることを特徴とする、第1のジンクフィンガー結合ドメインおよび第1の切断半ドメインを含む、第1の融合タンパク質を細胞内で発現させる工程；（b）第2のジンクフィンガー結合ドメインが細胞のゲノム中のPPP1R12C座の第2の標的部位に結合することを特徴とし、第2の標的部位が第1の標的部位と異なることを特徴とする、第2のジンクフィンガー結合ドメインおよび第2の切断半ドメインを含む、第2の融合タンパク質を細胞内で発現させる工程；ならびに（c）外因性核酸配列を含むポリヌクレオチドと細胞を接触させる工程を含み；細胞のゲノムがPPP1R12C座内で切断され、それによりPPP1R12C座の内部の細胞のゲノムへの相同性依存的な外因性配列の組込みおよび外因性配列の産物の発現がもたらされるように第1の融合タンパク質の第1の標的部位への結合、および第2の融合タンパク質の第2の標的部位への結合が切断半ドメインの位置を定めることを特徴とする方法を本明細書において開示する。ある態様において、機能ポリペプチドをコードする外因性配列をPPP1R12C遺伝子に挿入する。
本明細書に記載された方法のいずれかにおいて、第1および第2の切断半ドメインは、IIS型制限エンドヌクレアーゼ、例えば、FokIまたはStsI由来である。さらに、本明細書に記載された方法のいずれかにおいて、融合タンパク質のうちの少なくとも1つは、例えば、切断半ドメインの必須のヘテロ二量体が形成されるように、切断半ドメインの二量体化境界面のアミノ酸配列の改変を含んでもよい。
本明細書に記載された方法のいずれかにおいて、細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞であることができる。さらに、細胞を細胞周期のG2期で停止させてもよい。さらに、本明細書に記載された方法のいずれかにおいて、第1および／または第2のジンクフィンガー結合ドメインは、表1に示された認識ヘリックスを有するジンクフィンガータンパク質を含んでもよい（例えば、ZFNの対を使用する方法はZFN 15556およびZFN 15590を含む）。
したがって、本主題は、以下の態様を含むが、これらに限定されない：
1．外因性核酸配列の産物を細胞内で発現させるための方法であって、
（a）第1のジンクフィンガー結合ドメインが細胞のゲノム中のPPP1R12C遺伝子内の第1の標的部位に結合するように人工的に改変されていることを特徴とする、第1のジンクフィンガー結合ドメインおよび第1の切断半ドメインを含む、第1の融合タンパク質を細胞内で発現させる工程；
（b）第2のジンクフィンガー結合ドメインが細胞のゲノム中のPPP1R12C遺伝子内の第2の標的部位に結合することを特徴とし、第2の標的部位が第1の標的部位と異なることを特徴とする、第2のジンクフィンガー結合ドメインおよび第2の切断半ドメインを含む、第2の融合タンパク質を細胞内で発現させる工程；ならびに
（c）外因性核酸配列を含むポリヌクレオチドと細胞を接触させる工程
を含み、
細胞のゲノムがPPP1R12C遺伝子内で切断され、それによりPPP1R12C遺伝子内の細胞のゲノムへの外因性配列の相同性依存的な組込みおよび外因性配列の産物の発現がもたらされるように第1の融合タンパク質の第1の標的部位への結合、および第2の融合タンパク質の第2の標的部位への結合が切断半ドメインの位置を定めることを特徴とする方法。
1．外因性核酸配列の産物を細胞内で発現させるための方法であって、
（a）第1のジンクフィンガー結合ドメインが細胞のゲノム中のPPP1R12C遺伝子内の第1の標的部位に結合するように人工的に改変されていることを特徴とする、第1のジンクフィンガー結合ドメインおよび第1の切断半ドメインを含む、第1の融合タンパク質を細胞内で発現させる工程；
（b）第2のジンクフィンガー結合ドメインが細胞のゲノム中のPPP1R12C遺伝子内の第2の標的部位に結合することを特徴とし、第2の標的部位が第1の標的部位と異なることを特徴とする、第2のジンクフィンガー結合ドメインおよび第2の切断半ドメインを含む、第2の融合タンパク質を細胞内で発現させる工程；ならびに
（c）外因性核酸配列を含むポリヌクレオチドと細胞を接触させる工程
を含み、
細胞のゲノムがPPP1R12C遺伝子内で切断され、それによりPPP1R12C遺伝子内の細胞のゲノムへの外因性配列の相同性依存的な組込みおよび外因性配列の産物の発現がもたらされるように第1の融合タンパク質の第1の標的部位への結合、および第2の融合タンパク質の第2の標的部位への結合が切断半ドメインの位置を定めることを特徴とする方法。
2．外因性核酸配列がポリペプチドをコードすることを特徴とする、1記載の方法。
3．ポリペプチドが、抗体、抗原、酵素、成長因子、受容体（細胞表面または核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーター、その機能断片、およびその組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする、2記載の方法。
4．外因性配列がプロモーターをさらに含むことを特徴とする、1〜3のいずれか一項記載の方法。
5．ポリヌクレオチドが、PPP1R12C遺伝子内の第1の配列と相同ではあるが、同一ではない第1のヌクレオチド配列をさらに含むことを特徴とする、4記載の方法。
3．ポリペプチドが、抗体、抗原、酵素、成長因子、受容体（細胞表面または核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーター、その機能断片、およびその組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする、2記載の方法。
4．外因性配列がプロモーターをさらに含むことを特徴とする、1〜3のいずれか一項記載の方法。
5．ポリヌクレオチドが、PPP1R12C遺伝子内の第1の配列と相同ではあるが、同一ではない第1のヌクレオチド配列をさらに含むことを特徴とする、4記載の方法。
6．ポリヌクレオチドが、PPP1R12C遺伝子内の第2の配列と相同ではあるが、同一ではない第2のヌクレオチド配列をさらに含むことを特徴とする、5記載の方法。
7．第1および第2のヌクレオチド配列が外因性配列に隣接することを特徴とする、6記載の方法。
8．ポリヌクレオチドがプラスミドであることを特徴とする、1〜7のいずれか一項記載の方法。
9．ポリヌクレオチドが線状DNA分子であることを特徴とする、1記載の方法。
10．第1および第2の切断半ドメインがIIS型制限エンドヌクレアーゼ由来であることを特徴とする、1〜9のいずれか一項記載の方法。
7．第1および第2のヌクレオチド配列が外因性配列に隣接することを特徴とする、6記載の方法。
8．ポリヌクレオチドがプラスミドであることを特徴とする、1〜7のいずれか一項記載の方法。
9．ポリヌクレオチドが線状DNA分子であることを特徴とする、1記載の方法。
10．第1および第2の切断半ドメインがIIS型制限エンドヌクレアーゼ由来であることを特徴とする、1〜9のいずれか一項記載の方法。
11．IIS型制限エンドヌクレアーゼが、FokIおよびStsIからなる群より選択されることを特徴とする、10記載の方法。
12．細胞を細胞周期のG2期で停止させることを特徴とする、1〜12のいずれか一項記載の方法。
13．融合タンパク質のうちの少なくとも1つが、切断半ドメインの二量体化境界面のアミノ酸配列の改変を含むことを特徴とする、1〜11のいずれか一項記載の方法。
14．細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする、1〜13のいずれか一項記載の方法。
15．細胞がヒト細胞であることを特徴とする、14記載の方法。
12．細胞を細胞周期のG2期で停止させることを特徴とする、1〜12のいずれか一項記載の方法。
13．融合タンパク質のうちの少なくとも1つが、切断半ドメインの二量体化境界面のアミノ酸配列の改変を含むことを特徴とする、1〜11のいずれか一項記載の方法。
14．細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする、1〜13のいずれか一項記載の方法。
15．細胞がヒト細胞であることを特徴とする、14記載の方法。
本開示は、第19番染色体上にある、ヒトPPP1R12C遺伝子への標的化組込み（TI）のための方法および組成物に関する。PPP1R12Cは、アデノ随伴ウイルスのヒトゲノムへの組込みの主要部位であり、病態生理学的事象がアデノ随伴ウイルス感染に関連付けられたことはこれまでに一度もなく（Warrington & Herzog (2006) Hum Genet 119:571-603）、PPP1R12C機能の損失がヒト細胞によって許容され、この座を標的化組込みのための「安全港」とみなすことができるということを示している。その上、PPP1R12C遺伝子は広範に転写されている。したがって、挿入された（ドナー）配列はプロモーターレスであることができ、組み込まれたオープンリーディングフレームの転写は、内在性遺伝子プロモーターから生じることができ、それによってドナーのランダムな組込みおよび／またはドナー上にあるプロモーターによる内在性遺伝子の誤った活性化による重篤な有害事象の可能性が下がる（例えば、Kohn et al. Nat Rev Cancer 3:477-488を参照されたい）。
標的化切断およびPPP1R12C遺伝子への組換えに有用な組成物としては、切断ドメイン（または切断半ドメイン）およびジンクフィンガー結合ドメインを含む融合タンパク質、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびにポリペプチドおよびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの組み合わせが含まれる。ジンクフィンガー結合ドメインは、1つまたは複数のジンクフィンガー（例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、またはそれより多くのジンクフィンガー）を含むことができ、PPP1R12C内の任意の配列に結合するように人工的に改変することができる。そのような1つ（または複数）の融合タンパク質の細胞内での存在によって、1つ（または複数）の融合タンパク質のその（それらの）結合部位への結合および内在性PPP1R12C遺伝子内での切断が生じると考えられる。
概要
本発明の実施だけでなく、本明細書に開示された組成物の調製および使用もまた、そうでないように示さない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および解析、コンピュータ化学、細胞培養、組換えDNA、ならびに当業者の範囲内であるような関連分野における従来の技術を利用する。これらの技術は文献中で完全に説明されている。例えば、Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989および第3版, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987および定期的最新版; METHODS IN ENZYMOLOGYシリーズ, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, 第3版, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, “Chromatin” (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe編), Academic Press, San Diego, 1999;ならびにMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, “Chromatin Protocols” (P.B. Becker編) Humana Press, Totowa, 1999を参照されたい。
本発明の実施だけでなく、本明細書に開示された組成物の調製および使用もまた、そうでないように示さない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および解析、コンピュータ化学、細胞培養、組換えDNA、ならびに当業者の範囲内であるような関連分野における従来の技術を利用する。これらの技術は文献中で完全に説明されている。例えば、Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989および第3版, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987および定期的最新版; METHODS IN ENZYMOLOGYシリーズ, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, 第3版, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, “Chromatin” (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe編), Academic Press, San Diego, 1999;ならびにMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, “Chromatin Protocols” (P.B. Becker編) Humana Press, Totowa, 1999を参照されたい。
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に用いられ、線状かまたは環状の立体構造で、かつ1本鎖かまたは2本鎖の形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であるとみなされるべきではない。本用語は、天然のヌクレオチドと同様に、塩基、糖、および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）が修飾されているヌクレオチドの公知の類似体も包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成特異性を有する；すなわち、Aの類似体はTと塩基対形成すると考えられる。
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に用いられ、線状かまたは環状の立体構造で、かつ1本鎖かまたは2本鎖の形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であるとみなされるべきではない。本用語は、天然のヌクレオチドと同様に、塩基、糖、および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）が修飾されているヌクレオチドの公知の類似体も包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成特異性を有する；すなわち、Aの類似体はTと塩基対形成すると考えられる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すよう互換的に用いられる。本用語は、1つまたは複数のアミノ酸が対応する天然のアミノ酸の化学類似体または修飾された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
「結合」とは、配列特異的な、非共有結合による巨大分子間の（例えば、タンパク質と核酸の間の）相互作用を指す。全体としての相互作用が配列特異的である限りにおいて、結合相互作用の全ての構成要素が配列特異的である（例えば、DNA骨格中のリン酸残基と接触する）必要はない。そのような相互作用は通常、10-6 M-1またはそれより低い解離定数（Kd）を特徴とする。「親和性」とは、結合の強さを指し：増大した結合親和性はより低いKdと相関する。
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合で結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、DNA分子（DNA結合タンパク質）、RNA分子（RNA結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それは（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成するよう）それ自身に結合することができ、かつ／またはそれは1つもしくは複数の異なるタンパク質の1つもしくは複数の分子に結合することができる。結合タンパク質は、1種類よりも多くの結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、DNA結合、RNA結合、およびタンパク質結合活性を有する。
「ジンクフィンガーDNA結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、その構造が亜鉛イオンの配位によって安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、1つまたは複数のジンクフィンガーを介して配列特異的な様式でDNAに結合するタンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーDNA結合タンパク質という用語は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはZFPと略される。
ジンクフィンガー結合ドメインを、所定のヌクレオチド配列に結合するように人工的に改変することができる。ジンクフィンガータンパク質を人工的に改変するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたジンクフィンガータンパク質は、天然には生じないタンパク質であり、その設計／組成は原理的には合理的基準によりもたらされる。設計のための合理的基準は、置換規則ならびに既存のZFP設計および結合データの情報を保管するデータベース中の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第6,140,081号；第6,453,242号；および第6,534,261号を参照されたく；例えば、国際公開第98/53058号；国際公開第98/53059号；国際公開第98/53060号；国際公開第02/016536号；国際公開第03/016496号も参照されたい。
