CN101679977A - 向ppp1r12c基因座的靶向整合 - Google Patents

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Abstract

本文所公开的是用于将外源序列靶向整合至人类PPP1R12C基因座中的方法和组合物，例如，以便表达感兴趣的多肽。

Description

向PPP1R12C基因座的靶向整合
关于在联邦政府赞助的研究下作出的发明的权利的声明
不适用
技术领域
本公开内容属于基因组工程的领域，尤其是向人类PPP1R12C(“p84”或“AAVS1”)基因靶向整合的领域。
背景
基因组生物学中感兴趣的主要方面，尤其鉴于对许多基因组的全核苷酸序列的测定，是将一种或多种感兴趣的序列靶向整合到所需要的位置。已经进行了通过利用同源重组的自然现象在培养的细胞中改变基因组序列的尝试。参见例如Capecchi(1989)Science 244：1288-1292；美国专利第6,528,313和6,528,314号。如果多核苷酸与含有有待改变的序列的基因组区域具有足够的同源性，那么多核苷酸的部分或全部序列通过同源重组取代基因组序列是可能的。然而，在这些情况下，同源重组的频率是极其低的。而且，在缺乏序列同源性的基因组位置，外源多核苷酸的插入的频率超过靶向的同源重组的频率若干数量级。Sedivy和Joyner(1992)GeneTargeting，Oxford University Press，Oxford。
在与外源多核苷酸具有同源性的基因组的区域中将双链断裂引入基因组DNA已显示在培养的细胞中几千倍地激发在这一位点的同源重组。Rouet等人(1994)Mol.Cell.Biol.14：8096-8106；Choulika等人(1995)Mol.Cell.Biol.15：1968-1973；Donoho等人(1998)Mol.Cell.Biol.18：4070-4078。还参见Johnson等人(2001)Biochem.Soc.Trans.29：196-201；和Yanez等人(1998)Gene Therapy 5：149-159。在这些方法中，通过将大范围核酸酶(即其识别序列非常大以致在感兴趣的基因组中所述识别序列不存在或仅仅非常少地存在的内切核酸酶)的识别位点插入所需要的基因组区域中来完成在所需要的基因组区域中的DNA切割。
已经描述了多种用于基因组DNA的靶向切割的方法和组合物。这些靶向切割事件可被用来例如诱导靶向的突变发生、诱导细胞DNA序列的靶向的缺失以及促进在预定的染色体位点的靶向的重组。参见例如美国专利公布20030232410、20050208489、20050026157、20050064474和20060188987，以及国际公布WO 2007/014275，其公开内容适用于所有目的地通过引用全文并入本文。
然而，仍有对于用于向基因组中安全港基因座(safe harbor locus)，尤其是非必需的内源PPP1R12C(也称为p84和/或AAVS1)基因基因座的稳定的靶向整合的组合物和方法的需要。
概述
本公开内容提供用于表达已经整合至细胞中的PPP1R12C基因中的外源核酸序列的一种或多种产物(即蛋白或RNA分子)的方法和组合物。外源核酸序列可包括例如一种或多种基因或cDNA分子，或任何类型的编码或非编码序列以及一种或多种控制元件(例如启动子)。此外，外源核酸序列可产生一种或多种RNA分子(例如小发夹RNA(shRNA)、抑制性RNA(RNAi)、小RNA(miRNA)等)。外源核酸序列被引入细胞中，使得它在位于染色体19上的PPP1R12C基因中被整合到细胞的基因组中。
通过在PPP1R12C基因中的基因组的靶向的双链切割促进外源核酸序列向PPP1R12C基因的整合。通过使用含有锌指DNA结合结构域以及切割结构域或切割半结构域(cleavage half-domain)的融合蛋白将切割靶向至PPP1R12C基因，其中所述锌指DNA结合结构域被设计成与PPP1R12C中的序列结合。这种切割促进切割位点处或附近的外源多核苷酸序列的整合。外源序列的整合可通过同源性依赖和非同源性依赖的机制进行。
在一个方面，本文公开了设计的锌指蛋白，其结合PPP1R12C基因中的靶位点，所述设计的锌指蛋白例如包括表1中所示的识别螺旋的任何设计的锌指蛋白。在某些实施方案中，设计的锌指蛋白包括从N-末端至C-末端标明为F1至F4的四个锌指，并且其中F1-F4包括下列序列：F1：YNWHLQR(SEQ ID NO：16)；F2：RSDHLTT(SEQ ID NO：8)；F3：HNYARDC(SEQ ID NO：9)和F4：QNSTRIG(SEQ ID NO：15)。在其他的实施方案中，设计的锌指蛋白包括标明为F1至F4的四个锌指，并且其中F1包括QSSNLAR(SEQ ID NO：3)；F2包括RTDYLVD(SEQ ID NO：11)；F3包括YNTHLTR(SEQ ID NO：12)；并且F4包括QGYNLAG(SEQ ID NO：13)。在还有另外的实施方案中，本公开内容包括含有2或3个锌指的设计的锌指蛋白，所述2或3个锌指具有表1中所示的ZFN的识别螺旋。例如本文提供了包括从N-末端至C-末端标明为F1至F4的四个锌指的设计的锌指蛋白，其中所述蛋白包括表1中所示的ZFN的任何一个的F1、F2和F3；或F1、F3、F4；或F1、F2、F4；或F2、F3和F4；或F1和F2；或F1和F3；或F1和F4；或F2和F3；或F2和F4；或F3和F4，并且其中其余的(reminaing)指包括与表1中所示的各个指序列不同的序列。本文所描述的锌指蛋白中的任何一个还可包括功能结构域，例如切割结构域或切割半结构域(例如切割半结构域是来自IIS型限制性内切核酸酶诸如FokI或StsI)。
在另一个方面，本文公开了用于在细胞中表达外源核酸序列的产物的方法，所述方法包括：(a)在细胞中表达第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包括第一锌指结合结构域和第一切割半结构域，其中所述第一锌指结合结构域已被设计成与细胞的基因组的PPP1R12C基因中的第一靶位点结合；(b)在细胞中表达第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包括第二锌指结合结构域和第二切割半结构域，其中所述第二锌指结合结构域与细胞的基因组的PPP1R12C基因中的第二靶位点结合，其中第二靶位点与第一靶位点不同；以及(c)将细胞与包括外源核酸序列和第一核苷酸序列的多核苷酸接触，所述第一核苷酸序列与PPP1R12C基因中的第一序列同源；其中第一融合蛋白与第一靶位点的结合和第二融合蛋白与第二靶位点的结合定位切割半结构域，使得细胞的基因组在PPP1R12C基因中被切割，由此导致外源序列在PPP1R12C基因中整合到细胞的基因组中并且表达外源序列的产物。
外源核酸序列可包括具有或不具有一个或多个启动子的编码一个或多个功能多肽的序列(例如cDNA)和/或可产生一个或多个RNA序列(例如经由一个或多个shRNA表达盒)。在某些实施方案中，核酸序列包括编码抗体、抗原、酶、生长因子、受体(细胞表面或细胞核)、激素、淋巴因子、细胞因子、报道分子、上述任何一个的功能片段和上述的组合的无启动子序列。之后通过由内源PPP1R12C启动子驱动的转录确保整合的序列的表达。在其他的实施方案中，“串联的”盒以此方式被整合到PPP1R12C基因座中，盒的第一组件包括如前文所描述的无启动子序列，之后是转录终止序列和编码自主表达盒的第二序列。
在某些实施方案中，多核苷酸还包括第二核苷酸序列，其与PPP1R12C基因中的第二序列同源。第二核苷酸序列可与PPP1R12C基因中的第二序列相同。此外，在包括第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的实施方案中，第一核苷酸序列可与PPP1R12C基因中的第一序列相同，而第二核苷酸序列可与PPP1R12C基因中的第二序列同源但不相同。在本文所描述的方法的任何一个中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列位于外源序列侧面。
在某些实施方案中，多核苷酸是质粒。在另外的实施方案中，多核苷酸是线状DNA分子。
在另一个方面中，本文提供了用于将外源序列整合到细胞的基因组中的PPP1R12C基因中的方法，所述方法包括：(a)在细胞中表达第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包括第一锌指结合结构域和第一切割半结构域，其中所述第一锌指结合结构域已被设计成与细胞的基因组的PPP1R12C基因座中的第一靶位点结合；(b)在细胞中表达第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包括第二锌指结合结构域和第二切割半结构域，其中所述第二锌指结合结构域与细胞的基因组的PPP1R12C基因座中的第二靶位点结合，其中第二靶位点与第一靶位点不同；以及(c)将细胞与包括外源核酸序列的多核苷酸接触；其中第一融合蛋白与第一靶位点的结合和第二融合蛋白与第二靶位点的结合定位切割半结构域，使得细胞的基因组在PPP1R12C基因座中被切割，由此导致外源序列在PPP1R12C基因座中同源性依赖的整合到细胞的基因组中。在某些实施方案中，编码功能多肽的外源序列被插入到PPP1R12C基因中。
在本文描述的方法的任何一个中，第一切割半结构域和第二切割半结构域来自IIS型限制性内切核酸酶，例如FokI或StsI。此外，在本文描述的方法的任何一个中，融合蛋白中的至少一个可包括切割半结构域的二聚化界面的氨基酸序列中的改变，例如使得切割半结构域的专性异源二聚体(obligate heterodimer)形成。
在本文描述的方法的任何一个中，细胞可是哺乳动物细胞，例如，人类细胞。此外，细胞可被停滞在细胞周期的G2期。另外，在本文描述的方法的任何一个中，第一锌指结合结构域和/或第二锌指结合结构域可包括具有表1中展示的识别螺旋的锌指蛋白(例如其中所使用的ZFN对包括ZFN 15556和ZFN 15590的方法)。
因此本主题包括但不限于以下实施方案：
1.一种用于在细胞中表达外源核酸序列的产物的方法，所述方法包括：
(a)在细胞中表达第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包括第一锌指结合结构域和第一切割半结构域，其中所述第一锌指结合结构域已被设计成与细胞的基因组的PPP1R12C基因中的第一靶位点结合；
(b)在细胞中表达第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包括第二锌指结合结构域和第二切割半结构域，其中所述第二锌指结合结构域与细胞的基因组的PPP1R12C基因中的第二靶位点结合，其中第二靶位点与第一靶位点不同；以及
(c)将细胞与包括外源核酸序列的多核苷酸接触；
其中第一融合蛋白与第一靶位点的结合和第二融合蛋白与第二靶位点的结合定位切割半结构域，使得细胞的基因组在PPP1R12C基因中被切割，由此导致外源序列在PPP1R12C基因中同源性依赖的整合到细胞的基因组中并表达外源序列的产物。
2.如1所述的方法，其中所述外源核酸序列编码多肽。
3.如2所述的方法，其中所述多肽选自由抗体、抗原、酶、生长因子、受体(细胞表面或细胞核)、激素、淋巴因子、细胞因子、报道分子、其功能片段和其组合所组成的组。
4.如1至3中的任何一项所述的方法，其中所述外源序列还包括启动子。
5.如4所述的方法，其中所述多核苷酸还包括第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列与PPP1R12C基因中的第一序列同源但不相同。
6.如5所述的方法，其中所述多核苷酸还包括第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列与PPP1R12C基因中的第二序列同源但不相同。
7.如6所述的方法，其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列位于外源序列侧面。
8.如1至7中的任何一项所述的方法，其中所述多核苷酸是质粒。
9.如1所述的方法，其中所述多核苷酸是线状DNA分子。
10.如1至9中的任何一项所述的方法，其中所述第一切割半结构域和第二切割半结构域来自IIS型限制性内切核酸酶。
11.如10所述的方法，其中所述IIS型限制性内切核酸酶选自由FokI和StsI组成的组。
12.如1至12中的任何一项所述的方法，其中所述细胞被停滞在细胞周期的G2期。
13.如1至11中的任何一项所述的方法，其中所述融合蛋白中的至少一个包括切割半结构域的二聚化界面的氨基酸序列中的改变。
14.如1至13所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
15.如14所述的方法，其中所述细胞是人类细胞。
附图简述
图1是描述锌指核酸酶(ZFN)驱动的向PPP1R12C基因的靶向插入中所涉及的各种多核苷酸组件的示意图。参见，实施例1。顶部的线描述内源PPP1R12C基因座，包括示例性ZFN靶位点和与编码GFP的示例性质粒供体同源的区域。中部的线描述环状GFP质粒供体。当ZFN存在时，如底部的示意图所示，质粒供体上携带的GFP编码序列被插入PPP1R12C基因中。图中展示的实施方案允许所整合的GFP开放读码框的转录和其随后通过整合剪接受体(SA)位点的翻译，之后是翻译中断-再启动信号(2A；Fang等人(2005)Nat Biotech.23：584)，之后是GFP开放读码框，以及多腺苷酸化信号。
图2图示描述染色体19(顶部的线)和染色体19中PPP1R12C/p84的位置(中部的线)。示例性的ZFN结合位点示于底部的线上的PPP1R12C的内含子1。
图3，图A、B和C，描述靶向整合测定，所述靶向整合测定评估图1中所示的供体多核苷酸单独(标记为“供体单独”的泳道)或供体多核苷酸和靶向PPP1R12C的ZFN(标记为“供体+ZFN”的泳道)转染的细胞中GFP ORF的整合。图3A显示K562细胞中的结果。图3B显示293T细胞中的结果；以及图3C显示Hep3B细胞中的结果。
