JPWO2003020940A1 - 高等植物のゲノム改変法 - Google Patents
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Abstract
高等植物では高効率かつ高再現性を実現することが難しいとされてきた、相同組換えを利用したゲノム配列の一部を所望の配列に改変する技術を確立した。本発明により、高等植物が本来持つゲノム配列をターゲットとして、本来の遺伝子座位を変えることなく、高効率かつ再現性良く相同組換えが起こる個体を獲得することができる。更に、特定の遺伝子を自由自在に改変した形質転換植物を作出し、遺伝子の機能解析やゲノム動態の変化に伴った遺伝子発現の機構解明に貢献することができる。
Description
発明の分野
本発明は、相同組換えを利用した高等植物でのゲノム改変するための遺伝子構築物、および該遺伝子構築物を含む植物形質転換用ベクターを用いてゲノム改変高等植物を製造する方法に係り、植物が本来持つゲノム配列をターゲットとして、本来の遺伝子座位を変えることなく、高効率かつ再現性良く相同組換えの生じた個体を獲得することができる方法に関する。
従来の技術
高等植物の内、双子葉植物への遺伝子導入には、病原菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（アグロバクテリウムツメファシエンス）の感染時におこるＴｉプラスミド中のＴ−ＤＮＡの植物細胞への移行と染色体組込みを利用した方法がよく使われ、Ｔｉプラスミドから遺伝子導入に必要な領域だけを残して大腸菌との間を往復可能にした小さなバイナリーベクターが開発されている。単子葉植物では、プロトプラストへのエレクトロポレーションなどによるＤＮＡの直接導入法が一般的に使われるが、アグロバクテリウム感染法による成功例もある。
しかし、これらの方法では、導入遺伝子の染色体上の位置およびコピー数がランダムであり、そのために導入外来遺伝子の位置効果や、コサプレッション（共抑制）、ジーン・サイレンシング等の諸現象により、導入遺伝子を期待どおりに発現させることは困難であった。
また、ＴＯＳ１７により遺伝子を破壊する方法で、レトロトランスポゾンを利用して遺伝子破壊を行う方法がある（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ ａｓ ｇｅｎｅｔｉｃｔｏｏｌｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｂｉｏｌｏｇｙ．２００１ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：１２７−１３４）。この方法は、ゲノムを改変できるが、レトロトランスポゾンはゲノム上の不特定の場所に転移するため、狙い通りのゲノム改変植物体を得ることは非常に労力を要する。さらに、遺伝子を破壊することは可能であるが、任意に変異を導入したり、置換したりすることは不可能な技術である。
Ｔ−ＤＮＡタギング法は、アグロバクテリウム法によりＴ−ＤＮＡをゲノムに挿入し、遺伝子破壊を行う方法である（Ｐｌａｎｔ ｔａｇｎｏｌｏｇｙ．１９９９ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４：９０−９６）。この方法は、ＴＯＳ１７と同様、Ｔ−ＤＮＡはゲノム上の不特定の場所に挿入されるため、狙い通りのゲノム改変植物体を得ることは非常に労力を要する。さらに、遺伝子を破壊することは可能であるが、任意に変異を導入したり、置換したりすることは不可能な技術である。
ＲＮＡ／ＤＮＡのキメラ・オリゴヌクレオチドを利用した方法で、Ｚｈｕ Ｔらにより、ＲＮＡ／ＤＮＡのキメラ・オリゴヌクレオチドを利用して、トウモロコシのゲノム上の遺伝子に一塩基置換を導入し、除草剤耐性を付与したことが報告されている（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｕｓｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＲＮＡ／ＤＮＡｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９９ Ｊｕｌ ２０；９６（１５）：８７６８−７３）。この技術は、内在の遺伝子の極小さな領域に変異を導入することはできるが、大きな領域の改変には適用できない。
そこで、外来遺伝子を期待通りに発現させることができる可能性を有する方法として相同組換えを利用したゲノム改変法がある。これは、挿入したい外来遺伝子を相同遺伝子領域で挟んで、その両側で相同組換えを起こさせる方法である。相同組換えとは、相同な２本のＤＮＡ鎖の間でつなぎ換えが行われることをいう。
一方、植物のゲノム構造は動物に比べ繰返し配列が多く、特に体細胞では相同組換えが抑制されている可能性があると考えられている。アラビドプシスやタバコにおいては、ゲノムに人為的に設定したマーカー遺伝子を標的とした相同組換えが行われ、その頻度は１０−４〜１０−６と推定されている（Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ．ＥＭＢＯ Ｊ １９８８ ７：４０２１−４０２６，Ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ Ｊ １９９０ ９：３０７７−３０８４，Ｎｏｎｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ＤＮＡ ａｎｄ ａ ｐｌａｎｔ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃｕｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９３ ９０：７３４６−７３５０）。
しかし、このような高等植物での相同組換えを利用したゲノム改変法は、以下の萌芽的実験結果がいくつか報告されているのみである。これらの実験結果は、ｉ）人為的に設定した遺伝子マーカーを用いた場合と、ｉｉ）植物が本来もつゲノム配列をターゲットとしたものに分けられる。
ｉ）人為的に設定した遺伝子マーカーを用いた報告には以下のものがある。
相同組換えの頻度を上げるため、大腸菌のＲｅｃＡ遺伝子、ＲｕｖＣ遺伝子の発現や酵母菌のＨＯエンドヌクレアーゼ遺伝子やＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子によるＤＮＡ二重鎖切断の導入がタバコやアラビドプシスのゲノム上に人為的に設定したマーカー遺伝子の相同組換えを促進することが報告されている（ＲｅｃＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９６ ９３：３０９４−３０９８，Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｅｓｏｌｖａｓｅ ＲｕｖＣ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９９ ９６：７３９８−７４０２，Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｉｎｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ ＨＯ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １９９６ ８：２０５７−２０６６，Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ ｉｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｉｎｔｏ ＤＮＡ ｂｙ ａ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９３ ２１：５０３４−５０４０）。
Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ Ｊらは、タバコのプロトプラストを材料として、相同組換えによるゲノム改変に成功したことを報告している。これが植物で初めての成功例である。これにより、植物でも相同組換えによるゲノム改変の可能性が示された。ここでは、欠失させた機能しないカナマイシン耐性遺伝子（ポジティブ選抜マーカー）を最初にゲノムに組み込ませ、その細胞を材料として欠失部分を回復させる遺伝子を再度導入し、カナマイシン耐性でスクリーニングを行うという選抜システムを利用している（Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ．ＥＭＢＯ Ｊ １９８８ ７：４０２１−４０２６）。
Ｒｉｓｓｅｅｕｗ Ｅらは、タバコを材料としてアグロバクテリウム法による形質転換を行い、相同組換えを起こした培養細胞を１ライン得たと報告している。彼らは、まずＧＵＳ遺伝子およびｃｏｄＡ遺伝子をゲノムに組み込ませ、次にその形質転換細胞を材料とし、相同組換えが生じるとＧＵＳ遺伝子の一部とｃｏｄＡ遺伝子が欠失し、新たにカナマイシン耐性遺伝子が組み込まれるような遺伝子を用いて再度形質転換し、５−フルオロシトシン感受性、カナマイシン耐性、ＧＵＳ活性、ＰＣＲ法により相同組換えを起こした細胞を選抜し、サザンブロット法により確認している（Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔ−ＤＮＡ ｌｏｃｉ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｅ．Ｐｌａｎｔ Ｊ １９９７ Ａｐｒ；１１（４）：７１７−２８）。
Ｏｆｆｒｉｎｇａ Ｒらは、タバコ培養細胞を材料とし、アグロバクテリウム法を用いて遺伝子組換えを行い、相同組換えが起こったラインを１系統得たと報告している。これにより、アグロバクテリウム法が相同組換えによる植物ゲノムの改変に利用可能であることが示された。再現性については示されていない。彼らも一部を欠失させたカナマイシン耐性遺伝子をまずゲノムに組み込ませ、次にその細胞を材料として補完部分の遺伝子を用いて再度形質転換し、カナマイシンへの耐性とＰＣＲ法により相同組換えを起こした細胞を選抜し、サザンブロット法により確認している（Ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ Ｊ １９９０ Ｏｃｔ；９（１０）：３０７７−８４）。
Ｈａｌｆｔｅｒ Ｕらは、アラビドプシスのプロトプラストを材料とし、ＰＥＧ法を用いて遺伝子組換えを行い、相同組換えが起こった４個体を得たと報告している。彼らは一部を欠失させたハイグロマイシン耐性遺伝子をまずゲノムに組み込ませ、次にその細胞を材料として補完部分の遺伝子を用いて再度形質転換し、ハイグロマイシンへの耐性とＰＣＲ法により相同組換えを起こした細胞を選抜し、サザンブロット法により確認している（Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ．Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ １９９２ Ｊａｎ；２３１（２）：１８６−９３）。
ｉｉ）一方、植物が本来もつゲノム配列をターゲットとして相同組換えによって改変した例としては、以下の二報があるのみである。
Ｍｉａｏ ＺＨらは、アラビドプシスの根を材料としてアグロバクテリウム法により形質転換し、形質転換培養細胞２５８０ラインから相同組換えが起こった１ラインを得ている。彼らは、ゲノム上のＴＧＡ３座にカナマイシン耐性遺伝子を相同組換えにより挿入している。これが植物本来のゲノムを相同組換えにより改変した初めての例である。彼らは、カナマイシン耐性による選抜に加え、相同組換えが起こらずに外来遺伝子が組み込まれた細胞にはβ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅを発現させることにより、より選抜効率を上げている。ＰＣＲ法やサザンブロット法も利用して相同組換え個体を確認している。しかし、この細胞からは植物体を得ることはできず、相同組換えを起こした領域をホモで有する個体を得ることは実現できていない（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＴＧＡ３ ｌｏｃｕｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ．Ｐｌａｎｔ Ｊ １９９５ Ｆｅｂ；７（２）：３５９−６５）。
Ｙａｎｏｆｓｋｙ ＭＦらは、アラビドプシスを材料としてアグロバクテリウム法により形質転換し、相同組換えが起こった１ラインを得たことを報告している。彼らは、ゲノム上のＡＧＬ５遺伝子にカナマイシン耐性遺伝子を挿入し、選抜にはカナマイシン耐性とＰＣＲ法を利用しており、７５０のカナマイシン耐性ラインから１ラインを得、最終的にサザンブロット法およびＰＣＲ法で確認している（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ １９９７ Ｏｃｔ ２３；３８９（６６５３）：８０２−３）。
また、相同組換えを試みたが、相同組換えを起こした細胞を得ることはできなかったという次のような報告もある。
Ｔｈｙｋｊａｅｒ Ｔらは、ハスを材料としてアグロバクテリウムを用いた相同組換えを試みている。その際、ｃｏｄＡ遺伝子をネガティブ選抜マーカーとして利用しており、それをＴ−ＤＮＡの片側、両側等に配置した数種のベクターを用いている。しかし相同組換えを起こした細胞を得ることはできていない（Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｕｓｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｌａｒｇｅ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９７ Ｎｏｖ；３５（４）：５２３−３０）。
Ｇａｌｌｅｇｏ ＭＥらは、アラビドプシスを材料とし、カナマイシン耐性遺伝子をポジティブ選抜マーカーとして、ｃｏｄＡ遺伝子をネガティブ選抜マーカーとして利用している。しかし１ｘ１０５の形質転換細胞から相同組換えを起こした細胞を得ることはできていない（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔ−ＤＮＡ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９９ Ｊａｎ；３９（１）：８３−９３）。
発明の概要
相同組換えを利用したゲノム改変法には種々の利点があることは先に述べた。しかしながら、高等植物において、相同組換えの頻度は極めて低い等の理由により、高等植物本来のゲノム配列を相同組換えによって改変した報告は、上記Ｍｉａｏ ＺＨらおよびＹａｎｏｆｓｋｙ ＭＦらの二例あるだけで、いずれの報告においても再現性と信頼性の高い相同組換えの方法は開示されていない。しかも、単子葉植物においては、農業上きわめて重要であるにもかかわらず成功例は一例もなく、高等植物における再現性と信頼性の高い相同組換え方法の開発が強く望まれていた。
以上から本発明の目的は、イネ等の単子葉植物を含む種々の高等植物の細胞で、外来遺伝子導入で生ずる導入遺伝子のコピー数や位置効果あるいはコサプレッション、ジーン・サイレンシング等による発現の不安定性等、従来の形質転換法の諸問題を解決し、改変を行おうとする遺伝子領域以外はゲノムに一切変化を起こさせずに形質転換を行う方法に用いる遺伝子構築物、植物ゲノム改変用ベクターおよび該方法により形質転換された細胞から、完全な形質転換植物を作出する方法を提供することである。
発明の詳細な説明
本発明は、Ｔ−ＤＮＡ由来のＢＲ（右ボーダー配列）とＢＬ（左ボーダー配列）の間に、下記の要素を、ＢＲから
（１）発現可能、好ましくは高発現可能に存在させた、第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子、
（２）宿主ゲノム中の標的遺伝子と相同組換えさせる遺伝子の５’領域を組み込むための第一のクローニング部位、
（３）発現可能、好ましくは高発現可能に存在させたポジティブ選抜マーカー遺伝子、
（４）宿主ゲノム中の標的遺伝子と相同組換えさせる遺伝子の３’領域を組み込むための第二のクローニング部位および
（５）発現可能、好ましくは高発現可能に存在させた、第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子と同一であってもよい第二のネガティブ選抜マーカー遺伝子
の順に含んでなる、相同組換えにより高等植物のゲノムを改変するための遺伝子構築物及び該構築物を含む植物形質転換用ベクターを提供する。
本発明における遺伝子構築物は、Ｔ−ＤＮＡのＢＲとＢＬの間において、確実に発現させるようにした、好ましくは高発現性のポジティブ選抜マーカーの５’上流と３’下流に、確実に発現させるようにした、好ましくは高発現性のネガティブ選抜マーカーを置き、ポジティプ選抜マーカーとネガティブ選抜マーカーの間に相同組換えのための配列を組み込むためのクローニング部位（好ましくはマルチプルクローニングサイト）を有する遺伝子構築物であり、これをアグロバクテリウム法による植物形質転換用ベクター中に組み込んだものを本明細書中では「基本ベクター」と呼ぶ（図２ｂ）。
Ｔ−ＤＮＡとは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ内で保持されているＴｉプラスミドの一部であり、植物がＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに感染すると、菌体自身は植物細胞に侵入しないが、菌体内に存在するＴｉプラスミドの一部であるＴ−ＤＮＡ領域が植物細胞内に転移される。Ｔ−ＤＮＡは、ＢＲ（右ボーダー配列）とＢＬ（左ボーダー配列）によって、区切られている。各ボーダー配列は、約２５ｂｐの不完全な反復配列からなる。
本発明の遺伝子構築物は、ネガティブ選抜マーカーおよびポジティブ選抜マーカーを含む。それは、高等植物の形質転換では非相同組換えにより遺伝子導入が生ずる頻度が極めて高く、相同組換え体を非相同組換え体から効率良く選抜する必要があるからであり、その選抜のため、これらのマーカーがネガティブ選抜法とポジティブ選抜法に用いられる。
ポジティブ選抜とは、遺伝子が導入されて形質転換された細胞を選抜する時に、当該遺伝子産物が発現している細胞のみが生き残る条件にて選抜する方法である。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を導入すれば、導入された細胞がネオマイシンの類似体であるＧ４１８耐性を有することにより選抜される。
ネガティブ選抜とは、遺伝子が導入されて形質転換された細胞を選抜する時に、当該遺伝子産物が発現している細胞が死滅する条件にて選抜する方法である。例えば、ヒトヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子を細胞に導入し、チミジン類似体であるガンシクロビアの存在下で選抜すると、チミジンキナーゼ遺伝子を発現している細胞が死滅する。
本発明においては、選抜法として、ポジティブ選抜法とネガティブ選抜法を組み合わせたポジティブ・ネガティブ選抜法を利用する。この選抜法は、まずポジティブ選抜マーカーによって形質転換体を選抜し、さらにネガティブ選抜マーカーによって相同組換え以外により生じた形質転換体が致死となることを利用して、非相同組換え体を除いて相同組換え体を選択的に拾い上げる方法であり、選抜効率を高めることができる。
ネガティブ選抜マーカーは、植物細胞に対して毒性があり、ベクターを操作するために用いる大腸菌やアグロバクテリウムに対して毒性がないことが必要であり、ジフテリア毒素タンパク質Ａ鎖遺伝子が好ましい。他にもネガティブ選抜マーカーとして利用できる遺伝子としては、ｃｏｄＡ遺伝子、シトクロムＰ−４５０遺伝子、ｂａｒｎａｓｅ遺伝子が挙げられる。
ネガティブ選抜マーカーに関しては、以下の報告がある。Ｋｏｐｒｅｋ Ｔらは、小麦のネガティブ選抜マーカーとしてｃｏｄＡ遺伝子と細菌由来のＰ−４５０が利用できることを報告している（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｂａｒｌｅｙ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ．）：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｄＡ−ａｎｄ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｇｅｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ Ｊ １９９９ Ｓｅｐ；１９（６）：７１９−２６）。寺田らは、イネのネガティブ選抜マーカーとして、ジフテリア毒素タンパク質遺伝子（ＤｘＴ−Ａ）が利用できることを報告している（イネでのジフテリア毒素タンパク（ＤｘＴ−Ａ）遺伝子のネガティブ選抜効果とジーンターゲティング法への応用．日本分子生物学会第２２回年会１９９９ Ｄｅｃ；：２Ｐ−０３４３）。
