KR20120038020A - 표적화 변형에 대한 동형접합성 유기체 - Google Patents
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Abstract
동형접합성으로 변형된 유기체 및 이러한 유기체의 제조 및 사용 방법이 본원에 개시된다.
Description
관련 출원의 참조
본 출원은 2009년 8월 11일 제출된 미국 가 출원 제61/273,928호의 우선권을 주장하며, 이것은 명세서는 그 전문이 본원에 참고자료로 포함된다.
기술분야
본 발명은 하나 이상의 내인성 유전자의 표적화 변형을 위한 동형접합성 유기체에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 유전자의 양 대립형질이 파괴되지만, 이 동형접합성 녹아웃 유기체가 파괴된 유전자좌에 외래 서열을 함유하지 않는 유기체(예를 들어, 식물 또는 동물)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 유전자의 양 대립형질이 트랜스젠의 삽입에 의해서 변형된 유기체(예를 들어, 식물 또는 동물)로서, 트랜스젠이 리포터(예를 들어, 선택성 마커)를 암호화하는 서열을 결여한 유기체에 관한 것이다.
동형접합성 표적화 유전자 변형을 가진 유기체(예를 들어, 식물 및 동물)는 여러 다양한 농업, 제약 및 생물기술 용도에 유용하다. 이들 유기체들은 종래에는 변형에 대해 선택된 유전자에서 원하는 서열(도너)의 상동성 재조합을 유도함으로써 생성되었다. 그러나, 도너 DNA가 표적화 유전자좌에 통합된 세포를 선택하려면 표적화하는 벡터가 양성 선택 마커와 음성 선택 마커를 모두 포함해야 했다. 예를 들어, 미국특허 제5,464,764호를 참조한다. 선택된 세포는 이형접합체를 생산하는데, 유전자 변형에 대한 동형접합성 유기체를 얻기 위해서는 이들이 교배되어야 한다. 이 과정 내내 선택 마커는 유기체의 게놈에 통합되어 있는 상태이며, 결과의 변형된 동형접합체는 변형된 유전자와 외래(예를 들어, 마커) 서열을 모두 포함한다.
최근, 표적 부위에 특이적으로 결합하도록 조작된 징크 핑거 뉴클레아제 및 I-SceI와 같은 귀소(homing) 엔도뉴클레아제를 포함하는 뉴클레아제들이 다양한 상이한 종들에서 게놈 변형에 성공적으로 사용되었다. 예를 들어, 미국특허 공개 제2003-0232410호; 제2005-0208489호; 제2005-0026157호; 제2005-0064474호; 제2006-0188987호; 제2006-0063231호; 제2008-0182332호; 제2009-0111188호, 및 국제 공개 WO 07/014275를 참조하며, 이들의 명세서는 모든 취지에서 그 전문이 본원에 참고자료로 포함된다. 이들 ZFN은 표적 뉴클레오티드 서열에 이중가닥 파손부(DSB)를 만드는데 사용될 수 있으며, 이것은 표적화 유전자좌에 상동성 재조합을 통한 도너 핵산 도입의 빈도를 1000배 이상 증가시킨다(표적화 통합). 또한, 비-상동성 말단 결합(NHEJ)에 의한 부위-특이적 DSB의 부정확한 수선은 표적화 유전자 파괴를 가져올 수 있다.
그렇지만, 비-뉴클레아제 방법과 마찬가지로, 많은 유기체에서 뉴클레아제-매개 변형을 쉽게 확인하기 위해서 선택 마커 또는 리포터 유전자를 포함하는 외인성 DNA가 선택된 유전자좌를 향해 표적화된다. 예를 들어, Shukla et al. (2009) Nature 459(7245):437-441; 미국특허 공개 제2008-0182332호 및 제2009-0111188호를 참조한다. 리포터의 표적화 통합은 많은 용도에 있어서 변형을 확인할 수 있도록 하지만, 이 기술은 추가의 외래 핵산 서열이 게놈에 삽입되어 남기 때문에 항상 바람직한 것은 아니다.
따라서, 변형에 대해 표적화된 유전자좌(유전자좌들)에 삽입된 외래 서열이 없는 동형접합성 KO 유기체 및 선택성 마커와 같은 리포터를 암호화하는 서열이 없는 동형접합성 트랜스제닉 유기체를 포함하여, 원하는 유전자 유전자좌에서 변형된 동형접합성 유기체를 생성하기 위한 조성물 및 방법에 대한 필요성이 있다.
원하는 유전자 유전자좌에 변형을 포함하는 동형접합성 유기체 및 이들 유기체를 생성하는 방법 및 시스템이 본원에 설명된다. 변형된 유기체는 변형에 대해 표적화된 유전자좌(유전자좌들)에 삽입된 외래 서열이 없는 동형접합성 KO 유기체 및 리포터(예를 들어, 선택성 마커)를 암호화하는 서열이 없는 동형접합성 트랜스제닉 유기체를 포함한다.
한 양태에서, 유전자좌의 양 대립형질이 모두 변형된(예를 들어, 파괴된) 적어도 하나의 유전자 유전자좌를 포함하는 변형된 유기체가 본원에서 제공되며, 이때 변형된 유기체는 변형된 유전자좌에 외래 서열을 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, 본원에 설명된바 같은 유기체는 파괴되지 않은 어떤 유전자좌에 하나 이상의 트랜스젠(외래 서열)을 포함할 수 있다(녹아웃).
다른 양태에서, 유전자좌의 양 대립형질이 모두 트랜스젠을 포함하는 적어도 하나의 유전자 유전자좌를 포함하는 변형된 유기체가 본원에서 제공되며, 이때 트랜스젠은 스크리닝 또는 선택성 마커와 같은 리포터를 포함하지 않는다. 추가 양태에서, 유전자좌의 모든 대립형질(예를 들어, 3배체 또는 4배체 유기체에서)이 트랜스젠을 포함하는 적어도 하나의 유전자 유전자좌를 포함하는 변형된 유기체가 본원에서 제공되며, 이때 트랜스젠은 스크리닝 또는 선택성 마커와 같은 리포터를 포함하지 않는다.
본원에 설명된 유기체들 중 어느 것은 하나 이상의 양쪽-대립형질(또는 다중-대립형질) 변형(예를 들어, 파괴 또는 트랜스젠)을 포함할 수 있다. 또한, 유기체는, 예를 들어 진핵생물(예를 들어, 식물 또는 래트, 마우스와 같은 포유류, 또는 어류 등의 동물)일 수 있다.
다른 양태에서, 외래 서열을 결여하는 동형접합성(양쪽-대립형질) 녹아웃 유기체를 생성하는 방법이 본원에서 제공되며, 이 방법은 게놈의 선택된 유전자좌에 외래 서열의 표적화 통합을 매개하는 뉴클레아제를 사용하여 세포에 외래 서열(예를 들어, 리포터)을 도입하는 단계, 표적 유전자좌의 1개 대립형질에 외래 서열이 도입된 세포를 확인하는 단계(한쪽-대립형질 TI 세포), 나머지 대립형질에 NHEJ 결실을 포함하는 한쪽-대립형질 TI 세포를 확인하는 단계(TI/NHEJ 클론), TI/NHEJ 클론을 생식가능한 성숙도까지 발달시키는 단계, TI/NHEJ 유기체들을 서로 교배하는 단계(또는 식물의 경우 유기체의 "자체" 교배도 가능), 및 양쪽-대립형질 NHEJ 변형을 나타내는 자손을 확인하는 단계를 포함하며, 이로써 표적 유전자좌에 외래 서열을 결여한 양쪽-대립형질 녹아웃 유기체가 생성된다. 또 다른 양태에서, 리포터(예를 들어, 선택성 마커)를 암호화하는 서열을 결여하는 원하는 트랜스젠 서열을 포함하는 동형접합성(양쪽-대립형질) 유기체를 생성하는 방법이 본원에서 제공되며, 이 방법은 게놈의 선택된 유전자좌에 리포터 외래 서열의 표적화 통합을 매개하는 뉴클레아제를 사용하여 세포에 외래 리포터 서열을 도입하는 단계, 세포에 원하는 트랜스젠 서열(들)을 도입하는 단계로, 상기 뉴클레아제가 게놈의 선택된 유전자좌에 트랜스젠 서열의 표적화 통합을 매개하는 단계, 표적 유전자좌의 1개 대립형질에 외래 리포터 서열이 도입된 세포를 확인하는 단계(한쪽-대립형질 리포터-TI 세포), 나머지 대립형질에 트랜스젠 삽입을 포함하는 한쪽-대립형질 리포터-TI 세포를 확인하는 단계(리포터-TI/트랜스젠 클론), 리포터-TI/트랜스젠 클론을 생식가능한 성숙도까지 발달시키는 단계, 리포터-TI/트랜스젠 유기체들을 서로 교배하는 단계(또는 식물의 경우 유기체의 "자체" 교배도 가능하다), 및 양쪽-대립형질 트랜스젠 삽입을 나타내는 자손을 확인하는 단계를 포함하며, 이로써 표적 유전자좌에 원하는 트랜스젠을 포함하고, 리포터 서열은 결여한 양쪽-대립형질 유기체가 생성된다.
특정 구체예에서, 뉴클레아제는 하나 이상의 징크핑거 뉴클레아제(ZFN)를 포함한다. 다른 구체예에서, 뉴클레아제는 귀소 엔도뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제, 또는 TAL-이펙터 도메인 뉴클레아제 융합체("TALEN")를 포함한다. 본원에 설명된 구체예들 중 어느 것에서, 외래 서열(예를 들어, 외래 리포터 서열)과 트랜스젠은 뉴클레아제(들)와 동시에 또는 순차적으로 도입될 수 있다. 어떤 양태에서, 외래 서열은 선택성 마커(예를 들어, 식물의 제초제 내성 유전자) 또는 스크리닝 마커(예를 들어, 형광 단백질)와 같은 리포터 유전자를 포함한다. 본원에 설명된 방법들 중 어느 것은 동형접합성 KO인 유기체 또는 다수의 유전자좌에 동형접합성 트랜스젠 삽입을 함유하는 유기체를 생성하기 위해 반복될 수 있다. 본원에 설명된 방법들은 모두 둘 이상의 대립형질을 포함하는 배수체 유기체, 예를 들어 3배체 또는 4배체 식물에 적용될 수 있다는 것은 자명할 것이다(예를 들어, 단계를 반복함으로써).
다른 추가 양태에서, 본 발명은 삽입된 리포터(예를 들어, 스크리닝 또는 선택) 서열이 없는 동형접합성 표적화 유전자 변형을 갖는 유기체를 생성하는데 유용한 키트를 제공한다. 키트는 전형적으로 표적 부위(변형에 대해 선택된 유전자좌)와 결합하는 하나 이상의 뉴클레아제(또는 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드), 뉴클레아제의 표적 부위(들)를 함유하는 선택적 세포, 표적화 통합을 위한 외래 서열, 표적 부위에 상동성인 서열을 포함하는 선택적 도너 트랜스젠, 및 설명서를 포함하며, 설명서는 (i) 세포에 뉴클레아제와 외래 서열을 도입하고; (ii) 표적 유전자좌에서 대립형질에 외래 서열이 삽입된 세포를 확인하고; (iii) 유전자좌의 나머지 대립형질에 외래 리포터 서열의 한쪽-대립형질 표적화 통합 및 변형을 갖는 세포를 확인하고(리포터-TI/변형된 세포); (iv) 선택된 세포를 생식가능한 성숙한 유기체로 성장/발달시키고; (v) 리포터-TI/변형된 이형접합성 유기체들을 교배하고; (vi) 표적화 유전자 변형에 대해 양쪽-대립형질인 리포터-TI/변형된 교배의 자손을 확인하기 위한 것이다. 이러한 단계들을 배수체 유기체에서 반복하여 원한다면 모든 대립형질을 변형할 수 있다.
도 1은 옥수수(Zea mays)의 ZFN-TI-변형된 IPK1 염색분체의 비-TI 대립형질의 서열 분석을 나타낸다. 밑줄친 염기쌍이 게놈 변형에 사용된 ZFN 쌍의 결합 부위이다. ":"는 결실된 염기를 표시한다. 첫째 줄에 야생형 서열이 제시되고, 서열화된 비-TI 대립형질 사건의 다중 서열 판독이 아래 제시된다.
도 2는 쥐과 히스톤 H3.3B 유전자의 3' 미번역 영역에 형광 단백질(증진된 황색 형광 단백질(EYFP))을 도입하기 위한 설계도이다. 맨 윗줄은 염색체 11의 쥐과 게놈의 H3.3B의 도해로서, H3.3B-특이적 ZFN을 위한 유전자 서열의 표적 부위를 나타낸다. 둘째 줄은 EYFP 서열에 연결된 H3.3B를 포함하는 도너 뉴클레오티드("표적화하는 구성물")를 나타내며, 여기서 EYFP는 3' 미번역 영역의 5' 단부에 삽입되었다. 맨 아랫줄은 쥐과 게놈의 H3.3B 유전자좌에 도너 뉴클레오티드가 삽입된 것을 나타낸다.
도 3은 FACS 및 서던 블롯 분석의 결과로서, 쥐과 EX 세포에 EYFP 트랜스젠이 이형접합성 통합된 것을 나타낸다. 도 3a는 H3.3B 유전자좌(상부 패널)에 삽입된 EYFP 유전자 서열을 결여한 ES 세포의 FACS 결과 및 H3.3B-EYFP 삽입이 수용된 세포에 대한 FACS 결과를 나타낸다. 도 3b는 H3.3B-EYFP 서열이 삽입된 세포의 게놈 DNA로부터 유래된 서던 블롯을 야생형 세포와 비교하여 나타낸다.
도 4는 H3.3B-EYFP/이형접합체에서 HNEJ를 증명하는 19개 비-리포터 대립형질로부터의 서열을 나타낸다. 밑줄친 염기쌍이 변형에 사용된 ZFN 쌍의 결합 부위이다. "-"은 서열에 존재하는 결실된 염기 또는 공간을 표시하며, 이들이 삽입을 함유하는 클론과의 정렬을 허용한다.