「選択された」ジンクフィンガータンパク質は、その産生が、主として、ファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択などの実験的過程よりもたらされる、天然には見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第5,789,538号；米国特許第5,925,523号；米国特許第6,007,988号；米国特許第6,013,453号；米国特許第6,200,759；国際公開第95/19431号；国際公開第96/06166号；国際公開第98/53057号；国際公開第98/54311号；国際公開第00/27878号；国際公開第01/60970号；国際公開第01/88197号；および国際公開第02/099084号を参照されたい。
「配列」という用語は、DNAかまたはRNAであることができ；線状か、環状か、または分岐状であることができ、かつ1本鎖かまたは2本鎖のいずれかであることができる、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。「ドナー配列」という用語は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、長さ2〜10,000ヌクレオチド（またはその間もしくはそれを上回る任意の整数値）、好ましくは長さ約100〜1,000ヌクレオチド（またはその間の任意の整数）、より好ましくは長さ約200〜500ヌクレオチドであることができる。
「相同であって、同一ではない配列」とは、第2の配列とのある程度の配列同一性を共有するが、その配列が第2の配列のそれとは同一ではない第1の配列を指す。例えば、突然変異体遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、突然変異体遺伝子の配列と相同であって、同一ではない。ある態様において、2つの配列間の相同性の程度は、通常の細胞機構を利用した、その間での相同組換えを可能にするのに十分である。2つの相同であって、同一ではない配列は、任意の長さであることができ、それらの非相同性の程度は、（例えば、標的化相同組換えによるゲノム点突然変異の修正のために）1ヌクレオチドと同じぐらい小さいものであることができるし、または（例えば、染色体の所定の異所性部位での遺伝子の挿入のために）10もしくはそれより大きいキロベースと同じぐらい大きいものであることができる。相同であって、同一ではない配列を含む2つのポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば、20〜10,000のヌクレオチドまたはヌクレオチド対の外因性ポリヌクレオチド（すなわち、ドナーポリヌクレオチド）を用いることができる。
核酸およびアミノ酸の配列同一性を決定するための技術は、当技術分野において公知である。典型的には、そのような技術は、遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列を決定することおよび／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列を第2のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列と比較することを含む。ゲノム配列をこのやり方で決定および比較することもできる。一般に、同一性とは、それぞれ、2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチド対応またはアミノ酸対アミノ酸対応を指す。
2つまたはそれより多くの配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）を、それらのパーセント同一性を決定することによって比較することができる。2つの配列のパーセント同一性とは、核酸配列であれアミノ酸配列であれ、より短い配列の長さで除し、100を乗じた2つのアラインされた配列間の正確な一致の数である。核酸配列用の近似アラインメントは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981) の局所相同性アルゴリズムにより提供されている。Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff編, 補遺5. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAによって開発され、Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)によって標準化されたスコア化マトリックスを用いることによって、このアルゴリズムをアミノ酸配列に適用することができる。
配列のパーセント同一性を決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実行は、「BestFit」ユーティリティーアプリケーションのGenetics Computer Group (Madison, WI) により提供されている。この方法のためのデフォルトパラメーターは、Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, 第8版 (1995)（Genetics Computer Group, Madison, WIから入手可能）に記載されている。本開示の文脈におけるパーセント同一性を確立する好ましい方法は、University of Edinburghにより著作権が取得され、John F. CollinsおよびShane S. Sturrokにより開発され、IntelliGenetics社 (Mountain View, CA) により配布されたプログラムのMPSRCHパッケージを用いることである。デフォルトパラメーターをスコア表（例えば、ギャップオープンペナルティ12、ギャップ伸張ペナルティ1、およびギャップ6）に用いる場合、このパッケージ一式から、Smith-Watermanアルゴリズムを利用することができる。作成されたデータから、「マッチ」値は配列同一性を反映する。
配列間の同一性または類似性のパーセントを計算するためのその他の好適なプログラムが一般に当技術分野において公知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターを用いて使用される、BLASTである。例えば、BLASTNおよびBLASTPは、以下のデフォルトパラメーターを用いて使用されることができる：遺伝暗号 = 標準；フィルター = なし；鎖 = 両方；カットオフ = 60；予想 = 10；マトリックス = BLOSUM62；記載 = 50配列；選別 = 高スコア；データベース = 非重複、GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS翻訳 + Swissタンパク質 + Spupdate + PIR。
これらのプログラムの詳細を、インターネット上で見出すことができる。本明細書において記載された配列に関して、望ましい程度の配列同一性の範囲は、およそ80％〜100％、およびその間の任意の整数値である。典型的には、配列間のパーセント同一性は、少なくとも70〜75％、好ましくは80〜82％、より好ましくは85〜90％、一層より好ましくは92％、さらにより好ましくは95％、および最も好ましくは98％の配列同一性である。
あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度を、相同な領域間の安定な2重鎖の形成を可能にする条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、それに続く1本鎖特異的ヌクレアーゼを用いた消化、および消化された断片のサイズ決定によって決定することができる。上記の方法を用いて決定した場合に、配列が、規定の長さの分子に対する少なくとも約70％〜75％、好ましくは80％〜82％、より好ましくは85％〜90％、一層より好ましくは92％、さらにより好ましくは95％、および最も好ましくは98％の配列同一性を示す場合、2つの核酸、または2つのポリペプチド配列は互いに実質的に相同である。
本明細書において使用される場合、実質的に相同とは、特定のDNAまたはポリペプチドの配列に対する完全な同一性を示す配列も指す。実質的に相同であるDNA配列を、例えば、その特定の系のために規定されたような、ストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当業者の範囲内である。例えば、Sambrook et al., 前記; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, 編者B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Pressを参照されたい。
2つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションを以下のように決定することができる。2つの核酸分子間の配列同一性の程度は、そのような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強さに影響を及ぼす。部分的に同一な核酸配列は、少なくとも部分的には完全に同一な配列の標的分子へのハイブリダイゼーションを阻害すると考えられる。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害を、当技術分野において周知であるハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザン（DNA）ブロット、ノザン（RNA）ブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.参照）を用いて評価することができる。
そのようなアッセイを、様々に異なる程度の選択性を用いて、例えば、低いストリンジェンシーから高いストリンジェンシーまで様々に異なる条件を用いて実行することができる。低いストリンジェンシーの条件を利用する場合、非特異的結合事象の非存在下では、2次プローブが標的にハイブリダイズしないように、部分的な程度の配列同一性さえも欠く2次プローブ（例えば、標的分子との約30％未満の配列同一性を有するプローブ）を用いて、非特異的結合が存在しないことを評価することができる。
ハイブリダイゼーションに基づく検出系を利用する場合、参照核酸配列に相補的である核酸プローブが選抜され、その後適当な条件の選択によって、プローブおよび参照配列が互いに選択的にハイブリダイズするか、または結合し、2重鎖分子を形成する。適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照配列に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子は、典型的には、選択された核酸プローブの配列との少なくともおよそ70％の配列同一性を有する長さ少なくとも約10〜14ヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、選択された核酸プローブの配列との約90〜95％よりも大きい配列同一性を有する長さ少なくとも約10〜14ヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする。プローブおよび参照配列が特定の程度の配列同一性を有する場合、プローブ／参照配列ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件を当技術分野において知られているように決定することができる（例えば、Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, B.D. Hames and S.J. Higgins編, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Pressを参照されたい）。
ハイブリダイゼーションのための条件は当業者に周知である。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーとは、ハイブリダイゼーション条件がミスマッチのあるヌクレオチドを含むハイブリッドの形成に不利に働き、より高いストリンジェンシーがミスマッチのあるハイブリッドに対するより低い認容性と相関する程度を指す。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす因子は当業者に周知であり、温度、pH、イオン強度、ならびに例えば、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシドなどの有機溶媒の濃度を含むが、これらに限定されない。当業者には公知であるように、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、より高い温度、より低いイオン強度、およびより低い溶媒濃度によって増大する。
ハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件に関して、数々の同等の条件を利用して、例えば、以下の因子：配列の長さおよび性質、様々な配列の塩基組成、塩およびその他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中にブロッキング薬剤（例えば、デキストラン硫酸、およびポリエチレングリコール）が存在することまたは存在しないこと、ハイブリダイゼーションの反応温度および時間パラメーターだけでなく、洗浄条件を変えることを変えることによっても、特定のストリンジェンシーを確立することができるということが周知である。特定の組のハイブリダイゼーション条件の選択は、当技術分野における以下の標準的な方法に従って選択される（例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい）。
「組換え」とは、2つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の過程を指す。本開示の目的のために、「相同組換え（HR）」とは、例えば、細胞内の2本鎖切断の修復の間に起こるような交換の特殊化した形態を指す。この過程は、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子を用いて「標的」分子（すなわち、2本鎖切断を受ける分子）の修復の鋳型とし、かつそれがドナーから標的への遺伝情報の転移をもたらすので、「非交差遺伝子変換」または「短区域遺伝子変換」として様々に知られている。任意の特定の理論に束縛されることを望まないが、そのような転移は、切断された標的とドナーの間に形成されるヘテロ2重鎖DNAのミスマッチ修正、および／またはドナーを用いて標的の一部になると考えられる遺伝情報を再合成する、「合成依存的な鎖アニーリング」、および／または関連過程を含むことができる。そのような特殊化したHRは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチドに組み入れられるように標的分子の配列の改変をもたらす。
「切断」とは、DNA分子の共有結合骨格の破損を指す。切断を、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的な加水分解を含むが、これらに限定されない、様々な方法で開始させることができる。1本鎖切断および2本鎖切断の両方が可能であり、2本鎖切断は、2つの別個の1本鎖切断事象の結果として生じることができる。DNA切断は、平滑末端かまたは互い違い末端のいずれかの産生をもたらすことができる。ある態様において、融合ポリペプチドを標的化2本鎖DNA切断に用いる。
「切断ドメイン」は、DNA切断のための触媒活性を保有する1つまたは複数のポリペプチド配列を含む。切断ドメインは1本のポリペプチド鎖に含まれることができるし、または切断活性は2つ（もしくはそれより多く）のポリペプチドの会合から生じることができる。
「切断半ドメイン」は、（同一であるか異なるかのいずれかの）第2のポリペプチドと共に、切断活性（好ましくは2本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造体である。細胞クロマチンは、核酸、主にDNA、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含む、タンパク質を含む。真核生物の細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームコアが、各々2つのヒストンH2A、H2B、H3、およびH4を含む8量体と会合したおよそ150塩基対のDNAを含み；かつ（生物によって可変の長さの）リンカーDNAがヌクレオソームコアの間に伸長していることを特徴とする、ヌクレオソームの形で存在する。ヒストンH1という分子は、通常リンカーDNAと会合している。本開示の目的のために、「クロマチン」という用語は、原核生物および真核生物両方の、全ての種類の細胞核タンパク質を包含することが意味される。細胞クロマチンは、染色体クロマチンおよびエピソーム性クロマチンの両方を含む。
「染色体」は、細胞のゲノムの全部または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、その核型によって特徴付けられており、それは細胞のゲノムを含む全ての染色体の集合体である。細胞のゲノムは1つまたは複数の染色体を含むことができる。
「エピソーム」は、複製する核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の部分ではない核酸を含むその他の構造体である。エピソームの例として、プラスミドおよびある種のウイルスゲノムが含まれる。
「接近可能領域」は、核酸中に存在する標的部位が標的部位を認識する外因性分子により結合されることができる細胞クロマチン内の部位である。任意の特定の理論に束縛されることを望まないが、接近可能領域はヌクレオソーム構造にパッケージングされていない領域であると考えられている。接近可能領域の個別の構造を、多くの場合、化学的および酵素的なプローブ、例えば、ヌクレアーゼに対するその感受性によって検出することができる。
「標的部位」または「標的配列」は、結合するための十分な条件が存在するならば、結合分子が結合すると考えられる、核酸の一部を規定する核酸配列である。例えば、5'-GAATTC-3'という配列は、Eco RI制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。
「外因性」分子は、通常は細胞に存在しないが、1つまたは複数の遺伝学的方法、生化学的方法、またはその他の方法によって細胞内に導入することができる分子である。「通常細胞に存在すること」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の期間中のみに存在する分子は、成体の筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、熱ショックを受けていない細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、任意のポリペプチドもしくはその断片のコード配列、機能不全の内在性分子の機能型、または正常に機能する内在性分子の機能不全型を含むことができる。さらに、外因性分子は、宿主細胞内の内在性遺伝子のオルソログである別の種由来のコード配列を含むことができる。
