JP7332622B2 - ハンチンチン（ｈｔｔ）の調節のためのジンクフィンガータンパク質組成物 - Google Patents

ハンチンチン（ｈｔｔ）の調節のためのジンクフィンガータンパク質組成物 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１８年４月１８日に出願された米国仮出願第６２／６５９，５５２号および２０１８年１２月１７日に出願された米国仮出願第６２／７８０，６０５号の恩典を主張し、これらの開示が全体として参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年４月１５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、８３２５－０１７３＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズは３４，３７９バイトである。
技術分野
本開示は、ハンチントン病のための診断法および治療薬の分野である。
ハンチントン舞踏病としても知られるハンチントン病（ＨＤ）は、運動、認知および精神異常の進行性障害である。この疾患の発症の平均年齢は３５～４４歳であるが、症例の約１０％では、発症は２１歳より前に起こり、疾患の診断後の平均寿命は１５～１８年である。有病率は、西ヨーロッパ系統の１０万人に約３～７人である。
ハンチントン病は、三ヌクレオチドリピート伸長障害の例であり、１９９０年代の初期に最初に性質決定された（Ｄｉ Ｐｒｏｓｐｅｒｏ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｂｅｃｋ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５６－７６５参照）。これらの障害は、三ヌクレオチドの組の不安定なリピートの局所的な伸長を伴い、伸長したリピートがその中に存在する遺伝子の機能の喪失、有毒な機能の獲得または両方をもたらし得る。三ヌクレオチドリピートは、非コード領域およびコード遺伝子領域を含む遺伝子の任意の部分中に位置することができる。コード領域内に位置するリピートは、典型的には、グルタミンをコードするトリプレット（ＣＡＧ）またはアラニンをコードするトリプレット（ＣＧＡ）のいずれかの反復を含む。非コード配列内の伸長したリピート領域は、遺伝子の異常な発現をもたらし得るが、コード領域内の伸長したリピート（コドン反復障害としても知られる）は誤った折り畳みおよびタンパク質凝集を引き起こし得る。多くの場合、異常なタンパク質と関連する病態生理の正確な原因は不明である。典型的には、三ヌクレオチド伸長に供される野生型遺伝子中において、これらの領域は正常な集団中では、可変数のリピート配列を含有するが、罹病した集団では、倍増からリピートの数の対数オーダーでの増加まで、リピートの数が増加し得る。ＨＤでは、リピートは、大きな細胞質タンパク質であるハンチンチン（Ｈｔｔ）のＮ末端コード領域内に挿入される。正常なＨｔｔ対立遺伝子は１５～２０ＣＡＧリピート（配列番号７１）を含有するのに対して、３５またはそれを超えるリピートを含有する対立遺伝子は、ＨＤを引き起こす可能性がある対立遺伝子と考えることができ、疾患を発症させるリスクを付与することができる。３６～３９リピートを含有する対立遺伝子（配列番号８９）は不完全に浸透性であると考えられ、これらの対立遺伝子を保有する個体は、疾患を発症しまたは発症しないことがあるのに対して（または後の人生で症候を発症し得る）、４０またはそれを超えるリピートを含有する対立遺伝子は完全に浸透性であると考えられる。実際に、４０またはそれを超えるリピートを有するＨＤ対立遺伝子を含有する無症候性の人は報告されていない。若年発症型ＨＤを有する個人（２１歳未満）は、しばしば、６０またはそれを超えるＣＡＧリピートを有することが見出されている。ＣＡＧリピートの増加の他に、当該領域がポリグルタミンではなく、（＋１フレームシフトの場合には、ＡＧＣリピートによってコードされる）ポリセリンポリペプチドトラックをコードするように、ＨＤはリピート配列内に＋１および＋２フレームシフトを含み得ることも示されている（Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４３：８９３－８９６）。
ＨＤでは、変異体Ｈｔｔ対立遺伝子は、通常、優性形質として一方の親から遺伝される。ＨＤ患者から生まれた全ての子供は、他方の親がこの障害に罹患していなければ、５０％の確率で疾患を発症する。いくつかの事例では、親が中間ＨＤ対立遺伝子を有し、無症候性である場合があるが、リピート伸長のために、子供に疾患が現れる。加えて、ＨＤ対立遺伝子は、精子形成時のリピート領域の不安定な性質に起因して、数世代にわたって、重篤度の増加または発症年齢の減少が観察される表現促進として知られる現象も呈し得る。
さらに、Ｈｔｔ中の三ヌクレオチド伸長は、線条体中の中型有棘γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）投射神経細胞中に神経細胞の喪失をもたらし、新皮質中でも神経細胞の喪失が起こる。エンケファリンを含有し、淡蒼球外節に投射する中型有棘神経細胞は、サブスタンスＰを含有し、淡蒼球内節に投射する神経細胞より多く冒される。ハンチントン病を有する人々において大きく冒されているその他の脳領域には、黒質、皮質層３、５および６、海馬のＣＡ１領域、頭頂葉中の角回、小脳のプルキンエ細胞、視床下部の外側隆起核ならびに視床の正中中心核束傍核複合体が含まれる（Ｗａｌｋｅｒ（２００７）Ｌａｎｃｅｔ ３６９：２１８－２２８）。
正常なＨｔｔタンパク質の役割はほとんど理解されていないが、神経発生、アポトーシス細胞死および／または小胞輸送に関与している可能性がある。さらに、野生型Ｈｔｔは、線条体の神経細胞に対する生存促進因子である脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の産生を刺激するという証拠が存在する。ＨＤの進行は、ＨＤのマウスモデルにおけるＢＤＮＦ発現の減少と相関すること（Ｚｕｃｃａｔｏら、（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２（２）：１３３－１３９）、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって媒介される遺伝子送達を介したＢＤＮＦまたはグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のいずれかの送達が、ＨＤのマウスモデル中で線条体の神経細胞を保護し得ること（Ｋｅｌｌｓら、（２００４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ９（５）：６８２－６８８）が示されている。
変異体ＨＴＴ（ｍＨＴＴ）タンパク質由来の毒性および正常なＨＴＴタンパク質の喪失など、ＨＤ病態形成に対する様々な機序が調べられてきた（Ｒｏｓｓ＆Ｔａｂｒｉｚｉ（２０１１）Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １０：８３－９８；Ｚｕｃｃａｔｏら、（２０１０）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：９０５－９８１）。ｍＨｔｔを発現する複数のＨＤマウスモデルから得られた結果は、ｍＨｔｔが、主として機能獲得型毒性を通じてその発症活性を発揮することを示唆する（Ｂｒｏｏｋｓ＆Ｄｕｎｎｅｔｔ（２０１５）Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｂｅｈａｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２２：１０１－１３３）。誘導性ｍＨＴＴ導入遺伝子の不活化が疾患の回復をもたらすという知見（Ｙａｍａｍｏｔｏら、（２０００）Ｃｅｌｌ １０１：５７－６６）は、治療薬の候補として、ＨＴＴ降下剤の開発に結び付いた。ＨＴＴ ｍＲＮＡを標的とするＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、様々なＨＤ前臨床モデルにおける有効性を示しており（Ｂｏｕｄｒｅａｕら、（２００９）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７：１０５３－１０６３；Ｈａｒｐｅｒら、（２００５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０２：５８２０－５８２５；Ｋｏｒｄａｓｉｅｗｉｃｚら、（２０１２）Ｎｅｕｒｏｎ ７４：１０３１－１０４４；Ｓｔａｎｅｋら、（２０１４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２５（５）：４６１）、最近の第１／２ａ相試験は、ＡＳＯの複数回くも膜下腔投与は参加者の脳脊髄液中の正常なＨＴＴレベルと変異体ＨＴＴレベルの両方を低下させることを示した。
ＨＤに対する診断および処置の選択肢は、現在、極めて限られている。診断法の観点から、変化した（変異体）Ｈｔｔ（ｍＨＴＴ）レベルは、疾患負荷スコアと有意に関連しており、可溶性ｍＨＴＴ種の濃度は疾患の進行とともに増加する。しかしながら、少量のｍＨＴＴは患者の中枢神経系中で定量することが難しく、インビボでのＨＤの神経病理学における役割の両研究を制約し、ＨＴＴ低下薬によるターゲットエンゲージメントの実証を妨げている。例えば、Ｗｉｌｄら、（２０１４）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ８５：ｅ４参照。
処置に関して、シャペロニンの過剰発現または化合物ゲルダナマイシンによる熱ショック応答の誘導などの伸長ポリグルタミン鎖を通じて起こるタンパク質凝集と関連する毒性を抑制するように設計されたいくつかの有望な方法が、インビトロモデルにおいてこれらの毒性の低下を示した。その他の処置は、本疾患の臨床症状におけるアポトーシスの役割を標的にする。例えば、一方の親がＨＤ対立遺伝子を含み、他方の親がカスパーゼ１に対するドミナントネガティブ対立遺伝子を有するマウスの対の子孫での動物モデルにおけるカスパーゼ活性の遮断を介して、疾患症候の減速が示されている。さらに、カスパーゼによる変異体ＨＤ Ｈｔｔの切断が、本疾患の発病において役割を果たしている可能性がある。カスパーゼ－６抵抗性変異体Ｈｔｔを担持するトランスジェニックマウスは、正常な神経細胞機能を維持することが示され、非カスパーゼ抵抗性変異体Ｈｔｔ対立遺伝子を担持するマウスと比べて、線条体の神経変性を発症しなかった（Ｇｒａｈａｍら、（２００６）Ｃｅｌｌ １２５：１１７９－１１９１参照）。アポトーシス経路の要素を標的とする分子も、総体症状に対する遅延効果を有することが示されている。例えば、いずれもカスパーゼ活性を阻害する化合物であるｚＶＡＤ－ｆｍｋおよびミノサイクリンは、マウスで疾患出現を遅らせることが示されている。ＮＤＭＡ受容体への変異体Ｈｔｔの結合を抑制して、神経細胞に対する毒性効果の発揮を抑制する化合物と考えられたので、薬物レマセミドも小規模なＨＤヒト試験において使用されてきた。しかしながら、これらの試験では、神経細胞機能の統計的に有意な改善は観察されなかった。さらに、ハンチントン研究グループは、コエンザイムＱを用いた無作為二重盲検研究を実施した。コエンザイムＱ１０で処置された患者の間で、疾患の進行がより遅くなる傾向は観察されたが、全機能的能力の低下の速度に有意な変化は存在しなかった。（Ｄｉ Ｐｒｏｓｐｅｒｏ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｂｅｃｋ、同書）。
ジンクフィンガータンパク質（「ＺＦＰ」）由来のＤＮＡ結合ドメインを含む組換え転写因子は、Ｈｔｔ遺伝子などの内在性遺伝子の遺伝子発現を制御する能力を有する。例えば、米国特許第９，９４３，５６５号；同第９，４９９，５９７号；同第９，２３４，０１６号；および同第８，８４１，２６０号；ならびに米国特許出願公開第２０１５／０３３５７０８号；同第２０１７／００９６４６０号；および同第２０１５０２５５８７７号参照。ジンクフィンガータンパク質を含有するこれらの改変操作された転写因子を使用する臨床試験は、これらの新規転写因子が様々な症状を処置することが可能であることを示した。（例えば、Ｙｕら、（２００６）ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０：４７９－４８１参照）。
さらに、ＺＦＰを含む人工のヌクレアーゼは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）後におよび／または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が駆動する過程中の末端捕捉によって、いずれかの相同組換え修復（ＨＤＲ）などの、ヌクレアーゼによって媒介される遺伝子の修飾を介して内在性遺伝子の遺伝子発現を修飾する能力を有する。例えば、米国特許第９，８７３，８９４号；同第９，３９４，５４５号；同第９，１５０，８４７号；同第９，２０６，４０４号；同第９，２２２，１０５号；同第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第８，９５６，８２８号；同第８，９３６，９３６号；同第８，９４５，８６８号；同第８，８７１，９０５号；同第８，５８６，５２６号；同第８，５６３，３１４号；同第８，３２９，９８６号；同第８，３９９，２１８号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；同第８，７７１，９８５号；同第８，８９５，２６４号；米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号；同第２００５／０２０８４８９号；同第２００５／００２６１５７号；同第２００５／００６４４７４号；同第２００６／００６３２３１号；同第２０１１／０２６５１９８号；および同第２０１３／０１７７９６０号を参照、これらの開示の全体は、あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる。このため、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または修復テンプレートを使用する修復（相同組換え修復またはＨＤＲ）などのエラー発生過程による切断の修復が、遺伝子のノックアウトまたは関心対象の配列の挿入（標的化された組み込み）をもたらすことができるように、これらの方法は、標的ＤＮＡ配列中に二本鎖切断（ＤＳＢ）または切れ目を誘導するために、しばしば、改変操作された切断系を使用する。細胞のＮＨＥＪ経路によって導入された変異（「インデル」として知られる挿入および／または欠失）を介して標的とされた遺伝子を不活化するために、外的に供給される修復テンプレート（例えば、「ドナー」または「導入遺伝子」の不存在下での二本鎖切断の導入が一般的に使用されている。
しかしながら、疾患の進行をモニタリングするための、ＨＤの神経病理生物学の理解を深めるための、および疾患を改変するＨＤ治療薬を評価するためのｍＨＴＴの検出を含む、ハンチントン病の診断、研究、処置および／または予防のための方法がなお必要とされている。
米国特許第９，９４３，５６５号明細書 米国特許第９，４９９，５９７号明細書 米国特許第９，２３４，０１６号明細書 米国特許第８，８４１，２６０号明細書 米国特許出願公開第２０１５／０３３５７０８号明細書 米国特許出願公開第２０１７／００９６４６０号明細書 米国特許出願公開第２０１５／０２５５８７７号明細書 米国特許第９，８７３，８９４号明細書 米国特許第９，３９４，５４５号明細書 米国特許第９，１５０，８４７号明細書 米国特許第９，２０６，４０４号明細書 米国特許第９，２２２，１０５号明細書 米国特許第９，０４５，７６３号明細書 米国特許第９，００５，９７３号明細書 米国特許第８，９５６，８２８号明細書 米国特許第８，９３６，９３６号明細書 米国特許第８，９４５，８６８号明細書 米国特許第８，８７１，９０５号明細書 米国特許第８，５８６，５２６号明細書 米国特許第８，５６３，３１４号明細書 米国特許第８，３２９，９８６号明細書 米国特許第８，３９９，２１８号明細書 米国特許第６，５３４，２６１号明細書 米国特許第６，５９９，６９２号明細書 米国特許第６，５０３，７１７号明細書 米国特許第６，６８９，５５８号明細書 米国特許第７，０６７，３１７号明細書 米国特許第７，２６２，０５４号明細書 米国特許第７，８８８，１２１号明細書 米国特許第７，９７２，８５４号明細書 米国特許第７，９１４，７９６号明細書 米国特許第７，９５１，９２５号明細書 米国特許第８，１１０，３７９号明細書 米国特許第８，４０９，８６１号明細書 米国特許第８，７７１，９８５号明細書 米国特許第８，８９５，２６４号明細書 米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号明細書 米国特許出願公開第２００５／０２０８４８９号明細書 米国特許出願公開第２００５／００２６１５７号明細書 米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書 米国特許出願公開第２００６／００６３２３１号明細書 米国特許出願公開第２０１１／０２６５１９８号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１７７９６０号明細書
Ｄｉ Ｐｒｏｓｐｅｒｏ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｂｅｃｋ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５６－７６５ Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４３：８９３－８９６ Ｗａｌｋｅｒ（２００７）Ｌａｎｃｅｔ ３６９：２１８－２２８ Ｚｕｃｃａｔｏら、（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２（２）：１３３－１３９ Ｋｅｌｌｓら、（２００４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ９（５）：６８２－６８８ Ｒｏｓｓ＆Ｔａｂｒｉｚｉ（２０１１）Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １０：８３－９８ Ｚｕｃｃａｔｏら、（２０１０）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：９０５－９８１ Ｂｒｏｏｋｓ＆Ｄｕｎｎｅｔｔ（２０１５）Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｂｅｈａｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２２：１０１－１３３ Ｙａｍａｍｏｔｏら、（２０００）Ｃｅｌｌ １０１：５７－６ Ｂｏｕｄｒｅａｕら、（２００９）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７：１０５３－１０６３ Ｈａｒｐｅｒら、（２００５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０２：５８２０－５８２５ Ｋｏｒｄａｓｉｅｗｉｃｚら、（２０１２）Ｎｅｕｒｏｎ ７４：１０３１－１０４４ Ｓｔａｎｅｋら、（２０１４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２５（５）：４６１） Ｗｉｌｄら、（２０１４）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ８５：ｅ４ Ｇｒａｈａｍら、（２００６）Ｃｅｌｌ １２５：１１７９－１１９１ Ｙｕら、（２００６）ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０：４７９－４８１
ハンチントン病を診断および／または処置するための方法および組成物が本明細書に開示されている。特に、変異体Ｈｔｔ遺伝子（ｍＨｔｔ）発現、有毒な変異体ＨＴＴ（ｍＨＴＴ）タンパク質の選択的抑制など、Ｈｔｔ発現を調節するジンクフィンガータンパク質組成物が本明細書において提供される。これらの組成物および方法は、ＨＤ集団中に見出される野生型対立遺伝子の８６％超の発現を保ちながら、８０倍の用量範囲にわたって、ＨＤを引き起こす対立遺伝子の９９％超を選択的に抑制する。他のＣＡＧ含有遺伝子の発現は最小限に影響を受け、本明細書に記載されている人工の転写因子リプレッサーは、培養中で１００日を超えて、マウス脳内で少なくとも９ヶ月またはそれを超えて、ＨＤ神経細胞中で活性を示し、良好に耐容される。
したがって、一態様において、Ｈｔｔ遺伝子に対するＺＦＰ遺伝的調節因子が記載される。ある実施形態において、この遺伝的調節因子は、人工のＺＦＰ転写因子またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）と、ＨＤ対立遺伝子（例えば、Ｈｔｔ）の発現を調節する機能的ドメイン（転写活性化因子、転写抑制因子、ヌクレアーゼドメインなど）とを含む。ある実施形態において、ジンクフィンガータンパク質は、添付の表または図面のいずれかに示されている認識ヘリックスを有する。ある実施形態において、ＺＦＰ－ＴＦは、例えば、被験体に投与するために、薬学的組成物中に調合される。
一態様において、本明細書に記載されている遺伝的調節因子は、ＺＦＰリプレッサー（Ｈｔｔ発現を抑制する人工の転写因子またはヌクレアーゼ）である。これらのＺＦＰリプレッサーは、野生型および／または変異体Ｈｔｔ対立遺伝子特異的に結合し得る。ある種のリプレッサーは、野生型および変異体Ｈｔｔ遺伝子の両方に結合するが、その他は野生型のみに結合し、さらにその他は変異体Ｈｔｔ遺伝子のみに結合する。いくつかの実施形態において、人工の転写因子は、所定の大きさの多量体の安定した複合体を形成し、このため、ある最小の大きさを上回るＣＡＧ鎖と優先的に相互作用することが可能であり、ここで、その最小の大きさは野生型ＣＡＧ鎖の長さより大きい。
ある実施形態において、本明細書に記載されているＺＦＰ遺伝的調節因子は、変異体Ｈｔｔ対立遺伝子の発現を優先的に修飾する。いくつかの実施形態において、ＺＦＰ遺伝的調節因子（例えば、リプレッサー）は、変異体Ｈｔｔ対立遺伝子に特異的に結合し、ここで伸長した鎖はポリグルタミンをコードするのに対して、他の実施形態において、遺伝的調節因子は、変異体Ｈｔｔ対立遺伝子に特異的に結合し、伸長鎖はポリセリンをコードする。したがって、いくつかの実施形態において、ＺＦＰ遺伝的調節因子は、Ｈｔｔ対立遺伝子の野生型および変異体形態の両方を調節する。ある実施形態において、ＺＦＰ遺伝的調節因子は、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子のみを調節する。他の実施形態において、ＺＦＰ遺伝的調節因子は、Ｈｔｔの変異体形態のみを調節する。
他の実施形態において、本明細書に記載されているＺＦＰを含み、伸長したＨＤ Ｈｔｔ対立遺伝子と関連する公知のＳＮＰに優先的に結合する抑制調節因子が提供される。このように、遺伝子リプレッサーは、ＳＮＰを含有する変異体Ｈｔｔ対立遺伝子に対して特異的であり、変異体Ｈｔｔ対立遺伝子の特異的な抑制を可能にする。別の態様において、野生型対立遺伝子と関連するＳＮＰとの相互作用によって、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子を特異的に活性化させる遺伝的調節因子が提供される。このようにして、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子のみが活性化される。
ある実施形態において、ＺＦＰ遺伝的調節因子は、少なくとも１つの制御ドメイン（または機能的ドメイン）を含む。機能的ドメインは、例えば、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメインおよび／またはヌクレアーゼ（切断）ドメインであり得る。ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインとの融合のために活性化ドメインまたは抑制ドメインのいずれかを選択することによって、遺伝子発現を活性化または抑制するために、これらの人工の転写因子を使用することができる。いくつかの実施形態において、変異体Ｈｔｔ発現を下方制御するために使用することができる転写抑制ドメインに融合された、本明細書に記載されている変異体Ｈｔｔに標的化されるＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインを含む融合分子が提供される。いくつかの実施形態において、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子を上方制御することができる転写活性化ドメインに融合された、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子に標的化されるＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインを含む人工の転写因子が提供される。ある実施形態において、細胞の転写機構との相互作用が外因性リガンドの不存在下で起こらないように、制御ドメインの活性は、外来性小分子またはリガンドによって制御される。このような外来性リガンドは、転写機構との人工の転写因子の相互作用の程度を調節する。制御（機能的）ドメインは、１またはそれを超えるジンクフィンガードメインの間、１またはそれを超えるＺＦＰの外側およびこれらのあらゆる組み合わせを含む、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインの１またはそれより多くの任意の部分に作用可能に連結され得またはその他会合され得る。本明細書に記載されている融合タンパク質のいずれもが、薬学的組成物中に調合され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている遺伝的調節因子は、本明細書に記載されている改変操作されたＺＦＰタンパク質と切断（ヌクレアーゼドメイン）とを含む人工のヌクレアーゼを含む。これらの人工のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または神経細胞幹細胞などの幹細胞中で変異体Ｈｔｔ対立遺伝子を標的化するために使用することが可能であり、ここで、ヌクレアーゼ融合物の活性は、ＣＡＧリピートの野生型数を含有するＨｔｔ対立遺伝子をもたらすであろう。ある実施形態において、修飾された幹細胞を含む薬学的組成物は、被験体へのエクスビボ投与のために提供される。
さらに別の態様において、本明細書に記載されているＺＦＰ ＤＮＡ結合遺伝的調節因子（またはその成分）のいずれかをコードするポリヌクレオチドが提供される。このようなポリヌクレオチドは、ハンチントン病を処置することが望まれる被験体に投与することができる。
さらなる態様において、本発明は、ハンチントン病の研究のための特異的モデル系を生成するための方法および組成物を提供する。ある実施形態において、標的化された組み込みを駆動するために本明細書に記載されているＨｔｔ標的化された人工ヌクレアーゼを用いて、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子中に特定の（例えば、５０（配列番号７２）、８０（配列番号７３）、１０９（配列番号７４）および１８０ＣＡＧリピート（配列番号７５））三ヌクレオチド伸長鎖が挿入されている細胞および動物系統を生成するために、変異体Ｈｔｔ対立遺伝子が胚性幹細胞を用いて生成されるモデルが本明細書において提供される。ある実施形態において、モデル系はインビトロ細胞株を含むのに対して、他の実施形態において、モデル系はトランスジェニック動物を含む。本明細書に記載されている動物モデルのいずれにおいても、動物は、例えば、げっ歯類（例えば、ラット、マウス）、霊長類（例えば、非ヒト霊長類）またはウサギであり得る。
さらに別の態様において、本明細書に記載されているＺＦＰ調節因子をコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む遺伝子送達ベクターが提供される。ある実施形態において、ベクターは、アデノウイルスベクター（例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクター）、組み込み能を有するもしくは組み込み欠損のレンチウイルスベクターを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ）またはアデノウイルス随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。したがって、本明細書に記載されている少なくとも１つの遺伝的調節因子をコードし、ヌクレアーゼによって媒介される切断後に標的遺伝子中に標的化された組み込みをするための１またはそれを超えるドナー配列をさらに必要に応じてコードする配列を含む、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター、ＬＶまたはアデノウイルス随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）も本明細書において提供される ある実施形態において、Ａｄベクターは、キメラＡｄベクター、例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクターである。ある実施形態において、レンチウイルスベクターは、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）または組み込み能を有するレンチウイルスベクターである。ある実施形態において、ベクターは、ＶＳＶ－Ｇ外被でまたは他の外被で偽型化される。
いくつかの実施形態において、標的対立遺伝子（例えば、変異体Ｈｔｔ）は発現マーカーでタグが付加されている、ハンチントン病のためのモデル系が提供される。ある実施形態において、変異体対立遺伝子（例えば、変異体Ｈｔｔ）がタグを付加される。いくつかの実施形態において、野生型対立遺伝子（例えば、野生型Ｈｔｔ）がタグを付加されており、さらなる実施形態において、野生型および変異体対立遺伝子の両方が別個の発現マーカーでタグを付加されている。ある実施形態において、モデル系はインビトロ細胞株を含むのに対して、他の実施形態において、モデル系はトランスジェニック動物を含む。
さらに、本明細書に記載されている遺伝的調節因子の１またはそれより多くを含む薬学的組成物も提供される。例えば、ある組成物は、被験体への投与時に、ＺＦＰ－ＴＦが被験体中で発現され、Ｈｔｔ発現を調節するように、薬学的に許容され得る担体または希釈剤と組み合わせて本明細書に記載されているＺＦＰ－ＴＦをコードする配列を含む核酸を含む。ある実施形態において、コードされる遺伝的調節因子は、ＨＤ Ｈｔｔ対立遺伝子に対して特異的である。これらの薬学的組成物では、本明細書に記載されている遺伝的調節因子をコードする核酸と合わせてまたはこれに代えて、タンパク質ＺＦＰ－ＴＦも使用され得る。
さらに別の態様において、本明細書に記載されているＺＦＰ遺伝的調節因子および／または組成物のうち任意のものを含む単離された細胞も提供される。
別の態様において、本明細書に記載されている方法および組成物を用いて、ハンチントン病を処置および／または予防するための方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、この方法は、組成物を含み、ここで、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質は、ウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）および／またはこれらの組み合わせを用いて送達され得る。いくつかの実施形態において、この方法は、幹細胞集団を含む組成物を伴う。
これらのおよびその他の態様は、開示全体に照らせば、当業者にとって自明であろう。
図１Ａ～１Ｋは、ｍＨｔｔを標的とする対立遺伝子選択的ＺＦＰの設計および試験を図示する。図１Ａは、ＨＴＴの対立遺伝子特異的リプレッサーの構造および望まれる挙動の図である。適切な親和性と標的間隔でポリＣＡＧ鎖内に結合するように改変操作された、設計されたＺＦＰ－ＫＲＡＢタンパク質は、伸長した疾患対立遺伝子の高度に選択的な抑制を示すはずである。下流のＳＮＰを保有する患者細胞株中で、野生型（＜２２）および疾患（＞３９）対立遺伝子の差異的抑制に関してＺＦＰ－ＴＦをスクリーニングし、これは、ｒｓ３６３０９９、ｒｓ３６２３３１およびｒｓ３６２３０７を標的とするＳＮＰ特異的ｑＲＴ－ＰＣＲ試薬を用いた対立遺伝子レベルの独立した定量を可能にする。図１Ｂは、候補ＺＦＰを組み立てるために使用された１および２フィンガー単位ならびに１および２塩基長リンカーを示す。別の陰影は、ＤＮＡ接触残基と結合特性の異なる組を用いた別のデザインを示す。配列の詳細については、表１を参照。図１Ｃは、ｍＨＴＴの選択的抑制に関してスクリーニングされた、ＺＦＰ－ＴＦセンス鎖（左）およびアンチセンス鎖（右）を標的としたデザインを示す。別のリンカーを用いて３、４、５または６フィンガーＺＦＰを生成して隣接するフィンガー間で０、１または２塩基のスキップを可能とするために、ポリＣＡＧ鎖のいずれかの鎖を標的とする１および２フィンガーモジュールを連結した。標的とされた配列が、左、中央および右に、ＤＮＡ配列によって示されている。図１Ｄは、異なるポリＣＡＧ鎖長を有する患者線維芽細胞（ＧＭ０２１５１またはＧＭ０４７２３）へのヌクレオフェクションを介した１００ｎｇのＺＦＰ－ＴＦ ｍＲＮＡの送達から２４時間後に、ＨＴＴの正常（上のプロット）および疾患（下のプロット）対立遺伝子に対する転写物レベルが評価されたことを示す。さらなる研究のために、対立遺伝子選択的なリプレッサー（ＺＦＰ、Ａ、ＢおよびＤ）および１つの非選択的リプレッサー（ＺＦＰ－Ｃ）を選択した。ｎ＝３ 生物学的反復測定；平均±標準偏差。図１Ｄは、それぞれ、出現の順に、配列番号８１、８２、７９および８０を開示する。図１Ｅは、さらなる研究のために選択され、図１Ｄと同様に分析された３つのＺＦＰの対立遺伝子特異的抑制を示す。研究は、患者のＧＭ０４７２３線維芽細胞中で実施した。総ＨＴＴレベルも示されている。ｎ＝３ 生物学的反復測定；平均±標準偏差。図１Ｅは、それぞれ、出現の順に、配列番号８１および８２を開示する。図１Ｆは、１００ｎｇもしくは３０ｎｇのＺＦＰまたは対照ｍＲＮＡでのＧＭ０４７２３線維芽細胞の形質移入の７２時間後にウェスタンブロットによって計測された、ＺＦＰ－ＡおよびＺＦＰ－ＢによるｍＨＴＴ（上のブロットの上部のバンド）タンパク質の選択的下方制御を示している。野生型ＨＴＴ（上のブロットの下部のバンド）は減少していない。カルネキシン搭載対照（下のブロット）。図１Ｇ（図１Ｇは、出現の順に、それぞれ、配列番号８１および８２を開示する）、１Ｉ（図１Ｉは、出現の順に、それぞれ、配列番号７９および８０を開示する）および１Ｊ（図１Ｊは、出現の順に、それぞれ、配列番号８３および８４を開示する）は、患者のＧＭ０４７２３（図Ｇ）、ＧＭ０２１５１（図Ｉ）またはＧＭ３０２５９（図Ｊ）線維芽細胞中での対立遺伝子特異的抑制の用量応答を示す。全ＨＴＴ、ＷＴ ＨＴＴおよび変異体ＨＴＴに対するｑＲＴ－ＰＣＲを、１０万倍の用量範囲（およそ半対数用量段階で１，０００～０．０１ｎｇ）にわたるＺＦＰ ｍＲＮＡで形質移入された患者線維芽細胞から単離されたＲＮＡに対して行った。ｎ＝３生物学的反復測定；平均±標準偏差。図１Ｈは、ＨＤ集団中でのＣＡＧリピート長の頻度を示すプロットである。ＨＤ患者対立遺伝子頻度は、第三次Ｅｎｒｏｌｌ－ＨＤ定期データセットに基づいて計算した。３５より大きいＣＡＧ高を有する全てのエントリー（ｎ＝６６０２）を、平均および中位数ｍＨＴＴ対立遺伝子長の分析のために使用した。ＣＡＧ１７（配列番号７６）およびＣＡＧ４３（配列番号７７）ボックスに対して、中位数対立遺伝子が示されている。ＣＡＧ数の下の丸は、本研究において試験された対立遺伝子長を表す。図１Ｋは、ＧＭ０２１５１およびＧＭ３０２５９線維芽細胞中でのＺＦＰ４５２４９に対する活性を図示し、ここで、データは一対で示されており、各対の右側の棒は伸長した対立遺伝子でのＨｔｔ発現を表すのに対して、各対の左側の棒は野生型Ｈｔｔ対立遺伝子でのＨｔｔ発現を表す。図１Ｋは、それぞれ、出現の順に、配列番号７９、８０、８３および８４を開示する。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図２Ａ～２Ｎは、ＨＤ神経細胞中での対立遺伝子選択的抑制、特異性および表現型の矯正を図示する。図２Ａは、ＧＥＮＥＡ０２０ ｈＥＳＣ（ＣＡＧ１７／４８、配列番号７６／７８）に由来するＮＳＣを用いて行われた研究の時系列の概要を示す。図２Ｂは、ＨＤ ＮＳＣ中での対立遺伝子特異的抑制の用量応答を示す。ＷＴ（ＣＡＧ１７）および変異体（ＣＡＧ４８）ＨＴＴに対する全ＨＴＴまたはＳＮＰ特異的（ｒｓ３６２３０７）ｑＲＴ－ＰＣＲを、３，０００倍の用量範囲（およそ半対数用量段階で３，０００～１ｎｇ）にわたるＺＦＰ ｍＲＮＡで形質移入されたＮＳＣから単離されたＲＮＡに対して行った。ｎ＝３生物学的反復測定；平均±標準偏差。図２Ｂは、それぞれ、出現の順に、配列番号７６および７８を開示する。図２Ｃは、２１日間、ＡＡＶ６－ＺＦＰまたはＡＡＶ６－ＧＦＰ（１×１０５ｖｇ／細胞）で感染された分化したＨＤ神経細胞を図示する。図２Ｂと同様に、図は、ＷＴおよびｍＨＴＴに対するｑＲＴ－ＰＣＲを示す；ｎ＝２生物学的反復測定；平均±標準偏差。図２Ｃは、それぞれ、出現の順に、配列番号７６および７８を開示する。図２Ｄは、形質導入された細胞を濃縮するために感染の２７日後にＧＦＰ発現に対して細胞選別された、ＺＦＰ－２Ａ－ＧＦＰまたはＧＦＰのいずれかをコードするレンチウイルスを感染させたＨＤ ＮＳＣを示す。