图4，图A至F，描述如FACS所评估的GFP阳性细胞的百分比。图4A描述仅用GFP供体转染的K562细胞中的GFP阳性细胞。图4B描述用GFP供体和靶向PPP1R12C的ZFN转染的K562细胞中的GFP阳性细胞。图4C描述仅用GFP供体转染的293T细胞中的GFP阳性细胞。图4D描述用GFP供体和靶向PPP1R12C的ZFN转染的293T细胞中的GFP阳性细胞。图4E描述仅用GFP供体转染的Hep3B细胞中的GFP阳性细胞。图4F描述用GFP供体和靶向PPP1R12C的ZFN转染的Hep3B细胞中的GFP阳性细胞。
图5是描述在标明的细胞类型中PPP1R12C/p84mRNA表达的图解。PPP1R12C/18S标明PPP1R12C基因座相对于18S的表达，而PPP1R12C/GAPDH标明相对于GAPDH的表达的表达。
图6描述当标明的ZFN存在或不存在时供体多核苷酸向PPP1R12C/p84基因座中的整合。整合百分比示于每泳道之下。泳道1显示阴性对照(无ZFN)。泳道2显示用ZFN对15554/15587转染的细胞；泳道3显示用ZFN对15554/15590转染的细胞；泳道4显示用ZFN对15556/15587转染的细胞；泳道5显示用ZFN对15556/15590转染的细胞；泳道6显示用ZFN对15557/15587转染的细胞；泳道7显示用ZFN对15557/15590转染的细胞；以及泳道8显示用ZFN对9931/10099转染的细胞；ZFN对示于表1中。
图7，图A和B，描述ZFN介导的无启动子GFP ORF的插入。图7A是描述GFP ORF向由ZFN切割的区域的整合和mRNA表达的示意图。图7B描述GFP ORF在ZFN不存在(泳道1)或存在(泳道2)的条件下的插入。具有在ZFN存在(泳道2)的条件下整合的GFP ORF的细胞的百分比(9.6％)标明于泳道2之下。
图8，图A至E，描述含有启动子转录单位(PTU)的供体的整合。图8A显示当由内源p84启动子驱动时，K562细胞中GFP的表达的表观遗传的稳定性。显示了在无选择培养基中生长的25天内(大约30次细胞倍增)所测量的GFP阳性细胞池(十字)、由有限的稀释得到的在p84处对于GFP ORF来说纯合的(正方形)和杂合的(三角形)克隆的平均荧光强度(MFI)。也显示了未转化的K562(菱形)。图8B描述显示除了GFPORF筛选标记(screening marker)之外shRNA表达盒整合的串联的“标记-PTU”加入过程的图解示意图。图8C描述使用ZFN转移至p84基因座的PTU的有效的长期功能。如图8C中图示描述的，细胞(按照图中出现的顺序)为被留下未作处理，用编码抗CD58的质粒的shRNA瞬时转染或用ZFN和供体质粒转染。使用抗CD58的抗体通过免疫荧光和FACS测定细胞表面上CD58的表达。图8D描述p84处细胞双转基因的FACS染色概况。图8E描述对仅携带GFP ORF(中间泳道)或携带与编码抗CD58的shRNA的PTU串联的GFP ORF(右泳道)的GFP阳性细胞的以定量PCR为基础的测定的结果。数目表示已经被修饰的群体的百分比。
图9，图A和B，描述ZFN作用的全核(nucleus-wide)分子细胞学测量。图9A是显示由IL2Rγ靶向和p84靶向的ZFN在它们预期的基因座驱动的基因组编辑效率的对比的凝胶的再现。用标明的试剂转染K562细胞。靶基因座处的基因断裂频率通过SurveyorTM内切核酸酶如Miller等人(2007)Nat.Biotechnol.25(7)：778-785所描述的测定并标明在适当的泳道之下。图9B是描述使用如Miller等人(2007)Nat.Biotechnol.25(7)：778-785中所描述的基于FACS的测定在如标明的处理的细胞中的总的全核水平的H2A.X染色的图解。
详述
本公开内容涉及用于向位于染色体19上的人类PPP1R12C基因靶向整合(TI)的方法和组合物。PPP1R12C是腺伴随病毒向人类基因组整合的主要位点并且没有病理生理学事件已经与AAV感染相关(Warrington&Herzog(2006)Hum Genet 119：571-603)，表明PPP1R12C功能的丢失为人类细胞所耐受并且这一基因座可被认为是靶向整合的“安全港”。而且，PPP1R12C基因是广泛转录的。因此，插入的(供体)序列可是无启动子的并且整合的开放读码框的转录可由内源基因启动子产生，其降低了由于供体的随机整合和/或经由供体所携带的启动子的内源基因假性活化而引起的严重的不良事件的可能性(参见，例如Kohn等人Nat Rev Cancer3：477-488)。
用于向PPP1R12C基因靶向切割和重组的组合物包括融合蛋白、编码这些蛋白的多核苷酸以及多肽和编码多肽的多核苷酸的组合，所述融合蛋白含有切割结构域(或切割半结构域)和锌指结合结构域。锌指结合结构域可含有一个或多个锌指(例如2、3、4、5、6、7、8、9或更多锌指)并且可被设计成与PPP1R12C中的任何序列结合。细胞中这样的融合蛋白(或蛋白)的存在将导致融合蛋白与它(它们)的结合位点的P1R12C基因中的切割。
概况
本发明的实践，以及本文公开的组合物的制备和使用，除非另有说明，使用分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养、重组DNA和也在本领域技能范围内的相关领域中的常规技术。这些技术在文献中被充分说明。参见例如Sambrook等人MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL(分子克隆：实验室手册)，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989和第三版，2001；Ausubel等人，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(分子生物学中的通用规程)，JohnWiley&Sons，New York，1987和定期更新；METHODS IN ENZYMOLOGY(酶学方法)系列，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTUREAND FUNCTION(染色质结构和功能)，第三版，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY(酶学方法)，304卷，“Chromatin(染色质)”(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe，编辑)，Academic Press，San Diego，1999和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(分子生物学方法)，119卷，“Chromatin Protocols(染色质规程)”(P.B.Becker编辑)Humana Press，Totowa，1999。
定义
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用并是指线状或环状构象以及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。为了本公开内容的目的，这些术语不被理解为在有关聚合物长度的方面限制。该术语可包括天然的核苷酸的已知的类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸部分被修饰的核苷酸(例如硫代磷酸酯主链)。通常，特定的核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即A的类似物将与T碱基配对。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可互换使用以指氨基酸残基的聚合物。该术语还适用于其中一个或多个氨基酸是相应的天然存在的氨基酸的化学类似物或修饰的衍生物的氨基酸聚合物。
“结合”是指大分子之间(例如蛋白和核酸之间)序列特异的、非共价的相互作用。只要相互作用作为一个整体是序列特异的即可，并非结合相互作用的所有组件都需要是序列特异的(例如与DNA主链中的磷酸残基的接触)。这种相互作用通常以10-6M-1或更低的解离常数(Kd)为特征。“亲和性”是指结合的强度：增加的结合亲和性与较低的Kd有关。
“结合蛋白”是能够与另一个分子非共价结合的蛋白。结合蛋白可与例如DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白分子(蛋白结合蛋白)结合。在蛋白结合蛋白情况下，它可与自身结合(以形成同型二聚体、同型三聚体等)和/或它可与不同蛋白或多个不同蛋白的一个或多个分子结合。结合蛋白可具有多于一种类型的结合活性。例如锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白结合活性。
“锌指DNA结合蛋白”(或结合结构域)是蛋白或者较大蛋白中的结构域，其以序列特异的方式通过一个或多个锌指结合DNA，锌指是结合结构域中其结构通过锌离子配位而被稳定的氨基酸序列区域。术语锌指DNA结合蛋白常常被缩写为锌指蛋白或ZFP。
锌指结合结构域可被“设计”成与预定的核苷酸序列结合。用于设计锌指蛋白的方法的非限制性的实例是设计和选择。设计的锌指蛋白是自然界中不存在的蛋白，其设计/组成主要产生自合理标准。设计的合理标准包括取代规则和用于处理在储存已有的ZFP设计和结合数据信息的数据库中的信息的计算机算法的应用。参见，例如美国专利6,140,081、6,453,242和6,534,261；还参见WO 98/53058、WO 98/53059、WO 98/53060、WO02/016536和WO 03/016496。
“选择的”锌指蛋白是在自然界中找不到的蛋白，其产生主要来自于实验处理例如噬菌体展示、相互作用陷阱或杂交体选择。参见例如US5,789,538、US 5,925,523、US 6,007,988、US 6,013,453、US 6,200,759、WO 95/19431、WO 96/06166、WO 98/53057、WO 98/54311、WO 00/27878、WO 01/60970WO 01/88197和WO 02/099084。
术语“序列”是指任何长度的核苷酸序列，其可是DNA或RNA；可是线状、环状或分枝的并且可是单链或双链的。术语“供体序列”是指插入基因组的核苷酸序列。供体序列可具有任何长度，例如长度为2和10,000核苷酸之间(或其间或其上的任何整数值)，优选地长度为约100和1,000核苷酸之间(或其间的任何整数)，更优选长度为约200和500核苷酸之间。
“同源但不相同的序列”是指与第二序列分享一定程度的序列同一性的第一序列，但是其序列与第二序列的序列不相同。例如，含有突变基因的野生型序列的多核苷酸与突变基因的序列是同源但不相同的。在某些实施方案中，两个序列之间的同源性的程度足以允许其间利用正常的细胞机制的同源重组。两个同源但不相同的序列可是任何长度的并且它们的非同源性的程度可小至一个核苷酸(例如，为了通过靶向同源重组修正基因组点突变)或大至10或更多千碱基(例如为在染色体中的预定的异位位点插入基因)。含有同源但不相同的序列的两个多核苷酸不必为相同长度。例如，可使用20和10,000核苷酸或核苷酸对之间的外源多核苷酸(即供体多核苷酸)。
用于测定核酸和氨基酸序列的同一性的技术是本领域已知的。通常，这些技术包括测定基因的mRNA的核苷酸序列和/或测定其编码的氨基酸序列并将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列对比。基因组序列也可以这一方式被测定和对比。通常，同一性分别是指两个多核苷酸或多肽序列的精确的核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的一致性。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可通过测定它们的百分比同一性而被对比。无论核酸还是氨基酸序列，两个序列的同一性百分比是两个比对序列之间的精确匹配数除以较短的序列的长度并乘以100的数目。核酸序列的近似的序列对比是由Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics(应用数学进展)2：482-489(1981)的局部同源性算法提供的。这一算法可通过使用由Dayhoff，Atlas of Protein Sequences and Structure(蛋白序列和结构的地图集)，M.O.Dayhoff编辑.，第5次增补.3：353-358，National BiomedicalResearch Foundation，Washington，D.C，USA开发并由Gribskov，Nucl.Acids Res.14(6)：6745-6763(1986)标准化的得分矩阵而应用到氨基酸序列。这一算法测定序列的同一性百分比的示例性实施是由Genetics Computer Group(Madison，WI)在“BestFit”发明专利申请中提供的。这一方法的默认参数描述于Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual(Wisconsin序列分析程序包手册)，第8版(1995)(可从Genetics Computer Group，Madison，WI获得)。在本公开内容的背景下，建立同一性百分比的优选的方法是使用University of Edinburgh版权的John F.Collins和Shane S.Sturrok开发并由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)发布的MPSRCH程序包。根据这一套程序包，Smith-Waterman算法可在默认参数被用于记分台时(例如空位开放罚分12、空位延伸罚分1和空位6)使用。根据所产生的数据，“匹配”值反映了序列同一性。用于计算序列间同一性百分比或相似性的其他的适合的程序一般是本领域已知的，例如，另一种序列比对程序是BLAST，以默认参数使用。例如，BLASTN和BLASTP可通过采用下列默认参数而使用：遗传密码＝标准、过滤器＝无、链＝两者、临界值＝60、预期值＝10、矩阵＝BLOSUM62、描述＝50个序列、分类依据＝高分、数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swissprotein+Spupdate+PIR。这些程序的细节可在因特网上找到。关于本文所描述的序列，序列同一性的所期望的程度的范围是大约80％至100％以及其中任何整数值。通常序列间的同一性百分比为至少70-75％，优选地80-82％，更优选地85-90％，甚至更优选地92％，还更优选地95％和最优选地98％的序列同一性。
