JP2017506898A - ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みのための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

細胞のゲノムへの導入遺伝子配列の標的化されたヌクレアーゼ媒介性挿入のための方法および組成物が本明細書で開示されている。一局面において、単離された細胞の標的配列に外因性配列を組み込む方法が提供され、この方法は、（ｉ）上記標的配列を切断する１つまたは複数のヌクレアーゼ、および（ｉｉ）上記１つまたは複数のヌクレアーゼによる上記標的配列の切断後に上記標的配列に組み込まれる１つまたは複数のドナー配列を逐次的に投与するステップを含み、上記逐次的投与の間に少なくとも２４時間の遅延がある。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１４年２月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／９４３，８６５号（この開示内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

本開示は、遺伝子修飾、および細胞のゲノムへの外因性配列の標的化組み込みの増加の分野にある。

標的ＤＮＡ部位に特異的に結合するように設計されたジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系、Ｔｔａｇｏヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼは、ゲノム操作において有用である。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）およびＴＡＬＥＮ（Ｆｏｋ１−ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン融合物、Ｍｅｇａ ＴＡＬおよびｃＴＡＬＥＮを含むＴＡＬＥＮが挙げられる）は、ヌクレアーゼドメインに融合した操作された部位特異的ジンクフィンガーまたはＴＡＬ−エフェクタードメインを含むタンパク質である。このようなヌクレアーゼは、様々な異なる種の様々なゲノム位置でのゲノム修飾に成功裏に使用されてきた。例えば、参照によりそれらの開示の全体が全目的のため本明細書に組み込まれる米国特許第８，６２３，６１８号；同第８，０３４，５９８号；同第８，５８６，５２６号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；米国特許公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号および同第２０１３０１７７９６０号ならびに米国特許出願第１４／２７８，９０３号を参照されたい。

これらのヌクレアーゼによる標的ヌクレオチド配列の切断は、標的化された遺伝子座でのドナーとの相同組換え（ＨＲ）の頻度を１０００倍超増加させる。ヌクレアーゼ媒介性切断事象の相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用して、切断部位周辺領域に相同な配列が隣接した遺伝子をコードするドナー分子を同時送達することによって、遺伝子（導入遺伝子）の標的化挿入を容易にすることができる。加えて、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）による部位特異的ＤＳＢの修復はまた、ＮＨＥＪ依存性末端捕捉による遺伝子（導入遺伝子）挿入を含む遺伝子修飾をもたらし得る。例えば、米国特許公開第２０１１０２０７２２１号を参照されたい。導入遺伝子の標的化組み込みに加えて、ヌクレアーゼ媒介性切断およびＮＨＥＪによる修復は、切断部位での非特異的挿入および／または欠失（「インデル（ｉｎｄｅｌ）」）をもたらし得る。したがって、標的化された領域に特異的なヌクレアーゼは、導入遺伝子構築物がＨＤＲまたはＮＨＥＪ駆動プロセスのいずれかによって挿入されるように、あるいはヌクレアーゼ−媒介性ＤＳＢの誤りがちなＮＨＥＪ修復による遺伝子のノックアウトのために利用することができる。遺伝子修正はまた、標的化ヌクレアーゼ、および内因性遺伝子における特定領域をドナー中に供給される配列で置き換えるように設計されたドナー分子を使用して達成することができる。特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を遺伝子に導入し、遺伝子を修正するドナーＤＮＡの存在下で、相同依存性組換えを介して、ドナーの配列を用い目的の配列を置き換える。

このヌクレアーゼ媒介性標的化導入遺伝子挿入のアプローチは、遺伝子サイレンシングまたは近くの癌遺伝子の活性化のリスクを最小にするために正確な導入遺伝子の位置決定を可能にするので、古典的な組み込みアプローチと比較して、導入遺伝子の発現の改善、安全性および発現の耐久性の増加が見込まれる。しかし、ヌクレアーゼ活性の効率は、染色体ＤＮＡ標的への到達性およびヌクレアーゼとその標的核酸との間の結合相互作用の質等の種々の要因によって影響を受け得る。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるこれらのアプローチの効率はさらに、標的組織到達性ならびにヌクレアーゼおよび導入遺伝子ドナーを送達するベクターの組織による取り込みならびにｉｎ ｖｉｖｏにおいて達成できるヌクレアーゼ発現レベル等の要因によって複雑になる。ヌクレアーゼ駆動ゲノム修飾の成功率を増加させるため、研究者らは修飾されていないバリアントから修飾されたバリアントを選択することができるように、ドナー組み込みの際に選択マーカーを導入する手段を用いなければならないことが多い（例えば、米国特許第６，５２８，３１３号を参照のこと）。多くの適用で、この技法によってゲノムに追加的な遺伝子または核酸配列が挿入されたままになるので、選択マーカーの使用は望ましくない。