도 2는 쥐과 히스톤 H3.3B 유전자의 3' 미번역 영역에 형광 단백질(증진된 황색 형광 단백질(EYFP))을 도입하기 위한 설계도이다. 맨 윗줄은 염색체 11의 쥐과 게놈의 H3.3B의 도해로서, H3.3B-특이적 ZFN을 위한 유전자 서열의 표적 부위를 나타낸다. 둘째 줄은 EYFP 서열에 연결된 H3.3B를 포함하는 도너 뉴클레오티드("표적화하는 구성물")를 나타내며, 여기서 EYFP는 3' 미번역 영역의 5' 단부에 삽입되었다. 맨 아랫줄은 쥐과 게놈의 H3.3B 유전자좌에 도너 뉴클레오티드가 삽입된 것을 나타낸다.
도 3은 FACS 및 서던 블롯 분석의 결과로서, 쥐과 EX 세포에 EYFP 트랜스젠이 이형접합성 통합된 것을 나타낸다. 도 3a는 H3.3B 유전자좌(상부 패널)에 삽입된 EYFP 유전자 서열을 결여한 ES 세포의 FACS 결과 및 H3.3B-EYFP 삽입이 수용된 세포에 대한 FACS 결과를 나타낸다. 도 3b는 H3.3B-EYFP 서열이 삽입된 세포의 게놈 DNA로부터 유래된 서던 블롯을 야생형 세포와 비교하여 나타낸다.
도 4는 H3.3B-EYFP/이형접합체에서 HNEJ를 증명하는 19개 비-리포터 대립형질로부터의 서열을 나타낸다. 밑줄친 염기쌍이 변형에 사용된 ZFN 쌍의 결합 부위이다. "-"은 서열에 존재하는 결실된 염기 또는 공간을 표시하며, 이들이 삽입을 함유하는 클론과의 정렬을 허용한다.
표적화 유전자좌의 어느 하나의 대립형질에 부가된 유전자 재료가 없는 녹아웃(KO) 유기체 및 관심의 트랜스젠을 포함하지만, 관심의 트랜스젠이 선택성 마커와 같은 리포터를 암호화하는 서열을 결여하는 녹인 유기체를 포함하는 동형접합성으로 변형된 유기체가 본원에 설명된다. 또한, 이들 변형된 유기체를 생성하는 방법이 설명된다. 특히, 유기체는 전형적으로 양 대립형질 모두에서 유전자 기능을 변경하는 변형을 가진다. 이들 유기체는 관심의 유기체로부터 세포를 제공하는 단계, 뉴클레아제를 사용하여 표적화 통합(TI)을 통해서 세포의 선택된 유전자좌에서 대립형질에 외래 리포터 서열(예를 들어, 스크리닝 또는 선택성 마커)을 삽입하는 단계, 선택된 유전자좌에서 대립형질에 외래 리포터 서열이 삽입된 세포를 확인하는 단계, 유전자좌의 제 2 대립형질에서 변형 사건에 대한 한쪽-대립형질 리포터-TI 클론을 스크리닝하여 한 대립형질은 리포터 TI를 갖고, 나머지 대립형질은 NHEJ에 의해 변형되거나(리포터 TI/NHEJ), 또는 나머지 대립형질이 비-리포터 마커 트랜스젠을 포함하는(리포터-TI/변형된 클론) 세포를 확인하는 단계, 리포터-TI/변형된 클론을 생식가능한 성숙한 유기체로 발달시키는 단계, 리포터-TI/변형된 유기체들을 교배하는 단계, 및 양쪽-대립형질 녹아웃(NHEJ/NHEJ) 또는 양쪽-대립형질 비-리포터 마커 녹인(비-리포터 TI/비-리포터 마커 TI) 유기체인 교배의 자손을 확인하는 단계에 의해서 생성된다.
일반적 내용
본원에 개시된 방법의 실시와 조성물의 제조 및 사용에는 달리 지시되지 않는다면 분자생물학, 생화학, 크로마틴 구조 및 분석, 컴퓨터 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 분야 및 관련된 분야의 종래의 기술들이 사용되며, 이들은 당업자의 기술 범위 내이다. 이들 기술은 문헌에 충분히 설명된다. 예를 들어, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 및 제3판, 2001; Ausubel et al. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987, 및 주기적 개정판; METHODS IN ENZYMOLOGY 시리즈, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, 제3판, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin"(P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; 및 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999를 참조한다.
정의
용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호 교환하여 사용되며, 선형 또는 원형 입체형태의, 단일다각 또는 이중가닥 형태의, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 말한다. 본 명세서의 취지에서, 이들 용어는 중합체의 길이에 관한 제한으로서 해석되면 안 된다. 이들 용어는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 유사체뿐만 아니라, 염기, 당 및/또는 포스페이트 부분(예를 들어, 포스포로티오에이트 백본)에 변형이 있는 뉴클레오티드도 포괄할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기쌍 특이성을 가지는데, 즉 A의 유사체는 T와 염기쌍일 것이다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 상호 교환하여 사용되며, 아미노산 잔기들의 중합체를 말한다. 또한, 이 용어는 하나 이상의 아미노산이 상응하는 자연 발생한 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에도 적용된다.
"결합"은 거대분자들 사이의 서열-특이적, 비-공유 상호작용을 말한다(예를 들어, 단백질과 핵산 사이). 상호작용이 전체적으로 서열 특이적이기만 하면 결합 상호작용의 모든 성분이 서열 특이적일 필요는 없다(예를 들어, DNA 백본의 포스페이트 잔기와의 접촉). 이러한 상호작용은 일반적으로 10-6M-1 이하의 해리상수(Kd)를 특징으로 한다. "친화성"은 결합 강도를 말하며, 증가된 결합 친화성은 더 낮은 Kd와 관련된다.
"결합 단백질"은 다른 분자와 비-공유 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들어 DNA 분자(DNA-결합 단백질), RNA 분자(RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자(단백질-결합 단백질)와 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우, 그것은 자신과 결합할 수 있고(호모다이머, 호모트라이머 등을 형성), 및/또는 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자와 결합할 수 있다. 결합 단백질은 하나 이상의 타입의 결합 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 징크 핑거 단백질은 DNA-결합, RNA-결합 및 단백질-결합 활성을 가진다.
"TAL-이펙터 DNA 결합 도메인"은 하나 이상의 직렬 반복부 도메인을 통해 서열-특이적 방식으로 DNA와 상호작용하는 단백질, 또는 대형 단백질 내의 도메인이다.
"징크 핑거 DNA 결합 단백질"(또는 결합 도메인)은 하나 이상의 징크 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA와 결합하는 단백질, 또는 대형 단백질 내의 도메인으로서, 이들은 아연 이온의 배위를 통해 안정화된 구조를 갖는 결합 도메인 내의 아미노산 서열 영역이다. 용어 "징크 핑거 DNA 결합 단백질"은 주로 징크 핑거 단백질 또는 ZFP로 약기된다.
징크 핑거 결합 도메인(예를 들어, 인식 나선 영역)은 정해진 뉴클레오티드 서열과 결합하도록 "조작"될 수 있다. 징크 핑거의 조작된 영역은 전형적으로 인식 나선, 특히 -1에서 +6까지 알파-나선 영역의 부분이다. 조작된 인식 나선의 백본 서열은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, Miller et al. (2007) Nat Biotechnol 25, 778-785를 참조한다. 징크 핑거 단백질을 조작하는 방법의 비제한적 예는 설계 및 선택이다. 설계된 징크 핑거 단백질은 자연적으로 발생하지 않는 단백질로서, 그 설계/조성은 원칙적으로 합리적 기준의 결과이다. 합리적 설계 기준은 치환 규칙의 적용 및 기존 ZFP 설계 및 결합 데이터에 관한 정보를 저장하고 있는 데이터베이스에서 정보를 처리하는 컴퓨터 실행 알고리즘을 포함한다. 예를 들어, 미국특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 및 제6,534,261호; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496을 참조한다.
"선택된" 징크 핑거 단백질은 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선택과 같은 경험적 과정에서 주로 생기는 자연적으로는 존재하지 않는 단백질이다. 예를 들어, 미국특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,200,759호; 국제 공개 WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197 및 WO 02/099084을 참조한다.
용어 "서열"은 어떤 길이의 뉴클레오티드 서열을 말하는데, 이것은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 선형, 원형 또는 분지형일 수 있으며, 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 용어 "도너 서열"은 게놈에 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 도너 서열은 어떤 길이일 수 있으며, 예를 들어 2-10,000개 뉴클레오티드 길이(또는 이들 사이의 또는 그 이상의 어떤 정수 값), 바람직하게는 약 100-1,000개 뉴클레오티드 길이(또는 이들 사이의 어떤 정수), 더 바람직하게는 약 200-500개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
"동일하지 않은 상동성 서열"은 제 2 서열과 어느 정도 서열 동일성을 공유하지만, 그 서열이 제 2 서열과 동일하지는 않은 제 1 서열을 말한다. 예를 들어, 돌연변이체 유전자의 야생형 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 돌연변이체 유전자의 서열과 동일하지 않지만 상동성이다. 특정 구체예에서, 두 서열 간의 상동성 정도는 정상 세포성 메커니즘을 사용하여 그들 사이의 상동성 재조합이 허용될 만큼 충분하다. 2개의 동일하지 않은 상동성 서열은 어떤 길이일 수 있으며, 이들의 비-상동성 정도는 단일 뉴클레오티드만큼 적거나(예를 들어, 표적화 상동성 재조합에 의한 게놈 점 돌연변이의 보정의 경우), 또는 10 킬로베이스 이상만큼 클 수 있다(예를 들어, 염색체의 정해진 곳을 벗어난 부위에 유전자가 삽입되는 경우). 동일하지 않은 상동성 서열을 포함하는 2개의 폴리뉴클레오티드가 동일한 길이일 필요는 없다. 예를 들어, 20-10,000개 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍의 외래 폴리뉴클레오티드(즉, 도너 폴리뉴클레오티드)가 사용될 수 있다.
핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하는 기술은 본 분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 기술은 유전자의 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하고 및/또는 그것에 의해서 암호화된 아미노산 서열을 결정하는 단계, 및 이들 서열을 제 2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 단계를 포함한다. 이 방식으로 게놈 서열도 결정되고 비교될 수 있다. 일반적으로, 동일성이란 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 각기 정확한 뉴클레오티드-뉴클레오티드 또는 아미노산-아미노산 대응성을 말한다. 둘 이상의 서열(폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)이 이들의 동일성 퍼센트를 결정함으로써 비교될 수 있다. 핵산 서열이든 아미노산 서열이든 2개 서열의 서열 동일성은 2개의 정렬된 서열 사이의 정확한 매치의 수를 더 짧은 서열의 길이로 나누고, 100을 곱한 것이다.
대안으로서, 상동성 영역들 간의 안정한 듀플렉스의 형성을 허용하는 조건하에서 폴리뉴클레오티드들을 혼성화하고, 이어서 단일가닥-특이적 뉴클레아제(들)로 분해하고, 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 폴리뉴클레오티드들 사이의 서열 유사도가 결정될 수 있다. 2개의 핵산, 또는 2개의 폴리펩티드 서열은 상기 방법을 사용하여 결정했을 때, 분자들의 한정된 길이에서 해당 서열들이 70%-75%, 바람직하게 80%-82%, 더 바람직하게 85%-90%, 더욱 바람직하게 92%, 더 더욱 바람직하게 95%, 그리고 가장 바람직하게 98%의 서열 동일성을 나타낼 때 서로 실질적으로 상동성이라고 한다. 본원에서 사용된 "실질적으로 상동성"은 또한 명시된 DNA 또는 폴리펩티드 서열에 대해 완전한 동일성을 나타내는 서열을 말한다. 실질적으로 상동성인 DNA 서열은, 예를 들어 해당 특정 시스템에 대해 정의된 긴축 조건하의 서던 혼성화 실험에서 확인될 수 있다. 적절한 혼성화 조건의 한정은 본 분야의 기술범위 내이다. 예를 들어, Sambrook et al., 상동; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins((1985), Oxford; Washington, DC; IRL Press)를 참조한다.
"재조합"은 2개의 폴리뉴클레오티드 사이의 유전자 정보의 교환 과정을 말한다. 본 명세서의 취지에서, "상동성 재조합(HR)"은, 예를 들어 상동성-지정 수선 메커니즘을 통해 세포에서 이중가닥 파손부가 수선되는 동안 일어나는 이러한 교환의 특수화된 형태를 말한다. 이 과정은 뉴클레오티드 서열 상동성을 필요로 하고, "표적" 분자(즉, 이중가닥 파손을 경험한 것)의 주형 수선에 "도너" 분자를 사용하며, 이것은 "비-크로스오버 유전자 전환" 또는 "짧은 트랙 유전자 전환"이라고 다양하게 알려져 있는바, 이것은 도너로부터 표적으로 유전자 정보의 전달을 유도하기 때문이다. 어떤 특정 이론에 결부되지는 않지만, 이러한 전달은 파손된 표적과 도너 사이에 형성되는 헤테로듀플렉스 DNA의 미스매치 보정, 및/또는 도너가 유전자 정보의 재합성에 사용되어 표적의 일부가 되는 "합성-의존성 가닥 아닐링", 및/또는 관련된 과정들을 포함할 수 있다. 이러한 특수한 HR은 주로 표적 분자의 서열 변경을 가져오며, 도너 폴리뉴클레오티드의 서열의 일부 또는 전부가 표적 폴리뉴클레오티드에 통합된다.