図２Ｂと同様に、７４日におけるｑＲＴ－ＰＣＲデータが示されている；ｎ＝３生物学的反復測定；平均±標準偏差。図２Ｄは、それぞれ、出現の順に、配列番号７６および７８を開示する。図２Ｅは、神経細胞へと分化した図２Ｄから得られたＧＦＰ選別されたＮＳＣを示す。図２Ｂと同様に、神経細胞分化の開始から２５日後（レンチウイルス感染の１０３日後）におけるｑＲＴ－ＰＣＲデータが示されている；ｎ＝３生物学的反復測定；平均±標準偏差。図２Ｅは、それぞれ、出現の順に、配列番号７６および７８を開示する。図２Ｆは、１５００ｎｇのＺＦＰ ｍＲＮＡの形質移入から２４時間後にマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｐｒｉｍｅｖｉｅｗ、処置当たりｎ＝４～６の生物学的反復測定）を用いた、ＨＤ神経細胞（ＣＡＧ１７／４８（配列番号７６／７８））のゲノム全域にわたる特異性評価を図示する。各点は、対照処置された細胞と比較した、表記ＺＦＰで処置された細胞中での単一遺伝子に対する転写物レベルの倍数変化（ｘ軸）およびｐ値（ｙ軸）を表す。ｐ値＜０．０１で２倍を超えて制御された遺伝子が示されている。図２Ｇは、図２Ｆ中の制御された遺伝子のベン図を表す。図２Ｈは、ＺＦＰ－Ｂで処置された神経細胞中でのＡＴＰの細胞内レベルの増加を示す。ＺＦＰ－２Ａ－ＧＦＰまたはＣＭＶ－ＧＦＰのいずれかのレンチウイルス感染から２１日後に、ＨＤおよび正常神経細胞中での細胞内ＡＴＰレベルを測定した。図２Ｉは、ＺＦＰ－Ｂで処置された神経細胞中でのアポトーシスの低下を実証する。ＺＦＰ－２Ａ－ＧＦＰまたはＣＭＶ－ＧＦＰをコードするいずれかのレンチウイルスで５日間感染させ、その後、増殖因子を４８時間撤回された神経細胞のＴＵＮＥＬ染色によって、アポトーシスを評価した。図２Ｊは、ＨｄｈＱ５０マウス実験の概要である。図２Ｋは、ＺＦＰ－ＢまたはＧＦＰのいずれかをコードするＡＡＶ２／６の注射から７週後に、対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲによって、ヘテロ接合性Ｑ５０マウス中での線条体のＷＴ（Ｑ７）およびＫＩ（Ｑ５０）Ｈｔｔ ｍＲＮＡレベルが測定されたことを示す；群当たりｎ＝６～８半球、平均±標準偏差。図２Ｌは、ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価されたＱ５０またはＱ７のいずれかとＺＦＰ－Ｂ ｍＲＮＡレベルの回帰分析である。全ての線条体の部分切片が含まれている。９５％信頼帯が示されている。図２Ｍは、２Ｆに上記されているとおり、１５００ｎｇのＺＦＰ ｍＲＮＡでの形質移入から２４時間後における、マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｐｒｉｍｅｖｉｅｗ、処置当たりｎ＝４～６の生物学的反復測定）を用いたＨＤ神経細胞（ＣＡＧ１７／４８（配列番号７６／７８））およびＨＤ線維芽細胞（ＣＡＧ１８／４５（配列番号７９／８０））中でのゲノム全域にわたる特異性評価を図示する。図２Ｍでは、２つのＺＦＰ－ＴＦ：ＺＦＰ－ＢおよびＺＦＰ－４５２４９を比較した。点は、ＺＦＰ－ＴＦ処置なしと比較して２倍を超えて制御された遺伝子を表す。図２Ｎは、ＺＦＰ－４５２４９を用いた、ＧｅｎｅＡ０２０神経細胞中でのｍＨｔｔ対立遺伝子および野生型対立遺伝子の抑制を図示する。これらの同じＺＦＰに対するＣＰＥＢ１およびＭＢＤ５の抑制も示されている（実施例５参照）。図２Ｎは、それぞれ、出現の順に、配列番号７６および７８を開示する。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図３Ａ～３Ｇは、Ｒ６／２マウスにおける行動異常の改善および神経保護を図示する。図３Ａは、野生型およびＡＡＶ処置されたＲ６／２マウス中で評価された行動的および分子的評価項目の時系列の概要である。図３Ｂは、ＺＦＰ－Ｂ（左棒）またはＧＦＰ（右棒）のいずれかをコードするＡＡＶ２／６での処置後に毎週評価されたクラスピング行動を示すマウスの百分率を示す。群当たりｎ＝１４；処置効果Ｐ＝０．０２４、ログランク検定。図３Ｃおよび３Ｄは、野生型（左）、ＺＦＰ－Ｂ処置されたＲ６／２（中央）またはＧＦＰ処置された（右）Ｒ６／２マウスに対して、４（ベースライン）、６、８、１０および１２週齢で行われた、後肢での立ち上がり頻度（３Ｃ）または総移動距離（３Ｄ）に対するオープンフィールド試験から得られた結果を示す。反復測定分散分析、（３Ｃ、３Ｄ）遺伝子型主効果Ｐ＜０．０００１、（図３Ｃ）処置効果Ｐ＜０．００９、（３Ｄ）処置効果Ｐ＜０．０３８。図３Ｅは、ｑＲＴ－ＰＣＲによって、送達から７週後に測定されたＷＴおよび変異体Ｈｔｔ（Ｒ６／２）ｍＲＮＡを図示する。ｎ＝１４～２０半球；平均±標準偏差。図３Ｆは、（３Ｅ）と同様に、線条体の神経細胞マーカー、ＤＡＲＰＰ３２、ＰＤＥ１０Ａ、ＤＲＤ１ＡおよびＤＲＤ２のｍＲＮＡレベルのｑＲＴ－ＰＣＲ評価である；群当たりｎ＝６（野生型）、１４（ＧＦＰ）および２０（ＺＦＰ－Ｂ）半球；平均±標準偏差が示されている。図３Ｇは、ｍＨｔｔ、ＤＡＲＰＰ３２、ＰＤＥ１０Ａ、ＤＲＤ１ＡまたはＤＲＤ２レベルのいずれかとＺＦＰ－Ｂ ｍＲＮＡレベルの間の相関である。全ての線条体の部分切片が含まれている。９５％信頼帯が示されている。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図４Ａ～４Ｔは、ノックインＨＤマウスモデル中でのｍＨＴＴのＺＦＰによって誘導された抑制を示す。図４Ａおよび４Ｂは、ＺＦＰ－ＢまたはΔＤＢＤ．Ｔ２Ａ．ＧＦＰをコードするＡＡＶ２／１＋２での感染から１０日後における、ｚＱ１７５神経細胞中のマウスまたは変異体ＨＴＴ ｍＲＮＡ（図４Ａ）または可溶性タンパク質（図４Ｂ）レベルを図示する。ｍＲＮＡは、ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。タンパク質は、Ｓｉｎｇｕｌｅｘ（マウスＨＴＴ）またはＭＳＤ（ｍＨＴＴ）プラットフォーム上で評価した。図４Ｃは、ｚＱ１７５ヘテロ接合マウス研究での評価項目を示す時系列の概要である。図４Ｄは、２月齢においてＺＦＰ－Ｂ．Ｔ２Ａ．ＧＦＰをコードするＡＡＶ２／１＋２を注射され、ｍＥＭ４８、ＧＦＰ、ＤＡＲＰＰ－３２およびＤＡＰＩに対する染色（色は示されていないが以下のとおりである：ＨＴＴ封入体（ｍＥＭ４８）：黄色、ＧＦＰ：緑、ＤＡＲＰＰ－３２：赤、ＤＡＰＩ：青色）によって４月齢において分析されたヘテロ接合ｚＱ１７５線条体中のｍＥＭ４８免疫染色の代表的画像を示す。伸長したＧＦＰ＋およびＧＦＰ－領域が右に示されている。図４Ｅおよび４Ｆは、２～４ヶ月処置コホートから得られた線条体ＭＳＮ中の核周囲（図４Ｅ）および核（図４Ｆ）ｍＨＴＴ封入体の定量を示す；ｎ＝５；平均±標準偏差。４Ｅ～４Ｏにおいて使用された統計解析：ウェルチの補正を行う両側ｔ検定。図４Ｇは、（４Ｅおよび４Ｆ）と同様のＧＦＰ＋細胞中のｍＥＭ４８強度の定量を示す；ｎ＝５；平均±標準偏差。図４Ｈは、６月齢において、ＺＦＰ－Ｂ．Ｔ２Ａ．ＧＦＰをコードするＡＡＶ２／１＋２を注射され、１０月齢において分析されたヘテロ接合のマウスを使用したことを除き、４Ｄと同様のデータを示す。図４Ｉおよび４Ｊは、ＡＡＶ２／１＋２ ＺＦＰ－Ｂ．Ｔ２Ａ．ＧＦＰ、ΔＤＢＤ．Ｔ２Ａ．ＧＦＰまたはＧＦＰで処置された６～１０ヶ月コホートであることを除き、図４Ｅおよび４Ｆと同様のデータを示す。ｎ＝５；平均±標準偏差。図４Ｋは、ＡＡＶ２／１＋２ ＺＦＰ－Ｂ．Ｔ２Ａ．ＧＦＰ、ΔＤＢＤ．Ｔ２Ａ．ＧＦＰまたはＧＦＰで処置された６～１０ヶ月コホートであることを除き、図４Ｇと同様である。ｎ＝５；平均±標準偏差。図４Ｌは、１０月齢でＷＴおよびヘテロ接合ｚＱ１７５マウスの線条体中でＩＨＣによって測定されたＤＡＲＰＰ３２を図示する；ｎ＝５；平均±標準偏差。図４Ｍは、６月齢においてＡＡＶ２／１＋２ ＺＦＰ－Ｂ．Ｔ２Ａ．ＧＦＰ、ΔＤＢＤ．Ｔ２Ａ．ＧＦＰまたはＧＦＰを注射され、１０月齢において分析されたマウス線条体中のＤＡＲＰＰ３２レベルを図示する；ｎ＝５；平均±標準偏差。図４Ｎは、６月齢においてＺＦＰ－Ｂ．Ｔ２Ａ．ＧＦＰをコードするＡＡＶ２／１＋２を注射され、１０月齢においてＧＦＰ、ＤＡＰＩ、ＧＦＡＰおよびＩＢＡ１に対して分析された（色は示されていないが以下のとおりである：ＧＦＰ：緑、ＤＡＰＩ：青、ＧＦＡＰ：赤、ＩＢＡ１：黄色）ヘテロ接合ｚＱ１７５線条体中のＧＦＡＰおよびＩＢＡ１免疫染色の代表的画像を示す。図４Ｏおよび４Ｐは、６月齢において、ＡＡＶ２／１＋２ ＺＦＰ－Ｂ．Ｔ２Ａ．ＧＦＰ、ΔＤＢＤ．Ｔ２Ａ．ＧＦＰまたはＧＦＰで処置され、１０月齢において分析されたマウスの線条体中の全ての細胞と比較したＧＦＡＰ＋（ｏ）およびＩＢＡ＋（ｐ）細胞の定量を示す；ｎ＝５；平均±標準偏差。図４Ｑは、同一の樹状突起内の近位および遠位の位置において、ｂＡＰ誘発Ｃａ２＋画像の線スキャンが撮影され、樹状突起指標を計算するために使用されたことを示す。図４Ｒは、４ヶ月においてＺＦＰ－Ｄ．Ｔ２Ａ．ｔｄＴｏｍａｔｏ（ｚＱ１７５、左）、ΔＤＢＤ．Ｔ２Ａ．ｔｄＴｏｍａｔｏ ＺＱ１７５ ｈｅｔ（ｚＱ１７５、中央）またはＺＦＰ－Ｄ．Ｔ２Ａ．ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＷＴ同腹仔、右）のいずれかをコードするＡＡＶ２／９を注射され、６ヶ月において試験されたマウス由来の一過性Ｃａ２＋上昇を示す。図４Ｓおよび４Ｔは、ΔＤＢＤ．Ｔ２Ａ．ｔｄＴｏｍａｔｏ ｚＱ１７５（ｎ＝６～１１）およびＺＦＰ－Ｄ．Ｔ２Ａ．ｔｄＴｏｍａｔｏ ＷＴマウス（ｎ＝１０～１５）と比較した、ＺＦＰ－Ｄ．Ｔ２Ａ．ｔｄＴｏｍａｔｏで処置されたｚＱ１７５ ＨＥＴに対する２～６ヶ月（ｓ）または４～６ヶ月（ｔ）コホート（ｎ＝１０～１７）における樹状突起指標の救出を示す。マン－ホイットニーＵ、片側。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図５Ａ～５Ｆは、Ｑ１７５ ｈｅｔマウスの線条体中でのＺＦＰ発現による画像化マーカーの回復を示す。図５Ａ～５Ｆは、ＺＦＰ－Ｄ（右）またはＧＦＰ（左）コードするＡＡＶ２／１＋２のいずれかをを一側性に注射されたマウス（ｎ＝１０／群）のオートラジオグラフィー分析を示す。マウスは、２ヶ月に注射され、Ｄ１（図５Ａおよび５Ｄ）、Ｄ２（図４Ｂおよび４Ｅ）およびＰＤＥ１０（図５Ｃおよび５Ｆ）に対するマーカーを用いて、６ヶ月に分析され（図５Ｃ）、または４ヶ月に注射され、１０ヶ月に分析された（図５Ｄ～５Ｆ）。Ｄ１、Ｄ２およびＰＤＥ１０に対する特異的結合は、両研究において、ＡＡＶ２／１＋２ ＺＦＰ－Ｄで処置されたマウス中で有意に増加された（対応のあるｔ検定）。図５Ｇは、６．５／７月齢および１０月齢において、ＺＦＰ－ＤまたはＧＦＰをコードするＡＡＶ２／１＋２ ＺＦＰで処置されたｚＱ１７５マウスの注射された線条体対注射されていない線条体中での［１８Ｆ］ＭＮＩ－６５９のＢＰＮＤの％差を示す（ｎ＝３３～４１マウス／群／時点）。対応のないｔ検定によって、２つの処置群間で、右の線条体と左の線条体との％差を比較した。（図５Ｈ）１５分から６３分まで平均された、ＡＡＶ２／１＋２ ＺＦＰ－Ｄで処置された１０月齢ｚＱ１７５ ｈｅｔマウスの平均［１８Ｆ］ＭＮＩ－６５９％ＳＵＶ画像。テンプレートＭＲＩ（上列）ＰＥＴ（中央列）が、下列中で同時に位置合わせされている。左（非処置）および右（処置）線条体の両方が、矢状面に示されている（ｎ＝３６）。アスタリスクは、ＺＦＰ－Ｄ処置された線条体半球中で得られたＰＤＥ１０結合の増加を表す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図６Ａおよび６Ｂは、対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイの検証を示す。図６Ａは、ＨＴＴのｒｓ６３０９９Ｔ（０９９Ｔ）およびｒｓ３６３０９９Ｃ（０９９Ｃ）ＳＮＰに対応する、調製されたプラスミドテンプレートを用いた結果を示す。０９９Ｔ ＳＮＰは、ＧＭ０２１５１ ＣＡＧ１８／４５（配列番号７９／８０）およびＧＭ０４７２３ ＣＡＧ１５／６７ＨＤ（配列番号８１／８２）線維芽細胞中のＷＴ ＨＴＴと一致しているのに対して、０９９Ｃは、同じ細胞中の変異体ＨＴＴと一致している。次いで、示されているとおり、逆数系列希釈を調製するために、プラスミドを使用した。これを達成するために、固定量（１．２５ｆｇ）の０９９Ｔテンプレートの存在下で、５ｆｇから０．１５６ｆｇまで、０９９Ｃテンプレートを２倍系列希釈し（０．１２５：１から４：１までの０９９Ｃ：０９９Ｔ）、固定量（１．２５ｆｇ）の０９９Ｃテンプレートの存在下で、５ｆｇから０．１５６ｆｇまで、０９９Ｔテンプレートを２倍系列希釈した（０．１２５：１から４：１までの０９９Ｔ：０９９Ｃ）。ＨＴＴおよびｍＨＴＴ発現が枯渇された第三の患者線維芽細胞株から調製された固定量の全ｃＤＮＡの存在下で、系列希釈を構築した（実施例中の方法を参照）。この株では、ＨＴＴおよびｍＨＴＴは、同じく（それぞれ）０９９Ｔおよび０９９Ｃと一致していた。１：１プラスミド比から得られるｑＲＴ－ＰＣＲシグナルが枯渇されていない細胞由来のＨＴＴおよびｍＨＴＴ ｃＤＮＡからのｑＲＴ－ＰＣＲシグナルと概ね同じであるように、プラスミドレベルを選択した。希釈試料のそれぞれに対して、０９９Ｃ特異的（右の棒）および０９９Ｔ特異的（左の棒）ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイを行った。１：１の０９９Ｔおよび０９９Ｃテンプレート比を有する試料に対する得られた値の割合として、相対的な量をプロットする。図６Ｂは、ｒｓ３６２３３１Ｔ（３３１Ｔ、ＮＤ３０２５９ ＣＡＧ２１／３８（配列番号８３／８４）ＨＤ線維芽細胞中のＷＴ ＨＴＴと一致）およびｒｓ３６２３３１Ｃ（３３１Ｃ、ＮＤ３０２５９ ＣＡＧ２１／３８（配列番号８３／８４）ＨＤ線維芽細胞中のｍＨＴＴと一致）に対するプラスミドテンプレートから得られた結果が、ＷＴおよび変異体ＨＴＴの両方を９０％超抑制する二対立遺伝子ＺＦＰリプレッサーを形質移入されているＧＭ２１７５６線維芽細胞（ＣＡＧ１５／７０（配列番号８１／８５）から作られたｃＤＮＡ中に系列希釈されたことを示す。固定量（０．５ｆｇ）の３３１Ｔテンプレートの存在下で、２ｆｇから０．０６２５ｆｇまで、３３１Ｃテンプレートを２倍系列希釈し、固定量（０．５ｆｇ）の３３１Ｃテンプレートの存在下で、２ｆｇから０．０６２５ｆｇまで、３３１Ｔテンプレートを２倍系列希釈した。希釈試料のそれぞれに対して、３３１Ｃ特異的（赤い棒）および３３１Ｔ特異的（青い棒）ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイを行った。１：１の３３１Ｔおよび３３１Ｃテンプレート比を有する試料に対する得られた値の割合として、相対的な量をプロットする。 同上。
図７Ａおよび７Ｂは、１００倍の形質移入されたＺＦＰ ｍＲＮＡにわたる用量依存的ＺＦＰタンパク質発現を示す。図７Ａは、２×１０５細胞当たり１０００、３００、１００、３０および１０ｎｇの用量でＺＦＰ ｍＲＮＡを形質移入されたＨＤ線維芽細胞（ＧＭ０４７２３、ＣＡＧ１５／６７（配列番号８１／８２））を示す。形質移入の５時間後、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ Ｆ１８０４）を用いてＺＦＰウェスタンブロットのために、細胞を採集した。図７Ｂは、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ画像化装置を用いて定量化されたＺＦＰおよびＧＡＰＤＨタンパク質レベルを示しており、各試料に対するＺＦＰ／ＧＡＰＤＨ比は、１に設定した１，０００ｎｇのＺＦＰ－Ｃ試料の比に対して大きさを調整した。 同上。
図８Ａおよび８Ｂは、ＨｄｈＱ７／Ｑ１１１線条体細胞中での候補ＺＦＰデザインの試験を示す。図８Ａおよび８Ｂは、従前の研究において使用されたマウス細胞（ＳＴＨｄｈＱ１１１／ＨｄｈＱ７マウスモデルから得た細胞；ＣＡＧ４／１１１（配列番号８６／８７））（図８Ａ）中での候補ＺＦＰ－ＴＦデザインによって示された対立遺伝子選択性との、本研究のために使用されたスクリーニング系（患者線維芽細胞；ＣＡＧ１８／４５（配列番号７９／８０））（図８Ｂ）中での候補ＺＦＰ－ＴＦデザインによって示された対立遺伝子選択性の比較を示す。患者線維芽細胞系では、３つの試験されたデザイン（ＺＦＰ－Ａ、ＺＦＰ－Ｂ、ＺＦＰ－Ｄ）のみが高度に対立遺伝子特異的抑制を示す（７５％を超える変異体対立遺伝子の抑制、１０％未満の野生型対立遺伝子の抑制）。これに対して、厳密性がより低いマウス細胞中では、２５のデザインがこのような挙動を示す。マウス細胞研究のために、対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して、１００ｎｇのＺＦＰまたはＧＦＰ ｍＲＮＡでのＳＴＨｄｈＱ１１１／ＨｄｈＱ７マウス線条体細胞の形質移入の２４時間後にＷＴ（ＣＡＧ４（配列番号８６））およびＫＩ（ＣＡＧ１１１（配列番号８７））Ｈｔｔ対立遺伝子を測定した。ＥＩＦ４ａ２、ＡＴＰ５ｂおよびＧＡＰＤＨの平均に対して、Ｈｔｔシグナルを標準化し、次いで、ＧＦＰ（１と設定する）に対して大きさを調整した；ｎ＝３生物学的反復測定；平均±標準偏差。 同上。
図９は、ＨＤ線維芽細胞中での、Ｇａｒｒｉｇａ－Ｃａｎｕｔら、（２０１２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９（４５）：ｅ３１３６－４５から得たＣＡＧ標的化ＺＦＰの試験を示し、従前の研究からの患者線維芽細胞（ＣＡＧ１８／４５（配列番号７９／８０））中での対立遺伝子選択的抑制の比較を示す（ＺＦ６およびＺＦ１１、Ｇａｒｒｉｇａ－Ｃａｎｕｔら、（２０１２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９（４５）：ｅ３１３６－４５）参照）。１０００、３００または１００ｎｇのＺＦＰ ｍＲＮＡのいずれかでのＧＭ０２１５１線維芽細胞の形質移入の２４時間後における、全、ＷＴ（ＣＡＧ１８（配列番号８６））および変異体（ＣＡＧ４５（配列番号８７））ＨＴＴ ｍＲＮＡに対する対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲ。ＨＴＴ発現は、（図１Ｄ）と同様に標準化した。本研究において使用された同じ発現カセット中に、公表されたＺＦ６－ＫｏｘおよびＺＦ１１－Ｋｏｘ配列をクローニングし、図１Ｄで試験された全てのＺＦＰに対するインビトロ転写されたｍＲＮＡを平行して調製した；ｎ＝３技術的反復測定；平均±標準偏差。
図１０Ａ～１０Ｄは、分化したＣＡＧ１７／４８（配列番号７６／７８）ｈＥＳＣ中でのＮＳＣおよび神経細胞のマーカーの発現を示す。図１０Ａは、ＣＡＧ１７／４８（配列番号７６／７８）ＥＳＣ（ＧＥＮＥＡ０２０）から分化したＮＳＣ中でのＩＨＣによって確認された、ＮＳＣ特異的なＰＡＸ６（明るい陰影）およびネスチン（暗い陰影）の発現を示す。図１０Ｂは、一団の多能性マーカー（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧおよびＲＥＸ１）またはＮＳＣマーカー（ＰＡＸ６、ＳＯＸ１およびＮＥＳ）に対する発現レベルがＥＳＣまたは分化したＮＳＣ中でのｑＲＴ－ＰＣＲによって測定されたことを示す。ＧＡＰＤＨに対して、遺伝子発現を標準化し、ＥＳＣ（上のパネル）またはＮＳＣ（下のパネル）中での標準化された発現レベル（１と設定）に対して大きさを調整した；ｎ＝２生物学的反復測定；平均±標準偏差。図１０Ｃは、分化したＣＡＧ１７／４８（配列番号７６／７８）神経細胞（ＤＡＰＩ、より明るい陰影）中でのＩＨＣによって、神経細胞特異的βＩＩＩ－チューブリン発現（より暗い陰影）が確認されたことを示す。図１０Ｄは、ＣＡＧ１７／４８（配列番号７６／７８）ＮＳＣまたは分化した神経細胞からのｑＲＴ－ＰＣＲによって測定された一団の神経細胞マーカー（ＭＡＰ２、ＧＡＤ１およびＦＯＸＧ１）またはＮＳＣマーカー（ＰＡＸ６、ＳＯＸ１およびＮＥＳ）に対する発現レベルを示す。ＧＡＰＤＨに対して、遺伝子発現を標準化し、神経細胞（上）またはＮＳＣ（下）中での標準化された発現レベル（１と設定）に対して大きさを調整した；ｎ＝２生物学的反復測定；平均±標準偏差。 同上。 同上。 同上。
図１１Ａ～１１Ｄは、ＨＤ線維芽細胞中でのＺＦＰ特異性評価を示す。図１１Ａは、表記ＺＦＰ－ＴＦによる遺伝子発現の倍数変化を示す。各点は、対照処置された細胞と比較した、表記ＺＦＰで処置された細胞中での単一遺伝子に対する転写物レベルの倍数変化（ｘ軸）およびｐ値（ｙ軸）を表す。ｐ値＜０．０１で２倍を超えて制御された遺伝子が示されている。図１１Ｂは、表記遺伝子の倍数抑制を示す。図１１Ｂは、それぞれ、出現の順に、配列番号７９および８０を開示する。図１１Ｃは、表記遺伝子のパーセント標準化された発現を示す。図１１Ｄは、図１１Ｃ中の制御された遺伝子のベン図を表す。さらなる記述については、例えば、実施例を参照。 同上。 同上。 同上。
図１２Ａおよび１２Ｂは、マイクロアレイ研究で使用された試料中での対立遺伝子選択的ＨＴＴ抑制の確認を示すグラフである。ＧＥＮＥＡ０２０神経細胞（図１２Ａ中に示されている（それぞれ、出現の順に、（配列番号７６および７８）；図２Ｆおよび２Ｇに対応）およびＧＭＯ２１５１線維芽細胞（図１２Ｂ中に示されている（それぞれ、出現の順に、（配列番号７９および８０）；図１１Ａに対応）に対するマイクロアレイ分析に供されたＲＮＡ試料（処置当たり６つの生物学的反復測定）中でのｍＨＴＴの制御を確認するために、対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を行った。図２Ｂ（ＧＥＮＥＡ０２０神経細胞）および図１Ｉ（ＧＭＯ２１５１線維芽細胞）と同様に、対立遺伝子特異的ｑＰＣＲを分析した。 同上。
図１３Ａ～１３Ｃは、野生型（「Ｒ６２＿ＷＴ」）被験体およびＧＦＰ導入遺伝子（「Ｒ６２＿Ｔｇ ＧＦＰ」）またはＺＦＰ－ＴＦ３３０７４（「Ｒ６２＿Ｔｇ３３０７４」）で処置された被験体に対する、Ｒ６／２マウス研究の体重およびさらなる行動的データを示す。図１３Ａは、表記週における体重を図示するグラフである。雄雌混合、雄および雌の被験体に対する別々のグラフが示されている。図１３Ｂは、表記条件下での下降時間を図示するグラフである。雄雌混合、雄および雌の被験体に対する別々のグラフが示されている。図１３Ｃは、表記週における前肢握力：体重の標準化された比を図示するグラフである。さらなる記述については、実施例も参照。 同上。 同上。
図１４Ａ～１４Ｃは、ＡＡＶ１／２－ｈＳＹＮ１－ＧＦＰおよびＡＡＶ１／２－ｈＳＹＮ１－ＧＦＰを注射されたｚＱ１７５マウスのＩＨＣ分析を示す。対照構築物を注射されたヘテロ接合のｚＱ１７５マウスの線条体中でのｍＥＭ４８免疫染色の代表的画像。図１４Ａは、２月齢においてＡＡＶ２／１＋１－ｈＳＹＮ１－ＧＦＰを注射され、４月齢で分析された被験体から得られた結果を示し；図１４Ｂは、６月齢においてＡＡＶ２／１＋１－ｈＳＹＮ１－ＧＦＰを注射され、１０月齢で分析された被験体から得られる結果を示し；図１４Ｃは、６月齢でＡＡＶ２／１＋１－ｈＳＹＮ１－ΔＤＢＤ．Ｔ２Ａ．ＧＦＰを注射され、１０月齢で分析された被験体から得られた結果を示す。色は示されておらず、以下のとおり：Ｈｔｔ封入体（ｍＥＭ４８）：黄色、ＧＦＰ：緑、ＤＡＲＰＰ－３２：赤色、ＤＡＰＩ：青色。 同上。 同上。
図１５Ａ～１５Ｇは、処置された野生型およびｚＱ１７５マウス中での神経炎症の評価を示す。図１５Ａは、表記分子（ＧＦＰ、ＤＡＰ、ＧＦＡＰ、ＢＡ１）に対する免疫染色の結果を示す。図１５Ｂは、表記のとおり処置された被験体における２～６ヶ月での、全ての細胞に対するｂａ１細胞の比を示すグラフである。図１５Ｃは、表記のとおり処置された被験体における２～６ヶ月での、全ての細胞に対するＧＦＡＰ細胞の比を示すグラフである。図１５Ｄは、表記のとおり処置された被験体における２～６ヶ月での、ＧＦＡＰ細胞中のＧＦＡＰ Ｆ強度を示すグラフである。図１５Ｅは、表記のとおり処置された被験体における６～１２ヶ月での、全ての細胞に対するｂａ１細胞の比を示すグラフである。図１５Ｆは、表記のとおり処置された被験体における６～１２ヶ月での、全ての細胞に対するＧＦＡＰ細胞の比を示すグラフである。図１５Ｇは、表記のとおり処置された被験体における６～１２ヶ月での、ＧＦＡＰ細胞中のＧＦＡＰ Ｆ強度を示すグラフである。さらなる記述については、実施例も参照。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図１６Ａ～１６Ｅは、ｚＱ１７５マウス中のＺＦＰ－Ｄに対する分子的および組織病理学的架橋データを示す。図１６Ａは、ＺＦＰ－Ｄまたはモックで処置された被験体の神経細胞中での野生型および変異体Ｈｔｔの標準化されたｍＲＮＡ発現を示す。図１６Ｂは、表記された条件下での野生型および変異体ＨｔｔのＨＴＴタンパク質発現。図１６Ｃは、処置の２～６ヶ月後（左）または６～１２ヶ月後（右）に表記のとおり処置された被験体での核周囲封入体の密度を示す。図１６Ｃは、処置の２～６ヶ月後（左）または６～１２ヶ月後（右）に表記のとおり処置された被験体のＺＦＰ＋およびＮｕｅＮ＋神経細胞中の核封入体を示す。図１６Ｄは、処置の２～６ヶ月後（左）または６～１２ヶ月後（右）に表記のとおり処置された被験体のＺＦＰ＋およびＮｕｅＮ＋神経細胞中でのＥＭ４８核強度を示す。さらなる記述については、実施例も参照。 同上。 同上。 同上。 同上。
図１７Ａ～１７Ｆは、６ＣＡＧリピートを超えるまたは６ＣＡＧリピートに等しい（「≧ＣＡＧ×６」）を有する遺伝子のヒトおよびマウスゲノム中でのＣＡＧリピート含量の分析を示す。図１７Ａは、６マー当たり０個のミスマッチに対するスクリーニングの結果を示す。図１７Ｂは、転写部位部位（ＴＳＳ）の１ｋｂ以内の０個のミスマッチに対するスクリーニングの結果を示す。図１７Ｃは、６マー当たり３個以下のミスマッチに対するスクリーニングの結果を示す。図１７Ｄは、ＴＳＳの１ｋｂ以内の３個以下のミスマッチに対するスクリーニングの結果を示す。図１７Ｅは、０個のミスマッチを有する上位１００個の遺伝子（左）および３以下のミスマッチを有する上位１００個の遺伝子（右）のマウスおよびヒトの比較を示す。図１７Ｆは、０個のミスマッチを有する上位１００個の遺伝子（左）および３以下のミスマッチを有する上位１００個の遺伝子（右）のヒトおよびマウス（ｎｉｙｓｅ）の比較を示す。さらなる記述については、実施例も参照。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
変異体Ｈｔｔ対立遺伝子のＺＦＰ遺伝的調節因子を用いて被験体中の毒性ｍＨＴＴタンパク質レベルのレベルを低下させるための組成物および方法が本明細書に開示されている。本明細書に記載されている遺伝子リプレッサーは、ＨＤ集団中に見出される野生型対立遺伝子の８６％超の発現を保ちながら、８０倍の用量範囲にわたって、ＨＤを引き起こす対立遺伝子の９９％超を選択的に抑制する。同時に、他のＣＡＧ含有遺伝子の発現は最小限に影響を受け、ウイルスによって送達されたリプレッサーは、培養中で１００日を超えて、およびマウス脳内で少なくとも４ヶ月、ＨＤ神経細胞中で活性を示し、良好に耐容される。さらに、本明細書に記載されている遺伝子リプレッサーは、この疾患の複数の受容された動物モデルにおいて、ＨＤの分子的、組織病理的、電気生理的および表現型的是正をもたらす。
本明細書に記載されている方法および組成物は、天然のＨＴＴ遺伝子座における対立遺伝子選択的な転写抑制を与える。患者由来細胞における大規模な試験から得られた結果は、３８以上のＣＡＧリピートを有するｍＨＴＴ対立遺伝子からの発現は７９～９３％抑制することができるのに対して、２１以下のＣＡＧリピート（試験された最長の正常なリピート長）を有する正常な対立遺伝子からの発現はわずかに０～３１％抑制されることを実証する。したがって、対立遺伝子選択的ＺＦＰ－ＴＦは、ＨＤ集団において、完全に浸透性の変異体対立遺伝子の１００％と正常なＨＴＴ対立遺伝子の少なくとも８６％とを識別する特筆すべき能力を示す。それぞれがＨＤ患者の一部集団に限定されるＳＮＰベースの対立遺伝子選択的ｍＨＴＴ低下アプローチと比べて（Ｐｆｉｓｔｅｒら、（２００９）Ｃｕｒ Ｂｉｏｌ １９（９）：７７４－７７８；Ｓｏｕｔｈｗｅｌｌら、（２０１４）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２２（１２）：２０９３－１０６））、本研究に記載されているＣＡＧ標的化ＺＦＰリプレッサーは、ＨＤ患者の大半において、発病性対立遺伝子からの発現を選択的に下方制御する能力を有する。
正常なＨＴＴ発現の部分的な低下（約４５％）は、非ヒト霊長類線条体において耐容されるが（Ｇｒｏｎｄｉｎら、（２０１２）Ｂｒａｉｎ １３５（４）：１１９７－１２０９；ＭｃＢｒｉｄｅら、（２０１１）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９：２１５２－２１６２；Ｓｔｉｌｅｓら、（２０１２）Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ２３３：４６３－４７１）、さらなる低下の長期的な悪影響は不明である。ＨＴＴは、細胞内輸送、エネルギー、転写制御および自食作用を含む無数の生物機能において役割を果たす（Ｚｕｃｃａｔｏ、同書）。マウスでは、Ｈｔｔノックアウトは、胚性致死であり（Ｄｕｙａｏら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：４０７－４１０；Ｚｅｉｔｌｉｎら、（１９９５）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １１：１５５－１６３；Ｎａｓｉｒら、（１９９５）Ｃｅｌｌ ８１：８１１－８２３）、周産期における喪失は運動機能不全およびその他の神経病理をもたらし（Ｄｒａｇａｔｓｉｓら、（２０００）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２６：３００－３０６；Ａｒｔｅａｇａ－Ｂｒａｃｈｏら、（２０１６）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ ９６：１４４－１５５）、神経系発達における重要な役割を示唆する。成体マウス脳中での条件的なノックアウトは耐容されるように見受けられるが（Ｗａｎｇら、（２０１６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１３：３３５９－３３６４）、複合ヘテロ接合低形質ＨＴＴ変異形は、レット症候群様障害と関連があるとされており（Ｌｏｐｅｓ、Ｆ．ら、（２０１６）Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ５３：１９０－１９９；Ｒｏｄａｎら、（２０１６）Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２４：１８３３）、ヒトにおける決定的な役割を示唆する。したがって、ｍＨＴＴと同時に正常なＨＴＴを低下させること、特にベースラインレベルの５０％を下回って低下させることは、未知のリスクをもたらす。その結果、臨床的な使用に適した対立遺伝子選択的なｍＨＴＴ低下アプローチの開発は、長く待望されていた最終目標であった。
分解または翻訳の阻害によってｍＨＴＴ転写物を選択的に下方制御するために、ＲＮＡを標的とする様々な様式が調べられてきた。例えば、ｍＨＴＴ対立遺伝子と関連する一塩基多型（ＳＮＰ）を標的としたＡＳＯおよびＲＮＡｉをベースとする戦略は（Ｐｆｉｓｔｅｒら、（２００９）Ｃｕｒ Ｂｉｏｌ １９（９）：７７４－７７８；Ｌｏｍｂａｒｄｉら、（２００９）Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ２１７：３１２－３１９；Ｃａｒｒｏｌｌら、（２０１１）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１９（１２）：２１７８－８５）、ＨＤマウスモデルにおいて、ｍＨＴＴを選択的に低下させることが示されている。これらのアプローチの臨床開発に対する大きな障害は、各ＳＮＰ特異的な治療はその特定のＳＮＰを有する患者の一部集団のみしか処置できないことである（Ｋａｙら、（２０１５）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２３：１７５９－１７７１）。または、ＣＡＧリピートを直接標的とすることは、原理的には、全てのＨＤ患者に対する単一の治療となるであろう。しかしながら、おそらくは、選択性を達成するために質量作用効果に共通して依存している故に、ＣＡＧリピートに対するＡＳＯおよびＲＮＡｉベースの試薬は、これまでのところ、若干のレベルの対立遺伝子の識別を与えたに過ぎない（Ｅｖｅｒｓら、（２０１１）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（９）：ｅ２４３０８；Ｇａｇｎｏｎら、（２０１０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９：１０１６６－１０１７８；Ｈｕら、（２００９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２７：４７８－４８４；Ｙｕら、（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８９５－９０８；Ｆｉｓｚｅｒら、（２０１１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９：５５７８－５５８５）。
本明細書に記載されているように、プロモーターに近接して存在する伸長したＣＡＧ鎖への直接の結合を介した転写の抑制は、ｍＨｔｔレベルを効果的に低下させる。１つの理論に拘泥するものではないが、このアプローチは、転写の制御において機能的な相乗作用（Ｌｕｔｚら、（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ２８：３８６－３８９）および協同作用（Ｒｅｉｔｅｒら、（２０１７）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ４３：７３－８１）を活用することによって、より大きな程度の対立遺伝子の識別を与え、転写物合成のレベルを設定する上で複数の局所的制御要素を使用することができる。本発明者らのアプローチは、それ自体が病原性因子の可能性がある変異体ＲＮＡのレベルを低減するという付加的な恩恵を与える（Ｍａｒｔｉ（２０１６）Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ２６：７７９－７８６）。このアプローチは、細胞当たり何万という変異体ＲＮＡまたはタンパク質種の結合を伴う他のアプローチとは対照的に、単一コピーの治療標的（内在性ｍＨＴＴ遺伝子）の認識のみを必要とするので、転写抑制は、ｍＨＴＴの完全な消失を達成するためのより効果的な手段も提供することができる。従前の研究では、対立遺伝子選択的制御を試みるために、ポリＣＡＧに標的化される設計された転写因子が使用されたが、より単純で、より強力でない質量作用の機序を介していた（Ｇａｒｒｉｇａ－Ｃａｎｕｔら、（２０１２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９（４５）：ｅ３１３６－４５）。調査された試薬に対しては、小さすぎて単一の標的さえ構成することができない非病原性リピートアレイ（ＣＡＧ４（配列番号８６））を有するマウス細胞中のみで、差異的な抑制が実証された。さらに、対立遺伝子の歪みは高度に強調されており（４（配列番号８６）対１１１ＣＡＧ（配列番号８７）；２８の長さ比）、典型的な患者で見られるより１０倍超大きい（１７（配列番号７６）対４３ＣＡＧ（配列番号７７）；２．５の長さ比）。
さらに、ゲノム全域にわたっても高度に特異的である本明細書に記載された対立遺伝子選択的リプレッサー（ＺＦＰ－Ｂ）を用いて、本発明者らは、３つの異なるＨＤマウスモデルにおいて、７週と４ヶ月の間の時点でのｍＨｔｔ発現の強固なインビボ抑制を実証し、その結果としての分子的、組織学的、電気生理学的および表現型的病理の是正を実証する。本発明者らは、ＨＤ神経細胞中での１００日間を超える持続的なＺＦＰ発現および効力ならびにＲ６／２およびｚＱ１７５マウス中でのＭＳＮマーカー遺伝子発現の救出も確立し、標的脳領域およびヒト細胞種中での高度に強力な、ｍＨＴＴ選択的ＺＦＰの慢性的発現が良好に耐容されることを示している。
ここで、本発明者らは、規模、試験されたデザインの複雑さおよび所望の行動を直接的に検索するスクリーンの使用という点で従前の試みとは異なる転写を標的としたアプローチ：幅広い用量範囲にわたる内在性ヒト遺伝子の対立遺伝子選択的抑制を提示する。本発明者らは、抑制がポリＣＡＧ鎖長に高度に依存する機能的に相乗的なＺＦＰの新規クラスを特定する。これらのＺＦＰリプレッサーは、ＨＤ患者の正常な対立遺伝子と疾患対立遺伝子の組み合わせの８６％超を強く識別し（Ｌａｎｄｗｅｈｒｍｅｙｅｒら、（２０１７）Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ４：２１２－２２４）、他のＣＡＧリピート遺伝子と比較してｍＨＴＴに対して高度の特異性を示す。３つのＨＤマウスモデルを用いて、本発明者らは、幅広い分子的、組織病理的、電気生理学的および機能的評価項目の改善を実証する。最後に、本発明者らは、マウス線条体への投与後少なくとも９ヶ月まで、対立遺伝子選択的ＺＦＰが良好に耐容され、ＨＤ病理の複数のモデルにおいて有効であることを実証する。
総論
方法の実施ならびに本明細書に開示されている組成物の調製および使用は、別段の記述がなければ、本分野の技術に属する、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび関連する分野における慣用技術を利用する。これらの技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７および定期的な改訂版；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９；およびＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９参照。