可选地，多核苷酸之间的序列相似性的程度可通过在允许同源区域间稳定的双链体形成的条件下多核苷酸的杂交，之后是使用单链特异性核酸酶的消化和所消化片段的大小测定来测定。如使用上文的方法所测定的，当序列在确定的分子长度上显示出至少约70％-75％，优选地80％-82％，更优选地85％-90％，甚至更优选地92％，还更优选地95％和最优选地98％的序列同一性时，两个核酸或两个多肽序列是彼此大致同源的。如本文所用的，大致同源还指显示出与特定的DNA或多肽序列的完全同一性的序列。大致同源的DNA序列可在DNA杂交实验中在例如如对特定系统确定的严格条件下被识别。确定适当的杂交条件属于本领域的技术。参见例如Sambrook等人，如上；Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach(核酸杂交：实用方法)，B.D.Hames和S.J.Higgins编辑，(1985)Oxford；Washington，DC；IRL Press)。
两个核酸片段的选择性杂交可被如下测定。两个核酸分子之间的序列同一性的程度影响这些分子之间的杂交事件的效率和强度。部分相同的核酸序列将至少部分地抑制完全相同的序列与靶分子的杂交。完全相同的序列的杂交的抑制可使用本领域熟知的杂交测定来评定(例如Southern(DNA)印迹、Northern(RNA)印迹、溶液杂交或类似技术，参见Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第二版(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。这种测定可使用不同程度的选择性，例如使用从低严格性到高严格性变化的条件来进行。如果使用了低严格性的条件，非特异性结合的缺少可使用缺少甚至部分程度的序列同一性的次级探针(例如，与靶分子具有少于约30％序列同一性的探针)来评定，这样，缺少非特异性结合事件的情况下，次级探针将不与靶杂交。
当使用基于杂交的检测系统时，选择与参照核酸序列互补的核酸探针，并且随后通过选择适当的条件，探针和参照序列彼此选择性地杂交或结合以形成双链体分子。能够选择性地与参照序列在适度严格的杂交条件下选择性杂交的核酸分子通常在允许检测长度为至少约10-14个核苷酸的与所选择的核酸探针的序列具有至少约70％的序列同一性的靶核酸序列的条件下杂交。严格杂交条件通常允许检测长度为至少约10-14个核苷酸的与所选择的核酸探针的序列具有高于约90-95％的序列同一性的靶核酸序列。当探针和参照序列具有特定程度的序列同一性时，用于探针/参照序列杂交的杂交条件可如本领域中已知的被确定(参见，例如，Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach(核酸杂交：实用方法)，B.D.Hames和S.J.Higgins编辑，(1985)Oxford；Washington，DC；IRL Press)。
用于杂交的条件是本领域内的那些技术人员熟知的。杂交严格性是指杂交条件不适于含有错配核苷酸的杂交体的形成的程度，较高的严格性与对错配杂交体的较低的耐受性相关。影响杂交的严格性的因素是本领域的那些技术人员熟知的，并且包括但不限于温度、pH、离子强度和有机溶剂例如甲酰胺和二甲基亚砜的浓度。如本领域的那些技术人员已知的，杂交的严格性随更高的温度、更低的离子强度和更低的溶剂浓度而升高。
关于杂交的严格性条件，本领域内熟知的是通过变化例如下列因素，许多等效条件可被用于建立特定的严格性：序列的长度和性质，不同序列的碱基组成、盐和其他杂交溶液成分的浓度，杂交溶液中存在或不存在封闭剂(例如硫酸葡聚糖和聚乙二醇)，杂交反应温度和时间参数，以及改变清洗条件。一套特定杂交条件的选择是按照本领域内的标准方法选择的(参见例如Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第二版(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。
“重组”是指两个多核苷酸之间互换遗传信息的过程。为了本公开内容的目的，“同源重组(HR)”是指在例如细胞中双链断裂的修复期间发生的这种交换的特殊化的形式。这一过程需要核苷酸序列同源性，使用“供体”分子来模板修复“靶”分子(即经历双链断裂的分子)，并且由于其导致遗传信息从供体向靶转移而不同地称为“非交换型基因转化”或“短序列基因转化(short tract gene conversion)”。不希望被任何特定的理论所束缚，这种转移可涉及在断裂的靶和供体间形成的异源双链体DNA的错配修正，和/或“合成依赖的链退火”，其中供体被用于重合成将会成为部分靶的遗传信息和/或相关的过程。这种特殊化的HR常常导致靶分子的序列的改变以致供体多核苷酸的部分或全部序列被结合到靶多核苷酸中。
“切割”是指DNA分子的共价主链的断裂。切割可由不同的方法起始，所述方法包括但不限于磷酸二酯键的酶水解或化学水解。单链切割和双链切割都是可能的，并且双链切割可作为两个不同的单链切割事件的结果而发生。DNA切割可导致平端或粘性末端(staggered end)的产生。在某些实施方案中，融合多肽被用于靶向的双链DNA切割。
“切割结构域”包括对DNA切割具有催化活性的一个或多个多肽序列。切割结构域可包含在单独的多肽链中或者切割活性可来自两个(或更多个)多肽的联合。
“切割半结构域”是多肽序列，其与第二多肽(相同或不同的)结合形成具有切割活性(优选地双链切割活性)的复合体。
“染色质”是含有细胞基因组的核蛋白结构。细胞染色质包括核酸(主要是DNA)和蛋白(包括组蛋白和非组蛋白染色体蛋白)。大多数真核细胞染色质以核小体的形式存在，其中，核小体的核包括与含有组蛋白H2A、H2B、H3和H4各两个的八聚体相关的约150碱基对的DNA；并且连接体DNA(具有取决于生物体的可变的长度)在核小体的核之间延伸。组蛋白H1分子通常与连接体DNA有关。为了本公开内容的目的，术语“染色质”意指包括所有类型的细胞核蛋白，原核的和真核的。细胞染色质包括染色体染色质和附加型染色质。
“染色体”是含有全部或部分细胞基因组的染色质复合体。细胞基因组常常以它的核型为特征，核型是包括细胞基因组的所有染色体的集合。细胞基因组可包括一个或多个染色体。
“附加体”是含有不是细胞染色体核型的一部分的核酸的复制的核酸、核蛋白复合体或其他结构。附加体的实例包括质粒和某些病毒基因组。
“易接近的区域”是细胞染色质中的位点，其中核酸中存在的靶位点可被识别靶位点的外源分子结合。不希望被任何特定的理论所束缚，据信易接近的区域是没有被包装到核小体结构中的区域。易接近的区域的不同结构常常可通过它对化学和酶探针例如核酸酶的敏感度来检测。
“靶位点”或“靶序列”是以结合发生的充足条件为条件，定义结合分子将结合的核酸部分的核酸序列。例如，序列5’-GAATTC-3’是Eco RI限制性内切核酸酶的靶位点。
“外源的”分子是细胞中不是正常存在的但是可通过一种或多种遗传、生物化学或其他方法被引入细胞中的分子。就细胞特定的发育阶段和环境条件而言来确定“细胞中正常存在”。因此，例如只在肌肉的胚胎发育期间存在的分子对于成体肌肉细胞而言是外源分子。相似地，通过热休克诱导的分子对于非热休克的细胞来说是外源分子。外源分子可包括例如任何多肽或其片段的编码序列，未发挥作用的内源分子的发挥作用的形式或正常发挥作用的内源分子的未发挥作用的形式。此外，外源分子可包括来自另一物种的编码序列，其是宿主细胞中的内源基因的直向同源物。
特别地，外源分子可是小分子，例如通过组合的化学过程产生的，或大分子，例如蛋白、核酸、糖类、脂类、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的任何的修饰的衍生物或含有上述分子中的一种或多种的任何复合体。核酸包括DNA和RNA，可是单链或双链；可是线状、分枝或环状的并且可具有任何长度。核酸包括能够形成双链体的那些，以及形成三链体的核酸。参见例如美国专利第5,176,996和5,422,251号。蛋白包括但不限于DNA结合蛋白、转录因子、染色质重构因子、甲基化的DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、脱甲基酶、乙酰基转移酶、脱乙酰基酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶和解旋酶。
外源分子可是与内源分子相同类型的分子，例如外源蛋白或核酸。例如，外源核酸可包括引入细胞的感染的病毒基因组、质粒或附加体或在细胞中不是正常存在的染色体。用于将外源分子引入细胞的方法是本领域的那些技术人员已知的，并且包括但不限于脂类介导的转移(即，脂质体，包括中性脂类和阳离子脂类)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移和病毒载体(vector)介导的转移。
相比之下，“内源”分子是在特定的环境条件下处于特定发育阶段的特定的细胞中正常存在的分子。例如，内源核酸可包括染色体，线粒体、叶绿体或其他细胞器的基因组，或者天然存在的附加型核酸。此外，内源分子可包括蛋白，例如转录因子和酶。
如本文所用的，术语“外源核酸的产物”包括多核苷酸和多肽产物，例如转录产物(多核苷酸，例如RNA)和翻译产物(多肽)。
“融合”分子是其中两个或更多亚基分子被连接(优选共价地)的分子。亚基分子可是相同化学类型的分子或者可是不同化学类型的分子。第一类型的融合分子的实例包括但不限于融合蛋白(例如ZFP DNA结合结构域和切割结构域之间的融合)和融合核酸(例如，编码上文描述的融合蛋白的核酸)。第二类型的融合分子的实例包括但不限于形成三链体的核酸和多肽之间的融合，以及小沟结合物和核酸之间的融合。
细胞中融合蛋白的表达可由融合蛋白向细胞的递送产生或通过编码融合蛋白的多核苷酸向细胞的递送产生，其中多核苷酸被转录，并且转录物被翻译以产生融合蛋白。反式剪接、多肽切割和多肽连接也可被涉及在细胞中的蛋白的表达中。本公开内容的其他地方介绍了用于多核苷酸和多肽向细胞递送的方法。
为了本公开内容的目的，“基因”包括编码基因产物(见下文)的DNA区域，以及调节基因产物的产生的所有DNA区域，无论这些调节序列是否邻近编码和/或转录的序列。相应地，基因包括但不必限于，启动子序列、终止子、翻译调节序列例如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默基因、绝缘子、边界元件、复制原点、基质附着部位和基因座控制区。
“基因表达”是指包含在基因中的信息转化成基因产物。基因产物可是直接的基因转录产物(例如mRNA、tRNA、rRNA，反义RNA、核酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)或经由mRNA翻译所产生的蛋白。基因产物还包括通过过程例如加帽、多聚腺苷化、甲基化和编辑而被修饰的RNA和通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、十四烷基化(myristilation)和糖基化而被修饰的蛋白。
基因表达的“调节”是指基因活性的改变。表达的调节可包括但不限于基因活化和基因抑制。
“真核”细胞包括但不限于真菌细胞(例如酵母)、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人类细胞。
“感兴趣的区域”是细胞染色质的任何区域，例如，诸如基因或者基因中或邻近基因的非编码序列，其中结合外源分子是所期望的。结合可是为了靶向的DNA切割和/或靶向的重组的目的。感兴趣的区域可存在于例如染色体、附加体、细胞器的基因组(例如线粒体的、叶绿体的)或感染的病毒基因组中。感兴趣的区域可在基因的编码区域中，在转录的非编码区域例如，诸如前导序列、尾随序列或内含子中，在非转录区域(编码区域的上游或下游)中。感兴趣的区域在长度上可是小至单个核苷酸对或多达2,000个核苷酸对，或任何整数值的核苷酸对。
对于两个或更多组件(例如序列元件)的并置，术语“操作的连接”和“操作地连接的”(或“可操作地连接的”)可互换使用，其中组件被排列以使组件正常起作用并允许至少一个组件可介导施加于至少一个其他组件的作用的可能性。通过示例性说明，转录调节序列，例如启动子被操作地连接至编码序列，如果转录调节序列响应于一种或多种转录调节因子的存在或不存在控制编码序列的转录的水平。转录调节序列通常可操作地与编码序列顺式连接，但不必与其直接相邻。例如，增强子是转录调节序列，其操作地连接至编码序列，即使它们不是相邻的。
就融合多肽而言，术语“操作地连接的”可指与其他组件连接的每个组件执行的功能与如果它未如此连接时执行的功能相同的事实。例如，对于其中ZFP DNA结合结构域与切割结构域融合的融合多肽来说，如果在该融合多肽中ZFP DNA结合结构域部分能够结合它的靶位点和/或它的结合位点，而切割结构域能够邻近靶位点切割DNA，那么ZFP DNA结合结构域与切割结构域处于操作地连接。
蛋白、多肽或核酸的“功能片段”是其序列与全长的蛋白、多肽或核酸不相同但仍保留与全长的蛋白、多肽或核酸相同的功能的蛋白、多肽或核酸。功能片段可具有比相应的天然分子更多、更少或相同数目的残基，和/或可包含一个或多个氨基酸或核苷酸取代。用于确定核酸功能(例如编码功能、与另一个核酸杂交的能力)的方法是本领域熟知的。相似地，用于确定蛋白功能的方法是熟知的。例如，多肽的DNA结合功能可通过例如滤膜结合、电泳迁移率变换或免疫沉淀测定来确定。DNA切割可通过凝胶电泳来测定。参见Ausubel等人，如上。蛋白与另一个蛋白的相互作用的能力可通过例如免疫共沉淀、双杂交测定或互补(遗传的和生物化学的)来测定。参见例如Fields等人(1989)Nature 340：245-246；美国专利第5,585,245号和PCT WO 98/44350。