米国特許第８，６２３，６１８号明細書 米国特許第８，０３４，５９８号明細書 米国特許第８，５８６，５２６号明細書

したがって、導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みを増加させ、これらの強力なツールのさらにより効率的な使用を可能にするための組成物および方法が依然として必要とされている。

ヌクレアーゼ（複数可）および外因性配列（複数可）の逐次的投与を介した１つまたは複数の外因性配列の標的配列へのヌクレアーゼ媒介性組み込みのための方法および組成物が本明細書で開示されている。本明細書に記載されている方法および組成物は、外因性配列（導入遺伝子）のヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みの効率を増加させる。特に、本方法および組成物は、ヌクレアーゼおよび導入遺伝子の逐次的な別々の投与、例えば、別々の投与の間に遅延がある、ヌクレアーゼ（複数可）および導入遺伝子（複数可）の別々の溶液の投与を伴う。投与の間の遅延は、数分間、数時間または数日間またはそれより長くてもよく、例えば、投与の間は１０分またはそれ超、３０分またはそれ超、１時間またはそれ超、２時間またはそれ超、３時間またはそれ超、２４時間またはそれ超、３６時間またはそれ超、４８時間またはそれ超、７２時間またはそれ超、あるいは４日間またはそれ超、５日間またはそれ超、６日間またはそれ超、１週間またはそれ超、あるいはそれより長くてもよい。本明細書に記載されている方法および組成物は、代替方法（例えば、同時投与または少なくとも４時間未満おいた逐次投与）を使用して組み込まれた導入遺伝子と比較して、導入遺伝子組み込み効率の増強（例えば、導入遺伝子組み込みにおける１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍から１００倍（またはそれらの間の任意の値）またはそれ超の増加）をもたらす。

したがって、一態様において、単離された細胞の標的配列に外因性配列を組み込む方法であって、（ｉ）標的配列を切断する１つまたは複数のヌクレアーゼ、および（ｉｉ）１つまたは複数のヌクレアーゼによる標的配列の切断後に標的配列に組み込まれる１つまたは複数のドナー配列を逐次的に投与することを含み、逐次的投与の間に少なくとも２４時間の遅延がある方法が本明細書に記載されている。ある特定の実施形態において、逐次的投与の間の遅延は、２４時間〜７２時間の間である。一実施形態において、１つまたは複数のヌクレアーゼは１つまたは複数のドナーの前に投与され、１つもしくは複数のヌクレアーゼおよび／または１つもしくは複数のドナーはプラスミド、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を使用して、またはＲＮＡ、ミニサークルもしくは線状ＤＮＡ形態で投与される。別の実施形態において、１つまたは複数のドナーは１つまたは複数のヌクレアーゼの前に投与され、１つまたは複数のヌクレアーゼはＲＮＡ形態（例えば、ｍＲＮＡ形態）で投与される。

ヌクレアーゼ、例えば、操作されたメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥエフェクタードメインと制限エンドヌクレアーゼおよび／またはメガヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインとの融合物を含むＴＡＬＥＮ（メガＴＡＬＥおよびコンパクトＴＡＬＥＮ等））、Ｔｔａｇｏヌクレアーゼおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、任意の外因性ドナー配列（導入遺伝子）を挿入する細胞における内因性遺伝子座（例えば、セーフハーバー遺伝子または目的の遺伝子座）でＤＮＡを切断するために使用される。ドナー導入遺伝子の標的化挿入は相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同修復機構（例えば、ＮＨＥＪ媒介性末端捕捉）を介することができる。ヌクレオチド（例えば、内因性配列）の挿入および／または欠失（「インデル」）はまた、組み込みの部位で起こり得る。ヌクレアーゼは、標的ＤＮＡに二本鎖（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ニック）を誘導することができる。一部の実施形態において、２種のニッカーゼを使用して、２個のニックを導入することによってＤＳＢを作製する。一部の場合では、ニッカーゼはＺＦＮであるが、他の場合において、ニッカーゼはＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系である。