外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアル化学反応過程によって生成されるものなどの、小分子か、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の修飾された誘導体、もしくは上記の分子の1つもしくは複数を含む任意の複合体などの巨大分子であることができる。核酸は、DNAおよびRNAを含み、1本鎖かまたは2本鎖であることができ；線状か、分岐状か、または環状であることができ；かつ任意の長さであることができる。
核酸には、2重鎖を形成することができる核酸だけでなく、3重鎖を形成する核酸も含まれる。例えば、米国特許第5,176,996号および第5,422,251号を参照されたい。タンパク質には、DNA結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構築因子、メチル化DNA結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、ジメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイラーゼ、およびヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。
外因性分子は、内在性分子と同じ種類の分子、例えば、外因性のタンパク質または核酸であることができる。例えば、外因性核酸は、細胞内に導入された感染性ウイルスゲノム、プラスミド、もしくはエピソーム、または通常は細胞に存在しない染色体を含むことができる。外因性分子の細胞への導入のための方法は、当業者に公知であり、脂質を介する転移（すなわち、中性およびカチオン性の脂質を含む、リポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、粒子衝突、リン酸カルシウム共沈殿、DEAEデキストランを介する転移、およびウイルスベクターを介する転移を含むが、これらに限定されない。
対照的に、「内在性」分子は、特定の環境条件下の特定の発生段階の特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内在性核酸は、染色体、ミトコンドリアもしくは葉緑体もしくはその他のオルガネラのゲノム、または天然に存在するエピソーム性核酸を含むことができる。さらなる内在性分子として、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含むことができる。
本明細書において使用される場合、「外因性核酸の産物」という用語は、ポリヌクレオチド産物およびポリペプチド産物の両方、例えば、転写産物（RNAなどのポリヌクレオチド）および翻訳産物（ポリペプチド）を含む。
「融合」分子は、2つまたはそれより多くのサブユニット分子が、好ましくは共有結合で連結している分子である。サブユニット分子は同じ化学的種類の分子であることができるし、または異なる化学的種類の分子であることができる。第1の種類の融合分子の例として、融合タンパク質（例えば、ZFP DNA結合ドメインと切断ドメインの間の融合体）および融合核酸（例えば、前記の融合タンパク質をコードする核酸）が含まれるが、これらに限定されない。第2の種類の融合分子の例として、3重鎖を形成する核酸とポリペプチドの間の融合体、またはマイナーグルーブ・バインダーと核酸の間の融合体が含まれるが、これらに限定されない。
細胞内での融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達からか、またはポリヌクレオチドが転写され、転写産物が翻訳されて、融合タンパク質を生成することを特徴とする、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達によって生じることができる。トランス・スプライシング、ポリペプチド切断、およびポリペプチドライゲーションも、細胞内でのタンパク質の発現に関与することができる。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの細胞への送達のための方法は、本開示の別の場所で提示されている。
本開示の目的のための、「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするDNA領域（以下参照）だけでなく、遺伝子産物の産生を調節する全てのDNA領域も含み、そのような調節配列がコード配列および／または転写される配列に近接しているかどうかを問わない。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、および座制御領域を含むが、これらに必ずしも限定されない。
「遺伝子発現」とは、遺伝子に含まれる、情報を遺伝子産物に変換することを指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えば、mRNA、tRNA、rRNA、アンチセンスRNA、リボソーム、構造RNA、もしくは任意のその他の種類のRNA）またはmRNAの翻訳によって産生されるタンパク質を含む。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などの過程によって、修飾されているRNA 、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ADPリボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されているタンパク質も含む。
「遺伝子発現」の調整とは、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調整は、遺伝子活性化および遺伝子抑制を含むことができるが、これらに限定されない。
「真核生物」細胞には、（酵母などの）真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、およびヒト細胞が含まれるが、これらに限定されない。
「関心対象の領域」とは、例えば、遺伝子または外因性分子と結合することが望ましい、遺伝子内もしくは遺伝子に近接する非コード配列などの、細胞クロマチンの任意の領域である。結合は、標的化DNA切断および／または標的化組換えの目的のためであることができる。関心対象の領域は、例えば、染色体か、エピソームか、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）か、または感染性ウイルスゲノムに存在することができる。関心対象の領域は、遺伝子のコード領域内か、例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロンなどの転写される非コード領域内か、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの、非転写領域内にあることができる。関心対象の領域は、長さが1ヌクレオチド対と同じぐらい少ないかもしくは2,000ヌクレオチド対までか、または任意の整数値のヌクレオチド対であることができる。
「機能的な連結」および「機能的に連結される」（または「操作的に連結される」）という用語は、2つまたはそれより多くの（配列エレメントなどの）構成要素の並置に関して互換的に用いられており、その場合、構成要素は、両方の構成要素が正常に機能しかつ構成要素の少なくとも1つがその他の構成要素の少なくとも1つに対して影響を与える機能を媒介することができる可能性を与えるように配置されている。例説として、転写調節配列が、1つまたは複数の転写調節因子の存在または不在に応答してコード配列の転写のレベルを制御するならば、プロモーターなどの、転写調節配列は、コード配列に機能的に連結されている。転写調節配列は通常、コード配列とシスで機能的に連結されるが、それに直接的に近接している必要はない。例えば、エンハンサーは、たとえそれらが連続的でなくても、コード配列に機能的に連結される転写調節配列である。
融合ポリペプチドに関して、「機能的に連結される」という用語は、構成要素の各々がその他の構成要素と連結して、万が一そのように連結していなければそれが果たすであろうものと同じ機能を果たすという事実を指すことができる。例えば、ZFP DNA結合ドメインが切断ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して、ZFP DNA結合ドメインおよび切断ドメインは、融合タンパク質において、ZFP DNA結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、その一方で切断ドメインが標的部位付近のDNAを切断することができるならば、機能的に連結されている。
タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能断片」は、その配列が全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同じ機能を保持する、タンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能断片は、対応するネイティブの分子よりも多いか、その分子よりも少ないか、もしくはその分子と同じ数の残基を保有することができ、かつ／または1つもしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチドの置換を含むことができる。
核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は当技術分野において周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は周知である。例えば、ポリペプチドのDNA結合機能を、例えば、濾過結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。DNA切断をゲル電気泳動によってアッセイすることができる。Ausubel et al.、前記を参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力を、例えば、共免疫沈降、ツー・ハイブリッドアッセイ、または遺伝的相補性および生化学的相補性の両方によって決定することができる。例えば、Fields et al. (1989) Nature 340:245-246；米国特許第5,585,245号、およびPCT国際公開第98/44350号を参照されたい。
標的部位
開示された方法および組成物は、切断ドメイン（または切断半ドメイン）およびジンクフィンガードメインを含む融合タンパク質を含み、ジンクフィンガードメインは、ヒトPPP1R12C 座内の配列に結合することによって、切断ドメイン（または切断半ドメイン）の活性を配列の付近に導き、それによりPPP1R12C内での切断（例えば、2本鎖切断）を誘導する。本開示の別の場所で示されたように、ジンクフィンガードメインは、事実上全ての所望の配列に結合するように人工的に改変することができる。したがって、1つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメインは、PPP1R12C遺伝子内の1つまたは複数の配列に結合するように人工的に改変することができる。ジンクフィンガー結合ドメインおよび切断ドメインを含む融合タンパク質（または各々がジンクフィンガー結合ドメインおよび切断半ドメインを含む、2つの融合タンパク質）の細胞内での発現は、PPP1R12C 遺伝子内での切断に影響を与える。
開示された方法および組成物は、切断ドメイン（または切断半ドメイン）およびジンクフィンガードメインを含む融合タンパク質を含み、ジンクフィンガードメインは、ヒトPPP1R12C 座内の配列に結合することによって、切断ドメイン（または切断半ドメイン）の活性を配列の付近に導き、それによりPPP1R12C内での切断（例えば、2本鎖切断）を誘導する。本開示の別の場所で示されたように、ジンクフィンガードメインは、事実上全ての所望の配列に結合するように人工的に改変することができる。したがって、1つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメインは、PPP1R12C遺伝子内の1つまたは複数の配列に結合するように人工的に改変することができる。ジンクフィンガー結合ドメインおよび切断ドメインを含む融合タンパク質（または各々がジンクフィンガー結合ドメインおよび切断半ドメインを含む、2つの融合タンパク質）の細胞内での発現は、PPP1R12C 遺伝子内での切断に影響を与える。
ジンクフィンガードメインによる結合のためのPPP1R12C内の配列（例えば、標的部位）の選択を、例えば、選択された配列に結合するようにZFPを設計するための方法をも開示している、共同所有の米国特許第6,453,242号（2002年9月17日）に開示された方法に従って遂行することができる。ヌクレオチド配列を単に目視で調べることも標的部位を選択するのに用いることができるということが当業者に明白であると考えられる。したがって、標的部位選択のための任意の手段を、本明細書に記載された方法で用いることができる。
標的部位は通常、複数の近接する標的サブ部位から構成される。標的サブ部位とは、個々のジンクフィンガーによって結合される配列（通常ヌクレオチドトリプレットか、または近接するカドラプレット（quadruplet）と1ヌクレオチドだけ重複することができるヌクレオチドカドラプレットのいずれか）を指す。例えば、国際公開第02/077227号を参照されたい。ジンクフィンガータンパク質が最も大きく接触する鎖を、標的鎖の「1次認識鎖」、または「1次接触鎖」と表す場合、幾つかのジンクフィンガータンパク質は標的鎖中の3塩基トリプレットおよび非標的鎖上の第4の塩基に結合する。
標的部位は通常、少なくとも9ヌクレオチドの長さを有し、したがって、少なくとも3つのジンクフィンガーを含むジンクフィンガー結合ドメインによって結合される。しかしながら、例えば、4フィンガー結合ドメインの12ヌクレオチド標的部位への結合、5フィンガー結合ドメインの15ヌクレオチド標的部位への結合、または6フィンガー結合ドメインの18ヌクレオチド標的部位への結合も可能である。明白であると考えられるが、より大きい結合ドメイン（例えば、7フィンガー、8フィンガー、9フィンガー、およびそれより大きいフィンガー）のより大きい標的部位への結合も可能である。
標的部位が3ヌクレオチドの倍数である必要はない。例えば、交差鎖相互作用が生じる場合（例えば、米国特許第6,453,242号および国際公開第02/077227号参照）、多フィンガー結合ドメインの個々のジンクフィンガーのうちの1つまたは複数は、重複するカドラプレットのサブ部位に結合することができる。結果として、3フィンガータンパク質は、10番目のヌクレオチドが末端のフィンガーによって結合されるカドラプレットの一部であることを特徴とする、10ヌクレオチド配列に結合することができ、4フィンガータンパク質は、13番目のヌクレオチドが末端のフィンガーによって結合されるカドラプレットの一部であることを特徴とする、13ヌクレオチド配列に結合することができ、等々である。
多フィンガー結合ドメイン中の個々のジンクフィンガー間のアミノ酸リンカー配列の長さおよび性質も、標的配列への結合に影響を及ぼす。例えば、多フィンガー結合ドメイン中の近接するジンクフィンガー間のいわゆる「非カノニカルリンカー」、「長いリンカー」、または「構造リンカー」の存在は、それらのフィンガーを直に隣接していないサブ部位に結合させることができる。そのようなリンカーの非限定的な例は、例えば、米国特許第6,479,626号および国際公開第01/53480号に記載されている。したがって、ジンクフィンガー結合ドメインのための標的部位内の、1つまたは複数のサブ部位を、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれより多くのヌクレオチドだけ各々と隔てさせることができる。ほんの1例を示すと、4フィンガー結合ドメインは、配列中に、2つの連続する3ヌクレオチドサブ部位、介在ヌクレオチド、および2つの連続するトリプレットサブ部位を含む13ヌクレオチドの標的部位に結合することができる。
配列（例えば、標的部位）間の距離とは、互いに最も近い配列の端から測定した場合の、2つの配列間に介在するヌクレオチドまたはヌクレオチド対の数を指す。
切断が、2つのジンクフィンガードメイン／切断半ドメイン融合分子の別々の標的部位への結合に依存するある態様において、2つの標的部位は反対のDNA鎖上にあることができる（実施例1）。その他の態様において、両方の標的部位は同じDNA鎖上にある。
DNA結合ドメイン
任意のDNA結合ドメインを本明細書に開示された方法で用いることができる。ある態様において、DNA結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。ジンクフィンガー結合ドメインは、1つまたは複数のジンクフィンガーを含む。Miller et al. (1985) EMBO J. 4:1609-1614; Rhodes (1993) Scientific American Feb.:56-65; 米国特許第6,453,242号。本明細書に記載されたジンクフィンガー結合ドメインは通常、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または一層多くのジンクフィンガーを含む。
任意のDNA結合ドメインを本明細書に開示された方法で用いることができる。ある態様において、DNA結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。ジンクフィンガー結合ドメインは、1つまたは複数のジンクフィンガーを含む。Miller et al. (1985) EMBO J. 4:1609-1614; Rhodes (1993) Scientific American Feb.:56-65; 米国特許第6,453,242号。本明細書に記載されたジンクフィンガー結合ドメインは通常、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または一層多くのジンクフィンガーを含む。