본 명세서의 방법에서, 본원에 설명된바 같은 하나 이상의 표적화 뉴클레아제는 정해진 부위에서 표적 서열(예를 들어, 세포성 크로마틴)에 이중가닥 파손을 만들고, 파손된 영역의 뉴클레오티드 서열에 상동성인 "도너" 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입될 수 있다. 이중가닥 파손부(DSB)의 존재는 도너 서열의 통합을 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 도너 서열은 물리적으로 통합될 수 있거나, 또는 도너 폴리뉴클레오티드가 상동성 재조합을 통한 파손부 수선의 주형으로서 사용되어 세포성 크로마틴으로의 도너에서처럼 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부의 도입을 유도하게 된다. 이와 같이, 세포성 크로마틴의 제 1 서열이 변경될 수 있으며, 특정 구체예에서는 도너 폴리뉴클레오티드에 존재하는 서열로 전환될 수 있다. 따라서, 용어 "치환하다" 또는 "치환"의 사용은 한 뉴클레오티드 서열의 다른 것으로의 치환(즉, 정보의 의미에서 서열의 치환)을 나타내는 것으로 이해될 수 있으며, 한 뉴클레오티드의 다른 것으로의 물리적 또는 화학적 치환이 반드시 필요한 것은 아니다. 어떤 구체예에서, 본원에 설명된 표적화 뉴클레아제에 의해서 2개의 DSB가 도입되어, DSB 사이에 있는 DNA의 결실이 생긴다. 어떤 구체예에서, "도너" 폴리뉴클레오티드가 이들 2개 DSB 사이에 삽입된다.
따라서, 특정 구체예에서, 관심의 영역의 서열에 상동성인 도너 서열의 일부분은 치환된 게놈 서열에 대해 약 80-99%(또는 이 사이의 어떤 정수) 서열 동일성을 나타낸다. 다른 구체예에서, 도너 서열과 게놈 서열 사이의 상동성은, 예를 들어 100개 연속 염기쌍에 걸쳐 도너 서열과 게놈 서열 사이에 단지 1개의 뉴클레오티드만 차이가 있을 경우 99%를 초과한다. 특정 사례에서, 도너 서열의 비-상동성 부분은 관심의 영역에 존재하지 않는 서열을 함유할 수 있으며, 이로써 새로운 서열이 관심의 영역에 도입된다. 이런 예에서, 비-상동성 서열에는 일반적으로 50-1000개 염기쌍(또는 이 사이의 어떤 정수 값)의 서열 또는 1,000개를 초과하는 다수의 염기쌍들이 측면에 위치되고, 이들은 관심의 영역의 서열에 상동성이거나 동일하다. 다른 구체예에서, 도너 서열은 제 1 서열에 비-상동성이고, 비-상동성 재조합 메커니즘에 의해서 게놈에 삽입된다.
본원에 설명된 방법들 중 어느 것이라도 관심의 유전자(들)의 발현을 파괴하는 도너 서열의 표적화 통합에 의해 세포에서 하나 이상의 표적 서열을 부분적 또는 완전해 비활성화하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 유전자를 가진 셀라인이 제공된다.
또한, 본원에 설명된바 같은 표적화 통합 방법을 사용하여 하나 이상의 외래 서열을 통합할 수 있다. 외래 핵산 서열은, 예를 들어 하나 이상의 유전자 또는 cDNA 분자, 또는 모든 타입의 코딩 또는 비코딩 서열, 뿐만 아니라 하나 이상의 조절 요소(예를 들어, 프로모터)를 포함할 수 있다. 또한, 외래 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 분자(예를 들어, 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 억제성 RNA(RNAis), 마이크로RNA(miRNA) 등)를 생성할 수 있다.
"절단"은 DNA 분자의 공유 백본의 파손을 말한다. 절단은, 제한은 아니지만 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하는 다양한 방법에 의해서 개시될 수 있다. 단일가닥 절단과 이중가닥 절단이 모두 가능하며, 이중가닥 절단은 2개의 별개의 단일가닥 절단 사건의 결과로서 일어날 수 있다. DNA 절단은 블런트형(blunt) 단부나 스태거형(staggered) 단부 중 어느 하나를 생성할 수 있다. 특정 구체예에서, 표적화 이중가닥 DNA 절단을 위해 융합 폴리펩티드가 사용된다.
"절단 반-도메인"은 제 1 폴리펩티드(동일하거나 상이한)와 함께 절단 활성(바람직하게는 이중가닥 절단 활성)을 갖는 복합체를 형성하는 폴리펩티드 서열이다. 용어 "제 1 및 제 2 절단 반-도메인;" "+ 및 - 절단 반-도메인" 및 "우측 및 좌측 절단 반-도메인"은 상호 교환하여 사용되며, 다이머화하는 절단 반-도메인들의 쌍을 말한다.
"조작된 절단 반-도메인"은 다른 절단 반-도메인(예를 들어, 다른 조작된 절단 반-도메인)과 무조건적으로 헤테로다이머를 형성하도록 변형된 절단 반-도메인이다. 또한, 본원에 참고자료로 포함되는 미국 특허출원 공개 제2005/0064474호, 제20070218528호 및 제2008/0131962호를 참조한다.
"크로마틴"은 세포성 게놈을 포함하는 뉴클레오단백질 구조이다. 세포성 크로마틴은 핵산, 주로 DNA, 및 히스톤 및 비-히스톤 염색체 단백질을 포함하는 단백질을 포함한다. 진핵세포성 크로마틴은 대부분 뉴클레오솜의 형태로 존재하며, 뉴클레오솜 코어가 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4의 각 2개를 포함하는 옥타머와 관련된 DNA의 약 150개 염기쌍을 포함하고, 링커 DNA(길이는 유기체에 따라 가변적이다)가 뉴클레오솜 코어 사이에 연장되어 있다. 히스톤 H1의 분자는 일반적으로 링커 DNA와 관련된다. 본 명세서의 취지에서, 용어 "크로마틴"은 모든 타입의 세포성 뉴클레오단백질, 원핵세포성과 진핵세포성을 모두 포괄하는 의미이다. 세포성 크로마틴은 염색체 크로마틴과 에피솜 크로마틴을 모두 포함한다.
"염색체"는 세포의 게놈의 전부 또는 일부를 포함하는 크로마틴 복합체이다. 세포의 게놈은 주로 그것의 핵형에 의해서 특정되는데, 이것은 세포의 게놈을 포함하는 전체 염색체들의 집합이다. 세포의 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.
"에피솜"은 복제성 핵산, 뉴클레오단백질 복합체 또는 세포의 염색체 핵형의 일부가 아닌 핵산을 포함하는 다른 구조이다. 에피솜의 예들은 플라스미드 및 특정 바이러스 게놈을 포함한다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합을 위한 충분한 조건이 존재할 경우 결합 분자가 결합하는 핵산의 부분을 정의하는 핵산 서열이다. 예를 들어, 서열 5'-GAATTC-3'은 Eco RI 제한 엔도뉴클레아제의 표적 부위이다.
"외래" 분자는 정상적으로는 세포에 존재하지 않지만, 하나 이상의 유전적 방법, 생화학적 방법 또는 다른 방법들에 의해서 세포에 도입될 수 있는 분자이다. "정상적인 세포내 존재"는 특정한 발생 단계 및 세포의 환경적 조건과 관련하여 결정된다. 따라서, 예를 들어, 근육의 배 발생 동안에만 존재하는 분자는 성체 근육 세포와 관련해서는 외래 분자이다. 유사하게, 열 충격에 의해 유도된 분자는 비-열-충격 세포와 관련해서는 외래 분자이다. 외래 분자는, 예를 들어 기능부전 내인성 분자의 기능형 버전 또는 정상적으로 기능하는 내인성 분자의 기능부전 버전을 포함할 수 있다.
특히, 외래 분자는 조합 화학 공정에 의해서 생성되는 것과 같은 소 분자, 또는 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 리포단백질, 다당, 상기 분자들의 어떤 변형된 유도체, 또는 상기 분자들 중 하나 이상을 포함하는 어떤 복합체와 같은 거대분자일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하며, 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있고, 선형, 분지형 또는 환형일 수 있으며, 어떤 길이를 가질 수 있다. 핵산은 듀플렉스를 형성할 수 있는 것들, 및 트리플렉스-형성 핵산을 포함한다. 예를 들어, 미국특허 제5,176,996호 및 제5,422,251호를 참조한다. 단백질은, 제한은 아니지만 DNA-결합 단백질, 전사인자, 크로마틴 리모델링 인자, 메틸화 DNA 결합 단백질, 중합효소, 메틸라제, 디메틸라제, 아세틸라제, 디아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 인테그라제, 재조합효소, 리가제, 토포이소머라제, 기라제 및 헬리카제를 포함한다.
외래 분자는 내인성 분자와 동일한 타입의 분자, 예를 들어 외래 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 외래 핵산은 세포에 도입된 감염시키는 바이러스 게놈, 플라스미드 또는 에피솜, 또는 정상적으로는 세포에 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 세포에 외래 분자를 도입하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 제한은 아니지만 지질-매개 전달(즉, 리포솜, 중성 및 양이온성 지질을 포함), 전기천공, 직접 주사, 세포융합, 입자포격, 인산칼슘 공-침전, DEAE-덱스트란-매개 전달 및 바이러스 벡터-매개 전달을 포함한다.
반면에, "내인성" 분자는 특정한 환경 조건하에 특정한 발생 단계에서 특정한 세포에 정상적으로 존재하는 것이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘트리온의 게놈, 엽록체 또는 다른 세포소기관, 또는 자연-발생 에피솜 핵산을 포함할 수 있다. 추가의 내인성 분자는 단백질, 예를 들어 전사인자 및 효소를 포함할 수 있다.
"융합" 분자는 둘 이상의 서브유닛 분자가 결합된, 바람직하게는 공유 결합된 분자이다. 서브유닛 분자는 화학적 타입이 동일한 분자이거나, 또는 화학적 타입이 상이한 분자일 수 있다. 제 1 타입의 융합 분자의 예는, 제한은 아니지만 융합 단백질(예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인과 절단 도메인 사이의 융합체, 또는 TAL-이펙터 DNA 결합 도메인과 절단 도메인 사이의 융합체) 및 융합 핵산(예를 들어, 상기 설명된 융합 단백질을 암호화하는 핵산)을 포함한다. 제 2 타입의 융합 분자의 예는, 제한은 아니지만 트리플렉스-형성 핵산과 폴리펩티드 사이의 융합체, 및 마이너 그루브 바인더와 핵산 사이의 융합체를 포함한다.
세포에서 융합 단백질의 발현은 세포로의 융합 단백질의 송달로 인한 것이거나, 또는 세포로의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 송달에 의한 것일 수 있으며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 전사되고, 전사물이 번역되어 융합 단백질이 생성된다. 또한, 세포에서 단백질의 발현에는 트랜스-스플라이싱, 폴리펩티드 절단 및 폴리펩티드 리게이션이 포함될 수 있다. 세포로 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 송달하는 방법은 본 명세서의 다른 곳에서 설명된다.
본 발명의 취지에서, "유전자"는 유전자 산물(하기 참조)을 암호화하는 DNA 영역과 유전자 산물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함하며, 이러한 조절 서열이 코딩 서열 및/또는 전사된 서열에 인접해 있는지의 여부와는 무관하다. 따라서, 유전자는, 제한은 아니지만 프로모터 서열, 터미네이터, 전사 조절 서열, 예를 들어 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위, 인핸서, 사일런서, 인슐레이터, 경계 요소, 복제 기원, 바탕질 부착 부위 및 유전자좌 제어 영역을 포함한다.
"유전자 발현"은 유전자에 함유된 정보가 유전자 산물로 전환되는 것을 말한다. 유전자 산물은 유전자의 직접 전사 산물(예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조적 RNA, shRNA, RNAi, miRNA 또는 어떤 다른 타입의 RNA) 또는 mRNA의 번역에 의해서 생산된 단백질일 수 있다. 또한, 유전자 산물은 봉쇄, 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집과 같은 과정에 의해서 변형된 RNA, 및 예를 들어 메틸화, 아세틸화, 포스포릴화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화 및 글리코실화에 의해서 변형된 단백질을 포함한다.
유전자 산물의 "조정"은 유전자 활성의 변화를 말한다. 발현의 조정은, 제한은 아니지만 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있다. 게놈 편집(예를 들어, 절단, 변경, 비활성화, 도너 통합, 무작위 돌연변이)을 사용하여 발현을 조정할 수 있다. 유전자 비활성화는 본원에 설명된바 같은 변형인자를 포함하지 않는 세포와 비교하여 유전자 발현의 어떤 감소를 말한다. 따라서, 유전자 비활성화는 부분적일 수도 있고, 완전할 수도 있다.
"관심의 영역"은, 예를 들어 유전자 또는 유전자 내부의 또는 유전자에 인접한 비-코딩 서열과 같은 세포성 크로마틴의 어떤 영역이며, 외래 분자와 결합할 수 있는 것이 바람직하다. 결합은 표적화 DNA 절단 및/또는 표적화 재조합을 위한 것일 수 있다. 관심의 영역은, 예를 들어 염색체, 에피솜, 세포소기관 게놈(예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 감염성 바이러스 게놈에 존재할 수 있다. 관심의 영역은 유전자의 코딩 영역 내부, 전사된 비-코딩 영역, 예를 들어 리더 서열, 트레일러 서열 또는 인트론의 내부, 또는 코딩 영역의 상류 또는 하류에서 비-전사된 영역의 내부에 있을 수 있다. 관심의 영역은 단일 뉴클레오티드 쌍 정도의 작은 크기일 수 있거나, 또는 최대 2,000개 뉴클레오티드 쌍의 길이, 또는 어떤 정수 값의 뉴클레오티드 쌍의 크기일 수 있다.
"진핵" 세포는, 제한은 아니지만 진균 세포(효모 같은), 식물 세포, 동물 세포, 포유류 세포 및 사람 세포(예를 들어, T-세포)를 포함한다.
"식물" 세포는, 제한은 아니지만 단자엽성(monocots) 또는 쌍자옆성(dicots) 식물의 세포를 포함한다. 단자엽 식물의 비제한적 예는 옥수수, 쌀, 보리, 귀리, 밀, 수수, 호밀, 사탕수수, 파인애플, 양파, 바나나, 및 코코넛을 포함한다. 쌍자옆 식물의 비제한적 예는 담배, 토마토, 해바라기, 면화, 사탕무, 감자, 양상추, 멜론, 대두, 카놀라(평지씨), 및 알파파를 포함한다. 시물 세포는 식물의 어떤 부분의 것이거나, 및/또는 식물의 어떤 발생 단계의 것일 수 있다.