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、直鎖または環状立体構造の、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを表す。本開示において、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定するものと解釈されるべきではない。これらの用語は、天然のヌクレオチドの公知の類縁体ならびに塩基、糖および／またはホスフェート部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されているヌクレオチドを包含することができる。一般に、あるヌクレオチドの類縁体は、同じ塩基対合特異性を有する、すなわち、Ａの類縁体はＴと塩基対を形成するであろう。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを表すために互換的に使用される。本用語は、１またはそれを超えるアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類縁体または修飾された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも当てはまる。
「結合」は、高分子間での（例えば、タンパク質と核酸間での）配列特異的な非共有相互作用を表す。全体としての相互作用が配列特異的である限り、結合相互作用の全ての成分が配列特異的であることを必要とするわけではない（例えば、ＤＮＡ骨格中のホスフェート残基との接触）。このような相互作用は、一般的には、１０－６Ｍ－１またはそれを下回る解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けられる。「親和性」は、結合の強度を表す、すなわち、増加した結合親和性はより低いＫｄと相関する。
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域であってその構造が亜鉛イオンの配位を通じて安定化されている１またはそれを超えるジンクフィンガーを通じて、配列特異的な様式でＤＮＡを結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしば、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略称される。人工ヌクレアーゼおよび転写因子は、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインおよび機能的ドメイン（ＺＦＮに対してはヌクレアーゼドメインまたはＺＦＰ－ＴＦに対しては転写制御ドメイン）を含むことができる。「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」という用語には、１つのＺＦＮの他、二量体化して標的遺伝子を切断するＺＦＮの対（左および右ＺＦＮとしても知られる第一および第二のＺＦＮを含む。）も含まれる。
ジンクフィンガー結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガーの認識ヘリックス領域の改変操作（１またはそれを超えるアミノ酸を変化させること）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「改変操作する」ことができる。したがって、改変操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガー）は、天然に存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を改変操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が主に合理的な基準から生じる天然に存在しないタンパク質である。設計のための合理的な基準としては、既存のＺＦＰの設計ならびに結合データの情報を保存するデータベース中の情報を処理するための置換規則およびコンピュータ化されたアルゴリズムの適用が挙げられる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；および同第８，５８５，５２６号参照；国際公開第９８／５３０５８号；同第９８／５３０５９号；同第９８／５３０６０号；同第０２／０１６５３６号；および同第０３／０１６４９６号を参照。
「選択された」ジンクフィンガータンパク質は、その作製がファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの実証的過程から主として由来する天然に見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；同第８，５８６，５２６号；ならびに国際公開第９５／１９４３１号；同第９６／０６１６６号；同第９８／５３０５７号；同第９８／５４３１１号；同第００／２７８７８号；同第０１／６０９７０号；同第０１／８８１９７号；および同第０２／０９９０８４号を参照。
「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子発現抑制に関与すると考えられている原核生物のアルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。例えば、Ｓｗａｒｔｓら、（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４１９）：２５８－２６１、Ｇ．Ｓｈｅｎｇら、（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，６５２）参照。「ＴｔＡｇｏ系」は、例えば、ＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡを含む、必要とされる全ての成分である。
「組換え」は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同的組換えによるドナー捕捉を含むがこれに限定されない、２つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換の過程を表す。本開示において、「相同的組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復機序を介した細胞中での二本鎖切断の修復の間に起こるこのような交換の特殊化された形態を表す。この過程は、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経たもの）のテンプレート修復のための「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の導入をもたらすので、「非乗換え遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」と様々に称されている。いずれかの特定の理論に拘泥することを望むものではないが、このような導入は、切断された標的とドナー間で形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ修正および／または標的の一部となる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存性鎖アニーリング」および／または関連する過程を伴うことができる。このような特殊化されたＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチド中に取り込まれるように、しばしば、標的分子の配列の変化をもたらす。
本開示の方法では、本明細書に記載されている１またはそれを超える標的化されるヌクレアーゼは、所定の部位に、標的配列（例えば、細胞クロマチン）中に二本鎖切断（ＤＳＢ）を作出する。ＤＳＢは、相同組換え修復によってまたは非相同組換え修復機序によって、欠失および／または挿入をもたらし得る。欠失は、任意の数の塩基対を含み得る。同様に、挿入は、例えば、切断の領域中のヌクレオチド配列に対する相同性を必要に応じて有する「ドナー」ポリヌクレオチドの組み込みなど、任意の数の塩基対を含み得る。ドナー配列は、物理的に組み込まれ得、またはドナーポリヌクレオチドが、相同的組換えを介した切断の修復のためのテンプレートとして使用され、ドナー中などのヌクレオチド配列の全部または一部の細胞クロマチン中への導入をもたらす。したがって、細胞のクロマチン中の第一の配列は変化させることができ、ある実施形態において、ドナーポリヌクレオチド中に存在する配列へ変換することができる。したがって、「置換する」または「置換」という用語の使用は、あるヌクレオチド配列の別のヌクレオチド配列による置換（すなわち、情報的な意味での配列の置換）を表すと理解することができ、あるポリヌクレオチドの別のポリヌクレオチドによる物理的または化学的置換を必ずしも必要としない。
本明細書に記載されている方法のいずれも、任意のサイズのドナーの挿入のために、および／または関心対象の遺伝子の発現を妨害するドナー配列の標的化された組み込みによる細胞中の１もしくはそれを超える標的配列の部分的なもしくは完全な不活化のために使用することができる。部分的にまたは完全に不活化された遺伝子を有する細胞株も提供される。
本明細書に記載されている方法のいずれにおいても、外因性ヌクレオチド配列（「ドナー配列」または「導入遺伝子」）は、関心対象の領域中のゲノム配列に相同であるが同一ではない配列を含有することができ、これにより、関心対象の領域中に非同一配列を挿入するために相同的組換えを刺激する。したがって、ある実施形態において、関心対象の領域中の配列に相同であるドナー配列の部分は、置換されるゲノム配列と約８０～９９％（またはその間にある任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態において、例えば、ドナーと１００を超える連続する塩基対のゲノム配列との間で１つのヌクレオチドのみが異なれば、ドナーとゲノム配列間の相同性は９９％より高い。ある事例では、ドナー配列の非相同部分は、新たな配列が関心対象の領域中に導入されるように、関心対象の領域中に存在しない配列を含有することができる。これらの例では、一般に、５０～１，０００塩基対（またはこの間にある任意の整数値）または１，０００より大きい任意の数の塩基対の、関心対象の領域中の配列と相同または同一である配列が、非相同配列に隣接している。他の実施形態において、ドナー配列は第一の配列に対して非相同であり、非相同的組換え機序によってゲノム中に挿入される。
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を表す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むがこれらに限定されない様々な方法によって開始することができる。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は２つの別個の一本鎖切断現象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または粘着末端のいずれかの生成をもたらすことができる。ある実施形態において、標的化された二本鎖ＤＮＡ切断のために、融合ポリペプチドが使用される。
「切断半ドメイン」は、第二のポリペプチド（同一のまたは異なる）とともに、切断活性（好ましくは、二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第一および第二の切断半ドメイン；」「＋および－切断半ドメイン」および「右および左切断半ドメイン」は、二量体化する切断半ドメインの対を表すために互換的に使用される。
「改変操作された切断半ドメイン」は、別の切断半ドメイン（例えば、別の改変操作された切断半ドメイン）との絶対ヘテロ二量体を形成するように改変された切断半ドメインである。米国特許第８，６２３，６１８号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；および同第８，０３４，５９８号も参照、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
用語「配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、直鎖、環状または分岐であり得、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る任意の長さのヌクレオチド配列を表す。用語「ドナー配列」は、ゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列を表す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２～１００，０００，０００ヌクレオチドの長さ（またはこれらの間またはこれらの上にある任意の整数値）、好ましくは、約１００～１００，０００ヌクレオチドの長さ（またはこれらの間にある任意の整数）、より好ましくは、約２０００～２０，０００ヌクレオチドの長さ（またはこれらの間にある任意の値）、さらに好ましくは約５～１５ｋｂ（またはこれらの間にある任意の値）であり得る。
「クロマチン」は、細胞のゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞のクロマチンは、核酸、主にＤＮＡと、ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質とを含む。真核生物の細胞のクロマチンの大半は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４のそれぞれ２つを含む八量体と会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含み、（生物に応じた可変の長さの）リンカーＤＮＡが、ヌクレオソームコアの間に伸長する。ヒストンＨ１の分子が、一般に、リンカーＤＮＡと会合する。本開示において、用語「クロマチン」は、原核生物および真核生物の両方のあらゆる種類の細胞の核タンパク質を包含するものとする。細胞のクロマチンには、染色体のクロマチンとエピソームのクロマチンが両方含まれる。
「染色体」は、細胞のゲノムの全部または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、細胞のゲノムを含む全ての染色体の集合であるその核型によって、しばしば特徴付けられる。細胞のゲノムは、１またはそれを超える染色体を含むことができる。
「エピソーム」は、細胞の染色体の核型の一部ではない核酸を含む、複製する核酸、核タンパク質複合体または他の構造である。エピソームの例としては、プラスミドおよびある種のウイルスのゲノムが挙げられる。
「接近可能な領域」は、標的部位を認識する外因性分子によって、核酸中に存在する標的部位が結合されることができる、細胞のクロマチン中の部位である。いずれかの特定の理論に拘泥することを望むものではないが、接近可能な領域は、ヌクレオソームの構造へと凝集されない領域であると考えられる。接近可能な領域の特徴的な構造は、化学的および酵素的プローブ、例えば、ヌクレアーゼに対するその感受性によって、しばしば検出することができる。
「標的部位」または「標的配列」は、結合が存在するのに十分な条件が与えられれば、結合分子が結合する核酸の部分を規定する核酸配列である。標的部位は、任意の長さ、例えば、９～２０またはそれを超えるヌクレオチドであり得、長さおよび結合されるヌクレオチドは連続的または非連続的であり得る。
「外因性」分子は、細胞中に通常存在しないが、１またはそれを超える遺伝学的、生化学的またはその他の方法によって細胞中に導入することができる分子である。「細胞中での通常の存在」は、細胞の具体的な発達段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成体の筋肉細胞に関しては外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、熱ショックを受けていない細胞に関しては外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能しない内在性分子の機能するバージョンまたは正常に機能する内在性分子の機能しないバージョンを含むことができる。
「融合」分子は、２つまたはそれを超えるサブユニット分子が、好ましくは共有結合で、連結されている分子である。サブユニット分子は、同じ化学的種類の分子とすることができ、または異なる化学的種類の分子とすることができる。融合分子の第一の種類の例としては、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと１またはそれを超える活性化ドメインとの間の融合物）および融合核酸（例えば、上記融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。融合分子の第二の種類の例としては、三本鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物および副溝結合剤と核酸との間の融合物が挙げられるが、これらに限定されない。
細胞中での融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達の結果または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達の結果生じることができ、ここで、ポリヌクレオチドは転写され、転写物は翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチド連結も、細胞中でのタンパク質の発現に関与することができる。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達のための方法は、本開示の他の箇所に提示されている。
本開示において「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記参照）の他、そのような制御配列がコード配列および／または転写された配列に隣接しているかどうかを問わず、遺伝子産物の産生を制御する全てのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位などの翻訳制御配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界領域、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座調節領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
「遺伝子発現」は、遺伝子中に含有されている情報の、遺伝子産物への変換を表す。遺伝子産物は、遺伝子の直接の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは任意の他の種類のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化および編集などの過程によって修飾されたＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。
遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性の変化を表す。発現の調節としては、遺伝子活性化および遺伝子抑制を挙げることができるが、これらに限定されない。発現を調節するために、ゲノム編集（例えば、切断、改変、不活化、無作為な変異）を使用することができる。遺伝的調節因子は、本明細書に記載されているＺＦＰ遺伝的調節因子を含まない細胞と比較した遺伝子発現の任意の変化を表す。したがって、遺伝子不活化は、部分的または完全であり得る。
「関心対象の領域」は、外因性分子を結合することが望ましい細胞のクロマチンの任意の領域、例えば、遺伝子または遺伝子内もしくは遺伝子に隣接する非コード配列などである。結合は、標的化されたＤＮＡ切断および／または標的化された組換えを目的とすることができる。関心対象の領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）または感染性ウイルスゲノム中に存在することができる。関心対象の領域は、遺伝子のコード領域内に、転写された非コード領域内に、例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの中に、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかにある非転写領域内に存在し得る。関心対象の領域は、単一のヌクレオチド対と同じ小ささであり得、または最大２，０００ヌクレオチド対の長さであり得、または任意の整数値のヌクレオチド対であり得る。
「真核生物の」細胞としては、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるがこれらに限定されず、幹細胞（多能性および複能性）が含まれる。
「機能的な連結」および「機能的に連結された」（または「動作可能に連結された」）という用語は、両成分が正常に機能し、成分の少なくとも１つが、少なくとも１つの他の成分に対して発揮される機能を媒介することができる可能性を許容するように成分が配置されている２またはそれを超える成分（配列要素など）の並置に関して互換的に使用される。例として、１またはそれを超える転写制御因子の存在または不存在に応答して、転写制御配列がコード配列の転写のレベルを調節すれば、プロモーターなどの転写制御配列はコード配列に機能的に連結されている。転写制御配列は、一般的に、コード配列とシスに機能的に連結されるが、コード配列に直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、たとえ連続していなくても、コード配列に機能的に連結される転写制御配列である。
融合ポリペプチドに関して、「機能的に連結された」という用語は、成分のそれぞれがそのように連結されていない場合と同様に、成分のそれぞれが他の成分と連結されて同じ機能を発揮するという事実を表すことができる。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが転写抑制ドメインに融合またはその他結合されている融合分子に関しては、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することを可能にしながら、融合分子中において、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位を結合することが可能であれば、ＤＮＡ結合ドメインと抑制ドメインは機能的に連結されている。ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合されている融合ポリペプチドの場合、切断ドメインが標的部位の近傍のＤＮＡを切断することを可能にしながら、融合ポリペプチド中において、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位を結合することが可能であれば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインは機能的に連結されている。
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が完全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、完全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能をなお保持するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子より多い、より少ないもしくは同じ数の残基を有することができ、および／または１もしくはそれを超えるアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸とハイブリッドを形成する能力）を決定する方法は、本分野において周知である。同様に、タンパク質機能を決定する方法は周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動の移動度シフトまたは免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる。Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは相補性によって、遺伝学的および生化学的の両方で決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５－２４６；米国特許第５，５８５，２４５号および国際公開第９８／４４３５０号を参照。
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子導入ベクター」は、関心対象の遺伝子の発現を誘導することが可能であり、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、本用語は、クローニング、および発現媒体ならびに組み込みベクターを含む。
「被験体」および「患者」という用語は互換的に使用され、ヒト患者および非ヒト霊長類などの哺乳動物ならびにウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウスおよびその他の動物などの実験動物を表す。したがって、本明細書において使用される「被験体」または「患者」という用語は、本発明のヌクレアーゼ、ドナーおよび／または遺伝子改変された細胞を投与することができる任意の哺乳動物の患者または被験体を意味する。本発明の被験体には、障害を有する被験体が含まれる。
ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン
Ｈｔｔ遺伝子に結合するジンクフィンガータンパク質を含むＤＮＡ結合ドメインが本明細書に記載されている。例えば、米国特許第８，８４１，２６０号を参照。
改変操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して新しい結合特異性を有することができる。改変操作する方法としては、合理的な設計および様々な種類の選択が挙げられるが、これらに限定されない。合理的な設計としては、例えば、トリプレット（またはクアドルプレット）ヌクレオチド配列および個別のジンクフィンガーアミノ酸配列を含み、各トリプレットまたはクアドルプレットヌクレオチド配列が、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列を結合するジンクフィンガーの１またはそれを超えるアミノ酸配列と関連付けられているデータベースを使用することが挙げられる。例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、共有の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照。
ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む例示的な選択方法が、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；ならびに国際公開第９８／３７１８６号；同第９８／５３０５７号；同第００／２７８７８号；同第０１／８８１９７号；および英国特許第２，３３８，２３７号に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化が、例えば、共有の国際公開第０２／０７７２２７号に記載されている。
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されているように、ジンクフィンガードメインおよび／または多フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、５またはそれを超えるアミノ酸の長さのリンカーを含む任意の適切なリンカー配列を用いて一緒に連結され得る。６またはそれを超えるアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列に関しては、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されているタンパク質は、タンパク質の各ジンクフィンガーの間に適切なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化が、例えば、共有の国際公開第０２／０７７２２７号に記載されている。
標的部位の選択；ＺＦＰならびに融合タンパク質（およびこれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築の方法は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１５号；同第７８９，５３８号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；国際公開第９５／１９４３１号；同第９６／０６１６６号；同第９８／５３０５７号；同第９８／５４３１１号；同第００／２７８７８号；同第０１／６０９７０号；同第０１／８８１９７号；同第０２／０９９０８４号；同第９８／５３０５８号；同第９８／５３０５９号；同第９８／５３０６０号；同第０２／０１６５３６号；および同第０３／０１６４９６号に詳しく記載されている。
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されているように、ジンクフィンガードメインおよび／または多フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、５またはそれを超えるアミノ酸の長さのリンカーを含む任意の適切なリンカー配列を用いて一緒に連結され得る。６またはそれを超えるアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列に関しては、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されているタンパク質は、タンパク質の各ジンクフィンガーの間に適切なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。
ある実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｈｔｔ遺伝子中の標的部位に（配列特異的様式で）結合し、Ｈｔｔの発現を調節する改変操作されたジンクフィンガータンパク質である。ＺＦＰは、変異体Ｈｔｔ対立遺伝子または野生型Ｈｔｔ配列のいずれかに選択的に結合することができる。Ｈｔｔ標的部位は、典型的には、少なくとも１つのジンクフィンガーを含むが、複数のジンクフィンガー（例えば、２、３、４、５、６またはそれを超えるフィンガー）を含むことができる。通常、ＺＦＰは、少なくとも３つのフィンガーを含む。ある種のＺＦＰは４、５または６つのフィンガーを含むが、いくつかのＺＦＰは８、９、１０、１１または１２のフィンガーを含む。３つのフィンガーを含むＺＦＰは、典型的には、９または１０のヌクレオチドを含む標的部位を認識し、４つのフィンガーを含むＺＦＰは、典型的には、１２～１４のヌクレオチドを含む標的部位を認識し、６つのフィンガーを有するＺＦＰは、１８～２１のヌクレオチドを含む標的部位を認識することができる。ＺＦＰは、１またはそれを超える制御ドメインを含む融合タンパク質でもあることができ、制御ドメインは転写活性化または抑制ドメインであり得る。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、一緒に連結された２つのＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインを含む。これらのジンクフィンガータンパク質は、したがって、８、９、１０、１１、１２またはそれを超えるフィンガーを含むことができる。いくつかの実施形態において、１つのＤＮＡ結合ドメインが４、５または６つのジンクフィンガーを含み、第二のＤＮＡ結合ドメインがさらなる４、５または５つのジンクフィンガーを含むように、２つのＤＮＡ結合ドメインは、伸長可能な柔軟なリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態において、フィンガーアレイが８、９、１０、１１もしくは１２またはそれを超えるフィンガーを含む１つのＤＮＡ結合ドメインを含むように、リンカーは標準的なフィンガー間リンカーである。他の実施形態において、リンカーは、柔軟なリンカーなどの非定型リンカーである。ＤＮＡ結合ドメインは少なくとも１つの制御ドメインに融合されており、「ＺＦＰ－ＺＦＰ－ＴＦ」構造として考えることができる。これらの実施形態の具体例は、柔軟なリンカーで連結され、ＫＯＸリプレッサーに融合された２つのＤＮＡ結合ドメインを含む「ＺＦＰ－ＺＦＰ－ＫＯＸ」、２つのＺＦＰ－ＫＯＸ融合タンパク質がリンカーを介して一緒に融合されている「ＺＦＰ－ＫＯＸ－ＺＦＰ－ＫＯＸ」と表すことができる。
または、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来し得る。例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；同第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８；Ｄｕｊｏｎら、（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５－１１８；Ｐｅｒｌｅｒら、（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，１１２５－１１２７；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４－２２８；Ｇｉｍｂｌｅら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３－１８０；Ａｒｇａｓｔら、（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５－３５３およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位を結合するように改変操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら、（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５；Ｅｐｉｎａｔら、（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２－２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈら、（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６－６５９；Ｐａｑｕｅｓら、（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９－６６；米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８号を参照。
「両手型」ジンクフィンガータンパク質は、２つのジンクフィンガードメインが２つの不連続な標的部位に結合するように、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの２つのクラスターが、介在するアミノ酸によって分割されているタンパク質である。両手型タイプのジンクフィンガー結合タンパク質の例は、４つのジンクフィンガーのクラスターがタンパク質のアミノ末端に位置しており、３つのフィンガーのクラスターがカルボキシル末端に位置しているＳＩＰ１である（Ｒｅｍａｃｌｅら、（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １８（１８）：５０７３－５０８４参照）。これらのタンパク質中のジンクフィンガーの各クラスターは、特有の標的配列に結合することもでき、２つの標的配列間の間隔は多くのヌクレオチドを含むことができる。両手型ＺＦＰは、例えば、ＺＦＰの一方または両方に融合されている機能的ドメインを含み得る。したがって、機能的ドメインは一方もしくは両方のＺＦＰの外側に付着され得、またはＺＦＰ間に配置され（両ＺＦＰに付着され）得ることが明らかであろう。
融合タンパク質
本明細書に記載されているＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＺＦＰ）と異種の制御（機能的）ドメイン（またはその機能的断片）とを含む融合タンパク質も提供される。一般的なドメインとしては、例えば、転写因子ドメイン（活性化因子、リプレッサー、活性化補助因子、コリプレッサー）、サイレンサー、癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）；ＤＮＡ修復酵素およびその関連する因子および修飾因子；ＤＮＡ再編成酵素およびその関連する因子および修飾因子；クロマチン関連タンパク質およびその修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）；ならびにＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチル転移酵素、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）およびその関連因子および修飾因子が挙げられる。ＤＮＡ結合ドメインとヌクレアーゼ切断ドメインの融合物に関する詳細についての米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号；同第２００６／０１８８９８７号および同第２００７／０２１８５２８号は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