典型的には、1つのジンクフィンガードメインは、長さが約30アミノ酸である。各々のジンクフィンガードメイン（モチーフ）は、（2つの不変のシステイン残基を含むベータターンの中に収められた）2つのベータシートおよび（1つの不変のヒスチジン残基を含む）1つのアルファヘリックスを含み、それは2つのシステインおよび2つのヒスチジンによる亜鉛原子の配位を通じて特定の立体構造を保っているということが構造研究によって証明されている。
ジンクフィンガーは、カノニカルなC2H2ジンクフィンガー（すなわち、亜鉛イオンが2つのシステイン残基および2つのヒスチジン残基によって配位されているもの）と例えば、C3Hジンクフィンガー（亜鉛イオンが3つのシステイン残基および1つのヒスチジン残基によって配位されているもの）およびC4ジンクフィンガー（亜鉛イオンが4つのシステイン残基によって配位されているもの）などの非カノニカルなジンクフィンガーの両方を含む。国際公開第02/057293号も参照されたい。
ジンクフィンガー結合ドメインを、標準的な技術を用いて、PPP1R12C 内の標的部位（上記参照）に結合するように人工的に改変することができる。例えば、実施例1；その中に引用された参考文献を含む、共同所有の米国特許第6,453,242号および第6,534,261号を参照されたい。人工ジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有することができる。人工改変法として、合理的設計および様々な種類の選択が含まれるが、これらに限定されない。合理的設計は、例えば、トリプレット（またはカドラプレット）のヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、その場合、各々のトリプレットまたはカドラプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはカドラプレットの配列に結合するジンクフィンガーの1つまたは複数のアミノ酸配列と会合している。
ファージディスプレイおよびツー・ハイブリッド系を含む、例示的な選択法が、米国特許第5,789,538号；第5,925,523号；第6,007,988号；第6,013,453号；第6,410,248号；第6,140,466号；第6,200,759号；および第6,242,568号だけでなく、国際公開第98/37186号；国際公開第98/53057号；国際公開第00/27878号；国際公開第01/88197号、および英国特許第2,338,237号にも開示されている。
ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共同所有の国際公開第02/077227号に記載されている。
個々のジンクフィンガーは、3ヌクレオチド（すなわち、トリプレット）配列（または1ヌクレオチドだけ、近接するジンクフィンガーの4ヌクレオチド結合部位と重複することができる4ヌクレオチド配列）に結合するので、ジンクフィンガー結合ドメインが結合するように人工的に改変される配列（例えば、標的配列）の長さは、人工ジンクフィンガー結合ドメイン中のジンクフィンガーの数を決定すると考えられる。例えば、フィンガーモチーフが重複するサブ部位に結合しないZFPについては、6ヌクレオチドの標的配列が2フィンガー結合ドメインによって結合され；9ヌクレオチドの標的配列が3フィンガー結合ドメインによって結合され、等々である。本明細書で特筆したように、標的部位内の個々のジンクフィンガーの結合部位（すなわち、サブ部位）は、連続的である必要はないが、多フィンガー結合ドメイン内のジンクフィンガー間のアミノ酸配列（すなわち、フィンガー間リンカー）の長さおよび性質に応じて、1つヌクレオチドまたは数のヌクレオチドだけ隔てることができる。
多フィンガーのジンクフィンガー結合ドメインにおいて、隣接するジンクフィンガーを、およそ5アミノ酸のアミノ酸リンカー配列（いわゆる「カノニカルな」フィンガー間リンカー）によるか、または代わりに、1つもしくは複数の非カノニカルなリンカーによって隔てることができる。例えば、共同所有の米国特許第6,453,242号および第6,534,261号を参照されたい。3つよりも多くのフィンガーを含む人工ジンクフィンガー結合ドメインについては、それによって結合ドメインによる結合の親和性および／または特異性が増大する可能性があるので、ジンクフィンガーのうちの幾つかの間により長い（「非カノニカルな」）フィンガー間リンカーを挿入することが好ましい場合がある。例えば、米国特許第6,479,626および国際公開第01/53480号を参照されたい。したがって、多フィンガーのジンクフィンガー結合ドメインを、非カノニカルなフィンガー間リンカーの存在および箇所に関して特徴付けることもできる。
-例えば、（2つのカノニカルなフィンガー間リンカーによって接続された）3つのフィンガー、1つの長いリンカー、および（2つのカノニカルなフィンガー間リンカーによって接続された）3つの追加のフィンガーを含む6フィンガーのジンクフィンガー結合ドメインを2x3立体配置と命名する。同様に、（その間に1つのカノニカルなリンカーを持つ）2つのフィンガー、1つの長いリンカー、および（1つのカノニカルなリンカーによって接続された）2つの追加のフィンガーを含む結合ドメインを2x2タンパク質と命名する。（その各々の中で2つのフィンガーが1つのカノニカルなリンカーによって接続されている）3つの2フィンガー単位を含み、かつ各々の2フィンガー単位が、1つの長いリンカーによって近接する2フィンガー単位に接続されているタンパク質を3x2タンパク質と呼ぶ。
多フィンガー結合ドメイン内の2つの近接するジンクフィンガー間の長いリンカーまたは非カノニカルなフィンガー間リンカーの存在は、多くの場合、2つのフィンガーが標的配列内で直に連続していないサブ部位に結合するのを可能にする。したがって、標的部位内のサブ部位間に1つまたは複数のヌクレオチドのギャップがあることができる；すなわち、標的部位は、ジンクフィンガーによって接触されない1つまたは複数のヌクレオチドを含むことができる。例えば、2x2ジンクフィンガー結合ドメインは、1ヌクレオチドだけ隔てられた2つの6ヌクレオチド配列に結合することができ、すなわち、それは13ヌクレオチドの標的部位に結合する。Moore et al. (2001a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1432-1436; Moore et al. (2001b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1437-1441および国際公開第01/53480号も参照されたい。
先に述べたように、標的サブ部位は、1つのジンクフィンガーによって結合される3ヌクレオチド配列または4ヌクレオチド配列である。ある目的のために、2フィンガー単位を結合モジュールと命名する。結合モジュールは、例えば、特定の6ヌクレオチド標的配列に結合する多フィンガータンパク質（通常3フィンガー）の文脈において2つの近接するフィンガーを選択することによって得ることができる。あるいは、モジュールは、個々のジンクフィンガーを組み合わせることによって構築することができる。国際公開第98/53057号および国際公開第01/53480号も参照されたい。
あるいは、DNA結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来してもよい。例えば、I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII、およびI-TevIIIなどのホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が公知である。米国特許第5,420,032号；米国特許第6,833,252号；Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353、ならびにNew England Biolabsカタログも参照されたい。
さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのDNA結合特異性を、非天然の標的部位に結合するように人工的に改変することができる。例えば、Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; 米国特許出願公開第20070117128号を参照されたい。
切断ドメイン
本明細書で開示された融合タンパク質の切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来することができる例示的なエンドヌクレアーゼとして、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。例えば、2002-2003カタログ、New England Biolabs, Beverly, MA；およびBelfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388を参照されたい。DNAを切断するさらなる酵素が公知である（例えば、S1ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓DNアーゼI；マイクロコッカルヌクレアーゼ；酵母HOエンドヌクレアーゼ；Linn et al. (編) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993も参照されたい）。
本明細書で開示された融合タンパク質の切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来することができる例示的なエンドヌクレアーゼとして、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。例えば、2002-2003カタログ、New England Biolabs, Beverly, MA；およびBelfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388を参照されたい。DNAを切断するさらなる酵素が公知である（例えば、S1ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓DNアーゼI；マイクロコッカルヌクレアーゼ；酵母HOエンドヌクレアーゼ；Linn et al. (編) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993も参照されたい）。
ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの非限定的な例は、I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII、およびI-TevIIIを含み、公知である。米国特許第5,420,032号；米国特許第6,833,252号；Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353、およびNew England Biolabsカタログも参照されたい。これらの酵素（もしくはその機能断片）の1つまたは複数を、切断ドメインおよび切断半ドメインの源として用いることができる。
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、（認識部位で）DNAに配列特異的に結合し、かつ結合の部位かまたは結合の部位の近くでDNAを切断することができる。ある種の制限酵素（例えば、IIS型）は、認識部位から隔たった部位でDNAを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、IIS型酵素Fok Iは、一方の鎖上ではその認識部位から9ヌクレオチド離れた場所で、他方の鎖上ではその認識部位から13ヌクレオチド離れた場所で、DNAの2本鎖切断を触媒する。
例えば、米国特許第5,356,802号；第5,436,150号；および第5,487,994号だけでなく、Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982も参照されたい。したがって、1つの態様において、融合タンパク質は、少なくとも1つのIIS型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断半ドメイン）および人工的に改変されていてもよいしまたは人工的に改変されていなくてもよい、1つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
切断ドメインが結合ドメインから切り離せる、例示的なIIS型制限酵素は、Fok Iである。この特定の酵素は、2量体として活性がある。Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10,570-10,575。したがって、本開示の目的のために、開示された融合タンパク質で用いられるFok I酵素の部分は、切断半ドメインと考えられる。したがって、ジンクフィンガー-Fok I融合体を用いた細胞配列の標的化2本鎖切断および／または標的化交換のために、各々FokI切断半ドメインを含む、2つの融合タンパク質を用いて、触媒活性のある切断ドメインを再構成することができる。あるいは、1つのジンクフィンガー結合ドメインおよび2つのFok I切断半ドメインを含む1つのポリペプチド分子を用いることもできる。ジンクフィンガー-Fok I融合体を用いた標的化切断および標的化配列改変のためのパラメーターは本開示中の別の場所で提供されている。
切断ドメインまたは切断半ドメインは、切断活性を保持するか、または多量体化（例えば、二量体化）して、機能的な切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であることができる。
例示的なIIS型制限酵素は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、共同所有の国際公報国際公開第2007/014275号に記載されている。
切断特異性を向上させるために、切断ドメインを修飾することも可能である。ある態様において、切断半ドメインのホモ二量体化を最小化するかまたは抑制する、切断半ドメインの変異体を利用する。そのような修飾された切断半ドメインの非限定的な例は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開第2007/014275号に詳細に記載されている。実施例も参照されたい。ある態様において、切断ドメインが、二量体化を最小化するかまたは抑制する人工切断半ドメイン（二量体化ドメイン突然変異体とも呼ばれる）を含むことは当業者に公知であり、例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第20050064474号および第20060188987号に記載されている。
Fok I の位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537、および538のアミノ酸残基は全て、Fok I切断半ドメインの二量体化に影響を与えるための標的である。例えば、米国特許出願公開第20050064474号および第20060188987号；国際特許公報国際公開第07/139898号; Miller et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(7):778-785を参照されたい。
必須のヘテロ二量体を形成するFok Iのさらなる人工切断半ドメインを、本明細書に記載されたZFNで用いることもできる。第1の切断半ドメインがFok I の位置490および538のアミノ酸残基における突然変異を含み、第2の切断半ドメインが位置486および499のアミノ酸残基における突然変異を含む。
ある態様において、切断ドメインは、その両方ともが、結合ドメイン、第1の切断半ドメイン、および第2の切断半ドメインを含む1つのポリペプチドの一部である、2つの切断半ドメインを含む。切断半ドメインは、それらがDNAを切断するよう機能する限り、同じアミノ酸配列を有することができるし、または異なるアミノ酸配列を有することができる。
一般に、融合タンパク質が切断半ドメインを含む場合、2つの融合タンパク質が切断に必要とされる。あるいは、2つの切断半ドメインを含む1つのタンパク質を用いることができる。2つの切断半ドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能断片）に由来することができるし、または各々の切断半ドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能断片）に由来することができる。さらに、2つの融合タンパク質の標的部位は、好ましくは、2つの融合タンパク質のそれらのそれぞれの標的部位への結合により、切断半ドメインが、例えば、二量体化によって機能的な切断ドメインを形成するのを可能にする空間的な配向に切断半ドメインが置かれるように、互いに関して配置される。したがって、ある態様において、標的部位の近い末端を、5〜8ヌクレオチドまたは15〜18ヌクレオチド隔てさせる。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、2つの標的部位間に介在することができる（例えば、2〜50ヌクレオチドまたはそれより多く）。一般に、切断の点は、標的部位の間にある。
ジンクフィンガードメイン-切断ドメイン融合体
融合タンパク質（および融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は当業者に公知である。例えば、ジンクフィンガータンパク質を含む融合タンパク質（および融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、共同所有の米国特許第6,453,242号および第6,534,261号；ならびに国際公報国際公開第2007/014275号に記載されている。ある態様において、そのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを構築する。これらのポリヌクレオチドをベクターに挿入することができ、ベクターを細胞に導入することができる（ベクターおよび細胞にポリヌクレオチドを導入するための方法に関するさらなる開示については下記を参照されたい）。
融合タンパク質（および融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は当業者に公知である。例えば、ジンクフィンガータンパク質を含む融合タンパク質（および融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、共同所有の米国特許第6,453,242号および第6,534,261号；ならびに国際公報国際公開第2007/014275号に記載されている。ある態様において、そのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを構築する。これらのポリヌクレオチドをベクターに挿入することができ、ベクターを細胞に導入することができる（ベクターおよび細胞にポリヌクレオチドを導入するための方法に関するさらなる開示については下記を参照されたい）。