靶位点
所公开的方法和组合物包括含有切割结构域(或切割半结构域)和锌指结构域的融合蛋白，其中锌指结构域通过结合人类PPP1R12C基因座中的序列来指导与序列邻近的切割结构域(或切割半结构域)的活性并且因此诱导PPP1R12C中的切割(例如双链断裂)。如本公开内容中其他地方所展示的，锌指结构域可被设计成结合实际上任何期望的序列。相应地，一个或多个锌指结合结构域可被设计成结合PPP1R12C基因中的一个或多个序列。在细胞中，包括锌指结合结构域和切割结构域的融合蛋白(或两个融合蛋白，其每个包括锌指结合结构域和切割半结构域)的表达影响PPP1R12C基因中的切割。
PPP1R12C中用于经由锌指结构域来结合的序列(例如靶位点)的选择可依照例如共有的美国专利第6,453,242号(2002年9月17日)中公开的方法完成，该专利还公开了用于设计ZFP以与所选择的序列结合的方法。对于本领域的那些技术人员来说简单的目视检查核苷酸序列也可被用于选择靶位点是明显的。相应地，用于靶位点选择的任何方法可在本文描述的方法中使用。
靶位点通常包括多个相邻的靶亚位点。靶亚位点是指被各个锌指结合的序列(通常是可经由一个核苷酸与相邻的四联体重叠的核苷酸三联体或核苷酸四联体)。参见例如WO 02/077227。如果锌指蛋白与其进行大部分接触的链是指定的靶链“初级识别链”或“初级接触链”，某些锌指蛋白结合靶链中的三碱基三联体和在非靶链上的第四个碱基。靶位点通常具有至少9个核苷酸的长度，并且相应地被含有至少三个锌指的锌指结合结构域结合。然而，例如4-指结合结构域与12-核苷酸靶位点的结合、5-指结合结构域与15-核苷酸靶位点的结合或6-指结合结构域与18-核苷酸靶位点的结合也是可能的。显然地，更大的结合结构域(例如7-、8-、9-指和更多)与更长的靶位点的结合也是可能的。
对于靶位点来说不必为三个核苷酸的倍数。例如，在其中发生交叉链相互作用的情况中(参见例如美国专利6,453,242和WO 02/077227)，多指结合结构域中的各个锌指中的一个或多个可与重叠的四联体亚位点结合。作为结果，三指蛋白可结合10-核苷酸的序列，其中第十个核苷酸是末端的指结合的四联体的一部分，四指蛋白可结合13-核苷酸序列，其中第十三个核苷酸是末端的指结合的四联体的一部分，等等。
多指结合结构域中的各个锌指之间的氨基酸连接体序列的长度和性质也影响与靶序列的结合。例如，多指结合结构域中相邻锌指之间的所谓的“非规范连接体”、“长连接体”或“结构连接体”的存在可允许这些指结合不是直接相邻的亚位点。这种连接体的非限制性实例被描述于例如美国专利第6,479,626号和WO 01/53480中。相应地，在用于锌指结合结构域的靶位点中，一个或多个亚位点可通过1、2、3、4、5或更多个核苷酸与彼此分隔开。提供一个实例，四指结合结构域可与在序列中含有两个邻近的3-核苷酸亚位点，一个插入的核苷酸和两个连续的三联体亚位点的13-核苷酸的靶位点结合。
序列(例如靶位点)间的距离是指如从与彼此最近的序列的边缘开始所测量的两个序列之间插入的核苷酸或核苷酸对的数目。
在其中切割取决于两个锌指结构域/切割半结构域融合分子与分开的靶位点的结合的某些实施方案中，两个靶位点可位于相对的DNA链上(实施例1)。在其他的实施方案中，靶位点都位于同一个DNA链。
DNA结合结构域
任何DNA结合结构域可被用于本文所公开的方法中。在某些实施方案中，DNA结合结构域包括锌指蛋白。锌指结合结构域含有一个或多个锌指。Miller等人(1985)EMBO J.4：1609-1614；Rhodes(1993)ScientificAmerican二月：56-65；美国专利第6,453,242号。本文描述的锌指结合结构域通常包括2、3、4、5、6或者甚至更多个锌指。
通常，单独的锌指结构域在长度上大约为30个氨基酸。结构研究已经证实每个锌指结构域(基序)包括两个β片层(保持含有两个不变的半胱氨酸残基的β转角)和一个α螺旋(含有两个不变的组氨酸残基)，其通过经由两个半胱氨酸和两个组氨酸的锌原子的配位保持特定的构象。
锌指包括规范的C2H2锌指(即其中锌离子通过两个半胱氨酸和两个组氨酸残基配位的那些)和非规范的锌指例如，诸如C3H锌指(其中锌离子通过三个半胱氨酸残基和一个组氨酸残基配位的那些)和C4锌指(其中锌离子通过四个半胱氨酸残基配位的那些)。还参见WO 02/057293。
使用标准技术，可将锌指结合结构域设计成结合PPP1R12C中的靶位点(参见上文)。参见，实施例1；共有的美国专利6,453,242和6,534,261，包括其中引用的参考文献。与天然存在的锌指蛋白相比，设计的锌指结合结构域可具有新颖的结合特异性。设计的方法包括但不限于推理设计和各种类型的选择。推理设计包括例如使用包括三联体(或四联体)核苷酸序列和单独锌指氨基酸序列的数据库，其中每个三联体或四联体核苷酸序列与结合特定的三联体或四联体序列的锌指的一个或多个氨基酸序列相关。
示例性的选择方法，包括噬菌体展示和双杂交系统，被描述于美国专利5,789,538、5,925,523、6,007,988、6,013,453、6,410,248、6,140,466、6,200,759和6,242,568；以及WO 98/37186、WO 98/53057、WO 00/27878、WO 01/88197和GB 2,338,237。
锌指结合结构域的结合特异性的增强已经在例如共有的WO02/077227中描述。
由于单独锌指结合三核苷酸(即三联体)序列(或四核苷酸序列，其可通过一个核苷酸与邻近锌指的四核苷酸结合位点重叠)，锌指结合结构域被设计以结合的序列(例如靶序列)的长度将决定在设计的锌指结合结构域中锌指的数目。例如，对于其中指基序不与重叠的亚位点结合的ZFP，六核苷酸靶序列被二指结合结构域结合，九核苷酸靶序列被三指结合结构域结合，等。如本文所注意的，靶位点中单独的锌指的结合位点(即亚位点)不必是邻近的，而是取决于多指结合结构域中的锌指之间的氨基酸序列(即指间连接体)的长度和性质而可被一个或几个核苷酸分隔开。
在多指锌指结合结构域中，邻近的锌指可被大约5个氨基酸的氨基酸连接体序列(所谓的“规范的”指间连接体)分隔开，或可选择地被一个或多个非规范的连接体分隔开。参见，例如共有的美国专利第6,453,242和6,534,261号。对于含有多于三指的设计的锌指结合结构域来说，某些锌指之间较长(“非规范的”)指间连接体的插入由于可增加通过结合结构域的结合的亲和性和/或特异性而可是优选的。参见，例如，美国专利第6,479,626和WO 01/53480号。相应地，多指锌指结合结构域也可以关于非规范的指间连接体的存在和位置的方面为特征。例如，含有三个指(通过两个规范的指间连接体连接)、一个长连接体和三个另外的指(通过两个规范的指间连接体连接)的六指锌指结合结构域被表示为2x3构型。相似地，含有两个指(其间具有规范的连接体)、一个长连接体和两个另外的指(通过规范的连接体连接)的结合结构域被表示为2x2蛋白。含有三个两指单元(其每个中两个指通过一个规范的连接体连接)并且其中每个两指单元通过长连接体被连接至邻近的两指单元的蛋白，被称为3x2蛋白。
在多指结合结构域中两个相邻的锌指之间长的或非规范的指间连接体的存在常常允许两个指结合靶序列中并非直接相邻的亚位点。相应地，在靶位点中的亚位点之间可有一个或多个核苷酸的间隙，即靶位点可含有不被锌指接触的一个或多个核苷酸。例如2x2锌指结合结构域可结合被一个核苷酸分隔开的两个六核苷酸序列，即其结合13-核苷酸的靶位点。还参见Moore等人(2001a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：1432-1436；Moore等人(2001b)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：1437-1441和WO 01/53480。
如之前所提到的，靶亚位点是被一个锌指结合的三或四核苷酸序列。为了某些目的，二指单元被表示为结合构件。结合构件可通过例如在结合特定的六核苷酸靶序列的多指蛋白(通常三个指)的情况中选择两个相邻的指来获得。可选择地，构件可通过单独的锌指的集合来构建。还参见WO 98/53057和WO 01/53480。
可选择地，DNA结合结构域可从核酸酶获得。例如，归巢内切核酸酶和大范围核酸酶的识别序列例如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII是已知的。还参见，美国专利第5,420,032号；美国专利第6,833,252号；Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388；Dujon等人(1989)Gene 82：115-118；Perler等人(1994)Nucleic Acids Res.22，1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12：224-228；Gimble等人(1996)J.Mol.Biol.263：163-180；Argast等人(1998)J.Mol.Biol.280：345-353和New EnglandBiolabs catalogue(新英格兰生物实验室目录)。此外，归巢内切核酸酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性可被设计成结合非天然的靶位点。参见，例如Chevalier等人(2002)Molec.Cell 10：895-905；Epinat等人(2003)Nucleic Acids Res.31：2952-2962；Ashworth等人(2006)Nature 441：656-659；Paques等人(2007)Current Gene Therapy 7：49-66；美国专利公布第20070117128号。
切割结构域
本文公开的融合蛋白的切割结构域部分可从任何内切核酸酶或外切核酸酶获得。可从其获得切割结构域的示例性内切核酸酶包括但不限于限制性内切核酸酶和归巢内切核酸酶。参见，例如2002-2003目录，NewEngland Biolabs，Beverly，MA和Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388。切割DNA的其它酶是已知的(例如S1核酸酶、绿豆核酸酶、胰腺DNA酶I、微球菌核酸酶、酵母HO内切核酸酶；还参见Linn等人(编辑)Nucleases(核酸酶)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1993)。归巢内切核酸酶和大范围核酸酶的非限制性实例包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII是已知的。还参见，美国专利第5,420,032号；美国专利第6,833,252号；Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388；Dujon等人(1989)Gene 82：115-118；Perler等人(1994)NucleicAcids Res.22，1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet. 12：224-228；Gimble等人(1996)J.Mol.Biol.263：163-180；Argast等人(1998)J.Mol.Biol.280：345-353和New England Biolabs catalogue(新英格兰生物实验室目录)。这些酶中的一个或多个(或其功能片段)可被用作切割结构域和切割半结构域的来源。
限制性内切核酸酶(限制性酶)存在于许多物种中并且能够与DNA序列特异性地结合(在识别位点)并在结合的位点处或附近切割DNA。某些限制性酶(例如IIS型)在远离其识别位点的位点处切割DNA并具有可分离的结合和切割结构域。例如，IIS型酶Fok I在距其一条链上的识别位点9个核苷酸处和距其另一条链上的识别位点13个核苷酸处催化DNA的双链切割。参见，例如美国专利5,356,802、5,436,150和5,487,994；以及Li等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4275-4279；Li等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2764-2768；Kim等人(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：883-887；Kim等人(1994b)J.Biol.Chem.269：31，978-31，982。因此在一个实施方案中，融合蛋白含有来自至少一个IIS型限制性酶的切割结构域(或切割半结构域)和一个或多个锌指结合结构域，其可或不可被设计。
其切割结构域可与结合结构域分离的一种示例性IIS型限制性酶是Fok I。这一特定的酶作为二聚体时是活化的。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：10，570-10，575。相应地，为了本公开内容的目的，在所公开的融合蛋白中使用的Fok I酶的部分被认为是切割半结构域。因此，为了使用锌指-Fok I融合的细胞序列的靶向双链切割和/或靶向替代，两个融合蛋白，每个含有Fok I切割半结构域，可被用于重构催化活性的切割结构域。可选择地，也可使用含有锌指结合结构域和两个Fok I切割半结构域的单个多肽分子。使用锌指-Fok I融合的靶向切割和靶向序列改变的参数在本公开内容中其他地方提供。
切割结构域或切割半结构域可是保留切割活性的或保留多聚化(例如二聚化)以形成功能切割结构域的能力的蛋白的任何部分。
示例性IIS型限制性酶被描述于共有的国际公布WO 2007/014275中，其通过引用全文并入本文。