ポジティブ選抜マーカーとして好ましいものとして、ハイグロマイシン耐性遺伝子が挙げられる。他にもカナマイシン耐性遺伝子やイミダゾリン耐性遺伝子、グリフォセート耐性遺伝子、フォスフォマンノース−イソメラーゼ遺伝子、ブラストタイジンＳ耐性遺伝子、ｂａｒ遺伝子およびグリフォシネート耐性遺伝子等が挙げられる。
本発明の特徴の一つは、相同組換えの頻度の低い高等植物において、相同組換えが生じた細胞を効率よく選抜するため、ポジティブおよびネガティブ選抜マーカーの発現を確実にし、好ましくは高発現性とする点である。例えば、図２ｂおよび２ｃに示すように、ネガティブ選抜マーカーの発現を強化するために、プロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）にイントロンを接続して発現を強化し、または、単子葉植物で強い発現をするユビキチンプロモーターを使用する。一方、ポジティブ選抜マーカーの発現も好ましくは強化する。そのため、ポジティブ選抜マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を用いる場合は、ハイグロマイシン耐性遺伝子に対して発現の強いアクチンのプロモーターを使用するのが好ましい。これら選抜マーカーを高発現とするには、他にもトウモロコシユビキチンプロモーター、イネＰＬＤイントロン、ヒマカタラーゼイントロン等が使用できる。
本発明の別の特徴は、ネガティブ選抜マーカー遺伝子を、ＢＬ側とＢＲ側にそれぞれ使用することである。これらは異なる遺伝子であっても良いが、好ましくは同じ遺伝子である。本発明者らは、高等植物、特に単子葉植物でこれまで相同組換えを利用したゲノム改変が成功していなかった一つの理由は、非相同組換体の中には、ネガティブ選抜マーカー遺伝子が完全な形で組み込まれないものが相当数存在し、そのためネガティブ選抜の効率が低かったのではないかと考えた。本発明では、２つのネガティブ選抜マーカーを互いに離して使用することにより、非相同組換体が選抜工程で生き残る確率を十分に低くすることができる。
本発明の遺伝子構築物において、クローニング部位は、ポジティブ選抜マーカー遺伝子と第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子との間及び、第二のネガティブ選抜マーカー遺伝子との間の２カ所に存在させる。これらは、それぞれ標的遺伝子と相同組換えさせる遺伝子の５’領域及び３’領域を組込むのに適する限り、任意のクローニング部位であってよい。クローニング部位をマルチプルクローニング部位とすれば、任意の遺伝子の組込みに対応できるので好ましい。マルチプルクローニング部位は希望する制限酵素部位を持つオリゴＤＮＡを自由に設計、合成して使用することができる。
第一のクローニング部位には、相同組換えさせる遺伝子の５’領域を組込み、第二のクローニング部位には当該遺伝子の３’領域を組込む。
相同組換えさせる遺伝子は、特定のタンパク質をコードする構造遺伝子であってもよく、あるいは植物の表現形質に影響する他の遺伝子であってもよい。これらの遺伝子で、植物ゲノム中の標的とする遺伝子が機能しないようにする、または標的とする遺伝子を修飾して、組換体植物を改変することができる。標的とする遺伝子の非限定的な例として、Ｗａｘｙ遺伝子およびＥＰＳＰＳ遺伝子が挙げられる。
相同組換えさせる遺伝子の「５’領域」と「３’領域」の境界をどのように選ぶかについては特別の制限はない。例えば、標的の遺伝子の機能を抑制することを目的とする場合は、相同組換えさせる遺伝子はほぼ半々ないし、７：３〜３：７の長さに分けて、上流側を「５’領域」、下流側を「３’領域」としてよいが、一般的には各々の領域の長さは長い方が良い。但し、相同組換えを確実に行わせるため、各々の領域の長さは少なくとも１０００塩基よりも長くすることが好ましく、少なくとも５００塩基とする。
一方、標的遺伝子の機能の改変を目的とする場合には、相同組換えさせる遺伝子の「５’領域」と「３’領域」を各領域にわけて、それぞれのクローニング部位に挿入する。もし、相同組換えさせる遺伝子が適当なイントロンを有する場合は、イントロンの内部で５’領域と３’領域に分割することもできる。さらに、「５’領域」に相同組換えさせる遺伝子の発現に必要な機能を全部含む配列を用い、その下流に隣接する領域を「３’領域」として用いてもよいことは理解すべきである。逆に「３’領域」に相同組換えさせる遺伝子の機能を全部含む配列を用い、その上流の隣接領域を「５’領域」としてもよい。
遺伝子構築物は、ポジティブ選抜マーカーを形質転換植物の後代において部位特異的組換え系によって除くことができるように、要素（７）としてリコンビナーゼ認識配列（例えばＣｒｅ／ｌｏｘ組換え系のｌｏｘ配列、Ｒ／ＲＳ組換え系のＲＳ配列、またはＦＬＰ−ＦＲＴ組換え系のＦＲＴ配列）をポジティブ選抜マーカー遺伝子の前および後に加えることができる（図２ｂ、２ｃ）。Ｃｒｅ／ｌｏｘ組換え系は、Ｃｒｅリコンビナーゼとｌｏｘの組合せにより不要な部分を削除する方法である。Ｒ／ＲＳ組換え系は、Ｒ遺伝子がコードするリコンビナーゼとＲＳ配列の組合わせにより、２つのＲＳ配列に囲まれたＤＮＡ領域の欠失を誘導する方法である。また、ＦＬＰ−ＦＲＴ組換え系は、ＦＬＰリコンビナーゼとＦＲＴ配列の組合わせにより、２つのＦＲＴ配列に囲まれたＤＮＡ領域の欠失を誘導する方法である。
例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘ組換え系を加えた本発明の遺伝子構築物を用いて相同組換えした細胞に、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現させると、ゲノムの相同組換えを生じた領域内の二つのｌｏｘ配列にはさまれたポジティブ選抜マーカー遺伝子を含む配列が削除できる。Ｃｒｅリコンビナーゼを発現させ、ゲノム中の２つのｌｏｘ配列に挟まれた領域が削除すると、植物ゲノム中に相同組換えで導入した遺伝子の５’領域と３’領域を、該遺伝子が本来存在する状態に連結することができる。削除の有無は、ＰＣＲやサザンブロット法で確認できる。
カルスにＣｒｅリコンビナーゼを発現させ、ｌｏｘ配列間の領域を削除するには、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を遺伝子導入した別の植物と交配する、または相同組換えにより得られた植物体にＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を遺伝子導入することにより実現することができる。
Ｃｒｅとｌｏｘの組み合わせは、ｌｏｘ間の配列を削除するためだけでなく、修飾するために使用することができる。そのためには、まず、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を導入した組換え植物と交配してｌｏｘ間の配列を削除し、次にＣｒｅリコンビナーゼおよびｌｏｘ間に組込みたい遺伝子を有する組換え体と交配することによって、削除した後に残っているｌｏｘ配列部位に組込みたい遺伝子を挿入する。修飾の例としては、除草剤耐性遺伝子の挿入が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また標的とした遺伝子の発現の制御が目的の場合は、抑制効果を確実にするため、転写終止領域、好ましくはＥｎ／Ｓｐｍ型トランスポゾンの転写終止領域を要素（６）としてもつように設計することもできる（図２ｂ、２ｃ）。
上記要素（１）〜（５）および存在させる場合にはさらに要素（６）および／または（７）を所定の順序に連絡して、本発明の遺伝子構築物とすることは、通常の遺伝子工学技術で当業者が容易に行うことができる。さらに植物ゲノム中の標的遺伝子と相同組換えさせる遺伝子を選択し、その５’領域および３’領域をそれぞれ第一および第二のクローニング部位に挿入することも、当業者が通常の遺伝子工学技術で容易に行うことができる。
本発明の遺伝子構築物は、適当な制限酵素部位によって、アグロバクテリウム法による植物形質転換用のベクターのＴ−ＤＮＡ領域またはＢＲからＢＬまでの間の領域に置き換えて連絡する。得られたベクターは、本発明の基本ベクターである。この基本ベクターの第一および第二のクローニング部位に相同組換えさせる遺伝子の５’領域および３’領域をそれぞれ組込むと、本発明の遺伝子改変用ベクターとなる。
例えば、イネＷａｘｙ遺伝子およびその隣接領域を基本ベクターに導入すれば、イネＷａｘｙ遺伝子改変用ベクターが構築できる（図２ｃ）。
本発明はまた、下記の工程からなる相同組換えを利用したゲノム改変高等植物の製造方法を提供する：
（イ）本発明の遺伝子改変用ベクターを、Ｔｉプラスミドを含むアグロバクテリウム中に存在させ、
（ロ）当該アグロバクテリウムを植物の細胞、組織またはカルスに感染させ、
（ハ）ネガティブ選抜およびポジティブ選抜により、相同組み換えを生じた細胞、組織またはカルスを選抜し、
（ニ）選抜を細胞または組織で行った場合は、それをカルスに培養し、
（ホ）カルスを再生培地で培養して、ゲノム中にヘテロに相同組み換えを生じた植物個体に生長させ、そして
（ヘ）生じた植物を掛け合わせて、ホモに相同組み換えを有する、遺伝子改変高等植物を得る。
高等植物においては前述のように相同組換えの頻度は極めて低いため、上記（イ）〜（ロ）の工程は高頻度アグロバクテリウム形質転換法を用いて行うことが望ましい。遺伝子改変用ベクターを、高頻度アグロバクテリウム形質転換法によって、例えばイネ・カルスに導入し、ポジティブ・ネガティブ選抜法を適用して、相同組換えの生じた可能性の高いカルスを選抜する。高頻度アグロバクテリウム形質転換法とは、寺田らによりアグロバクテリウムによるイネ等への遺伝子導入技術を改良して得られた方法で、従来の５〜１０倍の効率で遺伝子導入できる手法である（高頻度の形質転換効率を示すイネ・アグロバクテリウム法の開発日本育種学会第９６回講演会１９９９ Ｓｅｐ；：２１２）。この方法は、バイナリーベクター系に基づき、高発現化したハイグロマイシン遺伝子を使用することを特徴としている。
ポジティブ・ネガティブ選抜は次の通りに行う。工程（ニ）で生じたカルスを、ポジティブ選抜用の培地に移す。培地は通常のカルス培養培地にポジティブ選抜用の成分を添加したものである。
ポジティブ選抜のために抗生物質耐性を利用する場合は、選抜用マーカー遺伝子で形質転換させていないカルスが生き残れない、または少なくとも増殖しない濃度の抗生物質を含ませておく。抗生物質がハイグロマイシンである場合は、培地１Ｌ当り１０〜２００ｍｇのハイグロマイシンを含ませる。
カルスを暗所、１５〜４０℃の条件で２〜３週間培養する。生き残ったカルスはポジティブ選抜用マーカー遺伝子を有し、且つネガティブ選抜用マーカー遺伝子をもたない相同組換えに成功したカルスの候補として選抜する。生き残ったカルスであるかの判断は、カルスの色、増殖の差異により行う。
さらにこれらの候補カルスが、目的とする遺伝子改変が生じているカルスであることを確認するためには、ＰＣＲ法による解析を行うことができる。
ＰＣＲ法による解析では、カルスの細胞からＤＮＡを抽出してＰＣＲを行う際、プライマーの一方は挿入遺伝子部分に結合し、他方のプライマーは挿入断片の境界を越えた遺伝子の部分配列と結合するようにデザインする。遺伝子挿入が起こらなかったかあるいは非相同組換えの起きた細胞ではプライマー対は互いに近傍には存在しないので、ＰＣＲによる断片の増幅は起こらない。しかし、相同組換えが起きた細胞では、両プライマーは互いに近接した位置に結合するため、予想通りのサイズの増幅断片を生じる。この断片が検出されれば、その細胞集団に相同組換えの起きた遺伝子が存在する可能性が高い。その細胞を小集団に分けＰＣＲにより再検討する。このサイクルを繰り返すことにより、相同組換えが生じた細胞を分離することができる。
さらに上記ＰＣＲ法に代えて、またはＰＣＲ法に引き続いて、詳細なサザンブロット法による解析を行い、遺伝子改変を確認することができる。
本発明の方法は、単子葉植物、例えばイネの相同組換えを、非常に効率よく行うことが可能である。実施例に示すように、好ましい態様においては、６回の実験で、各４００粒の種子からポジティブ・ネガティブ選抜後に平均１００以上のカルスが得られ、ここから少なくとも毎回１個体の遺伝子改変植物が得られている通り、本発明の方法は再現性と信頼性に優れている。
目的通り、遺伝子が改変されていることが確認されたカルスは、ＭＳ培地等の再生培地で培養して、ゲノム中にヘテロに相同組み換えを生じた植物個体を得ることができ、そして、花粉および種子における改変遺伝子の構造と発現を上記同様にＰＣＲ法および／またはサザンブロット法で解析することにより、遺伝子座で相同組換えがヘテロで起こっているか否かを確認する。
得られた植物体は稔性を有するため、生じた植物を自家受粉によりまたは他の個体と掛け合わせることにより、ホモに相同組み換えを有する遺伝子改変高等植物を得ることができる。
発明の効果
以上説明したように、本発明によれば、相同組換えの頻度が低く、非相同組換えにより遺伝子導入が生ずる頻度が極めて高い高等植物において、ネガティブ選抜マーカーを相同領域の両側に接続し、更にポジティブ選抜マーカーを利用したポジティブ・ネガティブ選抜を行い、植物が本来持つゲノム配列をターゲットとして、本来の遺伝子座位を変えることなく、得られたカルス中でおよそ１００分の１という割合で、しかも再現性良く相同組換えが起こる個体を獲得できる。
更に、本発明によれば、特定の遺伝子を自由自在に改変した形質転換植物を作出することができる。例えば本法によりイネの澱粉合成に関わるＷａｘｙ遺伝子の改変を行った場合には、Ｗａｘｙ遺伝子の発現を制御できるイネが得られる。遺伝子改変イネは、同遺伝子座に部位特異的組換えに必要な配列を組込んでいるため、部位特異的組換えによるさらなるゲノム改変の可能性も有する。また、遺伝子の機能解析やゲノム動態の変化に伴った遺伝子発現の機構解明に貢献することができる。
また、相同組換えが生じた個体を植物体として再生させることも可能であり、その植物体は稔性も有するため、相同組換えを起こしたゲノムをホモで有する個体をも獲得することができる。
実施例
実施例１
コントロールベクターとＷａｘｙターゲットベクター
ベクター、ｐＲＩＴ（図２ａ）、ｐＩＮＡ１３４（図２ｂ）、ｐＲＷ（図２ｃ）の構築には、ｐＶＳ１に由来する、ｐＧＳＧｌｕｃベクター（Ｓａａｌｂａｃｈ Ｉ，Ｐｉｃｋａｒｄｔ Ｔ，Ｍａｃｈｅｍｅｈｌ Ｆ，
ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ ２Ｓ ａｌｂｕｍｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒａｚｉｌ ｎｕｔ（Ｂｅｔｈｏｌｌｅｔｉａ ｅｘｃｅｌｓａ Ｈ．Ｂ．Ｋ．）ｉｓ ｓｔａｂｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｇｒａｉｎ ｌｅｇｕｍｅｓ．Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２４２：２２６−２３６）のｒｅｐおよびｓｔａ領域、およびスペクチノマイシン耐性遺伝子を用いた。
実施例１−１
ｐＲＩＴの構築
ｐＧＳＧｌｕｃをＳａｌＩで消化して得られる約９．４ｋｂｐの断片をセルフライゲーションしｐＧＳ−ＳａｌＩを構築した。これをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＩＧ２２１（Ｔａｎａｋａ Ａ，Ｍｉｔａ Ｓ，Ｏｈｔａ Ｓ，Ｋｙｏｚｕｋａ Ｊ，Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ Ｋ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ（１９９０）Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ａ ｄｉｃｏｔ ｉｎｔｒｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｉｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｍＲＮＡ ａｎｄ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｒｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６７６７−６７７０）とライゲーションした後ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで消化して得られる１２．４ｋｂｐの断片を、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、ＢｇｌＩＩ部位を持つ合成リンカーを用いてセルフライゲーションし、ｐＧＳＩＧを得た。ｐＡｃｈ１（Ｂｉｌａｎｇ Ｒ，Ｉｉｄａ Ｓ，Ｐｅｔｅｒｈａｎｓ Ａ，Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｉ，Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ Ｊ（１９９１）Ｔｈｅ ３’−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ−Ｂ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ｉｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ．Ｇｅｎｅ １００：２４７−２５０）からイネのＡｃｔｉｎ１プロモーター、その第１イントロン、ｈｐｈ遺伝子およびＣａＭＶ３５Ｓターミネーターを含む２．６ｋｂｐの断片を切りだし、ｐＧＳＩＧのＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、右ボーダーと左ボーダー間に、第１イントロンを持つイネＡｃｔｉｎ１プロモーター制御下のｈｐｈ遺伝子（ＡｃｔＰ−ｉｎｔ−ｈｐｈ ｇｅｎｅ）と、ＣａＭＶ３５Ｓ制御下のｇｕｓＡ遺伝子を持つｐＲＩＴを構築した。
実施例１−２
ｐＩＮＡ１３４の構築