一態様において、本方法は、コードしたヌクレアーゼを含むベクターが細胞によって取り込まれ、次いでヌクレアーゼが細胞ゲノムの特定の内因性遺伝子座を切断するように１つまたは複数のヌクレアーゼを細胞（例えば、ヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のベクター）に投与すること、最後に、外因性配列が切断されたゲノム（例えば、ヌクレアーゼ（複数可）結合および／または切断部位（複数可））に、またはその付近に、例えば、切断部位（複数可）の１〜３００（またはその間の任意の値）塩基対以内上流または下流に、より好ましくは結合および／または切断部位（複数可）のいずれかの側の１〜１００塩基対（またはその間の任意の値）以内、さらにより好ましくは結合および／または切断部位（複数可）のいずれかの側の１から５０塩基対（またはその間の任意の値）以内に（標的化様式で）組み込まれるように、一定期間後、１つまたは複数の外因性（ドナー）配列を細胞（例えば、これらの外因性配列を含む１つまたは複数のベクター）に投与することを含む。外因性配列は、ヌクレアーゼの投与後の任意の時間、例えば、１０分間またはそれ超、３０分間またはそれ超、１時間から７２時間またはそれ超（４日間、５日間、６日間、７日間またはそれ超）の範囲で投与することができる。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ（複数可）とドナーの投与の間の期間は、２４時間〜４日間の間、好ましくは、４８〜７２時間である。ある特定の実施形態において、細胞は単離された細胞であり、ヌクレアーゼ（複数可）の投与とドナー導入遺伝子の投与の間に培養される。

別の態様において、本方法は外因性配列（例えば、外因性配列を含むベクター、プラスミド、ミニサークルまたは線状ＤＮＡ）の細胞への投与と、続くヌクレアーゼの投与（例えば、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ヌクレアーゼをコードするベクターまたはプラスミドの投与、あるいはタンパク質形態としてのヌクレアーゼの投与）を含む。例えば、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡまたはタンパク質ヌクレアーゼは、外因性配列後の任意の時間、例えば、１０分間またはそれ超、３０分間またはそれ超、１時間から７２時間またはそれ超（４日間、５日間、６日間、７日間またはそれ超）の範囲で投与することができる。ある特定の実施形態において、ドナーおよびヌクレアーゼ（複数可）の投与の間の期間は、２４時間〜４日間の間、好ましくは、４８〜７２時間である。

一部の実施形態において、ヌクレアーゼ（複数可）はＲＮＡとして（例えば、それらをコードしているｍＲＮＡとして）投与される。一部の実施形態において、ｍＲＮＡはリボソームスタッタリング（ｓｔｕｔｔｅｒｉｎｇ）部位によって隔てられたヌクレアーゼ対の２つのヌクレアーゼ、および内部リボソーム進入部位等（例えば、２Ａ配列またはＩＲＥＳ）を含む。他の実施形態において、ヌクレアーゼ対において２つのヌクレアーゼをコードする２つのｍＲＮＡは、細胞への投与前または投与中に組み合わせることができる別々のｍＲＮＡである。一部の実施形態において、ｍＲＮＡは修飾またはキャップされる。
切断は、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）等、特異的ヌクレアーゼの使用により、Ｔｔａｇｏヌクレアーゼを使用してあるいは特異的切断を誘導するための操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（「単鎖ガイドＲＮＡ」）によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して行うことができる。一部の実施形態において、２種のニッカーゼを使用して、２個のニックを導入することによりＤＳＢを作製する。一部の場合では、ニッカーゼは、ＺＦＮであるが、他の場合において、ニッカーゼは、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系である。外因性ドナー配列の標的化組み込みは、相同組換え修復機構（ＨＤＲ）および／または非相同性修復機構（例えば、ＮＨＥＪ媒介性末端捕捉）により起こり得る。本明細書に記載されたようなヌクレアーゼは、例えば、リーダー配列、調節配列、トレーラー配列またはイントロン等の遺伝子内または遺伝子に隣接したコードまたは非コード領域における、あるいはコード領域の上流または下流の非転写領域内の目的の領域に結合し、かつ／または切断することができる。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは結合部位またはその付近で標的配列を切断する。