本明細書に記載された方法のある態様において、融合タンパク質は、ジンクフィンガー結合ドメインおよびFok I制限酵素由来の切断半ドメインを含み、2つのそのような融合タンパク質が細胞内で発現する。2つの融合タンパク質の細胞内での発現は、2つのタンパク質の細胞への送達；1つのタンパク質およびタンパク質のうちの1つをコードする1つの核酸の細胞への送達；各々がタンパク質のうちの1つをコードする、2つの核酸の細胞への送達；または両方のタンパク質をコードする、1つの核酸の細胞への送達によってもたらすことができる。追加の態様において、融合タンパク質は、2つの切断半ドメインおよび1つのジンクフィンガー結合ドメインを含む1つのポリペプチド鎖を含む。この場合、1つの融合タンパク質が細胞内で発現し、理論に束縛されることを望まないが、切断半ドメインの分子内二量体の形成の結果としてDNAを切断すると考えられている。
各々が1つのジンクフィンガー結合ドメインおよび1つの切断半ドメインを含む、2つの融合タンパク質が細胞内で発現し、機能的な切断ドメインが再構成されて、DNAが標的部位の付近で切断されるように並置されている標的部位に結合してもよい。1つの態様において、切断は、2つのジンクフィンガー結合ドメインの標的部位間で生じる。ジンクフィンガー結合ドメインおよび／または切断ドメインの一方または両方を人工的に改変することができる。実施例1を参照されたい。
ジンクフィンガードメインが融合タンパク質のアミノ末端に最も近く、切断半ドメインがカルボキシ末端に最も近いように、融合タンパク質（例えば、ZFP-Fok I融合体）の構成要素を配置してもよい。機能的ヌクレアーゼを形成するための切断半ドメインの二量体化は、結合部位の5'末端が互いに接近している、反対のDNA鎖上の部位に融合タンパク質が結合することによってもたらされる。
あるいは、切断半ドメインが融合タンパク質のアミノ末端に最も近く、ジンクフィンガードメインがカルボキシ末端に最も近いように、融合タンパク質（例えば、ZFP-Fok I融合体）の構成要素を配置してもよい。これらの態様において、機能的ヌクレアーゼを形成するため切断半ドメインの二量体化は、結合部位の3'末端が互いに接近している、反対のDNA鎖上の部位に融合タンパク質が結合することによってもたらされる。
さらに追加の態様において、第1の融合タンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端に最も近い切断半ドメイン、およびカルボキシ末端に最も近いジンクフィンガードメインを含み、第2の融合タンパク質は、ジンクフィンガードメインが融合タンパク質のアミノ末端に最も近く、かつ切断半ドメインがカルボキシ末端に最も近いように配置される。これらの態様において、両方の融合タンパク質は、カルボキシ末端に最も近いジンクフィンガードメインを含む第1の融合タンパク質の結合部位が、アミノ末端に最も近いジンクフィンガードメインを含む第2の融合タンパク質の結合部位の5'側に位置する、同じDNA鎖に結合する。
2つの融合タンパク質は、関心対象の領域において同じかまたは反対の極性で結合することができ、それらの結合部位（すなわち、標的部位）を任意の数のヌクレオチド、例えば、0〜200ヌクレオチドまたはその間の任意の整数値だけ隔てることができる。ある態様において、各々が1つのジンクフィンガー結合ドメインおよび1つの切断半ドメインを含む、2つの融合タンパク質の結合部位は、その他の結合部位に最も近い各々の結合部位の端から測定した場合、5〜18ヌクレオチド離れて、例えば、5〜8ヌクレオチド離れて、または15〜18ヌクレオチド離れて、または6ヌクレオチド離れて、または16ヌクレオチド離れて位置することができ、切断は結合部位の間で起こる。
DNAが切断される部位は通常、2つの融合タンパク質の結合部位の間にある。DNAの2本鎖破損は、多くの場合、2つの1本鎖切断、すなわち1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれより多くのヌクレオチドが段違いになった、「ニック」から生じる（例えば、ネイティブのFok Iによる2本鎖DNAの切断は、4ヌクレオチドが段違いになった1本鎖破損から生じる）。したがって、切断は、必ずしも各DNA鎖上の正反対の部位で起こらない。さらに、融合タンパク質の構造および標的部位間の距離は、切断が1ヌクレオチド対隣りで起こるかどうかということ、または切断が幾つかの部位で起こるかどうかということに影響を与えることができる。しかしながら、標的化組込みについては、一定の範囲のヌクレオチド内部での切断で通常十分であり、特定の塩基対間の切断は必要とされない。
開示された融合タンパク質において、ジンクフィンガードメインと切断ドメイン（または切断半ドメイン）の間のアミノ酸配列を「ZCリンカー」と命名する。ZCリンカーは、上で考察したフィンガー間リンカーとは区別されるべきである。ZCリンカーは、例えば、国際公開第2007/014275号に詳細に記載されている。
下記に詳細に考察するように、融合タンパク質（ZFN）、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは細胞内に導入される。ひとたび細胞内に導入されるか、または細胞内で発現されれば、融合タンパク質がPPP1R12C 内の標的配列に結合し、この遺伝子座の内部で切断する。
PPP1R12C遺伝子への標的化組込み
開示された方法および組成物を用いて、細胞クロマチンのPPP1R12C遺伝子内のDNAを切断することができ、それによって外因性配列のPPP1R12C座の「安全港」への安定な、標的化組込みが促進される。上で特筆したように、内在性PPP1R12C の機能の損失は、ヒト細胞に十分に許容され、この遺伝子内部に組み込まれた配列は内在性プロモーターから広範に転写される。したがって、PPP1R12Cは外因性配列の標的化組込みのために望ましい部位である。
開示された方法および組成物を用いて、細胞クロマチンのPPP1R12C遺伝子内のDNAを切断することができ、それによって外因性配列のPPP1R12C座の「安全港」への安定な、標的化組込みが促進される。上で特筆したように、内在性PPP1R12C の機能の損失は、ヒト細胞に十分に許容され、この遺伝子内部に組み込まれた配列は内在性プロモーターから広範に転写される。したがって、PPP1R12Cは外因性配列の標的化組込みのために望ましい部位である。
PPP1R12Cへの標的化組込みのために、1つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメインを、所定の切断部位かまたは切断部位の近くで標的部位に結合するように人工的に改変し、人工ジンクフィンガー結合ドメインおよび切断ドメインを含む融合タンパク質を細胞内で発現させる。融合タンパク質のジンクフィンガー部分が標的部位に結合すると同時に、好ましくは2本鎖破損を介して、標的部位の近くで切断ドメインによってDNAが切断される。
PPP1R12C座内の2本鎖破損の存在によって、相同組換えを介した外因性配列の組込みが促進される。したがって、PPP1R12C遺伝子内に挿入されるべき外因性配列を含むポリヌクレオチドは、相同組換えを促進するためにPPP1R12C 遺伝子と相同性がある1つまたは複数の領域を含むと考えられる。
本明細書に記載されたように、任意の関心対象の配列（外因性配列）をPPP1R12C座に導入することができる。例示的な外因性配列として、任意のポリペプチドコード配列（例えば、cDNA）、プロモーター、エンハンサー、およびその他の調節配列、shRNA発現カセット、エピトープタグ、マーカー遺伝子、切断酵素認識部位、ならびに様々な種類の発現コンストラクトが含まれるが、これらに限定されない。そのような配列は、標準的な分子生物学の技術（クローニング、合成など）を用いて容易に得ることができ、かつ／または市販されている。例えば、MISSION（商標）TRC shRNAライブラリーが、Sigmaから市販されている。
マーカー遺伝子には、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、G418耐性、ピューロマイシン耐性）を仲介するタンパク質をコードする配列、着色タンパク質または蛍光タンパク質または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、増強された緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、細胞表面抗原（例えば、ΔNGFR）、ならびに増強された細胞成長および／または遺伝子増幅を仲介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素）が含まれるが、これらに限定されない。エピトープタグには、例えば、1コピーまたは複数コピーのFLAG、His、myc、Tap、HA、または任意の検出可能なアミノ酸配列が含まれる。
好ましい態様において、外因性配列は、細胞内での発現が望ましい任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、抗体、抗原、酵素、受容体（細胞表面または核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、成長因子、および上記のいずれかの機能断片を含むが、これらに限定されない。コード配列は、例えば、cDNAであってもよい。外因性配列はまた、転写調節因子をコードしてもよい。
例えば、PPP1R12C座に標的化される外因性配列は、以下の遺伝子疾患：軟骨無形成症、色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（OMIM 第102700号）、副腎白質ジストロフィー、アイカルディ症候群、アルファ-1アンチトリプシン欠損症、アルファ地中海貧血、アンドロゲン不応症候群、アペール症候群、不整脈源性右室異形成、毛細血管拡張性失調症、バース症候群、ベータ地中海貧血、青色ゴムまり様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫性疾患（CGD）、猫泣き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉異形成症、ファンコニ貧血、進行性骨化性線維異形成症、脆弱X症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（例えば、GM1）、 ヘモクロマトーシス、ベータグロビンの6番目のコドンにおけるヘモグロビンA突然変異（HbC）、血友病、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ症、クラインフェルター症候群、クラッベ病、ランガー・ギーディオン症候群、白血球接着不全症（LAD、OMIM 第116920号）、白質ジストロフィー、QT延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（MPS）、爪膝蓋骨症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、ニーマン・ピック病、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラダー・ウィリー症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、サンフィリポ症候群、重症複合免疫不全（SCID）、シュワックマン症候群、鎌形赤血球症（鎌形赤血球貧血）、スミス・マジェニス症候群、スティックラー症候群、テイ・サックス病、血小板減少-橈骨欠損（TAR）症候群、トリチャーコリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォン・ヒッペル・ランド症候群、ワールデンブルグ症候群、ウィリアム症候群、ウィルソン病、ウィスコット・オルドリッチ症候群、X連鎖リンパ球増殖症候群（XLP、OMIM 第308240号）のいずれかを含むが、これらに限定されない、遺伝子疾患を有する対象で欠けているかまたはその対象で機能しないポリペプチドをコードする配列を含む。
標的化組込みによって処置することができる追加の例示的な疾患として、獲得性免疫不全、リソソーム貯蔵疾患（例えば、ゴーシェ病、GM1、ファブリー病、およびテイ・サックス病）、ムコ多糖症（例えば、ハンター病、ハーラー病）、異常ヘモグロビン症（例えば、鎌形赤血球症、HbC、α-地中海貧血、β-地中海貧血）、ならびに血友病が含まれる。
ある態様において、外因性配列は、標的化組込みを経た細胞の選択を可能にする、マーカー遺伝子（上記）、および追加の機能性をコードする関連配列を含むことができる。
さらに、発現には必要とされないが、外因性配列はまた、転写または翻訳の調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム侵入部位、2Aペプチドをコードする配列、および／またはポリアデニル化シグナルであってもよい。
本明細書で開示されたような、外因性配列の標的化組込みを用いて、タンパク質発現用の細胞または細胞株を作製することができる。例えば、共同所有の米国特許出願公開第2006/0063231号を参照されたい（その開示は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。ゲノムに組み込まれた外因性配列によってコードされる1つまたは複数のタンパク質の最適発現のために、染色体の組込み部位は、好ましくは広範囲の細胞型および発生段階において、組み込まれた配列の高レベルの転写と適合するべきである。
しかしながら、組み込まれた配列の転写は、とりわけ、組込み部位のゲノムのクロマチン構造が原因で組込み部位によって様々に異なるということが観察されている。したがって、組み込まれた配列の高レベルの転写を支持するゲノムの標的部位が望ましい。ある態様において、外因性配列の組込みが、1つまたは複数の細胞遺伝子（例えば、オンコジーン）の異所性発現を引き起こさないということも望ましいと考えられる。他方、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列の組込みの場合、異所性の活性化が望ましい場合がある。
外因性（ドナー）配列を、融合タンパク質の発現の前にか、発現と同時にか、または発現の後に細胞内に導入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、それとそれが相同性を有するゲノム配列との間の相同組換え（または相同性指向性の修復）を支持するのに十分なゲノム配列に対する相同性を含む。ドナーとゲノム配列の間のおよそ25、50、100、200、500、750、1,000、1,500、2,000ヌクレオチド、もしくはそれより多くの配列相同性（または10〜2,000ヌクレオチドの間の任意の整数値、もしくはそれより多く）が、その間の相同組換えを支持すると考えられる。
ドナー配列は、10〜5,000ヌクレオチド（もしくはその間の任意の整数値のヌクレオチド）の長さまたはそれより長い範囲に及ぶことができる。ドナー配列は、典型的には、それが交換するゲノム配列と同一ではないということが直ぐに明白であると考えられる。例えば、ドナーポリヌクレオチドの配列は、染色体配列との十分な相同性が存在する限りにおいて、ゲノム配列に関して1つまたは複数の1塩基変化、挿入、欠失、逆位、または再配置を含むことができる。
あるいは、ドナー配列は、2つの相同な領域と隣接した相同でない配列を含むことができる。さらに、ドナー配列は、細胞クロマチン内の関心対象の領域と相同でない配列を含むベクター分子を含むことができる。通常、ドナー配列の相同な領域は、組換えが望ましいゲノム配列に対する少なくとも50％の配列同一性を有すると考えられる。ある態様において、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、または99.9％の配列同一性が存在する。ドナーポリヌクレオチドの長さに応じて、1％〜100％の間の任意の値の配列同一性が存在することができる。
ドナー分子は、幾つかの、連続的でない、細胞クロマチンに対して相同な領域を含むことができる。例えば、相同な領域は、所望の改変を含む2つまたはそれより多くの領域に隣接することができる。
ドナーポリヌクレオチドは、DNAかまたはRNA、1本鎖かまたは2本鎖であることができ、線状かまたは環状の形態で細胞内に導入することができる。線状形態で導入する場合、当業者に公知の方法によって、ドナー配列の末端を（例えば、エキソヌクレアーゼ分解的な分解から）保護することができる。例えば、国際公開第2007/014275号を参照されたい。ポリヌクレオチドを、例えば、複製起点、プロモーター、および抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞内に導入することができる。その上、ドナーポリヌクレオチドを、裸の核酸として、リポソームもしくはポロキサマーなどの作用物質との複合体を形成した核酸として導入することができるし、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、AAV、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス）によって送達することができる。
追加のZFP機能ドメイン融合体の使用を含むが、これに限定されない、標的化組換えのレベルを亢進させ得る方法および組成物も提供する。国際公開第2007/014275号を参照されたい。
相同性によって駆動される修復過程が最大限に活発である、細胞周期のG2期で細胞をブロックすることにより、ジンクフィンガー／ヌクレアーゼ融合分子およびドナーDNA分子を含む細胞内での、標的化組換えの効率のさらなる増大を達成する。そのような停止を多くの方法で達成することができる。例えば、例えばG2期で細胞を停止させるために、細胞周期進行に影響を与える薬物、化合物、および／または小分子で細胞を処置することができる。
例示的なこの種の分子として、微小管重合に影響を及ぼす化合物（例えば、ビンブラスチン、ノコダゾール、タキソール）、DNAと相互作用する化合物（例えば、シス-白金(II)ジアミン二塩化物、シスプラチン、ドキソルビシン）、ならびに／またはDNA合成に影響を及ぼす化合物（例えば、チミジン、ヒドロキシウレア、L-ミモシン、エトポシド、5-フルオロウラシル）が含まれるが、これらに限定されない。クロマチン構造を変化させて、ゲノムDNAを細胞の組換え装置により接近し易くするヒストンデアセチラーゼ（HDAC）インヒビター（例えば、酪酸ナトリウム、トリコスタチンA）の使用によって、組換え効率のさらなる増大を達成する。