ジフテリア毒素Ａ鎖遺伝子（ＤＴ−Ａ遺伝子）は、ｐＭＣ１ＤｐＡ（Ｙａｇｉ Ｔ，Ｉｋａｗａ Ｙ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｋ，Ｓｈｉｇｅｔａｎｉ Ｙ，Ｔａｋｅｄａ Ｎ，Ｍａｂｕｃｈｉ Ｉ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ，Ａｉｚａｗａ Ｓ（１９９０）Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｔ ｃ−ｆｙｎ ｌｏｃｕｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｕｓｅ ｏｆ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ Ａ−ｆｒａｇｍｅｎｔ ｇｅｎｅ ｉｎ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９９１８−９９２２）をテンプレートとしたＰＣＲによって断片を獲得し、ｐＣＫＲ１３８（Ｉｚａｗａ Ｔ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｃ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｍ，Ｔｅｒａｄａ Ｒ，Ｉｉｄａ Ｓ，ａｎｄ Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ Ｋ（１９９１）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｉｚｅ ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔ Ａｃ ｉｎ ｒｉｃｅ（Ｏｒｉｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）．Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２２７：３９１−３９６）のｈｐｈ遺伝子のコーディング部分と置換することにより、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＤＴ−Ａ、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーターを接続し、プラスミドｐ３５ＳＰ−ＤＴ−Ａを構築した。ＣａＭＶ３５ＳプロモーターとＤＴ−Ａ遺伝子の間にヒマカタラーゼイントロン（Ｏｈｔａ Ｓ，Ｍｉｔａ Ｓ，Ｈａｔｔｏｒｉ Ｔ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ（１９９０）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｏｆ ａ β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ＧＵＳ）ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ｉｎｔｒｏｎ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３１：８０５−８１３）を挿入し、ｐ３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａを構築した。挿入する断片はＰＣＲによって獲得した。ｐＡＨＣ２７（Ｔａｋｉｍｏｔｏ Ｉ，Ｃｈｒｉｔｓｔｅｎｓｅｎ ＡＨ，Ｑｕａｉｌ ＰＨ，Ｕｃｈｉｍｉｙａ Ｈ，Ｔｏｋｉ Ｓ（１９９４）Ｎｏｎ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｔｒｅｓｓ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｍａｉｚｅ ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｇｅｎｅ（Ｕｂｉ−１）ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６：１００７−１０１２）をＰｓｔＩで消化して得られるトウモロコシＵｂｉｑｕｉｔｉｎ１プロモーターとその第１イントロンを含む２．０ｋｂの断片と、ｐ３５ＳＰ−ＤＴ−ＡのＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを置換し、プラスミドｐＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａを構築した。Ｔｎ９３０（Ｇｒｉｎｄｌｅｙ ＮＤＦ ａｎｄ Ｊｏｙｃｅ ＣＭ（１９８１）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｋａｎａｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｔｎ９０３．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４５：１２５−１３３）由来のカナマイシン耐性遺伝子をｐＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−ＡのＣａＭＶ３５Ｓターミネーターの３‘末端にＤＴ−Ａと同方向になるように挿入し、そのカナマイシン耐性遺伝子の３’末端にｐ３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａのプロモーターからターミネーターまで含む断片を逆向きに挿入し、ｐＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ／３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａを構築した。ｐＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ／３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａのカナマイシン耐性遺伝子中に有るＨｉｎｄＩＩＩ部位をＨｉｎｄＩＩＩによる消化および平滑末端化、セルフライゲーションにより除去し、ｐＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ／３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ（ΔＨｉｎｄＩＩＩ）を構築した。ｐＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ／３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ（ΔＨｉｎｄＩＩＩ）のＵｂｉｑｕｉｔｉｎ１プロモーターからＣａＭＶ３５Ｓプロモーターにはさまれる領域をＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、ｐＧＳ−ＳａｌＩのＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ｐＧＳ−ＳａｌＩ−ＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ／３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａを構築した。構築後、ＨｉｎｄＩＩＩで部分消化してリンカー（５’−ＡＧＣ ＴＧＧ ＧＡＴ ＣＣＣ−３’）を挿入することにより、２ヶ所あるＨｉｎｄＩＩＩ部位をそれぞれ除去し、ｐＧＳ−ＳａｌＩ−ＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ／３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ（ΔＨｉｎｄＩＩＩ）を構築した。
トウモロコシのＥｎ／Ｓｐｍトランスポゾン（Ｇｉｅｒｌ Ａ，Ｓｃｈｗａｒｚ−Ｓｏｍｍｅｒ Ｚ，ａｎｄ Ｓａｅｄｌｅｒ Ｈ（１９８５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎ−Ｉｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｚｅａ ｍａｙｓ．ＥＭＢＯ Ｊ．４：５７９−５８３）の転写終止領域は、ＰＣＲによって１．０ｋｂの断片として合成し、ｐＡｃｈ１のＣａＭＶ３５Ｓターミネーターの３‘末端に挿入してｐＡｃｈ１−Ｅｎ／Ｓｐｍを構築した。バクテリオファージＰ１（Ｋａｎｅｇａｅ Ｙ，Ｌｅｅ Ｇ，Ｓａｔｏ Ｙ，Ｔａｎａｋａ Ｍ，Ｎａｋａｉ Ｍ，Ｓａｋａｋｉ Ｔ，Ｓｕｇａｎｏ Ｓ ａｎｄ Ｓａｉｔｏ Ｉ（１９９５）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３：３８１６−３８２１）由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換え系のｌｏｘＰ配列と、ターゲティングベクターを構築する際に相同配列を挿入するクローニング部位は、ＰＣＲによって合成し、ｐＡｃｈ１−Ｅｎ／ＳｐｍのＡｃｔＰ−ｉｎｔ−ｈｐｈ−Ｅｎ／Ｓｐｍ遺伝子の５’末端と３‘末端に挿入し、ｐＡｃｈ１−Ｅｎ／Ｓｐｍ２を構築した。これをｐＧＳ−ＳａｌＩ−ＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ／３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ（ΔＨｉｎｄＩＩＩ）のカナマイシン耐性遺伝子の領域と置換してｐＩＮＡ１３４を構築した。
実施例１−３
ｐＲＷの構築
日本稲品種「シモキタ」のＷａｘｙ遺伝子とその周辺領域６７ｋｂを含むＢＡＣクローン、１２３−Ｄ４をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｗａｘｙ遺伝子を含む１４．７ｋｂの断片をｐＢＣ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏ．）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。これをＸｂａＩで消化し、得られる６．３ｋｂ、６．１８ｋｂの断片をそれぞれｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏ．）のＸｂａＩ部位に挿入し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ−Ｗａｘｙ６．３ｋｂおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ−Ｗａｘｙ６．８ｋｂを構築した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ−Ｗａｘｙ６．８ｋｂの３’側のマルチクローニング部位にあるＮｏｔＩ部位にＡｓｃＩリンカーを挿入した後、ＳｍａＩおよびＡｓｃＩで消化して得られる６．８ｋｂの断片をｐＩＮＡ１３４のＰｍｅＩおよびＡｓｃＩ部位間に挿入し、ｐＩＮＡ−Ｗａｘｙ６．８ｋｂを構築した。Ｗａｘｙ遺伝子のプロモーター領域を含む６．３ｋｂの断片を持つｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔはＨｉｎｄＩＩＩで消化し、得られる６．３ｋｂの断片をｐＩＮＡ−Ｗａｘｙ６．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、Ｗａｘｙターゲティングベクター、ｐＲＷを構築した。
これらのベクターは、それぞれＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＥＨＡ１０１株（Ｈｏｏｄ ＥＥ，Ｆｒａｌｅｙ ＲＴ，Ｃｈｉｌｔｏｎ Ｍ−Ｄ（１９８６）Ｔｈｅ ｈｙｐｅｒ−ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ Ａ２８１ ｏｎ ｌｅｇｕｍｅｓ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８３：５２９−５３４）にエレクトロポレーション法（Ｓａｍｂｏｏｋ，Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）により導入した。
実施例２ 形質転換
アグロバクテリウムを用いた形質転換の多くはＨｉｅｉら（Ｈｉｅｉ Ｙ，Ｏｈｔａ Ｓ，Ｋｏｍａｒｉ Ｔ，Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ Ｔ（１９９４）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ−ＤＮＡ．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：２７１−２８２）の方法に従った。ただし、イネの培養には、Ｇｅｌｒｉｔｅの代わりにＡｇａｒｏｓｅ Ｔｙｐｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）を用いた。日本晴れの完熟種子を用いてカルスを誘導した。種子は、籾を取り除き、７０％エタノールに１分浸漬した後、２．５％ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｔｅに２０分間浸漬して滅菌した。その後滅菌水ですすぎ、Ａｇａｒｏｓｅ Ｔｒｙｐｅ Ｉを用いた２Ｎ６培地に移し、暗所、２８℃で３−４週間培養した。その後別の２Ｎ６培地に移し、３−７日間培養した。
ｐＲＩＴ、ｐＩＮＡ１３４、ｐＲＷをそれぞれ保有するアグロバクテリウムＥＨＡ１０１株は、１２５ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを含むＡＢ培地（Ｃｈｉｌｔｏｎ ＭＤ，Ｃｕｒｒｉｅｒ ＴＣ，Ｆａｒｒａｎｄ ＳＫ，Ｂｅｎｄｉｃｈ ＡＪ，Ｇｏｒｄｏｎ ＭＰ，Ｎｅｓｔｅｒ ＥＷ（１９７４）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＤＮＡ ａｎｄ ＰＳ８ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ＤＮＡ ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｃｒｏｗｎ ｇａｌｌ ｔｕｍｏｒｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７１：３６７２−３６７６）上で２８℃、３日間培養した。培養後、集菌し、４００μＭアセトシリンゴンを含むＡＡＭ溶液（Ｈｉｅｉ Ｙ，Ｏｈｔａ Ｓ，Ｋｏｍａｒｉ Ｔ，Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ Ｔ（１９９４）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ−ＤＮＡ．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：２７１−２８２）に懸濁し、１−２時間、２８℃、１００ｒｐｍで振盪した。バクテリアの濃度をＯＤ６００＝０．１８に調整した溶液にカルスを３−４分間浸漬し、過剰のバクテリアを滅菌したペーパータオルで取り除いた後に、４００μＭのアセトシリンゴンを含む０．８％Ａｇａｒｏｓｅ Ｔｙｐｅ Ｉの２Ｎ６−ＡＳ培地に移し、暗所、２８℃で３日間培養した。５００ｍｇ／ｌのセフォタキシムを含む滅菌水でカルスを洗い、滅菌したペーパータオルで過剰の水分を取り除いた後に、５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、５００ｍｇ／ｌセフォタキシムを含む０．８％Ａｇａｒｏｓｅ Ｔｙｐｅ Ｉの２Ｎ６−ＣＨ培地に移し、暗所、２８℃で３−４週間培養した。継続的に増殖するカルスの数を数え、２Ｎ６−ＣＨ溶液を入れたマルチウェル・プレートにそれぞれのカルスを移し、以後の解析に用いた。
ｐＲＷの形質転換におけるポジティブ・ネガティブ選抜の形質転換効率とエスケープ・カルス（ハイグロマイシン耐性であるが、相同組換えを起こしていないカルス）の数を調べるために、ｐＲＩＴおよびｐＩＮＡ１３４の形質転換から得られたカルスの数をｐＲＷの場合と比較した。これは、感染前のカルスの生重と得られたカルスの数に基づいて行った。各実験では、４００粒の完熟種子から健康な約４０ｇＦＷ（グラム生重）のカルスが得られた。１−５ｇＦＷのカルスをｐＲＩＴ、ｐＩＮＡ１３４の形質転換に用い、残りをｐＲＷのために用いた。２Ｎ６−ＣＨ上で選抜した後、ハイグロマイシン耐性のカルスの数を数えた。
カルスの再分化には、ＭＳ塩（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ．Ｆ．（１９６２）Ａ ｒｅｖｉｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｂｉｏａｓｓａｙｓ ｗｉｔｈ ｔｏｂａｃｃｏ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５，４７３）、３０ｇ／ｌスクロース、３０ｇ／ｌソルビトール、１ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、２ｍｇ／ｌ ＢＡＰ、５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、５００ｍｇ／ｌセフォタキシム、０．８％Ａｇａｒｏｓｅ Ｔｙｐｅ Ｉを含むＭＳＲＥ培地を用いた。再分化した植物体は、３０ｇ／ｌスクロース、５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、５００ｍｇ／ｌセフォタキシム、０．８％Ａｇａｒｏｓｅ Ｔｙｐｅ Ｉを含むＭＳ培地で生育させ、その後温室へ移した。
実施例３
ターゲティングされたカルスの検出
３０ｍｇＦＷのカルスを２ｍｌ容のプラスティック・チューブに入れ、直径３ｍｍの陶器製の玉（Ｎｉｋｋａｔｏ Ｃｏ．）を５個と０．５ｍｌのＣＴＡＢ溶液（Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ．Ｋｕｒａｂｏ Ｃｏ．）を加えて、ＦａｓｔＰｒｅｐ ｔｉｓｓｕｅ ｃｒｕｓｈｅｒ（ＦＰ１２０；Ｂｉｏ １０１ Ｃｏ．）で速度６．５、２０秒間粉砕した。これを６５℃で０．５−２時間保温し、自動ＤＮＡ抽出装置（ＮＡ２０００．Ｋｕｒａｂｏ Ｃｏ．）によってＤＮＡを抽出、精製した。葉の場合は１０ｍｇＦＷの葉を用い、チューブごと液体窒素で凍結し、葉を簡単に粉砕した後にＦａｓｔＰｒｅｐ ｔｉｓｓｕｅ ｃｒｕｓｈｅｒで、速度６．５、１０秒間粉砕した。他の操作は、カルスの場合と同様にＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、２６０ｎｍの吸収により定量した。ＰＣＲはＬＡ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ Ｃｏ．）を用いた。反応条件は、９４℃、１分、１サイクル、９４℃、１分、６０℃、２０分、３２サイクル、７２℃、１０分、１サイクルで行った。相同組換えの確認用には、プライマーとしてＨ１Ｆ；５’−ＧＴＡ ＴＡＡ ＴＧＴ ＡＴＧ ＣＴＡ ＴＡＣ ＧＡＡ ＧＴＴ ＡＴＧ ＴＴＴ−３’とＷ２Ｒ；５’−ＧＴＴ ＴＧＧ ＴＣＡ ＴＡＴ ＴＡＴ ＧＴＡ ＣＴＴ ＡＡＧ ＣＴＡ ＡＧＴ−３’を用いた。Ｗａｘｙ遺伝子の元のプロモーターを確認するためには、Ｐｒｏ１；５’−ＡＣＡ ＣＡＡ ＡＴＡ ＡＣＴ ＧＣＡ ＧＴＣ ＴＣ−３’とＥｘ２；ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＧＡ ＣＧＴ ＧＧＴ ＧＡＧ ＡＧＣ ＣＧＡ ＣＡＴ Ｇ−３’を用いた。増幅したＤＮＡは０．６％アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウム・ブロマイドを用いて可視化した。
実施例４
胚乳と花粉のヨード染色
胚乳はカミソリで切断した。約は裂開直前に採取し、染色前に固定溶液（酢酸：エタノール＝１：３ｖ／ｖ）で処理した。胚乳と花粉は、ヨード溶液（０．１８％（ｗ／ｖ）ヨード、１％（ｗ／ｖ）ヨウ化カリウム）で染色した。
実施例５
ａ．サザンブロット分析
日本晴れおよび形質転換体のＤＮＡは、緑葉からＣＴＡＢ法で抽出し、精製した（Ｍｕｒｒａｙ ＭＧ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＷＦ．（１９８０）Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｐｌａｎｔ ＤＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ８：４３２１−４３２５）。ＢＡＣクローン１２３−Ｄ４のプラスミドＤＮＡは核酸抽出キット（Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ．Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏ．）で単離した。ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＭｕｎＩ、ＥｃｏＲＶで単離したＤＮＡをそれぞれ消化し、０．７％アガロースゲルを用いて分離し、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏ．）に転写した。プラスミド、Ａｄｈ１−ａｎｔｉＷｘをＥｃｏＲＩで消化して得られる２．７ｋｂｐの断片をｃＷｘ２．７プローブとして利用した。ｃＷｘ２．７プローブは２．３ｋｂのＷａｘｙコーディング領域と約４００ｂｐのＷａｘｙ第１イントロンを含んでいる。プラスミド、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ−Ｗａｘｙ６．３ｋｂをＸｈｏＩで消化して得られる４．１ｋｂｐの断片をｐＷｘ４．１プローブとして利用した。これらの断片はジゴキシゲニンで標識した（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）。Ｆ１Ｈｍ；５’−ＧＴＡ ＧＧＴ ＡＧＡ ＣＣＧ ＧＧＧ ＧＣＡ ＡＴＧ ＡＧ−３’およびＲ２Ｈｍ；５’−ＡＣＧ ＣＣＣ ＧＡＣ ＡＧＴ ＣＣＣ ＧＧＣ ＴＣＣ ＧＧ−３’をプライマーとして、ＰＣＲ ＤＩＧ ｐｒｏｂｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｃｏ．）用いてｈｐｈ遺伝子の標識プローブを作成した。ＰＣＲの条件は、９４℃、２分、１サイクル、９４℃、３０秒、６０℃、４５秒、６８℃、４５秒を３８サイクル、７２℃、３分、１サイクルで行った。ＤＮＡを転写した膜は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、２％ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）、０．２％ＳＤＳ、０．１％ラウリルサルコシンを含む溶液に標識した断片を加え、４２℃でハイブリダイズした。ハイブリダイズしたプローブは、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と抗ジゴキシゲニン・アルカリフォスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて検出した。