本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて、ドナー配列はタンパク質産物を発現する１つまたは複数の導入遺伝子を含むことができる。ある特定の実施形態において、タンパク質産物は治療用であり、障害（例えば、血友病、リソソーム蓄積症、代謝疾患、異常ヘモグロビン症等の遺伝性障害）において異常に発現されるタンパク質の機能性バージョンである。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、１つまたは複数の機能性凝固因子タンパク質（例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子および／または第Ｘ因子）をコードする。一部の実施形態において、ドナー配列は、ヌクレアーゼ依存性ＨＤＲを介して内因性遺伝子における変異を修正するように設計される。

ヌクレアーゼは、任意の内因性遺伝子座を標的化することができる。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、セーフハーバー遺伝子座（例えば、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａまたはアルブミン。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；同第８，５８６，５２６号；米国特許公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号；同第２０１３０１２２５９１号および同第２０１３０１７７９６０号；米国特許出願第１４／２７８，９０３号を参照のこと）に特異的な少なくとも１つのヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を使用して部位特異的（標的化）様式で組み込まれる。

別の態様において、外因性配列を含むために細胞を遺伝的に修飾する方法であって、１つまたは複数のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）を使用して細胞における内因性遺伝子を切断すること、および導入遺伝子が内因性遺伝子座に組み込まれ、細胞内で発現するように、一定期間後、導入遺伝子を細胞に投与することを含む方法が本明細書に記載されている。ある特定の実施形態において、内因性遺伝子はＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａまたはアルブミン遺伝子座等のセーフハーバー遺伝子である。

別の態様において、１つまたは複数の外因性配列を含むために細胞を遺伝的に修飾する方法であって、外因性配列を含むベクターを細胞に投与すること、外因性配列を含むベクターの細胞による十分な時間の取り込みを可能にすること、次に１つまたは複数のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ（ＴＡＬエフェクタードメインおよびヌクレアーゼドメイン（制限エンドヌクレアーゼおよび／またはメガヌクレアーゼ））および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）をコードするｍＲＮＡを投与すること、またはヌクレアーゼが内因性遺伝子を切断し、外因性配列が組み込まれて発現するようにヌクレアーゼをタンパク質として投与することを含む方法が本明細書に記載されている。ある特定の実施形態において、内因性遺伝子座はＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａまたはアルブミン遺伝子等のセーフハーバー遺伝子座である。

別の態様において、例えば、遺伝性障害を処置するために、患者において欠如または欠損している機能性タンパク質を提供する方法が本明細書で提供されている。ある特定の実施形態において、本方法は、本明細書で開示したようなヌクレアーゼ（複数可）および導入遺伝子（複数可）の順序付けた逐次的投与を使用した、機能性タンパク質をコードする配列をそれを必要とする被験体の細胞に組み込むことを含む。他の実施形態において、本方法は、遺伝的に修飾された細胞（被験体において異常に発現される１つまたは複数のタンパク質の機能性バージョンを発現する）を被験体に直接投与することを含む。したがって、単離された細胞を被験体に導入することができる（エクスビボ細胞療法）、あるいは被験体の一部である細胞を修飾することができる（インビボ）。例えば遺伝子障害の処置のための医薬の調製における、障害の処置のための、本明細書に記載されているドナーおよび／またはヌクレアーゼの使用も提供される。ある特定の実施形態において、外因性配列はウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）および／またはそれらの組み合わせを使用して送達される。

記載した組成物および方法のいずれかにおいて、ヌクレアーゼ（複数可）および／または導入遺伝子（複数可）は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶ２／８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６等のシュードタイプ化したＡＡＶが挙げられるがこれらに限定されないＡＡＶベクターで運んでもよい。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼおよび導入遺伝子ドナーは、同じＡＡＶベクター型を使用して送達する。他の実施形態において、ヌクレアーゼおよび導入遺伝子ドナーは、異なるＡＡＶベクター型を使用して送達する。ヌクレアーゼおよび導入遺伝子は、２つまたはそれ超のベクター、例えば、一方がヌクレアーゼ（複数可）（例えば、ＺＦＮ対の左および右ＺＦＮ、例えば２Ａペプチドを含む）を運び、一方が導入遺伝子を運ぶ２つのベクター、あるいは１つのベクターがヌクレアーゼ対の一方のヌクレアーゼ（例えば、左ＺＦＮ）を運び、別のベクターがヌクレアーゼ対の他方のヌクレアーゼ（例えば、右ＺＦＮ）を運び、第３の別のベクターが導入遺伝子を運ぶ３つのベクターを使用して送達することができる。２つまたはそれ超のベクターを使用する実施形態において、ベクターは、同じ濃度または異なる比で使用することができ、例えば、ヌクレアーゼベクター（複数可）を導入遺伝子ベクター（複数可）よりも２倍、３倍、４倍、５倍またはそれ超高い濃度で投与することができる。