活性化を達成するための適切なドメインとしては、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍａｎｎら、（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５９５２－５９６２参照）核内ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａら．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３－３８３参照）；核内因子κＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ＆Ｂａｒｉｋ（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０－５６１８およびＤｏｙｌｅ＆Ｈｕｎｔ（１９９７）Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ８：２９３７－２９４２）；Ｌｉｕら、（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：３－２８）またはＶＰ６４などの人工キメラ機能的ドメイン（Ｂｅｅｒｌｉら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４６２３－３３）およびデグロン（Ｍｏｌｉｎａｒｉら、（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊ．１８：６４３９－６４４７）が挙げられる。さらなる例示的な活性化ドメインとしては、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ－２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ－２およびＣＴＦ１（Ｓｅｉｐｅｌら、（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４９６１－４９６８ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２ＡおよびＥＲＦ－２が挙げられる。例えば、Ｒｏｂｙｒら、（２０００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：３２９－３４７；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２３：２５５－２７５；Ｌｅｏら、（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：１－１１；Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ－Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ（１９９９）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．４６：７７－８９；ＭｃＫｅｎｎａら、（１９９９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：３－１２；Ｍａｌｉｋら、（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７－２８３；およびＬｅｍｏｎら、（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９－５０４を参照。さらなる例示的な活性化ドメインとしては、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ－１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ－５、－６、－７およびー８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ－ＲＰ／ＧＰならびにＴＲＡＢ１が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｏｇａｗａら、（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：２１－２９；Ｏｋａｎａｍｉら、（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：８７－９９；Ｇｏｆｆら、（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：２９８－３０９；Ｃｈｏら、（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：４１９－４２９；Ｕｌｍａｓｏｎら、（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：５８４４－５８４９；Ｓｐｒｅｎｇｅｒ－Ｈａｕｓｓｅｌｓら、（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１－８；Ｇｏｎｇら、（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３３－４４；およびＨｏｂｏら、（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１５，３４８－１５，３５３を参照されたい。
ＤＮＡ結合ドメインと機能的ドメインとの間での融合タンパク質（またはこれをコードする核酸）の形成において、活性化ドメインまたは活性化ドメインと相互作用する分子のいずれかが機能的ドメインとして適切であることが当業者には明らかであろう。本質的には、標的遺伝子に活性化複合体を動員することができるおよび／または活性（例えば、ヒストンアセチル化など）を活性化することができる任意の分子が、融合タンパク質の活性化ドメインとして有用である。インスレータードメイン、局在化ドメインおよびＩＳＷＩ含有ドメインなどのクロマチンリモデリングタンパク質および／または融合分子中での機能的ドメインとしての使用に適したメチル結合ドメインタンパク質が、例えば、共有の米国特許出願公開第２００２／０１１５２１５号および同第２００３／００８２５５２号中におよび共有の国際特許出願公開第０２／４４３７６号に記載されている。
例示的な抑制ドメインとしては、ＫＲＡＢ Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦβ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、ＲｂおよびＭｅＣＰ２が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｉｒｄら、（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４５１－４５４；Ｔｙｌｅｒら、（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４３－４４６；Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒら、（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４７－４５０；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２５：３３８－３４２を参照。さらなる例示的な抑制ドメインとしては、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈｅｍら、（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：３０５－３２１；およびＷｕら、（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１９－２７を参照。
融合分子は、当業者に周知であるクローニングおよび生化学的抱合の方法によって構築される。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能的ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）を含む。融合分子は、必要に応じて、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０中型Ｔ抗原由来のものなど）およびエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよび赤血球凝集素など）も含む。融合タンパク質（およびこれをコードする核酸）は、翻訳読み枠が融合物の成分間で保存されるように設計される。
一方で機能的ドメイン（またはその機能的断片）のポリペプチド成分と他方で非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、挿入剤、副溝結合剤、核酸）との間での融合は、当業者に公知の生化学的抱合の方法によって構築される。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）Ｃａｔａｌｏｇｕｅを参照。副溝結合剤とポリペプチドの間での融合物を作製するための方法および組成物は、記載されている。Ｍａｐｐら、（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：３９３０－３９３５。
ある実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインによって結合される標的部位は、細胞のクロマチンの接近可能な領域中に存在する。接近可能な領域は、例えば、共有の国際公開第０１／８３７３２号に記載されているとおりに決定することができる。標的部位が細胞のクロマチンの接近可能な領域中に存在しなければ、共有の国際公開第０１／８３７９３号に記載されているとおりに、１またはそれを超える接近可能な領域を生成することができる。さらなる実施形態において、融合分子のＤＮＡ結合ドメインは、その標的部位が接近可能な領域中に存在するかどうかに関わらず、細胞のクロマチンに結合することができる。例えば、このようなＤＮＡ結合ドメインは、リンカーＤＮＡおよび／またはヌクレオソームのＤＮＡに結合することができる。この種の「パイオニア」ＤＮＡ結合ドメインの例は、ある種のステロイド受容体中および肝細胞核因子３（ＨＮＦ３）中に見出される。Ｃｏｒｄｉｎｇｌｅｙら、（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：２６１－２７０；Ｐｉｎａら、（１９９０）Ｃｅｌｌ ６０：７１９－７３１；およびＣｉｒｉｌｌｏら、（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：２４４－２５４。
融合分子は、当業者に公知であるとおり、薬学的に許容され得る担体とともに調合され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８５；および共有の国際公開第００／４２２１９号を参照。
融合分子がそのＤＮＡ結合ドメインを介して標的配列に結合したら、融合分子の機能的成分／ドメインは、遺伝子の転写に影響を与えることができる様々な異なる成分のいずれからも選択することができる。したがって、機能的成分としては、活性化因子、リプレッサー、活性化補助因子、コリプレッサーおよびサイレンサーなどの様々な転写因子ドメインを挙げることができるが、これらに限定されない。
さらなる例示的な機能的ドメインは、例えば、共有の米国特許第６，５３４，２６１号および米国特許出願公開第２００２／０１６０９４０号に開示されている。
外因性小分子またはリガンドによって制御される機能的ドメインも選択され得る。例えば、外部ＲｈｅｏＣｈｅｍ（商標）リガンドの存在下でのみ、機能的ドメインがその活性な立体構造を採るＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）技術が使用され得る（例えば、米国特許出願公開第２００９／０１３６４６５号参照）。したがって、ＺＦＰは、その結果生じるＺＦＰ－ＴＦの活性が外部リガンドによって調節される制御可能な機能的ドメインに動作可能に連結され得る。
送達
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドおよび本明細書に記載されているタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の適切な手段によって送達され得る。ある実施形態において、ヌクレアーゼおよび／またはドナーはインビボで送達される。他の実施形態において、ヌクレアーゼおよび／またはドナーは、患者へのエクスビボ送達において有用な改変された細胞を与えるために、単離された細胞（例えば、自家または異種幹細胞）に送達される。
本明細書に記載されているヌクレアーゼを送達する方法は、例えば、それらの全ての開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４５３，２４２号：同第６，５０３，７１７号：同第６，５３４，２６１号：同第６，５９９，６９２号：同第６，６０７，８８２号：同第６，６８９，５５８号：同第６，８２４，９７８号：同第６，９３３，１１３号：同第６，９７９，５３９号：同第７，０１３，２１９号：および同第７，１６３，８２４号に記載されている。
本明細書に記載されているヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物は、裸のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）およびこれらの成分の１またはそれより多くをコードする配列を含有するベクターを含む、任意の核酸送達機構を用いても送達され得る。プラスミドベクター、ＤＮＡミニサークル、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどならびにこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない任意のベクター系が使用され得る。それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号ならびに米国特許出願公開第２０１４／０３３５０６３号も参照。さらに、これらの系のいずれもが、処置のために必要とされる配列の１またはそれより多くを含む得ることが自明であろう。したがって、１またはそれを超えるヌクレアーゼおよびドナー構築物が細胞中に導入される場合には、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、同一の送達系上でまたは異なる送達機構上で運ばれ得る。複数の系が使用される場合には、各送達機構は、１または複数のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物をコードする配列（例えば、１もしくはそれを超えるヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよび／または１もしくはそれを超えるドナー構築物を担持するｍＲＮＡもしくはＡＡＶ）を含み得る。
細胞（例えば、哺乳動物の細胞）および標的組織中にヌクレアーゼおよびドナー構築物をコードする核酸を導入するために、慣用のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入法を使用することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡミニサークル、裸の核酸およびリポソームまたはポロクサマーなどの送達ビヒクルと複合化された核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達後にエピソームまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。遺伝子治療手順の総説として、Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８－８１３；Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｌｇｎｅｒ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１－２１７；Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２－１６６；Ｄｉｌｌｏｎ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７－１７５；Ｍｉｌｌｅｒ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５－４６０；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９－１１５４；Ｖｉｇｎｅ（１９９５）Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５－３６；Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ（１９９５）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１－４４；Ｈａｄｄａｄａら、（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｍ（ｅｄｓ．）；およびＹｕら、（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３－２６を参照。
核酸の非ウイルス性送達の方法としては、電気穿孔、リポフェクション、微量注入、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸抱合体、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、キャップ付きＲＮＡ、人工のビリオンおよび薬剤によって増強されたＤＮＡの取り込みが挙げられる。核酸の送達のために、例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を用いた音響穿孔法も使用することができる。
さらなる例示的な核酸送達系としては、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．によって提供されるものが挙げられる（例えば、米国特許第６，００８，３３６号参照）。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号；同第４，９４６，７８７号；および同第４，８９７，３５５号）に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適した陽イオン性および中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号、国際公開第９１／１６０２４号のものが挙げられる。いくつかの態様において、ヌクレアーゼはｍＲＮＡとして送達され、導入遺伝子は、ウイルスベクター、ミニサークルＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、リポソーム、ナノ粒子などの他の様式を介して送達される。
免疫脂質複合体などの標的化されたリポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４－４１０；Ｂｌａｅｓｅら、（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１－２９７；Ｂｅｈｒら、（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２－３８９；Ｒｅｍｙら、（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７－６５４；Ｇａｏら、（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０－７２２；Ａｈｍａｄら、（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７－４８２０；米国特許第４，１８６，１８３号；同第４，２１７，３４４号；同第４，２３５，８７１号；同第４，２６１，９７５号；同第４，４８５，０５４号；同第４，５０１，７２８号；同第４，７７４，０８５号；同第４，８３７，０２８号；および同第４，９４６，７８７号を参照）。
さらなる送達の方法としては、ＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）中に送達されるべき核酸をパッケージングすることの使用が挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織に対する特異性を有し、他方がＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を用いて標的組織に特異的に送達される。抗体がＥＤＶを標的細胞表面に持って来た後に、エンドサイトーシスによって、ＥＤＶが細胞中に運び込まれる。いったん細胞中に入ると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら、（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（７）：６４３参照）。
改変操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸を送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスをベースとする系の使用は、体内の特異的な細胞にウイルスを標的誘導し、ウイルス搭載物を核に運ぶための高度に進化した過程を活用する。ウイルスベクターは、被験体に直接投与することができ（インビボ）、または細胞をインビトロで処置するために使用することができ、改変された細胞が被験体に投与される（エクスビボ）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を送達するための慣用のウイルスをベースとした系としては、遺伝子導入のための、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよび単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。宿主ゲノム中の組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子導入法によって可能であり、しばしば、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、多くの異なる細胞種および標的組織中で、高い形質導入効率が観察されてきた。
レトロウイルスの指向性は、外来外被タンパク質を取り込むこと、標的細胞の潜在的標的集団を増大させることによって変化させることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染することが可能であり、典型的には、高いウイルス力価を生成するレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列をパッケージングする能力を有するシス作用性末端反復配列から構成される。ベクターの複製およびパッケージングのためには、最小限のシス作用性ＬＴＲが十分であり、次いで、ベクターは、標的細胞中に治療用遺伝子を組み込んで恒常的な導入遺伝子発現を与えるために使用される。広く使用されるレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびこれらの組み合わせを基礎とするものが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら、（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９；Ｊｏｈａｎｎら、（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５－１６４０；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、（１９９０）Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８－５９；Ｗｉｌｓｏｎら、（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３７８；Ｍｉｌｌｅｒら、（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４；国際公開第１９９４／０２６８７７号を参照）。
一過性発現が好ましい用途においては、アデノウイルスを基礎とする系を使用することができる。アデノウイルスを基礎とするベクターは、多くの細胞種で極めて高い形質導入効率を可能にし、細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いて、高い力価および高い発現のレベルが得られてきた。このベクターは、比較的単純な系内で大量に作製することができる。例えば、核酸およびペプチドのインビトロでの産生において、ならびにインビボおよびエクスビボ遺伝子治療手法のために、標的核酸で細胞を形質導入するために、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターも使用される（例えば、Ｗｅｓｔら、（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７；米国特許第４，７９７，３６８号；国際公開第９３／２４６４１号；Ｋｏｔｉｎ（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１；Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１を参照）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８５）；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１；Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０；およびＳａｍｕｌｓｋｉら、（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８を含む多数の刊行物中に記載されている。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６およびＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶ ｒｈ１０ならびにＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６などの偽型化されたＡＡＶを含む任意のＡＡＶ血清型を使用することができる。
臨床試験における遺伝子導入のために、現在、少なくとも６種のウイルスベクターアプローチが利用可能であり、これらは、形質導入因子を生成するために、ヘルパー細胞株中に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補を含むアプローチを利用する。
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ－Ｓは、臨床試験において使用されてきたレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、（１９９５）Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８－３０５；Ｋｏｈｎら、（１９９５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７－１０２；Ｍａｌｅｃｈら、（１９９７）ＰＮＡＳ ９４（２２）：１２１３３－１２１３８）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験において使用された最初の治療用ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５－４８０）。ＭＦＧ－Ｓパッケージされたベクターに対しては、５０％またはそれを超える形質導入効率が観察されてきた。（Ｅｌｌｅｍら、（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０－２０；Ｄｒａｎｏｆｆら、（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１１１－２。
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損した非病原性パルボウイルスであるアデノ随伴２型ウイルスを基礎とする有望な別の遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５塩基対（ｂｐ）の逆位反復配列のみを保持するプラスミドに由来する。効率的な遺伝子導入および形質導入された細胞のゲノム中への組み込みによる安定な導入遺伝子送達が、このベクター系の鍵となる特徴である。（Ｗａｇｎｅｒら、（１９９８）Ｌａｎｃｅｔ ３５１（９１１７）：１７０２－３、Ｋｅａｒｎｓら、（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７４８－５５）。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４５およびＡＡＶｒｈ１０ならびにこれらの全ての変異形を含むその他のＡＡＶ血清型も、本発明に従って使用することができる。
複製欠損性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高い力価で産生されることができ、多数の異なる細胞種に容易に感染することができる。多くのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよび／またはＥ３遺伝子を置換し、続いて、複製欠損性ベクターが、欠失された遺伝子機能をトランスに供給するヒト２９３細胞中で増殖されるように改変操作される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓および筋肉中に見出される細胞などの分裂しない分化した細胞を含む、複数種の組織をインビボで形質導入することができる。慣用のＡｄベクターは、大きな運搬能力を有する。臨床試験におけるＡＤベクターの使用の一例は、筋肉内注射を用いた抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療を伴った（Ｓｔｅｒｍａｎら、（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３－１０８９）。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４（１）：５－１０；Ｓｔｅｒｍａｎら、（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（７）：１０８３－１０８９；Ｗｅｌｓｈら、（１９９５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２０５－１８；Ａｌｖａｒｅｚら、（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７－６１３；およびＴｏｐｆら、（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７－５１３が挙げられる。
宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するために、パッケージング細胞が使用される。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療において使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングするプロデューサー細胞株によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主中への組み込み（該当する場合）のために必要とされる最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるべきタンパク質をコードする発現カセットによって置換されている。喪失しているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスに供給される。例えば、遺伝子治療において使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノム中への組み込みのために必要とされるＡＡＶゲノム由来の末端逆位反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠如するヘルパープラスミドを含有する細胞株中でパッケージングされる。細胞株は、ヘルパーとしてアデノウイルスでも感染される。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠如しているために、著しい量ではパッケージングされない。アデノウイルスの混入は、例えば、アデノウイスがＡＡＶより感受性が高い熱処理によって低減することができる。
多くの遺伝子治療用途において、遺伝子治療ベクターは、特定の組織の種類に対して高度の特異性をもって送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外側表面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、所定の細胞種に対して特異性を有するように改変することができる。リガンドは、関心対象の細胞種上に存在することが知られている受容体に対して親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎら、（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：９７４７－９７５１は、モロニーマウス白血病ウイルスはｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するように改変することができ、この組換えウイルスはヒト上皮増殖因子受容体を発現するある種のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する他のウイルス・標的細胞対に拡張することができる。例えば、繊維状ファージは、実質的に任意の選択された細胞受容体に対して特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）をディスプレイするように改変操作することができる。上記記載は主にウイルスベクターに当てはまるが、同じ原理を非ウイルスベクターに当てはめることができる。このようなベクターは、特異的な標的細胞による取り込みを好む特異的な取り込み配列を含有するように改変操作することができる。
遺伝子治療ベクターは、個々の被験体への投与によって、典型的には、以下に記載されているように、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、舌下または頭蓋内注入）局所適用によってまたは肺吸入を介して、インビボで送達することができる。または、ベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検）または万能ドナー造血幹細胞など、エクスビボで細胞に送達することができ、その後、通常は、ベクターを取り込んだ細胞に関して選択した後に、患者中への細胞の再移植が続く。
ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）は、インビボでの細胞の形質導入のために、生物に直接投与することもできる。または、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、血液または組織細胞との最終的な接触に分子を導入するために通常使用される任意の経路により、注射、注入、局所適用、吸入および電気穿孔を含むがこれらに限定されない。このような核酸を投与する適切な方法が利用可能であり、当業者に周知であって、特定の組成物を投与するために１を超える経路を使用することができるが、多くの場合、別の経路より、特定の経路がより直ちにより効果的な反応を与えることができる。
本明細書に記載されているポリヌクレオチドの導入に適したベクターとしては、組み込み欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）が挙げられる。例えば、Ｏｒｙら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３８２－１１３８８；Ｄｕｌｌら、（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３－８４７１；Ｚｕｆｆｅｒｙら、（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３－９８８０；Ｆｏｌｌｅｎｚｉら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：２１７－２２２；米国特許第８，９３６，９３６号を参照。