为了增强切割特异性，切割结构域还可被修饰。在某些实施方案中，使用了切割半结构域的变体，该变体将切割半结构域的同源二聚化最小化或阻止切割半结构域的同源二聚化。这种修饰的切割半结构域的非限制性的实例具体描述于WO 2007/014275中，其通过引用全文并入本文。还参见实施例。在某些实施方案中，切割结构域含有设计的切割半结构域(也称为二聚化结构域突变体)，其将同源二聚化最小化或阻止同源二聚化是本领域的那些技术人员已知的并被描述于例如美国专利公布第20050064474和20060188987号，其通过引用全文并入本文。Fok I的446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537和538位置处的氨基酸残基是影响Fok I切割半结构域的二聚化的所有靶。参见例如美国专利公布第20050064474和20060188987号；国际专利公布WO 07/139898；Miller等人(2007)Nat.Biotechnol.25(7)：778-785。
形成专性异源二聚体的其他设计的Fok I的切割半结构域也可被用于本文描述的ZFN中。第一切割半结构域包括Fok I的490和538位置处的氨基酸残基上的突变而第二切割半结构域包括氨基酸残基486和499处的突变。
在某些实施方案中，切割结构域含有两个切割半结构域，其都是含有结合结构域、第一切割半结构域和第二切割半结构域的单个多肽的一部分。切割半结构域可具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列，只要它们起作用以切割DNA。
通常，如果融合蛋白含有切割半结构域，那么两个融合蛋白是切割所需要的。可选择地，可使用含有两个切割半结构域的单个蛋白。两个切割半结构域可来源于相同的内切核酸酶(或其功能片段)或每个切割半结构域可来源于不同的内切核酸酶(或其功能片段)。此外，两个融合蛋白的靶位点被优选地相对于彼此排列，使得两个融合蛋白与它们各自的靶位点的结合以相对于彼此的空间方位放置切割半结构域，所述空间方位允许切割半结构域形成功能切割结构域(例如通过二聚化)。因此，在某些实施方案中，靶位点的近侧边缘被5-8个核苷酸或被15-18个核苷酸分隔开。然而，任何整数数目的核苷酸或核苷酸对可插入两个靶位点之间(例如从2至50个核苷酸或更多)。通常切割的点位于靶位点之间。
锌指结构域-切割结构域融合
用于设计和构成融合蛋白(以及编码这一融合蛋白的多核苷酸)的方法是本领域的那些技术人员已知的。例如，用于设计和构成含有锌指蛋白的融合蛋白(以及编码这一融合蛋白的多核苷酸)的方法被描述于共有的美国专利6,453,242和6,534,261以及国际公布WO 2007/014275中。在某些实施方案中，编码这些融合蛋白的多核苷酸被构成。这些多核苷酸可被插入载体中，而载体可被引入细胞中(参见下文关于将多核苷酸引入细胞的载体和方法的另外的公开内容)。
在本文描述的方法的某些实施方案中，融合蛋白含有锌指结合结构域和来自Fok I限制性酶的切割半结构域，并且在细胞中表达两个这样的融合蛋白。细胞中两个融合蛋白的表达可由两个蛋白向细胞的递送、一个蛋白和编码蛋白中的一个的一个核酸向细胞的递送、两个核酸(其每个编码蛋白中的一个)向细胞的递送或通过单一的核酸(其编码两个蛋白)向细胞的递送而产生。在另外的实施方案中，融合蛋白含有单一的多肽链，该单一的多肽链含有两个切割半结构域和锌指结合结构域。在这一实例中，单一的融合蛋白在细胞中被表达，并且，不希望被理论所束缚，单一的融合蛋白据信作为切割半结构域的分子内二聚体的形成的结果而切割DNA。
两个融合蛋白，每个含有锌指结合结构域和切割半结构域，可在细胞中被表达并与靶位点结合，所述靶位点以使得在靶位点附近功能切割结构域被重构并且DNA被切割的方式并置。在一个实施方案中，切割发生在两个锌指结合结构域的靶位点之间。锌指结合结构域中的一个或两个和/或切割结构域可被设计。参见实施例1。
融合蛋白(例如ZFP-Fok I融合)的组件可被排列，以使锌指结构域最接近融合蛋白的氨基末端并且切割半结构域最接近羧基末端。通过融合蛋白与相对的DNA链上的位点的结合获得切割半结构域的二聚化以形成功能核酸酶，结合位点的5’末端彼此最接近。
可选择地，融合蛋白(例如ZFP-Fok I融合)的组件可被排列以使切割半结构域最接近融合蛋白的氨基末端并且锌指结构域最接近羧基末端。在这些实施方案中，通过融合蛋白与相对的DNA链上的位点的结合获得切割半结构域的二聚化以形成功能核酸酶，结合位点的3’末端彼此最接近。
在还有另外的实施方案中，第一融合蛋白包含最接近融合蛋白的氨基末端的切割半结构域和最接近融合蛋白的羧基末端的锌指结构域，而第二融合蛋白被排列以使锌指结构域最接近融合蛋白的氨基末端并且切割半结构域最接近羧基末端。在这些实施方案中，两个融合蛋白都与相同的DNA链结合，含有最接近羧基末端的锌指结构域的第一融合蛋白的结合位点位于含有最接近氨基末端的锌指结构域的第二融合蛋白的结合位点的5’侧。
两个融合蛋白可以相同或相反的极性在感兴趣的区域中结合并且它们的结合位点(即靶位点)可被任何数目的核苷酸例如从0到200个核苷酸或其间的任何整数值的核苷酸所分隔开。在某些实施方案中，两个融合蛋白(每个含有锌指结合结构域和切割半结构域)的结合位点如从每个结合位点的最接近另一个结合位点的边缘开始所测量的可相隔5和18个之间的核苷酸，例如相隔5-8个核苷酸、或相隔15-18个核苷酸或相隔6个核苷酸，或相隔16个核苷酸，并且切割发生在结合位点之间。
DNA被切割的位点通常位于两个融合蛋白的结合位点之间。DNA的双链断裂通常来自于两个单链的断裂，或抵消1、2、3、4、5、6或更多个核苷酸的“切口”(例如通过天然Fok I的双链DNA的切割来自于抵消4个核苷酸的单链断裂)。因此，切割不是必须发生在每条DNA链上的精确相对的位点处。此外，融合蛋白的结构和靶位点之间的距离可影响切割是否邻近单一核苷酸对发生或者切割是否发生在几个位点。然而，对靶向的整合来说，一定范围内的核苷酸中的切割通常是足够的，而特定碱基对之间的切割是不需要的。
在所公开的融合蛋白中，锌指结构域和切割结构域(或切割半结构域)之间的氨基酸序列被表示为“ZC连接体”。ZC连接体与上文所讨论的指间连接体不同。ZC连接体具体被描述于例如WO 2007/014275中。
如下文所具体讨论的，融合蛋白(ZFN)或编码这一蛋白的多核苷酸被引入细胞中。一旦被引入细胞中或在细胞中被表达，融合蛋白与PPP1R12C中的靶序列结合并在这一基因座内切割。
向PPP1R12C基因的靶向整合
所公开的方法和组合物可被用于切割细胞染色质的PPP1R12C基因中的DNA，其有利于外源序列稳定的靶向的整合到PPP1R12C基因座的“安全港”中。如上文所提到的，内源PPP1R12C的功能的丢失被人类细胞所很好的耐受并且整合到这一基因中的序列从内源启动子被广泛地转录。因此，PPP1R12C是外源序列的靶向整合的理想位点。
为了向PPP1R12C靶向整合，一个或多个锌指结合结构域被设计成结合预定切割位点处或附近的靶位点，并且含有设计的锌指结合结构域和切割结构域的融合蛋白在细胞中被表达。当融合蛋白的锌指部分与靶位点结合时，DNA，优选地经由双链断裂，邻近靶位点通过切割结构域被切割。
PPP1R12C基因座中双链断裂的存在有助于外源序列经由同源重组整合。因此，含有有待被插入PPP1R12C基因的外源序列的多核苷酸将包括与PPP1R12C基因同源的一个或多个区域以帮助同源重组。
感兴趣的任何序列(外源序列)可如本文所描述的被引入PPP1R12C基因座中。示例性的外源序列包括但不限于任何多肽编码序列(例如cDNA)、启动子、增强子和其他调节序列、shRNA表达盒、附加表位、标记基因、切割酶识别位点和各种类型的表达构建体。这些序列可使用标准分子生物学技术(克隆、合成等)容易地获得和/或可商业获得。例如，MISSIONTM TRC shRNA库是可从Sigma商业获得的。
标记基因包括但不限于编码介导抗生素抗性(例如氨苄青霉素抗性、新霉素抗性、G418抗性、嘌呤霉素抗性)的蛋白的序列、编码有色或荧光或发光的蛋白(例如绿色荧光蛋白、增强的绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶)、细胞表面抗原(例如ΔNGFR)以及介导增强的细胞生长和/或基因扩增的蛋白(例如二氢叶酸还原酶)的序列。附加表位包括例如FLAG、His、myc、Tap、HA或任何可检测的氨基酸序列的一个或多个拷贝。
在优选的实施方案中，外源序列包括编码在细胞中其表达是期望的任何多肽的多核苷酸，所述多肽包括但不限于抗体、抗原、酶、受体(细胞表面或细胞核)、激素、淋巴因子、细胞因子、报道多肽、生长因子和上述任何一个的功能片段。编码序列可是例如cDNA。外源序列还可编码转录调节因子。
例如，靶向PPP1R12C基因座的外源序列包括编码在患有遗传疾病的受治疗者中缺少或无功能的多肽的序列，所述遗传疾病包括但不限于下列遗传疾病中的任何一种：软骨发育不全、色盲、酸性麦芽糖酶缺乏、腺苷脱氨酶缺乏(OMIM第102700号)、肾上腺脑白质营养不良、艾卡尔迪综合征、α-1抗胰蛋白酶缺乏、α-地中海贫血、雄激素不敏感综合征、阿佩尔综合征、心律失常性右室心肌病、发育不良、共济失调毛细血管扩张症、巴特综合征、β-地中海贫血、蓝色橡皮疱痣综合征、卡纳万病、慢性肉芽肿疾病(CGD)、猫叫综合征、囊性纤维化、德尔肯病、外胚层发育不良、范可尼贫血、进行性骨化性纤维发育不良、脆性X综合征、半乳糖血症、戈谢病、全身性神经节苷脂病(例如GM1)、血色素沉着病、β球蛋白的第六密码子中的血红蛋白C突变(HbC)、血友病、亨廷顿病、胡尔勒综合征、低磷酸酯酶症、克莱恩费尔特综合征、克拉伯病、Langer-Giedion综合征、白细胞粘附缺陷(LAD，OMIM第116920号)、脑白质营养不良、长QT综合征、马方综合征、Moebius综合征、粘多糖病(MPS)、指甲髌骨综合征、肾性尿崩症、神经纤维瘤病、Neimann-Pick病、成骨不全、卟啉症、普-威综合征、早衰、变形杆菌综合征(Proteus syndrome)、视网膜母细胞瘤、雷特综合征、鲁宾斯坦-泰比综合征、圣菲利波综合症、重症联合免疫缺陷(SCID)、施瓦赫曼综合征、镰状细胞病(镰状细胞性贫血)、史密斯-马吉利氏综合征、斯蒂克勒综合征、泰-萨病、血小板过低合并桡骨缺失(TAR)综合征、特雷彻·柯林斯综合征、三体性、结节性硬化症、特纳综合征、尿素循环障碍、希佩尔-林道病、瓦尔敦堡综合征、威廉斯综合征、威尔逊病、威斯科特-奥尔德里奇综合征、X连锁淋巴组织增生综合征(XLP，OMIM第308240号)。
可通过靶向的整合治疗的其他示例性的疾病包括获得性免疫缺陷、溶酶体贮积病(例如戈谢病、GM1、法布里病和泰-萨病)、粘多糖病(例如亨特病、胡尔勒病)、血红蛋白病(例如镰状细胞病、HbC、α-地中海贫血、β-地中海贫血)和血友病。
在某些实施方案中，外源序列可包括标记基因(上文所描述的)和编码另外的功能性的连接序列，其中所述标记基因允许已经经历靶向整合的细胞的选择。
此外，尽管不是表达所需要的，外源序列也可是转录或翻译调节序列，例如启动子、增强子、绝缘子、内部核糖体进入位点、编码2A肽的序列和/或多腺苷酸化信号。
如本文所公开的，外源序列的靶向整合可被用来产生用于蛋白表达的细胞和细胞系。参见，例如，共有的美国专利申请公布第2006/0063231号(其公开内容适用于所有目的地通过引用全文并入本文)。为了由整合到基因组的外源序列编码的一种或多种蛋白的最佳表达，染色体整合位点应与整合序列的高水平转录相容，优选地在大范围的细胞类型和发育阶段中。然而，已经观察到整合序列的转录由于尤其是整合位点处的基因组的染色质结构而取决于整合位点而变化。相应地，支持整合序列的高水平转录的基因组的靶位点是所期望的。在某些实施方案中，外源序列的整合不会导致一种或多种细胞基因(例如致癌基因)的异位活化也是所期望的。在另一方面，在整合启动子和/或增强子序列的情况下，异位表达可能是所期望的。
外源(供体)序列可被引入细胞中，在融合蛋白的表达之前、同时或之后。供体多核苷酸包含与基因组序列的足够的同源性以支持它和与它具有同源性的基因组序列之间的同源重组(或同源性指导的修复)。在供体和基因组序列之间大约25、50、100、200、500、750、1,000、1,500、2,000个核苷酸或更多的序列同源性(或10和2,000之间的任何整数值个核苷酸或更多)将支持其间的同源重组。供体序列长度上可在10至5,000个核苷酸(或其间任何整数值个核苷酸)或更长的范围内。显而易见的是供体序列与它所替代的基因组序列通常不相同。例如，供体多核苷酸的序列可含有对于基因组序列来说一个或多个单一的碱基改变、插入、缺失、倒位或重排，只要存在与染色体序列的足够的同源性。
可选择地，供体序列可含有侧面为两个同源性区域的非同源性序列。此外，供体序列可包括载体分子，其含有与细胞染色质中感兴趣的区域不同源的序列。通常，供体序列的同源性区域与希望进行重组的基因组序列具有至少50％的序列同一性。在某些实施方案中，存在60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或99.9％的序列同一性。可存在1％和100％之间的任何值的序列同一性，这取决于供体多核苷酸的长度。
供体分子可含有与细胞染色质同源的几个不连续的区域。例如，同源性的区域可在包含所期望的改变的两个或更多个区域侧面。
供体多核苷酸可是DNA或RNA，单链的或双链的并可被以线状或环状形式引入细胞中。如果以线状形式引入，供体序列的末端可通过本领域的那些技术人员已知的方法被保护(例如避免核酸外切降解)。参见WO2007/014275。多核苷酸可作为具有另外的序列例如诸如复制原点、启动子和编码抗生素抗性的基因的载体分子的一部分被引入细胞。而且，供体多核苷酸可作为裸露的核酸、作为与剂例如脂质体或泊洛沙姆络合的核酸而被引入，或可通过病毒(例如腺病毒、AAV、疱疹病毒、反转录病毒、慢病毒)被递送。
还提供了可增强靶向重组水平的方法和组合物，包括但不限于另外的ZFP功能结构域融合的使用。参见WO 2007/014275。
在含有锌指/核酸酶融合分子和供体DNA分子的细胞中，靶向重组的效率的进一步提高是通过在同源性驱动的修复过程被最大地活化时，将细胞阻滞在细胞周期的G2期中来实现的。这种阻滞可以多种方法实现。例如，可用例如影响细胞周期进程的药物、化合物和/或小分子处理细胞以便将细胞阻滞在G2期。这一类型的示例性分子包括但不限于影响微管聚合的化合物(例如长春碱、诺考达唑、紫杉醇)、与DNA相互作用的化合物(例如顺二氯二胺铂(II)、顺铂、阿霉素)和/或影响DNA合成的化合物(例如胸苷、羟基脲、L-含羞草碱、依托泊苷、5-氟尿嘧啶)。此外重组效率上的提高是通过使用组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂(例如丁酸钠、制滴菌素A)实现的，所述抑制剂改变染色质结构以使基因组DNA对于细胞的重组机制来说更容易达到。