本明細書に記載されている組成物および方法のいずれかにおいて、ヌクレアーゼ（複数可）は前記ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡとして送達することができる。一部の実施形態において、各ヌクレアーゼのコード配列が「自己切断」配列（例えば、２Ａ配列）によって隔てられたヌクレアーゼ対の２つのヌクレアーゼをコードする単鎖ｍＲＮＡが記載されている。他の実施形態において、ヌクレアーゼ対の各ヌクレアーゼは、単鎖ｍＲＮＡとして含まれ、２つの単鎖ｍＲＮＡがヌクレアーゼ対を投与するために一緒に使用される。本明細書に記載されているｍＲＮＡ組成物のいずれかにおいて、ｍＲＮＡは転写の安定性および／または効率を増加させるために修飾することができ、あるいは修飾されたヌクレオシドを含むことができ（例えば、米国特許第８，６９１９，６６号および米国特許第７，０７４，５９６号を参照のこと）、あるいはｍＲＮＡは製剤化された粒子を介して、またはカプセル化したリポソーム（例えば、米国特許第５，９７６，５６７号を参照のこと）として送達することができる。

本明細書に記載されている組成物および方法のいずれかにおいて、導入遺伝子は、タンパク質、例えば、障害において欠如している、および／または異常に発現されるタンパク質の機能性バージョンをコードすることができる。一部の実施形態において、導入遺伝子は、天然に存在する対応物と比較して特性が増強された天然に存在しないタンパク質をコードすることができる。本明細書に記載されている組成物または方法のいずれかにおいて、導入遺伝子はまた転写調節因子を含むが、他の場合において、転写因子は含まず、転写は内因性調節因子によって調節される。別の態様において、本発明の方法は、それを必要とする被験体の治療的処置のための組成物を含む。一部の実施形態において、組成物は、セーフハーバー特異的ヌクレアーゼおよび導入遺伝子ドナーを含む操作された幹細胞を含む。他の実施形態において、組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて遺伝子修飾を行うために、導入遺伝子ドナーおよび特異的ヌクレアーゼおよび／または修飾されたｍＲＮＡを含む操作されたウイルス粒子を含む。

本明細書に記載されている組成物または方法のいずれかにおいて、細胞は真核細胞であることができる。好適な細胞の非限定的な例として、分泌細胞（例えば、肝臓細胞、粘膜細胞、唾液腺細胞、下垂体細胞等）、血液細胞（赤血球）、赤血球前駆細胞、肝細胞、筋肉細胞、幹細胞（例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、肝幹細胞、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋））または内皮細胞（例えば、血管、糸球体および尿細管内皮細胞）等の真核細胞または細胞系が挙げられる。したがって、標的細胞は、ヒト細胞、または他の哺乳動物（獣医学上の動物が含まれる）、特に非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ：アカゲザル、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ：カニクイザル）およびＲｏｄｅｎｔａ目（マウス、ラット、ハムスター）、Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ目（ウサギ）、Ｃａｒｎｉｖｏｒａ目（ネコ、イヌ）およびＡｒｔｅｒｉｏｄａｃｔｙｌａ目（ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）の哺乳動物の細胞であることができる。一部の態様において、標的細胞は組織（例えば、肝臓）を含む。一部の態様において、標的細胞は、幹細胞（例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、肝幹細胞等）または本明細書に記載されている方法のいずれかによる動物胚であり、次に胚は生きた動物が生まれるように移植される。その後、動物は性的成熟まで成長させ、繁殖させ、その子孫のうちの少なくとも一部はゲノム修飾を含む。細胞はまた、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは他の哺乳動物細胞胚の胚細胞を含むことができる。細胞は、任意の生物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌまたは他の哺乳動物細胞由来であることができる。細胞は、単離することができる、あるいは生物（例えば、被験体）の一部であり得る。