細胞周期停止のためのさらなる方法として、例えば、タンパク質をコードするcDNAを細胞内に導入することによるか、またはタンパク質をコードする遺伝子の発現を活性化する人工ZFPを細胞内に導入することによって、CDK細胞周期キナーゼの活性を阻害するタンパク質を過剰発現することが含まれる。例えば、RNAi法（例えば、米国特許第6,506,559号）を用いて、サイクリンおよびCDKの活性を阻害することによるか、または例えば、サイクリンおよび／もしくはCDK遺伝子などの細胞周期進行に関与する1つもしくは複数の遺伝子の発現を抑制する人工ZFPを細胞内に導入することによっても、細胞周期停止を達成する。例えば、遺伝子発現の調節用の人工ジンクフィンガータンパク質の合成のための方法については、共同所有の米国特許第6,534,261号を参照されたい。
あるいは、場合によっては、（好ましくはS期またはG2期に）ドナーポリヌクレオチドの非存在下で標的化切断が行なわれ、組換えが相同染色体間で起こる。
送達
融合タンパク質（ZFN）をポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドとして導入することができる。例えば、各々が前述のポリペプチドのうちの1つをコードする配列を含む、2つのポリヌクレオチドを細胞内に導入することができ、ポリペプチドが発現しかつ各々がその標的配列に結合した時に、標的配列かまたは標的配列の近くで切断が起こる。あるいは、両方の融合ポリペプチドをコードする配列を含む1つのポリヌクレオチドを細胞内に導入する。ポリヌクレオチドは、DNA、RNA、またはDNAおよび／もしくはRNAの任意の修飾形態もしくは類似体であることができる。
融合タンパク質（ZFN）をポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドとして導入することができる。例えば、各々が前述のポリペプチドのうちの1つをコードする配列を含む、2つのポリヌクレオチドを細胞内に導入することができ、ポリペプチドが発現しかつ各々がその標的配列に結合した時に、標的配列かまたは標的配列の近くで切断が起こる。あるいは、両方の融合ポリペプチドをコードする配列を含む1つのポリヌクレオチドを細胞内に導入する。ポリヌクレオチドは、DNA、RNA、またはDNAおよび／もしくはRNAの任意の修飾形態もしくは類似体であることができる。
任意の好適な方法を用いて、本明細書に記載されたような核酸（例えば、ZFNをコードするポリヌクレオチドおよび／または外因性「ドナー」配列）を細胞内に導入してもよい。
ある態様において、1つまたは複数のZFPまたはZFP融合タンパク質を、複製および／または発現のために原核生物または真核生物の細胞に形質転換するためのベクターにクローニングすることができる。ベクターは、原核生物ベクター、例えば、プラスミド、もしくはシャトルベクター、昆虫ベクター、または真核生物ベクターであることができる。例えば、Sambrook et al., 前記、ならびに米国特許公報第20030232410号；第20050208489号；第20050026157号；第20050064474号；第20060188987号、および国際公報国際公開第2007/014275号に記載された標準的な技術を用いて、本明細書に記載された配列（ZFN）をコードする核酸を、植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞もしくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、または原生生物細胞への投与のための、発現ベクターにクローニングすることもできる。
ある態様において、ZFNおよびドナー配列を遺伝子治療用途のためにインビボまたはエクスビボで送達する。ポリヌクレオチドを細胞に送達するための非ウイルスベクター送達系は、DNAプラスミド、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルとの複合体を形成した核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソーム性のゲノムかまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する、DNAウイルスおよびRNAウイルスを含む。
遺伝子治療手順の概説については、Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Baehm (編) (1995) の中のHaddada et al.; およびYu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994) を参照されたい。
インビボまたはエクスビボでの核酸の非ウイルス送達の方法として、エレクトロポレーション、リポフェクション（米国特許第5,049,386号；第4,946,787号、ならびにTransfectam（商標）およびLipofectin（商標）などの市販の試薬を参照）、マイクロインジェクション、バイオリスティックス（biolistics）、ウイロソーム、リポソーム（例えば、Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); 米国特許第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号、および第4,946,787参照）, 免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のDNA、人工ビリオン、ウイルスベクター系（例えば、ZFPを含むタンパク質を送達するための国際公開第2007/014275号に記載されたような、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、および単純ヘルペスウイルスのベクター）、ならびに薬剤で増強されるDNAの取込みが含まれる。例えば、Sonitron 2000系（Rich-Mar）を用いるソノポレーションを核酸の送達に用いることもできる。
追加の例示的な核酸送達系は、Amaxa Biosystems (Cologne, Germany), Maxcyte社（Rockville, Maryland）およびBTX Molecular Delivery Systems（Holliston, MA）によって提供されている送達系を含む。
例えば、ZFP融合タンパク質の一過性発現が好ましい、ある態様において、アデノウイルスに基づく系を用いることができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型で非常に高い形質導入効率が可能であり、かつ細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高力価でかつ高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的簡単な系で大量に産生することができる。
アデノ随伴ウイルス（「AAV」）ベクターもまた、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、ならびにインビボおよびエクスビボの遺伝子治療手順のために、標的核酸を細胞に形質導入するために用いられる（例えば、West et al., Virology 160:38-47 (1987); 米国特許第4,797,368号; 国際公開第93/24641号; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994) を参照されたい）。組換えAAVベクターの構築は、米国特許第5,173,414号; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); およびSamulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989) を含む、多くの出版物に記載されている。
少なくとも6つのウイルスベクターによるアプローチが、臨床試験における遺伝子転移に現在利用可能であり、臨床試験によって、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補を含むアプローチが利用され、形質導入作用物質が作製されている。
pLASNおよびMFG-Sは、臨床試験で用いられているレトロウイルスベクターの例である（Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)）。PA317/pLASNは、遺伝子治療試験で用いられた最初のベクターであった（Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)）。50％またはそれを上回る形質導入効率がMFG-Sパッケージベクターについて観察された（Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997)）。
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（rAAV）は、欠損性でかつ非病原性のパルボウイルスアデノ随伴ウイルス亜型に基づく有望な代替の遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接しているAAVの145bpの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノム内への組込みによる効率的な遺伝子転移および安定な導入遺伝子送達が、このベクター系にとっての重要な特色である（Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)）。さらに、自己相補的な組換えアデノ随伴ウイルス（scAAV）由来ベクターを用いることができる。
複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ad）を高力価で産生し、多くの異なる細胞型に容易に感染させることができる。多くのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がAd E1a、E1b、および／またはE3遺伝子に置き換わるように人工的に改変されており；後に、複製欠損ベクターが、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト293細胞内で増殖する。Adベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉で見出される細胞のような非分裂性の、分化した細胞を含む、インビボの多くの種類の組織に形質導入することができる。従来のAdベクターは、大きい運搬能力を有する。
臨床試験におけるAdベクターの使用の例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫付与のためのポリヌクレオチド治療を含んだ（Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)）。臨床試験における遺伝子転移のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例として、Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998) が含まれる。
パッケージング細胞を用いて、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成させる。そのような細胞として、アデノウイルスをパッケージングする、293細胞、およびレトロウイルスをパッケージングする、Ψ2細胞またはPA317細胞が含まれる。遺伝子治療で用いられるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングするプロデューサー細胞株によって作製される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよび（適用可能な場合には）その後の宿主への組込みに必要とされる最小限のウイルス配列を含み、その他のウイルス配列は発現されるべきタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられている。
失われたウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療で用いられるAAVベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組込みに必要とされるAAVゲノム由来の逆方向末端反復（ITR）配列のみを保有する。ウイルスDNAは、その他のAAV遺伝子、すなわち、repおよびcapをコードするが、ITR配列を欠くヘルパープラスミドを含む、細胞株でパッケージングされる。また、細胞株にアデノウイルスをヘルパーとして感染させる。ヘルパーウイルスは、AAVベクターの複製およびヘルパープラスミドからのAAV遺伝子の発現を助長する。ヘルパープラスミドは、ITR配列がないために、十分な量でパッケージングされない。例えば、アデノウイルスの方がAAVよりも敏感である熱処置によって、アデノウイルスの汚染を減らすことができる。
多くの遺伝子治療用途において、ポリヌクレオチド（例えば、ZFNコード配列および／またはドナー配列）を、特定の組織型に対する高度の特異性をもって送達することが望ましい。したがって、リガンドをウイルス外被タンパク質との融合タンパク質としてウイルスの外表面に発現させることによって所与の細胞型に対する特異性を有するようにウイルスベクターを修飾することができる。関心対象の細胞型に存在することが知られている受容体に対する親和性を有するようにリガンドを選抜する。
例えば、Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995) は、モロニーマウス白血病ウイルスを修飾して、gp70に融合したヒトヘレギュリン（heregulin）を発現させることができ、かつ組換えウイルスはヒト上皮成長因子受容体を発現するある種のヒト乳癌細胞に感染するということを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する、その他のウイルス-標的細胞対まで拡大することができる。例えば、事実上全ての選抜された細胞受容体に対する特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、FABまたはFv）をディスプレイするようにフィラメント状ファージを人工的に改変することができる。上記のことはウイルスベクターに主に適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターを、特異的な標的細胞による摂取に有利に働く特異的な摂取配列を含むように人工的に改変することができる。
遺伝子治療ベクターを、個々の患者への投与によって、典型的には、下記のような、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内への注入）または局所適用によってインビボで送達することができる。あるいは、ベクターを、個々の患者から外植された細胞（例えば、白血球、骨髄吸引物、組織生検）または一般的なドナー造血幹細胞などの、エクスビボの細胞に送達し、それに続いて通常はベクターを取り込んだ細胞を選択した後に、患者に細胞を再移植することができる。
診断、研究用の、または（例えば、トランスフェクトした細胞の宿主生物への再注入による）遺伝子治療用のエクスビボ細胞トランスフェクションは当業者に周知である。好ましい態様において、細胞を対象生物から単離し、細胞にZFP核酸（遺伝子またあcDNA）および外因性配列をトランスフェクトし、細胞を対象生物（例えば、患者）に再注入して戻す。エクスビボトランスフェクションに好適な様々な細胞型が当業者に周知である（患者から細胞を単離し、培養する方法についての考察については、例えば、Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (第3版 1994) およびその中に引用された参照を参照されたい）。
1つの態様において、細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のためのエクスビボ手順において幹細胞を用いる。幹細胞を用いる利点は、それらをインビトロでその他の細胞型に分化させることができ、またはそれらが骨髄内で生着すると考えられる場合には（細胞のドナーなどの）哺乳動物に導入することができるということである。GM-CSF、IFN-γ、およびTNF-αなどのサイトカインを用いてCD34+細胞をインビトロで臨床的に重要な免疫細胞型に分化させるための方法が公知である（Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992) を参照されたい）。
形質導入および分化のために公知の方法を用いて幹細胞を単離する。例えば、CD4+およびCD8+（T細胞）、CD45+（汎B細胞）、GR-1（顆粒球）、ならびにIad（分化抗原提示細胞）などの、望まない細胞に結合する抗体で骨髄細胞をパニングすることによって、幹細胞を骨髄細胞から単離する（Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992) を参照されたい）。
本明細書に記載されたような核酸を含むベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）を、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。あるいは、裸のDNAを投与することができる。投与は、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない、分子を導入して、血液または組織の細胞と最終的に接触させるのに通常用いられる経路のいずれかによる。そのような核酸を投与する好適な方法が利用可能でありかつ当業者に周知であり、1つより多くの経路を用いて特定の組成物を投与することはできるものの、特定の経路が、多くの場合、別の経路よりも直接的でかつ効果的な反応を提供することができる。
DNAを造血幹細胞に導入するための方法が、例えば、米国特許第5,928,638号に開示されている。造血幹細胞、例えば、CD34+細胞への導入遺伝子の導入に有用なベクターとして、アデノウイルスタイプ35が含まれる。