薬学的に許容され得る担体は、１つには、投与されている具体的な組成物によって、および組成物を投与するために使用される具体的な方法によって決定される。したがって、以下に記載されているとおり、利用可能な薬学的組成物の多様な適切な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８９参照）。
ヌクレアーゼコード配列およびドナー構築物は、同じ系または異なる系を用いて送達できることが自明であろう。例えば、ドナーポリヌクレオチドはＡＡＶによって担持されることができるのに対して、１またはそれを超えるヌクレアーゼはｍＲＮＡによって担持されることができる。さらに、異なる系は、同一の経路または異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、その他の静脈内注射、腹腔内投与および／または筋肉内注射によって投与することができる。複数のベクターは、同時にまたは任意の逐次的順序で送達することができる。
エクスビボおよびインビボ投与のための製剤としては、液体または乳化された液体中の懸濁液が挙げられる。活性成分は、しばしば、薬学的に許容され得るおよび活性成分と適合的である賦形剤と混合される。適切な賦形剤としては、例えば、水、生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびこれらの組み合わせが挙げられる。さらに、組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤または薬学的組成物の有効性を増強する他の試薬などの微量の補助物質を含有し得る。
［実施例１］材料および方法
一過性形質移入のためのｍＲＮＡの作製
ＰＣＲ（フォワードプライマーＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧ（配列番号１）；リバースプライマー（Ｔ（１８０））：ＣＴＧＧＣＡＡＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧ（配列番号２））を用いて、ｐＶＡＸ－ＺＦＰまたはｐＶＡＸ－ＧＦＰプラスミドから、インビトロ転写のためのテンプレートを生成した。製造業者の指示に従って、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ７ ＵＬＴＲＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｍＲＮＡを合成し、ＲＮｅａｓｙ９６カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。
レンチウイルスベクターの作製
ＣＭＶプロモーターの下流へ、レンチウイルス導入ベクターｐＲＲＬ中に、ＺＦＰ－２Ａ－ＧＦＰに対するコード配列をクローニングした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、１５ｃｍ組織培養皿中で培養されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、以下のプラスミド：ｐＲＲＬ－ＣＭＶ－ＺＦＰ－２Ａ－ＧＦＰ（３７．５μｇ）、ＶＳＶＧエンベローププラスミド（１８．７５μｇ）およびパッケージングプラスミド（ｐＭＤＬおよびｐＲＥＶ、それぞれ１８．７５μｇ）で形質移入した（Ｄｕｌｌ，Ｔ．ら、（１９９８）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（１１）：８４６３－８４７１）。形質移入の４８時間および７２時間後に、ウイルス上清（３０ｍＬ）を採集し、５０，０００×ｇで９０分間、４℃での限外ろ過（Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－８０Ｋ ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって、３００倍濃縮する前に、０．４５μｍフィルターを通してろ過した。次いで、適切な容量のＨａｎｋ’ｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｏｎｚａ）中に沈渣を懸濁した。感染力価を決定するために、１００μＬの系列希釈されたベクター調製物で一晩、２×１０４のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３つ組にて形質導入し、次いで、さらに４８時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。ＧＦＰ発現に対して線形の用量応答を与えた希釈物を用いて、感染力価を決定した。
ＡＡＶベクターの作製
本分野で標準的な方法に従い、バキュロウイルスをベースとしたＡＡＶ作製によって、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰおよびＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＺＦＰ（Ａ、ＢおよびＣ）を生成した。ＡＡＶ６ベクターは全て、二重ＣｓＣｌ超遠心分離によって精製し、０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８を用いて、ＰＢＳに緩衝液を交換した。ｑＰＣＲを用いて、ＡＡＶ力価を決定した。
ヒトシナプシン１（ｈＳＹＮ１）プロモーターの調節下でＺＦＰ－２Ａ－ＧＦＰおよびＧＦＰ対照を発現するために、Ｅｖｏｔｅｃ ＡＧ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、キメラＡＡＶ血清型１／２（Ｈａｕｃｋ，Ｂ．ら、（２００３）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ７：４１９－４２５）ベクターを生成した。ＨＥＫ２９３形質移入によってＡＡＶ１／２ベクターを作製し、記載されているとおりに、イオジキサノール勾配によって精製した（Ｈｅｉｋｋｉｎｅｎら、（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ５０７１７、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５０７１７）。
細胞培養およびｍＲＮＡ形質移入
不死化されたマウス線条体細胞株ＳＴＨｄｈＱ１１１／ＨｄｈＱ７（Ｑ１１１／Ｑ７，Ｔｒｅｔｔｅｌら、（２０００）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９：２７９９－２８０９、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／９．１９．２７９９）は、ＣＨＤＩ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＣＨＤＩ）からいただいた。１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびＧ４１８（０．４ｍｇ／ｍＬ）を加えたＤＭＥＭ中に、３３℃で、Ｑ１１１／Ｑ７細胞を維持した。９６ウェルＳｈｕｔｔｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、ｍＲＮＡ形質移入を行い、Ｐ３溶液およびプログラムＥＮ－１３２を用いて、１×１０５細胞当たり１００ｎｇのＺＦＰ ｍＲＮＡを形質移入した。形質移入の２４時間後、ｑＲＴ－ＰＣＲによる遺伝子発現分析のために、細胞を採集した。
ＨＤ線維芽細胞株ＧＭ０４７２３（ＣＡＧ１５／６７（配列番号８１／８２））、ＧＭ０２１５１（ＣＡＧ１８／４５（配列番号７９／８０））およびＮＤ３０２５９（ＣＡＧ２１／３８（配列番号８３／８４））は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから取得し、２０％ＦＢＳを加えた完全ＭＥＭ中に維持した。ＣＡＧリピートの長さを、配列決定によって確認した。９６ウェルＳｈｕｔｔｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、ｍＲＮＡ形質移入を行った。Ｐ２溶液およびプログラムＣＡ－１３７を用いて、１．５×１０５細胞当たり０．０１～１０００ｎｇのＺＦＰ ｍＲＮＡを形質移入した。１００ｎｇのＺＦＰ ｍＲＮＡ未満の用量に対しては、形質移入されるｍＲＮＡの全量を１００ｎｇにするために、ＧＦＰ ｍＲＮＡを加えた。形質移入の２４時間後、ｑＲＴ－ＰＣＲによる遺伝子発現分析のために、細胞を採集した。
ＨＤ ＥＳＣ株ＧＥＮＥＡ０１８（ＣＡＧ１７／４８（配列番号７６／７８）、Ｂｒａｄｌｅｙら、（２０１１）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ ２０：４９５－５０２、ｄｏｉ：１０．１０８９／ｓｃｄ．２０１０．０１２０）は、ＣＨＤＩからいただいた。ＣＡＧリピートの長さを、配列決定によって確認した。アクターゼ（ａｃｃｕｔａｓｅ）を用いて、ＨＤ－ＥＳＣを継代し、Ｅ８培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、マトリゲルで被覆されたプレート上で培養した。ＳｔｅｍＰｒｏ Ｎｅｕｒａｌ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、神経幹細胞を誘導した。簡潔に述べると、２×１０５細胞／ウェルで、ｇｅｌｔｒｅｘ被覆された６ウェル皿中に、ＥＳＣを播種し、１０～２０％の集密状態になった時点で、培地をＳｔｅｍＰｒｏ Ｎｅｕｒａｌ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に変更した。培地を２日ごとに交換し、７日目にＮＳＣを採集し、増殖させた。ＨＤ－ＮＳＣおよび非ＨＤ ＮＳＣ（ＨＩＰ（商標）Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ｇｌｏｂａｌｓｔｅｍを培養するために、ＳｔｅｍＰｒｏ ＮＳＣ ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。ｇｅｌｔｒｅｘを被覆されたプレート上で、アクターゼを用いてＮＳＣを継代した。９６ウェルＳｈｕｔｔｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、ｍＲＮＡ形質移入を行った。ＮＳＣサブカルチャープロトコール（ＳｔｅｍＰｒｏ ＮＳＣ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って、ＮＳＣを調製し、２０μＬのＳＦ溶液およびプログラムＣＭ－１３０を用いて、２×１０５細胞を形質移入した。この直後、５０μＬの加温した培地を含有する９６ウェルプレートに移す前に、８０μＬの培地をウェルに加えた。
Ｂ－２７ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔおよびＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地からなる神経分化培地（ＮＤＩＦＦ）に変更することによって、ＮＳＣからの神経細胞の分化を誘導した。培地は、３～４週ごとに交換した。ＮＤＩＦＦ中で７日後、細胞は神経細胞の形態を取った。
ＮＳＣおよび神経細胞の分化を確認するために、神経細胞のマーカー遺伝子の免疫組織化学分析のため、ＨＤ ＮＳＣまたは神経細胞をチャンバースライド（Ｌａｂ－Ｔｅｋ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上で培養した。簡潔に述べると、細胞を固定し、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、透過処理した。スライドを４％ＮＧＳでブロックし、４℃で一晩、一次抗体抗ＰＡＸ６（ＡＢ２２３７、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗ネスチン－４８８（ＭＡＢ５３２６Ａ４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）または抗βーＩＩＩチューブリン（ＭＡＢ１１９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で染色した。二次染色のために、適切なＡｌｅｘａ ４８８または５５５抱合二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を１：５００希釈した。
ＨＤタンパク質ノックダウンに対するウェスタンブロット分析
Ｐ２溶液中で、ＬｏｎｚａプログラムＣＡ－１３７を用いて、１５０，０００細胞／形質移入で、４つ組にて、ＧＭＯ４７２３（ＣＡＧ１５／６７（配列番号８１／８２））ヒト線維芽細胞をＺＦＰ（３００ｎｇ）で形質移入した。形質移入後に、細胞を完全培地中にプールし、次いで、２４ウェルプレートの４ウェル中に分けて、３７°、５％ＣＯ２で７２時間、インキュベートした。細胞をトリプシン処理し、洗浄し、沈降させ、熱い９５°Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中に溶解し、９５°で５分間インキュベートした。５μＬ／レーンで、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ４～１５％ＴＧＸゲル上に試料を搭載し、ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ走行緩衝液中において、室温で３．５時間、１５０Ｖで走行させた。ＭｅＯＨ（１０％）を含有する転写緩衝液中において、９０Ｖで２．５時間、４°でＰＶＤＦ膜上へのウエット式転写を行った。Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液中において、４°で膜をブロックし、次いで、室温で３時間、一次抗体とともにインキュベートした：０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０ Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液中のマウス抗Ｈｔｔ（１：５００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＡＢ２１６６）およびウサギ抗カルネキシン（１：５０００；Ｓｉｇｍａ Ｃ４７３１）。ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）中で、３×１０分、ブロットを洗浄した。次いで、光から保護しながら、室温で１時間、ブロットを二次抗体とともにインキュベートした：０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、０．０１％ＳＤＳを含有するＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液中のヤギ抗マウスＩｇＧ１（１：５０００；Ｌｉ－Ｃｏｒ ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ ９２６－３２３５０）およびヤギ抗ウサギ（１：１０，０００；ＬｉＣｏｒ ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤ ＃９２６－６８０７１）。光から保護しながら、ＰＢＳ－Ｔ中で、３×１０分、ブロットを洗浄し、Ｗｈａｔｍａｎペーパー間で乾燥させ、Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ近赤外蛍光画像化システム上で走査した。
ＺＦＰを発現する安定なＮＳＣ株の生成
ＺＦＰを発現するＨＤ－ＮＳＣを作製するために、２ＡペプチドによりＧＦＰに連結されたＺＦＰの発現を誘導するＣＭＶプロモーターを有するレンチウイルスベクターを使用した。６ウェルプレート中において、濃縮されたベクターに１×１０６細胞を接種した。数回の継代後に、ＧＦＰ陽性細胞を濃縮するために、得られた細胞を細胞選別に供した。上に記載されているように、選別された細胞をさらに増殖させ、神経細胞へ分化させた。
ｑＲＴ－ＰＣＲを用いた遺伝子発現分析
それぞれ、ＨｉｇｈＰｕｒｅ ＲＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ）およびＰｕｒｅｌｉｎｋ ＲＮＡミニキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、培養された細胞およびマウス線条体から全ＲＮＡを抽出した。Ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｃＤＮＡを生成し、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプローブスーパーミックス（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）およびＣＦＸリアルタイムＰＣＲ機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、定量的ＰＣＲを実施した。遺伝子発現分析用のｑＲＴ－ＰＣＲプライマー／プローブの組は、ＩＤＴに注文した：：マウス全Ｈｔｔ（Ｍｍ．ＰＴ．５８．６９５３４７９）、ＤＲＤ１Ａ（Ｍｍ．ＰＴ．５６ａ．４３５７６９５５．ｇ）、ＤＲＤ２（Ｍｍ．ＰＴ．５６ａ．７８１１７６７）、ＰＤＥ１０Ａ（Ｍｍ．ＰＴ．５６ａ．１６９１９８２４）、ＤＡＲＰＰ－３２（Ｍｍ．ＰＴ．５３ａ．９２５３５２６．ｇｓ）、ＡＴＰ５Ｂ（Ｍｍ．ＰＴ．５３ａ．１７２７９４６２）、ＥＩＦ４Ａ２（Ｍｍ．ＰＴ．５３ａ．９４９８１９５．ｇ）、ＲＰＬ３８（Ｍｍ．ＰＴ．５８．４２９９３４０３．ｇ）ＡＩＦ１（Ｍｍ．ＰＴ．５８．７０１４８１６）；ヒト全ＨＴＴ（Ｈｓ．ＰＴ．４９ａ．１４６７６８５２．ｇ）、ＳＴＣ１（Ｈｓ．ＰＴ．５１．１４９９２７２２）、ＮＡＰ１Ｌ３（Ｈｓ．ＰＴ．５６ａ．２４６５５５４９．ｇ）、ＡＴＸＮ２（Ｈｓ．ＰＴ．５８．４０１２６６０７）、ＯＲＣ４（Ｈｓ．ＰＴ．５６ａ．２４５２７８２３．ｇ）、ＴＨＡＰ１１（Ｈｓ．ＰＴ．４９ａ．１５４０４５５３．ｇ）、ＧＬＳ（Ｈｓ．ＰＴ．５３ａ．２０６２４７３２）、ＦＢＸＯ１１（Ｈｓ．ＰＴ．５８．２６６５６０１）、ＤＮＭ１（Ｈｓ．ＰＴ．５８．２５２６２５０１）、ＴＢＰ（Ｈｓ．ＰＴ．５６ａ．２０７９２００４）、ＦＯＸＰ２（Ｈｓ．ＰＴ．５８．１５３５７７３５）、ＥＮＯ２（Ｈｓ．ＰＴ．５３ａ．２５２２７２８２）、Ｂ２Ｍ（Ｈｓ．ＰＴ．２０２３４０８４）、ＴＯＰ１（Ｈｓ．ＰＴ．５３ａ．１９５４１３８１）、ＮＥＳ（Ｈｓ．ＰＴ．５３ａ．２０７５８６２０）、ＳＯＸ１（Ｈｓ．ＰＴ．５３ａ．２８０４１４１４．ｇ）、ＰＡＸ６（Ｈｓ．ＰＴ．５３ａ．８１４３１４）、ＯＣＴ４（Ｈｓ．ＰＴ．５８．１４４９４１６９．ｇ）、ＲＥＸ１（Ｈｓ．ＰＴ．５３ａ．２３００１２０９）、ＮＡＮＯＧ（Ｈｓ．ＰＴ．５３ａ．２１４８０８４９）、ＧＡＤ１（Ｈｓ．ＰＴ．５６ａ．２１２８３０００）、ＭＡＰ２（Ｈｓ．ＰＴ．５３ａ．４０７９１３３７．ｇ）およびＦＯＸＧ１（Ｈｓ．ＰＴ．５６ａ．２６９０６１１２．ｇ）。
５’ＵＴＲに対する共通のプライマー／プローブの組によって、ＡＡＶ６ベクターから発現されたＺＦＰおよびＧＦＰ ｍＲＮＡを検出した。
フォワードプライマー：ＧＧＡＡＣＧＧＴＧＣＡＴＴＧＧＡＡＣＧ（配列番号３）
リバースプライマー：ＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＴＴＧＣＣ（配列番号４）
プローブ：ＡＧＣＡＣＧＴＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡＣ（配列番号５）
以下のプライマー／プローブの組を用いて、Ｒ６／２マウス中の変異体Ｈｔｔ ｍＲＮＡを検出した。
フォワードプライマー：ＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＧＧＧＴＴＡＣ（配列番号６）
リバースプライマー：ＧＣＴＧＣＡＣＣＧＡＣＣＧＴＧＡＧＴ（配列番号７）
プローブ：ＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＧＧＣＧＧ（配列番号８）
ＨＤ線維芽細胞ＧＭ０４７２３（ＣＡＧ１５／６７（配列番号８１／８２））およびＧＭ０２１５１（ＣＡＧ１８／４５（配列番号７９／８０））中でのヒトＨＴＴ発現の対立遺伝子特異的検出は、ＳＮＰ ｒｓ３６３０９９ Ｃ／Ｔ（エキソン２９）に基づく特別設計のプライマーを用いて行った。
３６３０９９Ｃ－Ｆ（０９９－Ｃフォワードプライマー）：ＡＧＴＴＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＣＴＣ（配列番号９）
３６３０９９Ｔ－Ｆ（０９９－Ｔフォワードプライマー）：ＡＧＴＴＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＣＴＴ（配列番号１０）
３６３０９９Ｔ－ＢＬ（０９９－Ｔブロッカー）：ＡＧＧＧＴＴＴＣＴＣＣＧＣＴＣＡＧＣ／ｐｈｏｓ／（配列番号１１）
３６３０９９－Ｒ（リバースプライマー、０９９－Ｃおよび０９９Ｔフォワードプライマーの両方とともに使用される）ＴＣＧＡＣＴＡＡＡＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＡＧＧ（配列番号１２）。
０９９－Ｔブロッカーオリゴは、「Ｃ／Ｇ」対立遺伝子にアニーリングするように設計され、変異体対立遺伝子の増幅を抑制するために、３’末端塩基をリン酸化し（Ｍｏｒｌａｎら、（２００９）ＰＬＯＳ ＯＮＥ ４：ｅ４５８４）、０９９Ｔフォワードプライマーに対して、２：１のモル比で加えた。各試料について、以下のように、１０μＬのｑＰＣＲ反応液を０９９Ｔおよび０９９Ｃに対して準備した。５μＬのＳｓｏＦａｓｔ Ｅｖａｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、０．５μＬの２０×０９９Ｃまたは０９９Ｔ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（最終濃度は各プライマーにつき０．５μＭおよび０９９Ｔアッセイにおいて１μＭのブロッカーオリゴ）、２．５μＬ Ｈ２Ｏおよび２μＬのｃＤＮＡ試料。サーマルサイクリング条件は以下のとおりであった。１）９８℃２分間、２）９８℃５秒間、３）０９９Ｃアッセイに対しては５８．３℃９秒間または０９９Ｔアッセイに対しては５５．６℃９秒間、４）プレート読み取り、５）工程２～４を４５回反復、６）終了。
ＨＤ線維芽細胞ＮＤ３０２５９（ＣＡＧ２１／３８（配列番号８３／８４））中でのヒトＨＴＴ発現の対立遺伝子特異的検出は、ＳＮＰ ｒｓ３６２３３１ Ｃ／Ｔ（エキソン５０）に基づく特別設計のプライマーを用いて行った。３６２３３１－Ｆ（３３１フォワードプライマー）：ＴＣＴＣＣＴＣＣＡＣＡＧＡＧＴＴＴＧＴＧＡ（配列番号１３），３６２３３１－Ｒ（３３１リバースプライマー）：ＣＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＧＡＣＴＡＡＧＡＡＧＣＴＧ（配列番号１４），３６２３３１Ｃプローブ：ＴＣＣ ＣＴＣ ＡＴＣ＋Ｃ＋ＡＣ ＴＧＴ ＧＴ（配列番号１５）および３６２３３１Ｔプローブ：ＣＴＣ＋Ａ＋Ｔ＋Ｃ＋Ｔ＋Ａ＋Ｃ ＴＧＴ ＧＴ（配列番号１６）。
各アッセイにつき、ロックド核酸（ＬＮＡ）塩基（「＋Ｎ」によって示される）を含有する３３１Ｃまたは３３１Ｔを検出するための対立遺伝子特異的Ｔａｑｍａｎプローブを添加した。修飾されていないＤＮＡプローブと比較して、対立遺伝子の識別を改善するために、ＬＮＡプローブを使用した（Ｌａｔｏｒｒａら、（２００３）Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ ２２：７９－８５，ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｕｍｕ．１０２２８およびＹｏｕら、（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４：ｅ６０，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｌ１７５）。各試料について、以下のように、１０μＬのｑＰＣＲ反応液を３３１Ｔおよび３３１Ｃに対して準備した。５μＬのＳｓｏＦａｓｔ Ｐｒｏｂｅｓ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、１μＬの１０×３３１－Ｃ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（アッセイにおける最終濃度、各々０．５μＭのＦおよびＲプライマーならびに０．２５μＭの３３１Ｃプローブ）または３３１Ｔ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（アッセイにおける最終濃度、各々０．５μＭのＦおよびＲプライマーならびに０．２５μＭの３３１－Ｔプローブ）、２μＬ Ｈ２Ｏおよび２μＬのｃＤＮＡ試料。サーマルサイクリング条件は以下のとおりであった。１）９５°４５秒間、２）９５°５秒間、３）３３１Ｃアッセイに対しては６２°１分間または３３１Ｔアッセイに対しては６２．７°１分間、４）プレート読み取り、５）工程２～４を４５回反復、６）終了。
マイクロアレイ
ＺＦＰ－ＴＦをコードするインビトロ転写されたｍＲＮＡ（１００ｎｇ）を、生物学的６つ組にて、１５０，０００ＨＤ線維芽細胞（ＧＭ０２１５１）中に形質移入した（Ａｍａｘａ ｓｈｕｔｔｌｅ、設定ＣＡ－１３７、溶液Ｐ２、Ｌｏｎｚａ）。２４時間後に、ＰＢＳで１回細胞を洗浄し、次いで、全ＲＮＡ抽出のために処理した（Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ、Ｒｏｃｈｅ）。試料調製、ハイブリッド形成、流体工学および走査のための製造業者のプロトコールに従って、各反復実験（５０ｎｇの全ＲＮＡ）を処理した（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍｅｖｉｅｗ ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）。各プローブの組から得られる未加工シグナルを標準化するために、ロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）を使用した。倍数変化分析は、「Ｇｅｎｅ Ｌｅｖｅｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ」オプションとともにＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｎｓｏｌｅ ３．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて実施した。ＺＦＰ－Ａ、ＺＦｐ－ＢおよびＺＦＰ－Ｃで形質移入された試料を、線維芽細胞中に２つの公知の標的（ＰＡＰＰＡおよびＬＭＣＤ１、いずれも＜２ＦＣ抑制される）を有する非ＣＡＧ標的化ＺＦＰ－ＴＦで処理された試料と比較した。対照と比較して２倍より大きい平均シグナルの差およびＰ値＜０．０５（各プローブセットに対する、片側分散分析、対応のないＴ検定）を有する転写物（プローブの組）に対して変化コールが報告される。１を超えるプローブセットを有する任意の遺伝子に対しては、最高の倍数変化を有するプローブセットを下流の分析のために選択した。
バイオインフォマティクス分析
ＭＯＯＤＳパッケージ（バージョン１．９．２）からの’ｍｏｏｄｓ＿ｄｎａ．ｐｙ’Ｐｙｔｈｏｎスクリプトを用い、モチーフ中の０または最大３つのミスマッチのいずれかを検出するように閾値を設定して、ヒト染色体１－２２番、ＸおよびＹ（バージョンＧＲＣｈ３８）を、６量体ＣＡＧモチーフ（ＺＦＰ－ＡおよびＺＦＰ－Ｃ）またはＣＡＧＣＡＧｎｎＧＣＡＧＣＡｎＣＡＧＣＡＧモチーフ（配列番号１７）（ＺＦＰ－Ｂ）について走査した。このアプローチによって見出された領域を、特注のｐｙｔｈｏｎスクリプトを用いてＢＥＤフォーマットに変換した。ＢＥＤ領域を選別し、鎖状態とは独立したＢＥＤｔｏｏｌｓ（ｖ２．２６．０）’マージ’コマンドを用いて、隣接または重複するモチーフ領域を単一の領域へと融合した。
ＥＮＳＥＭＢＬ ＢｉｏｍａｒｔからＥＮＳＥＭＢＬヒト転写物およびそれらの転写開始部位座標（Ｅｎｓｅｍｂｌリリース８７）を取得し、ＧＥＮＣＯＤＥ（ｖ２５）ＢＡＳＩＣアノテーションおよび’ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｃｏｄｉｎｇ’の生物型を有するもののみを選別した。ｂｅｄｔｏｏｌｓコマンド’ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｃｌｏｓｅｓｔ－Ｄ’を用いて、所定の転写開始部位からのＣＡＧモチーフの距離（または逆も同じ）を決定した。ＥＮＳＥＭＢＬ転写物マッピングに対するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＰｒｉｍｅｖｉｅｗプローブセットＩＤは、Ｂｉｏｍａｒｔ ｈｇ３８データを用いて実施した。ＥＮＳＥＭＢＬバイオマートアノテーションに従って複数の遺伝子にマッピングされた（ＧＲＣｈ３８．７、リリース８７）またはＥＮＳＥＭＢＬ転写物に重複しなかったＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｐｒｉｍｅｖｉｅｗプローブセットは、さらなる分析から除外した。複数の転写物がＰｒｉｍｅｖｉｅｗプローブセットにマッピングされた場合には、ＣＡＧモチーフとＴＳＳ間の距離が最小である転写物を選択した。
以下のカテゴリー：ｂｒａｉｎ＿ｃａｕｄａｔｅ、ｂｒａｉｎ＿ｃｏｒｔｅｘ、ｂｒａｉｎ＿ｐｕｔａｍｅｎおよびｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ＿ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓに対するＵＣＳＣゲノムブラウザを介して入手可能なＧＴＥＸプロジェクトデータ（Ｍｅｌｅら、（２０１５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８：６６０－６６５、ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａａ０３５５）から、ヒト組織発現に対する発現ＲＰＫＭ値を取得した。
培養された神経細胞中のＡＴＰレベルの測定
インビトロで分化したＣＡＧ１７／４８（配列番号７６／７８）神経細胞および正常な神経細胞（約１．５×１０５細胞）を、３つ組にて、５００の感染効率でＬｅｎｔｉーＣＭＶ－ＺＦＰ－２Ａ－ＧＦＰまたはＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＧＦＰに感染させた。感染の２１日後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、細胞内ＡＴＰレベルを測定し、ＡｐｏＬｉｖｅ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、各試料中の細胞数を決定した。次いで、異なる細胞／処理から得られた細胞当たりのＡＴＰレベルを、偽感染されたＨＤ神経細胞のＡＴＰレベルに対して標準化した。
培養された神経細胞中での、増殖因子の撤回によって誘導されたアポトーシスの測定
インビトロで分化したＣＡＧ１７／４８（配列番号７６／７８）神経細胞および正常な神経細胞（約１．５×１０５細胞）を、３つ組にて、５００の感染効率でＬｅｎｔｉーＣＭＶ－ＺＦＰ－２Ａ－ＧＦＰまたはＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＧＦＰに感染させた。感染の５日後に、培地を増殖因子なしの新鮮な神経基礎培地に交換した。増殖因子撤回の４８時間後に、末端デオキシヌクレオチジル転移酵素ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイキット（ＡｐｏＢｒｄＵ Ｒｅｄ ＤＮＡ断片化キット、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いて、細胞死のレベルを測定した。レンチ形質導入された（ＧＦＰ陽性）細胞のうちアポトーシス細胞（抗ＢｒｄＵ染色に対して陽性）のパーセントを測定するために、フローサイトメトリーを使用した。
マウス研究
ＨｄｈＱ５０／Ｈｄｈ＋（Ｑ５０）およびＲ６／２マウス研究は、実験動物の人道的管理と使用に関する米国公衆衛生局規範に従って、ＰｓｙｃｈｏＧｅｎｉｃｓ Ｉｎｃ．（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）において行い、手順は、ＰｓｙｃｈｏＧｅｎｉｃｓの動物実験委員会によって承認を受けた。ｚＱ１７５マウス研究は、ドイツ動物福祉法およびＥＵ法（ＥＵ指令２０１０／６３／ＥＵ）の規制に従って、Ｅｖｏｔｅｃ ＡＧ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において行った。動物は、年齢、性別、ＣＡＧ数および体重に基づいて、異なる処置群に登録した。
Ｑ５０マウス研究
ＨｄｈＱ５０／Ｈｄｈ＋（Ｑ５０）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ＣＨＤＩによって提供された。１１週齢の時点で、定位固定注射を用いて、Ｑ５０マウスの線条体へＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＺＦＰまたはＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰ（１×１０１３ｖｇ／ｍＬ）を両側性に送達した（ｎ＝４／群、雄２匹および雌２匹、群サイズは予備研究によって決定した）。線条体のベクターカバー範囲を増加させるために、各線条体中で２つの注射部位を使用した：段階的カニューレデザインを用いて、０．５μＬ／分の速度で、前側部位（座標：Ａ／Ｐ＋１．４ｍｍ、Ｍ／Ｌ＋／－１．７ｍｍ、Ｄ／Ｖ－３．５ｍｍ）中に４μＬを送達し、後側部位（座標：Ａ／Ｐ＋０．２ｍｍ、Ｍ／Ｌ＋／－２．３ｍｍ、Ｄ／Ｖ－３．２ｍｍ）中に０．５μＬを送達した。研究の期間を通じて、１週間に２回、体重を監視した。注射の７週後に、マウスを断頭し、頭蓋骨から脳を素早く取り出し、全ての表面の血液を除去するために氷冷した生理食塩水中ですすいだ。冷却した表面上で線条体を切断し、線条体の吻側、中央および尾側部分に相当する３つの等しい大きさの片に細分し、ＲＮＡＬａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）中において４℃で一晩、線条体組織を処理し、次いで、ＲＮＡ抽出まで－８０℃で保存した。ＡＡＶ注射は線条体に完全かつ均一には行き渡らないので（データは示さず）、不十分に形質導入された領域中のベースラインＨｔｔレベルが十分に形質導入された領域中のＨｔｔ制御の検出を妨害する可能性を低減するために、各線条体を３つの切片に切断した。各線条体の切片に対して、ｑＲＴ－ＰＣＲによって、ＨｔｔおよびＺＦＰ発現を定量した。
ｚＱ１７５マウス研究
ｚＱ１７５ Ｃ５７Ｂ／Ｌ６Ｊノックインマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ、ＵＳＡ）から入手した。２または６月齢において、ヘテロ接合のｚＱ１７５マウス（群当たりｎ＝５、雌雄混合）は、右半球にＡＡＶ１／２－ｈＳＹＮ１－ＺＦＰ－２Ａ－ＧＦＰ（１×１０１３ｖｇ／ｍＬ）を、左半球にＡＡＶ１／２－ｈＳＹＮ１－ＧＦＰ（１×１０１３ｖｇ／ｍＬ）の線条体内注射を受けた。Ｈａｍｉｌｔｏｎ気密シリンジ（Ｍｏｄｅｌ １８０１ ＲＮ）および特注のゲージ２６針を用いて、２００ ０．５μＬ／分の一定の流速で、線条体当たり計２μＬのＡＡＶベクターを送達し、注射座標は、Ａ／Ｐ＋０．８ｍｍ、Ｍ／Ｌ＋／－１．８ｍｍ、Ｄ／Ｖ－３．８ｍｍであった。
蠕動ポンプを用いた、３０ｍＬの氷冷したＰＢＳ、続いて、５０ｍＬの４％パラホルムアルデヒドの経心腔的灌流によって、注射の２または４ヶ月後にｚＱ１７５マウスを安楽死させた。頭蓋骨から脳試料を取り出し、切片作製のために処理した。免疫組織化学、画像獲得および自動化画像分析は、以前に記載されたとおりに実施した（Ｃａｒｔｙら、（２０１５）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０：ｅ０１２３５２７、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１２３５２７）。
Ｒ６／２マウス研究
ＣＢＡｘＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドの卵巣移植された雌（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をＣ５７ＢＬ／６野生型雄と交配することによって、ＰｓｙｃｈｏＧｅｎｉｃｓのコロニー中でＲ６／２トランスジェニックマウスを繁殖させた。ＣＡＧリピート長は、トランスジェニックマウスにおいて１２３±０．６であることが確認された。全ての実験者は、群処置について盲検化した。５週齢の時点で、定位固定注射を用いて、Ｒ６／２マウスの線条体へＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＺＦＰまたはＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰ（１×１０１３ｖｇ／ｍＬ）を両側性に送達した（ｎ＝１４／群、雄７匹および雌７匹、群サイズは、同じモデルで別の因子を試験する過去の研究に基づいて選択した）；Ｑ５０マウス研究と同じ注射容量および座標を使用した。マウスの生存は、１日に２回モニターした。マウスを安楽死させた１２週齢まで、週に１回、体重（ＢＷ）を測定した。統計的に有意なＢＷの差は、２つの群間に観察されなかった。