本明細書に記載されている方法および組成物のいずれかにおいて、例えば、組み込まれた導入遺伝子との融合タンパク質として、内因性遺伝子の一部もしくはすべてが発現されるまたは全く発現されないように、導入遺伝子は、内因性セーフハーバー遺伝子に組み込むことができる。一部の実施形態において、内因性セーフハーバー遺伝子は、アルブミン遺伝子であり、内因性配列は、アルブミン配列である。内因性配列は、外因性タンパク質のアミノ（Ｎ）末端部分および／または外因性タンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端部分に存在し得る。アルブミン配列は、完全長の野生型または変異型のアルブミン配列を含むことができる、あるいは部分的アルブミンアミノ酸配列を含むことができる。ある特定の実施形態において、アルブミン配列（完全長または部分的）は、それが融合した導入遺伝子により発現されるポリペプチドの血清半減期の増加に、および／または担体として役立つ。他の実施形態において、導入遺伝子は、アルブミン配列を含み、ゲノム内の別のセーフハーバーへの挿入に標的化される。さらに、導入遺伝子は、その発現を駆動する外因性プロモーター（例えば、構成的または誘導性プロモーター）を含むことができる、あるいはその発現は、内因性制御配列（例えば、内因性アルブミンプロモーター）により駆動することができる。一部の実施形態において、ドナーは、コドン最適化、グリコシル化部位の追加、シグナル配列等が挙げられるがこれらに限定されない追加的修飾を含む。

さらに、本明細書に記載されている方法のいずれかは、任意の時点での細胞のコールドショック（米国特許第８，７７２，００８号）、部分的肝切除術または形質導入を増強し、かつ／または肝細胞に細胞周期を誘導する第２の作用物質による処置を含む追加的ステップをさらに含むことができる。第２の作用物質の例には、ガンマ線照射、ＵＶ照射、チミジン等のトリチウム標識したヌクレオチド、シスプラチン、エトポシド、ヒドロキシウレア、アフィディコリン、プレドニゾロン、四塩化炭素および／またはアデノウイルスが挙げられる。

本明細書に記載されている方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて実施することができる。ある特定の実施形態において、生きた無傷の哺乳動物で方法は実施される（および／または修飾された細胞等の組成物は送達される）。哺乳動物は、送達時に発生の任意の段階、例えば、胚、胎仔、新生仔、乳仔、幼若期または成体期であることができる。さらに、標的化された細胞は健康か、または病的であることができる。ある特定の実施形態において、１つまたは複数の組成物は、静脈内（例えば、肝門脈を介して肝臓へ、例えば、尾静脈注射）、動脈内、腹腔内、筋肉内、肝実質内（例えば、注射によって）、肝動脈内（例えば、注射によって）および／または胆道系（ｂｉｌｉａｒｙ ｔｒｅｅ）を通じて（例えば、注射によって）送達される。

組成物を特定の種類の細胞、例えば、血小板、線維芽細胞、肝細胞、造血幹／前駆細胞等に標的化するために、１つまたは複数の投与した組成物に、細胞の表面受容体に特異的に結合するホーミング剤と会合させてもよい。例えば、ベクターは、ある特定の肝臓系細胞が受容体を有するリガンド（例えば、ガラクトース）にコンジュゲートすることができる。コンジュゲーションは、共有結合、例えば、グルタルアルデヒド等の架橋剤、または非共有結合、例えば、ビオチン化ベクターへのアビジン化リガンドの結合であることができる。共有結合コンジュゲーションの別の形態は、１つまたは複数のコードされたコートタンパク質が天然のＡＡＶコートタンパク質とペプチドまたはタンパク質リガンドのハイブリッドとなるように、ベクターストックを調製するために使用したＡＡＶヘルパープラスミドを操作して、リガンドがウイルス粒子の表面上に曝露されるようにすることによって提供される。

本発明の組成物（例えば、遺伝的に修飾された細胞、ＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および／またはＴＡＬＥを含むキットも提供される。本キットは、ヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ分子または好適な発現ベクターまたはタンパク質に含有されるヌクレアーゼコード遺伝子）、ドナー分子、好適な宿主細胞系、本発明の方法を実施するための説明書等を含むことができる。