ｂ．組換え領域の塩基配列解析
形質転換体の緑葉から単離したＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃、１０分、１サイクル、９４℃、０．５分、５５℃、０．５分、７２℃、１分、３６サイクル、７２℃、１０分、１サイクルで行った。
プライマーは、ＷｘＲ−Ｆ１；５’−ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＴＴＧ ＡＴＧ ＣＡＴ ＡＣ−３’およびＷｘＲ−Ｒ１３９１；５’−ＧＡＣ ＡＧＧ ＡＣＡ ＡＧＡＧ ＣＴＧ ＡＧＧ ＧＧＡ ＡＣ−３’、ＷｘＲ−Ｆ１２７６；５’−ＴＡＴ ＡＡＴ ＧＧＣ ＣＣＡ ＧＡＧ ＴＡＧ ＴＡ−３’およびＷｘＲ−Ｒ１７８８；５’−ＴＴＧ ＣＣＣ ＡＧＴ ＴＧＣ ＣＣＡ ＡＡＧ ＡＡ−３’、ＷｘＲ−Ｆ１７１３；５’−ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＣＴ ＣＣＴ ＣＴＣ ＣＣＴ ＴＴＣ Ｔ−３’およびＷｘＲ−Ｒ２３９６；５’−ＴＣＣ ＴＴＧ ＧＡＴ ＴＡＴ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＡ−３’、ＷｘＲ−Ｆ２３６３；５’−ＣＣＡ ＡＴＣ ＣＡＡ ＴＣＣ ＡＡＴ ＣＣＡ ＴＣＡ Ｃ−３’およびＷｘＲ−Ｒ２９２５；５’−ＣＣＣ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＴＣ ＣＣＴ ＴＴＴ ＧＡＣ Ｃ−３’、ＷｘＲ−Ｆ２８８７；５’−ＴＧＧ ＴＧＴ ＴＧＴ ＣＣＴ ＴＣＴ ＧＴＧ ＧＴＣ Ａ−３’およびＷｘＲ−Ｒ３８３１；５’−ＣＧＴ ＣＧＴ ＣＧＴ ＣＧＧ ＧＧＴ ＴＣＡ ＧＧＴ Ａ−３’、ＷｘＲ−Ｆ３５０９；５’−ＧＴＣ ＡＧＣ ＣＴＣ ＣＣＴ ＣＴＣ ＣＣＴ ＴＣＴ Ｃ−３’およびＷｘＲ−Ｒ４７０１；５’−ＴＡＣ ＡＧＣ ＣＧＴ ＧＧＧ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＡＴ Ａ−３’、ＷｘＲ−Ｆ４４５１；５’−ＡＡＧ ＴＣＡ ＡＡＴ ＴＡＧ ＣＣＡ ＣＧＴ ＡＧ−３’およびＷｘＲ−Ｒ５６２５；５’−ＣＧＧ ＣＴＴ ＧＧＣ ＧＴＡ ＣＧＴ ＴＧＣ ＡＴ−３’、ＷｘＲ−Ｆ５４４７；５’−ＣＡＣ ＧＣＡ ＣＡＣ ＣＣＣ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＣ−３’およびＷｘＲ−Ｒ７８９９；５’−ＣＴＴ ＧＧＧ ＴＴＡ ＡＡＡ ＴＣＴ ＴＧＣ ＧＡ−３’、ＷｘＲ−Ｆ７６７５；５’−ＡＡＣ ＴＧＴ ＴＣＴ ＴＧＡ ＴＣＡ ＴＣＧ ＣＡ−３’およびＷｘＲ−Ｒ９８６７；５’−ＡＴＴ ＧＴＡ ＴＡＣ ＣＧＴ ＴＣＣ ＧＴＡ ＴＣ−３’、ＷｘＲ−Ｆ９７０９；５’−ＡＧＧ ＡＧＡ ＡＧＴ ＡＴＣ ＣＧＧ ＧＣＡ ＡＧ−３’およびＷｘＲ−Ｒ１２４６５；５’−ＴＣＴ ＴＧＡ ＣＴＴ ＧＴＣ ＣＣＧ ＧＡＣ ＣＡＴ−３’、ＷｘＲ−Ｆ１４６５４；５’−ＣＴＴ ＡＴＡ ＴＴＧ ＴＧＧ ＧＡＣ ＧＧＡ ＧＡ−３’およびＷｘＲ−Ｒ１５０２２；５’−ＡＧＡ ＡＧＣ ＣＴＡ ＡＴＡ ＴＡＣ ＣＡＣ ＧＡ−３’、ＷｘＲ−Ｆ−２８４；５’−ＡＴＧ ＣＡＡ ＴＧＡ ＧＡＡ ＧＡＴ ＣＴＧ ＴＡ−３’およびＷｘＲ−Ｒ２０９；５’−ＴＣＴ ＴＡＴ ＡＡＧ ＣＣＧ ＧＡＧ ＴＣＴ ＴＧ−３’の１２組を用いてそれぞれ反応を行った。得られた１２種の断片の配列をＢｉｇＤｙｅＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖ３．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ登録商標 ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ登録商標 ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（共にＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）および各種プライマーを用いて解読した。
実施例６
効果的なポジティブ・ネガティブ選抜のために、ハイグロマイシン・フォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）をポジティブ選抜マーカーとして、ジフテリア毒素Ａ鎖遺伝子（ＤＴ−Ａ；Ｐａｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ，ＡＭ Ｊｒ（１９７７）Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４６：６９−９４）をネガティブ選抜マーカーとして選んだ。ＤＴ−Ａは植物を含む真核生物に毒性を持っており、これはエロンゲーション・ファクターのＡＤＰリボシル化を介したタンパク質合成を阻害することによる（Ｙａｇｉ Ｔ，Ｉｋａｗａ Ｙ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｋ，Ｓｈｉｇｅｔａｎｉ Ｙ，Ｔａｋｅｄａ Ｎ，Ｍａｂｕｃｈｉ Ｉ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ，Ａｉｚａｗａ Ｓ（１９９０）Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｔ ｃ−ｆｙｎ ｌｏｃｕｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｕｓｅ ｏｆ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ Ａ−ｆｒａｇｍｅｎｔ ｇｅｎｅ ｉｎ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ｕｓａ ８７：９９１８−９９２２、Ｃｚａｋｏ Ｍ ａｎｄ Ａｎ Ｇ（１９９１）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ ｃｈａｉｎ Ａ ｉｓ ｔｏｘｉｃ ｔｏ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ９５：６８７−６９２、Ｂｅｌｌｅｎ ＨＪ，Ｄ’ｅｖｅｌｙｎ Ｄ，Ｈａｒｖｅｙ Ｍ，Ｅｌｌｅｄｇｅ ＳＪ（１９９２）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１４ ７８７−７９６）。形質転換頻度を調査するために、ポジティブ・コントロールベクターとしてｐＲＩＴを、ネガティブ・コントロールベクターとしてｐＩＮＡ１３４を使用した。ｐＲＷと同様、ｐＲＩＴおよびｐＩＮＡ１３４もｈｐｈをポジティブ選抜マーカーとして持っており、形質転換効率をできるだけ高めるために、イネａｃｔｉｎ１プロモーターとその第１イントロンを使用した。
ｐＲＩＴを用いて形質転換を行ったところ、４００粒の完熟種子より１５００の独立したカルスが得られことを確認した。ネガティブ選抜の効果を調べるために同様の方法でｐＩＮＡ１３４を形質転換したところ、９９％以上の致死率を確認した。ＰＣＲによる解析により、生存できなかったカルスはＤＴ−Ａ遺伝子を持つことが示唆された。ｐＩＮＡ１３４を形質転換して生き残ったカルスの多くは、ＤＴ−Ａ遺伝子の一部または全体を欠失してＴ−ＤＮＡが組み込まれていた。これらの結果は、高い活性を持つプロモーターに接続したＤＴ−Ａ遺伝子がイネのネガティブ選抜に有効であることを示唆している。また、２つのＤＴ−Ａ遺伝子を離れて配置することにより、２つのＤＴ−Ａ遺伝子が共に削られて組み込まれる確率が極めて低いことも示唆している。
ＷａｘｙターゲットベクターであるｐＲＷを用いて形質転換を行った。この際、形質転換効率、ポジティブ・ネガティブ選抜効果を確認するために、同時にｐＲＩＴおよびｐＩＮＡ１３４も形質転換に用い、得られたハイグロマイシン耐性カルスの数を数えた。表１に示すように、６回の形質転換実験で、平均すると、一回当たりｐＲＩＴの場合は約１５００、ｐＩＮＡ１３４は約６０、ｐＲＷは約１００のカルスが得られた。
Ｈ１ＦとＷ２Ｒプライマーを組み合わせたＰＣＲによってＷａｘｙ座位の相同組換えを確認した。Ｈ１Ｆプライマーは、Ｅｎ／Ｓｐｍ配列の３‘末にあるｌｏｘＰ配列を、Ｗ２Ｒプライマーは相同組換えが起こる領域の外の配列をコードしている。相同組換えが起こったカルスに対してこれらのプライマーを用いれば、約８ｋｂの断片の増幅が確認できる。６回の実験で得られた合計６３０の生存カルスをこれらのプライマーで解析し、６個の独立した陽性カルス（ラインＡ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）を見出した。表１に示すように、各実験で得られたカルスのうち、平均１００分の１のカルスがＰＣＲで陽性であった。一方、まれに異なる鎖長の断片が増幅されることもあった。これは不規則な組み込みやＤＴ−Ａ遺伝子が欠失して組み込まれたものであると考えられる。
ＰＣＲで陽性であった６個体の再生植物（ラインＡ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）の緑葉からＤＮＡを単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｕｎＩおよびＥｃｏＲＶで消化してサザン解析を行った。組換え前は１４．７ｋｂのＷａｘｙ断片が、ＰＣＲで陽性であった組換え体では６．３ｋｂと１２．１ｋｂに変化していた。これは、相同組換えにより第１イントロン部分にＨｉｎｄＩＩＩ部位が挿入されたことによる。６．３ｋｂの断片はＷａｘｙプロモーター領域、ｐＷ４．１とハイブリダイズし、１２．１ｋｂの断片はｈｐｈ遺伝子のコーディング領域、Ｈｍ０．９およびＷａｘｙ遺伝子のコーディング領域、ｃＷｘ２．７とハイブリダイズした。同様のことはＭｕｎＩ、ＥｃｏＲＶを用いた解析からも確認できた。また、検出されたシグナルの強さから、すべての個体で対立遺伝子の片方のみで相同組換えが起こっていると推察された。
相同組換えされたカルス（ラインＡ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）すべては、植物体に再生することができ、稔性があり、種子が得られた。このうちＡ−Ｉについて、ヨード染色とＰＣＲにより、Ｗａｘｙ遺伝子の分離を解析した。Ｗａｘｙ遺伝子を持つ日本晴れの花粉と種子の澱粉は、アミロースとアミロペクチンから成り、ヨード染色により濃紺色に染まる。一方、ｗａｘｙ遺伝子を持つ糯米の澱粉はアミロペクチンのみから成り、赤茶色に染まる。Ａ−Ｉは、濃紺色に染まった花粉と赤茶色との比は１：１であった。また、得られた種子５３粒を染色したところ、１３粒が赤茶色に染まった。Ａ−ＩＩ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆの種子を用いて同様の実験を行ったところ、染色の比率はＡ−Ｉとほぼ同様であった。これらは、Ａ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆの個体ではＷａｘｙ対立遺伝子の片方のみで相同組換えが起こったことを示唆している。次に、得られた種子の遺伝子型を区別するために、種子を発芽させ、緑葉からＤＮＡを単離し、ＰＣＲ解析を行った。相同組換えを起こしたことを確認するためには、プライマー、Ｈ１ＦおよびＷ２Ｒを、元のＷａｘｙ座位の検出にはＰｒｏ１およびＥｘ２を用いた。Ｐｒｏ１とＥｘ２は、第１イントロン付近の１．３ｋｂの断片を増幅する。ＰＣＲ解析の結果、ヨード染色による表現型とＰＣＲ解析による遺伝子型は完全に一致し、濃紺色に染まった種子のうち２７粒は遺伝子型がヘテロであった。つまり、Ｆ１個体では遺伝子型が１：２：１で分離しており、相同組換えは対立遺伝子の片側のみで起こったことが示された。加えて、相同組換えが起こった遺伝子が次世代に正確に遺伝することが示された。
ゲノム遺伝子に予期せぬ再構成が生じた結果、Ｗａｘｙ遺伝子が機能しなくなった可能性もあるため、ｈｐｈ−Ｅｎ／Ｓｐｍ遺伝子がＷａｘｙの第１イントロンに正確に組み込まれていることをサザン分析により確認した。Ａ−Ｉの後代はＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＭｕｎＩおよびＥｃｏＲＶで、Ａ−ＩＩ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆの後代はそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｕｎＩおよびＥｃｏＲＶでゲノムＤＮＡを消化して分析に用いた。また解析にはそれぞれ複数の個体を用いた。これらの制限酵素は、日本晴れとシモキタのＷａｘｙ座位間で多型が無く、ｈｐｈ−Ｅｎ／Ｓｐｍ遺伝子にも存在することから選定した。プローブにはｐＷ４．１、Ｈｍ０．９、ｃＷｘ２．７を用いた。その結果、予想通りの鎖長の断片がすべてのＦ１個体で確認され、目的通りの相同組換えが起こり、後代に正確に遺伝していることが分かった。
ラインＡ−Ｉ、Ｂ、Ｃの個体の後代で組換え領域がホモである個体のゲノムＤＮＡを用い、相同組換えを起こしたと予想されるＷａｘｙ領域の塩基配列を解読し、予定外の欠失、挿入等の変異、異常が全く起こっていないことを確認した。
以上のように、独立の６回の実験で得られた６個体の形質転換体のサザン解析、Ｆ１個体のＰＣＲ解析、表現型と遺伝子型、サザン分析の分離様式およびラインＡ−Ｉ、ＢおよびＣの組換え領域の配列解析結果から、得られたイネは正確に相同組換えが起こったものであることが示された。また、この遺伝子改変法に再現性のあることが示された。
ａ．１−５ｇＦＷのカルスを用いたｐＲＩＴの形質転換で得られたハイグロマイシン耐性カルスの数を、ｐＲＷの形質転換に用いたカルスの重量（約４０ｇＦＷ）相当に換算した数。
ｂ．１−５ｇＦＷのカルスを用いたｐＩＮＡ１３４の形質転換で得られるハイグロマイシン耐性カルスの数をｐＲＷの形質転換に用いたカルスの重量（約４０ｇＦＷ）相当に換算した数。
ｃ．４０ｇＦＷのカルスを用いたｐＲＷの形質転換で得られたハイグロマイシン耐性カルスの数
ｄ．＜８．６ｘ１０−４
参考文献
上記文献の他、以下の文献を参考文献とした。
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（３）ＭｃＥｌｒｏｙ Ｄ，Ｂｌｏｗｅｒｓ ＡＤ，Ｊｅｎｅｓ Ｂ，Ｗｕ Ｒ（１９９１）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ａｃｔｉｎ（Ａｃｔ１）５’ｒｅｇｉｏｎ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｍｏｎｏｃｏｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２３１：１５０−１６０
（４）Ｎｅｌｓｏｎ，ＯＥ（１９６２）Ｔｈｅ Ｗａｘｙ ｌｏｃｕｓ ｉｎ ｍａｉｚｅ．Ｉ．Ｉｎｔｒａｌｏｃｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｂｙ ｐｏｌｌｅｎ ａｎｄ ｂｙ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４７：７３７−７４２
（５）Ｗｅｓｓｌｅｒ，ＳＲ，Ｖａｒａｇｏｎａ，ＭＪ（１９８５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｗａｘｙ ｌｏｃｕｓ ｏｆ ｍａｉｚｅ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｉｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ｕｓａ ８２：４１７７−４１８１
（６）ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ ６１８７９９４，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９７６５６１３
（７）国際公開番号ＷＯ９９２５８２１、国際出願番号ＷＯ９８ＵＳ２４６１０（８）ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ ５４６４７６４，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ０１４０８３
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、イネＷａｘｙ遺伝子を例とした高等植物ゲノム改変の概念図を示す。ａ．は、導入遺伝子とＷａｘｙ遺伝子間で相同組み換えが生じる際の模式図であり、ｂ．は、Ｗａｘｙ座に相同組み換えが生じた際の模式図である。
図２は、ゲノム改変用ベクターの模式図を示す。ａ．は、コントロールベクター、ｂ．は、基本ベクターｐＩＮＡ１３４、ｃ．は、Ｗａｘｙ遺伝子改変用ベクターの模式図である。図中、ｐＵｂｉはトウモロコシ・ユビキチン１プロモーター、ｉＵｂｉはトウモロコシ・ユビキチン１第１イントロン、ＤＴはジフテリア毒素タンパク質Ａ鎖、ｌｏｘはバクテリオファージのＣｒｅ／ｌｏｘ組換えのｌｏｘ配列、ｐＡｃｔはイネ・アクチンプロモーター、ｉＡｃｔはイネ・アクチン第１イントロン、ｈｐｈはハイグロマイシン耐性遺伝子、ｔ３５Ｓはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓターミネーター、Ｅｎ／ＳｐｍはＥｎ／Ｓｐｍ型トランスポゾンの転写終止領域、ｉＣａｔはヒマ・カタラーゼ遺伝子の第１イントロン、ｐ３５Ｓはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、およびｔＮｏｓはノパリンシンセターゼターミネーターを表す。
図３は、ｐＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ、ｐ３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ、およびｐＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ／３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ（ΔＨｉｎｄＩＩＩ）の模式を示す。
図４は、ｐＧＳ−ＳａｌＩ．ｐＧＳ−ＳａｌＩ−ＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ／３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ（ΔＨｉｎｄＩＩＩ）の模式を示す。
図５は、ベクターｐＩＮＡ１３４の構築模式図であり、ｐＡｃｈ１−Ｅｎ／ＳｐｍおよびｐＡｃｈ１−Ｅｎ／Ｓｐｍ２の模式を示す。
図６は、Ｗａｘｙ座、ベクター、および相同組換え後の物理地図模式図を示す。
図７は、相同組み換え個体の解析を示す。ａは、ＨＩＦ、Ｗ２Ｒプライマーを用いたＰＣＲによる解析を示す。また、ＰＣＲで陽性であった個体の再生植物の緑葉からＤＮＡを単離し、ＨｉｎｄＩＩＩまたはＭｕｎＩで消化してサザン解析を行った結果を示す。ｂは、ＨｉｎｄＩＩＩを用いたゲノムサザン解析を示す。ｃは、ＭｕｎＩを用いたゲノムサザン解析を示す。図中、ＲＣＶは陽性コントロールベクターおよびＮは非組換え体を表し、Ａ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｅ、ＦはそれぞれラインＡ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆの個体を表す。
図８は、ヨード染色の結果を示す。
図９は、相同組換え個体の再生の様子を示す。ａは、ハイグロマイシン耐性カルス、ｂは再生イネ、およびｃは出穂後の再生イネを示す。
本発明は、相同組換えを利用した高等植物でのゲノム改変するための遺伝子構築物、および該遺伝子構築物を含む植物形質転換用ベクターを用いてゲノム改変高等植物を製造する方法に係り、植物が本来持つゲノム配列をターゲットとして、本来の遺伝子座位を変えることなく、高効率かつ再現性良く相同組換えの生じた個体を獲得することができる方法に関する。
従来の技術
高等植物の内、双子葉植物への遺伝子導入には、病原菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（アグロバクテリウムツメファシエンス）の感染時におこるＴｉプラスミド中のＴ−ＤＮＡの植物細胞への移行と染色体組込みを利用した方法がよく使われ、Ｔｉプラスミドから遺伝子導入に必要な領域だけを残して大腸菌との間を往復可能にした小さなバイナリーベクターが開発されている。単子葉植物では、プロトプラストへのエレクトロポレーションなどによるＤＮＡの直接導入法が一般的に使われるが、アグロバクテリウム感染法による成功例もある。