各体重セッションの間にクラスピング行動を記録した。簡潔に述べると、各マウスをそのホームケージから取り出し、ケージの蓋を上下逆にして、マウスをこの表面上に置いた。次いで、動物が表面の上約１２インチに吊るされるまで、観察者が、滑らかな動きで穏やかに動物を後方および上方に引っ張った。動物を３０秒間観察した。中心部へしっかり引っ張られた後肢と前肢の同時折り曲げとして定義される完全な折り曲げを記録し、分析のために使用した。
４（ベースライン）、６、８、１０および１２週齢で、マウスはオープンフィールド（ＯＦ）試験にも供された。赤外光線源によって囲まれたプレキシガラスの四角のチャンバー（２７．３×２７．３×２０．３ｃｍ；Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃｓ．，Ｓｔ Ａｌｂａｎｓ，ＶＴ）中に動物を３０分間配置した。総水平活動（移動した距離）および垂直活動（後肢での立ち上がり）を継続的な光線の中断から測定した。
ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＺＦＰ群中のマウス３匹およびＡＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰ群中のマウス５匹が、研究期間の間に死亡した。１２週齢でマウスを安楽死させた後、Ｑ５０マウス研究に対して記載されているとおりの遺伝子発現分析のために、線条体を切除した（それぞれ、ＧＦＰおよびＺＦＰ群に対してｎ＝７および１０匹のマウス）。
ＺＦＰ処置されたｚＱ１７５マウス中のＨＴＴ凝集物の分析（動物研究）
雄および雌のｚＱ１７５ Ｃ５７Ｂ／Ｌ６Ｊノックインマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ、ＵＳＡ）から入手した。ｚＱ１７５系統は、ＣＡＧ１４０ノックインマウスにおけるＣＡＧコピー数の自発的増大から誘導され、Ｐｓｙｃｈｏｇｅｎｉｃｓ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）において生成された。ヘテロ接合のｚＱ１７５マウスおよび野生型同複仔を生成するために、トランスジェニックマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊと戻し交配した。動物は、Ｅｕｒｏｓｔａｎｄａｒｄ Ｔｙｐｅ ＩＩの長いケージ中で飼育し、餌と水に自由に接近することができた。環境条件は以下のように保った。周囲温度２１±１℃、湿度５５±１０％および１２：１２明暗サイクル、午前７時から午後７時まで照明点灯。動物の健康状態を毎日チェックした。全ての動物の取り扱いは、ドイツ動物福祉法およびＥＵ法（ＥＵ指令２０１０／６３／ＥＵ）の規制に従って行った。研究プロトコールは、ファイル番号＃Ｖ１１３０７／５９１ ００．３３で、ハンブルグ市および州の健康および消費者保護局の地域倫理委員会（「Ｂｅｈｏｒｄｅ ｆｕｒ Ｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔ ｕｎｄ Ｖｅｒｂｒａｕｃｈｅｒｓｃｈｕｔｚ」ＢＧＶ、Ｈａｍｂｕｒｇ）によって承認された。
ＡＡＶベクター構築および作製
ＺＦＰの発現のために、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターｐＡＡＶ－６Ｐ－ＳＷＢからプラスミドを改変した（Ｍｉｎｄｅｒｅｒら、（２０１２）Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ５９０（１）：９９－１０７）。ヒトシナプシン１プロモーター（ｐｈＳｙｎ１）の後ろにＺＦＰ－Ｃ（ＦＬＡＧタグを付加）をクローニングして、ｐＡＡＶ－ＳＷＢ－ＺＦＰ－Ｃを生成した。さらに、ＺＦＰ－ＢからＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインを欠失させることによって、不活性なＺＦＰ対照構築物を生成した（ＺＦＰ－ΔＤＢＤ）。以前に記載されたとおりに、偽型化されたｒＡＡＶ２／１＋２粒子を作製し、精製した（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ，Ｓ．ら、（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６（６）：９７３－８５．ＰＭＩＤ：１０４５５３９９）；Ｃａｒｔｙ，Ｎ．ら、（２０１５）ＰＬＯＳ ＯＮＥ １０：ｅ０１２３５２７）。
簡潔に述べると、ポリエチレンイミンによって媒介されるプラスミド形質移入によって、等モル比の、関心対象の転写単位を担持するＡＡＶベクターならびにｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有するプラスミド（ｐＤＰ１ｒｓおよびｐＤＰ２ｒｓ、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｆａｃｔｏｒｙ）で、ＨＥＫ２９３細胞を同時形質移入した。３回の凍結融解サイクルによって、形質移入の４８時間後に細胞を溶解し、遠心によって細胞片を除去した。ウイルス粒子を含有する上清をベンゾナーゼで処理し、６０，０００ｒｐｍでのイオジキサノール密度遠心（Ｓ６、Ｓ７）に供した。イオジキサノールを除去し、フィルター遠心によって、ＰＢＳ ３００ ＭＫ（３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ ＫＣｌ）中にウイルス粒子を濃縮した。残りのｒＡＡＶ溶液は、Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ ０．２２μｍ細孔径を通してろ過した。無菌ｒＡＡＶ粒子を４℃で保存し、インビボ適用のためのＰＢＳ ＭＫ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．２５ｍＭ ＫＣｌ）を得るために、無菌ＰＢＳ緩衝液で１：１希釈した。ｑＰＣＲを用いて、ＡＡＶ力価を決定した。インビボ適用の前に、ｚＱ１７５ ｈｅｔマウスから得た初代線条体神経細胞中でのＷＴまたは変異体Ｈｔｔの下方制御に関して、ＺＦＰ発現ｒＡＡＶ粒子をインビトロで試験した。簡潔に述べると、２Ｅ５細胞／ウェルの細胞密度で、２４ウェルプレート中に線条体培養物を調製した。ｒＡＡＶ粒子（３Ｅ８ゲノム含有コピー、ＧＳｓ）を３インビトロ培養日に加え、細胞を１４インビトロ培養日に採集した。以下のプライマーを使用するｑＰＣＲを用いて、Ｗｔおよび変異体Ｈｔｔノックダウンを評価した：それぞれ、ＷＴに対して、フォワードＣＡＧ ＧＴＣ ＣＧＧ ＣＡＧ ＡＧＧ ＡＡＣ Ｃ（配列番号１８）およびリバースＴＴＣ ＡＣＡ ＣＧＧ ＴＣＴ ＴＴＣ ＴＴＧ ＧＴＧ Ｇ（配列番号１９）、変異体Ｈｔｔに対して、フォワードＧＣＣ ＣＧＧ ＣＴＧ ＴＧＧ ＣＴＧ Ａ（配列番号２０）およびリバースＴＴＣ ＡＣＡ ＣＧＧ ＴＣＴ ＴＴＣ ＴＴＧ ＧＴＧ Ｇ（配列番号２１）。
ＡＡＶ－ＺＦＰインビボ適用
１６匹のｚＱ１７５ ｈｅｔマウス（雄８匹および雌８匹）の２つの群が、２月齢で、ＨＴＴ対立遺伝子特異的ＺＦＰ３０６４０またはＺＦＰ－ΔＤＢＤ対照のいずれかをコードするｒＡＡＶ構築物の両側線条体内注射を受けた。１Ｌ／分の流速で、３％イソフルランによってマウスを個別に麻酔し、定位固定機器（Ｋｏｐｆ、Ｍｏｄｅｌ Ｎｏ．９４０）中に配置した。０．５Ｌ／分の流速での、２％イソフルランの気体ノーズコーン送達を介して、手術手技を通じて麻酔を維持した。７０％エタノールおよびヨウ素溶液での滅菌およびリドカイン適用後に、長さ１ｃｍの長軸方向中央矢状切開を頭皮中に施した。皮膚切開後に、電気ドリル（Ｆｏｒｅｄｏｍ；Ｍｏｄｅｌ Ｎｏ．Ｈ．３０）を用いて、線条体の注射部位に対応する小さな穴を頭蓋骨内に開けた。マウスのブレグマに従って測定された座標は、平らな頭蓋骨・ノーズバー設定で、ブレグマから０．８ｍｍ前側、１．８ｍｍ右外側および３．８ｍｍの深さであった。２００ｎＬ／分の一定した流速で、自動化された微量注射ポンプに接続されたＨａｍｉｌｔｏｎ気密シリンジ（モデル１８０１ ＲＮ、特注ゲージ２６針）を用いて、計４μＬ容量の（４Ｅ１０ ＧＣｓ）ＺＦＰウイルスベクターを投与した。注射後、手術創を塞ぎ、完全に回復するまで、動物は温熱パッド中で飼育した。
組織学および免疫組織化学
経心腔的灌流によって、６月齢および１０月齢でマウスを安楽させた。灌流のために、小径２７Ｇ針を用いたケタミン／キシラジン混合物（１５μＬ／ｇ体重で、ｋｇ当たり１２０ｍｇ／１５ｍｇ）の腹腔内注射によって、マウスを深く麻酔にかけた。灌流を開始する前に、正しい麻酔のレベルが達成されたことを確認するために、足指ピンチ反射および角膜反射の喪失に関して、動物を評価した。蠕動ポンプを用いて、３０ｍＬの氷冷したＰＢＳ、その後、５０ｍＬの４％パラホルムアルデヒドをマウスに経心腔的に灌流した。頭蓋骨から脳試料を取り出し、４℃で同じ固定液中において一晩後固定し、飽和するまで、３０％スクロース溶液中でインキュベートすることによって凍結保護した。全脳をＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ中に包埋し、－８０℃で保存した。クリオスタットを用いて、２５μｍの冠状切片を切断し、２４ウェルプレート中の浮遊状態で収集し、直接染色に使用するか、または使用時まで、－２０°で凍結保護溶液（２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４、３０％エチレングリコール、２０％グリセロール）中に保存した。免疫染色のために、以下の一次抗体を使用した：モノクローナルマウス抗変異体ハンチンチン（１：１００；ＥＭ４８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ５３７４、ｌｏｔ＃２１３５０５５）、モノクローナルウサギ抗ＤＡＲＰＰ－３２（１：２５０；クローン１９Ａ３、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２３０６、ｌｏｔ＃２）、ポリクローナルウサギ抗ＮｅｕＮ（１：１０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢＮ７８、ｌｏｔ＃２１４００８６）、モノクローナルマウス抗ＧＦＡＰ（１：１５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ３４０２、ｌｏｔ＃１９９０６８６）、ポリクローナルウサギ抗Ｉｂａ１（１：１０００、Ｗａｋｏ、＃０１９－１９７４１、ｌｏｔ＃ＳＡＥ６９２１）。全ての染色は、浮遊切片を用いて行った。０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ中で切片を透過性にし、１０％正常ヤギ血清／ＰＢＳ中でブロッキングし、４℃で一晩、ＰＢＳ中の１％正常ヤギ血清、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中に希釈された一次抗体とともにインキュベートした。ＰＢＳ中で１５分間、切片を３回洗浄し、室温で２時間、二次抗体中でインキュベートした。上記のとおり、切片をＰＢＳ中で洗浄し、Ｏｐｅｒａ Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．）を用いた画像化に適した２４ウェルガラス底プレート（Ｓｅｎｓｏｐｌａｔｅ、Ｇｒｅｉｎｅｒ、＃６６２８９２）中の、ＤＡＰＩ（Ｆｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄ、Ｓｉｇｍａ、Ｆ６０５７）を含有する水性封入剤を用いて封入した。
画像取得および自動画像解析
画像取得および分析は、以前に記載されたとおりに行った（Ｃａｒｔｙ，Ｎ．ら、同書）。簡潔に述べると、ｍＨＴＴ封入体の画像化のために、４０倍浸水対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＮＡ１．１５、ピクセルサイズ：０．３２μｍ）または組織中の膠細胞の分析のために、２０倍浸水対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＮＡ０．７、ピクセルサイズ：０．６４μｍ）を使用するＯｐｅｒａ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ ＳｃｒｅｅｎｉｎｇシステムおよびＯｐｅｒａソフトウェア２．０．１（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．）を用いて、自動画像取得を行った。Ａｃａｐｅｌｌａ（登録商標）Ｓｔｕｄｉｏ ３．１（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．）およびＣｏｌｕｍｂｕｓ（登録商標）システムの一部としての一体化されたＡｃａｐｅｌｌａ（登録商標）バッチ分析を用いて、ｍＨＴＴ包含体の性質決定および定量のための画像分析スクリプトを開発した。星状膠細胞および小膠細胞を同定するために、アルゴリズムは、ＧＦＡＰおよびＩｂａ１チャンネル中の神経突起様細胞伸長を検索した。核周囲の４ピクセル幅の周縁内にある予め決定された核境界に結合した伸長は、妥当であると考えた。伸長を検出することができる場合に限り、細胞はＧＦＡＰまたはＩｂａ１陽性であると考えた。その後、予め決定された核境界から３ｐｘ幅および２ｐｘ距離の核外周縁領域内で、「局所的」バックグランドシグナル強度を決定した。最後に、平均「局所的」バックグラウンド強度より高い核ＧＦＡＰまたはＩｂａ１強度を有する細胞のみを、それぞれ、星状膠細胞または小膠細胞と考えた。動物当たり６つの切片から得られた画像データを平均し、統計的評価のために、処置群当たり５匹の動物を使用した。
Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）分析のための組織ホモジネーション
ＦａｓｔＰｒｅｐ２４ホモジナイザー（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて、８０μＬの組織溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ホスファターゼ阻害剤カクテルＩＩ（Ｓｉｇｍａ）、ホスファターゼ阻害剤カクテルＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ）、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））中で脳の半球から切り出された全線条体を溶解した。１０分間、１６，０００ｒｃｆおよび４℃で、未精製可溶化液を３回連続で遠心し、各遠心工程後に上清を収集した。ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、全タンパク質濃度を決定し、溶解緩衝液を用いて、１ｍｇ／ｍＬに調整した。ホモジネートを分割量とし、瞬間凍結させ、分析まで－８０℃で保存した。
Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ分析
ウェル当たり炭酸塩－重炭酸塩コーティング緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３／３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中の１０μＬのコーティング抗体で、ＭＳＤプレート（３８４ウェル）を４℃で一晩被覆した。次いで、ウェル当たり３５μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）で、プレートを洗浄し、回転振盪しながら、室温で１時間、ウェル当たり３５μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の２％プロブミン／０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）でブロッキングした。５０％組織溶解緩衝液と５０％ブロッキング緩衝液の混合物中に、線条体抽出物を０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。さらなる洗浄工程の後、抗体で被覆されたＭＳＤプレートの各ウェルに、試料当たり１０μＬを移し、室温で１時間、振盪しながらインキュベートした。試料の廃棄およびそれぞれ３５μＬの洗浄緩衝液での４洗浄サイクル後に、各ウェルに１０μＬの検出抗体を加え、室温で１時間、振盪しながらインキュベートした。洗浄緩衝液での３回の洗浄後、３５μＬの界面活性剤を加えた読み取り緩衝液Ｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を各ウェルに加え、製造業者の指示書に従ってＳｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）上でプレートを画像化した。以下の抗体の組み合わせを使用した。４μｇ／ｍＬ ２Ｂ７／０．１μｇ／ｍＬ ４Ｃ９－ＳＴ；４μｇ／ｍＬ ＭＷ８／１ｍｇ／ｍＬ ４Ｃ９－ＳＴ；４μｇ／ｍＬ ＭＷ８／５μｇ／ｍＬ ＭＷ８－ＳＴ（ＳＴ：ＳＵＬＦＯ－ｔａｇ）。ヒトＨＴＴ－Ｑ７３、ａａ１－５７３（アッセイ２Ｂ７／４Ｃ９－ＳＴのため）または凝集エクソン１－Ｑ４６（ＭＷ８／４Ｃ９－ＳＴおよびＭＷ８／ＭＷ８－ＳＴアッセイのため）標準曲線に対して、試料を定量した。
データ解析および統計学
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）６．０ソフトウェアを用いて、統計解析を実施した。全ての解析について、０．０５未満のｐ値を統計学的に有意であると考えた。Ｗｅｌｃｈの補正をしたｔ検定を用いて、定量的解析（処置群当たり、ｎ＝５匹の動物、動物当たり６個の切片）を行った；ｐ＜０．０５＊；ｐ＜０．０１＊＊；ｐ＜０．００１＊＊＊
受容体オートラジオグラフィー（ＡＲＧ）およびマイクロＰＥＴ研究のために使用された動物
２月齢または４月齢のいずれかで、Ｅｖｏｔｅｃ Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙにおいて、ヘテロ接合のｚＱ１７５マウス（雄雌混合）にＡＡＶ１／２－ｈＳＹＮ１－ＺＦＰ－ＤまたはＡＡＶ２／１－ｈＳＹＮ１－ΔＤＢＤ－ＺＦＰを一側性に注射した。
３つの線条体マーカー［３Ｈ］ラクロプリド（Ｄ２リガンド）、［３Ｈ］ＭＮＩ－６５９（ＰＤＥ１０リガンド）および［３Ｈ］ＮＮＣ１１２（Ｄ１リガンド）を用いるＡＲＧを使用して、ｚＱ１７５ ｈｅｔマウスの２つのコホートの脳をＡＲＧで調べた。２月齢で注射された動物の１つのコホート（ｎ＝１０マウス／群）を６ヶ月で屠殺し、カロリンスカ研究所に発送し、放射性リガンドを使用するインビトロＡＲＧを用いて脳を調べた。
第二のコホートは、４月齢で注射した（ｎ＝３３～４１マウス／群）。動物をカロリンスカ研究所（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）に発送し、ドーパミンＤ２／Ｄ３受容体放射性リガンド［１１Ｃ］ラクロプリドを用いて、およびＰＤＥ１０Ａ酵素に対する放射性リガンドである［１８Ｆ］ＭＮＩ－６５９を用いて、６．５～７および１０月齢でマイクロＰＥＴ画像化を実施した。１０ヶ月の画像化研究の終わりにこの群の一部（ｎ＝１０動物／群）を屠殺し、［３Ｈ］ラクロプリド（Ｄ２リガンド）、［３Ｈ］ＭＮＩ－６５９（ＰＤＥ１０リガンド）および［３Ｈ］ＮＮＣ１１２（Ｄ１リガンド）を用いたＡＲＧのために使用した。
カロリンスカ研究所では、餌および水に自由に接近できるようにして、１２時間の明／暗サイクル（午前７：００に点灯）で、温度（±２１℃）および湿度（±４０％）が調節された環境中において、カロリンスカ大学病院の動物部門で動物を飼育した。画像化期間の開始前に、動物は、少なくとも１週間、動物部門に馴れさせた。全ての実験は、サイクルの明期の間に行った。全ての実験は、スウェーデン、北ストックホルムの動物倫理審査委員会によって承認されたプロトコール（Ｎ５５８／１１）に基づき、スウェーデン国立実験動物委員会の指針に従って実施した。
脳の取り出しおよび切片作製
頭蓋骨から脳を素早く取り出し、凍結するために、約－４０℃で１５～２０秒間、イソペンタン（２－メチルブタン９９％溶液）中に置いた。凍結された脳をスズ箔で包み、使用まで－８０℃で保存した。クリオスタットクライオミクロトーム（Ｌｅｉｃａ ＣＭ １８６０）上で、中央部分または線条体（約１ｍｍ）を１４μｍの厚さの切片（冠状）とした。スライド当たり３つの切片（７５切片＝１ｍｍ組織＝２５スライド）。顕微鏡スライド（ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ（登録商標）Ｐｌｕｓ、Ｍｅｎｚｅｌ－Ｇｌａｓｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上に切片を解凍マウントし、風乾し、クリオスタット中で直接再度凍結した。使用するまで、スライドを－２０°に保った。切片作製は連続的に行った、すなわち、同じスライド上には３つのレベルからの切片が存在する。
ＨＴＴ凝集物に対する蛍光免疫組織化学（ＩＨＣ）
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に切片を置き、次いで、ＰＢＳ中の０．３％ＴＸ－１００、０．１％ＮａＮ３中に１／３００希釈されたマウス抗ＨＴＴ一次抗体（ＣｈｅｍｉｃｏｎからのＭＡＢ５３７４、抗ハンチンチンタンパク質抗体、クローンｍＥＭ４８、マウス起源）とともに、７２時間インキュベートした。０．５％ｔｗｅｅｎを含有するＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で切片を洗浄し、ブロックし（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、４８８抱合抗マウス二次抗体（１／２００、Ｊａｃｋｓｏｎ）を含有するブロッキング緩衝液中でインキュベートした後、０．５％ｔｗｅｅｎを含有するＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝生理食塩水中で数回洗浄した。全ての切片は、核マーカーＨｏｅｃｈｓｔ（１／５．０００）で対比染色し、１％Ｓｕｄａｎ Ｂｌａｃｋ（７０％エタノール中）を用いて組織自己蛍光をブロックし、２．５％ＤＡＢＣＯを含有するポリビニルアルコール／グリセロール（Ｓｉｇｍａ）とともに載置した。全てのＩＨＣスライドは、ＭｅｔａＶｉｅｗｅｒ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓを用いて分析した。
放射性リガンド
［３Ｈ］ＮＮＣ１１２（７７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、カロリンスカ研究所、臨床神経科学部門において合成され、［３Ｈ］ラクロプリド（８１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、Ｎｏｖａｎｄｉ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＡＢ（Ｓｏｄｅｒｔａｌｊｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。［３Ｈ］ＭＮＩ６５９（５７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、ＣＨＤＩ基金によって提供された。全ての放射性リガンドの放射化学的純度は、ＡＲＧ実験の前に測定した（＞９５％）。
インビトロオートラジオグラフィー（ＡＲＧ）
スライドを室温で解凍し、結合緩衝液（Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ７．４、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む）中で、およそ２０分間、プレインキュベートした。次いで、室温で６０分間、結合緩衝液中において、１ｎＭ放射性リガンドでスライドをインキュベートした。
２組の容器中に、置換不能な結合を確立するために、１０μＭのブタクラモール（［３Ｈ］ＮＮＣ１１２および［３Ｈ］ラクロプリド）またはＭＰ－１０（［３Ｈ］ＭＮＩ６５９）を加えた。インキュベーション後、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ７．４中で１０分間、スライドを３回洗浄した後、蒸留水中で短時間洗浄した。室温で一晩または加熱した（３７℃）プレート上でおよそ３０分間、スライドを乾燥させた。オートラジオグラフィーマイクロスケール標準（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）とともにスライドを配置し、トリチウム感受性リン光体画像化プレート（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｐｌａｔｅ ＢＡＳ－ＴＲ２０２５、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）上で９０時間露出した。
［３Ｈ］ＭＮＩ６５９に対して使用された組織切片は、リン光体画像化プレートへの露出前に、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中での固定に供した。これは、この放射性リガンドが極めて強力である故にシグナルを分析するために不可欠であるシグナル強度の減少をもたらす。組織の後固定を伴う本技術は、トリチウム（３Ｈ）のような低エネルギー同位体のリン光体画像化プレートの複数回使用を可能にするために以前に用いられた。この文脈では、本発明者らは、組織中での［３Ｈ］ＭＮＩ６５９のシグナル強度を減少させて、結合画分と遊離画分間で平衡に達するために不可欠であるより高い濃度（例えば、１ｎＭ）での結合を使用するために後固定を使用する。後固定工程がないと、本発明者らは、０．１５ｎＭより下の濃度での結合の実施に限定され、これは、平衡に達するのに十分でなく、したがって、野生型とＱ１７５［３Ｈ］ＭＮＩ６５９インビトロ結合間の差異を可視化するのに十分でない。
［３Ｈ］ＭＮＩ６５９での後固定の欠点は、減少したシグナルが、特異的結合のより低い定量値（ｆｍｏｌ／ｍｇ組織）での画像解析に影響を与えることである。それにも関わらず、分析された脳領域間の比は同一に保たれ、群間の特異的結合の差が同等であることを意味している。
画像解析
リン光体画像化プレートを走査し、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ ＢＡＳ－５０００リン光体画像化装置（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）中で得られた画像を処理した。関心領域（ＲＯＩ）分析は、蛍光ＩＨＣによって可視化されたＥＭ４８免疫反応性に基づく注射部位の手動での描写によって適用した。次いで、６切片から得たＲＯＩの平均ピクセル値を放射能値に変換し、マイクロスケール標準を用いて結合密度（ｆｍｏｌ／ｍｇ組織、組織湿潤重量）に変換した。定量分析は、Ｍｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅ ３．２ホスフォイメージャーソフトウェア（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて行った。特異的結合は、各切片に対して、総結合から非特異的結合のレベルを差し引くことによって計算した。
放射性合成
［１１Ｃ］ラクロプリドの放射性合成：［１１Ｃ］ラクロプリドは、以前に記載されているとおりに（Ｌａｎｇｅｒら、（１９９９）Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ２６（５）：５０９－１８）、［１１Ｃ］メチルトリフレートを用いて、デスメチル前駆体類縁体のメチル化によって、カロリンスカ研究所において合成された。取り込み率は５０％超であり、放射化学的純度は９９％超であった。
［１８Ｆ］ＭＮＩ６５９の放射性合成：放射性合成は、ＰＭＩＤ２７８５６６２５に記載されているとおりに実施した。
［１１Ｃ］ラクロプリドおよび［１８Ｆ］ＭＮＩ－６５９によるインビボ画像化
ＰＥＴ測定は、Ｍｅｄｉｓｏ ｎａｎｏＳｃａｎ（登録商標）ＰＥＴ－ＭＲＩおよびｎａｎｏＳｃａｎ（登録商標）ＰＥＴ－ＣＴ前臨床小規模動物画像化システムを用いて行った。２つのシステムは、同一のＰＥＴ性能を有し（Ｎａｇｙら、（２０１３）Ｊ．Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ５４（１０）：１８２５－３２）、一貫した結果を与えるために較正した。第一のＰＥＴ測定は、動物が６．５～７月齢のときに行った。実験日には、イソフルラン（１００％酸素中の４～５％イソフルラン）の吸入によって、動物に麻酔をかけた。麻酔の導入後に、イソフルラン濃度は１．５～２％（５０／５０空気／酸素）に低下し、動物は、指定されたマウスベッド中において、スキャナー中に配置した。カニューレを尾静脈中に挿入し、そこから放射性リガンドを投与した。放射性リガンドの静脈内注射後直ちに、６３分のダイナミックＰＥＴスキャンを開始した。画像化期間が終了したら、動物をそのケージに戻した。動物は、カロリンスカ研究所の動物部門において１０月齢まで飼育され、ここで、同じ放射性リガンドを用いて画像化を繰り返した。
画像および統計解析
獲得されたリストモードデータを、２５のタイムフレーム（６３分スキャン＝４×１０秒、４×２０秒、４×６０秒、７×１８０秒、６×３６０秒）に再構築した。画像再構築は、完全に３次元の最尤推定期待値最大化アルゴリズム（ＭＬＥＭ；ｍａｘｉｍｕｍ－ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によって、２０回反復して、散乱および減衰補正せずに行った。関心体積（ＶＯＩ）の組も取り込んだ、ＰＭＯＤ中で利用可能な内蔵マウスＭＲＩテンプレート（ＰＭＯＤ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．，Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に、再構築されたダイナミックＰＥＴ画像を同時に位置合わせした。これらのＶＯＩの組の助けを借りて、減衰補正された時間放射能曲線（ＴＡＣ）を作成した。参照領域として小脳を使用する簡易参照組織モデル（ＳＲＴＭ）を用いて、結合能（ＢＰＮＤ）をＰＭＯＤで計算した。以下の式にしたがって、左線条体と右線条体間の％差を計算した。
％差＝（（右線条体－左線条体））／（左線条体）×１００
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．００ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）を使用し、被験体内での対応のあるｔ検定を用いて、線条体の２つの側の差を解析した。さらに、被験体間での対応のないｔ検定を用いて、対照処置群とリプレッサー処置群間での、左線条体と右線条体間の％差を解析した。
電気生理学的記録
電気生理学的記録のために、赤外線微分干渉コントラストを取り付けたＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１正立顕微鏡（６０Ｘ／０．９ＮＡ対物レンズ）上に載置された浸水スタイル記録チャンバーにスライスを移した。ホールセルパッチクランプ電気生理学的記録は、Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ ７００Ｂ増幅器を用いて行った。シグナルに１ｋＨＺでフィルターをかけ、Ｄｉｇｉｄａｔａ １４００を用いてデジタル型式に変換した。二光子画像法と電気生理学を同期化する特別に作成されたソフトウェアＷｉｎＦｌｕｏｒ（Ｊｏｈｎ Ｄｅｍｐｓｔｅｒ、Ｓｔｒａｔｈｃｌｙｄｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｇｌａｓｇｏｗ、ＵＫ）を用いて、電気生理学的記録の刺激および表示を得た。ｉＳＰＮまたはｄＳＰＮから標的化された電気生理学的記録を得た。フィラメントを有し、１３５ ＫＭｅＳＯ４、５ ＫＣｌ、５ ＨＥＰＥＳ、０．０５ ＥＧＴＡ、２ ＡＴＰ－Ｍｇ２、０．５ ＧＴＰ－Ｎａ、１０ホスホクレアチン－ジ（ｔｒｉｓ）で満たされた（ｍＭ）ホウケイ酸ガラスを使用し、Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓホリゾンタルプラーを用いて、パッチピペット（４～６ＭΩ）を作製した；ＫＯＨを用いてｐＨを７．２５に調整し、浸透圧を２７０～２８０ｍｏｓＭに調整した。樹状突起棘および軸中の一過性Ｃａ２＋上昇を記録するために、１００μＭ Ｆｌｕｏ－４五カリウム塩および２５μＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８ヒドラジドナトリウム塩（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を満たした。全ての記録は、ホールセル配置が確立されてから３０分後に行った。神経細胞の電気生理学的性質決定は、電流クランプ配置で行った。電極抵抗を補償するために、増幅器ブリッジ回路を調整した。アクセス抵抗を継続的にモニターし、２０％を超える変化が観察されたら、実験を廃棄した。安定な記録された神経細胞のみを分析のために考慮した。アクセス抵抗の変化のために、本発明者らの記録の３０％を廃棄した。膜電位は、－８０ｍＶに維持した。市販のソフトウェア（ＩＧＯＲ Ｐｒｏ ６．０、ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ、Ｏｒｅｇｏｎ）を用いて、デジタル化されたデータを分析のために取り込んだ。
二光子Ｃａ２＋画像化
逆伝播活動電位（ｂＡＰ）によって、一過性Ｃａ２＋上昇を誘発した（それぞれ５つのｂＡＰトリプレット；５０Ｈｚトレイン内；トレイン間５Ｈｚ；ＺＦＰ実験では、単一の５０ＨＺトリプレットによって、ｂＡＰを生成した）。８２０ｎｍの励起波長（８０－ＭＨｚパルス周波数；２５０ｆ秒パルス期間）を用いて、調節可能なレーザー（Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｌａｓｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に取り付けられたＵｌｔｉｍａ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、旧Ｐｒａｉｒｉｅ）を用いて、同じ樹状突起の同一平面上切片からの近位（５０～６０μｍ）および遠位樹状突起棘（＞１００μｍ）において、一過性Ｃａ２＋上昇を記録した。樹状突起を可視化するために、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（５８０～６３０ｎｍ）からの赤いシグナルを使用し、一過性Ｃａ２＋上昇を記録するために、Ｆｌｕｏ－４（４９０～５６０ｎｍ）からの緑のシグナルを使用した。近位および遠位切片から得られたシグナルを標準化するために、赤いチャンネルを使用した。このように、一過性Ｃａ２＋上昇は、緑と赤い蛍光の比（Ｇ／Ｒ）として表した。その赤い蛍光が１０％未満異なる同じ焦点面中に位置する近位および遠位樹状突起のみをさらなる分析のために検討し、色素拡散人為現象を回避した。線当たり５１２ピクセル解像度および１０μ秒／ピクセル滞留時間を用いて、線スキャンシグナルを獲得した。トリプレットｂＡＰを使用するＺＦＰ実験については、データ平滑化および統計のために、ＩＧＯＲ Ｐｒｏ（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ、Ｌａｋｅ Ｏｓｗｅｇｏ、ＯＲ）を使用した。時間の関数（Ｆ（ｔ））としての平均蛍光は５つの隣接するピクセルの空間的平均であったが、基底蛍光Ｆｏは、線スキャン内の最初の３０時点の平均であった。電流注入に起因する標準化されたＣａ２＋シグナルの差（ΔＦ／Ｆｏ）を、基底蛍光によって標準化された最大蛍光変化として定義した。
二光子レーザー放出
顕微鏡（Ｕｌｔｉｍａ、Ｂｒｕｋｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に取り付けられた２つの異なるフェント秒パルスを用いて、同時の二光子Ｃａ２＋画像化および二光子レーザー放出を行った。ＭＮＩ－グルタメート（５ｍＭ）を記録された領域中に表面灌流し、光刺激レーザー（Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｌａｓｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）によって７２０ｎｍで励起した。試料に対する２つのレーザー光線は、２組の独立した重量測定走査ミラーによって個別に調節される。同じ焦点面中に位置する単一の棘（５～１０の棘）に、１ｍ秒のパルス（約１０ｍＷ）を送達した。各刺激された棘に対して１～２ｍＶの細胞体興奮性後シナプス電位を誘発するために、単一棘刺激を較正した。一過性Ｃａ２＋上昇、電気生理学的記録および二光子レーザー刺激を同期化するために、特別作成のソフトウェア（ＷｉｎＦｌｕｏｒ）を使用した。
ＺＦＰ構築物
ＺＦＰ－Ｄ ｃＤＮＡおよび非結合ＺＦＰ ｃＤＮＡを含有するプラスミドをサブクローニングし、Ｖｉｒｏｖｅｋ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）によってＡＡＶ９中にパッケージングした。Ｎ末端ＮＬＳおよびＣ末端ＦＬＡｇタグが付加されたヒト変異体Ｈｔｔ－リプレッサーＺＦＰおよびｔｄＴｏｍａｔｏの発現を、ウイルス２Ａ切断ペプチドによって架橋する。ＺＦＰによって媒介されるｍＨＴＴ発現の抑制を試験するために、１１１ポリグルタミンリピートを有するヒト化されたエクソン１と、７ポリグルタミンリピートを有する野生型マウスＨＴＴを有する他方とを有するヘテロ接合ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子座を含有するノックイントランスジェニックマウスから得られる線条体由来の細胞株ＳＴ ＨＤＨ Ｑ７／１１１（Ｃｏｒｉｅｌｌ、ＣＨＤＩ－９０００００７２）を使用した。１２ウェルプレート中に細胞を播種し、次いで、一晩のインキュベーション後に、ＺＦＰ－３０６４５を担持するＡＡＶで感染させ、ＲＮＡ単離のために、感染の７２時間後に採集した。