용어 "작동가능한 연결" 및 "작동가능하게 연결된"(또는 "작동성 연결된")은 병렬 배치된 2개 이상의 성분(서열 요소와 같은)에 대해 상호 교환하여 사용되며, 이때 성분들은 두 성분이 모두 정상적으로 기능하고, 성분들 중 적어도 하나가 나머지 성분들 중 적어도 하나에 대해 발휘되는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용하도록 배열된다. 예로서, 프로모터와 같은 전사 조절 서열은, 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 코딩 서열의 전사 수준을 제어하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 전사 조절 서열은 일반적으로 코딩 서열과 시스 형태로 작동가능하게 연결되고, 그것에 바로 인접해 있을 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서가 코딩 서열에 작동가능하게 연결되는 전사 조절 서열이며, 이들은 연속해 있지 않아도 된다.
융합 폴리펩티드와 관련하여, 용어 "작동가능하게 연결된"은 다른 성분과 연결된 상태에서도 각 성분이 그렇게 연결되지 않았을 때와 동일한 기능을 수행한다는 사실을 말할 수 있다. 예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인이 절단 도메인과 융합된 융합 폴리펩티드와 관련하여, ZFP DNA-결합 도메인과 절단 도메인은, 융합 폴리펩티드에서 ZFP DNA-결합 도메인 부분은 그것의 표적 부위 및/또는 그것의 결합 부위와 결합할 수 있고, 절단 도메인은 표적 부위의 근처에서 DNA를 절단할 수 있을 때 작동가능하게 연결된 상태이다.
단백질, 폴리펩티드 또는 핵산의 "기능적 단편"은 전장 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일하지는 않지만, 전장 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일한 기능을 보유하는 서열을 가진 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산이다. 기능적 단편은 상응하는 천연 분자와 동일한 수, 더 많은 수, 또는 더 적은 수의 잔기를 지닐 수 있으며, 및/또는 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 치환을 함유할 수 있다. 핵산의 기능(예를 들어, 코딩 기능, 다른 핵산과 혼성화하는 능력)을 결정하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 유사하게, 단백질 기능을 결정하는 방법도 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 DNA-결합 기능은, 예를 들어 필터-결합 전기영동 이동도-이동이나, 또는 면역침전 분석에 의해 결정될 수 있다. DNA 절단은 겔 전기영동에 의해서 분석될 수 있다. Ausubel et al.(상동)을 참조한다. 다른 단백질과 상호작용하는 단백질의 능력은, 예를 들어 공-면역침전, 2개 하이브리드 분석 또는 상보성(유전자 상보성과 생화학적 상보성 모두)에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, Fields et al.(1989) Nature 340:245-246; 미국특허 제5,585,245호 및 PCT WO 98/44350을 참조한다.
"벡터"는 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있다. 전형적으로, "유전자 전달 벡터", "벡터 구성물" 및 "발현 벡터"는 관심의 유전자의 발현을 지정할 수 있는 어떤 핵산 구성물을 의미하며, 이들은 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있다. 따라서, 이 용어는 클로닝, 및 발현 비히클, 뿐만 아니라 통합 벡터를 포함한다.
"리포터 유전자" 또는 "리포터 서열"은 바람직하게는 통상의 분석에서 쉽게 측정되는 단백질 산물을 생산하는 어떤 서열을 말한다. 특정 종들에 대한 적합한 리포터 유전자가 당업자에게 공지되어 있으며, 제한은 아니지만 Mel1, 클로르암페니콜 아세틸 트랜스페라제(CAT), 광 발생 단백질, 예를 들어 GFP, 루시페라제 및/또는 β-갈락토시다제를 포함한다. 또한, 동물에 있어서 적합한 리포터 유전자는 PET 스캐닝을 이용하여 생체내 측정되는 티미딘 키나제, 또는 전신 발광 영상화를 통해 생체내 측정되는 루시페라제와 같이, 생체내 측정될 수 있는 마커 또는 효소를 암호화할 수 있다. 또한, 선택성 마커가 리포터에 더하여, 또는 그 대신에 사용될 수 있다. 양성 선택 마커는 유전자를 보유하고 발현하는 세포만이 특정 조건하에서 생존 및/또는 성장할 수 있도록 하는 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다. 예를 들어, 네오마이신 내성(Neor) 유전자를 발현하는 세포는 화합물 G418에 대해 내성이지만, Neor을 발현하지 않는 세포는 G418에 의해 사멸된다. 마찬가지로, 제초제 관용성(내성) 유전자(예를 들어, PAT(포스피노트리신 아세틸 트랜스페라제) 유전자)를 발현하는 식물 세포는 제초제 바이알라포스에 대한 내성을 부여한다. 히그로마이신 내성 등을 포함하는 양성 선택 마커의 다른 예들도 당업자에게 알려져 있다. 음성 선택 마커는 유전자를 보유하고 발현하는 세포만이 특정 조건하에서 사멸될 수 있도록 하는 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다. 예를 들어, 티미딘 키나제(예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제, HSV-TK)를 발현하는 세포는 강시클로비르가 첨가되면 사멸된다. 다른 음성 선택 마커들도 당업자에게 알려져 있다. 선택성 마커가 트랜스젠일 필요는 없으며, 또한 리포터와 선택성 마커는 다양한 조합으로 사용될 수 있다.
개요
선택성 마커와 같은 삽입된 외래 서열 없이 녹아웃(KO)을 포함하는 동형접합성으로 변형된 유기체 및 원하는 유전자좌의 양 대립형질에 리포터(예를 들어, 선택성 마커)를 암호화하는 서열이 없는 트랜스젠을 함유하는 유기체를 생성하기 위한 조성물 및 방법이 본원에서 설명된다. 유기체는 전형적으로 두 단계로 생성된다. 제 1 단계에서, 하나 이상의 뉴클레아제(예를 들어, ZFN)가 세포의 원하는 유전자좌에 관심의 이종성 도너-유래 서열의 표적화 통합(TI)에 사용된다. 이종성 서열은 전형적으로 관심의 유전자좌의 1개 대립형질에 리포터-TI를 가진 클론의 선택을 허용하는 리포터(예를 들어, 선택성 또는 스크리닝 마커)를 함유한다. 트랜스젠의 TI를 위해서 원하는 트랜스젠 도너(리포터 서열을 결여하는)가 리포터 도너와 함께 도입된다. 다음에, 리포터-TI-선택된 클론이 비-리포터-TI 대립형질에서 유전자형 분류되며, 이로써 NHEJ에 의해 비-리포터-TI 대립형질이 파괴된 세포가 확인되거나, 또는 비-리포터-TI 대립형질에 삽입된 비-리포터 마커 트랜스젠을 함유하는 세포가 확인된다.
제 2 단계에서, 상기와 같이 확인된 리포터-TI/변형된 클론(예를 들어, 리포터-TI/NHEJ 또는 리포터-TI/비-리포터 TI 클론)은 생식가능한 성숙도까지 발달하도록 허용되고, 다음에 이들 리포터-TI/변형된 이형접합성 유기체들이 서로 교배되거나 자체 교배된다. 이들 교배에서 생긴 리포터-TI/변형된 유기체의 자손 중 1/4은 변형된 사건에 대해 동형접합성일 것으로 예상되며(NHEJ/NHEJ 또는 비-리포터 TI/비-리포터 TI), 따라서 어떤 삽입된 리포터 DNA가 없는 동형접합성으로 변형된 유기체가 제공된다.
뉴클레아제
본원에 설명된 방법 및 조성물은 광범하게 적용되며, 관심의 어떤 뉴클레아제를 수반할 수 있다. 뉴클레아제의 비제한적 예는 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제 및 TALEN을 포함한다. 뉴클레아제는 이종성 DNA-결합 및 절단 도메인(예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제; 이종성 절단 도메인 또는 TALEN을 갖는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인)을 포함할 수 있거나, 또는 달리 자연 발생한 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 선택된 표적 부위와 결합하도록 변경될 수 있다(예를 들어, 동족 결합 부위와 상이한 부위와 결합하도록 조작된 메가뉴클레아제).
특정 구체예에서, 뉴클레아제는 메가뉴클레아제(귀소 엔도뉴클레아제)이다. 자연 발생한 메가뉴클레아제는 15-40개 염기쌍의 절단 부위를 인식하며, 통상 4개 과로 분류된다: LAGLIDADG 과, GIY-YIG 과, His-Cyst 박스 과 및 HNH 과. 전형적인 귀소 엔도뉴클레아제는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, VI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-7evII 및 I-TevIII를 포함한다. 이들의 인식 서열은 공지되어 있다. 또한, 미국특허 제5,420,032호; 미국특허 제6,833,252호; Belfort et al.(1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al.(1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 뉴잉글랜드 바이오랩스 카탈록을 참조한다.
자연 발생한 메가뉴클레아제, 주로 LAGLIDADG 과로부터의 DNA-결합 도메인을 사용하여 식물, 효모, 초파리, 포유류 세포 및 마우스에서 부위-특이적 게놈 변형을 촉진할 수 있었지만, 이 접근법은 메가뉴클레아제 인식 서열이 보존되는 상동성 유전자의 변형(Monet et al. (1999), Biochem. Biophysics. Res. Common. 255:88-93)이나, 또는 인식 서열이 도입되는 사전-조작된 게놈(Route et al. (1994), Mol. Cell. Biol. 14:8096-106; Chilton et al. (2003), Plant Physiology. 133:956-65; Puchta et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5055-5060; Rong et al. (2002), Genes Dev. 16:1568-81; Gouble et al. (2006), J. Gene Med. 8(5):616-622)에만 제한되었다. 따라서, 의학적으로 또는 생물기술적으로 관련된 부위에서 새로운 결합 특이성을 나타내도록 메가뉴클레아제를 조작하려는 시도가 이루어졌다(Porteus et al. (2005), Nat. Biotechnol. 23:967-73; Sussman et al. (2004), J. Mol. Biol. 342:31-41; Epinat et al. (2003), Nucleic Acids Res. 31:2952-62; Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Chames et al. (2005) Nucleic Acids Res 33(20):e178; Arnould et al. (2006) J. Mol. Biol. 355:443-458; Ashworth et al.(2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; 미국특허 공개 제2007-0117128호; 제2006-0206949호; 제2006-0153826호; 제2006-0078552호; 및 제2004-0002092호). 또한, 메가뉴클레아제로부터의 자연 발생한 또는 조작된 DNA-결합 도메인은 이종성 뉴클레아제(예를 들어, FokI)로부터의 절단 도메인과 작동가능하게 연결되었다.
잔토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원성 박테리아는 중요한 작물에 많은 질병을 일으킨다고 알려져 있다. 잔토모나스(Xanthomonas)의 병원성은 보존된 타입 III 분비(T3S) 시스템에 좌우되는데, 이것은 식물 세포에 25개 이상의 상이한 이펙터 단백질을 주사하는 것이다. 이들 주사된 단백질들은 특히 식물 전사 활성화인자를 의태하고, 식물 트랜스크립톰(transcriptome)을 조작하는 전사 활성화인자-유사(TAL) 이펙터이다(Kay et al.(2007) Science 318:648-651 참조). 이들 단백질은 DNA 결합 도메인과 전사 활성화 도메인을 함유한다. 가장 잘 특성화된 TAL-이펙터 중 하나가 잔토모나스 캄페스트그리스 피브이. 베시카토리아(Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria)로부터의 AvrBs3이다(Bonas et al. (1989) Mol. Gen Genet 218:127-136 및 WO 2010/079430 참조). TAL-이펙터는 직렬 반복부의 중심 도메인을 함유하며, 각 반복부는 대략 34개 아미노산을 함유하는데, 이들은 단백질의 DNA 결합 특이성의 핵심이다. 또한, 이들은 핵 국소화 서열 및 산성 전사 활성화 도메인을 함유한다(Schornack S, et al. (2006) J. Plant Physiol 163 (3):256-272 참조). 더욱이, 식물 병원성 박테리아인 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)에서 Brg11 및 hpxl17로 지정된 것이 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) biovar 1 계통 GMI1000 및 biovar 4 계통 RS1000에서 잔토모나스(Xanthomonas)의 AvrBs3과 상동성인 것으로 판명되었다(Heuer et al. (2007) Appl and Envir Micro 73(13):4379-4384 참조). 이들 유전자는 뉴클레오티드 서열이 서로 98.9% 동일하고, hpx17의 반복 도메인에 1,575bp의 결실이 있다는 것만 차이이다. 그러나, 두 유전자 산물은 모두 잔토모나스(Xanthomonas)의 AvrBs3 과의 단백질과 40% 미만의 서열 동일성을 가진다.
이들 TAL 이펙터의 특이성은 직렬 반복부에 존재하는 서열에 좌우된다. 반복된 서열은 대략 102bp를 포함하며, 이 반복부들은 전형적으로 서로 91-100% 상동성이다(Bonas et al., 상동). 반복부의 다형성은 일반적으로 위치 12 및 13에 위치되며, 위치 12 및 13의 초가변성 2개 잔기의 동일성과 TAL-이펙터의 표적 서열의 연속 뉴클레오티드의 동일성 사이에는 1 대 1의 대응관계가 존재하는 것으로 보인다(Moscou and Bogdanove (2009) Science 326:1501 및 Boch et al. (2009) Science 326:1509-1512 참조). 경험적으로, 이들 TAL-이펙터의 DNA 인식을 위한 코드는 위치 12 및 13에서 HD 서열은 시토신(C)과 결합하고, NG는 T와, NI는 A, C, G 또는 T와 결합하고, NN은 A 또는 G와 결합하고, IG는 T와 결합하도록 결정되었다. 이들 DNA 결합 반복부는 새로운 조합과 반복 횟수를 갖는 단백질로 조립되었으며, 이로써 새로운 서열과 상호작용할 수 있는 인공적 전사인자를 만들어 식물 세포에서 리포터 유전자의 발현을 활성화할 수 있다(Boch et al., 상동). 그러나, 이들 DNA 결합 도메인은 모든 세포 타입에 있어서 표적화 게놈 편집 또는 표적화 유전자 조절의 분야에서는 일반적인 이용 가능성을 갖지 않는 것으로 나타났다. 특히, Boch 등은 식물 세포에서의 기능만을 밝혔을 뿐이고(즉, 이들 도메인이 내부에서 기능하도록 진화된 생물학적 환경에서만), 내인성 유전자좌에서의 활성은 증명하지 못했다. 또한, 조작된 TAL-이펙터는 포유류 세포의 천연 잔토모나스(Xanthomonas) TAL-이펙터 단백질에 자연적으로 존재하지 않는 어떤 외인성 기능적 단백질 이펙터 도메인(뉴클레아제, 전사인자, 조절, 효소, 재조합효소, 메틸라제, 및/또는 리포터 도메인)과 관련해서는 기능하지 않는 것으로 나타났다. Christian et al.((2010) < Genetics epub 10.1534/genetics.ll0.120717)에 의한 최근 간행물에서는 조작된 TAL 단백질을 Fok1 절단 반-도메인과 연결하여 TAL-이펙터 도메인 뉴클레아제 융합체(TALEN)를 수득하였는데, 이것은 분석을 위해서 플라스미드 기반 표적의 절단이 필요한 효모 리포터 분석에서 활성인 것으로 나타났다.