しかし、これらの方法では、導入遺伝子の染色体上の位置およびコピー数がランダムであり、そのために導入外来遺伝子の位置効果や、コサプレッション（共抑制）、ジーン・サイレンシング等の諸現象により、導入遺伝子を期待どおりに発現させることは困難であった。
また、ＴＯＳ１７により遺伝子を破壊する方法で、レトロトランスポゾンを利用して遺伝子破壊を行う方法がある（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ ａｓ ｇｅｎｅｔｉｃｔｏｏｌｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｂｉｏｌｏｇｙ．２００１ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：１２７−１３４）。この方法は、ゲノムを改変できるが、レトロトランスポゾンはゲノム上の不特定の場所に転移するため、狙い通りのゲノム改変植物体を得ることは非常に労力を要する。さらに、遺伝子を破壊することは可能であるが、任意に変異を導入したり、置換したりすることは不可能な技術である。
Ｔ−ＤＮＡタギング法は、アグロバクテリウム法によりＴ−ＤＮＡをゲノムに挿入し、遺伝子破壊を行う方法である（Ｐｌａｎｔ ｔａｇｎｏｌｏｇｙ．１９９９ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４：９０−９６）。この方法は、ＴＯＳ１７と同様、Ｔ−ＤＮＡはゲノム上の不特定の場所に挿入されるため、狙い通りのゲノム改変植物体を得ることは非常に労力を要する。さらに、遺伝子を破壊することは可能であるが、任意に変異を導入したり、置換したりすることは不可能な技術である。
ＲＮＡ／ＤＮＡのキメラ・オリゴヌクレオチドを利用した方法で、Ｚｈｕ Ｔらにより、ＲＮＡ／ＤＮＡのキメラ・オリゴヌクレオチドを利用して、トウモロコシのゲノム上の遺伝子に一塩基置換を導入し、除草剤耐性を付与したことが報告されている（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｕｓｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＲＮＡ／ＤＮＡｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９９ Ｊｕｌ ２０；９６（１５）：８７６８−７３）。この技術は、内在の遺伝子の極小さな領域に変異を導入することはできるが、大きな領域の改変には適用できない。
そこで、外来遺伝子を期待通りに発現させることができる可能性を有する方法として相同組換えを利用したゲノム改変法がある。これは、挿入したい外来遺伝子を相同遺伝子領域で挟んで、その両側で相同組換えを起こさせる方法である。相同組換えとは、相同な２本のＤＮＡ鎖の間でつなぎ換えが行われることをいう。
一方、植物のゲノム構造は動物に比べ繰返し配列が多く、特に体細胞では相同組換えが抑制されている可能性があると考えられている。アラビドプシスやタバコにおいては、ゲノムに人為的に設定したマーカー遺伝子を標的とした相同組換えが行われ、その頻度は１０−４〜１０−６と推定されている（Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ．ＥＭＢＯ Ｊ １９８８ ７：４０２１−４０２６，Ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ Ｊ １９９０ ９：３０７７−３０８４，Ｎｏｎｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ＤＮＡ ａｎｄ ａ ｐｌａｎｔ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃｕｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９３ ９０：７３４６−７３５０）。
しかし、このような高等植物での相同組換えを利用したゲノム改変法は、以下の萌芽的実験結果がいくつか報告されているのみである。これらの実験結果は、ｉ）人為的に設定した遺伝子マーカーを用いた場合と、ｉｉ）植物が本来もつゲノム配列をターゲットとしたものに分けられる。
ｉ）人為的に設定した遺伝子マーカーを用いた報告には以下のものがある。
相同組換えの頻度を上げるため、大腸菌のＲｅｃＡ遺伝子、ＲｕｖＣ遺伝子の発現や酵母菌のＨＯエンドヌクレアーゼ遺伝子やＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子によるＤＮＡ二重鎖切断の導入がタバコやアラビドプシスのゲノム上に人為的に設定したマーカー遺伝子の相同組換えを促進することが報告されている（ＲｅｃＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９６ ９３：３０９４−３０９８，Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｅｓｏｌｖａｓｅ ＲｕｖＣ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９９ ９６：７３９８−７４０２，Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｉｎｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ ＨＯ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １９９６ ８：２０５７−２０６６，Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ ｉｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｉｎｔｏ ＤＮＡ ｂｙ ａ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９３ ２１：５０３４−５０４０）。
Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ Ｊらは、タバコのプロトプラストを材料として、相同組換えによるゲノム改変に成功したことを報告している。これが植物で初めての成功例である。これにより、植物でも相同組換えによるゲノム改変の可能性が示された。ここでは、欠失させた機能しないカナマイシン耐性遺伝子（ポジティブ選抜マーカー）を最初にゲノムに組み込ませ、その細胞を材料として欠失部分を回復させる遺伝子を再度導入し、カナマイシン耐性でスクリーニングを行うという選抜システムを利用している（Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ．ＥＭＢＯ Ｊ １９８８ ７：４０２１−４０２６）。
Ｒｉｓｓｅｅｕｗ Ｅらは、タバコを材料としてアグロバクテリウム法による形質転換を行い、相同組換えを起こした培養細胞を１ライン得たと報告している。彼らは、まずＧＵＳ遺伝子およびｃｏｄＡ遺伝子をゲノムに組み込ませ、次にその形質転換細胞を材料とし、相同組換えが生じるとＧＵＳ遺伝子の一部とｃｏｄＡ遺伝子が欠失し、新たにカナマイシン耐性遺伝子が組み込まれるような遺伝子を用いて再度形質転換し、５−フルオロシトシン感受性、カナマイシン耐性、ＧＵＳ活性、ＰＣＲ法により相同組換えを起こした細胞を選抜し、サザンブロット法により確認している（Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔ−ＤＮＡ ｌｏｃｉ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｅ．Ｐｌａｎｔ Ｊ １９９７ Ａｐｒ；１１（４）：７１７−２８）。
Ｏｆｆｒｉｎｇａ Ｒらは、タバコ培養細胞を材料とし、アグロバクテリウム法を用いて遺伝子組換えを行い、相同組換えが起こったラインを１系統得たと報告している。これにより、アグロバクテリウム法が相同組換えによる植物ゲノムの改変に利用可能であることが示された。再現性については示されていない。彼らも一部を欠失させたカナマイシン耐性遺伝子をまずゲノムに組み込ませ、次にその細胞を材料として補完部分の遺伝子を用いて再度形質転換し、カナマイシンへの耐性とＰＣＲ法により相同組換えを起こした細胞を選抜し、サザンブロット法により確認している（Ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ Ｊ １９９０ Ｏｃｔ；９（１０）：３０７７−８４）。
Ｈａｌｆｔｅｒ Ｕらは、アラビドプシスのプロトプラストを材料とし、ＰＥＧ法を用いて遺伝子組換えを行い、相同組換えが起こった４個体を得たと報告している。彼らは一部を欠失させたハイグロマイシン耐性遺伝子をまずゲノムに組み込ませ、次にその細胞を材料として補完部分の遺伝子を用いて再度形質転換し、ハイグロマイシンへの耐性とＰＣＲ法により相同組換えを起こした細胞を選抜し、サザンブロット法により確認している（Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ．Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ １９９２ Ｊａｎ；２３１（２）：１８６−９３）。
ｉｉ）一方、植物が本来もつゲノム配列をターゲットとして相同組換えによって改変した例としては、以下の二報があるのみである。
Ｍｉａｏ ＺＨらは、アラビドプシスの根を材料としてアグロバクテリウム法により形質転換し、形質転換培養細胞２５８０ラインから相同組換えが起こった１ラインを得ている。彼らは、ゲノム上のＴＧＡ３座にカナマイシン耐性遺伝子を相同組換えにより挿入している。これが植物本来のゲノムを相同組換えにより改変した初めての例である。彼らは、カナマイシン耐性による選抜に加え、相同組換えが起こらずに外来遺伝子が組み込まれた細胞にはβ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅを発現させることにより、より選抜効率を上げている。ＰＣＲ法やサザンブロット法も利用して相同組換え個体を確認している。しかし、この細胞からは植物体を得ることはできず、相同組換えを起こした領域をホモで有する個体を得ることは実現できていない（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＴＧＡ３ ｌｏｃｕｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ．Ｐｌａｎｔ Ｊ １９９５ Ｆｅｂ；７（２）：３５９−６５）。
Ｙａｎｏｆｓｋｙ ＭＦらは、アラビドプシスを材料としてアグロバクテリウム法により形質転換し、相同組換えが起こった１ラインを得たことを報告している。彼らは、ゲノム上のＡＧＬ５遺伝子にカナマイシン耐性遺伝子を挿入し、選抜にはカナマイシン耐性とＰＣＲ法を利用しており、７５０のカナマイシン耐性ラインから１ラインを得、最終的にサザンブロット法およびＰＣＲ法で確認している（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ １９９７ Ｏｃｔ ２３；３８９（６６５３）：８０２−３）。
また、相同組換えを試みたが、相同組換えを起こした細胞を得ることはできなかったという次のような報告もある。
Ｔｈｙｋｊａｅｒ Ｔらは、ハスを材料としてアグロバクテリウムを用いた相同組換えを試みている。その際、ｃｏｄＡ遺伝子をネガティブ選抜マーカーとして利用しており、それをＴ−ＤＮＡの片側、両側等に配置した数種のベクターを用いている。しかし相同組換えを起こした細胞を得ることはできていない（Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｕｓｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｌａｒｇｅ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９７ Ｎｏｖ；３５（４）：５２３−３０）。
Ｇａｌｌｅｇｏ ＭＥらは、アラビドプシスを材料とし、カナマイシン耐性遺伝子をポジティブ選抜マーカーとして、ｃｏｄＡ遺伝子をネガティブ選抜マーカーとして利用している。しかし１ｘ１０５の形質転換細胞から相同組換えを起こした細胞を得ることはできていない（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔ−ＤＮＡ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９９ Ｊａｎ；３９（１）：８３−９３）。
発明の概要
相同組換えを利用したゲノム改変法には種々の利点があることは先に述べた。しかしながら、高等植物において、相同組換えの頻度は極めて低い等の理由により、高等植物本来のゲノム配列を相同組換えによって改変した報告は、上記Ｍｉａｏ ＺＨらおよびＹａｎｏｆｓｋｙ ＭＦらの二例あるだけで、いずれの報告においても再現性と信頼性の高い相同組換えの方法は開示されていない。しかも、単子葉植物においては、農業上きわめて重要であるにもかかわらず成功例は一例もなく、高等植物における再現性と信頼性の高い相同組換え方法の開発が強く望まれていた。
以上から本発明の目的は、イネ等の単子葉植物を含む種々の高等植物の細胞で、外来遺伝子導入で生ずる導入遺伝子のコピー数や位置効果あるいはコサプレッション、ジーン・サイレンシング等による発現の不安定性等、従来の形質転換法の諸問題を解決し、改変を行おうとする遺伝子領域以外はゲノムに一切変化を起こさせずに形質転換を行う方法に用いる遺伝子構築物、植物ゲノム改変用ベクターおよび該方法により形質転換された細胞から、完全な形質転換植物を作出する方法を提供することである。
発明の詳細な説明
本発明は、Ｔ−ＤＮＡ由来のＢＲ（右ボーダー配列）とＢＬ（左ボーダー配列）の間に、下記の要素を、ＢＲから
（１）発現可能、好ましくは高発現可能に存在させた、第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子、
（２）宿主ゲノム中の標的遺伝子と相同組換えさせる遺伝子の５’領域を組み込むための第一のクローニング部位、
（３）発現可能、好ましくは高発現可能に存在させたポジティブ選抜マーカー遺伝子、
（４）宿主ゲノム中の標的遺伝子と相同組換えさせる遺伝子の３’領域を組み込むための第二のクローニング部位および
（５）発現可能、好ましくは高発現可能に存在させた、第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子と同一であってもよい第二のネガティブ選抜マーカー遺伝子
の順に含んでなる、相同組換えにより高等植物のゲノムを改変するための遺伝子構築物及び該構築物を含む植物形質転換用ベクターを提供する。
本発明における遺伝子構築物は、Ｔ−ＤＮＡのＢＲとＢＬの間において、確実に発現させるようにした、好ましくは高発現性のポジティブ選抜マーカーの５’上流と３’下流に、確実に発現させるようにした、好ましくは高発現性のネガティブ選抜マーカーを置き、ポジティプ選抜マーカーとネガティブ選抜マーカーの間に相同組換えのための配列を組み込むためのクローニング部位（好ましくはマルチプルクローニングサイト）を有する遺伝子構築物であり、これをアグロバクテリウム法による植物形質転換用ベクター中に組み込んだものを本明細書中では「基本ベクター」と呼ぶ（図２ｂ）。
Ｔ−ＤＮＡとは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ内で保持されているＴｉプラスミドの一部であり、植物がＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに感染すると、菌体自身は植物細胞に侵入しないが、菌体内に存在するＴｉプラスミドの一部であるＴ−ＤＮＡ領域が植物細胞内に転移される。Ｔ−ＤＮＡは、ＢＲ（右ボーダー配列）とＢＬ（左ボーダー配列）によって、区切られている。各ボーダー配列は、約２５ｂｐの不完全な反復配列からなる。
本発明の遺伝子構築物は、ネガティブ選抜マーカーおよびポジティブ選抜マーカーを含む。それは、高等植物の形質転換では非相同組換えにより遺伝子導入が生ずる頻度が極めて高く、相同組換え体を非相同組換え体から効率良く選抜する必要があるからであり、その選抜のため、これらのマーカーがネガティブ選抜法とポジティブ選抜法に用いられる。
ポジティブ選抜とは、遺伝子が導入されて形質転換された細胞を選抜する時に、当該遺伝子産物が発現している細胞のみが生き残る条件にて選抜する方法である。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を導入すれば、導入された細胞がネオマイシンの類似体であるＧ４１８耐性を有することにより選抜される。
ネガティブ選抜とは、遺伝子が導入されて形質転換された細胞を選抜する時に、当該遺伝子産物が発現している細胞が死滅する条件にて選抜する方法である。例えば、ヒトヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子を細胞に導入し、チミジン類似体であるガンシクロビアの存在下で選抜すると、チミジンキナーゼ遺伝子を発現している細胞が死滅する。
本発明においては、選抜法として、ポジティブ選抜法とネガティブ選抜法を組み合わせたポジティブ・ネガティブ選抜法を利用する。この選抜法は、まずポジティブ選抜マーカーによって形質転換体を選抜し、さらにネガティブ選抜マーカーによって相同組換え以外により生じた形質転換体が致死となることを利用して、非相同組換え体を除いて相同組換え体を選択的に拾い上げる方法であり、選抜効率を高めることができる。
ネガティブ選抜マーカーは、植物細胞に対して毒性があり、ベクターを操作するために用いる大腸菌やアグロバクテリウムに対して毒性がないことが必要であり、ジフテリア毒素タンパク質Ａ鎖遺伝子が好ましい。他にもネガティブ選抜マーカーとして利用できる遺伝子としては、ｃｏｄＡ遺伝子、シトクロムＰ−４５０遺伝子、ｂａｒｎａｓｅ遺伝子が挙げられる。
ネガティブ選抜マーカーに関しては、以下の報告がある。Ｋｏｐｒｅｋ Ｔらは、小麦のネガティブ選抜マーカーとしてｃｏｄＡ遺伝子と細菌由来のＰ−４５０が利用できることを報告している（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｂａｒｌｅｙ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ．）：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｄＡ−ａｎｄ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｇｅｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ Ｊ １９９９ Ｓｅｐ；１９（６）：７１９−２６）。寺田らは、イネのネガティブ選抜マーカーとして、ジフテリア毒素タンパク質遺伝子（ＤｘＴ−Ａ）が利用できることを報告している（イネでのジフテリア毒素タンパク（ＤｘＴ−Ａ）遺伝子のネガティブ選抜効果とジーンターゲティング法への応用．日本分子生物学会第２２回年会１９９９ Ｄｅｃ；：２Ｐ−０３４３）。
ポジティブ選抜マーカーとして好ましいものとして、ハイグロマイシン耐性遺伝子が挙げられる。他にもカナマイシン耐性遺伝子やイミダゾリン耐性遺伝子、グリフォセート耐性遺伝子、フォスフォマンノース−イソメラーゼ遺伝子、ブラストタイジンＳ耐性遺伝子、ｂａｒ遺伝子およびグリフォシネート耐性遺伝子等が挙げられる。
本発明の特徴の一つは、相同組換えの頻度の低い高等植物において、相同組換えが生じた細胞を効率よく選抜するため、ポジティブおよびネガティブ選抜マーカーの発現を確実にし、好ましくは高発現性とする点である。例えば、図２ｂおよび２ｃに示すように、ネガティブ選抜マーカーの発現を強化するために、プロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）にイントロンを接続して発現を強化し、または、単子葉植物で強い発現をするユビキチンプロモーターを使用する。一方、ポジティブ選抜マーカーの発現も好ましくは強化する。そのため、ポジティブ選抜マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を用いる場合は、ハイグロマイシン耐性遺伝子に対して発現の強いアクチンのプロモーターを使用するのが好ましい。これら選抜マーカーを高発現とするには、他にもトウモロコシユビキチンプロモーター、イネＰＬＤイントロン、ヒマカタラーゼイントロン等が使用できる。
本発明の別の特徴は、ネガティブ選抜マーカー遺伝子を、ＢＬ側とＢＲ側にそれぞれ使用することである。これらは異なる遺伝子であっても良いが、好ましくは同じ遺伝子である。本発明者らは、高等植物、特に単子葉植物でこれまで相同組換えを利用したゲノム改変が成功していなかった一つの理由は、非相同組換体の中には、ネガティブ選抜マーカー遺伝子が完全な形で組み込まれないものが相当数存在し、そのためネガティブ選抜の効率が低かったのではないかと考えた。本発明では、２つのネガティブ選抜マーカーを互いに離して使用することにより、非相同組換体が選抜工程で生き残る確率を十分に低くすることができる。