Ａ２ａ－Ｑ１７５ ＨＥＴ中でのＺＦＰ媒介性抑制
イソフルランで麻酔された４月齢のＡ２ａ－ＥＧＦＰおよびＡ２ａ－ＥＧＦＰ／Ｑ１７５ ｈｅｔマウスの線条体（ＭＬ＝－１．７、ＡＰ＝－０．９８、ＤＶ＝－３．６）中にＺＦＰおよびｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子を担持するＡＡＶの定位固定注射を行った。注射後に少なくとも２ヶ月、マウスを回復させた。
Ｈｔｔ ｍＲＮＡ発現の定量的リアルタイムＰＣＲ分析
ＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＺＦＰ ＡＡＶを注射されたマウスのＳＴ ＨＤＨ Ｑ７／１１１細胞および線条体組織からＲＮＡを単離した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＲＮＡを逆転写した。ＳＹＢＲ－Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘとともにＡＢＩ ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ ｒｔＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｒｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて、定量的リアルタイムＰＣＲを行った。異なる転写物の相対的存在量は、２－［Δ］［Δ］Ｃｔ法（ＡＢＳ、Ｕｓｅｒ ｂｕｌｌｅｔｅｉｎ２）を使用するＳＹＢＲ定量的ＰＣＲによって評価した。ＰＣＲ増幅のために、以下のプライマー（ＩＤＴ）を使用した。野生型－マウスＨｔｔ＿ｆｗ：ＣＡＧ ＧＴＣ ＣＧＧ ＣＡＧ ＡＧＧ ＡＡＣ Ｃ（配列番号２２）、Ｍｕｔ－マウス－Ｈｔｔ＿Ｑ１７５＿ｆｗ：ＧＣＣ ＣＧＧ ＣＴＧ ＴＧＧ ＣＴＧ Ａ（配列番号２３）、Ｍｕｔ＆野生型Ｈｔｔ＿ｒｖ＊：ＴＴＣ ＡＣＡ ＣＧＧ ＴＣＴ ＴＴＣ ＴＴＧ ＧＴＧ Ｇ（配列番号２４）、ＺＦＰ＿ｆｗ：ＣＴＧ ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＡＡＴ Ｔ（配列番号２５）およびＺＦＰ＿ｒｖ：ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＣ ＴＴＧ ＴＡＧ ＴＣＡ ＡＣＴ ＧＡ（配列番号２６）、（＊野生型および変異体ＨＴＴが同一のリバースプライマー配列を共有する）。簡潔に述べると、以下の式を用いて、実験的Ｃｔ値をＧＡＰＤＨ値に対して標準化した。ΔＣｔ＝Ｃｔ（Ｈｔｔ）－Ｃｔ（ＧＡＰＤＨ）。以下の式を用いて、対照と比較した発現レベルを計算した。ΔΔＣｔ＝Ｃｔ（処置）－ΔＣｔ（対照）。最終発現レベルは、式２－ΔΔＣｔを用いて得た。
［実施例２］伸長したポリＣＡＧ鎖を保有するＨＴＴ対立遺伝子を選択的に抑制するＺＦＰ－ＴＦの同定
これらの研究を試みる上で、高度に相乗的な機能を呈し、Ｈｔｔを抑制するその能力において、ポリＣＡＧ鎖長に対して急峻な依存性を示すポリＣＡＧ標的化ＺＦＰ－ＴＦの結合特性（図１Ａ）は予想することができなかった。さらに、対立遺伝子特異的応答を可能にする環境要因をモデル系内で模倣することは困難であるという事実に対処するために、本発明者らは、患者細胞中での内在性ＨＴＴプロモーター状況における対立遺伝子特異的なインサイチュ抑制に関して直接、多様なＺＦＰ－ＴＦの多様なパネルをスクリーニングすることに重点を置いた戦略を遂行した。
したがって、患者細胞中での内在性Ｈｔｔプロモーター状況における、対立遺伝子特異的なインサイチュ抑制に関して、多様なＺＦＰ－ＴＦのパネルを直接スクリーニングした。図１Ｂおよび１Ｃならびに以下の表１および２に示されているように、ポリＣＡＧ鎖内に多様な構造、標的長および結合周期性を有する４１組の異なるＺＦＰを（本質的に、米国特許第８，８４１，２６０号に記載されているとおりに）組み立てた。以前に記載されているとおりに、ＫＯＸ１タンパク質由来のＫＲＡＢ転写抑制ドメインに各ＺＦＰを連結した。標準的な技法のとおり、ＺＦＰは、１または２フィンガーモジュールのいずれかから組み立て、これらのタンパク質は、ＺＦＰモジュール間に異なるフィンガーリンカーを使用した（下表１では、「Ｍｏｄ ｌｉｎｋ」と称される。）。使用したリンカーは以下のとおりである。「０ａ」は、ＴＧＥＫＰＦＱ（配列番号２７）であり；「０ｃ」は、ＴＧＳＱＫＰＦＱ（配列番号２８）であり；「１ｃ」は、ＴＨＰＲＡＰＩＰＫＰＦＱ（配列番号８８）であり；「２ｆ」は、ＴＰＮＰＨＲＲＴＤＰＳＨＫＰＦＱ（配列番号２９）である。０ａおよび０ｃリンカーは、モジュール間のヌクレオチド塩基を一切スキップしないのに対して、１ｃおよび２ｆは、それぞれ、１塩基対および２塩基対をスキップする。
Figure 0007332622000001
Figure 0007332622000002
Figure 0007332622000003
Figure 0007332622000004
Figure 0007332622000005
Figure 0007332622000006
次いで、それぞれが変異体および野生型ポリＣＡＧ鎖長の異なる組み合わせを有する２人の異なるＨＤ患者由来の線維芽細胞中へのＲＮＡヌクレオフェクションを介して送達されたときの対立遺伝子選択的抑制に関して、これらのタンパク質をスクリーニングした（図１Ｄ）。ＳＮＰをベースとする対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲを介して、野生型および変異体転写物レベルの独立したモニタリングを達成した（図１Ａおよび図６）。
このスクリーニングは、いくつかのデザインに対する対立遺伝子特異性の明確な証拠を含む、多岐にわたるＨｔｔ抑制挙動をもたらした（例えば、図１Ｄ参照）。
［実施例３］ 広いＺＦＰ用量範囲にわたるｍＨＴＴの対立遺伝子選択的抑制
次に、本発明者らは、初期スクリーニングにおいて変異体対立遺伝子を選択的に抑制した２つのＺＦＰ－ＴＦを使用し、同じくＨｔｔタンパク質産物の定量を介して、対立遺伝子特異的抑制と両立する用量範囲の評価に及んだ（ＺＦＰ－ＡおよびＺＦＰ－Ｂ、図１Ｃ）。ＺＦＰ－ＡないしＺＦＰ－Ｄに対する完全な配列が、下表３に提供されている。
Figure 0007332622000007
図１Ｅに示されているように、ＣＡＧ１５／６７（配列番号８１／８２）線維芽細胞での研究において、ＺＦＰ－ＡおよびＺＦＰ－Ｂ ＺＦＰ－ＴＦはいずれも、伸長した対立遺伝子の排他的抑制を示した。さらに、図１Ｆに示されているように、両リプレッサーは、ウェスタンブロットによって計測されたところによると、ｍＨｔｔタンパク質のみを選択的に低下させることが示された（図１Ｆ、上（ｍＨｔｔ）のバンドと下（ｗｔＨｔｔ）のバンドを比較せよ。
次に、本発明者らは、上記のとおりの滴定研究において、これらのＺＦＰ－ＴＦを評価した。
図１Ｇに示されているように、幅広い用量範囲にわたる対立遺伝子特異的抑制が観察された。特に、ＺＦＰ－Ｂは、２．５８ｎｇのＥＣ５０で（Ｒ２０．９６）、１００倍の範囲の送達されたＲＮＡ用量（１０ｎｇ～１０００ｎｇの送達されたＲＮＡ）にわたって、９２％を超える疾患対立遺伝子の抑制を示し、野生型ＨＴＴの抑制を示さなかった。注目すべきことに、ＺＦＰ発現は、この投薬範囲にわたって、送達されたＲＮＡレベルを正確に反映していた。総合すると、これらの研究は、設計されたＺＦＰ－ＴＦが、１００倍の範囲のＺＦＰ発現にわたって専らｍＨＴＴ転写物を下方制御することができ、ｍＨＴＴタンパク質産物の選択的低下をもたらすことを確定した。
［実施例４］多様なＨＤ遺伝子型にわたる対立遺伝子選択的抑制
本発明者らは、次に、ＨＤ集団を代表するポリＣＡＧ鎖を保有する線維芽細胞での滴定研究を行った（図１Ｈ）。これを達成するために、１８リピートのポリＣＡＧ鎖（配列番号７９）および４５リピートのポリＣＡＧ鎖（配列番号８０）を呈するＧＭ０２１５１線維芽細胞中で、リプレッサーＺＦＰ－ＡおよびＺＦＰ－Ｂをまず評価した。
図１Ｇに示されているように、ＺＦＰ－ＡおよびＺＦＰ－Ｂは、約１００倍の用量範囲にわたって、ｍＨＴＴを選択的に抑制し、任意の用量において、１５％未満のＣＡＧ１８（配列番号７９）対立遺伝子の抑制が見られた。
さらに、野生型ポリＣＡＧ鎖長と変異体ポリＣＡＧ鎖長間で、２１リピート（配列番号８３）および３８リピート（配列番号８４）という非典型的に狭い隔たりを有する患者線維芽細胞中においても、リプレッサーの効果を調べた。
図１Ｈに示されているように、ＺＦＰ－ＡおよびＺＦＰ－Ｂは、１００倍用量にわたって、選択的かつ強力なＣＡＧ３８対立遺伝子（配列番号８４）の抑制（最大９３％の低下）を誘導したが（ＺＦＰ－Ａ ＥＣ５０＝９．８ｎｇ、Ｒ２＝０．９４；ＺＦＰ－Ｂ ＥＣ５０＝３．９ｎｇ Ｒ２＝０．９４）、より高い用量において、ＣＡＧ２１対立遺伝子（配列番号８３）の若干の（一般に、＜２５％）抑制が見られた（図１Ｊ）。
これらの結果は、本明細書に記載されている設計された遺伝子リプレッサーが、１００倍のＺＦＰレベルの範囲にわたって、内在性対立遺伝子選択的抑制を誘導することができることを確認し、これは、ポリＣＡＧに標的化される他の様式に対して以前に実証されたものより大幅に大きい（例えば、ＡＳＯまたはＲＮＡｉ、Ｇａｇｎｏｎら、同書；Ｈｕら、同書およびＹｕら、同書参照）。さらに、抑制に対して感受性である（ＣＡＧ≧３８）または抑制に対して抵抗性である（ＣＡＧ≦２１）対立遺伝子の長さを区分することによって、これらの研究は、ＨＤ患者中に見出される少なくとも８７％の正常な対立遺伝子を区別しながら、１００％の完全浸透性変異体対立遺伝子（ＣＡＧ＞３９）を下方制御するＺＦＰ－ＡおよびＺＦＰ－Ｂの能力を明らかにする（図１Ｈ）。
ＺＦＰ－ＡおよびＺＦＰ－Ｂによって示された高度の対立遺伝子選択性は、ポリＣＡＧ鎖の長さに対してずっと低い感受性であるように見受けられた従前の研究（Ｇａｒｒｉｇａ－Ｃａｎｕｔら、同書）において報告されたＨＴＴリプレッサーの挙動と対照的であった。この相違は、本発明者らがより厳格で、疾患に関連する状況（患者の線維芽細胞）中で対立遺伝子選択性をスクリーニングしたことによるものであり、これにより、本発明者らは、真正な機能的相乗作用を表す稀なリプレッサーを、単純な質量作用を介して対立遺伝子をより非効果的に識別するより一般的なデザインと区別することが可能となったと、本発明者らは考えた。これと合致して、Ｇａｒｒｉｇａ－Ｃａｎｕｔのマウス細胞系（ＨｄｈＱ７／Ｑ１１１、それぞれ、４（配列番号８６）および１１１（配列番号８７）の連続的ＣＡＧリピート対立遺伝子を含む）中での本発明者らの候補デザインの評価は、ずっとより高頻度の明らかに対立遺伝子選択的な的中をもたらし、２５のＺＦＰ－ＴＦが、ｍＨＴＴの７５％超の低下および１０％未満の野生型ＨＴＴの低下を示した（図８）。これに対して、本発明者らのより厳格な患者線維芽細胞スクリーニングモデル（ＣＡＧ１８／４５（配列番号７９／８０））では、３つのＺＦＰ－ＴＦのみが量的に同等の挙動を与えた。この観察と合致して、ＣＡＧ４／１１１（配列番号８６／８７）細胞においてのみ対立遺伝子選択的であった対照ＺＦＰ（ＺＦＰ－Ｃ）は、ＺＦＰ－ＡおよびＺＦＰ－Ｂを性質決定するために使用された同じ追跡研究では対立遺伝子選択的でなかった（図１Ｅ～１Ｊ参照）。最後に、Ｇａｒｒｉｇａ－Ｃａｎｕｔら、同書からの２つの主要なＺＦＰの直接的評価は、疾患関連ポリＣＡＧ鎖（ＣＡＧ１８／４５（配列番号７９／８０））を有する患者線維芽細胞（ＧＭＯ２１５１）中で試験されたときにいずれも対立遺伝子選択性を示さないことを示した（図９）。
［実施例５］ ヒト神経細胞およびマウス線条体中でのｍＨＴＴの長期対立遺伝子選択的抑制およびＨＤ関連表現型の改善
ＨＤの病態は神経細胞の機能不全によって特徴付けられるので、本発明者らは、ＣＡＧ１７／４８（配列番号７６／７８）胚性幹細胞（ＥＳＣ；Ｇｅｎｅａ０２０）の十分に性質決定された株から分化した神経幹細胞（ＮＳＣ）および神経細胞中でのＺＦＰの能力を評価するために一連の研究を行った（図２Ａ；図１０）。最初の研究は、上述のように、対立遺伝子特異的抑制について調べた。
図２Ｂに示されているように、一過性のｍＲＮＡ形質移入を介したＺＦＰの送達は、幅広い投与範囲にわたって対立遺伝子選択的抑制を明らかにし、実施例１に記載されているものと同様の結果であった。特に、ＺＦＰ－Ｂは、１００倍の範囲の送達されたＲＮＡ用量（３０ｎｇ～３０００ｎｇ）にわたって、疾患対立遺伝子の９０％を超える抑制を示し、野生型ＨＴＴの抑制を示さなかった。分化した神経細胞においても、ＡＡＶ形質導入を介したＺＦＰの送達は高度に対立遺伝子特異的抑制をもたらしたが（図２Ｃ；本研究において使用された全てのＡＡＶベクターの要約に関しては下表４を参照）、ＣＡＧ１７（配列番号７６）が穏やかに低下し（それぞれ、ＺＦＰ－ＡおよびＺＦＰ－Ｂに対しておよそ１７％および８％）、これは、この系でのより高いＺＦＰ発現レベルを反映したものであり得る。ＨＤ線維芽細胞中でのその挙動と同様、ＺＦＰ－Ｃは、ＮＳＣおよび神経細胞中で正常な対立遺伝子と疾患対立遺伝子の両方を強力に抑制した。
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次に、本発明者らは、細胞の耐容性および長期的な効力の証拠を得るために、ＺＦＰを調べた。これを達成するために、レンチウイルスの送達を使用して、ＮＳＣおよび神経細胞中での１０３日の研究を通じて慢性的なＺＦＰ発現を誘導した。感染したＮＳＣを増殖させ、２７日後に、ＺＦＰ発現に関してＦＡＣＳ濃縮し、５１日間増殖させ、最後に神経細胞へ分化させ、さらに２５日間培養した。７４日目および１０３日目に対立遺伝子の発現を評価した（図２Ａ）。
図２Ｄおよび２Ｅに示されているように、制御は高度に選択的であり（ＣＡＧ４８（配列番号７８）は８８％超の低下、ＣＡＧ１７（配列番号７６）は１２％未満の低下）、第二の試料採取日に低減しておらず、全ての研究期間の間に、ＺＦＰ発現が良好に耐容されたことを示している。この結果と合致して、マイクロアレイによるトランスクリプトーム全体にわたる特異性分析（ｎ＝１８，１４９遺伝子を調査）によって、強固なオンターゲット対立遺伝子特異的制御という条件下では、ＣＡＧ１７／４８（配列番号７６／７８）神経細胞（（ｎ＝５、ＺＦＰ－Ａ；ｎ＝１６、ＺＦＰ－Ｂ）、図２Ｆ；下表５）およびＣＡＧ１８／４５（配列番号７９／８０）線維芽細胞（（ｎ＝１０、ＺＦＰ－Ａ；ｎ＝５、ＺＦＰ－Ｂ）、図１１Ａ；下表６）中でのオフターゲット遺伝子抑制のレベルは限定的あることが明らかとなった（図１１）。神経細胞（ｎ＝５３）および線維芽細胞（ｎ＝４５）において、大幅により多数の遺伝子が非対立遺伝子選択的ＺＦＰ－Ｃによって抑制され、その多くは、ＴＳＳの１ｋｂ以内にＣＡＧアレイを含有する（図２Ｇ、図１１Ｄ）。マイクロアレイの性能は、対照転写物の組のｑＲＴ－ＰＣＲを介して広く確認された（図１１Ｂおよび１１Ｃ）。重要なことに、マイクロアレイデータのメンバーシップ分析は、ＺＦＰ－ＡおよびＺＦＰ－Ｂによって制御される遺伝子間に重複がないことを明らかにし（図２Ｇ、図１１Ｄ）、対応するプロモーターの調査は、遺伝子が制御されるかどうかと、ＣＡＧリピートの存在、長さまたは位置との間に厳密な対応がないことを示した（表５および６参照）。総合すると、これらの結果は、対立遺伝子特異的ｍＨＴＴ抑制のためのＣＡＧ標的化アプローチが、さらに長いおよび／またはより容易に結合されるリピートアレイを有するある種の他の遺伝子を不可避的に抑制し得るという可能性を除外し、代わりに、本発明者らのデザインのさらなる最適化はｍＨｔｔを特異的に抑制するＺＦＰ－ＴＦを与え得ることを示唆する。
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次いで、本発明者らは、ＨＤ関連表現型の軽減に関して、ＺＦＰ－Ｂ処置されたＣＡＧ１７／４８（配列番号７６／７８）神経細胞を評価した（図２Ａ）。
図２Ｈに示されているように、ＣＡＧ１７／４８（配列番号７６／７８）神経細胞は、非ＨＤ神経細胞と比較して（図２Ｈおよび２Ｉ）、非ＨＤ神経細胞と比較して、細胞内ＡＴＰレベルの著しい減少およびアポトーシスに対する増加した感受性を有していた。ＺＦＰ－Ｂ発現の２１日後に、ＡＴＰレベルは、対照処理された神経細胞と比べて、約７０％増加し、ｍＨＴＴのＺＦＰを媒介した抑制はＨＤ関連代謝異常を改善することができることを示唆する。培養されたＨＤ神経細胞は、アポトーシスに対する増加した感受性も示す。増殖因子を撤回してから７日後に、アポトーシスを受けているＣＡＧ１７／４８（配列番号７６／７８）神経細胞の百分率は非ＨＤ神経細胞の百分率より３．３倍高く、ＺＦＰ発現は、アポトーシスをベースラインレベルへ回復させた。図２Ｉに示されているように、ＺＦＰ－Ｂの発現は、アポトーシスレベルを正常な神経細胞のレベルへと低下させた。
したがって、ＺＦＰ－ＴＦによるｍＨＴＴ対立遺伝子の選択的抑制は、ＨＤの重要な病理的特徴と関連する細胞の表現型の回復をもたらした。
げっ歯類中でＨＤ様疾患を誘導するために人工的に長いＣＡＧ鎖が必要とされることを考慮して、表現型の研究を実施する前に、本発明者らは、内在性マウスＨｔｔ遺伝子に４８ＣＡＧをコードするヒトエクソン１（配列番号７８）のノックイン対立遺伝子を有するヘテロ接合のＱ５０（ＨｄｈＱ５０／Ｈｄｈ＋）マウス中でＺＦＰ－Ｂの性能を評価した。表現型的には正常であるが、Ｑ５０モデルは、ＨＤ患者に典型的であって、本発明者らのヒト神経細胞研究において使用されたものと長さが同じＣＡＧアレイの状況でｍＨｔｔ抑制の評価を可能にする。２つの用量（３×１０１０または９×１０１０ＶＧ／半球；図２Ｊ）で、１１週齢のＱ５０ヘテロ接合体への両側線条体内注射によって、ＺＦＰ－ＢまたはＧＦＰのいずれかをコードするＡＡＶを投与した。送達から７週後に、ｑＲＴ－ＰＣＲによって、導入遺伝子発現およびＨｔｔ制御を評価した。
図２Ｋに示されているように、Ｑ５０対立遺伝子は、それぞれ、低用量および高用量で、５５％（Ｐ＜０．００１）または６７％（Ｐ＜０．０００１）抑制された。内在性マウスＱ７対立遺伝子（ＣＡＧ４（配列番号８６））は、いずれの用量でも、ＺＦＰ－Ｂによって抑制されず、総Ｈｔｔレベルは、対立遺伝子選択的なＱ５０抑制の観察されたレベルと一致していた。さらに、図２Ｌに示されているように、全ての線条体切片の回帰分析は、ＺＦＰ－ＢとＱ５０の発現レベル間での逆相関を明らかにしたが（Ｐ＜０．００１、Ｒ２＝０．３６）、Ｑ７との逆相関は明らかにしなかった。線条体切片間でのＺＦＰ発現およびＱ５０抑制レベルの変動は、本発明者らの定位固定送達研究を通じて本発明者らが観察した線条体へのＡＡＶの不完全な到達と合致していた（典型的には、線条体の３０～７０％をカバー）。さらに、ＧＥＮＥＡ０２０神経細胞中で、ＺＦＰ－ＴＦ ４５７９４も試験した（図２Ｎ参照）。
総合すると、これらの結果は、ヒトＨＤ神経細胞およびマウス線条体のいずれにおいても、ＺＦＰが、疾患関連ＣＡＧ対立遺伝子の長期的かつ選択的な抑制を達成することができることを実証する。
いずれの治療戦略に対しても重要な考慮事項は、特異性およびオフターゲット効果の評価である。このアプローチに関して特に興味深いのは、合わせて１７６遺伝子のプロモーターに隣接しているヒトゲノム中の他の１，０５３の内在性ＣＡＧアレイ（６フィンガーＺＦＰのおよそのＤＮＡフットプリントを考慮するために、６以上の長さ）が広く存在することであった（方法参照）。部分的に不連続なアレイ（六量体当たり最大３つのミスマッチ）はさらに多量に存在し、２１，４５６の総部位（全てのＣＡＧアレイ）が１，８７２のヒト遺伝子の近位にある。他のヒト遺伝子は、完全に浸透性の最小のｍＨＴＴ対立遺伝子（ＣＡＧ４０（配列番号９１）；図１Ｈ参照）と同じ大きさのＴＳＳ隣接ＣＡＧ鎖を有していないが、ＣＡＧに隣接したある種のオフターゲット遺伝子の制御の可能性があることは、この戦略の臨床的使用に対して危険をもたらす可能性がある。
これを調べるために、本発明者らは、患者の神経細胞および線維芽細胞中での網羅的な転写プロファイリングを使用した。以前のＣＡＧ標的化戦略とは対照的に、本発明者らは、いずれもオフターゲット挙動に予測不能に影響を及ぼすことがある、プロモーターコンテクストの不確定な影響、後成的な修飾および他の因子と相乗作用する本発明者らのＺＦＰ－ＴＦの可能性に起因する特異性を調べるために偏りのないアプローチを選択した。本報告の焦点である本発明者らの第一のデザインの試みにおいて、本発明者らは、この特性に対して一切の最適化を行わずにゲノム全体で高度の特異性を示したＺＦＰを同定した。特に有益であるのは、対立遺伝子選択的ＺＦＰに対する特異性への明白な構造的影響であった。ＺＦＰ－ＡおよびＺＦＰ－Ｂは、調べた全てのｍＨＴＴ対立遺伝子に対して、類似のオンターゲット挙動を有していたが、これらは、２つの細胞状況において、相互に排他的なオフターゲット特性を有していた（図２Ｇ、図１１）。例えば、不連続なＣＡＧ鎖（ＣＡＧ１９（配列番号９２）、ＴＳＳから０ｂｐ）を有するＣＡＧ隣接遺伝子であるＭＢＤ５は、ＺＦＰ－Ｂによって抑制されたが、ＺＦＰ－Ａによっては抑制されなかった（図１１Ｂおよび１１Ｃ）。ＺＦＰ－ＡおよびＺＦＰ－Ｂは、ＣＡＧ鎖の異なるフレームを標的とし、異なるＺＦモジュールから構成され、異なるリンカー構造を利用し、これらのオフターゲット特性はデザイン依存性であり得ること、したがって、最適化に適し得ることを示唆する。本発明者らは、ＺＦモジュールの改変操作における最近の進歩（例えば、ＣＡＧ／ＣＴＧアレイ中の標的化可能なフレームに対して改善された選好性を有する）ならびにＺＦとＤＮＡ骨格間の非特異的相互作用の消失が、ＺＦＰ特異性の最適化および臨床的使用に適したＺＦＰの開発のための潜在的な補足的経路を与えることにも注目する。
本発明者らの最初のデザインの試みは、ヒト線維芽細胞および神経細胞中でゲノム全体にわたって高度の特異性を有する対立遺伝子選択的ＺＦＰを作製したが、本発明者らは、相同分子種間でＣＡＧリピート保存が実質的に欠如していることを考慮すると、異なる遺伝子座においてではあるものの、本発明者らのタンパク質が、マウスにおいて何らかのオフターゲット活性も示すことがあり得ると予想した。驚くべきことに、最大のＴＳＳ隣接ＣＡＧアレイを有する上位１００のマウス遺伝子のうち８５は、ヒトゲノム中に対応するリピートを有していない。本発明者らは、それにも関わらず、野生型およびｚＱ１７５ ｈｅｔマウスの両方での線条体内ＺＦＰ処置後に、マウスゲノム中で最大のＴＳＳ隣接ＣＡＧアレイ（ＴＳＳの＋／－１ｋｂ）を有するマウス遺伝子に対してバイアスがあるオフターゲット分析を行った。インビボでＺＦＰ－Ｂおよび／またはＺＦＰ－Ｄによって著しく制御されたマウス遺伝子のうち全てが、ヒトと比べて、大幅により大きなＣＡＧリピートをマウス相同分子種中に有していた。例えば、ＤＮＡＪＣ１２－マウスプロモーター中に存在するが、ヒト相同分子種中に存在しない１９ＣＡＧリピートを有する遺伝子（配列番号９２）は、マウス線条体中では制御されたが、ヒト線維芽細胞または神経細胞中では制御されず、ヒト細胞中で特異性を評価する必要性を明確に示す。相同分子種のうち、ＮＡＰ１Ｌ３のみが、ＺＦＰ－Ａ（３．１～５．８倍の抑制）によってのみ、ヒト神経細胞および線維芽細胞中で制御され、ＺＦＰ－Ｂによっては制御されず（変化は検出されず）、ＣＡＧオフターゲット制御が、ＺＦＰデザインによって高度に影響を受けるという本発明者らの観察をさらに確認する。
重要なことに、本発明者らは、ＺＦＰが分子、細胞または行動レベルで何らかの検出可能な毒性をもたらすかどうかを理解するために、大規模な長期耐容性および安全性研究を実施した（図４、１６および１７）。本発明者らは、複数のプロモーターおよびＡＡＶ血清型を用いたヒト神経細胞およびマウス線条体の両方の中での慢性的発現という条件下において、少なくとも１５月齢および９ヶ月のＺＦＰ曝露まで、本発明者らが神経変性、神経炎症または毒性の証拠を観察しなかったことに注目し、これらの送達および発現条件下において、ＺＦＰが良好に耐容されることを示唆している。ＺＦＰ－ＡおよびＺＦＰ－Ｂのオンターゲット効力および対立遺伝子選択性ウィンドウを考慮し、また、本発明者らが、オンターゲットＥＣ５０用量を１～２．５桁上回る規模のＺＦＰ用量で本発明者らのオフターゲット分析を実施したことに鑑みて、本発明者らの実験系の枠外にあるこれらの試薬（例えば、別の血清型または投与の経路）を用いてＨＴＴ生物学の諸側面を調べる場合には、より弱い細胞種特異的プロモーターの使用が有用であり得る。
［実施例６］Ｒ６／２モデルにおけるＺＦＰによって誘導される神経保護および行動異常の軽減
いくつかのインビトロ状況および脳内において強固なｍＨＴＴ抑制を確立したので、本発明者らは、対立遺伝子選択的ＺＦＰが、ＨＤマウスにおいて、顕著な特徴となる神経病理学的および行動的表現型を改善することができるかどうかを評価することに着手した。本発明者らは、まず、伸長したＣＡＧアレイ（約１２０ＣＡＧ）を有するヒトＨＴＴのエクソン１断片を過剰発現するＲ６／２マウスモデルにおいてＺＦＰの性能を調べた。Ｒ６／２マウスは、神経細胞生理の早期かつ進行性の変化、体重（ＢＷ）低下、クラスピングおよび自発運動抑制状態を含む運動および認知の変化、ならびにＤＡＲＰＰ３２、ホスホジエステラーゼ１０ａ（ＰＤＥ１０ａ）、ドーパミン受容体Ｄ１（ＤＲＤ１）およびＤ２（ＤＲＤ２）を含む中型有棘神経細胞（ＭＳＮ）マーカーの大幅な低下を示す（実施例１参照）。
これらの研究では、５週齢のＲ６／２マウスに、ＺＦＰ－ＢまたはＧＦＰのいずれかをコードするＡＡＶを両側性に線条体内注射し、全ての評価項目に関して、年齢を合わせた非トランスジェニック対照と比較した（図３Ａ）。
図３Ｂに示されているように、ＺＦＰ－Ｂは、７週の期間の研究にわたって、大幅なクラスピングの低下を与え（Ｐ＝０．０２４、ログランク検定）、ＧＦＰ処置された群と比べて、ＺＦＰ処置されたマウスは、毎週、クラスピングをする数が少なかった。７週の研究にわたって、ＺＦＰ処置された群は、ＧＦＰ群より、クラスピングをする可能性が２．４倍少なかった（図３Ｂ）。
オープンフィールド試験を用いて、２週間ごとに自発運動抑制も調べた。図３Ｃに示されているように、自発運動に対する隔週のオープンフィールド評価において、ＺＦＰ処置は、後肢での立ち上がり頻度（Ｐ＝０．００９）および総移動距離（図３Ｄ；Ｐ＝０．０３８）の両方に関してＧＦＰ処置された対照と比べて、著しい長期的な改善を与えた。さらに、ＺＦＰ処置されたマウスは、ＺＦＰ投与後のいくつかの時点で成績が著しく優れており、対照処置されたマウスと比べて最大の恩恵は、最終の時点（１２週）で観察された。注目すべきことに、対照と比べて、ＺＦＰ処置されたマウスに対して有意なＢＷ差は存在せず、本発明者らは、握力またはロータロッドの成績の測定値に対するＺＦＰ処置効果も検出しなかった（図１３）。
ある種の行動評価項目において本発明者らが観察した改善は、ＡＡＶ形質導入された線条体領域中のＺＦＰ発現神経細胞が保護されたという見込みを高めた。この可能性を調査するために、１２週の行動評価後にマウスを屠殺し、線条体組織をＺＦＰ、ＨＴＴおよびＭＳＮマーカー発現に関するｑＲＴ－ＰＣＲに供した（上記方法参照）。
図３Ｅに示されているように、Ｑ５０マウスでのバルク組織分析に対して見られた本発明者らの結果と同様に（図２Ｋおよび２Ｌ）、ＺＦＰ処置はｍＨｔｔの６２％低下をもたらした（Ｐ＜０．０００１）のに対して、天然のマウスＨｔｔの発現は変化しなかった。本発明者らは、対照群から得た動物の一部においてＧＦＰ蛍光を調べて、ＡＡＶのカバー範囲が線条体の約５０～７０％にわたることを見出し、送達された領域中での最大に近いｍＨＴＴの抑制を示唆した（データは示さず）。ＺＦＰ処置されたマウス中でのＤＡＲＰＰ３２、ＰＤＥ１０Ａ、ＤＲＤ１ＡおよびＤＲＤ２の転写物レベルは、年齢を合わせた非トランスジェニック対照より１．５～２．３倍低いレベルであったが（全てＰ＜０．０００１）、ＧＦＰ処置されたマウスより１．６～２．０倍高く（全てＰ＜０．０００１；図３Ｆ）、分析された線条体領域の不完全なベクターのカバー範囲および介入の年齢時に既に存在していた神経変性と合致する。重要なことに、全ての線条体の試料の回帰分析によって、ＺＦＰとｍＨＴＴ転写物レベル間の有意な負の関係（Ｒ２＝０．４８、Ｐ＜０．０００１；図３Ｇ）およびＺＦＰ発現と全てのＭＳＮマーカーのレベルとの間の対応する正の関係（Ｒ２＝０．３８～０．６２、全てＰ＜０．０００１）が明らかとなった。総合すると、Ｒ６／２マウスにおける本発明者らの知見は、行動的および分子神経病理学的評価項目の両方がＺＦＰによって改善された証拠を与え、より侵襲性の低い疾患モデルにおける、対立遺伝子選択的なＺＦＰの細胞レベルでの神経保護的恩恵の可能性についてさらなる調査を促した。
［実施例７］ｚＱ１７５ヘテロ接合マウスにおけるｍＨｔｔの抑制ならびに組織病理および電気生理学的欠陥の矯正
マウスにおける実質内ＡＡＶ送達および急速なＲ６／２疾患の進行によって課される制約のため、本発明者らは、進行がより遅いｚＱ１７５モデルにおいて、ＺＦＰ－ＴＦが主要な神経病理学的欠陥に影響をおよぼすことができるかどうかに焦点を当てた。これらのマウスは、約１８８ＣＡＧリピートを有するノックインｍＨＴＴヒトエクソン１対立遺伝子を保有し、ＨＤに関連する分子的、組織学的、電気生理学的および行動的表現型を示す。実施例１参照。ヘテロ接合ｚＱ１７５マウスは、３～４月齢において、１２月齢まで蓄積を続ける特徴的なｍＨＴＴ含有封入体を発達させ、４～６月齢の間に分子的および電気生理学的な疾患の特徴を呈し、１０～１２月齢に相対的に穏やかな自発運動障害の遅発性発症をするので（Ｍｅｎａｌｌｅｄら、（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４９８３８；Ｈｅｉｋｋｉｎｅｎら、（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ５０７１７；Ｃａｒｔｙら、（２０１５）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０：ｅ０１２３５２７；Ｂｅａｕｍｏｎｔら、（２０１６）Ｎｅｕｒｏｎ ９２：１２２０－１２３７）、疾患の進行の異なるステージにおいてＺＦＰの効力を評価することが可能となる。まず、本発明者らは、ＺＦＰ－ＢのＡＡＶ送達が、培養された一次ヘテロ接合ｚＱ１７５線条体神経細胞中で、変異体ＨＴＴ ｍＲＮＡ（９９％、Ｐ＜０．０００１）およびタンパク質（９９％；Ｐ＜０．０００１）の選択的な抑制をもたらすことを確認した（図４Ａおよび４Ｂ）。予想されたとおり、野生型マウスＨＴＴの低下は観察されず、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインを欠如する対照ウイルス（ΔＤＢＤ）は、大幅に変異体ＨＴＴを低下することができなかった。
ｍＨＴＴ封入体に対するＺＦＰの影響を評価するために、本発明者らは、神経病理の発症の前（早期処置）または後（後期処置）のいずれかでの線条体内処置後に、ヘテロ接合ｚＱ１７５マウス中でＥＭ４８免疫反応性をモニターした（図４ｃ）。早期処置コホートについては、２月齢マウスの背側線条体中にＺＦＰ－ＢまたはＧＦＰのいずれかをコードするＡＡＶを注射し、４月齢で、ＨＴＴ凝集を評価した。ＺＦＰ発現細胞を標識するために、自己切断Ｔ２Ａ－ＧＦＰタグを使用した。形質導入されたＭＳＮ（ＤＡＲＰＰ３２＋ＧＦＰ＋）では、ＺＦＰ－Ｂは、核ｍＨＴＴ凝集をほぼ完全に防止した（９９．６％低下、Ｐ＜０．０００１）（図４Ｄおよび４Ｅ；図１４）。核周囲ＨＴＴ封入体の密度の有意な減少（８８％低下；Ｐ＜０．０００１）および総ＥＭ４８免疫蛍光（４８％低下；Ｐ＜０．０１）も観察された（図４Ｆおよび４Ｇ）。後期処置コホートについては、ＨＴＴ凝集体の大幅な負荷が既に存在している６月齢のヘテロ接合ｚＱ１７５マウスの線条体へのＺＦＰ－Ｂ．Ｔ２Ａ．ＧＦＰ、ΔＤＢＤ．Ｔ２Ａ．ＧＦＰまたはＧＦＰベクター（Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉら、（１９９６）Ｃｅｌｌ ８７：４９３－５０６）。注射の４ヶ月後に、ＺＦＰ－Ｂ処置は、ＧＦＰ対照群と比して、核ＥＭ４８＋封入体の数を１９％（Ｐ＜０．０１、図４Ｈおよび４Ｉ）、核周囲封入体の数を８７％（Ｐ＜０．０００１；図４Ｈおよび４Ｊ）低下させた（図１４）。核封入体を有する細胞中のＥＭ４８強度も２４％低下した（Ｐ＜０．０５、図４ｋ）。これらの研究における任意の評価項目に関して、ΔＤＢＤおよびＧＦＰ処置マウス間に有意な差は存在しなかった。
総合すると、これらの結果は、対立遺伝子選択的ＺＦＰが、疾患発症前および後の両方で、ｍＨＴＴ凝集を低下させることができること、および阻止できる可能性があることを示す。
本発明者らは、ＤＡＲＲＰ３２レベルをモニタリングすることによって、後期処置コホート中の形質導入されたＭＳＮの健康に対するＺＦＰ発現の影響も評価した。年齢を合わせたＷＴマウスと比較して、１０月齢のｚＱ１７５ヘテロ接合体は、線条体におけるＤＡＲＰＰ－３２免疫反応性の１７％（Ｐ＜０．０１）の低下を示す（図４Ｌ）。Ｒ６／２マウスにおける本発明者らの知見と合致して、６月齢のｚＱ１７５マウスへのＺＦＰ－Ｂ投与は、１０月齢で、ＤＡＲＰＰ３２免疫反応性の２０％（Ｐ＜０．０１）の増加をもたらした（図４Ｍ）。重要なことに、この効果はＺＦＰを発現するＭＳＮに限定され、ＺＦＰ発現によって保護効果が付与されたことを示唆する。慢性的ＺＦＰ発現が神経炎症性応答をインビボで誘導するかどうかを評価するために、本発明者らは、アストログリア増殖症（ＧＦＡＰ）および小膠細胞症（Ｉｂａ１）のマーカーをモニターした。（注射痕に局在された）注射それ自体の一過性効果の他には、本発明者らは、これらの研究の期間中に、いずれの処置に対しても、ＧＦＡＰ＋（図４Ｎおよび４Ｏ）またはＩｂａ＋（図４Ｎおよび４Ｐ）細胞のマーカー強度または数の増加を観察しなかった。重要なことに、これらのマーカーに対してＧＦＰ発現の効果は存在しなかった（図１５）。
ｍＨＴＴ凝集病理およびＤＡＲＰＰ３２レベルが改善したので、本発明者らは、ＺＦＰが、４月齢までに生じる、ｚＱ１７５間接経路投射神経細胞（ｉＳＰＮ）を冒す重要な電気生理学的欠陥も軽減できるかどうかを調べることにした（ＰＭＩＤ：２４９９１９６１、ＰＭＩＤ：２５７００１４６に概説されている）。これらの研究では、２または４月齢のマウスは、ＺＦＰ－Ｄ．Ｔ２Ａ．ｔｄＴｏｍａｔｏまたはΔＤＢＤ．Ｔ２Ａ．ｔｄＴｏｍａｔｏをコードするＡＡＶの線条体内注射を受け、ｉＳＰＮ樹状突起の興奮性を６月齢の時点で評価された（図４Ｃおよび４Ｎ；図１５）。
まず、本発明者らは、ＺＦＰ－ＤによるｍＨＴＴ特異的抑制の程度が本発明者らの以前の定位固定送達研究と合致していること、および標的とされていない皮質領域中では変化していないことを確認した（データは示さず）。次いで、本発明者らは、５０Ｈｚで３つのＡＰから構成される簡略化された逆伝播活動電位（ｂＡＰ）バーストプロトコールを用いて、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ｉＳＰＮ中で樹状突起の興奮性を試験した（図４Ｏ）。樹状突起の興奮性の平均３５％の抑制を示した（Ｐ＜０．０１）対照処置されたｚＱ１７５ ｉＳＰＮと比べて、２ヶ月（図４Ｓ、Ｐ＜０．０５）および４ヶ月コホート（図４Ｔ、Ｐ＜０．０５）の両方について、ＺＦＰ－Ｄ処置されたｚＱ１７５ ｉＳＰＮの樹状細胞指標はほぼ野生型レベルまで回復した。したがって、ｚＱ１７５マウスにおけるｉＳＰＮ電気生理の欠陥は、ｍＨＴＴ標的化ＺＦＰによって、予防可能でありかつ可逆的である。さらに、ｍＨＴＴ抑制は線条体に限局されたので、本発明者らの知見は、機能不全の神経細胞による神経支配という二次的な帰結というよりはむしろ、樹状突起の興奮性低下の発生に対する局所的に自律的なモデルと合致する（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、（２００９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２９（３３）：１０３７１－８６）。
［実施例８］ＺＦＰ処置されたｚＱ１７５マウス中での翻訳バイオマーカーの回復
Ｒ６／２マウスにおける本発明者らの結果は、早期ＺＦＰ処置が、ＰＤＥ１０ＡならびにＤ１およびＤ２受容体を含む、ＨＤにおいて下方制御される遺伝子の発現を部分的に回復することができることを実証した。ＰＥＴ画像化研究が、臨床診断の何年も前に始まる、ＨＤ患者でのＰＤＥ１０Ａ酵素およびＤ２様受容体のレベルの早期、進行性かつ顕著な低下を示しているので、これらの遺伝子をモニタリングすることの重要性は誇張し過ぎることはない（ＣＨＤＩ／カロリンスカ研究所の未公表の結果；概説については、Ｎｉｃｃｏｌｉｎｉら、（２０１８）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ＰＭＩＤ：２８８８９０９３参照）。ヘテロ接合ｚＱ１７５マウスでの類似の研究において（ＰＭＩＤ：２７８５６６２５）、臨床的画像化リガンドは、相同分子種のマウスタンパク質の早期かつ進行性の変化を特定した。したがって、本発明者らは、線条体の脳切片のインビトロオートラジオグラフィー（ＡＲＧ）および生きた動物での縦断的マイクロＰＥＴ画像化法という２つのアプローチを用いて、これらのマーカーが、ＺＦＰ投与後のｍＨＴＴ低下に対して感受性があるかどうかを探索した。