다른 구체예에서, 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)이다. ZFN은 선택된 유전자 및 절단 도메인 또는 절단 반-도메인에서 표적 부위와 결합하도록 조작된 징크 핑거 단백질을 포함한다.
징크 핑거 결합 도메인은 선택된 서열과 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416을 참조한다. 조작된 징크 핑거 결합 도메인은 자연 발생한 징크 핑거 단백질과 비교하여 새로운 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은, 제한은 아니지만 합리적 설계 및 다양한 타입의 선택을 포함한다. 합리적 설계는, 예를 들어 트리플릿(또는 쿼드러플릿) 뉴클레오티드 서열과 각각의 징크 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 이용하는 것을 포함하며, 이때 각 트리플릿 또는 쿼드러플릿 뉴클레오티드 서열이 그 특정한 트리플릿 또는 쿼드러플릿 서열과 결합하는 징크 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 연계된다. 예를 들어, 본원에 전문이 참고자료로 포함되는 공동으로 소유된 미국특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호를 참조한다.
파지 디스플레이 및 2개 하이브리드 시스템을 포함하는 전형적인 선택 방법들이 미국특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 및 제6,242,568호; 및 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 개시된다. 또한, 징크 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 증진이, 예를 들어 공동으로 소유된 WO 02/077227에 설명되었다.
표적 부위의 선택; ZFN 및 융합 단백질(및 그것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)의 설계 및 구축 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 본원에 참고자료로 포함되는 미국 특허출원 공개 제2005-0064474호 및 제2006-0188987호에 상세히 설명된다.
이에 더하여, 이들 및 다른 참고문헌에 개시된 대로, 징크 핑거 도메인들 및/또는 멀티-핑거 징크 핑거 단백질들은, 예를 들어 5개 이상의 아미노산 길이를 가진 링커를 포함하는 어떤 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 예를 들어, 6개 이상의 아미노산 길이를 가진 전형적인 링커 서열에 대해서 미국특허 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호를 참조한다. 본원에 설명된 단백질은 단백질의 각각의 징크 핑거들 사이에 적합한 링커들의 어떤 조합이 존재하는 것을 포함할 수 있다.
또한, ZFN, TALEN 및/또는 메가뉴클레아제와 같은 뉴클레아제가 뉴클레아제(절단 도메인, 절단 반-도메인)를 포함한다. 상기 주지된 대로, 절단 도메인은 DNA-결합 도메인, 예를 들어 징크 핑거 DNA-결합 도메인 및 뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인 또는 TAL-이펙터 도메인으로부터의 절단 도메인 및 상이한 뉴클레아제로부터의 절단 도메인에 이종성일 수 있다. 이종성 절단 도메인은 어떤 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻어질 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 전형적인 엔도뉴클레아제는, 제한은 아니지만 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제를 포함한다. 예를 들어, 뉴잉글랜드 바이오랩스(Beverly, MA) 2002-2003 카달록; 및 Belfort et al.(1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388을 참조한다. DNA를 절단하는 추가의 효소들도 알려져 있다(예를 들어, S1 뉴클레아제; 멍빈 뉴클레아제; 췌장 DNaseI; 단구균성 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 또한, Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993를 참조한다). 이들 효소들(또는 이들의 기능적 단편들) 중 하나 이상이 절단 도메인 및 절단 반-도메인의 공급원으로 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 반-도메인은 상기 제시된바 같은 어떤 뉴클레아제 또는 그것의 일부분으로부터 유래될 수 있으며, 절단 활성을 위해 다이머화가 필요하다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 반-도메인을 포함한다면 절단을 위해서 2개의 융합 단백질이 필요하다. 또는 달리, 2개의 절단 반-도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 절단 반-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제(또는 그것의 기능적 단편)으로부터 유래될 수 있거나, 또는 각 절단 반-도메인이 상이한 엔도뉴클레아제(또는 그것의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있다. 또한, 2개의 융합 단백질의 표적 부위는 바람직하게는 2개의 융합 단백질과 그들의 각각의 표적 부위와의 결합이 절단 반-도메인이, 예를 들어 다이머화에 의해 기능적 절단 도메인을 형성할 수 있는 서로에 대한 공간적 배향으로 절단 반-도메인이 위치되도록 서로에 대해 배치된다. 따라서, 특정 구체예에서, 표적 부위의 근 가장자리는 5-8개 뉴클레오티드 또는 15-18개 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 그러나, 어떤 정수 값의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍도 2개의 표적 부위 사이에 개재될 수 있다(예를 들어, 2-50개 이상의 뉴클레오티드 쌍). 일반적으로, 절단 부위는 표적 부위들 사이에 놓인다.
제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 많은 종들에 존재하며, DNA와 서열 특이적으로 결합할 수 있고(인식 부위에서), 결합 부위나 그 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소(예를 들어, 타입 IIS)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하며, 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 가진다. 예를 들어, 타입 IIS 효소인 FokI는 한 가닥에서는 인식 부위로부터 9 뉴클레오티드에서, 다른 가닥에서는 인식 부위로부터 13 뉴클레오티드에서 DNA의 이중가닥 절단을 촉매한다. 예를 들어, 미국특허 제5,356,802호; 제5,436,150호 및 제5,487,994호; 및 Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982를 참조한다. 따라서, 한 구체예에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 타입 IIS 제한 효소로부터의 절단 도메인(또는 절단 반-도메인)과 하나 이상의 징크 핑거 결합 도메인을 포함하며, 징크 핑거 결합 도메인은 조작될 수도 있고, 그렇지 않을 수도 있다.
결합 도메인으로부터 분리가능한 절단 도메인을 갖는 전형적인 타입 IIS 제한 효소는 FokI이다. 이 특정한 효소는 다이머로서 활성이다. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10,570-10,575. 따라서, 본 명세서의 취지에서, 개시된 융합 단백질에 사용된 FokI 효소의 일부분이 절단 반-도메인으로 간주된다. 따라서, 징크 핑거-FokI 융합체를 사용한 세포성 서열의 표적화 이중가닥 절단 및/또는 표적화 치환을 위하여, 각각 FokI 절단 반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질을 사용하여 촉매 활성 절단 도메인을 재구성할 수 있다. 또는 달리, 징크 핑거 결합 도메인을 함유하는 1개의 폴리펩티드 분자와 2개의 FokI 절단 반-도메인이 사용될 수도 있다. 징크 핑거-FokI 융합체를 사용한 표적화 절단 및 표적화 서열 변경을 위한 파라미터는 본 명세서의 다른 곳에서 제공된다.
절단 도메인 또는 절단 반-도메인은 절단 활성을 보유하거나, 또는 멀티머화(예를 들어, 다이머화)하여 기능적 절단 도메인을 형성할 수 있는 능력을 보유하는 단백질의 어떤 부분일 수 있다.
전형적인 타입 IIS 제한 효소는 본원에 그 전문이 포함되는 국제 공개 WO 07/014275에 설명된다. 또한, 추가 제한 효소는 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 함유하며, 이들은 본 명세서에서 고려된다. 예를 들어, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420를 참조한다.
특정 구체예에서, 절단 도메인은, 예를 들어 미국특허 공개 제2005-0064474호 및 제2006-0188987호와 미국출원 제11/805,850호(2007년 5월 23일 제출)에 설명된바 같이 호모다이머화를 최소화하거나 방지하는 하나 이상의 조작된 절단 반-도메인(다이머화 도메인 돌연변이체라고도 한다)을 포함하며, 상기 문헌의 명세서는 전문이 본원에 참고자료로 포함된다. FokI의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538의 아미노산 잔기는 모두 FokI 절단 반-도메인의 다이머화에 영향을 미치기 위한 표적이다.
무조건적으로 헤테로다이머를 형성하는 FokI의 전형적인 조작된 절단 반-도메인은 제 1 절단 반-도메인이 FokI의 위치 490 및 538의 아미노산 잔기에 돌연변이를 포함하고, 제 2 절단 반-도메인이 아미노산 잔기 486 및 499에 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다.
따라서, 한 구체예에서, 490의 돌연변이는 Glu(E)가 Lys(K)로 치환되고; 538의 돌연변이는 Iso(I)가 Lys(K)로 치환되고; 486의 돌연변이는 Gln(Q)이 Glu(E)로 치환되고; 499의 돌연변이는 Iso(I)가 Lys(K)로 치환된 것이다. 구체적으로, 본원에 설명된 조작된 절단 반-도메인은 제 1 절단 반-도메인에서 위치 490(E→K) 및 538(I→K)에 돌연변이를 만들어 "E490K:I538K"로 지정된 조작된 절단 반-도메인을 생성하고, 제 2 절단 반-도메인에서 위치 486(Q→E) 및 499(I→L)에 돌연변이를 만들어 "Q486E:I499L"로 지정된 조작된 절단 반-도메인을 생성함으로써 제조되었다. 본원에 설명된 조작된 절단 반-도메인은 비정상 절단이 최소화되거나 제거된 무조건적인 헤테로다이머 돌연변이체이다. 예를 들어, 본원에 전문이 참고자료로 포함되는 미국특허 공개 제2008-0131962호를 참조한다.
본원에 설명된 조작된 절단 반-도메인은 비정상 절단이 최소화되거나 제거된 무조건적인 헤테로다이머 돌연변이체이다. 예를 들어, WO 07/139898의 실시예 1을 참조한다. 특정 구체예에서, 조작된 절단 반-도메인은 위치 486, 499 및 496(야생형 FokI에 따라 넘버링)에 돌연변이를 포함하는데, 예를 들어 위치 486에서 야생형 Gln(Q) 잔기가 Glu(E) 잔기로 치환된 돌연변이, 위치 499에서 야생형 Iso(I) 잔기가 Leu(L) 잔기로 치환된 돌연변이, 및 위치 496에서 야생형 Asn(N) 잔기가 Asp(D) 또는 Glu(E) 잔기로 치환된 돌연변이를 포함한다(각각 "ELD" 및 "ELE" 도메인이라고도 한다). 다른 구체예에서, 조작된 절단 반-도메인은 위치 490, 538 및 537(야생형 FokI에 따라 넘버링)에 돌연변이를 포함하는데, 예를 들어 위치 490에서 야생형 Glu(E) 잔기가 Lys(K) 잔기로 치환된 돌연변이, 위치 538에서 야생형 Iso(I) 잔기가 Lys(K) 잔기로 치환된 돌연변이, 및 위치 537에서 야생형 His(H) 잔기가 Lys (K) 또는 Arg(R) 잔기로 치환된 돌연변이를 포함한다(각각 "KKK" 및 "KKR" 도메인이라고도 한다). 다른 구체예에서, 조작된 절단 반-도메인은 위치 490 및 537(야생형 FokI에 따라 넘버링)에 돌연변이를 포함하는데, 예를 들어 위치 490에서 야생형 Glu(E) 잔기가 Lys(K) 잔기로 치환된 돌연변이, 및 위치 537에서 야생형 His(H) 잔기가 Lys (K) 또는 Arg(R) 잔기로 치환된 돌연변이를 포함한다(각각 "KIK" 및 "KIR" 도메인이라고도 한다)(2010년 2월 8일 제출된 미국 가 출원 제61/337,769호를 참조한다).
본원에 설명된 조작된 절단 반-도메인은 어떤 적합한 방법을 사용하여, 예를 들어 미국특허 공개 제2005-0064474호 및 제2008-0131962호에 설명된바 같은 야생형 절단 반-도메인(FokI)의 부위-지정 돌연변이유발에 의해서 제조될 수 있다.
또는 달리, 뉴클레아제는 소위 말하는 "스플릿-효소" 기술을 이용하여 핵산 표적 부위에서 생체내 조립될 수 있다(예를 들어, 미국특허 공개 제2009-0068164호 참조). 이러한 스플릿 효소의 성분들은 각각의 발현 구성물 상에서 발현될 수 있거나, 또는 1개의 한 오픈 리딩 프레임에서 연결될 수 있으며, 여기서는 예를 들어 자체-절단 2A 펩티드 또는 IRES 서열에 의해서 각 성분이 분리되어 있다. 성분들은 개별 징크 핑거 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제 핵산 결합 도메인의 도메인이다.
뉴클레아제(예를 들어, ZFN)는, 예를 들어 WO 2009/042163 및 2009-0068164에 설명된바 같은 효모-기반 염색체 시스템에서 사용 전에 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
발현 벡터
하나 이상의 뉴클레아제를 암호화하는 핵산은 원핵 또는 진핵 세포에서의 형질전환을 위해 벡터에서 클로닝될 수 있다. 벡터는 원핵 벡터, 예를 들어 플라스미드, 또는 셔틀 벡터, 곤충 벡터, 또는 본원에 설명된 식물 벡터를 포함하는 진핵 벡터일 수 있다.