これらの態様および他の態様は、全体としての本開示を考慮することにより当業者には容易に明らかとなる。

図１Ａおよび１Ｂは、両方をウイルスベクターで送達するか、またはヌクレアーゼをｍＲＮＡとして送達するか否かに応じて、ドナーおよびヌクレアーゼを追加する順序を変えるためのスキームを示している。図１Ａは、ヌクレアーゼ（複数可）をｍＲＮＡとして送達する場合の方法を示す。この場合、ドナーを含有するＡＡＶウイルスを細胞に送達し、続いてドナー送達の４８時間後までにヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを送達する。図１Ｂは、ドナーおよびヌクレアーゼの両方をＡＡＶウイルスによって送達する場合の方法を示す。この場合、ヌクレアーゼ含有ウイルスを最初に送達し、細胞によって取り込ませ、次にドナー含有ウイルスをヌクレアーゼウイルス送達の４８時間後までに送達する。

図２は、初代ヒト肝細胞への挿入後の導入遺伝子活性を示すグラフである。この実験において、ｈＡＬＢ特異的相同アームに隣接した、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子タンパク質をコードするＤＮＡドナーを含むＡＡＶ２／６ウイルス粒子を１ｅ５のＭＯＩで細胞に導入した。ヒトアルブミン特異的ＺＦＮをコードするｍＲＮＡは、ドナーを含有するＡＡＶの導入後０から７２時間の様々な時点で細胞に導入した。次いで、導入遺伝子発現を７日後に測定した。グラフは、ＡＡＶ−ドナー導入後２４〜４８時間のヌクレアーゼの導入が最適な導入遺伝子発現を導くことを示している。

図３Ａから３Ｃは、ヒト第９因子（ｈＦ．ＩＸ）の発現のためにヌクレアーゼおよび導入遺伝子ドナーの追加の順序を変化させる研究の結果を示している。図３Ａは、ヒトＦ９遺伝子の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）初代肝細胞におけるアルブミン遺伝子座への挿入を示す概略図である。この図は、ｈＦ９遺伝子ドナーにＮＨＰ（アカゲザル）アルブミン相同アームが隣接していたことを示している。図３Ｂは、導入遺伝子挿入による初期翻訳産物を示しており、プレプロｈＦ．ＩＸペプチドのタンパク質分解性切断部位を示している。図３Ｃは、細胞上清において検出されたｈＦ．ＩＸの発現を示している。このグラフは、２つのＮＨＰ（アカゲザル）アルブミン特異的ＺＦＮ対、３６８０６／３５３９６および３７８０４／４３０４３を使用して、ＺＦＮをコードするｍＲＮＡをＡＡＶ含有ｈＦ９導入遺伝子の添加の２４または４８時間後のいずれかに添加した場合の結果を示している。この実験における最高の発現レベルは、ＺＦＮをコードするｍＲＮＡを、導入遺伝子を含有するＡＡＶの２４時間後に添加したときに得られた。

図４は、ＮＨＰ（アカゲザル）初代肝細胞へのｍＲＮＡ導入後の２つのＮＨＰ（アカゲザル）アルブミン特異的ＺＦＮタンパク質のうちの１つの発現を示すウェスタンブロットである。ＺＦＮを検出するために、抗ＦｏｋＩ抗体を使用したが、ＨＳＰ９０はローディング対照として役立てた。データは、ＺＦＮタンパク質レベルがトランスフェクション後約８時間でピークに達し、トランスフェクション後４８時間でほとんど検出できなくなることを示している。

図５Ａおよび５Ｂは、ＺＦＮおよびドナーの両方がウイルスベクターとして送達される場合のヌクレアーゼおよび導入遺伝子の逐次的投与による、アカゲザル初代肝細胞でのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みを示している。ＺＦＮ（アカゲザルアルブミン遺伝子に特異的）およびｈＦ９ドナーの両方は組換えＡＡＶ２／６ウイルスを介して送達され、ドナーｈＦ９導入遺伝子はアカゲザルアルブミン遺伝子における切断部位の周囲の配列に相同な配列を含有する相同アームに隣接していた。ＺＦＮを含有するウイルスを最初に添加し、次いでドナーを含むウイルスを同日または４８時間後までのいずれかに添加した。図５Ａは、ＡＡＶ粒子をドナーＡＡＶ：ＺＦＮ１ ＡＡＶ：ＺＦＮ２ ＡＡＶの比が１０：１：１で送達したときのｈＦＩＸ特異的ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示したグラフを示すが、図５Ｂは、比が変化したとき（ドナーＡＡＶ：ＺＦＮ１ ＡＡＶ：ＺＦＮ２ ＡＡＶが３：１：１、１０：１：１または１６：１：１）の結果を示すグラフを示している。両グラフは、最適なｈＦ．ＩＸ導入遺伝子発現は、ドナー−ＡＡＶ導入遺伝子ウイルスをＺＦＮ−ＡＡＶの２４時間後に添加したときに見出され、これらの条件下ではより低いドナー：ＺＦＮ比が有益であることを示している。