免疫細胞（例えば、T細胞）への導入遺伝子の導入に好適なベクターは、非組込み型のレンチウイルスベクターを含む。例えば、Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull et al. (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222を参照されたい。
薬学的に許容される担体は、投与されている特定の組成物によるだけでなく、組成物を投与するのに用いられる特定の方法によっても一部決定される。したがって、下記のような、利用可能な多種多様の好適な薬学的組成物の製剤がある（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第17版, 1989を参照されたい）。
上で特筆したように、例えば、国際公開第2007/014275号に記載された方法を用いて、ZFN融合タンパク質の1つまたは複数をポリペプチドとして細胞内に導入することもできる。タンパク質送達ビヒクルの非限定的な例として、「膜転位ポリペプチド」が含まれ、例えば、ペプチドは、膜を転位する担体、毒素分子、リポソーム、および（標的化リポソームを含む）免疫リポソームなどのリポソーム誘導体として作用する能力を有する両親媒性または疎水性のアミノ酸サブ配列を有する。
ZFPおよびZFPをコードする発現ベクターを、治療的または予防的な用途、例えば、癌、虚血、糖尿病性網膜症、黄斑変性、関節リウマチ、乾癬、HIV感染、鎌形赤血球貧血、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、神経変性疾患、血管疾患、嚢胞性線維症、脳卒中などのためのPPP1R12Cへの標的化切断組込みのために直接患者に投与することができる。
治療的有効量の投与は、ZFPを導入して、処置されるべき組織細胞と最終的に接触させるのに通常用いられる経路のいずれかによる。任意の好適なやり方で、好ましくは薬学的に許容される担体と共にZFPを投与する。そのようなモジュレーターを投与する好適な方法が利用可能でありかつ当業者に周知であり、1つより多くの経路を用いて特定の組成物を投与することはできるものの、特定の経路が、多くの場合、別の経路よりも直接的でかつ効果的な反応を提供することができる。
薬学的に許容される担体は、投与されている特定の組成物によるだけでなく、組成物を投与するのに用いられる特定の方法によっても一部決定される。したがって、下に記載するような、利用可能である多種多様の好適な薬学的組成物の製剤がある（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第17版, 1985を参照されたい）。
単独かまたはその他の好適な構成要素と組み合わせて、吸入によって投与されるようにZFPをエアロゾル製剤として作ることができる（すなわち、それらを「噴霧する」ことができる）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などのような、加圧型の許容される推進剤に収納することができる。
例えば、静脈内、筋肉内、皮内、および皮下の経路などの、非経口投与に好適な製剤には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含むことができる、水性および非水性の、等張滅菌注射溶液、ならびに懸濁薬剤、可溶化剤、増粘薬剤、安定化剤、および防腐剤を含むことができる水性および非水性の滅菌懸濁が含まれる。開示された組成物を、例えば、静脈内注入によるか、経口的か、局所的か、腹腔内か、膀胱内か、または髄腔内に投与することができる。化合物の製剤は、アンプルおよびバイアルなどの、単位用量または複数用量の密封容器中に提示することができる。注射溶液および懸濁は、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
実施例1：PPP1R12Cに標的化されるジンクフィンガーヌクレアーゼの設計
1対の4フィンガージンクフィンガータンパク質ヌクレアーゼ（ZFN）を含む融合タンパク質を、国際公報国際公開第2007/014275号に記載されたように設計し、出版されたプロトコル（Rebar & Pabo (1994) Science 263(5147):671-3; Greisman & Pabo (1997) Science 275(5300):657-61）によるファージディスプレイを用いて最適化し、図1に示されたようにPPP1R12Cのイントロン1に2本鎖破損を誘導した。ZFN標的配列は、ヒト第19番染色体の「-」鎖の位置60318932〜60318961に対応する（UCSCヒトゲノム公開 2006年3月）。
1対の4フィンガージンクフィンガータンパク質ヌクレアーゼ（ZFN）を含む融合タンパク質を、国際公報国際公開第2007/014275号に記載されたように設計し、出版されたプロトコル（Rebar & Pabo (1994) Science 263(5147):671-3; Greisman & Pabo (1997) Science 275(5300):657-61）によるファージディスプレイを用いて最適化し、図1に示されたようにPPP1R12Cのイントロン1に2本鎖破損を誘導した。ZFN標的配列は、ヒト第19番染色体の「-」鎖の位置60318932〜60318961に対応する（UCSCヒトゲノム公開 2006年3月）。
表1は、PPP1R12C座への標的化組込み実験に用いられた例示的なPPP1R12C標的化ZFNを示す。
実施例2：PPP1R12C座への標的化組込み
同じ座（位置60318104〜60319750）の1,647 bp断片を用い、ZFN 9931とZFN 10099の結合部位の間の位置に「スプライスアクセプター - FMDV 2A - GFP - ポリ(A)」カセットを導入することにより、ドナーを設計した。必須のヘテロ二量体形態のFokIエンドヌクレアーゼをZFN発現カセットで用いて（上記の「切断ドメイン」という題の節を参照）、K562細胞、293T細胞、Hep3B細胞、またはHEK293細胞に導入することを除いて、Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651およびMoehle et al (2007) PNAS 194:305に記載されたようにZFNおよびドナーのコンストラクトを調製した。
同じ座（位置60318104〜60319750）の1,647 bp断片を用い、ZFN 9931とZFN 10099の結合部位の間の位置に「スプライスアクセプター - FMDV 2A - GFP - ポリ(A)」カセットを導入することにより、ドナーを設計した。必須のヘテロ二量体形態のFokIエンドヌクレアーゼをZFN発現カセットで用いて（上記の「切断ドメイン」という題の節を参照）、K562細胞、293T細胞、Hep3B細胞、またはHEK293細胞に導入することを除いて、Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651およびMoehle et al (2007) PNAS 194:305に記載されたようにZFNおよびドナーのコンストラクトを調製した。
トランスフェクションの72時間後、Moehle et al. (2007) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 104:3055-3060に記載されたように、放射性標識PCRアッセイで標的化組込み（TI）の割合をアッセイした。トランスフェクションの2週間後、Moehle et al. (2007) に同様に記載されたように、GFP陽性細胞のパーセンテージをFACSでアッセイした。
結果を図3および4に示す。標的化組込み頻度の解析（図3AおよびB）により、ドナー配列のPPP1R12Cへの組込みが、K562細胞（図3A）および293T細胞（図3B）の両方においてZFNの存在下で顕著に増大することが示された。PCR解析の結果は、サザンブロッティングで検証された（図7B参照）。
さらに、図4に示されたように、FACS解析によるGFP発現によっても、GFPドナー配列がPPP1R12Cに組込まれていることが確認された。特に、PPP1R12CへのドナーGFP配列の組込み頻度（図4A）は、ZFN発現コンストラクトの同時導入がなければ、無視できるほど小さかった。ZFNの存在下では、ドナー配列がPPP1R12C 内の標的部位に組み込まれる細胞のパーセントは、13.09％まで増加した（図4B）。同様に、293T細胞において、ドナー配列は、野生型細胞には組み込まれなかったが（図4C、0％）、PPP1R12C標的化ZFNの存在下では、3.66％の細胞に組み込まれた（図4D）。Hep3B細胞において、ドナー配列は、PPP1R12C標的化ZFNの非存在下では、0.65％の細胞に組み込まれたが（図4E）、PPP1R12C標的化ZFNの存在下では、1.73％のHep3B細胞に組み込まれた（図4F）。
このように、様々な細胞型において、ZFNは、プロモーターレスの外因性コード配列のPPP1R12C の「安全港」座への標的化組込みを駆動した。
実施例3：PPP1R12C/p84 mRNAの定量的RT-PCR測定
一般に用いられる形質転換細胞型（HEK293（293T）、繊維芽細胞、K562、HeLa、DU-145、Hep3B）のパネル全体のPPP1R12C/p84 mRNAレベルの定量的RT-PCR測定を行ない、遺伝子が様々な細胞型で発現しているかどうかを調べた。18SかまたはGAPDHと比較したPPP121R12C座の発現の比率として結果を示す。
一般に用いられる形質転換細胞型（HEK293（293T）、繊維芽細胞、K562、HeLa、DU-145、Hep3B）のパネル全体のPPP1R12C/p84 mRNAレベルの定量的RT-PCR測定を行ない、遺伝子が様々な細胞型で発現しているかどうかを調べた。18SかまたはGAPDHと比較したPPP121R12C座の発現の比率として結果を示す。
簡潔に述べると、PPP1R12C用のカスタムメイドの遺伝子発現アッセイ（ABI）を用いて、Tan et al. (2003) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 100:11997-12002) に記載されたようなApplied Biosystems 7300 TaqManマシーンでリアルタイムRT-PCRによってPPP1R12C mRNAのレベルを測定した。図5に示された、結果は、検討された全てのヒト細胞／組織でPPP1R12C/p84が構成的に転写されていることを示す入手可能なデータと合致して、PPP1R12C/p84が広範に転写されていることを示す。
実施例4：PPP1R12C座への標的化組込み
遺伝子付加のためのPPP1R12C（p84）遺伝子座の実用性を明らかにするために、代わりのZFN設計のパネルの一過性トランスフェクションおよびDSB誘導の効率を決定するためのSurveyorヌクレアーゼアッセイ（Miller et al. (2007) Nat Biotechnol. 25(7):778-85）を利用したスクリーニングによって、表1に示されたZFNのパネルからリードZFNを同定した。このアッセイは、DSB修復の遺伝子シグネチャー：非相同性の末端接続により生み出された小さい挿入および欠失を持つPPP1R12C/p84由来染色分体の比率を測定する。
遺伝子付加のためのPPP1R12C（p84）遺伝子座の実用性を明らかにするために、代わりのZFN設計のパネルの一過性トランスフェクションおよびDSB誘導の効率を決定するためのSurveyorヌクレアーゼアッセイ（Miller et al. (2007) Nat Biotechnol. 25(7):778-85）を利用したスクリーニングによって、表1に示されたZFNのパネルからリードZFNを同定した。このアッセイは、DSB修復の遺伝子シグネチャー：非相同性の末端接続により生み出された小さい挿入および欠失を持つPPP1R12C/p84由来染色分体の比率を測定する。
PPP1R12C/p84への標的化組込みに関する全ての実験について、本発明者らは、染色体座と相同な1.6 kbのドナーDNAコンストラクト（Urnov et al., Nature. 2005 435(7042):646-51）を用い、記載された異種ストレッチを標準的な組換えDNA技術を用いて導入した。ΔLNGFR細胞表面マーカー用の自律的発現カセットを、1つしかないSnaBI部位を用いてドナーコンストラクトの右の相同性腕の外側に導入した。HEK293細胞およびK562細胞を培養し、Urnov et al.（同上）に記載されたようなDNAコンストラクトをトランスフェクトした。
図6に示されたように、組込みを示さなかった陰性対象と比較した場合、検討した全てのZFN対がドナーコンストラクトを組み込んだ。これらのデータにより、PPP1R12C/p84遺伝子座の所望の領域にDSBを効率的に標的化するZFNが得られたことが示された。
さらに、このアッセイで同定されたリードZFN対（15556/15590、図6のレーン5）は、PPP1R12C/p84遺伝子の転写開始部位の〜1,800 bp下流、すなわち、この座にオープンリーディングフレームを付加するためのプロモーターを含まないドナーDNA設計を可能にするのにネイティブなプロモーター配列から十分に離れた所にDSBを導入した（図7A）。本発明者らは、DNA部位を標的化するZFPの最適化によってゲノム編集率が増加することを以前に示した。例えば、Urnov et al.（2005）を参照されたい。この観察と一致して、PPP1R12C/p84のためのリードZFNの最適化もまた、切断活性の著しい亢進（〜4倍増）をもたらし、5本につき1本の編集された染色分体を提示する一過性にトランスフェクトされたK562細胞の集団を生じさせた。
実施例4：ZFNを介する部位特異的遺伝子付加
上記のZFNが、遺伝子カセットのPPP1R12C/p84座への効率的な部位特異的付加を駆動するかどうかを明らかにするために、本発明者らは、ネイティブなPPP1R12C/p84プロモーターを利用するプロモーターレスのドナーDNA設計を用いて、マーカー陽性細胞を生み出した（図7a）。このドナープラスミドは、プロモーターレスGFP ORFおよびポリアデニル化シグナル配列で中断されたPPP1R12C/p84座のイントロン1内のDSB部位に隣接する領域と相同な2つの750 bpの配列のストレッチを含む。PPP1R12C/p84のエクソン1が翻訳された時に、ネイティブなPPP1R12C/p84プロモーターによって駆動されるGFP発現が達成されるように、本発明者らは、スプライスアクセプター部位と、それに続く2Aリボソーム断続シグナル（Fang et al (2005) Nat Biotech. 23:584参照）をORFの上流に含めた（図7A）。
上記のZFNが、遺伝子カセットのPPP1R12C/p84座への効率的な部位特異的付加を駆動するかどうかを明らかにするために、本発明者らは、ネイティブなPPP1R12C/p84プロモーターを利用するプロモーターレスのドナーDNA設計を用いて、マーカー陽性細胞を生み出した（図7a）。このドナープラスミドは、プロモーターレスGFP ORFおよびポリアデニル化シグナル配列で中断されたPPP1R12C/p84座のイントロン1内のDSB部位に隣接する領域と相同な2つの750 bpの配列のストレッチを含む。PPP1R12C/p84のエクソン1が翻訳された時に、ネイティブなPPP1R12C/p84プロモーターによって駆動されるGFP発現が達成されるように、本発明者らは、スプライスアクセプター部位と、それに続く2Aリボソーム断続シグナル（Fang et al (2005) Nat Biotech. 23:584参照）をORFの上流に含めた（図7A）。
図7Aに表されたように、この発現カセットのPPP1R12C/p84座への正真正銘の部位特異的遺伝子付加によって、PPP1R12C/p84のエクソン1およびマーカーGFP ORFを含むPPP1R12C/p84プロモーターから駆動された1つの転写産物が生じたと考えられる。このmRNAの翻訳により、2つの別個のポリペプチド；（i）PPP1R12C/p84のエクソン1によってコードされるペプチド；および（ii）完全なGFPポリペプチドの生成が2Aペプチド配列の結果としてもたらされたと考えられる。卓上ミニFACS装置（Guava Technologies）を用いてFACS解析を行ない、WinMDIソフトウェアを用いてデータをさらに解析した。
制限酵素消化工程を省いたことを除いて、記載されたような高度に定量的なPCRアッセイ（Urnov et al., 2005）によってDNAに基づく標的化組込み頻度の解析を行なった（唯一の例外は、NcoI制限部位を含む30 bpパッチを導入しているドナーを用いた実験であり、この場合、野生型染色体と組込み物を持つ染色体の間の小さいサイズの相違によって制限酵素消化の使用を余儀なくされた）。余分なドナーDNAを排除するためのDpnIおよびゲノムDNAを消化するためのAccIで消化されたゲノムDNAに対するサザンブロッティングを記載されたように行なった（Urnov et al., 2005）。本質的にMiller et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(7):778-785およびTan et al. (2003) Proc Natl Acad Sci U S A 100:11997-12002に記載されたように、ゲノム規模の発現プロファイリングおよび免疫細胞化学を行なった。
ZFNをコードするプラスミドDNAおよびドナーDNAコンストラクトをトランスフェトして48時間後のK562細胞の解析により、平均で、細胞集団内の10％の染色分体が、PCRおよびサザンブロッティングで判断されるようなドナー特定カセットを獲得していることが示された（図7B）。その後、修飾された細胞を、いかなる選択もない中で1か月（30世代を超える倍加）の間、成長させた。2日目に得られた分子データ（図7B、レーン2）と一致して、培養の期間が延長されたにもかかわらず、13％のGFP陽性細胞が、ZFNおよびドナーで処置したプールで観察され、その一方でドナープラスミド単独で処置した細胞の1％未満がGFPを発現した。これらのデータは、プロモーターレスのマーカーORFをヒトPPP1R12C/p84座に付加することによって、所望の事象のための選択の非存在下で、マーカーが安定に陽性である細胞が高頻度に生み出されることを示す。
これらの観察の一般性を明らかにするために、本発明者らは、異なる由来の2つの追加のよく用いられる細胞型（神経細胞のアデノウイルス形質転換により得られた細胞株である、HEK293、および肝細胞癌である、Hep3B）を用いて類似の実験を行なった。内在性PPP1R12C/p84プロモーターがこれらの細胞型の両方で活性があることに注目して、本発明者らは、先と同様に、同じプロモーターレスのGFPドナープラスミドを用い（図7A、上のパネル）、PPP1R12C/p84 4座にZFNによって付加されたORFを持つGFP陽性細胞のプールを得ることができた。注目すべきことに、関心対象の細胞型に特異的な一過性トランスフェクション条件を使用すること以外に、その他のいかなる修飾もGFP ORF付加を行なうための試薬に必要がなかった。