本発明の遺伝子構築物において、クローニング部位は、ポジティブ選抜マーカー遺伝子と第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子との間及び、第二のネガティブ選抜マーカー遺伝子との間の２カ所に存在させる。これらは、それぞれ標的遺伝子と相同組換えさせる遺伝子の５’領域及び３’領域を組込むのに適する限り、任意のクローニング部位であってよい。クローニング部位をマルチプルクローニング部位とすれば、任意の遺伝子の組込みに対応できるので好ましい。マルチプルクローニング部位は希望する制限酵素部位を持つオリゴＤＮＡを自由に設計、合成して使用することができる。
第一のクローニング部位には、相同組換えさせる遺伝子の５’領域を組込み、第二のクローニング部位には当該遺伝子の３’領域を組込む。
相同組換えさせる遺伝子は、特定のタンパク質をコードする構造遺伝子であってもよく、あるいは植物の表現形質に影響する他の遺伝子であってもよい。これらの遺伝子で、植物ゲノム中の標的とする遺伝子が機能しないようにする、または標的とする遺伝子を修飾して、組換体植物を改変することができる。標的とする遺伝子の非限定的な例として、Ｗａｘｙ遺伝子およびＥＰＳＰＳ遺伝子が挙げられる。
相同組換えさせる遺伝子の「５’領域」と「３’領域」の境界をどのように選ぶかについては特別の制限はない。例えば、標的の遺伝子の機能を抑制することを目的とする場合は、相同組換えさせる遺伝子はほぼ半々ないし、７：３〜３：７の長さに分けて、上流側を「５’領域」、下流側を「３’領域」としてよいが、一般的には各々の領域の長さは長い方が良い。但し、相同組換えを確実に行わせるため、各々の領域の長さは少なくとも１０００塩基よりも長くすることが好ましく、少なくとも５００塩基とする。
一方、標的遺伝子の機能の改変を目的とする場合には、相同組換えさせる遺伝子の「５’領域」と「３’領域」を各領域にわけて、それぞれのクローニング部位に挿入する。もし、相同組換えさせる遺伝子が適当なイントロンを有する場合は、イントロンの内部で５’領域と３’領域に分割することもできる。さらに、「５’領域」に相同組換えさせる遺伝子の発現に必要な機能を全部含む配列を用い、その下流に隣接する領域を「３’領域」として用いてもよいことは理解すべきである。逆に「３’領域」に相同組換えさせる遺伝子の機能を全部含む配列を用い、その上流の隣接領域を「５’領域」としてもよい。
遺伝子構築物は、ポジティブ選抜マーカーを形質転換植物の後代において部位特異的組換え系によって除くことができるように、要素（７）としてリコンビナーゼ認識配列（例えばＣｒｅ／ｌｏｘ組換え系のｌｏｘ配列、Ｒ／ＲＳ組換え系のＲＳ配列、またはＦＬＰ−ＦＲＴ組換え系のＦＲＴ配列）をポジティブ選抜マーカー遺伝子の前および後に加えることができる（図２ｂ、２ｃ）。Ｃｒｅ／ｌｏｘ組換え系は、Ｃｒｅリコンビナーゼとｌｏｘの組合せにより不要な部分を削除する方法である。Ｒ／ＲＳ組換え系は、Ｒ遺伝子がコードするリコンビナーゼとＲＳ配列の組合わせにより、２つのＲＳ配列に囲まれたＤＮＡ領域の欠失を誘導する方法である。また、ＦＬＰ−ＦＲＴ組換え系は、ＦＬＰリコンビナーゼとＦＲＴ配列の組合わせにより、２つのＦＲＴ配列に囲まれたＤＮＡ領域の欠失を誘導する方法である。
例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘ組換え系を加えた本発明の遺伝子構築物を用いて相同組換えした細胞に、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現させると、ゲノムの相同組換えを生じた領域内の二つのｌｏｘ配列にはさまれたポジティブ選抜マーカー遺伝子を含む配列が削除できる。Ｃｒｅリコンビナーゼを発現させ、ゲノム中の２つのｌｏｘ配列に挟まれた領域が削除すると、植物ゲノム中に相同組換えで導入した遺伝子の５’領域と３’領域を、該遺伝子が本来存在する状態に連結することができる。削除の有無は、ＰＣＲやサザンブロット法で確認できる。
カルスにＣｒｅリコンビナーゼを発現させ、ｌｏｘ配列間の領域を削除するには、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を遺伝子導入した別の植物と交配する、または相同組換えにより得られた植物体にＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を遺伝子導入することにより実現することができる。
Ｃｒｅとｌｏｘの組み合わせは、ｌｏｘ間の配列を削除するためだけでなく、修飾するために使用することができる。そのためには、まず、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を導入した組換え植物と交配してｌｏｘ間の配列を削除し、次にＣｒｅリコンビナーゼおよびｌｏｘ間に組込みたい遺伝子を有する組換え体と交配することによって、削除した後に残っているｌｏｘ配列部位に組込みたい遺伝子を挿入する。修飾の例としては、除草剤耐性遺伝子の挿入が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また標的とした遺伝子の発現の制御が目的の場合は、抑制効果を確実にするため、転写終止領域、好ましくはＥｎ／Ｓｐｍ型トランスポゾンの転写終止領域を要素（６）としてもつように設計することもできる（図２ｂ、２ｃ）。
上記要素（１）〜（５）および存在させる場合にはさらに要素（６）および／または（７）を所定の順序に連絡して、本発明の遺伝子構築物とすることは、通常の遺伝子工学技術で当業者が容易に行うことができる。さらに植物ゲノム中の標的遺伝子と相同組換えさせる遺伝子を選択し、その５’領域および３’領域をそれぞれ第一および第二のクローニング部位に挿入することも、当業者が通常の遺伝子工学技術で容易に行うことができる。
本発明の遺伝子構築物は、適当な制限酵素部位によって、アグロバクテリウム法による植物形質転換用のベクターのＴ−ＤＮＡ領域またはＢＲからＢＬまでの間の領域に置き換えて連絡する。得られたベクターは、本発明の基本ベクターである。この基本ベクターの第一および第二のクローニング部位に相同組換えさせる遺伝子の５’領域および３’領域をそれぞれ組込むと、本発明の遺伝子改変用ベクターとなる。
例えば、イネＷａｘｙ遺伝子およびその隣接領域を基本ベクターに導入すれば、イネＷａｘｙ遺伝子改変用ベクターが構築できる（図２ｃ）。
本発明はまた、下記の工程からなる相同組換えを利用したゲノム改変高等植物の製造方法を提供する：
（イ）本発明の遺伝子改変用ベクターを、Ｔｉプラスミドを含むアグロバクテリウム中に存在させ、
（ロ）当該アグロバクテリウムを植物の細胞、組織またはカルスに感染させ、
（ハ）ネガティブ選抜およびポジティブ選抜により、相同組み換えを生じた細胞、組織またはカルスを選抜し、
（ニ）選抜を細胞または組織で行った場合は、それをカルスに培養し、
（ホ）カルスを再生培地で培養して、ゲノム中にヘテロに相同組み換えを生じた植物個体に生長させ、そして
（ヘ）生じた植物を掛け合わせて、ホモに相同組み換えを有する、遺伝子改変高等植物を得る。
高等植物においては前述のように相同組換えの頻度は極めて低いため、上記（イ）〜（ロ）の工程は高頻度アグロバクテリウム形質転換法を用いて行うことが望ましい。遺伝子改変用ベクターを、高頻度アグロバクテリウム形質転換法によって、例えばイネ・カルスに導入し、ポジティブ・ネガティブ選抜法を適用して、相同組換えの生じた可能性の高いカルスを選抜する。高頻度アグロバクテリウム形質転換法とは、寺田らによりアグロバクテリウムによるイネ等への遺伝子導入技術を改良して得られた方法で、従来の５〜１０倍の効率で遺伝子導入できる手法である（高頻度の形質転換効率を示すイネ・アグロバクテリウム法の開発日本育種学会第９６回講演会１９９９ Ｓｅｐ；：２１２）。この方法は、バイナリーベクター系に基づき、高発現化したハイグロマイシン遺伝子を使用することを特徴としている。
ポジティブ・ネガティブ選抜は次の通りに行う。工程（ニ）で生じたカルスを、ポジティブ選抜用の培地に移す。培地は通常のカルス培養培地にポジティブ選抜用の成分を添加したものである。
ポジティブ選抜のために抗生物質耐性を利用する場合は、選抜用マーカー遺伝子で形質転換させていないカルスが生き残れない、または少なくとも増殖しない濃度の抗生物質を含ませておく。抗生物質がハイグロマイシンである場合は、培地１Ｌ当り１０〜２００ｍｇのハイグロマイシンを含ませる。
カルスを暗所、１５〜４０℃の条件で２〜３週間培養する。生き残ったカルスはポジティブ選抜用マーカー遺伝子を有し、且つネガティブ選抜用マーカー遺伝子をもたない相同組換えに成功したカルスの候補として選抜する。生き残ったカルスであるかの判断は、カルスの色、増殖の差異により行う。
さらにこれらの候補カルスが、目的とする遺伝子改変が生じているカルスであることを確認するためには、ＰＣＲ法による解析を行うことができる。
ＰＣＲ法による解析では、カルスの細胞からＤＮＡを抽出してＰＣＲを行う際、プライマーの一方は挿入遺伝子部分に結合し、他方のプライマーは挿入断片の境界を越えた遺伝子の部分配列と結合するようにデザインする。遺伝子挿入が起こらなかったかあるいは非相同組換えの起きた細胞ではプライマー対は互いに近傍には存在しないので、ＰＣＲによる断片の増幅は起こらない。しかし、相同組換えが起きた細胞では、両プライマーは互いに近接した位置に結合するため、予想通りのサイズの増幅断片を生じる。この断片が検出されれば、その細胞集団に相同組換えの起きた遺伝子が存在する可能性が高い。その細胞を小集団に分けＰＣＲにより再検討する。このサイクルを繰り返すことにより、相同組換えが生じた細胞を分離することができる。
さらに上記ＰＣＲ法に代えて、またはＰＣＲ法に引き続いて、詳細なサザンブロット法による解析を行い、遺伝子改変を確認することができる。
本発明の方法は、単子葉植物、例えばイネの相同組換えを、非常に効率よく行うことが可能である。実施例に示すように、好ましい態様においては、６回の実験で、各４００粒の種子からポジティブ・ネガティブ選抜後に平均１００以上のカルスが得られ、ここから少なくとも毎回１個体の遺伝子改変植物が得られている通り、本発明の方法は再現性と信頼性に優れている。
目的通り、遺伝子が改変されていることが確認されたカルスは、ＭＳ培地等の再生培地で培養して、ゲノム中にヘテロに相同組み換えを生じた植物個体を得ることができ、そして、花粉および種子における改変遺伝子の構造と発現を上記同様にＰＣＲ法および／またはサザンブロット法で解析することにより、遺伝子座で相同組換えがヘテロで起こっているか否かを確認する。
得られた植物体は稔性を有するため、生じた植物を自家受粉によりまたは他の個体と掛け合わせることにより、ホモに相同組み換えを有する遺伝子改変高等植物を得ることができる。
発明の効果
以上説明したように、本発明によれば、相同組換えの頻度が低く、非相同組換えにより遺伝子導入が生ずる頻度が極めて高い高等植物において、ネガティブ選抜マーカーを相同領域の両側に接続し、更にポジティブ選抜マーカーを利用したポジティブ・ネガティブ選抜を行い、植物が本来持つゲノム配列をターゲットとして、本来の遺伝子座位を変えることなく、得られたカルス中でおよそ１００分の１という割合で、しかも再現性良く相同組換えが起こる個体を獲得できる。
更に、本発明によれば、特定の遺伝子を自由自在に改変した形質転換植物を作出することができる。例えば本法によりイネの澱粉合成に関わるＷａｘｙ遺伝子の改変を行った場合には、Ｗａｘｙ遺伝子の発現を制御できるイネが得られる。遺伝子改変イネは、同遺伝子座に部位特異的組換えに必要な配列を組込んでいるため、部位特異的組換えによるさらなるゲノム改変の可能性も有する。また、遺伝子の機能解析やゲノム動態の変化に伴った遺伝子発現の機構解明に貢献することができる。
また、相同組換えが生じた個体を植物体として再生させることも可能であり、その植物体は稔性も有するため、相同組換えを起こしたゲノムをホモで有する個体をも獲得することができる。
実施例
実施例１
コントロールベクターとＷａｘｙターゲットベクター
ベクター、ｐＲＩＴ（図２ａ）、ｐＩＮＡ１３４（図２ｂ）、ｐＲＷ（図２ｃ）の構築には、ｐＶＳ１に由来する、ｐＧＳＧｌｕｃベクター（Ｓａａｌｂａｃｈ Ｉ，Ｐｉｃｋａｒｄｔ Ｔ，Ｍａｃｈｅｍｅｈｌ Ｆ，
実施例１−１
ｐＲＩＴの構築
ｐＧＳＧｌｕｃをＳａｌＩで消化して得られる約９．４ｋｂｐの断片をセルフライゲーションしｐＧＳ−ＳａｌＩを構築した。これをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＩＧ２２１（Ｔａｎａｋａ Ａ，Ｍｉｔａ Ｓ，Ｏｈｔａ Ｓ，Ｋｙｏｚｕｋａ Ｊ，Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ Ｋ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ（１９９０）Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ａ ｄｉｃｏｔ ｉｎｔｒｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｉｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｍＲＮＡ ａｎｄ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｒｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６７６７−６７７０）とライゲーションした後ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで消化して得られる１２．４ｋｂｐの断片を、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、ＢｇｌＩＩ部位を持つ合成リンカーを用いてセルフライゲーションし、ｐＧＳＩＧを得た。ｐＡｃｈ１（Ｂｉｌａｎｇ Ｒ，Ｉｉｄａ Ｓ，Ｐｅｔｅｒｈａｎｓ Ａ，Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｉ，Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ Ｊ（１９９１）Ｔｈｅ ３’−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ−Ｂ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ｉｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ．Ｇｅｎｅ １００：２４７−２５０）からイネのＡｃｔｉｎ１プロモーター、その第１イントロン、ｈｐｈ遺伝子およびＣａＭＶ３５Ｓターミネーターを含む２．６ｋｂｐの断片を切りだし、ｐＧＳＩＧのＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、右ボーダーと左ボーダー間に、第１イントロンを持つイネＡｃｔｉｎ１プロモーター制御下のｈｐｈ遺伝子（ＡｃｔＰ−ｉｎｔ−ｈｐｈ ｇｅｎｅ）と、ＣａＭＶ３５Ｓ制御下のｇｕｓＡ遺伝子を持つｐＲＩＴを構築した。
実施例１−２
ｐＩＮＡ１３４の構築
ジフテリア毒素Ａ鎖遺伝子（ＤＴ−Ａ遺伝子）は、ｐＭＣ１ＤｐＡ（Ｙａｇｉ Ｔ，Ｉｋａｗａ Ｙ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｋ，Ｓｈｉｇｅｔａｎｉ Ｙ，Ｔａｋｅｄａ Ｎ，Ｍａｂｕｃｈｉ Ｉ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ，Ａｉｚａｗａ Ｓ（１９９０）Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｔ ｃ−ｆｙｎ ｌｏｃｕｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｕｓｅ ｏｆ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ Ａ−ｆｒａｇｍｅｎｔ ｇｅｎｅ ｉｎ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９９１８−９９２２）をテンプレートとしたＰＣＲによって断片を獲得し、ｐＣＫＲ１３８（Ｉｚａｗａ Ｔ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｃ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｍ，Ｔｅｒａｄａ Ｒ，Ｉｉｄａ Ｓ，ａｎｄ Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ Ｋ（１９９１）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｉｚｅ ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔ Ａｃ ｉｎ ｒｉｃｅ（Ｏｒｉｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）．Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２２７：３９１−３９６）のｈｐｈ遺伝子のコーディング部分と置換することにより、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＤＴ−Ａ、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーターを接続し、プラスミドｐ３５ＳＰ−ＤＴ−Ａを構築した。ＣａＭＶ３５ＳプロモーターとＤＴ−Ａ遺伝子の間にヒマカタラーゼイントロン（Ｏｈｔａ Ｓ，Ｍｉｔａ Ｓ，Ｈａｔｔｏｒｉ Ｔ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ（１９９０）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｏｆ ａ β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ＧＵＳ）ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ｉｎｔｒｏｎ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３１：８０５−８１３）を挿入し、ｐ３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａを構築した。挿入する断片はＰＣＲによって獲得した。ｐＡＨＣ２７（Ｔａｋｉｍｏｔｏ Ｉ，Ｃｈｒｉｔｓｔｅｎｓｅｎ ＡＨ，Ｑｕａｉｌ ＰＨ，Ｕｃｈｉｍｉｙａ Ｈ，Ｔｏｋｉ Ｓ（１９９４）Ｎｏｎ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｔｒｅｓｓ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｍａｉｚｅ ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｇｅｎｅ（Ｕｂｉ−１）ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６：１００７−１０１２）をＰｓｔＩで消化して得られるトウモロコシＵｂｉｑｕｉｔｉｎ１プロモーターとその第１イントロンを含む２．０ｋｂの断片と、ｐ３５ＳＰ−ＤＴ−ＡのＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを置換し、プラスミドｐＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａを構築した。Ｔｎ９３０（Ｇｒｉｎｄｌｅｙ ＮＤＦ ａｎｄ Ｊｏｙｃｅ ＣＭ（１９８１）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｋａｎａｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｔｎ９０３．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４５：１２５−１３３）由来のカナマイシン耐性遺伝子をｐＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−ＡのＣａＭＶ３５Ｓターミネーターの３‘末端にＤＴ−Ａと同方向になるように挿入し、そのカナマイシン耐性遺伝子の３’末端にｐ３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａのプロモーターからターミネーターまで含む断片を逆向きに挿入し、ｐＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ／３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａを構築した。ｐＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ／３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａのカナマイシン耐性遺伝子中に有るＨｉｎｄＩＩＩ部位をＨｉｎｄＩＩＩによる消化および平滑末端化、セルフライゲーションにより除去し、ｐＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ／３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ（ΔＨｉｎｄＩＩＩ）を構築した。ｐＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ／３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ（ΔＨｉｎｄＩＩＩ）のＵｂｉｑｕｉｔｉｎ１プロモーターからＣａＭＶ３５Ｓプロモーターにはさまれる領域をＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、ｐＧＳ−ＳａｌＩのＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ｐＧＳ−ＳａｌＩ−ＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ／３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａを構築した。構築後、ＨｉｎｄＩＩＩで部分消化してリンカー（５’−ＡＧＣ ＴＧＧ ＧＡＴ ＣＣＣ−３’）を挿入することにより、２ヶ所あるＨｉｎｄＩＩＩ部位をそれぞれ除去し、ｐＧＳ−ＳａｌＩ−ＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ／３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ（ΔＨｉｎｄＩＩＩ）を構築した。