用于细胞周期阻滞的另外的方法包括抑制CDK细胞周期激酶活性的蛋白的过量表达，例如通过将编码蛋白的cDNA引入细胞或通过将活化编码蛋白的基因的表达的所设计的ZFP引入细胞。细胞周期阻滞也通过例如使用RNAi方法(例如美国专利第6,506,559号)抑制细胞周期蛋白和CDK的活性或通过向细胞中引入抑制细胞周期过程中所涉及的一个或多个基因(例如，诸如细胞周期蛋白和/或CDK基因)的表达的设计的ZFP来实现。参见，例如共有的美国专利第6,534,261号的用于合成用于调节基因表达的设计的锌指蛋白的方法。
可选择地，在某些实例中，靶向的切割在供体多核苷酸不存在的情况下(优选地在S或G2期中)进行，并且重组发生在同源染色体之间。
递送
融合蛋白(ZFN)可作为多肽和/或多核苷酸被引入。例如，两个多核苷酸(其每一个含有编码前述多肽中的一个的序列)可被引入细胞，并且当多肽被表达并且其每一个都与它的靶序列结合时，切割在靶序列处或附近发生。可选择地，包括编码两种融合多肽的序列的单一的多核苷酸被引入细胞中。多核苷酸可是DNA、RNA或任何修饰的形式或类似物或DNA和/或RNA。
可使用任何适合的方法将如本文所描述的核酸(例如编码ZFN的多核苷酸和/或外源“供体”序列)引入细胞中。
在某些实施方案中，可将一个或多个ZFP或ZFP融合蛋白克隆至用于向原核或真核细胞转化的载体中以便复制和/或表达。载体可是原核载体(例如质粒)、或穿梭载体、昆虫载体或真核载体。使用例如Sambrook等人，如上和美国专利公布20030232410、20050208489、20050026157、20050064474和20060188987和国际公布WO 2007/014275中描述的标准技术，编码本文描述的序列的核酸(ZFN)也可被克隆至表达载体中以便施用于植物细胞、动物细胞(优选地哺乳动物细胞或人类细胞)、真菌细胞、细菌细胞或原生动物细胞。
在某些实施方案中，为了基因治疗用途，ZFN和供体序列被体内或离体递送。用于将多核苷酸递送至细胞中的非病毒载体递送系统包括DNA质粒、裸露的核酸和与递送运载体例如脂质体或泊洛沙姆络合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，其在递送至细胞后具有附加型或整合的基因组。基因治疗程序的综述，参见Anderson，Science 256：808-813(1992)；Nabel&Felgner，TIBTECH 11：211-217(1993)；Mitani&Caskey，TIBTECH 11：162-166(1993)；Dillon，TIBTECH 11：167-175(1993)；Miller，Nature 357：455-460(1992)；Van Brunt，Biotechnology 6(10)：1149-1154(1988)；Vigne，Restorative Neurology and Neuroscience 8：35-36(1995)；Kremer&Perricaudet，British Medical Bulletin 51(1)：31-44(1995)；Haddada等人于Current Topics in Microbiology and Immunology(微生物学和免疫学中的热点)Doerfler和
Figure G2008800188367D00331
(编辑)(1995)中和Yu等人Gene Therapy1：13-26(1994)。
核酸的体内或离体的非病毒递送的方法包括电穿孔、脂转染(参见美国专利第5,049,386；4,946,787号和可商业获得的试剂例如TransfectamTM和LipofectinTM)、显微注射、生物射弹、病毒颗粒、脂质体(参见例如Crystal，Science 270：404-410(1995)；Blaese等人Cancer Gene Ther.2：291-297(1995)；Behr等人，Bioconjugate Chem.5：382-389(1994)；Remy等人，Bioconjugate Chem.5：647-654(1994)；Gao等人，Gene Therapy 2：710-722(1995)；Ahmad等人，Cancer Res.52：4817-4820(1992)；美国专利第4,186,183，4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028和4,946,787号)、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸轭合物、裸露的DNA、人造病毒体、病毒载体系统(例如反转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随、牛痘和如WO 2007/014275中所描述的用于递送包括ZFP的蛋白的单纯疱疹病毒载体)以及剂强化的DNA吸收。使用例如Sonitron2000系统(Rich-Mar)的声穿孔(Sonoporation)也可被用于递送核酸。
另外的示例性核酸递送系统包括由Amaxa Biosystems(Cologne，Germany)、Maxcyte，Inc.(Rockville，Maryland)和BTX Molecular DeliverySystems(Holliston，MA)所提供的那些。
在某些实施方案中，例如，在其中ZFP融合蛋白的瞬时表达是优选的实施方案中，可使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有非常高的转导效率并且不要求细胞分裂。用这些载体获得了高效价和高水平的表达。这一载体可在相对简单的系统中被大量生产。腺伴随病毒(“AAV”)载体也可被用来转导具有靶核酸的细胞，例如在核酸和肽的体外生产中，以及用于体内和离体的基因治疗程序(参见，例如West等人，Virology 160：38-47(1987)；美国专利第4,797,368号；WO93/24641；Kotin，Human Gene THerapy 5：793-801(1994)；Muzyczka，J.Clin.Invest.94：1351(1994)。重组的AAV载体的构成被描述于大量出版物中，包括美国专利第5,173,414号；Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.5：3251-3260(1985)；Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.4：2072-2081(1984)；Hermonat&Muzyczka，PNAS 81：6466-6470(1984)和Samulski等人，J.Virol.63：03822-3828(1989)。
对于临床试验中的基因转移来说，至少六种病毒载体方法是目前可获得的，其利用了包括通过插入辅助细胞系的基因补充缺陷型载体以产生转导剂的方法。
pLASN和MFG-S是反转录病毒载体的实例，其已经被用于临床试验(Dunbar等人Blood 85：3048-305(1995)；Kohn等人Nat.Med.1：1017-102(1995)；Malech等人，PNAS 94：22 12133-12138(1997))。PA317/pLASN是用于基因治疗实验的第一个治疗性载体(Blaese等人，Science 270：475-480(1995))。对于MFG-S包装载体已经观察到50％或更高的转导效率(Ellem等人，Immunol Immunother.44(1)：10-20(1997)；Dranoff等人，Hum.GeneTher.1：111-2(1997)。
重组的腺伴随病毒载体(rAAV)是基于缺陷型的并且非病原的细小病毒腺伴随病毒亚型的很有前途的备选基因递送系统。所有的载体都是来源于仅保留位于转基因表达盒侧面的AAV的145bp的倒置末端重复的质粒。归因于向所转导的细胞的基因组的整合的有效的基因转移和稳定的转基因递送是这一载体系统的主要特征(Wagner等人，Lancet 351：9117 1702-3(1998)，Kearns等人，Gene Ther.9：748-55(1996))。此外，可使用自身互补型重组腺伴随病毒(scAAV)来源的载体。
复制缺陷型重组腺病毒载体(Ad)可以高效价被生产并且容易地感染许多不同的细胞类型。大多数腺病毒载体被设计成使得转基因取代AdE1a、E1b和/或E3基因；之后复制缺陷型载体反过来在支持删除基因功能的人类293细胞中被繁殖。Ad载体可体内转导多种类型的组织，包括不分裂的分化的细胞例如在肝、肾和肌肉中存在的那些。常规的Ad载体具有大的携带能力。Ad载体在临床试验中使用的一个实例包括使用肌肉内注射的用于抗肿瘤免疫法的多核苷酸治疗(Sterman等人，Hum.Gene Ther.7：1083-9(1998))。在临床试验中用于基因转移的腺病毒载体的使用的另外的实例包括Rosenecker等人，Infection 24：15-10(1996)；Sterman等人，Hum.Gene Ther.9：7 1083-1089(1998)；Welsh等人，Hum.Gene Ther.2：205-18(1995)；Alvarez等人，Hum.Gene Ther.5：597-613(1997)；Topf等人，Gene Ther.5：507-513(1998)；Sterman等人，Hum.Gene Ther.7：1083-1089(1998)。
包装细胞被用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。这种细胞包括包装腺病毒的293细胞以及ψ2细胞或PA317细胞，其包装反转录病毒。用于基因治疗的病毒载体通常是通过将核酸载体包装到病毒颗粒中的生产细胞系产生的。载体通常含有包装和之后向宿主的整合(如果可用)所需要的最少的病毒序列，其他的病毒序列被编码有待表达的蛋白的表达盒所取代。丢失的病毒功能反过来由包装细胞系提供。例如，基因治疗中使用的AAV载体通常仅具有来自AAV基因组的倒置末端重复(ITR)序列，其是包装和向宿主基因组整合所需要的。病毒DNA在细胞系中被包装，所述细胞系含有编码其他AAV基因即rep和cap的辅助质粒，但缺少ITR序列。也用腺病毒作为辅助病毒感染细胞系。辅助病毒启动AAV载体的复制和来自辅助质粒的AAV基因的表达。由于缺少ITR序列，大量的辅助质粒不被包装。腺病毒的污染可通过例如热处理来减少，腺病毒对热处理比AAV更敏感。
在许多基因治疗应用中，高度的特异性地将多核苷酸(例如ZFN编码序列和/或供体序列)递送至特定的组织类型是所期望的。相应地，病毒载体可通过表达配体而被修饰成具有对给定的细胞类型的特异性，所述配体为具有病毒外部表面上的病毒外壳蛋白的融合蛋白。配体被选择以对已知存在于所感兴趣的细胞类型上的受体具有亲和性。例如Han等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：9747-9751(1995)，报道莫洛尼鼠白血病病毒可被修饰以表达与gp70融合的人类调蛋白，并且重组的病毒感染某些表达人类表皮生长因子受体的人类乳癌细胞。这一原理可被扩展至其他病毒-靶细胞对，其中靶细胞表达受体而病毒表达含有细胞表面受体的配体的融合蛋白。例如，丝状噬菌体可被设计成展示抗体片段(例如FAB或Fv)，所述抗体片段实际上对任何所选择的细胞受体具有特异的结合亲和性。尽管上述描述主要应用于病毒载体，但相同的原理可被应用于非病毒载体。这些载体可被设计成含有特定的摄取序列，其有助于通过特定的靶细胞摄取。
基因治疗载体可通过对个别的患者施用，通常通过全身施用(例如静脉内的、腹膜内的、肌肉内的、皮下的或颅内的输注)或如下文所描述的局部应用而被体内递送。可选择地，载体可被离体递送至细胞，例如从个别的患者移植的细胞(例如淋巴细胞、骨髓吸出物、组织的活组织检查)或普通供体的造血干细胞，之后，通常在选择具有合并的载体的细胞之后，将细胞再植入患者中。
用于诊断、研究或用于基因治疗(例如经由转染细胞向宿主生物体的再输注)的离体细胞转染是本领域的那些技术人员所熟知的。在优选的实施方案中，将细胞从受治疗生物体分离，用ZFP核酸(基因或cDNA)和外源序列转染并再输注回所述受治疗生物体(例如患者)中。适于离体转染的各种细胞类型是本领域的那些技术人员熟知的(参见，例如Freshney等人.，Culture of Animal Cells，A Manual of Basic Technique(动物细胞培养，基本技术手册)(第3版.1994))和其中引用的关于如何从患者分离并培养细胞的讨论的参考文献)。
在一个实施方案中，干细胞被用于细胞转染和基因治疗的离体程序中。使用干细胞的优势是它们可在体外被分化成其他细胞类型或可被引入哺乳动物(例如细胞的供体)中，在所述哺乳动物中它们将移植到骨髓中。使用细胞因子例如GM-CSF、IFN-γ和TNF-α将CD34+细胞体外分化为临床上重要的免疫细胞类型的方法是已知的(参见Inaba等人，J.Exp.Med.176：1693-1702(1992))。
使用已知的方法将干细胞分离以用于转导和分化。例如，通过用与不需要的细胞例如CD4+和CD8+(T细胞)、CD45+(panB细胞)、GR-1(粒细胞)和Iad(分化的抗原呈递细胞)结合的抗体来淘选骨髓细胞可将干细胞从骨髓细胞分离(参见Inaba等人，J.Exp.Med.176：1693-1702(1992))。
含有如本文所述的核酸的载体(例如反转录病毒、腺病毒、脂质体等)也可被直接施用于生物体以便进行体内细胞转导。可选择地，可施用裸露的DNA。施用通过通常用于将分子引入与血液或组织细胞最终接触的路线中的任何一种，包括但不限于注射、输注、局部应用和电穿孔。施用这种核酸的适合的方法是可得的并且是本领域的那些技术人员所熟知的，并且，尽管多于一种的路线可被用于施用特定的组合物，但是特定的路线常常可提供比另外的路线更直接和更有效的反应。
用于将DNA引入造血干细胞的方法被公开在例如，美国专利第5,928,638号中。用于将转基因引入造血干细胞例如CD34+细胞中的载体包括腺病毒35型。