第一の研究では、２または４月齢のヘテロ接合のｚＱ１７５マウスは、ＺＦＰ－ＤまたはＧＦＰのいずれかをコードするＡＡＶの一側性線条体内注射を受けた（図５Ａ）。Ｄ１様受容体（［３Ｈ］ＮＮＣ１１２）、Ｄ２様受容体（［３Ｈ］ラクロプリド）またはＰＤＥ１０Ａ（［３Ｈ］ＭＮＩ－６５９）に対するトリチウム標識されたリガンドを用いて、発現を評価した。（隣接した切片のＥＭ４８染色によって評価される）ｍＨＴＴの減少した蓄積を示す領域によって描出された線条体関心領域（ＲＯＩ）内のＡＲＧによって、結合を測定した。ＺＦＰ－Ｄで処置されたマウスでは、注射された線条体ＲＯＩ中の［３Ｈ］ＮＮＣ１１２結合は、早期２～６ヶ月（３４％、Ｐ＜０．０００１）および後期４～１０ヶ月（２４％、Ｐ＜０．０００１）コホートの両方で、反対側線条体ＲＯＩ中での結合より著しく高かった（図５Ｂ）。注射された線条体ＲＯＩ中の［３Ｈ］ラクロプリドの結合も、早期（２６％、Ｐ＜０．０００１）および後期（７％、Ｐ＜０．００１）ＺＦＰ処置群において、注射されていない線条体ＲＯＩより著しく高かった（図５Ｃ）。同様に、ＺＦＰ注射された線条体ＲＯＩ中の［３Ｈ］ＭＮＩ－６５９結合は、早期（３１％、Ｐ＜０．０００１）および後期（１１％、Ｐ＜０．００１）コホートの両方で著しくより高かった（図５Ｄ）。
総合すると、これらのデータは、ＡＡＶ送達されたＺＦＰリプレッサーが、確立された疾患を有するマウス中でＰＤＥ１０Ａ酵素、Ｄ１およびＤ２様受容体に対する特異的結合を予防し、回復することができることを示しており、症候の発症およびバイオマーカー発現の減少前にＺＦＰを発現する動物に対して最大の恩恵が観察された。
次に、Ｄ２様およびＰＤＥ１０ ＡＲＧ発現のインビトロでの変化を生きた動物中でモニターすることができるかどうかを調べるために、本発明者らは、マイクロＰＥＴによる［１１Ｃ］ラクロプリドおよび［１８Ｆ］ＭＮＩ－６５９結合に対するＺＦＰ処置の影響を評価した。本発明者らは、ｚＱ１７５線条体中のラクロプリドおよびＭＮＩ－６５９結合はいずれも、６月齢と９月齢の間に、それぞれ、６０％から５６％に、および５２％から４１％に、６月齢と９月齢の間に、次第に減少することを以前に示した（ＰＭＩＤ ２７８５６６２５）。したがって、本発明者らは、ＡＡＶ ＺＦＰ－ＤまたはΔＤＢＤのいずれかを一側性に４月齢のマウスに注射し、６．５～１０月齢まで長期的に結合をモニターした。これらのマウスにおいてＡＲＧを用いて得られた効果のより大きな規模と合致して、非処置線条体と比較したＺＦＰ注射された線条体に対する［１８Ｆ］ＭＮＩ－６５９ＢＰＮＤは、６．５月齢（１２．８％、Ｐ＜０．０００１）および１０月齢（１６．５％、Ｐ＜０．００１）の両方で著しく増加したのに対して、いずれの時点においても、ΔＤＢＤコホートについては、統計的に有意な増加が存在しなかった（７ヶ月の時点で１．９％、１０ヶ月の時点でー１．５％；図５Ｅおよび５Ｆならびに表７）。さらに、半球間のＢＰＮＤのパーセント差を処置間で比較すると、ＺＦＰ－Ｄコホートは、６．５～７月齢（１１．０％、Ｐ＜０．００１）および１０月齢（１８．１％、Ｐ＜０．０００１）の両方で、ＧＦＰマウスと比べて有意に上昇したＢＰＮＤを示した（図５Ｅ）。興味深いことに、４～１０月のＡＲＧコホートでは、ラクロプリド結合の７％増加が見られたにも関わらず、本発明者らは、マイクロＰＥＴ研究において、ＺＦＰ－Ｄについて、［１１Ｃ］ラクロプリドＢＰＮＤの有意な増加を検出することができなかった（表７および８）。
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総合すると、Ｒ６／２およびＱ１７５マウスにおける本発明者らの分子的知見は、対立遺伝子選択的ＺＦＰ－ＴＦが、疾患進行の主要なマーカーの喪失を予防し、反転させることが可能であること、およびこれらの変化は、臨床的翻訳バイオマーカーを用いて、生きた被験体内でモニターできることを実証する。
［実施例９］インビボでの慢性的ＺＦＰ－ＴＦ発現後の耐容性および特異性の評価
本発明者らは、本発明者らのインビトロまたはインビボ研究において、対立遺伝子選択的ＺＦＰに対して毒性の証拠を観察しなかったが、本発明者らは、インビボでの短期および長期ＺＦＰ処置後に耐容性および特異性のマーカーをより綿密に調べようと努めた。慢性的ＺＦＰ発現が神経炎症応答または神経変性をもたらすかどうかを評価するために、本発明者らは、早期（２～６月齢）および後期（６～１２月齢）枠組みの両方で、ＺＦＰで処置された野生型およびｚＱ１７５マウスの両方において、アストログリア増殖症（ＧＦＡＰ）、小膠細胞症（Ｉｂａ１）および一般的な神経細胞の生存性（ＮｅｕＮ）のマーカーをモニターした。（注射痕に局在された）注射それ自体の一過性効果の他には（図１６Ａ）、本発明者らは、いずれの処置に対してもマーカー強度（図１６Ｄおよび１６Ｇ）またはＧＦＡＰ＋（図４ｒ、ｓならびに図１６Ｅおよび１６Ｆ）もしくはＩｂａ＋（図４ｒ、ｔならびに図１６Ｂおよび１６Ｅ）細胞の数の増加を観察しなかった。重要なことに、これらのマーカーに対してＧＦＰ発現の効果は存在しなかった（図１６）。上昇した神経炎症性マーカーの不存在と合致して、本発明者らは、ＺＦＰ－ＢまたはＺＦＰ－Ｄで処置されたＷＴまたはｚＱ１７５ ｈｅｔ線条体において、ＮｅｕＮ＋細胞または強度または神経細胞の数の低下を一切検出しなかった（図１７）。これらの結果は、ＷＴならびに疾患発症前および発症後のｚＱ１７５マウスにおいて、長期線条体発現は一般に良好に耐容され、明らかな神経炎症性応答を誘導しなかったことを示す。本発明者らは、一側性線条体内ＡＡＶ注射後に、ＷＴおよびｚＱ１７５ ｈｅｔマウスの早期（２～６月齢）および後期（６～１２月齢）処置コホートの両方で、ＺＦＰ－ＢおよびＺＦＰ－Ｄをさらに評価した。本発明者らは、研究の期間にわたるＢＷ低下、全般的な活動、自発的な行動、毛づくろい、巣作り、餌および液体摂取または体温の変化を観察しなかった。組織学的な分析は、反対側半球と比較して、脳体積の変化の兆候、ＮｅｕＮ発現の喪失および星状膠細胞マーカーの評価を示さなかった。
本発明者らのインビボ研究におけるオフターゲット制御の可能性を評価するために、本発明者らは、まず、マウスおよびヒトゲノム中のアノテーションが付された全ての転写開始部位（ＴＳＳ）に対して、最も近いＣＡＧアレイ（１つのＺＦＰ結合部位を最小限考慮するために、６ＣＡＧリピート以上の長さ；方法参照）の位置をマッピングした。より長い、不連続なリピート鎖を考慮に入れるために、本発明者らは、完全なＣＡＧアレイおよびＣＡＧ六量体当たり最大３つのミスマッチを有するＣＡＧアレイの両方を検討した。これらの検索は、マウスゲノムが、ヒトゲノムより大幅に高いＣＡＧ含量を有することを明らかにした（３，４７２対１０５３の完全なＣＡＧリピート；３２，３２８対２１，４５６の不完全なＣＡＧリピート）。しかしながら、ＴＳＳへの１ｋｂの距離という要件を課すことによって、ＴＳＳに隣接するＣＡＧアレイを有する遺伝子の総数に関して、両ゲノムは類似することが明らかとなった（１５０対１７６の完全なＣＡＧリピート；１７２０対１８７２の不完全なＣＡＧリピート）。次いで、本発明者らは、各アノテーションが付されたタンパク質をコードするマウス遺伝子を対応するヒト相同分子種にマッピングし、その逆も同様に行われる双方向性の相同分子種分析を行った（方法参照）。重要なことに、上位１００のＣＡＧマウス遺伝子のうち１５のみがヒト相同分子種中に任意の長さのＴＳＳ隣接ＣＡＧアレイを有する相同分子種を有し、上位１００のヒト遺伝子の１２のみが逆の比較に関して相同分子種を有しており、本発明者らは、相同分子種間のＣＡＧ保存が乏しいことを見出した。
これらの情報科学的結果は、本発明者らの機能的マウス機能研究において使用されたＺＦＰに対するインビボでのオフターゲット分析の指針とするために使用した。本発明者らは、６月齢の野生型（ＷＴ）およびｚＱ１７５マウスの右半球にＺＦＰ－Ｂ、ＺＦＰ－ＤまたはΔＤＢＤのいずれかをコードするＡＡＶを、左半球にＰＢＳを線条体内注射した。１ヶ月後に、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析のために、線条体組織を集めた。
これらのＺＦＰの対立遺伝子選択性と合致して、本発明者らは、変異体ＨＴＴ ｍＲＮＡレベルの７０％を超える低下を観察したが、いずれの遺伝子型においても、マウスＨＴＴの著しい抑制は観察しなかった。次いで、本発明者らは、本発明者らのオフターゲット検索において同定された１２の遺伝子を調べ、マウスゲノム中で最大のＴＳＳ隣接ＣＡＧリピートを有する遺伝子に焦点を当てた。このパネルは、ヒト相同分子種中のＴＳＳ隣接ＣＡＧアレイを有するおよび有さない遺伝子を含んだ。
総合すると、本発明者らは、１９ＣＡＧ以下のＣＡＧアレイを有する遺伝子（ＭＴＵＳ２、ＲＳＬＤ２４１、ＡＫＴ３、ＫＣＮＡ６、ＩＴＧＡ７）に対して抑制を観察せず、例外は、ＺＦＰ－Ｂによって７０％、ＺＦＰ－Ｄによって６２％制御され、ヒト相同分子種中にＣＡＧリピートを欠如するＤＮＡＪＣ１２であった。マウスＤｎａｊｃ１２プロモーターの調査によって、１２ＣＡＡリピートがこのＣＡＧアレイに直接隣接していることが明らかとなり、このことは、これが制御されたのに対して、他の類似の長さのＣＡＧ候補が制御されなかった理由を説明し得る。２４以上のＣＡＧを含有するアレイを有する調査されたマウス遺伝子については、本発明者らは、ＺＦＰ－ＤにおけるＲＵＮＸ２（ＣＡＧ２８（配列番号９３、ＴＳＳ １００ｂｐ）の３８％低下からＺＦＰ－ＢにおけるＮＡＰ１Ｌ３（ＣＡＧ２８（配列番号９３）、ＴＳＳ ５１１ｂｐ）の７９％低下にわたる抑制を観察した。ＲＵＮＸ２およびＮＡＰ１Ｌ３の場合を除いて、統計的に等しいｚＱ１７５抑制に関わらず、多くの事例で、ＺＦＰ－Ｄは、ＺＦＰ－Ｂより著しく少ないオフターゲット抑制をもたらした。遺伝子型は、制御のパターンまたは程度を大幅に変化させるようには見受けられなかった。本発明者らは、ＺＦＰ－ＢまたはＺＦＰ－Ｄ処置が神経細胞のバイオマーカー転写物ＤＲＤ１ａ、ＤＲＤ２、ＤＡＲＰＰ３２、ＰＤＥ１０ａおよびＲＢＦＯＸ３／ＮＥＵＮの喪失をもたらすかどうかも調べた。本発明者らの以前の長期分析と合致して、本発明者らは、１ヶ月の処置期間後に、これらの神経細胞のマーカーのレベルの著しい低下を見出さなかった。最後に、長期ＺＦＰ発現によって与えられる一般的な耐容性および任意の行動異常の可能性を調べるために、本発明者らは、延長された処置期間にわたって、マウスの大きなコホートを用いて２つのさらなる研究を実施した。第一の研究では、本発明者らは、様々な年齢での一側性線条体内注射後に、ＺＦＰ－ＢおよびＺＦＰ－Ｄの安全性を評価した。本発明者らは、ＷＴおよびｚＱ１７５ ｈｅｔマウス（ｎ＝１２マウス／群）の早期（２～６月齢）および後期（６～１２月齢）コホートに、ＺＦＰ－ＢまたはＺＦＰ－Ｄのいずれかを注射した。注射されていない同年齢の同腹仔も含めた。本発明者らは、研究の期間における体重低下（早期コホート、４ヶ月；後期コホート、６ヶ月）、全般的な活動、自発的な行動、毛づくろい、巣作り、餌および液体摂取または体温の変化を観察しなかった。本発明者らの以前の研究と合致して、組織学的な分析は、反対側と比較して、脳体積の変化の兆候、ＮｅｕＮ発現の喪失およびＩｂａ１およびＧＦＡＰの評価を示さず（データは示さず）、健康な線条体および疾患を有する線条体の両方における長期ＺＦＰ耐容性をさらに裏付ける。
第二の研究では、合計１６４匹の６週齢の雌および雄のｚＱ１７５ヘテロ接合マウスに、ビヒクルまたはＺＦＰ－ＤもしくはｅＧＦＰのいずれかをコードするＡＡＶを両側性に注射し、オープンフィールド、ロータロッド、クラスピング、神経学的指標測定、脳ＭＲＩおよび体重を９ヶ月にわたってモニターした（ｎ＝１５匹の動物であるｚＱ１７５ ｈｅｔ非注射群を除く全ての群について、ｎ＝２２匹の動物／群）。本研究では、注射されていない同年齢の野生型対照同腹仔（ｎ＝４４）も含めた。総合すると、本発明者らは、疾患の顕在化後に、いずれの指標においても、ｚＱ１７５ヘテロ接合マウス中にＺＦＰ－Ｄの有害な効果を観察しなかった。ｚＱ１７５ ｈｅｔマウスは、明らかなクラスピング表現型またはオープンフィールドでの自発的運動もしくは神経学的指標異常の変化を示さなかった。線条体のＺＦＰ処置は１５ヶ月の時点で観察された僅かなｚＱ１７５ ｈｅｔロータロッド成績異常、疾患進行中の体重変化を著しく変化させず、または神経学的指標のスコアに影響を与えなかった。さらに、線条体内ＺＦＰ－Ｄ投与は、ＭＲＩによって評価されたｚＱ１７５全脳、線条体および皮質体積に対して影響を与えなかった。
総合すると、これらの大規模なインビボ研究の結果は、対立遺伝子選択的ＺＦＰが、ＷＴよび疾患マウス線条体において、細胞および行動のレベルで良好に耐容されるという結論を指示する。
要するに、このデータは、変異体Ｈｔｔ配列を標的とするＺＦＰ遺伝的調節因子はインビボでＨＤを処置するために使用することができることを実証する。
結論
本発明者らの研究は、マウス中の天然のＨＴＴ遺伝子座における対立遺伝子選択的な転写抑制の初めての直接的な実証を提示する。患者由来細胞における大規模な試験から得られた結果は、３８以上のＣＡＧリピートを有するｍＨＴＴ対立遺伝子からの発現は７９～９３％抑制することができるのに対して、２１以下のＣＡＧリピート（試験された最長の正常なリピート長）を有する正常な対立遺伝子からの発現はわずかに０～３１％抑制されることを実証する。したがって、対立遺伝子選択的ＺＦＰ－ＴＦは、ＨＤ集団において、完全に浸透性の変異体対立遺伝子の１００％と正常なＨＴＴ対立遺伝子の少なくとも８６％とを識別する特筆すべき能力を示す（図１Ｈ）。それぞれがＨＤ患者の一部集団に限定されるＳＮＰベースの対立遺伝子選択的ｍＨＴＴ低下アプローチと比べて、本研究に記載されているＣＡＧ標的化ＺＦＰリプレッサーは、ＨＤ被験体の大半において、発病性対立遺伝子からの発現を選択的に下方制御する潜在的能力を有する。
さらに、本発明者らは、３つの異なるＨＤマウスモデルにおいて、７週から９ヶ月またはそれより長い曝露期間にわたって、対立遺伝子選択的ＺＦＰによるｍＨｔｔ発現の強固なインビボ抑制、その結果としての分子的、組織学的、電気生理学的およびある種の行動的異常の改善を実証する。本発明者らは、ヒトＨＤ神経細胞中での１００日間を超える持続的なＺＦＰ発現および効力ならびにインビボでのＭＳＮマーカー遺伝子発現および線条体の投射神経細胞の電気生理学的異常の救出も確立し、標的脳領域および関連するヒト細胞種中でのｍＨＴＴ選択的ＺＦＰの慢性的発現が良好に耐容され、中核的な疾患表現型を緩和する上で有効であることを示している。
本発明者らが開発したＺＦＰは、対立遺伝子選択性、ゲノム全域にわたる特異性および長期の持続的抑制の高度な組み合わせ示し、これは、本発明者らが知る限り、合成転写因子に関しては前例がない。これらの研究は、このような因子の性能およびこのような因子の可能性のある用途に対する新たなベンチマークを確立する。これらの結果は、本発明者らの開発戦略が、特に差異的な対立遺伝子抑制における従前の試みと比較して（Ａｇｕｓｔｉｎ－Ｐａｖｏｎら、（２０１６）Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ １１：６４）、所望の特性を有するＺＦＰを首尾よく同定することに如何に寄与し得たかに関して興味深い問題も提起し得る。これに関して、本発明者らの研究の中心的な側面は、リピート鎖長に対する極めて急峻な（単純な質量作用によって可能なものより急峻な）機能的依存性を有するポリＣＡＧ標的化ＺＦＰリプレッサーを同定することが、十分に多様な候補デザインのパネルの中からこの挙動を探すことによって可能になり得るという認識であったように思われる。高分子系は、最初の結合現象がその後の結合現象を促進して協調的な全か無かの応答をもたらす高度に協同的な挙動をする能力を提供できることが以前から認識されてきた（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ＆Ｐａｂｏ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：８０９－８１７。このような挙動のために最も必要とされるのは、基質が結合したリガンド間でのコミュニケーションのための手段である。染色体のリピートアレイへのＺＦＰの結合は、隣接するＤＮＡを結合したフィンガー間での非共有結合的接触（Ｎｅｋｌｕｄｏｖａ＆Ｐａｂｏ（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：６９４８－６９５２）、結合依存性のＤＮＡの歪み（Ｍｉｒｎｙ（２０１０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７：２２５３４－２２５３９）、ヌクレオソーム放出（Ｉｙｅｎｇａｒ＆Ｆａｒｎｈａｍ（２０１１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８６：２６２６７－２６２７６）、ならびにＫＲＡＢ抑制ドメインと、その成分が多量体およびより高レベルのオリゴマーを形成する大きなコリプレッサー複合体との相互作用から考えられる、結合力効果の可能性（Ｌｕｐｏら、（２０１３）Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４：２６８－２７８；Ｐｅｎｇら、（２０００）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：１８０００－１８０１０；Ｈｉｎｄｅら、（２０１５）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５：１２００１；Ｂｒａｓｈｅｒら、（２０００）ＥＭＢＯ Ｊ １９：１５８７－１５９７；Ｓａｔｈａｓｉｖａｍら、（２０１３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０：２３６６－２３７０）を含む、かかるコミュニケーションに対する多くの可能性を与える。
これらの考察が動機となって、本発明者らは、ＺＦＰ構造（多様なフィンガー、リンカーおよび標的化されたポリＣＡＧフレームから構成される５Ｆおよび６Ｆタンパク質）、デザイン規模（対立遺伝子を最適に識別する相対的にまれなＺＦＰデザインを同定するのに十分大きい）および形態（患者細胞中での内在性の正常および変異体対立遺伝子発現の独立したモニタリング）を選択した。これらの特徴を整え、相対的に控え目なスクリーニングの試み（４１デザイン）によって、所望の特性を有するタンパク質が得られた。これに対して、従前の研究は、１つだけの反復するフィンガーを利用し、キメラエピソームレポーターとマウス細胞など真正でない状況を用いて、対立遺伝子識別に関してずっと少ない候補（４つ）をスクリーニングした（Ａｇｕｓｔｉｎ－Ｐａｖｏｎ、同書）。その研究は、対立遺伝子選択的なｍＨＴＴ抑制を実証したが、単一の完全長標的さえ欠いた非病原性対立遺伝子（ＣＡＧ４（配列番号８６））を有するマウス細胞という非疾患関連状況において実証されたに過ぎない。さらに、最初に同定されたＺＦＰは良好に耐容されず、インビボで２週間を超える抑制を達成するために、ＺＦＰ骨格、ＫＲＡＢ抑制ドメインおよびプロモーターに対するさらなる修飾を必要とした（Ｇｅｒｓｂａｃｈ＆Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａ（２０１４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ １８：８３５－８３９）。本発明者らは、本発明者らがＨＤ患者細胞中でこれらの試薬を自ら試験した際に、疾患関連ヒトＨＴＴ対立遺伝子（１８（配列番号７９）対４５（配列番号８０）ＣＡＧ）を識別できないことを観察したことを強調する。従前の研究と比較した本発明者らの開発戦略の相違がＺＦＰの性能の大幅な解離を説明し得るように思われる。
本発明者らの知見は、対立遺伝子選択的抑制の可能な機序への洞察も与える。特に、この現象がデザイン依存性であるという本発明者らの観察（図１Ｄ）は、例えば、ＤＮＡ構造の伝播された歪みまたはヌクレオソームの放出を介する結合されたＺＦＰ－ＴＦ間での間接的なやり取りの可能性を否定するように見受けられる（Ｍｉｒｎｙ、同書、Ｉｙｅｎｇａｒ＆Ｆａｒｎｈａｍ、同書）。さらに、精製された成分を用いたゲルシフト研究において見られた結合協同性の欠如は、隣接する結合されたＺＦＰ間での直接的接触の出現とは矛盾する（データは示さず）。最後に、本発明者らは、観察された特性のためにＫＲＡＢ機能的ドメインが必要とされたことを注目する。これは、対立遺伝子選択的挙動が大きなコリプレッサー複合体とのＫＲＡＢ抑制ドメインの相互作用によって媒介される可能性がある結合力効果に由来する可能性を残す。
いずれの治療戦略に対しても重要な考慮事項は、特異性およびオフターゲット効果の評価である。このアプローチに関して特に興味深いのは、合わせて１７６遺伝子のプロモーターに隣接しているヒトゲノム中の他の１，０５３の内在性ＣＡＧアレイ（６フィンガーＺＦＰのおよそのＤＮＡフットプリントを考慮するために、６以上の長さ）が広く存在することであった部分的に不連続なアレイ（六量体当たり最大３つのミスマッチ）はさらに多量に存在し、２１，４５６の総部位（全てのＣＡＧアレイ）が１，８７２のヒト遺伝子の近位にある。他のヒト遺伝子は、完全に浸透性の最小のｍＨＴＴ対立遺伝子（ＣＡＧ４０（配列番号９１）；図１Ｈ参照）と同じ大きさのＴＳＳ隣接ＣＡＧ鎖を有していないが、ＣＡＧに隣接したある種のオフターゲット遺伝子の制御の可能性があることは、この戦略の臨床的使用に対して危険をもたらす可能性がある。
これを調べるために、本発明者らは、患者の神経細胞および線維芽細胞中での網羅的な転写プロファイリングを使用した。以前のＣＡＧ標的化戦略（Ｇａｇｎｏｎ、同書；Ｈｕ、同書；Ｙｕ、同書；Ｆｉｓｚｅｒ、同書；Ｌｕｔｚ、同書）とは対照的に、本発明者らは、いずれもオフターゲット挙動に予測不能に影響を及ぼすことがある、プロモーターコンテクストの不確定な影響、後成的な修飾および他の因子と相乗作用する本発明者らのＺＦＰ－ＴＦの可能性に起因する特異性を調べるために偏りのないアプローチを選択した。本発明者らは、この特性に対する一切の最適化を行わずにゲノム全体にわたる高度の特異性を示したＺＦＰを同定した。特に有益であるのは、対立遺伝子選択的ＺＦＰに対する特異性への明白な構造的影響であった。ＺＦＰ－ＡおよびＺＦＰ－Ｂは、調べた全てのｍＨＴＴ対立遺伝子に対して、類似のオンターゲット挙動を有していたが、これらは、２つの細胞状況において、相互に排他的なオフターゲット特性を有していた（図２Ｇ、図１１、図１７）。例えば、不連続なＣＡＧ鎖（ＣＡＧ１９（配列番号９２）、ＴＳＳから０ｂｐ）を有するＣＡＧ隣接遺伝子であるＭＢＤ５は、ＺＦＰ－Ｂによって抑制されたが、ＺＦＰ－Ａによっては抑制されなかった（図１１Ｂおよび１１Ｃ）。ＺＦＰ－ＡおよびＺＦＰ－Ｂは、ＣＡＧ鎖の異なるフレームを標的とし、異なるＺＦモジュールから構成され、異なるリンカー構造を利用し、これらのオフターゲット特性はデザイン依存性であり得ること、したがって、最適化に適し得ることを示唆する。特異性にとって等しく最も重要なのは、疾患原因因子の効率的な標的化である。ＨＴＴ遺伝子中のＣＡＧ伸長がＨＤの原因であると以前から認識されてきたが、その結果生じる神経変性を引き起こす可能性がある分子種はずっと不明であった。例えば、いくつかのＨＤげっ歯類モデルおよび死後のＨＤ脳中には、エクソン１およびイントロン１を含有する異常にスプライシングされたＨｔｔイソフォームが存在し、発病性ポリＱ含有Ｎ末端タンパク質種の形成に寄与し得る（Ｂａｎｅｚ－Ｃｏｒｏｎｅｌら、（２０１５）Ｎｅｕｒｏｎ ８８：６６７－６７７）。さらに、ｍＨＴＴのＣＡＧリピートを含む、ますます多くの疾患関連マイクロサテライト伸長が、アンチセンス転写およびリピート関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）翻訳を受けて、患者の脳内に蓄積する神経毒性ジペプチドを与えることが示されている（Ａｒｂｅｒ（２０１７）ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ９：２８１－２８４）。これらのＨＴＴアイソフォームは、エクソン１の下流にある配列を標的とするＡＳＯおよびＲＮＡｉベースの戦略に対して抵抗性であると予測される。これに対して、対立遺伝子選択的ＺＦＰ－ＴＦは、伸長したＣＡＧを含有する全てのセンスおよびアンチセンスｍＨｔｔアイソフォームの産生を低下させると予想され、重要な治療的利点を与える可能性を秘める。本発明者らは、他の様式はエクソン１中のＣＡＧ伸長を標的とするように開発されてきたが、対立遺伝子選択的挙動は狭い用量範囲（２～５倍）に対してのみ報告されたことを強調する（Ｐｆｉｓｔｅｒら、（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９：７７４－７７８；Ｇａｇｎｏｎ、同書；Ｈｕ．同書；Ｙｕ、同書、Ｆｉｓｚｅｒ、同書；Ｌｕｔｚ、同書）。重要なことに、本発明者らは、ＺＦＰ－ＴＦがずっと幅広い用量域（少なくとも１００倍）にわたって対立遺伝子選択的抑制を達成できることを示し、標的組織内の全ての細胞へ均一な用量を送達することの現時点での技術的困難さを考慮すると、臨床適用可能性にとって極めて重要な要因である。
ＺＦＰ処置されたＲ６／２マウスはある種の行動上の評価項目（クラスピングおよびオープンフィールド試験）に対する顕著な改善を示したが、本発明者らは、Ｒ６／２またはｚＱ１７５ ｈｅｔマウスのいずれにおいても、その他の標準的なＨＤモデル評価項目に対して著しい処置効果を観察しなかった（例えば、加速するロータロッドまたは握力）。この点に関する重要な考慮事項は、マウス脳への定位固定式投与に対して達成可能な限られたＡＡＶカバー範囲である。本発明者らの研究では、実質内注射はマウス線条体の３０～７０％をカバーし、これにより、疾患進行のいくつかの指標に対する、最も重要なことには行動のレベルでのＺＦＰの影響を評価する能力が限定される。さらに、Ｒ６／２は侵襲性モデルであり、５週齢（定位固定注射を確実に実施できる最も早い時期）でＺＦＰを導入することは、ある種の行動的評価項目に影響を及ぼすには遅すぎることがあり得る。線条体の関与は運動制御にとって極めて重要であるが、運動パターン学習と実行におけるより広範な皮質－線条体－視床皮質ループの役割を考慮すれば、ｍＨＴＴの線条体選択的抑制がこれらの症候を改善するのに十分であるかどうかは不明である。さらに、ＨＤマウス中での自発運動の変化が専ら線条体のｍＨＴＴ発現によって引き起こされるかどうかは不明である。明らかに、運動関連の皮質領域、小脳および脳幹核などの他の脳領域がマウスにおける自発的な運動調節に寄与しており、これらもこれらのモデルにおいて影響を受ける可能性がある（Ｃａｐｅｌｌｉら、（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ ５５１：３７３－３７７；Ｄａｔｓｏｎら、（２０１７）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２：ｅ０１７１１２７）。したがって、ｍＨＴＴの幅広い抑制が、ＨＤマウスモデルにおいてこれらの疾患表現型を救出するために必要な可能性があり得る。この考えを裏付けるように、マウス脳の全体により広く分布することが示された別のアプローチ（例えば、ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡ）に対して、自発的な運動およびロータロッド成績の改善が報告されているが、効果は通例穏やかであり、または回復は部分的であった（Ｓｔａｎｅｋら、（２０１４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５（５）：４６１－４７４；Ｒｕｓｓｅｌｌら、（２０１４）ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ ７１：１５２０－１５２８）。これらの制約およびｍＨＴＴがＨＤの根本原因であるという理解を前提として、本発明者らは、ターゲットエンゲージメントの読み出し、組織病理的および電気生理的異常の矯正、ならびにバイオマーカーの改善に本発明者らの分析の焦点を主に当て、これらは、ＨＤ患者での神経変性を遅延および／または反転させるという最終目標により移行可能で、直接的に関連する有効性読み出し（ｅｆｆｉｃａｃｙ ｒｅａｄｏｕｔｓ）に相当し得る。
ドーパミンＤ１様およびＤ２様受容体ならびにＰＤＥ１０Ａ酵素に対するマーカーを使用するオートラジオグラフィーの結果は、早期および後期処置研究のいずれにおいても、Ｑ１７５ヘテロ接合マウス中のｍＨＴＴの低下が［３Ｈ］ＮＮＣ１１２、［３Ｈ］ラクロプリドおよび［３Ｈ］ＭＮＩ－６５９の増加した特異的結合を（症候開始およびこれらの発現の低下後に）伴うことを示した。最も大きな差はＤ１様受容体について、続いて、ＰＤＥ１０ＡおよびＤ２様受容体について観察され、ＰＤＥ１０はＳＰＮの両集団によって発現されるので、マウス中で症候開始後にｍＨＴＴを低下させる効果は、直接経路の線条体神経細胞中でより顕著であることが示唆される。また、ｍＨＴＴを低下させる効果は、早期処置研究においてより顕著であり、介入が早期に開始されれば、ｍＨＴＴを低下させることはより大きな効果をもたらし得ることを示唆する。それにも関わらず、４ヶ月での処置開始は（ＺＦＰ発現は、インビボではウイルス形質導入の１～２週以内に予想される；データは示さず）、Ｑ１７５ヘテロ接合マウス中でのこれらの標的の下方制御の後に起こり（Ｍｏｎｏｄら、（１９６５）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １２：８８－１１８）、ＺＦＰ投与がこれらのタンパク質の既存の喪失を部分的に回復できることを示唆する。ＰＤＥ１０Ａ ＡＲＧの結果は、［１８Ｆ］ＭＮＩ－６５９を用いたマイクロＰＥＴを使用して確認され、ここで、本発明者らは、臨床的意義を有するトランスレーショナルな評価項目を用いて、症候開始の後でさえ、結合能の著しい上昇を示す。これに対して、ラクロプリド結合はマイクロＰＥＴ研究において変化せず、これは、Ｄ２様のインビトロＡＲＧとインビボマイクロＰＥＴとの方法論的な差およびこのマーカーに対する小さな効果を検出するために使用されたウイルスベクターの限定された組織分布を反映している可能性があり得る。総合すると、本発明者らの知見は、ヒト試験における線条体ｍＨＴＴ低下の読み出し情報として、画像化リガンドを使用することの有望な裏付けを与える（Ｗｉｌｓｏｎら、（２０１６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３６８：２４３－２４８；Ｍａｒｋｓら、（２０１６）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２７：５２２－５２７）。ｍＨＴＴ低下が臨床的に追跡されている、皮質などのＨＤに関与する他の脳領域に対するマーカーを探索するために、さらなる研究が必要とされる。
本明細書に挙げられている全ての特許、特許出願および刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
理解を明確にするために、例示および実施例によって、いくぶん詳しく開示を提供してきたが、様々な変更および修正が本開示の精神または範囲から逸脱することなく実施できることが当業者に自明であろう。したがって、先述の記載および実施例は、限定するものとして解釈すべきでない。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ジンクフィンガータンパク質転写因子リプレッサーであって、抑制ドメインおよび以下のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）：
（ａ）アミノ酸配列
Figure 0007332622000017
を含む、ＺＦＰ－Ａと名付けられたＺＦＰ；
（ｂ）アミノ酸配列
Figure 0007332622000018
を含む、ＺＦＰ－Ｂと名付けられたＺＦＰ；
（ｃ）アミノ酸配列
Figure 0007332622000019
を含む、ＺＦＰ－Ｃと名付けられたＺＦＰ；および
（ｄ）
アミノ酸配列
Figure 0007332622000020
を含む、ＺＦＰ－Ｄと名付けられたＺＦＰ；
を含む、ジンクフィンガータンパク質転写因子リプレッサー。
（項目２）
項目１に記載のＺＦＰ－ＴＦリプレッサーをコードするポリヌクレオチド。
（項目３）
項目２に記載の１またはそれを超えるポリヌクレオチドを含むｍＲＮＡまたはＡＡＶ２ベクター。
（項目４）
項目１に記載の１もしくはそれを超えるＺＦＰ－ＴＦリプレッサーと、１もしくはそれを超えるポリヌクレオチドと、および／または項目３に記載の１もしくはそれを超えるｍＲＮＡもしくはＡＡＶベクターを含む薬学的組成物。
（項目５）
項目１に記載の１もしくはそれを超えるＺＦＰ－ＴＦリプレッサーと、１もしくはそれを超えるポリヌクレオチドと、項目３に記載の１もしくはそれを超えるｍＲＮＡもしくはＡＡＶベクターと、および／または項目４に記載の薬学的組成物とを含む細胞。
（項目６）
神経細胞または線維芽細胞である、項目５に記載の細胞。
（項目７）
ハンチントン病（ＨＤ）を有する被験体由来の神経細胞中のアポトーシスを低減し、ＡＴＰレベルを増加させる方法であって、項目１に記載の１もしくはそれを超えるＺＦＰ－ＴＦリプレッサーと、１もしくはそれを超えるポリヌクレオチドと、項目３に記載の１もしくはそれを超えるｍＲＮＡもしくはＡＡＶベクターと、および／または項目４に記載の薬学的組成物とを前記神経細胞に投与することを含む、方法。
（項目８）
項目１に記載の１もしくはそれを超えるＺＦＰ－ＴＦリプレッサー、１もしくはそれを超えるポリヌクレオチド、項目３に記載の１もしくはそれを超えるｍＲＮＡもしくはＡＡＶベクターおよび／または項目４に記載の薬学的組成物を、ハンチントン病（ＨＤ）を有する被験体の線条体に投与することによって、前記被験体中の運動障害を軽減するための、前記１もしくはそれを超えるＺＦＰ－ＴＦリプレッサー、前記１もしくはそれを超えるポリヌクレオチド、前記１もしくはそれを超えるｍＲＮＡもしくはＡＡＶベクターおよび／または前記薬学的組成物の使用。
（項目９）
項目１に記載の１もしくはそれを超えるＺＦＰ－ＴＦリプレッサー、１もしくはそれを超えるポリヌクレオチド、項目３に記載の１もしくはそれを超えるｍＲＮＡもしくはＡＡＶベクターおよび／または項目４に記載の薬学的組成物を、ハンチントン病（ＨＤ）を有する被験体の線条体に投与することによって、前記被験体中のＨＴＴ封入体を低減するための、前記１もしくはそれを超えるＺＦＰ－ＴＦリプレッサー、前記１もしくはそれを超えるポリヌクレオチド、前記１もしくはそれを超えるｍＲＮＡもしくはＡＡＶベクターおよび／または前記薬学的組成物の使用。
（項目１０）
前記ＨＴＴ封入体が核周囲またはＥＭ４８＋封入体である、項目９に記載の使用。
（項目１１）
項目１に記載の１もしくはそれを超えるＺＦＰ－ＴＦリプレッサー、１もしくはそれを超えるポリヌクレオチド、項目３に記載の１もしくはそれを超えるｍＲＮＡもしくはＡＡＶベクターおよび／または項目４に記載の薬学的組成物を、ＨＤを有する被験体の線条体に投与することによって、前記被験体中の翻訳バイオマーカーを回復させるための、前記１もしくはそれを超えるＺＦＰ－ＴＦリプレッサー、前記１もしくはそれを超えるポリヌクレオチド、前記１もしくはそれを超えるｍＲＮＡもしくはＡＡＶベクターおよび／または前記薬学的組成物の使用。
（項目１２）
前記バイオマーカーが、ＰＤＥ１０Ａおよび／またはＤ１もしくはＤ２受容体である、項目１１に記載の使用。
（項目１３）
ハンチントン病を処置および／または予防することを必要とする被験体において、ハンチントン病を処置および／または予防するための、項目１に記載の１もしくはそれを超えるＺＦＰ－ＴＦリプレッサー、１もしくはそれを超えるポリヌクレオチド、項目３に記載の１もしくはそれを超えるｍＲＮＡもしくはＡＡＶベクターおよび／または項目４に記載の薬学的組成物の使用。

Claims (13)

  1. ジンクフィンガータンパク質転写因子リプレッサーであって、抑制ドメインおよび以下のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）：
    （ａ）アミノ酸配列


    を含む、ＺＦＰ－Ａと名付けられたＺＦＰ；
    （ｂ）アミノ酸配列
    Figure 0007332622000022

    を含む、ＺＦＰ－Ｂと名付けられたＺＦＰ；または
    （ｃ）アミノ酸配列


    を含む、ＺＦＰ－Ｄと名付けられたＺＦＰ；
    を含む、ジンクフィンガータンパク質転写因子リプレッサー。
  2. 請求項１に記載のＺＦＰ－ＴＦリプレッサーをコードするポリヌクレオチド。
  3. 請求項２に記載の１またはそれを超えるポリヌクレオチドを含むｍＲＮＡまたはＡＡＶ２ベクター。
  4. 請求項１に記載の１もしくはそれを超えるＺＦＰ－ＴＦリプレッサーと、請求項２に記載の１もしくはそれを超えるポリヌクレオチドと、および／または請求項３に記載の１もしくはそれを超えるｍＲＮＡもしくはＡＡＶベクターを含む薬学的組成物。
  5. 請求項１に記載の１もしくはそれを超えるＺＦＰ－ＴＦリプレッサーと、請求項２に記載の１もしくはそれを超えるポリヌクレオチドと、請求項３に記載の１もしくはそれを超えるｍＲＮＡもしくはＡＡＶベクターと、および／または請求項４に記載の薬学的組成物とを含む細胞。
  6. 神経細胞または線維芽細胞である、請求項５に記載の細胞。
  7. ハンチントン病（ＨＤ）を有する被験体由来の神経細胞中のアポトーシスを低減し、ＡＴＰレベルを増加させるための、請求項４に記載の薬学的組成物であって、前記神経細胞に投与されることを特徴とする、薬学的組成物。
  8. ハンチントン病（ＨＤ）を有する被験体の運動障害を軽減するための、請求項４に記載の薬学的組成物であって、前記被験体の線条体に投与されることを特徴とする、薬学的組成物。
  9. ハンチントン病（ＨＤ）を有する被験体のＨＴＴ封入体を低減するための、請求項４に記載の薬学的組成物であって、前記被験体の線条体に投与されることを特徴とする、薬学的組成物。
  10. 前記ＨＴＴ封入体が核周囲またはＥＭ４８＋封入体である、請求項９に記載の薬学的組成物。
  11. ＨＤを有する被験体の翻訳バイオマーカーを回復させるための、請求項４に記載の薬学的組成物であって、前記被験体の線条体に投与されることを特徴とする、薬学的組成物。
  12. 前記バイオマーカーが、ＰＤＥ１０Ａおよび／またはＤ１もしくはＤ２受容体である、請求項１１に記載の薬学的組成物。
  13. ハンチントン病を処置および／または予防することを必要とする被験体において、ハンチントン病を処置および／または予防するための、請求項４に記載の薬学的組成物。
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