トウモロコシのＥｎ／Ｓｐｍトランスポゾン（Ｇｉｅｒｌ Ａ，Ｓｃｈｗａｒｚ−Ｓｏｍｍｅｒ Ｚ，ａｎｄ Ｓａｅｄｌｅｒ Ｈ（１９８５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎ−Ｉｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｚｅａ ｍａｙｓ．ＥＭＢＯ Ｊ．４：５７９−５８３）の転写終止領域は、ＰＣＲによって１．０ｋｂの断片として合成し、ｐＡｃｈ１のＣａＭＶ３５Ｓターミネーターの３‘末端に挿入してｐＡｃｈ１−Ｅｎ／Ｓｐｍを構築した。バクテリオファージＰ１（Ｋａｎｅｇａｅ Ｙ，Ｌｅｅ Ｇ，Ｓａｔｏ Ｙ，Ｔａｎａｋａ Ｍ，Ｎａｋａｉ Ｍ，Ｓａｋａｋｉ Ｔ，Ｓｕｇａｎｏ Ｓ ａｎｄ Ｓａｉｔｏ Ｉ（１９９５）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３：３８１６−３８２１）由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換え系のｌｏｘＰ配列と、ターゲティングベクターを構築する際に相同配列を挿入するクローニング部位は、ＰＣＲによって合成し、ｐＡｃｈ１−Ｅｎ／ＳｐｍのＡｃｔＰ−ｉｎｔ−ｈｐｈ−Ｅｎ／Ｓｐｍ遺伝子の５’末端と３‘末端に挿入し、ｐＡｃｈ１−Ｅｎ／Ｓｐｍ２を構築した。これをｐＧＳ−ＳａｌＩ−ＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ／３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ（ΔＨｉｎｄＩＩＩ）のカナマイシン耐性遺伝子の領域と置換してｐＩＮＡ１３４を構築した。
実施例１−３
ｐＲＷの構築
日本稲品種「シモキタ」のＷａｘｙ遺伝子とその周辺領域６７ｋｂを含むＢＡＣクローン、１２３−Ｄ４をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｗａｘｙ遺伝子を含む１４．７ｋｂの断片をｐＢＣ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏ．）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。これをＸｂａＩで消化し、得られる６．３ｋｂ、６．１８ｋｂの断片をそれぞれｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏ．）のＸｂａＩ部位に挿入し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ−Ｗａｘｙ６．３ｋｂおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ−Ｗａｘｙ６．８ｋｂを構築した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ−Ｗａｘｙ６．８ｋｂの３’側のマルチクローニング部位にあるＮｏｔＩ部位にＡｓｃＩリンカーを挿入した後、ＳｍａＩおよびＡｓｃＩで消化して得られる６．８ｋｂの断片をｐＩＮＡ１３４のＰｍｅＩおよびＡｓｃＩ部位間に挿入し、ｐＩＮＡ−Ｗａｘｙ６．８ｋｂを構築した。Ｗａｘｙ遺伝子のプロモーター領域を含む６．３ｋｂの断片を持つｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔはＨｉｎｄＩＩＩで消化し、得られる６．３ｋｂの断片をｐＩＮＡ−Ｗａｘｙ６．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、Ｗａｘｙターゲティングベクター、ｐＲＷを構築した。
これらのベクターは、それぞれＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＥＨＡ１０１株（Ｈｏｏｄ ＥＥ，Ｆｒａｌｅｙ ＲＴ，Ｃｈｉｌｔｏｎ Ｍ−Ｄ（１９８６）Ｔｈｅ ｈｙｐｅｒ−ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ Ａ２８１ ｏｎ ｌｅｇｕｍｅｓ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８３：５２９−５３４）にエレクトロポレーション法（Ｓａｍｂｏｏｋ，Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）により導入した。
実施例２ 形質転換
アグロバクテリウムを用いた形質転換の多くはＨｉｅｉら（Ｈｉｅｉ Ｙ，Ｏｈｔａ Ｓ，Ｋｏｍａｒｉ Ｔ，Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ Ｔ（１９９４）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ−ＤＮＡ．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：２７１−２８２）の方法に従った。ただし、イネの培養には、Ｇｅｌｒｉｔｅの代わりにＡｇａｒｏｓｅ Ｔｙｐｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）を用いた。日本晴れの完熟種子を用いてカルスを誘導した。種子は、籾を取り除き、７０％エタノールに１分浸漬した後、２．５％ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｔｅに２０分間浸漬して滅菌した。その後滅菌水ですすぎ、Ａｇａｒｏｓｅ Ｔｒｙｐｅ Ｉを用いた２Ｎ６培地に移し、暗所、２８℃で３−４週間培養した。その後別の２Ｎ６培地に移し、３−７日間培養した。
ｐＲＩＴ、ｐＩＮＡ１３４、ｐＲＷをそれぞれ保有するアグロバクテリウムＥＨＡ１０１株は、１２５ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを含むＡＢ培地（Ｃｈｉｌｔｏｎ ＭＤ，Ｃｕｒｒｉｅｒ ＴＣ，Ｆａｒｒａｎｄ ＳＫ，Ｂｅｎｄｉｃｈ ＡＪ，Ｇｏｒｄｏｎ ＭＰ，Ｎｅｓｔｅｒ ＥＷ（１９７４）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＤＮＡ ａｎｄ ＰＳ８ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ＤＮＡ ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｃｒｏｗｎ ｇａｌｌ ｔｕｍｏｒｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７１：３６７２−３６７６）上で２８℃、３日間培養した。培養後、集菌し、４００μＭアセトシリンゴンを含むＡＡＭ溶液（Ｈｉｅｉ Ｙ，Ｏｈｔａ Ｓ，Ｋｏｍａｒｉ Ｔ，Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ Ｔ（１９９４）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ−ＤＮＡ．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：２７１−２８２）に懸濁し、１−２時間、２８℃、１００ｒｐｍで振盪した。バクテリアの濃度をＯＤ６００＝０．１８に調整した溶液にカルスを３−４分間浸漬し、過剰のバクテリアを滅菌したペーパータオルで取り除いた後に、４００μＭのアセトシリンゴンを含む０．８％Ａｇａｒｏｓｅ Ｔｙｐｅ Ｉの２Ｎ６−ＡＳ培地に移し、暗所、２８℃で３日間培養した。５００ｍｇ／ｌのセフォタキシムを含む滅菌水でカルスを洗い、滅菌したペーパータオルで過剰の水分を取り除いた後に、５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、５００ｍｇ／ｌセフォタキシムを含む０．８％Ａｇａｒｏｓｅ Ｔｙｐｅ Ｉの２Ｎ６−ＣＨ培地に移し、暗所、２８℃で３−４週間培養した。継続的に増殖するカルスの数を数え、２Ｎ６−ＣＨ溶液を入れたマルチウェル・プレートにそれぞれのカルスを移し、以後の解析に用いた。
ｐＲＷの形質転換におけるポジティブ・ネガティブ選抜の形質転換効率とエスケープ・カルス（ハイグロマイシン耐性であるが、相同組換えを起こしていないカルス）の数を調べるために、ｐＲＩＴおよびｐＩＮＡ１３４の形質転換から得られたカルスの数をｐＲＷの場合と比較した。これは、感染前のカルスの生重と得られたカルスの数に基づいて行った。各実験では、４００粒の完熟種子から健康な約４０ｇＦＷ（グラム生重）のカルスが得られた。１−５ｇＦＷのカルスをｐＲＩＴ、ｐＩＮＡ１３４の形質転換に用い、残りをｐＲＷのために用いた。２Ｎ６−ＣＨ上で選抜した後、ハイグロマイシン耐性のカルスの数を数えた。
カルスの再分化には、ＭＳ塩（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ．Ｆ．（１９６２）Ａ ｒｅｖｉｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｂｉｏａｓｓａｙｓ ｗｉｔｈ ｔｏｂａｃｃｏ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５，４７３）、３０ｇ／ｌスクロース、３０ｇ／ｌソルビトール、１ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、２ｍｇ／ｌ ＢＡＰ、５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、５００ｍｇ／ｌセフォタキシム、０．８％Ａｇａｒｏｓｅ Ｔｙｐｅ Ｉを含むＭＳＲＥ培地を用いた。再分化した植物体は、３０ｇ／ｌスクロース、５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、５００ｍｇ／ｌセフォタキシム、０．８％Ａｇａｒｏｓｅ Ｔｙｐｅ Ｉを含むＭＳ培地で生育させ、その後温室へ移した。
実施例３
ターゲティングされたカルスの検出
３０ｍｇＦＷのカルスを２ｍｌ容のプラスティック・チューブに入れ、直径３ｍｍの陶器製の玉（Ｎｉｋｋａｔｏ Ｃｏ．）を５個と０．５ｍｌのＣＴＡＢ溶液（Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ．Ｋｕｒａｂｏ Ｃｏ．）を加えて、ＦａｓｔＰｒｅｐ ｔｉｓｓｕｅ ｃｒｕｓｈｅｒ（ＦＰ１２０；Ｂｉｏ １０１ Ｃｏ．）で速度６．５、２０秒間粉砕した。これを６５℃で０．５−２時間保温し、自動ＤＮＡ抽出装置（ＮＡ２０００．Ｋｕｒａｂｏ Ｃｏ．）によってＤＮＡを抽出、精製した。葉の場合は１０ｍｇＦＷの葉を用い、チューブごと液体窒素で凍結し、葉を簡単に粉砕した後にＦａｓｔＰｒｅｐ ｔｉｓｓｕｅ ｃｒｕｓｈｅｒで、速度６．５、１０秒間粉砕した。他の操作は、カルスの場合と同様にＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、２６０ｎｍの吸収により定量した。ＰＣＲはＬＡ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ Ｃｏ．）を用いた。反応条件は、９４℃、１分、１サイクル、９４℃、１分、６０℃、２０分、３２サイクル、７２℃、１０分、１サイクルで行った。相同組換えの確認用には、プライマーとしてＨ１Ｆ；５’−ＧＴＡ ＴＡＡ ＴＧＴ ＡＴＧ ＣＴＡ ＴＡＣ ＧＡＡ ＧＴＴ ＡＴＧ ＴＴＴ−３’とＷ２Ｒ；５’−ＧＴＴ ＴＧＧ ＴＣＡ ＴＡＴ ＴＡＴ ＧＴＡ ＣＴＴ ＡＡＧ ＣＴＡ ＡＧＴ−３’を用いた。Ｗａｘｙ遺伝子の元のプロモーターを確認するためには、Ｐｒｏ１；５’−ＡＣＡ ＣＡＡ ＡＴＡ ＡＣＴ ＧＣＡ ＧＴＣ ＴＣ−３’とＥｘ２；ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＧＡ ＣＧＴ ＧＧＴ ＧＡＧ ＡＧＣ ＣＧＡ ＣＡＴ Ｇ−３’を用いた。増幅したＤＮＡは０．６％アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウム・ブロマイドを用いて可視化した。
実施例４
胚乳と花粉のヨード染色
胚乳はカミソリで切断した。約は裂開直前に採取し、染色前に固定溶液（酢酸：エタノール＝１：３ｖ／ｖ）で処理した。胚乳と花粉は、ヨード溶液（０．１８％（ｗ／ｖ）ヨード、１％（ｗ／ｖ）ヨウ化カリウム）で染色した。
実施例５
ａ．サザンブロット分析
日本晴れおよび形質転換体のＤＮＡは、緑葉からＣＴＡＢ法で抽出し、精製した（Ｍｕｒｒａｙ ＭＧ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＷＦ．（１９８０）Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｐｌａｎｔ ＤＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ８：４３２１−４３２５）。ＢＡＣクローン１２３−Ｄ４のプラスミドＤＮＡは核酸抽出キット（Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ．Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏ．）で単離した。ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＭｕｎＩ、ＥｃｏＲＶで単離したＤＮＡをそれぞれ消化し、０．７％アガロースゲルを用いて分離し、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏ．）に転写した。プラスミド、Ａｄｈ１−ａｎｔｉＷｘをＥｃｏＲＩで消化して得られる２．７ｋｂｐの断片をｃＷｘ２．７プローブとして利用した。ｃＷｘ２．７プローブは２．３ｋｂのＷａｘｙコーディング領域と約４００ｂｐのＷａｘｙ第１イントロンを含んでいる。プラスミド、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ−Ｗａｘｙ６．３ｋｂをＸｈｏＩで消化して得られる４．１ｋｂｐの断片をｐＷｘ４．１プローブとして利用した。これらの断片はジゴキシゲニンで標識した（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）。Ｆ１Ｈｍ；５’−ＧＴＡ ＧＧＴ ＡＧＡ ＣＣＧ ＧＧＧ ＧＣＡ ＡＴＧ ＡＧ−３’およびＲ２Ｈｍ；５’−ＡＣＧ ＣＣＣ ＧＡＣ ＡＧＴ ＣＣＣ ＧＧＣ ＴＣＣ ＧＧ−３’をプライマーとして、ＰＣＲ ＤＩＧ ｐｒｏｂｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｃｏ．）用いてｈｐｈ遺伝子の標識プローブを作成した。ＰＣＲの条件は、９４℃、２分、１サイクル、９４℃、３０秒、６０℃、４５秒、６８℃、４５秒を３８サイクル、７２℃、３分、１サイクルで行った。ＤＮＡを転写した膜は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、２％ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）、０．２％ＳＤＳ、０．１％ラウリルサルコシンを含む溶液に標識した断片を加え、４２℃でハイブリダイズした。ハイブリダイズしたプローブは、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と抗ジゴキシゲニン・アルカリフォスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて検出した。
ｂ．組換え領域の塩基配列解析
形質転換体の緑葉から単離したＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃、１０分、１サイクル、９４℃、０．５分、５５℃、０．５分、７２℃、１分、３６サイクル、７２℃、１０分、１サイクルで行った。
プライマーは、ＷｘＲ−Ｆ１；５’−ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＴＴＧ ＡＴＧ ＣＡＴ ＡＣ−３’およびＷｘＲ−Ｒ１３９１；５’−ＧＡＣ ＡＧＧ ＡＣＡ ＡＧＡＧ ＣＴＧ ＡＧＧ ＧＧＡ ＡＣ−３’、ＷｘＲ−Ｆ１２７６；５’−ＴＡＴ ＡＡＴ ＧＧＣ ＣＣＡ ＧＡＧ ＴＡＧ ＴＡ−３’およびＷｘＲ−Ｒ１７８８；５’−ＴＴＧ ＣＣＣ ＡＧＴ ＴＧＣ ＣＣＡ ＡＡＧ ＡＡ−３’、ＷｘＲ−Ｆ１７１３；５’−ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＣＴ ＣＣＴ ＣＴＣ ＣＣＴ ＴＴＣ Ｔ−３’およびＷｘＲ−Ｒ２３９６；５’−ＴＣＣ ＴＴＧ ＧＡＴ ＴＡＴ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＡ−３’、ＷｘＲ−Ｆ２３６３；５’−ＣＣＡ ＡＴＣ ＣＡＡ ＴＣＣ ＡＡＴ ＣＣＡ ＴＣＡ Ｃ−３’およびＷｘＲ−Ｒ２９２５；５’−ＣＣＣ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＴＣ ＣＣＴ ＴＴＴ ＧＡＣ Ｃ−３’、ＷｘＲ−Ｆ２８８７；５’−ＴＧＧ ＴＧＴ ＴＧＴ ＣＣＴ ＴＣＴ ＧＴＧ ＧＴＣ Ａ−３’およびＷｘＲ−Ｒ３８３１；５’−ＣＧＴ ＣＧＴ ＣＧＴ ＣＧＧ ＧＧＴ ＴＣＡ ＧＧＴ Ａ−３’、ＷｘＲ−Ｆ３５０９；５’−ＧＴＣ ＡＧＣ ＣＴＣ ＣＣＴ ＣＴＣ ＣＣＴ ＴＣＴ Ｃ−３’およびＷｘＲ−Ｒ４７０１；５’−ＴＡＣ ＡＧＣ ＣＧＴ ＧＧＧ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＡＴ Ａ−３’、ＷｘＲ−Ｆ４４５１；５’−ＡＡＧ ＴＣＡ ＡＡＴ ＴＡＧ ＣＣＡ ＣＧＴ ＡＧ−３’およびＷｘＲ−Ｒ５６２５；５’−ＣＧＧ ＣＴＴ ＧＧＣ ＧＴＡ ＣＧＴ ＴＧＣ ＡＴ−３’、ＷｘＲ−Ｆ５４４７；５’−ＣＡＣ ＧＣＡ ＣＡＣ ＣＣＣ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＣ−３’およびＷｘＲ−Ｒ７８９９；５’−ＣＴＴ ＧＧＧ ＴＴＡ ＡＡＡ ＴＣＴ ＴＧＣ ＧＡ−３’、ＷｘＲ−Ｆ７６７５；５’−ＡＡＣ ＴＧＴ ＴＣＴ ＴＧＡ ＴＣＡ ＴＣＧ ＣＡ−３’およびＷｘＲ−Ｒ９８６７；５’−ＡＴＴ ＧＴＡ ＴＡＣ ＣＧＴ ＴＣＣ ＧＴＡ ＴＣ−３’、ＷｘＲ−Ｆ９７０９；５’−ＡＧＧ ＡＧＡ ＡＧＴ ＡＴＣ ＣＧＧ ＧＣＡ ＡＧ−３’およびＷｘＲ−Ｒ１２４６５；５’−ＴＣＴ ＴＧＡ ＣＴＴ ＧＴＣ ＣＣＧ ＧＡＣ ＣＡＴ−３’、ＷｘＲ−Ｆ１４６５４；５’−ＣＴＴ ＡＴＡ ＴＴＧ ＴＧＧ ＧＡＣ ＧＧＡ ＧＡ−３’およびＷｘＲ−Ｒ１５０２２；５’−ＡＧＡ ＡＧＣ ＣＴＡ ＡＴＡ ＴＡＣ ＣＡＣ ＧＡ−３’、ＷｘＲ−Ｆ−２８４；５’−ＡＴＧ ＣＡＡ ＴＧＡ ＧＡＡ ＧＡＴ ＣＴＧ ＴＡ−３’およびＷｘＲ−Ｒ２０９；５’−ＴＣＴ ＴＡＴ ＡＡＧ ＣＣＧ ＧＡＧ ＴＣＴ ＴＧ−３’の１２組を用いてそれぞれ反応を行った。得られた１２種の断片の配列をＢｉｇＤｙｅＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖ３．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ登録商標 ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ登録商標 ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（共にＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）および各種プライマーを用いて解読した。