まとめると、これらのデータは、ZFNを介するPPP1R12C/p84遺伝子座への部位特異的で安定な遺伝子付加を、よく用いられるヒト細胞のパネル全体に適当なプラスミドDNAを簡単に一過性にトランスフェクトすることによってすぐに達成することができるということを示している。
実施例5：PPP1R12C/p84への遺伝子付加は安定な発現レベルをもたらす
プラスミドまたはウイルスの送達を介した外来DNAのランダムな組込みによる遺伝子組換えは、多くの場合、変わりやすい最初の遺伝子発現レベルだけでなく、経時的な発現の不安定性ももたらす。
プラスミドまたはウイルスの送達を介した外来DNAのランダムな組込みによる遺伝子組換えは、多くの場合、変わりやすい最初の遺伝子発現レベルだけでなく、経時的な発現の不安定性ももたらす。
ZFNを介するPPP1R12C/p84座への部位特異的な遺伝子付加がこれらの限界を克服するかどうかを明らかにするために、本発明者らは、ZFNおよびGFP ORFをコードするプラスミドにK562細胞を曝露し、いかなる選択薬剤もない中で4週間、細胞を拡大し、その後、FACSを用いてGFP陽性細胞プールを単離した。より大きい（導入遺伝子を含む）染色分体のPCR増幅は、混合した細胞集団内のより小さい、野生型アレルよりも効率的ではない。この相違について標準化しながら、本発明者らは、これらの細胞内のPPP1R12C/p84座をPCRでジェノタイピングし、それによって染色分体の〜80％がPPP1R12C/p84遺伝子座に挿入されたORFを持つことが分かった（図8E、レーン2）。重要なことに、GFP発現についてさらに選別することなく限界希釈によって、1アレル型または2アレル型の立体配置で、かつPCRジェノタイピングの結果と完全に一致した相対頻度でGFPカセットがPPP1R12C/p84に正確に挿入されていることが分かった、〜20の1細胞由来クローン株のパネルが作製された。
さらに、遺伝子が組み換えられた染色分体の配列に基づくジェノタイピングによって、正確な、相同性に基づくドナー特定導入遺伝子のPPP1R12C/p84座への付加が明らかになった。
GFP発現の安定性を明らかにするために、代表的な対照K562細胞、FACSで濃縮されたGFP陽性の細胞プール、ならびにPPP1R12C/p84でのGFP挿入が1アレル型および2アレル型である、2つの1細胞クローン株を50回の細胞倍加の間成長させ、GFP発現について週2回アッセイした。図8Aに示された、データにより、（i）実験の間に平均蛍光強度が失われないこと；および（ii）GFP陽性細胞プール内のマーカー陰性細胞の全体の比率が変化しないこと（〜5％）；（iii）PPP1R12C/p84におけるGFPカセットについてヘテロ接合よりもホモ接合の細胞の蛍光強度の方が一貫して高いことが明らかになった。
これらのデータは、ZFNによって可能になるPPP1R12C/p84遺伝子座へのORF付加によって、「内在性プロモータートラップ」を人工的に作製することから期待される発現の長期にわたる安定性および一貫性がもたらされるということを示している。
実施例6：ZFNによって駆動される自律的発現カセットの付加
プロモーターレスGFP ORF系を用いて得られた結果をPPP1R12C/p84プロモーターによって駆動されるマーカー発現（図7）に拡張するために、本発明者らは次に、自律的発現カセットをコードするドナーDNA設計を用いることの実行可能性を評価した：このいわゆる「プロモーター-転写単位」（PTU）は、それ自体のプロモーターと、それに続く（shRNAをコードするコンストラクトまたはcDNAなどの）転写されるべきストレッチ、および転写終結シグナル（例えば、ポリ(A) ストレッチまたはRNAポリメラーゼIIIターミネーター）を持つ。
プロモーターレスGFP ORF系を用いて得られた結果をPPP1R12C/p84プロモーターによって駆動されるマーカー発現（図7）に拡張するために、本発明者らは次に、自律的発現カセットをコードするドナーDNA設計を用いることの実行可能性を評価した：このいわゆる「プロモーター-転写単位」（PTU）は、それ自体のプロモーターと、それに続く（shRNAをコードするコンストラクトまたはcDNAなどの）転写されるべきストレッチ、および転写終結シグナル（例えば、ポリ(A) ストレッチまたはRNAポリメラーゼIIIターミネーター）を持つ。
本発明者らは、shRNA用の発現カセットを含むように本発明者らのドナープラスミドを修飾した。このドナーDNA設計を図8Bに図式の形で示す。本発明者らは、PPP1R12C/p84座への正真正銘の遺伝子付加を受けた細胞にタグを付ける方法としてプロモーターレスGFP ORF系のエレメントを保持することを選んだ。GFPカセットの下流に、本発明者らは、（K562細胞で発現していることが知られている）、細胞表面マーカーCD58を標的化するshRNA発現カセットを含め、それによって（PPP1R12C/p84から駆動される）GFP発現と同じ座でのshRNA発現コンストラクトの組込みを物理的に関連付けた。
ZFNおよびshRNAを含むドナープラスミドをK562細胞にトランスフェトして48時間後の定量的PCR解析により、PPP1R12C/p84染色分体の8％が、標的部位でORF-PTUカセットを獲得していることが明らかになった。GFP陽性細胞プールのFACS選別によって、ZFNによって修飾された染色分体の〜10倍の濃縮がもたらされた（図8D）。
挿入されたshRNAカセットの有効性を明らかにするために、本発明者らは、shRNA分子の標的である、CD58のFACS染色によって、対照細胞およびPPP1R12C/p84 ZFN/ドナーによって修飾された細胞を比較した。重要なことに、CD58の細胞表面染色は、30回の細胞集団倍加の後でさえ顕著に低下しており、shRNA発現プラスミドそれ自体を一過性にトランスフェクトして48時間後に見られるのと大きさが同じ程度であった。図8Cを参照されたい。48時間の一過性トランスフェクション試料が、安定に遺伝子を組み換えられた設定で1コピーまたは2コピーしか持たない細胞で見られるのと同じ程度の標的遺伝子の低下を示すことは注目に値する。ZFNによって修飾された細胞のプールをGFPのみのドナー（すなわち、部位特異的遺伝子付加はあるが、shRNAカセットはない）を用いて並行して作製することによって、正常レベルのCD58染色がもたらされたが、その一方でCD58抗体が除かれた対照試料は、残留蛍光しかもたらさなかった。
まとめると、これらのデータは、安定に発現されるPTUのために特定の部位で遺伝子が組み換えられている細胞集団を、迅速に、薬物選択なしで、1工程でタグ付けし、単離するための、プロモーターレスGFP連結型PTUドナー系の実用性を示している。
実施例7：ZFNによって駆動されるPPP1R12C/p84遺伝子標的化の特異性
本発明者らは、ZFNによって駆動される遺伝子付加の特異性をプラスミドに基づく送達を用いて実験的に調べるために2つの十分に確立されたアッセイを用いた。
本発明者らは、ZFNによって駆動される遺伝子付加の特異性をプラスミドに基づく送達を用いて実験的に調べるために2つの十分に確立されたアッセイを用いた。
第一に、本発明者らは、よく研究されたDSB修復の特質、すなわち、リン酸化ヒストン変異体H2A.Xのフォーカスの修復部位での集合（Paull et al. (2000) Curr Biol 10:886-895）を用いてDSBの発生をゲノム規模で測定した。本発明者らは、（IL2Rγ座を標的化する）陽性対照ZFNと並行して行なわれるこれらのアッセイを行なった。PPP1R12C/p84およびIL2Rγを標的化するZFNは、ZFNの対の作用をそれらの必要とされる標的に限定するように設計された、忠実度の高い「必須のヘテロ二量体」形態のFokIエンドヌクレアーゼを利用している。例えば、Miller et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(7):778-785を参照されたい。これらのIL2Rγを標的化するZFNの場合、これによって、核全体でバックグラウンドを上回ってわずか1つのDSBしか発生させないタンパク質がもたらされる。
それらの意図された標的部位を編集するのに〜2.5倍より効果的であるにもかかわらず、PPP1R12C/p84 ZFNは、IL2Rγを標的化するZFNを用いて得られたものと統計的に区別できないレベルのH2A.X染色を示した。図9Aおよび9Bを参照されたい。対照的に、DSB誘導薬物であるエトポシドでの処置により、H2A.X シグナルの統計的に有意な増加がもたらされ、それによりアッセイが機能していることが確認された。
第二に、本発明者らは、PPP1R12C/p84 ZFNの発現によって、ドナーDNAがゲノム中にランダムに組み込まれるようになる割合が増大するかどうかを問うた。この問題に対処するために、本発明者らは、本質的にMoehle et al. (2007) に記載されたように、ドナーの相同性腕の外側に置かれた細胞表面マーカー（ΔNGFR）用の自律的発現カセットを持つプラスミドドナーDNAを用いた。プラスミドの誤った組込みによって、ΔNGFR カセットの取込みおよび発現がもたらされ、相同性指向性の修復によってΔNGFR発現のないGFP陽性細胞がもたらされると考えられた。
IL2Rγ座に標的化されたZFNを検討した初期の仕事（Moehle et al., 2007; Urnov et al., 2005）と一致して、本発明者らは、ドナーDNAのみで処置した細胞で観察される誤った組込み率を上回るドナープラスミドの誤った組込み率の増加を見出さなかった。対照的に、エトポシド（DNA損傷誘導薬物）の添加は、ΔNGFR 細胞の数の統計的に有意な増加をもたらす。
これらのデータは、PPP1R12C/p84指向性のヌクレアーゼが、使用したアッセイの感度の限界の範囲内で、バックグラウンドを上回って1つより多くのDSBを発生させることもなく、ドナープラスミドのランダムな組込みの無視できないほどの増加を駆動することもないということを示している。したがって、ZFN特異性に関する2つのアッセイ - ゲノム当たりのZFN誘導性DSBの数の直接的な測定およびランダムな組込みによる間接的な読み取り - において、PPP1R12C/p84 ZFNは、高い特異性を示し、形質転換されたヒト細胞株の作製におけるそれらの使用を支持している。
本明細書で言及された全ての特許、特許出願、および特許公報は、あらゆる目的のために、それらの全体が、参照により本明細書に組み入れられる。
本開示は、理解の明瞭さのために例説および実施例として少し詳細に提供されているが、本開示の精神または範囲を逸脱することなく様々な変更および修飾を実施することができるということが当業者には明白であると考えられる。したがって、前述の説明および実施例は、限定的であるとみなされるべきではない。
Claims (32)
- 外因性核酸配列の産物を細胞内で発現させるための方法であって、以下の工程を含む方法：
（a）第1のDNA結合ドメインが、前記細胞の前記ゲノム中の前記PPP1R12C遺伝子内の第1の標的部位に結合するように人工的に改変されていることを特徴とする、第1のDNA結合ドメインおよび第1の切断ドメインまたは切断半ドメインを含む、第1の融合タンパク質を前記細胞内で発現させる工程；ならびに
（b）前記第1の融合タンパク質が、前記PPP1R12C遺伝子内で前記細胞の前記ゲノムを切断し、前記外因性核酸配列が前記切断部位に挿入されかつ発現されるような条件下で外因性核酸配列を含むポリヌクレオチドと前記細胞を接触させる工程。 - 前記DNA結合ドメインがジンクフィンガー結合ドメインであることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 第2のジンクフィンガー結合ドメインが前記細胞の前記ゲノムの前記PPP1R12C遺伝子内の第2の標的部位に結合することを特徴とし、前記第2の標的部位が前記第1の標的部位と異なることを特徴とする、第2のジンクフィンガー結合ドメインおよび第2の切断半ドメインを含む、第2の融合タンパク質を前記細胞内で発現させる工程
をさらに含み、
前記細胞の前記ゲノムが前記PPP1R12C遺伝子内で切断され、それにより前記PPP1R12C遺伝子内での前記細胞の前記ゲノムへの前記外因性配列の組込みおよび前記外因性配列の産物の発現がもたらされるように前記第1の融合タンパク質の前記第1の標的部位への結合、および前記第2の融合タンパク質の前記第2の標的部位への結合が前記切断半ドメインの位置を定めることを特徴とする、請求項2記載の方法。 - 前記外因性核酸配列がポリペプチドをコードすることを特徴とする、請求項1〜3いずれか一項記載の方法。
- 前記外因性核酸配列がポリヌクレアーゼを産生することを特徴とする、請求項1〜3いずれか一項記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、抗体、抗原、酵素、成長因子、受容体（細胞表面または核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーター、その機能断片、およびその組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする、請求項4記載の方法。
- 前記レポーターがGFPを含むことを特徴とする、請求項8記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、1つまたは複数のshRNA、1つまたは複数のRNAi分子、1つまたは複数のmiRNA、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする、請求項5記載の方法。
- 前記外因性配列がプロモーターをさらに含むことを特徴とする、請求項1〜8いずれか一項記載の方法。
- 前記外因性配列がプロモーターを含まないことを特徴とする、請求項1〜8いずれか一項記載の方法。
- 前記外因性配列が、前記PPP1R12C 遺伝子内の第1の配列と相同ではあるが同一ではない第1のヌクレオチド配列をさらに含むことを特徴とする、請求項1〜10いずれか一項記載の方法。
- 前記外因性配列が、前記PPP1R12C 遺伝子内の第2の配列と相同ではあるが同一ではない第2のヌクレオチド配列をさらに含むことを特徴とする、請求項11記載の方法。
- 前記第1および第2のヌクレオチド配列が前記外因性配列に隣接することを特徴とする、請求項12記載の方法。
- 前記外因性配列がプラスミドであることを特徴とする、請求項1〜13いずれか一項記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが線状DNA分子であることを特徴とする、請求項1〜13いずれか一項記載の方法。
- 細胞のゲノムへの外因性配列の組込みを同定するための方法であって、以下の工程を含む方法：
外因性核酸配列がマーカー遺伝子を含むことを特徴とする、請求項1〜15いずれか一項記載の前記細胞内で外因性配列を発現させる工程；および
マーカー遺伝子を発現する細胞を同定し、それによりその中に前記外因性配列が組み込まれている細胞を同定する工程。 - 前記外因性配列がプロモーターに操作的に連結されることを特徴とする、請求項16記載の方法。
- 前記マーカー遺伝子がスクリーニングマーカーを含むことを特徴とする、請求項16または17記載の方法。
- 前記スクリーニングマーカーがGFPを含むことを特徴とする、請求項18記載の方法。
- 前記第1および第2の切断半ドメインがIIS型制限エンドヌクレアーゼ由来であることを特徴とする、請求項1〜19いずれか一項記載の方法。
- 前記IIS型制限エンドヌクレアーゼがFokIおよびStsIからなる群より選択されることを特徴とする、請求項20記載の方法。
- 前記細胞が前記細胞周期のG2期で停止されることを特徴とする、請求項1〜21いずれか一項記載の方法。
- 前記融合タンパク質の少なくとも1つが、前記切断半ドメインの二量体化境界面のアミノ酸配列の改変を含むことを特徴とする、請求項1〜22いずれか一項記載の方法。
- 前記細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする、請求項1〜23いずれか一項記載の方法。
- 前記細胞がヒト細胞であることを特徴とする、請求項24記載の方法。
- ジンクフィンガー結合ドメインが、N末端からC末端にかけてF1〜F4と順序付けられた、4つのジンクフィンガーを含むことを特徴とし、さらに：
F1がYNWHLQR（配列番号：16）を含み
F2がRSDHLTT（配列番号：8）を含み
F3がHNYARDC（配列番号：9）を含み；かつ
F4がQNSTRIG（配列番号：15）を含む
ことを特徴とする、請求項2〜25いずれか一項記載の方法。 - ジンクフィンガー結合ドメインが、N末端からC末端にかけてF1〜F4と順序付けられた、4つのジンクフィンガーを含むことを特徴とし、さらに：
F1がQSSNLAR（配列番号：3）を含み；
F2がRTDYLVD（配列番号：11）を含み；
F3がYNTHLTR（配列番号：12）を含み；かつ
F4がQGYNLAG（配列番号：13）を含む
ことを特徴とする、請求項2〜26いずれか一項記載の方法。 - 人工ジンクフィンガータンパク質が4つのジンクフィンガーを含み、前記ジンクフィンガーの各々の認識領域のアミノ酸配列が以下の通りである：
F1がYNWHLQR（配列番号：16）を含み
F2がRSDHLTT（配列番号：8）を含み
F3がHNYARDC（配列番号：9）を含み；かつ
F4がQNSTRIG（配列番号：15）を含む
ことを特徴とする、前記PPP1R12C遺伝子に結合する人工ジンクフィンガータンパク質。 - 人工ジンクフィンガータンパク質が4個のジンクフィンガーを含み、前記ジンクフィンガーの各々の認識領域のアミノ酸配列が以下の通りである：
F1がQSSNLAR（配列番号：3）を含み；
F2がRTDYLVD（配列番号：11）を含み；
F3がYNTHLTR（配列番号：12）を含み；かつ
F4がQGYNLAG（配列番号：13）を含む
ことを特徴とする、前記PPP1R12C遺伝子に結合する人工ジンクフィンガータンパク質。 - 切断ドメインまたは切断半ドメインをさらに含む、請求項28または請求項29記載の前記人工ジンクフィンガータンパク質。
- 前記切断半ドメインがIIS型制限エンドヌクレアーゼ由来であることを特徴とする、請求項28〜30いずれか一項記載のタンパク質。
- 前記IIS型制限エンドヌクレアーゼがFokIおよびStsIからなる群より選択されることを特徴とする、請求項31記載のタンパク質。
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