뉴클레아제 발현 구성물은 본 분야에 공지된 방법들을 사용하여 쉽게 설계될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 공개 제2003-0232410호; 제2005-0208489호; 제2005-0026157호; 제2005-0064474호; 제2006-0188987호; 제2006-0063231호; 제2008-0182332호; 제2009-011188호 및 국제 공개 WO 07/014275를 참조한다. 뉴클레아제의 발현은 구성성 프로모터 또는 유도성 프로모터의 제어하에 있을 수 있으며, 예를 들어 라피노오스 및/또는 갈락토오스의 존재하에 활성화되고(탈억제), 글루코오스의 존재하에 억제되는 갈락토키나제 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 식물 프로모터의 비제한적 예는 아라비도피스 탈리아나(A. thaliana) 유비퀴틴-3(ubi-3)(Callis et al, 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493); 아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens) 만노핀 신타제(Δmas)(Petolino et al. 미국특허 제6,730,824호); 및/또는 카사바 베인(Cassava Vein) 모자이크 바이러스(CsVMV)(Verdaguer et al. (1996) Plant Molecular Biology 31:1129-1139)로부터 유래된 프로모터 서열들을 포함한다. 추가의 적합한 박테리아 및 진핵 프로모터들도 본 분야에 알려져 있으며, 예를 들어 Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2nd ed. 1989; 3rd ed., 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, (1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al., 상동)에 설명된다. ZFP를 발현하는 박테리아 발현 시스템은, 예를 들어 이.콜라이(E. coli), 바실러스 에스피.(Bacillus sp.), 및 살모넬라(Salmonella)에서 이용할 수 있다(Palva et al. (1983) Gene 22:229-235).
프로모터에 더하여, 발현 벡터는 전형적으로 원핵이든 진핵이든 숙주 세포에서 핵산의 발현에 필요한 추가 요소를 전부 함유하는 전사 단위 또는 발현 카세트를 함유한다. 따라서, 전형적인 발현 카세트는, 예를 들어 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 예를 들어 전사물의 효과적인 폴리아데닐화, 전사 종결, 리보솜 결합 부위 또는 번역 종결에 필요한 신호들을 함유한다. 카세트의 추가 요소는, 예를 들어 인핸서, 이종성 스플라이싱 신호, 및/또는 핵 국소화 신호(NLS)를 포함할 수 있다.
이러한 발현 시스템을 위한 키트는 상업적으로 입수가능하다. 포유류 세포, 효모, 식물 및 곤충 세포의 진핵 발현 시스템은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 역시 상업적으로 입수가능하다.
이러한 숙주 세포에 외래 뉴클레오티드 서열을 도입하기 위한 잘 공지된 과정들 중 어느 것이 사용될 수 있다. 이들은 인산칼슘 트랜스펙션, 폴리브렌, 원형질체 융합, 전기천공, 초음파법(예를 들어, 소노포레이션), 리포솜, 마이크로인젝션, 네이키드 DNA, 플라스미드 벡터, 에피솜 및 통합성 바이러스 벡터, 및 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 다른 외래 유전자 재료를 숙주 세포에 도입하기 위한 다른 공지된 방법들 중 어느 것의 사용을 포함한다(예를 들어, Sambrook et al., 상동, 참조). 사용된 특정한 유전자 조작 과정은 적어도 하나의 유전자를 선택된 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포에 성공적으로 도입할 수 있기만 하면 된다.
DNA 구성물은 다양한 종래의 기술에 의해서 원하는 식물 숙주에(예를 들어, 원하는 식물 숙주의 게놈에) 도입될 수 있다. 이러한 기술에 관해서는, 예를 들어 Weissbach & Weissbach Methods for Plant Molecular Biology(1988, Academic Press, N.Y.) Section VIII, pp. 421-463; and Grierson & Corey, Plant Molecular Biology(1988, 2d Ed.), Blackie, London, Ch. 7-9를 참조한다.
예를 들어, DNA 구성물은 식물 세포 원형질체의 전기천공 및 마이크로인젝션과 같은 기술을 사용하여 식물 세포의 게놈 DNA에 직접 도입되거나, 또는 DNA 구성물은 DNA 입자 포격과 같은 바이오리스틱(biolistic) 방법을 사용하여 식물 조직에 직접 도입될 수 있다(예를 들어, Klein et al.(1987) Nature 327:70-73 참조). 또는 달리, DNA 구성물은 적합한 T-DNA 측면 영역과 조합되어 종래의 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 숙주 벡터에 도입될 수 있다. 디스아밍(disarming) 및 바이너리 벡터의 사용을 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)-매개된 형질전환 기술은 과학 문헌에 잘 설명되어 있다. 예를 들어, Horsch et al. (1984) Science 233:496-498 및 Fraley et al. (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:4803를 참조한다.
이에 더하여, 유전자 전달은 비-아그로박테리움 박테리아 또는
리조비움 에스피.(Rhizobium sp.) NGR234, 시노리조비움 멜릴로티(Sinorhizoboium meliloti), 메소리조비움 로티(Mesorhizobium loti), 감자 바이러스 X, 콜리플라워 모자이크 바이러스 및 카사바 베인 모자이크 바이러스 및/또는 담배 모자이크 바이러스와 같은 바이러스를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4를 참조한다.
아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 숙주의 병독성은 식물 세포가 바이너리 T DNA 벡터(Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721) 또는 공-배양 과정(Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231)에 의해 박테리아로 감염되었을 경우 식물 세포 DNA에 해당 구성물과 인접 마커의 삽입을 지시할 것이다. 일반적으로, 아그로박테리움 형질전환 시스템은 쌍자엽 식물을 조작하는데 사용된다(Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384; Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-641). 또한, 아그로박테리움 형질전환 시스템은 DNA를 형질전환하여 단자엽 식물 및 식물 세포를 전달하는데 사용될 수 있다. 미국특허 제5,591,616호; Hernalsteen et al. (1984) EMBO J 3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311: 763-764; Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-179; Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40; 및 Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426-434를 참조한다.
유전자 전달 및 형질전환의 대안적 방법은, 제한은 아니지만 네이키드 DNA의 칼슘-, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)- 또는 전기천공-매개 흡수를 통한 원형질체 형질전환(Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722, Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828; 및 Shimamoto (1989) Nature 338:274-276 참조) 및 식물 조직의 전기천공(D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505)을 포함한다. 식물 세포 형질전환을 위한 추가의 방법은 마이크로인젝션, 탄화규소-매개 DNA 흡수(Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418) 및 마이크로프로젝타일 포격(Klein et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:4305-4309; 및 Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618 참조)을 포함한다.
유효량의 투여는 치료될 세포와 최종적으로 접촉되는 뉴클레아제를 도입하는데 일반적으로 사용되는 경로들 중 어느 것에 의해 이루어진다. 뉴클레아제는 어떤 적합한 방식으로, 바람직하게는 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 투여된다. 이러한 조정제들을 투여하는 적합한 방법이 이용될 수 있으며, 당업자에게 잘 공지되어 있고, 특정 조성물을 투여하는데 하나 이상의 경로가 사용될 수 있지만, 다른 경로보다는 특정 경로가 더욱 즉각적이고 더욱 효과적인 반응을 주로 제공할 수 있다.
또한, 담체가 사용될 수 있으며, 담체는 투여되는 특정 조성과 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 따라서 일부 결정된다. 따라서, 여러 다양한 적합한 제형의 제약 조성물이 이용될 수 있다(예를 들어, Remington 's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985 참조).
유기체
본 발명은, 제한은 아니지만 식물, 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 영장류, 가축, 토끼 등과 같은 포유류), 어류 등과 같은 진핵 유기체를 포함하여 이형접합성으로 변형된 유기체를 만들기를 원하는 어떤 유기체에도 적용될 수 있다. 전형적으로, 유기체는 본원에 설명된바 같이 유전자 변형될 수 있고, 생식가능한 성숙한 유기체로 발달할 수 있는 유기체로부터 분리된 세포를 사용하여 발생된다. 진핵(예를 들어, 효모, 식물, 진균, 어류 세포 및 고양이과, 개과, 쥐과, 소과 및 돼지과 등의 포유류 세포) 세포가 사용될 수 있다. 또한, 본원에 설명된바 같은 하나 이상의 동형접합성 KO 유전자좌 또는 다른 유전자 변형을 함유하는 유기체로부터의 세포가 사용될 수 있다.
전형적인 포유류 세포는 관심의 유기체의 어떤 세포 또는 셀라인, 예를 들어 난모세포, K562 세포, CHO(차이니즈 햄스터 난소) 세포, HEP-G2 세포, BaF-3 세포, Schneider 세포, COS 세포(SV40 T-항원을 발현하는 원숭이 신장세포), CV-I 세포, HuTu80 세포, NTERA2 세포, NB4 세포, HL-60 세포 및 HeLa 세포, 293 세포(예를 들어, Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36:59 참조), 및 SP2 또는 NS0 같은 골수종 세포(예를 들어, Galfre and Milstein (1981) Meth. Enzymol. 73(B):3 46)를 포함한다. 또한, 말초혈 단핵세포(PBMC)나 T-세포도 사용될 수 있고, 배아 줄기세포와 성체 줄기세포도 사용될 수 있다. 예를 들어, 사용될 수 있는 줄기세포는 배아 줄기세포(ES), 만능 유도 줄기세포(iPSC), 간엽 줄기세포, 조혈 줄기세포, 근육 줄기세포, 피부 줄기세포 및 신경 줄기세포를 포함한다.
전형적인 표적 식물 및 식물 세포는, 제한은 아니지만 단자엽 및 쌍자엽 식물을 포함하며, 예를 들어 곡물류(예를 들어, 밀, 옥수수, 쌀, 기장 보리), 과일류(예를 들어, 토마토, 사과, 배, 딸기, 오랜지), 초목류(예를 들어, 알파파), 근채류(예를 들어, 당근, 감자, 사탕무, 참마), 엽채류(예를 들어, 양상추, 시금치)를 포함하는 작물; 화훼류(예를 들어, 페츄니아, 장미, 국화), 침엽수 및 상록수(예를 들어, 소나무, 전나무, 가문비나무); 식물이용 환경정화에 사용되는 식물(예를 들어, 중금속 축적 식물); 유료 작물(예를 들어, 해바라기, 평지씨); 및 실험 목적으로 사용되는 식물(예를 들어, 애기장대(Arabidopsis))을 포함한다. 따라서, 개시된 방법과 조성물은, 제한은 아니지만 아스파라구스(Asparagus), 아베나(Avena), 브라시카(Brassica), 시트루스(Citrus), 시트룰루스(Citrullus), 캅시쿰(Capsicum), 쿠쿠르비타(Cucurbita), 다우쿠스(Daucus), 에리제론(Erigeron), 글리신(Glycine), 고시피움(Gossypium), 호르데움(Hordeum), 락투카(Lactuca), 롤리움(Lolium), 리코페르시콘(Lycopersicon), 말루스(Malus), 만니홋(Manihot), 니코티아나(Nicotiana), 오리코프라그무스(Orychophragmus), 오리자(Oryza), 페르세아(Persea), 파세올루스(Phaseolus), 피숨(Pisum), 피루스(Pyrus), 피루누스(Prunus), 라파누스(Raphanus), 세칼레(Secale), 솔라눔(Solanum), 소르굼(Sorghum), 트리티쿰(Triticum), 비티스(Vitis), 비그나(Vigna), 및 제아(Zea) 속에 속하는 종들을 포함하는 광범위한 식물들에 사용될 수 있다. 용어 "식물 세포"는 분리된 식물 세포뿐만 아니라 전체 식물 또는 전체 식물의 일부분, 예를 들어 종자, 유합조직, 잎, 뿌리 등을 포함한다. 또한, 본 명세서는 트랜스젠 또는 유전자 구성물을 갖는, 상기 설명된 식물들의 종자를 포함한다. 또한, 본 명세서는 상기 설명된 트랜스제닉 식물의 자손, 클론, 셀라인 또는 세포를 포함하며, 이때 상기 자손, 클론, 셀라인 또는 세포가 트랜스젠 또는 유전자 구성물을 가진다.
표적화
통합
본원에 설명된바 같은 동형접합성으로 변형된 유기체를 생성하는 제 1 단계는 원하는 표적 유전자좌에서의 도너 리포터 서열의 뉴클레아제-매개 표적화 통합을 포함한다. 구체적으로, 개시된 뉴클레아제를 사용하여 세포성 크로마틴의 관심의 영역에서 DNA를 절단할 수 있다(예를 들어, 게놈의 원하는 또는 정해진 부위에서). 이러한 표적화 DNA 절단을 위해서, 정해진 절단 부위에서 또는 그 근처에서 표적 부위와 결합하도록 뉴클레아제의 DNA 결합 도메인(예를 들어, 징크 핑거 결합 도메인)이 조작되고, DNA 결합 도메인과 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질이 세포에서 발현된다. 융합 단백질의 DNA-결합 도메인(예를 들어, 징크 핑거 부분)과 표적 부위의 결합시 절단 도메인에 의해 DNA가 표적 부위 근처에서 절단된다.
또는 달리, 각각 징크 핑거 결합 도메인과 절단 반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질이 세포에서 발현되고, 기능적 절단 도메인이 재구성되고, 표적 부위의 근처에서 DNA가 절단되는 방식으로 병렬 배치되어 표적 부위에 결합된다. 한 구체예에서, 절단은 2개의 징크 핑거 결합 도메인의 표적 부위 사이에서 일어난다.
본원에 설명된바 같은 뉴클레아제에 의한 표적화 절단은 절단 부위에 도너(외래) 서열의 표적화 통합(상동성-지정 수선)을 가져오는 것으로 나타났다. 예를 들어, 미국특허 공개 제2007-0134796호, 제2008-029580호, 제2008-0182332호, 제2009-0117617호 및 제2009-0111188호를 참조한다.
따라서, 본원에 설명된 뉴클레아제에 더하여, 선택된 게놈 서열의 표적화 치환(통합)도 역시 치환(또는 도너) 리포터 서열의 도입을 필요로 한다. 도너 리포터 서열은 융합 단백질(들)의 발현 이전에, 발현과 동시에, 또는 발현에 이어서 세포에 도입될 수 있다. 도너 리포터 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 그것과 그것이 상동성을 갖는 게놈 서열 사이의 상동성 재조합(또는 상동성-지정 수선)을 뒷받침할 만큼 충분한 상동성을 함유한다. 도너 서열은 전형적으로 그들이 치환하는 게놈 서열과 동일하지 않다는 것이 자명할 것이다. 예를 들어, 도너 폴리뉴클레오티드의 서열은 염색체 서열과의 충분한 상동성이 존재하는 한 게놈 서열에 대해서 하나 이상의 단일 염기 변화, 삽입, 결실, 반전 또는 재배열을 함유할 수 있다.