実施例６
効果的なポジティブ・ネガティブ選抜のために、ハイグロマイシン・フォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）をポジティブ選抜マーカーとして、ジフテリア毒素Ａ鎖遺伝子（ＤＴ−Ａ；Ｐａｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ，ＡＭ Ｊｒ（１９７７）Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４６：６９−９４）をネガティブ選抜マーカーとして選んだ。ＤＴ−Ａは植物を含む真核生物に毒性を持っており、これはエロンゲーション・ファクターのＡＤＰリボシル化を介したタンパク質合成を阻害することによる（Ｙａｇｉ Ｔ，Ｉｋａｗａ Ｙ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｋ，Ｓｈｉｇｅｔａｎｉ Ｙ，Ｔａｋｅｄａ Ｎ，Ｍａｂｕｃｈｉ Ｉ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ，Ａｉｚａｗａ Ｓ（１９９０）Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｔ ｃ−ｆｙｎ ｌｏｃｕｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｕｓｅ ｏｆ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ Ａ−ｆｒａｇｍｅｎｔ ｇｅｎｅ ｉｎ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ｕｓａ ８７：９９１８−９９２２、Ｃｚａｋｏ Ｍ ａｎｄ Ａｎ Ｇ（１９９１）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ ｃｈａｉｎ Ａ ｉｓ ｔｏｘｉｃ ｔｏ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ９５：６８７−６９２、Ｂｅｌｌｅｎ ＨＪ，Ｄ’ｅｖｅｌｙｎ Ｄ，Ｈａｒｖｅｙ Ｍ，Ｅｌｌｅｄｇｅ ＳＪ（１９９２）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１４ ７８７−７９６）。形質転換頻度を調査するために、ポジティブ・コントロールベクターとしてｐＲＩＴを、ネガティブ・コントロールベクターとしてｐＩＮＡ１３４を使用した。ｐＲＷと同様、ｐＲＩＴおよびｐＩＮＡ１３４もｈｐｈをポジティブ選抜マーカーとして持っており、形質転換効率をできるだけ高めるために、イネａｃｔｉｎ１プロモーターとその第１イントロンを使用した。
ｐＲＩＴを用いて形質転換を行ったところ、４００粒の完熟種子より１５００の独立したカルスが得られことを確認した。ネガティブ選抜の効果を調べるために同様の方法でｐＩＮＡ１３４を形質転換したところ、９９％以上の致死率を確認した。ＰＣＲによる解析により、生存できなかったカルスはＤＴ−Ａ遺伝子を持つことが示唆された。ｐＩＮＡ１３４を形質転換して生き残ったカルスの多くは、ＤＴ−Ａ遺伝子の一部または全体を欠失してＴ−ＤＮＡが組み込まれていた。これらの結果は、高い活性を持つプロモーターに接続したＤＴ−Ａ遺伝子がイネのネガティブ選抜に有効であることを示唆している。また、２つのＤＴ−Ａ遺伝子を離れて配置することにより、２つのＤＴ−Ａ遺伝子が共に削られて組み込まれる確率が極めて低いことも示唆している。
ＷａｘｙターゲットベクターであるｐＲＷを用いて形質転換を行った。この際、形質転換効率、ポジティブ・ネガティブ選抜効果を確認するために、同時にｐＲＩＴおよびｐＩＮＡ１３４も形質転換に用い、得られたハイグロマイシン耐性カルスの数を数えた。表１に示すように、６回の形質転換実験で、平均すると、一回当たりｐＲＩＴの場合は約１５００、ｐＩＮＡ１３４は約６０、ｐＲＷは約１００のカルスが得られた。
Ｈ１ＦとＷ２Ｒプライマーを組み合わせたＰＣＲによってＷａｘｙ座位の相同組換えを確認した。Ｈ１Ｆプライマーは、Ｅｎ／Ｓｐｍ配列の３‘末にあるｌｏｘＰ配列を、Ｗ２Ｒプライマーは相同組換えが起こる領域の外の配列をコードしている。相同組換えが起こったカルスに対してこれらのプライマーを用いれば、約８ｋｂの断片の増幅が確認できる。６回の実験で得られた合計６３０の生存カルスをこれらのプライマーで解析し、６個の独立した陽性カルス（ラインＡ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）を見出した。表１に示すように、各実験で得られたカルスのうち、平均１００分の１のカルスがＰＣＲで陽性であった。一方、まれに異なる鎖長の断片が増幅されることもあった。これは不規則な組み込みやＤＴ−Ａ遺伝子が欠失して組み込まれたものであると考えられる。
ＰＣＲで陽性であった６個体の再生植物（ラインＡ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）の緑葉からＤＮＡを単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｕｎＩおよびＥｃｏＲＶで消化してサザン解析を行った。組換え前は１４．７ｋｂのＷａｘｙ断片が、ＰＣＲで陽性であった組換え体では６．３ｋｂと１２．１ｋｂに変化していた。これは、相同組換えにより第１イントロン部分にＨｉｎｄＩＩＩ部位が挿入されたことによる。６．３ｋｂの断片はＷａｘｙプロモーター領域、ｐＷ４．１とハイブリダイズし、１２．１ｋｂの断片はｈｐｈ遺伝子のコーディング領域、Ｈｍ０．９およびＷａｘｙ遺伝子のコーディング領域、ｃＷｘ２．７とハイブリダイズした。同様のことはＭｕｎＩ、ＥｃｏＲＶを用いた解析からも確認できた。また、検出されたシグナルの強さから、すべての個体で対立遺伝子の片方のみで相同組換えが起こっていると推察された。
相同組換えされたカルス（ラインＡ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）すべては、植物体に再生することができ、稔性があり、種子が得られた。このうちＡ−Ｉについて、ヨード染色とＰＣＲにより、Ｗａｘｙ遺伝子の分離を解析した。Ｗａｘｙ遺伝子を持つ日本晴れの花粉と種子の澱粉は、アミロースとアミロペクチンから成り、ヨード染色により濃紺色に染まる。一方、ｗａｘｙ遺伝子を持つ糯米の澱粉はアミロペクチンのみから成り、赤茶色に染まる。Ａ−Ｉは、濃紺色に染まった花粉と赤茶色との比は１：１であった。また、得られた種子５３粒を染色したところ、１３粒が赤茶色に染まった。Ａ−ＩＩ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆの種子を用いて同様の実験を行ったところ、染色の比率はＡ−Ｉとほぼ同様であった。これらは、Ａ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆの個体ではＷａｘｙ対立遺伝子の片方のみで相同組換えが起こったことを示唆している。次に、得られた種子の遺伝子型を区別するために、種子を発芽させ、緑葉からＤＮＡを単離し、ＰＣＲ解析を行った。相同組換えを起こしたことを確認するためには、プライマー、Ｈ１ＦおよびＷ２Ｒを、元のＷａｘｙ座位の検出にはＰｒｏ１およびＥｘ２を用いた。Ｐｒｏ１とＥｘ２は、第１イントロン付近の１．３ｋｂの断片を増幅する。ＰＣＲ解析の結果、ヨード染色による表現型とＰＣＲ解析による遺伝子型は完全に一致し、濃紺色に染まった種子のうち２７粒は遺伝子型がヘテロであった。つまり、Ｆ１個体では遺伝子型が１：２：１で分離しており、相同組換えは対立遺伝子の片側のみで起こったことが示された。加えて、相同組換えが起こった遺伝子が次世代に正確に遺伝することが示された。
ゲノム遺伝子に予期せぬ再構成が生じた結果、Ｗａｘｙ遺伝子が機能しなくなった可能性もあるため、ｈｐｈ−Ｅｎ／Ｓｐｍ遺伝子がＷａｘｙの第１イントロンに正確に組み込まれていることをサザン分析により確認した。Ａ−Ｉの後代はＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＭｕｎＩおよびＥｃｏＲＶで、Ａ−ＩＩ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆの後代はそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｕｎＩおよびＥｃｏＲＶでゲノムＤＮＡを消化して分析に用いた。また解析にはそれぞれ複数の個体を用いた。これらの制限酵素は、日本晴れとシモキタのＷａｘｙ座位間で多型が無く、ｈｐｈ−Ｅｎ／Ｓｐｍ遺伝子にも存在することから選定した。プローブにはｐＷ４．１、Ｈｍ０．９、ｃＷｘ２．７を用いた。その結果、予想通りの鎖長の断片がすべてのＦ１個体で確認され、目的通りの相同組換えが起こり、後代に正確に遺伝していることが分かった。
ラインＡ−Ｉ、Ｂ、Ｃの個体の後代で組換え領域がホモである個体のゲノムＤＮＡを用い、相同組換えを起こしたと予想されるＷａｘｙ領域の塩基配列を解読し、予定外の欠失、挿入等の変異、異常が全く起こっていないことを確認した。
以上のように、独立の６回の実験で得られた６個体の形質転換体のサザン解析、Ｆ１個体のＰＣＲ解析、表現型と遺伝子型、サザン分析の分離様式およびラインＡ−Ｉ、ＢおよびＣの組換え領域の配列解析結果から、得られたイネは正確に相同組換えが起こったものであることが示された。また、この遺伝子改変法に再現性のあることが示された。
ｂ．１−５ｇＦＷのカルスを用いたｐＩＮＡ１３４の形質転換で得られるハイグロマイシン耐性カルスの数をｐＲＷの形質転換に用いたカルスの重量（約４０ｇＦＷ）相当に換算した数。
ｃ．４０ｇＦＷのカルスを用いたｐＲＷの形質転換で得られたハイグロマイシン耐性カルスの数
ｄ．＜８．６ｘ１０−４
参考文献
上記文献の他、以下の文献を参考文献とした。
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（５）Ｗｅｓｓｌｅｒ，ＳＲ，Ｖａｒａｇｏｎａ，ＭＪ（１９８５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｗａｘｙ ｌｏｃｕｓ ｏｆ ｍａｉｚｅ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｉｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ｕｓａ ８２：４１７７−４１８１
（６）ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ ６１８７９９４，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９７６５６１３
（７）国際公開番号ＷＯ９９２５８２１、国際出願番号ＷＯ９８ＵＳ２４６１０（８）ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ ５４６４７６４，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ０１４０８３
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、イネＷａｘｙ遺伝子を例とした高等植物ゲノム改変の概念図を示す。ａ．は、導入遺伝子とＷａｘｙ遺伝子間で相同組み換えが生じる際の模式図であり、ｂ．は、Ｗａｘｙ座に相同組み換えが生じた際の模式図である。
図２は、ゲノム改変用ベクターの模式図を示す。ａ．は、コントロールベクター、ｂ．は、基本ベクターｐＩＮＡ１３４、ｃ．は、Ｗａｘｙ遺伝子改変用ベクターの模式図である。図中、ｐＵｂｉはトウモロコシ・ユビキチン１プロモーター、ｉＵｂｉはトウモロコシ・ユビキチン１第１イントロン、ＤＴはジフテリア毒素タンパク質Ａ鎖、ｌｏｘはバクテリオファージのＣｒｅ／ｌｏｘ組換えのｌｏｘ配列、ｐＡｃｔはイネ・アクチンプロモーター、ｉＡｃｔはイネ・アクチン第１イントロン、ｈｐｈはハイグロマイシン耐性遺伝子、ｔ３５Ｓはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓターミネーター、Ｅｎ／ＳｐｍはＥｎ／Ｓｐｍ型トランスポゾンの転写終止領域、ｉＣａｔはヒマ・カタラーゼ遺伝子の第１イントロン、ｐ３５Ｓはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、およびｔＮｏｓはノパリンシンセターゼターミネーターを表す。
図３は、ｐＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ、ｐ３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ、およびｐＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ／３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ（ΔＨｉｎｄＩＩＩ）の模式を示す。
図４は、ｐＧＳ−ＳａｌＩ．ｐＧＳ−ＳａｌＩ−ＵｂｉＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ／３５ＳＰ−ｉｎｔ−ＤＴ−Ａ（ΔＨｉｎｄＩＩＩ）の模式を示す。
図５は、ベクターｐＩＮＡ１３４の構築模式図であり、ｐＡｃｈ１−Ｅｎ／ＳｐｍおよびｐＡｃｈ１−Ｅｎ／Ｓｐｍ２の模式を示す。
図６は、Ｗａｘｙ座、ベクター、および相同組換え後の物理地図模式図を示す。
図７は、相同組み換え個体の解析を示す。ａは、ＨＩＦ、Ｗ２Ｒプライマーを用いたＰＣＲによる解析を示す。また、ＰＣＲで陽性であった個体の再生植物の緑葉からＤＮＡを単離し、ＨｉｎｄＩＩＩまたはＭｕｎＩで消化してサザン解析を行った結果を示す。ｂは、ＨｉｎｄＩＩＩを用いたゲノムサザン解析を示す。ｃは、ＭｕｎＩを用いたゲノムサザン解析を示す。図中、ＲＣＶは陽性コントロールベクターおよびＮは非組換え体を表し、Ａ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｅ、ＦはそれぞれラインＡ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆの個体を表す。
図８は、ヨード染色の結果を示す。
図９は、相同組換え個体の再生の様子を示す。ａは、ハイグロマイシン耐性カルス、ｂは再生イネ、およびｃは出穂後の再生イネを示す。
Claims (14)
- Ｔ−ＤＮＡ由来のＢＲ（右ボーダー配列）とＢＬ（左ボーダー配列）の間に、下記の要素を、ＢＲから下記の順に含んでなる、相同組換えにより高等植物のゲノムを改変するための遺伝子構築物：
（１）発現可能に存在させた、第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子、
（２）宿主ゲノム中の標的遺伝子と相同組換えさせる遺伝子の５’領域を組み込むための第一のクローニング部位、
（３）発現可能に存在させたポジティブ選抜マーカー遺伝子、
（４）宿主ゲノム中の標的遺伝子と相同組換えさせる遺伝子の３’領域を組み込むための第二のクローニング部位および
（５）発現可能に存在させた、第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子と同一であってもよい第二のネガティブ選抜マーカー遺伝子。 - さらに、第一のクローニング部位の後に、（６）転写終止領域、好ましくはＥｎ／Ｓｐｍ型トランスポゾンの転写終止領域を含む、請求項１の遺伝子構築物。
- さらに、ポジティブ選抜マーカー遺伝子の前および後に（７）リコンビナーゼ認識配列を含む、請求項１または請求項２の遺伝子構築物。
- 宿主ゲノム中の標的遺伝子と相同組換えさせる遺伝子の５’および３’領域を組み込むための各クローニング部位の一方または両方がマルチプルクローニングサイトである、請求項１ないし３のいずれか１項の遺伝子構築物。
- 発現可能に存在させた第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子は、トウモロコシ・ユビキチン１プロモーター（ｐＵｂｉ）と、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓターミネーター（ｔ３５Ｓ）との間に存在する、請求項１ないし４のいずれか１項の遺伝子構築物。
- ポジティブ選抜マーカー遺伝子を、イネ・アクチンプロモーター（ｐＡｃｔ）およびイネ・アクチン第１イントロン（ｉＡｃｔ）と、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓターミネーター（ｔ３５Ｓ）との間に存在させることにより発現可能に存在させた、請求項１ないし５のいずれか１項の遺伝子構築物。
- 第二のネガティブ選抜マーカー遺伝子を、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ｐ３５Ｓ）およびヒマ・カタラーゼ第１イントロンと、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓターミネーター（ｔ３５Ｓ）との間に存在させることにより発現可能に存在させた、請求項１ないし６のいずれか１項の遺伝子構築物。
- 第一および第二のネガティブ選抜マーカー遺伝子の転写方向が、互いに向き合っている、請求項１ないし７のいずれか１項の遺伝子構築物。
- ポジティブ選抜マーカー遺伝子が、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子および除草剤耐性遺伝子（例えばｂａｒ遺伝子）からなる群から選抜され、ネガティブ選抜マーカー遺伝子が、ジフテリア毒素タンパク質Ａ鎖遺伝子（ＤＴ−Ａ）、ｃｏｄＡ遺伝子、シトクロムＰ−４５０遺伝子およびｂａｒｎａｓｅ遺伝子からなる群から選抜される、請求項１ないし８のいずれか１項の遺伝子構築物。
- 請求項１ないし９のいずれか１項の遺伝子構築物を含む、植物形質転換用ベクター。
- 第一のクローニング部位に宿主ゲノム中の標的遺伝子と相同組換えさせる遺伝子の５’領域を組み込み、第二のクローニング部位に宿主ゲノム中の標的遺伝子と相同組換えさせる遺伝子の３’領域を組み込んだ、請求項１ないし９のいずれか１項の遺伝子構築物を含む、植物形質転換用ベクター。
- 下記の工程からなる相同組換えを利用したゲノム改変高等植物（好ましくは単子葉植物）の製造方法：
（イ）請求項１１の植物形質転換用ベクターを、Ｔｉプラスミドを含むアグロバクテリウム中に存在させ、
（ロ）当該アグロバクテリウムを植物の細胞、組織またはカルスに感染させ、
（ハ）ネガティブ選抜およびポジティブ選抜により、相同組み換えを生じた細胞、組織またはカルスを選抜し、
（ニ）選抜を細胞または組織で行った場合は、それをカルスに培養し、
（ホ）カルスを再生培地で培養して、ゲノム中にヘテロに相同組み換えを生じた植物個体に生長させ、そして
（ヘ）生じた植物を掛け合わせて、ホモに相同組み換えを有する、遺伝子改変高等植物を得る。 - 工程（ニ）、（ホ）または（ヘ）の前後に、植物細胞のゲノム中の相同組み換えを生じた領域から、ポジティブ選抜マーカー遺伝子およびそのプロモーター、ターミネーター、および存在する場合は転写終止領域を削除する工程を含む、請求項１２の方法。
- 削除する工程が、Ｃｒｅ／ｌｏｘ組換え系、Ｒ／ＲＳ組換え系、またはＦＬＰ−ＦＲＴ組換え系である請求項１３の方法。
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