适用于将转基因引入免疫细胞(例如T细胞)中的载体包括非整合的慢病毒载体。参见，例如Ory等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：11382-11388；Dull等人(1998)J.Virol.72：8463-8471；Zuffery等人(1998)J.Virol.72：9873-9880；Follenzi等人(2000)Nature Genetics 25：217-222。
药学上可接受的载体(carrier)部分地通过正在被施用的特定的组合物以及通过用于施用组合物的特定的方法而确定。相应地，如下文所描述的，有可获得的药物组合物的各种适用的制剂(参见例如Remington’sPharmaceutical Sciences(雷明顿药学)，第17版，1989)。
如上文所提到的，使用例如WO 2007/014275中所描述的方法，一种或多种ZFN融合蛋白也可作为多肽被引入细胞中。蛋白递送运载体的非限制性实例包括“膜易位多肽”例如具有两亲性或疏水氨基酸子序列的肽、毒素分子、脂质体和脂质体衍生物例如免疫脂质体(包括靶向脂质体)，其中所述两亲性或疏水氨基酸子序列具有作为膜易位载体的能力。
为了治疗或预防应用，例如癌、局部缺血、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、风湿性关节炎、银屑病、HIV感染、镰状细胞性贫血、阿尔兹海默病、肌营养不良、神经变性疾病、血管疾病、囊性纤维化、中风和类似疾病，ZFP和编码ZFP的表达载体可被直接施用于患者以便靶向的切割整合到PPP1R12C中。
治疗上有效的量的施用是通过通常用于将ZFP引入与有待治疗的组织最终接触的路线中的任何一种。以任何适合的方式施用ZFP，优选地用药学上可接受的载体。施用这种调节剂的适合的方法是可得的并且是本领域的那些技术人员所熟知的，并且尽管多于一种的路线可被用于施用特定的组合物，但是特定的路线常常可提供比另外的路线更直接和更有效的反应。
药学上可接受的载体部分地通过正在被施用的特定的组合物以及通过用于施用组合物的特定的方法而确定。相应地，有可获得的药物组合物的各种适用的制剂(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药学)，第17版，1985))。
可将ZFP单独或与其他适合的成分联合制成气溶胶制剂(即它们可被“雾化”)以经由吸入而被施用。气溶胶制剂可被放置在加压的可接受的推进剂例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气和类似物中。
适用于肠胃外例如，诸如通过静脉内、肌肉内、皮内和皮下路线施用的制剂包括含水和非含水的等渗的无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得制剂与预期的接受者的血液等渗的溶质；以及含水和非含水的无菌悬浮液，其可含有悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。所公开的组合物可例如通过静脉内输注、口服地、局部地、腹膜内地、膀胱内地或鞘内地被施用。化合物的制剂可存在于单位剂量或多剂量的密封的容器例如安瓿和小瓶中。注射液和悬浮液可从之前描述过的类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
实施例
实施例1：靶向PPP1R12C的锌指核酸酶的设计
按照国际公布WO 2007/014275中所描述的，设计含有一对4-指的锌指蛋白核酸酶(ZFN)的融合蛋白，并用噬菌体展示依照公开的流程(Rebar&Pabo(1994)Science263(5147)：671-3；Greisman&Pabo(1997)Science275(5300)：657-61)优化以诱导如图1所示的PPP1R12C的内含子1中的双链断裂。ZFN靶序列对应于人类染色体19的“-”链的位置60318932-60318961(UCSC人类基因组发布，2006年3月)。
表1显示示例性的靶向PPP1R12C的ZFN，其被用于向PPP1R12C基因座的靶向整合实验。
表1
  ZFN名称   靶位点 F1 F2 F3 F4
9931   acTAGGGACAGGATtg(SEQ ID NO：1)   QSSNLAR(SEQ IDNO：3)   RPDFLNQ(SEQ IDNO：4)   QSGHLAR(SEQ IDNO：5)   RSDNLTT(SEQ IDNO：6)
10099   ccCCACTGTGGGGTgg(SEQ ID NO：2)   QSSHLTR(SEQ IDNO：7)   RSDHLTT(SEQ IDNO：8)   HNYARDC(SEQ IDNO：9)   QKATRTT(SEQ IDNO：10)
15587   acTAGGGACAGGATtg(SEQ ID NO：1)   QSSNLAR(SEQ IDNO：3)   RTDYLVD(SEQ IDNO：11)   YNTHLTR(SEQ IDNO：12)   RSDNLTT(SEQ IDNO：6)
15590   acTAGGGACAGGATtg(SEQ ID NO：1)   QSSNLAR(SEQ IDNO：3)   RTDYLVD(SEQ IDNO：11)   YNTHLTR(SEQ IDNO：12)   QGYNLAG(SEQ IDNO：13)
15554   ccCCACTGTGGGGTgg(SEQ ID NO：2)   ERHHLMR(SEQ IDNO：14)   RSDHLTT(SEQ IDNO：8)   HNYARDC(SEQ IDNO：9)   QNSTRIG(SEQ IDNO：15)
15556   ccCCACTGTGGGGTgg(SEQ ID NO：2)   YNWHLQR(SEQ IDNO：16)   RSDHLTT(SEQ IDNO：8)   HNYARDC(SEQ IDNO：9)   QNSTRIG(SEQ IDNO：15)
15557   ccCCACTGTGGGGTgg(SEQ ID NO：2)   LHHQLVR(SEQ IDNO：17)   RSDHLTT(SEQ IDNO：8)   HNYARDC(SEQ IDNO：9)   QNSTRIG(SEQ IDNO：15)
实施例2：向PPP1R12C基因座的靶向整合
通过使用相同基因座的1,647bp的片段(位置60318104-60319750)并将“剪接受体-FMDV 2A-GFP-poly(A)”盒引入ZFN的9931和10099结合位点之间的位置来设计供体。如Urnov等人(2005)Nature 435：646-651和Moehle等人(2007)PNAS 194：305中所描述的制备ZFN和供体构建体，除了FokI内切核酸酶的专性异源二聚体形式被用于ZFN表达构建体(参见上文标题为“切割结构域”的章节)并被引入K562、293T、Hep3B或HEK293细胞。
如Moehle等人(2007)Proc.Nat’l Acad. Sci.USA 104：3055-3060所描述的，转染七十二小时后，通过放射标记的PCR测定来测定靶向整合(TI)的比例。同样如Moehle等人(2007)所描述的，转染两个星期后，通过FACS测定GFP阳性细胞的百分比。
结果示于图3和4中。靶向整合的频率分析(图3A和B)证实在K562(图3A)和293T(图3B)细胞中供体序列向PPP1R12C的整合在ZFN存在的情况下显著增加。DNA印记法证实了PCR分析的结果(见图7B)。
此外，如图4中所示，通过FACS分析GFP表达还证实了GFP供体序列被整合进PPP1R12C中。特别地，没有ZFN表达构建体的共引入，供体GFP序列整合进PPP1R12C的频率(图4A)是可忽略的。ZFN存在的情况下，其中供体序列被整合进PPP1R12C中的靶位点的细胞的百分比增加至13.09％(图4B)。同样地，在293T细胞中，供体序列没有被整合进野生型细胞中(图4C，0％)但是在靶向PPP1R12C的ZFN存在的情况下被整合进3.66％的细胞中(图4D)。在Hep3B细胞中，在靶向PPP1R12C的ZFN不存在的情况下供体序列被整合至0.65％的细胞中(图4E)，而在靶向PPP1R12C的ZFN存在的情况下被整合至1.73％的Hep3B细胞中(图4F)。
因此，不同细胞类型中，ZFN驱动无启动子外源编码序列靶向整合至PPP1R12C“安全港”基因座中。
实施例3：PPP1R12C/p84mRNA的定量RT-PCR测量
进行了涉及一组通常所用的转化细胞类型(HEK293(293T)、成纤维细胞、K562、HeLa、DU-145、Hep3B)的PPP1R12C/p84mRNA 水平的定量RT-PCR测量以研究基因是否在多种细胞类型中表达。结果被表示为PPP121R12C基因座相对于18S或GAPDH的表达的比率。简单的说，使用PPP1R12C的定制的基因表达测定(ABI)，如在Tan等人(2003)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 100：11997-12002)中所描述的通过Applied Biosystems7300TaqMan机上的实时RT-PCR测量了PPP1R12C mRNA的水平。结果示于图5，证实了PPP1R12C/p84是被广泛转录的，与指示了PPP1R12C/p84在所研究的所有人类细胞/组织中是组成型转录的可得数据一致。
实施例4：向PPP1R12C基因座的靶向整合
为了测定用于基因添加的PPP1R12C(p84)基因基因座的效用，经由使用一组可选择的ZFN设计的瞬时转染和测量核酸酶测定的筛选鉴定来自表1中所示的ZFN组的引导ZFN以测定DSB诱导的效率(Miller等人(2007)Nat Biotechnol.25(7)：778-85)。这一测定测量PPP1R12C/p84衍生的携带DSB修复的遗传标志(genetic signature)的染色单体的部分：经由非同源末端连接产生的小的插入和缺失。对于所有向PPP1R12C/p84的靶向整合的实验，我们使用了与染色体基因座同源的1.6kb的供体DNA构建体(Urnov等人，Nature.2005 435(7042)：646-51)并使用标准重组DNA技术引入所描述的异源序列段(stretches)。使用唯一的SnaBI位点，ΔLNGFR细胞表面标记的自主表达盒被引入供体构建体的右侧同源性臂的外部。如Urnov等人(上文)中所描述的培养HEK293和K562细胞并用DNA构建体转染。
如图6中所示，与显示无整合的阴性对照相比，所测试的所有ZFN对整合供体构建体。这些数据证实有效地将DSB靶向至PPP1R12C/p84基因基因座的所期望的区域中的ZFN已经获得。
此外，这一测定中鉴定的引导ZFN对(15556/15590，图6的泳道5)将DSB～1,800bp引入PPP1R12C/p84基因的转录起始位点的下游，即距原始启动子序列足够远以允许用于将开放读码框添加至这一基因座的无启动子的供体DNA设计(图7A)。之前我们已经展示了靶向DNA位点的ZFP的优化增加了基因组编辑速率。参见例如Urnov等人(2005)。与这一观察结果相一致，PPP1R12C/p84的引导ZFN的优化也导致了切割活性的显著增强(～4倍增加)，产生了显示出五分之一的编辑染色单体的瞬时转染的K562细胞的群体。
实施例4：ZFN介导的位点特异的基因添加
为了测定上文的ZFN是否将驱动基因盒向PPP1R12C/p84基因座的有效的位点特异的添加，我们使用了无启动子的供体DNA设计，其利用了原始PPP1R12C/p84启动子以产生标记阳性的细胞(图7a)。这一供体质粒包括两个750bp的序列段，该序列段与被无启动子的GFP ORF和多腺苷酸化信号序列所中断的PPP1R12C/p84基因座的内含子1中的DSB位点侧面区域同源。当PPP1R12C/p84中的外显子1被翻译，为获得原始PPP1R12C/p84启动子驱动的GFP表达，我们在ORF的上游，2A核糖体打滑信号之前(参见Fang等人(2005)Nat Biotech.23：584)包含了剪接受体位点(图7A)。
如图7A中所描述的，这一盒向PPP1R12C/p84基因座的真实的位点特异的基因添加将导致由PPP1R12C/p84启动子驱动的单一转录，所述启动子包括PPP1R12C/p84的外显子1和标记GFP ORF。作为2A肽序列的结果，这一mRNA的翻译将导致2个分离的多肽的产生：(i)由PPP1R12C/p84的外显子1编码的肽，以及(ii)完整的GFP多肽。使用台式迷你FACS设备(Guava Technologies)进行了FACS分析，并且使用WinMDI软件进一步分析了数据。如所描述的(Urnov等人，2005)通过高定量PCR测定进行了以DNA为基础的靶向整合频率的分析，除了省略了限制性酶消化的步骤(唯一的例外是实验使用引入含有Nco I识别位点的30bp小片段(patch)的供体，其中野生型和携带整合的染色体之间小型差异需要限制性酶消化的使用)。如所描述的(Urnov等人，2005)进行了使用DpnI(消除过量的供体DNA)和AccI(消化基因组DNA)消化的基因组DNA的DNA印迹。如主要在Miller等人(2007)Nat.Biotechnol.25(7)：778-785和Tan等人(2003)Proc Natl Acad Sci USA 100：11997-12002中描述的进行全基因组表达谱和免疫细胞化学。
用编码ZFN的质粒DNA和供体DNA构建体转染48小时后的K562细胞的分析证实，如通过PCR和通过DNA印迹所估计的，平均上，细胞群体中10％的染色单体已经获得供体特异的盒(图7B)。之后在不存在任何选择的情况下将修饰的细胞培养一个月(超过30次群体倍增)。与在第2天获得的分子数据(图7B，泳道2)一致，尽管培养的时间延长，在ZFN和供体处理的池中观察到13％的GFP阳性细胞，而少于1％的单独用供体质粒处理的细胞表达GFP。这些数据显示无启动子的标记ORF向人类PPP1R12C/p84基因座的添加在不存在用于期望事件的选择的情况下，产生高频率的稳定的标记阳性的细胞。