특정 구체예에서, 원하는 트랜스젠의 도입이 또한 달성될 수 있다. 원하는 트랜스젠 도너 서열도 역시 그것과 그것이 상동성을 갖는 게놈 서열 사이의 상동성 재조합 또는 상동성-지정 수선을 뒷받침할 만큼 게놈 서열에 대해 충분한 상동성을 가질 것이다. 예를 들어, 미국 특허출원 제12/386,059호를 참조한다. 관심의 도너 트랜스젠은 전형적으로 관심의 서열을 암호화하는 서열을 함유한다. 비제한적 예는 유전자 조절인자 서열(예를 들어, 프로모터 서열), 단백질 산물을 암호화하는 서열(예를 들어, 유기체 또는 치료 단백질의 표현형 변형에 관련된 단백질) 또는 shRNA, RNAi 등과 같은 RNA 산물을 암호화하는 서열을 포함한다.
도너 리포터 서열은 전형적으로 표적화 통합이 발생한 세포를 확인하기 위한 리포터 유전자를 암호화하는 서열을 포함한다. 어떤 리포터 유전자라도 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 리포터 유전자는 직접 검출되는 신호, 예를 들어 GFP(녹색 형광 단백질)와 같은 형광 단백질로부터의 신호를 제공한다. 형광은, 예를 들어 형광-활성화 세포 정렬(FACS) 시스템을 포함하는 다양한 상업적으로 이용가능한 형광 검출 시스템을 사용하여 검출된다.
또한, 리포터 유전자는 검출가능한 산물(예를 들어, 프로테아제, 리파제, 뉴클레아제, 포스파타제, 당 가수분해효소 및 에스테라제)의 생산을 촉매하는 효소일 수 있다. 효소를 암호화하는 적합한 리포터 유전자의 비제한적 예는, 예를 들어 MEL1, CAT(클로르암페니콜 아세틸 트랜스페라제; Alton and Vapnek (1979) Nature 282:864-869), 루시페라제, β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제, β-락타마제, 양고추냉이 퍼옥시다제 및 알칼리성 포스파타제를 포함한다(예를 들어, Toh, et al. (1980) Eur. J. Biochem. 182:231-238; 및 Hall et al. (1983) J. Mol. Appl. Gen. 2:101).
추가의 리포터 유전자는, 제한은 아니지만 암피실린 내성, 네오마이신 내성, G418 내성, 퓨로마이신 내성과 같은 항생제 내성뿐만 아니라 PAT 유전자와 같은 제초제 내성을 포함하는 선택성 마커(예를 들어, 양성 및/또는 음성 선택 마커)를 포함한다.
도너 폴리뉴클레오티드(리포터 및/또는 트랜스젠)은 단일가닥 또는 이중가닥의 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 선형 또는 원형 형태로 세포에 도입될 수 있다. 선형 형태로 도입될 경우, 도너 서열의 단부는 당업자에게 공지된 방법에 의해서 보호될 수 있다(예를 들어, 엑소뉴클레올리틱 분해로부터). 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오티드 잔기가 선형 분자의 3' 말단에 부가되고, 및/또는 자기-상보성 올리고뉴클레오티드가 한쪽 또는 양쪽 단부에 리게이션된다. 예를 들어, Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889을 참조한다. 외래 폴리뉴클레오티드를 분해로부터 보호하는 추가의 방법은, 제한은 아니지만 말단 아미노기(들)의 부가 및 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 및 O-메틸 리보오스 또는 데옥시리보오스 잔기와 같은 변형된 뉴클레오티드간 결합의 사용을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 복제 기원, 프로모터 및 항생제 또는 제초제 내성을 암호화하는 유전자와 같은 추가의 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포에 도입될 수 있다. 또한, 도너 폴리뉴클레오티드는 네이키드 핵산, 리포솜 또는 폴록사머 같은 제제와 복합체화된 핵산으로서 도입될 수 있거나, 또는 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스)에 의해 송달 수 있다.
선택된 유전자좌의 검사(서열화 또는 PCR), 또는 도너 DNA에 존재하는 마커 유전자에 의해 암호화된 특질에 대한 표적화 세포의 선택 및/또는 스크리닝을 포함하는 어떤 적합한 방식으로 표적화 통합에 대해 세포가 분석될 수 있다. 예를 들어, 선택은 조작된 세포를 형질전환하는 유전자 구성물이 내성을 부여하는 항생제나 제초제의 억제량을 함유하는 배지에서 성장시킴으로써 수행될 수 있다. 또한, 형질전환된 세포는 재조합 핵산 구성물에 존재할 수 있는 어떤 시각적 마커 유전자(예를 들어, 형광 단백질, β-글루쿠로니다제, 루시페라제, B 또는 C1 유전자)의 활성을 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 이러한 선택 및 스크리닝 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
또한, 물리적 방법 및 생화학적 방법을 사용하여 표적화 유전자좌에 삽입된 도너 서열을 함유하는 세포를 확인할 수 있다. 이들 방법은, 제한은 아니지만 1) 재조합 DNA 삽입체의 구조를 검출하고 결정하기 위한 서던 분석 또는 PCR 증폭; 2) 유전자 구성물의 RNA 전사물을 검출하고 검사하기 위한 노던 블롯, S1 RNase 보호, 프라이머-확장 또는 역전사효소-PCR 증폭; 3) 유전자 구성물에 의해서 이러한 유전자 산물이 암호화되는 경우의 효소 또는 리보자임 활성을 검출하기 위한 효소 분석; 4) 유전자 구성물 산물이 단백질인 경우의 단백질 겔 전기영동, 웨스턴 블롯 기술, 면역침전, 또는 효소-결합 면역분석을 포함한다. 또한, 원위치 혼성화, 효소 염색 및 면역 염색과 같은 추가의 기술을 사용하여 특정 식물 기관 및 조직에서 재조합 구성물의 존재 또는 발현을 검출할 수 있다. 모든 이러한 분석들을 행하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
본원에 개시된 방법들을 사용한 유전자 조작의 효과는, 예를 들어 관심의 조직으로부터 분리된 RNA(예를 들어, mRNA)의 노던 블롯에 의해서 관찰될 수 있다. 전형적으로, mRNA의 양이 증가했다면, 상응하는 내인성 유전자가 전보다 더 큰 비율로 발현된 것으로 가정될 수 있다. 유전자 및/또는 CYP74B 활성을 측정하는 다른 방법들도 사용될 수 있다. 사용된 기질 및 반응 산물 또는 부산물의 증가나 감소를 검출하는 방법에 따라서 상이한 타입의 효소 분석이 사용될 수 있다. 또한, 발현된 유전자 및/또는 CYP74B 단백질의 수준이 면역화학적으로, 즉 당업자에게 잘 알려진 ELISA, RIA, EIA 및 다른 항체 기반 분석에 의해서, 예를 들어 전기영동 검출 분석(염색에 의해서든 웨스턴 블롯팅에 의해서든)에 의해서 측정될 수 있다.
동형접합성으로 변형된 유기체의 생성
다음으로, 표적 유전자좌에 리포터 도너 서열이 삽입된 세포는 비-리포터-TI 대립형질에서 변형의 존재에 대해, 예를 들어 NHEJ 사건 또는 리포터(선택성 마커)를 암호화하는 서열을 결여한 트랜스젠의 삽입에 대해서 분석된다. 이러한 리포터 TI/변형된 세포는 서열화, PCR 분석 등을 포함하는 당업자에게 공지된 어떤 적합한 방법을 사용하여 확인될 수 있다.
계속해서, 리포터-TI/변형된 돌연변이체가 배양되거나 또는 처리되며, 이로써 이들은 원하는 유전자좌에 리포터-TI/변형된 유전자형을 가진 전체 유기체를 생성하게 된다. 예를 들어, 기존의 전-핵 주사 또는 난모세포 주사 방법을 사용하여 리포터-TI/변형된 동물을 생성할 수 있다. 예를 들어, ZFN-변형된 래트 난모세포의 점라인 송달을 나타낸 미국 특허출원 제61/205,970호를 참조한다.
마찬가지로, 리포터-TI/변형된 식물 세포도 형질전환된 유전자형과 그에 따른 바람직한 표현형을 지닌 전체 식물이 재생되도록 배양될 수 있다. 이러한 재생 기술은 조직 배양 성장 배지 중의 특정 피토호르몬의 조작에 의존하며, 전형적으로 원하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도입된 살생물제 및/또는 제초제 마커에 따라 좌우된다. 배양된 원형질체로부터 식물을 재생하는 것은 Evans et al. "Protoplasts Isolation and Culture", Handbook of Plant Cell Culture, p.124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; 및 Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985에 설명된다. 또한, 재생은 식물 유합조직, 외식체, 기관, 화분, 배 또는 이들의 부분으로부터 얻어질 수 있다. 이러한 재생 기술은 일반적으로 Klee et al.(1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486에 설명된다. 당업자는 발현 카세트가 트랜스제닉 식물에 안정하게 통합되어 작동가능한 것으로 확인된 후에 그것이 유성 교배를 통해서 다른 식물에 도입될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 교배되는 종에 따라서 다수의 표준 육종 기술이 사용될 수 있다. 또한, 트랜스제닉 유기체의 감수분열 후에는 반수체 유기체(예를 들어, 배우체)가 만들어질 수 있다. 조류, 진균 및 일부 식물과 같은 몇 가지 유기체들은 생명주기의 적어도 일부분을 반수체 상태로 살 수 있다.
일단 리포터-TI/변형된 이형접합성 유기체가 생식가능한 성숙도에 도달하면, 이들은 서로 교배될 수 있거나, 어떤 예에서는 포자가 반수체로 성장될 수 있다. 교배로부터 생긴 결과의 자손 중 약 25%는 표적 유전자좌에서 동형접합성 변형된/변형된 것일 것이다(NHEJ/NHEJ 또는 비-리포터 TI/비-리포터 TI). 반수체 자손 중 절반은 관심의 변형을 함유할 것이다. 변형된/변형된 유기체는, 제한은 아니지만 서열화, PCR 분석 등을 포함하는 상기 설명된 방법들 중 어느 것을 사용하여 확인될 수 있다. 이들 유기체는 원하는 동형접합성 유전자 변형을 갖지만, 어떤 삽입된 외래 리포터 서열(예를 들어, 마커)은 포함하지 않을 것이다.
키트
또한, 본원에 설명된바 같은 유기체를 생성하기 위한 키트가 제공된다. 키트는 전형적으로 본원에 설명된바 같은 하나 이상의 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 도너 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 선택성 마커를 가진)와 비-리포터-TI 대립형질에서의 변형에 대해서 선택된 TI 클론을 분석하기 위한 설명서와 리포터-TI/변형된 유기체들을 서로 교배하여 뉴클레아제 및/또는 도너 폴리뉴클레오티드가 도입된 도너 DNA가 삽입되지 않은 파괴된 유전자좌에 동형접합성인 유기체를 생성하기 위한 설명서를 함유한다. 또한, 키트는 세포, 시약, 세포 형질전환을 위한 버퍼, 세포 배양 배지, 및/또는 분석을 수행하기 위한 버퍼를 함유할 수 있다. 전형적으로, 키트는 또한 키트의 다른 구성요소에 부착되거나 첨부된 설명서, 포장 또는 광고 리플릿과 같은 어떤 재료를 포함하는 라벨을 함유한다.
용도
본원에 설명된 동형접합성으로 변형된 유기체는 외래 서열이 삽입된 KO 유기체가 현재 사용되고 있는 모든 용도에 사용될 수 있다. 이러한 유기체들은 생물학적 및 의학적 연구, 제약 약물의 생산, 실험 의학 및 농업 분야에 사용될 수 있다.
예를 들어, KO 동물은 유전자 산물의 기능을 분석하고, 사람 질환의 모델을 만드는데 있어서 매우 유용한 것으로 판명되었으며, 따라서 약물 개발을 가능하게 한다. 유사하게, 본원에 설명된바 같은 KO 식물은 원하는 유전자가 파괴되고, 천연 작물을 잠재적으로 손상시킬 수 있는 서열은 삽입되지 않은 작물을 생산하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 설명된바 같은 KO 식물은 이들이 외인성 DNA를 포함하지 않는다는 점에서 비-트랜스제닉 GMO일 수 있다. 또는 달리, KO 유기체는 파괴된 유전자좌(유전자좌들)에는 삽입된 서열을 결여하고, 나머지 유전자좌 또는 유전자좌들에는 트랜스젠을 포함할 수 있다.
트랜스젠에 대해서는 동형접합성이고, 외래 리포터 서열을 결여하는 식물 또는 동물을 만드는 것이 주로 바람직하다. 따라서, 본원에 설명된 방법과 조성물은 원하는(비-리포터) 유전자 서열이 양 대립형질에 모두 삽입되지만, 결과의 식물 자손이 어떤 리포터 서열도 함유하지 않는 식물 및 동물의 생성을 위한 도구를 제공한다. 예를 들어, 관심의 특정 유전자를 제어(억제 또는 활성화)하기 위해서 조절인자 서열이 삽입될 수 있다. 유사하게, 트랜스젠은 관심의 유전자좌의 모든 대립형질에 삽입될 수 있다. 트랜스젠은 표적 유전자의 발현이 바람직하지 않은 경우 그 특정한 유전자를 녹아웃으로 만들기 위해서 삽입될 수 있다.
다음의 실시예는 뉴클레아제가 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 포함하는 본 명세서의 전형적인 구체예들에 관한 것이다. 이것은 단지 예시의 목적일 뿐이고, 다른 뉴클레아제들, 예를 들어 조작된 DNA-결합 도메인을 가진 귀소 엔도뉴클레아제(메가뉴클레아제) 및/또는 조작된 귀소 엔도뉴클레아제(메가뉴클레아제) DNA-결합 도메인과 이종성 절단 도메인 또는 TALEN의 자연 발생한 융합체도 사용될 수 있음이 인정될 것이다.
실시예
실시예
1: 양쪽-
대립형질
녹아웃 식물의 생성
옥수수의 IPK1 유전자에 표적화된 ZFN을 제초제 내성 유전자(PAT)의 표적화 삽입(TI)에 사용했다. 사용된 ZFN과 TI 기술은 Shukla et al. (2009) Nature 459: 437-441 및 미국특허 공개 제2008-0182332호 및 제2009-0111188호에 설명된다. 설명된 대로, ZFN은 선택성 마커의 한쪽-대립형질 또는 양쪽-대립형질 표적화 통합에 의해서 표적 유전자좌를 정확하게 변형했다.
계속해서, 비-TI 대립형질에서 TI/-(한쪽-대립형질) 클론(사건)을 유전자형 분류했다. 도 1에 도시된 대로, 비-TI 대립형질에서 서열화된 사건들 중 어떤 사건은 비-TI 대립형질에서 NHEJ-유도 돌연변이(결실)를 가졌다. 도 1은 야생형 서열 및 해당 사건의 다중 서열 판독을 도시한다. 이러한 사건을 TI/NHEJ로 지정한다. 다음으로, TI/NHEJ 사건을 표준 방법에 의해서 자체 수분시켜 식물을 얻었는데, 이들은 표적화 유전자좌에서는 양쪽-대립형질 녹아웃(-/- 또는 NHEJ/NHEJ)이지만, 삽입된 리포터(선택성 마커) 서열은 결여한다.
실시예
2: 이형접합체 녹아웃
쥐과
줄기세포의 생성
쥐과 히스톤 H3.3B에 표적화된 ZFN을 이 유전자의 3' 미번역 부분의 시작부에 형광 마커인 증진된 황색 형광 단백질(EYFP)의 표적화 통합에 사용했다. ZFN은 필수적으로 미국특허 제6,534,261호에 설명된 대로 구성했다. 사용된 ZFN 쌍의 인식 나선과 표적 서열을 하기 표 1 및 2에 나타낸다.
EYFP 서열에 작동가능하게 연결된 H3.3B 유전자를 함유하는 도너 DNA를 구성했다(도 2 참조). 간단히 말해서, 마우스 H3.3B의 게놈 DNA의 PCR 단편을 Phusion 중합효소(NEB F-530L)를 사용하여 C57BL/6J 마우스 염색체 11로부터의 게놈 박테리아 인공 염색체(BAC)로부터 TA-TOPO 클로닝(Invitrogen K4500-02)에 의해서 pCR2.1 벡터(pCR2.1-H3.3B)로 클로닝했다. H3.3B-EYFP 도너 구성물(pCR2.1-H3.3B-EYFP)을 생성하기 위해서, EYFP(Clontech)의 6개 아미노산(SRPVAT) 링커와 뒤이은 오픈-리딩 프레임을 H3.3B의 마지막 코딩 엑손에 프레임 내 삽입했다. H3.3B-EYFP 도너는 H3.3B 프로모터 서열을 포함하지 않았고, 마지막 H3.3B 코딩 아미노산까지 인트론을 포함해서 제 2 H3.3B 코돈에서 시작하는 5' 상동성 게놈 서열의 약 0.6kb와 뒤이어 링커 및 EYFP, 중단 코돈, 및 H3.3B 3'UTR에 상동성인 약 1.3kb를 함유한다. 다음으로, ZFN 쌍을 함유하는 도너 및 발현 벡터를 마우스 배아 줄기 세포에 공-트랜스펙션했다. ZFN과 도너 구성물을 송달하기 위해서, 마우스 ES 세포를 Amaxa 뉴클레오펙션에 의해 트랜스펙션했다. 간단히 말해서, 트랜스펙션 직전에 ES 세포를 수거하여 ES 세포에서 영양분을 고갈시키고, 30분간 영양분 없는 접시에 평판한 다음, ES 부화된 비부착성 세포를 수집해서 트랜스펙션했다. 2-5*10-6 세포의 ES 세포를 90μl 용액에 재현탁하고, 10μl 뉴클레오펙션 용액 중에서 2개의 비-선형 플라스미드(2A 펩티드 서열에 의해 분리된 두 ZFN을 갖는 ZFN 플라스미드 1μg + 도너 플라스미드 10μg)와 혼합하고, 마우스 ES 세포에 대해서 Amaxa 제조자의 프로토콜에 설명된 대로 A-013 프로그램을 사용하여 트랜스펙션했다.
트랜스펙션 후, 멸균 플라스틱 피펫을 사용하여 세포를 미리 영양분을 첨가해 둔 조직 배양 접시 안의 따뜻한 ES 배지로 옮겼다. 이송 후, ES 세포를 3-5일간 처리된 영양분 위에서 표준 조건하에 배양하고, 형광 활성화 세포 정렬(FACS) 또는 형광 콜로니 채집을 수행했다. 콜로니 채집, 클론성 분리 및 확장 후, 게놈 DNA를 Qiagen DNeasy 혈액 & 조직 키트(Qiagen 69504)를 사용하여 제조했다. 개별 콜로니를 PCR로 스크리닝했다. 야생형과 변형된 H3.3B 대립형질 둘 모두로부터의 PCR 산물을 표준 방법을 사용하여 서열화했다. 서던 블롯팅을 수행하기 위해, 게놈 DNA를 야생형 및 표적화 ES 세포로부터 BsrBI로 절단하고, 프로브로서 H3.3B 도너의 표지된 638bp Avail 단편을 사용하여 야생형 H3.3B 및 통합된 H3.3B 도너를 시각화했다.
FACS 및 서던 블롯 분석으로 EYFP가 H3.3B 유전자좌에 통합되었음을 확인했다(도 6 참조). 하나의 H3.3B 유전자좌에 통합된 EYFP를 함유한 클론들 중 약 20%는 나머지 유전자좌에 NHEJ 사건을 갖는 것으로 밝혀졌다(도 7 참조).
실시예
3: 동형접합체 녹아웃 마우스의 생성
관심의 유전자좌에 이형접합성 리포터 TI/변형된 대립형질을 함유하는 줄기세포를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 동형접합성 변형된/변형된 마우스를 생성한다(예를 들어, Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual, 3rd Edition Nagy et al, eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2003) 참조).
실시예
4:
트랜스젠을
함유하는 이형접합성 포유류 세포의 생성
PPP1R12C 유전자(미국특허 공개 제2008-0299580호 참조)의 한쪽 대립형질은 PGK-GFP-pA 선택성 마커를, PPP1R12C 유전자의 나머지 대립형질은 HindIII 제한 부위를 만드는 신규 RFLP를 지닌 트랜스젠을 함유하는 이형접합성 세포를 생성한다. 간단히 말해서, K562 세포를 2개의 도너 분자와 함께 상기 설명된 대로 ZFN 발현 플라스미드로 트랜스펙션한다. 1개 도너는 PGK 프로모터에 의해 유도된 리포터 GFP를 포함하고, 나머지 도너는 신규 RFLP를 가진 PPP1R12C 유전자를 포함한다. 제한 희석 및 육안 검사에 의해서 GFP 양성 세포를 분리한다. 클론을 성장시키고, 게놈 DNA를 분리해서 PCR 및 서열화에 의해 유전자형 분류한다.
본원에서 언급된 모든 특허, 특허출원 및 간행물은 그 전문이 참고자료로 본원에 포함된다.
본 명세서는 이해를 명확히 할 목적에서 예시 및 실시예의 방식으로 일부 상세히 제공되었지만, 본 명세서의 정신 및 범위에서 벗어나지 않고 다양한 변화 및 변형이 실시될 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 전술한 설명 및 실시예는 제한으로서 해석되지 않아야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> DOYON, YANNICK
<120> ORGANISMS HOMOZYGOUS FOR TARGETED MODIFICATION
<130> 8325-0073
<140> PCT/US2010/002205
<141> 2010-08-11
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<151> 2009-08-11
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Unknown
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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oligonucleotide
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Claims (16)
- 적어도 제 1 대립형질과 제 2 대립형질을 갖는 유전자 유전자좌에서의 변형에 대해 동형접합성인, 유기체로서,
(i) 유전자 유전자좌의 제 1 대립형질 및 제 2 대립형질은 유전자 유전자좌를 비활성화시키는 하나 이상의 결실을 포함하고, 또한 제 1 대립형질 및 제 2 대립형질은 외래 서열을 포함하지 않으며; 또는
(ii) 유전자 유전자좌의 제 1 대립형질 및 제 2 대립형질은 하나 이상의 외래 서열을 포함하고, 하나 이상의 외래 서열이 리포터 또는 선택성 마커를 암호화하지 않는, 유기체. - 제 1 항에 있어서, 제 1 대립형질과 제 2 대립형질이 유전자 유전자좌를 비활성화시키는 하나 이상의 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 유기체.
- 제 1 항에 있어서, 제 1 대립형질과 제 2 대립형질이 리포터 또는 선택성 마커를 암호화하지 않는 하나 이상의 외래 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유기체.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 유기체가 식물 또는 동물인 것을 특징으로 하는 유기체.
- 제 4 항에 있어서, 식물이 옥수수, 쌀, 밀, 감자, 대두, 토마토, 담배, 브라시카(Brassica) 과의 일원, 및 애기장대(Arabidopsis)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유기체.
- 제 4 항 또는 제 5 항의 식물에 의해서 생산된 종자.
- 제 4 항에 있어서, 동물이 포유류인 것을 특징으로 하는 유기체.
- 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 동형접합성 유기체를 생성하는 방법으로서, 동형접합성 유기체가 선택된 표적 유전자좌에 외래 서열을 결여하며, 상기 방법은
(a) 유기체의 게놈의 선택된 유전자좌에 외래 서열의 표적화 통합을 매개하는 뉴클레아제를 사용하여 세포에 외래 서열을 도입하는 단계로서, 유전자좌가 적어도 제 1 대립형질과 제 2 대립형질을 포함하는 단계;
(b) (i) 표적 유전자좌의 제 1 대립형질에 외래 서열을 포함하고, (ii) 선택된 표적 유전자좌의 제 2 대립형질에 비-상동성 말단 결합(NHEJ) 변형을 포함하는 세포를 확인하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 확인된 세포를 생식가능한 성숙한 유기체로 발달시키는 단계;
(d) 생식가능한 성숙한 유기체들을 서로 교배하는 단계; 및
(e) 선택된 표적 유전자좌의 제 1 대립형질과 제 2 대립형질에서 NHEJ 변형을 나타내는 자손을 확인하는 단계
를 포함하며, 이로써 선택된 표적 유전자좌에 외래 서열을 결여한 동형접합성 유기체를 생성하는, 방법. - 제 1 항 또는 제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 유기체를 생성하는 방법으로서, 유기체가 게놈의 선택된 표적 유전자좌에서 하나 이상의 외래 서열에 대해 동형접합성이며, 이때 외래 서열은 선택된 표적 유전자좌에 리포터 또는 선택성 마커를 포함하지 않고, 상기 방법은
(a) 게놈의 선택된 표적 유전자좌에 리포터의 표적화 통합을 매개하는 뉴클레아제를 사용하여 유기체의 세포에 리포터 또는 선택성 마커 서열을 도입하는 단계로서, 선택된 표적 유전자좌가 적어도 제 1 대립형질과 제 2 대립형질을 포함하는 단계;
(b) 세포에 하나 이상의 외래 서열(들)을 도입하는 단계로서, 이때 뉴클레아제가 게놈의 선택된 표적 유전자좌에 외래 서열의 표적화 통합을 매개하는 단계;
(c) (i) 선택된 표적 유전자좌의 제 1 대립형질에 리포터 또는 선택성 마커를 포함하고, (ii) 제 2 대립형질에 하나 이상의 외래 서열을 포함하는 세포를 확인하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 확인된 세포를 생식가능한 성숙한 유기체로 발달시키는 단계;
(e) 생식가능한 성숙한 유기체들을 서로 교배하는 단계; 및
(f) 제 1 대립형질과 제 2 대립형질에 하나 이상의 외래 서열을 포함하는 단계 (e)의 교배의 자손을 확인하는 단계
를 포함하며, 이로써 외래 서열에 대해 동형접합성이고, 선택된 표적 유전자좌에 리포터 또는 선택성 마커 서열을 결여하는 유기체를 생성하는, 방법. - 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 뉴클레아제가 하나 이상의 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN); 하나 이상의 메가뉴클레아제 및 하나 이상의 TAL-이펙터 도메인 뉴클레아제로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터 또는 선택성 마커 서열 및 하나 이상의 외래 서열이 하나 이상의 뉴클레아제와 동시에 또는 순차적으로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터 서열이 선택성 마커 또는 스크리닝 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레아제가 폴리뉴클레오티드로서 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 유기체를 생성하기 위한 키트로서, 상기 키트는
(a) 선택된 표적 유전자좌의 표적 부위에 결합하는 하나 이상의 뉴클레아제;
(b) 선택된 표적 유전자좌에 표적화 통합을 위한 하나 이상의 외래 서열; 및
(c) (i) 세포에 뉴클레아제 및 외인성 서열을 도입하고;
(ii) 선택된 표적 유전자좌의 제 1 대립형질에 삽입된 하나 이상의 외래 서열을 포함하는 세포를 확인하고;
(iii) 선택된 표적 유전자좌의 제 2 대립형질에 변형을 포함하는 (ii)의 세포를 확인하고;
(iv) (iii)의 세포를 생식가능한 성숙한 유기체로 성장시키고;
(v) (iv)의 유기체들을 교배하고; 및
(vi) 표적화 유전자 변형에 대해 동형접합성인 (v)의 교배의 자손을 확인하기 위한 설명서
를 포함하는 키트. - 제 14 항에 있어서, 뉴클레아제가 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서 공급되는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 표적 부위에 상동성인 서열을 포함하는 선택적 도너 트랜스젠을 더 포함하며, 이때 도너 트랜스젠은 리포터 유전자를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 키트.
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