为了测定这些观察结果的普遍性，我们用不同来源的两个另外的常用的细胞类型进行了类似的实验(HEK293，通过神经元细胞的腺病毒转化获得的细胞系，以及Hep3B，肝细胞癌)。注意到内源PPP1R12C/p84启动子在这两种细胞类型中都是有活性的，我们使用了与之前相同的无启动子的GFP供体质粒(图7A，上部的图)并能够获得在PPP1R12C/p844基因座携带添加ZFN的ORF的GFP阳性细胞的池。值得注意的是，除了使用对所感兴趣的细胞类型特异的瞬时转染条件，没有其他的修饰是进行GFPORF添加的试剂所必需的。
总的来说，这些数据证实ZFN介导的向PPP1R12C/p84基因基因座的位点特异性的稳定的基因添加可通过适合的质粒DNA对一组常用的人类细胞的简单的瞬时转染迅速地获得。
实施例5：向PPP1R12C/p84的基因添加导致稳定的表达水平
经由外源DNA经由质粒或病毒递送的随机整合的转基因常常导致变化的初始基因表达水平以及表达随时间的不稳定性。
为了确定ZFN介导的向PPP1R12C/p84基因座的位点特异的基因添加是否将克服这些限制，我们将K562细胞暴露于编码ZFN和GFP ORF的质粒，在不存在任何选择剂的情况下使细胞增殖(expand)4周，并且之后用FACS以分离GFP阳性细胞池。较大的(含有转基因的)染色单体的PCR扩增不如在混合细胞群体中较小的野生型等位基因的扩增有效。将这一差异标准化，我们通过PCR对这些细胞中的PPP1R12C/p84基因座进行基因分型，其显示～80％的染色单体在PPP1R12C/p84基因基因座携带插入的ORF(图8E，泳道2)。重要地是，没有用于GFP表达的另外的分选的有限的稀释产生一组～20个单细胞来源的克隆系，其被发现以单等位基因的或二对等位基因的构型并以与PCR基因分型的结果完全一致的相对频率在PPP1R12C/p84携带精确插入的GFP盒。
此外，以序列为基础的转基因染色单体的基因分型显示出精确的、以同源性为基础的供体特异性转基因向PPP1R12C/p84基因座的添加。
为了确定GFP表达的稳定性，将代表性的对照K562细胞、GFP阳性的FACS富集细胞池和对于PPP1R12C/p84的GFP插入来说单等位基因的和二对等位基因的两个单细胞克隆系培养50次细胞倍增并每两周测定GFP表达水平。数据示于图8A，显示(i)在实验的过程中没有平均荧光强度的损失；(ii)在GFP阳性细胞池中标记阴性细胞的整体分数没有变化(～5％)；并且(iii)对于PPP1R12C/p84处的GFP盒来说纯合的细胞的平均荧光强度始终高于杂合的细胞。
这些数据证实ZFN激活的向PPP1R12C/p84基因基因座的ORF添加产生设计的“内源启动子陷阱”所期望的表达的长期稳定性和一致性。
实施例6：ZFN驱动的自主表达盒的添加
为了扩展使用用于由PPP1R12C/p84启动子驱动的标记表达的无启动子的GFP ORF系统获得的结果(图7)，我们接下来评估使用编码自主表达盒的供体DNA设计的可行性：这一所谓的“启动子转录单位”(PTU)携带它自己的启动子，之后是有待被转录的序列段(例如编码shRNA的构建体或cDNA)和转录终止信号(例如聚(A)序列段或RNA聚合酶III终止子)。我们修饰了我们的供体质粒以含有shRNA的表达盒。这一供体DNA设计以图解形式示于图8B中。我们选择保留无启动子GFP ORF系统的元件作为将已经经历了真实的向PPP1R12C/p84基因座的基因添加的细胞标记的方法。GFP盒的下游我们包括了靶向细胞表面标记CD58(已知将在K562细胞中表达)的shRNA表达盒，由此将GFP表达(由PPP1R12C/p84驱动)与shRNA表达构建体在同一基因座的整合物理相连。
用ZFN和含有shRNA的供体质粒转染K562细胞48小时后的定量PCR分析表明8％的PPP1R12C/p84染色单体已经获得位于靶位点的ORF-PTU盒。GFP阳性细胞池的FACS分选产生～10倍富集的ZFN修饰的染色单体(图8D)。
为了确定插入的shRNA盒的效力，我们通过对CD58(shRNA分子的靶)的FACS染色对比了对照细胞和PPP1R12C/p84ZFN/供体修饰的细胞。重要的是，CD58的细胞表面染色在30次细胞群体倍增之后甚至显著下降并且在数量级上与在用shRNA表达质粒本身瞬时转染48小时后所观察到的差不多。参见图8C。值得注意的是48小时，瞬时转染样品证实靶基因减少与在稳定的转基因背景下携带仅仅1个或2个拷贝的细胞中所观察到的差不多。使用只有GFP的供体(即位点特异性基因添加但是无shRNA盒)平行产生的ZFN修饰的细胞的池产生正常水平的CD58染色，而其中CD58抗体被省略的对照样品中只提供了残余的荧光。
总的来说，这些数据证实快速的、无药物选择的、一步标记的并且分离在特异性位点转基因的细胞群体的用于稳定表达PTU的无启动子的GFP连接的PTU供体系统的效用。
实施例7：ZFN驱动的PPP1R12C/p84基因靶向的特异性
我们使用两个公认的测定以实验性的研究使用以质粒为基础的递送的ZFN驱动的基因添加的特异性。
首先，我们测量了使用充分研究的DSB修复的标志的DSB全基因组的产生，所述标志即以在修复位点的磷酸化的组蛋白变体H2A.X为焦点的集合(Paull等人(2000)Curr Biol 10：886-895)。我们进行了与阳性对照ZFN(靶向IL2Rγ基因座)平行进行的这些测定。靶向PPP1R12C/p84和IL2Rγ的ZFN使用FokI内切核酸酶的高保真的“专性异源二聚体”形式，其被设计成限制ZFN对与它们所需要的靶的作用。参见Miller等人(2007)Nat.Biotechnol.25(7)：778-785。在这些靶向IL2Rγ的ZFN的例子中，产生了在整个核中仅产生高于背景的单个DSB的蛋白。
尽管在编辑它们预期的靶位点上为～2.5倍多有效，但PPP1R12C/p84ZFN显示出与用靶向IL2Rγ的ZFN获得的那些在统计学上难以区别的H2A.X染色水平。参见图9A和9B。相反，使用诱导DSB的药物依托泊苷的处理产生H2A.X信号的统计学上显著的增加，因此证实了测定的功能性。
其次，我们想知道PPP1R12C/p84ZFN的表达是否将增加供体DNA随机整合至基因组中的比例。为了解决这一问题，我们使用携带位于供体同源性臂的外部的用于细胞表面标记的自主表达盒(ΔNGFR)的质粒供体DNA，主要如Moehle等人(2007)中所描述的。质粒的错整合(misintergation)将产生ΔNGFR盒的结合和表达，其同源性指导的修复产生没有ΔNGFR表达的GFP阳性细胞。
与较早的检测靶向IL2Rγ基因座的ZFN的工作(Moehle等人，2007；Urnov等人，2005)相一致，我们发现在仅用供体DNA处理的细胞中观察到的上文的供体质粒错整合率没有增加。相反，加入依托泊苷(DNA损害诱导药物)导致ΔNGFR细胞数目的统计学上显著的增加。
这些数据表明PPP1R12C/p84定向的核酸酶在所使用的测定的灵敏度的范围内，没有产生多于一种的高于背景的DSB，也没有驱动供体质粒随机整合上的可测量的增加。因此，在ZFN特异性的两个测定(每基因组的ZFN诱导的DSB数目的直接测量和经由随机整合的间接读数)中，PPP1R12C/p84ZFN显示了高特异性，支持了它们在产生转化的人类细胞系中的使用。
本文提及的所有专利、专利申请和公布适用于所有目的地通过引用全文并入本文。
尽管为了清楚理解的目的已经通过示例性说明和实施例的方法较详细地提供了公开内容，但是对本领域那些技术人员来说明显的是在不背离本公开内容的精神或范围的情况下可进行各种改变和修饰。相应地，前述说明和实施例不应被解释为是限制性的。

Claims (32)

1.一种用于在细胞中表达外源核酸序列的产物的方法，所述方法包括：
(a)在所述细胞中表达第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包括第一DNA结合结构域和第一切割结构域或第一切割半结构域，其中所述第一DNA结合结构域已被设计成与所述细胞的基因组的PPP1R12C基因中的第一靶位点结合；以及
(b)在使得所述第一融合蛋白在所述PPP1R12C基因中切割所述细胞的基因组并且所述外源核酸序列被插入切割位点中并被表达的条件下，将所述细胞与包括外源核酸序列的多核苷酸接触。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA结合结构域是锌指结合结构域。
3.如权利要求2所述的方法，其还包括：
在所述细胞中表达第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包括第二锌指结合结构域和第二切割半结构域，其中所述第二锌指结合结构域与所述细胞的基因组的PPP1R12C基因中的第二靶位点结合，其中所述第二靶位点与所述第一靶位点不同；
其中所述第一融合蛋白与所述第一靶位点的结合和所述第二融合蛋白与所述第二靶位点的结合定位所述切割半结构域，使得所述细胞的基因组在所述PPP1R12C基因中被切割，由此导致外源序列在所述PPP1R12C基因中整合到所述细胞的基因组中并表达所述外源序列的产物。
4.如权利要求1至3中的任何一项所述的方法，其中所述外源核酸序列编码多肽。
5.如权利要求1至3中的任何一项所述的方法，其中所述外源核酸序列产生多核苷酸。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述多肽选自由抗体、抗原、酶、生长因子、受体(细胞表面或细胞核)、激素、淋巴因子、细胞因子、报道分子、其功能片段和其组合所组成的组。
7.如权利要求8所述的方法，其中所述报道分子包括GFP。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述多核苷酸选自由一个或多个shRNA、一个或多个RNAi分子、一个或多个miRNA和其组合组成的组。
9.如权利要求1至8中的任何一项所述的方法，其中所述外源序列还包括启动子。
10.如权利要求1至8中的任何一项所述的方法，其中所述外源序列不包括启动子。
11.如权利要求1至10中的任何一项所述的方法，其中所述外源序列还包括第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列与所述PPP1R12C基因中的第一序列同源但不相同。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述外源序列还包括第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列与所述PPP1R12C基因中的第二序列同源但不相同。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列位于所述外源序列侧面。
14.如权利要求1至13中的任何一项所述的方法，其中所述外源序列是质粒。
15.如权利要求1至13中的任何一项所述的方法，其中所述多核苷酸是线状DNA分子。
16.一种用于鉴定向细胞的基因组整合外源序列的方法，所述方法包括：
如权利要求1至15中的任何一项在所述细胞中表达外源序列，其中所述外源核酸序列包括标记基因；以及
鉴定表达所述标记基因的细胞，由此鉴定所述外源序列已经被整合至其中的细胞。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述外源序列被可操作地连接至启动子。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中所述标记基因包括筛选标记。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述筛选标记包括GFP。
20.如权利要求1至19中的任何一项所述的方法，其中所述第一切割半结构域和第二切割半结构域来自IIS型限制性内切核酸酶。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述IIS型限制性内切核酸酶选自由FokI和StsI组成的组。
22.如权利要求1至21中的任何一项所述的方法，其中所述细胞被停滞在细胞周期的G2期。
23.如权利要求1至22中的任何一项所述的方法，其中所述融合蛋白中的至少一个包括所述切割半结构域的二聚化界面的氨基酸序列中的改变。
24.如权利要求1至23所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述细胞是人类细胞。
26.如权利要求2至25中的任何一项所述的方法，其中锌指结合结构域包括四个锌指，从N-末端至C-末端依次为F1至F4并且进一步地其中：
F1包括YNWHLQR(SEQ ID NO：16)；
F2包括RSDHLTT(SEQ ID NO：8)；
F3包括HNYARDC(SEQ ID NO：9)；以及
F4包括QNSTRIG(SEQ ID NO：15)。
27.如权利要求2至26中的任何一项所述的方法，其中锌指结合结构域包括四个锌指，从N-末端至C-末端依次为F1至F4并且进一步地其中：
F1包括QSSNLAR(SEQ ID NO：3)；
F2包括RTDYLVD(SEQ ID NO：11)；
F3包括YNTHLTR(SEQ ID NO：12)；以及
F4包括QGYNLAG(SEQ ID NO：13)。
28.一种设计的锌指蛋白，其与PPP1R12C基因结合，其中所述蛋白包括四个锌指并且所述锌指中的每一个的识别区域的氨基酸序列如下：
F1包括YNWHLQR(SEQ ID NO：16)；
F2包括RSDHLTT(SEQ ID NO：8)；
F3包括HNYARDC(SEQ ID NO：9)；以及
F4包括QNSTRIG(SEQ ID NO：15)。
29.一种设计的锌指蛋白，其与PPP1R12C基因结合，其中所述蛋白包括四个锌指并且所述锌指中的每一个的识别区域的氨基酸序列如下：
F1包括QSSNLAR(SEQ ID NO：3)；
F2包括RTDYLVD(SEQ ID NO：11)；
F3包括YNTHLTR(SEQ ID NO：12)；以及
F4包括QGYNLAG(SEQ ID NO：13)。
30.如权利要求28或权利要求29所述的设计的锌指蛋白，其还包括切割结构域或切割半结构域。
31.如权利要求28至30的任何一项所述的蛋白，其中所述切割半结构域来自IIS型限制性内切核酸酶。
32.如权利要求31所述的蛋白，其中所述IIS型限制性内切核酸酶选自由FokI和StsI组成的组。
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