図６は、ｈＦ９導入遺伝子が、導入遺伝子が挿入されているＮＨＰアルブミン遺伝子座に相同な相同アームではなくヒトＦ９遺伝子に相同な領域に隣接していた場合のｈＦ．ＩＸ導入遺伝子発現を示すグラフであり、ＮＨＥＪ依存性末端捕捉によってのみドナーを組み込ませるスキームを示している。この場合、ＺＦＮ−ＡＡＶ処置後２４時間ドナー−ＡＡＶ添加を遅延してもｈＦ．ＩＸ発現はまだ最適であった。

図７Ａおよび７Ｂは、ｈＦ９導入遺伝子をＮＨＰアルブミン遺伝子座ではなくヒトアルブミン遺伝子座の相同アームに隣接させ、導入遺伝子をＮＨＥＪ依存性末端捕捉によって組み込ませる、ｈＦ９導入遺伝子ＡＡＶ−ドナーウイルス遅延導入の結果を示している。図７Ａは、変動するＺＦＮ：ドナーウイルス比条件下で、ＺＦＮによるアルブミン切断部位で検出された挿入および欠失（「インデル」）の百分率の分析によって、トランスフェクション後４および８日目のＺＦＮ活性の特徴付けを示している。このデータは、同日により大量のドナーウイルスを導入したときにＺＦＮ活性が減少することを示している。対照的に、ドナー添加を２４時間遅延すると、ドナーベクターがＺＦＮ活性に対して有する負の影響は、ドナー：ＺＦＮ比が高くてももはや明白ではなかった。８日目の試料で示されたデータは、２連の試料から得られた。図７Ｂは、図７Ａで記載されたのと同じ条件でのｈＦ９導入遺伝子発現の量を示している。ｈＦ．ＩＸ発現は、ＡＡＶ−ドナーベクターをＡＡＶ−ＺＦＮ後２４時間の培養物に導入したときに最高である。

図８は、様々なドナーおよびＺＦＮウイルス遅延プロトコール下での、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスにおけるｈＦ９導入遺伝子の発現を示している。使用したウイルスはＡＡＶ２／８であり、ドナー−ＡＡＶ：ＺＦＮ１−ＡＡＶ：ＺＦＮ２−ＡＡＶウイルスの比は６：１：１であった。条件は以下の通りであった：ドナーを最初に添加、ＺＦＮウイルスを２４時間後に添加（円）、両ウイルスを同時に投与（四角）、最初にＺＦＮウイルスを、続いてドナーウイルスを２４時間後に投与（三角）、最初にＺＦＮウイルスを、続いてドナーウイルスを７２時間後に投与（逆三角）、最初にＺＦＮウイルスを、続いてドナーウイルスを１２０時間後に投与（ひし形）。対照群は、ＺＦＮのみ、ドナーのみおよびビヒクルのみを含む。Ｐ値は、群２および３の間、または群２および４の間それぞれのスチューデントＴ検定の結果を表す。

図９Ａおよび９Ｂは、前述の同じ実験におけるＺＦＮ活性および発現を示している。図９Ａは、全群の肝臓ゲノムＤＮＡにおけるアルブミン遺伝子座で検出された（前述したように）インデルの百分率によって測定されたＺＦＮ切断活性を示している。図９Ｂは、同じ肝臓組織におけるウェスタンブロット分析によるＺＦＮ発現を示している。ＺＦＮ活性および発現は、ＺＦＮ含有ＡＡＶを単独で、またはドナー含有ＡＡＶの添加の３日前に添加したとき、最高であった。

図１０は、ＡＡＶ−ＺＦＮおよびＡＡＶ−ドナーウイルスで感染させた後のマウス血清におけるｈＦ．ＩＸのレベルを示したグラフである。ＡＡＶ−ドナーをマウスにＡＡＶ−ＺＦＮウイルスの１日前に与えるか、同日に与えるか、またはＡＡＶ−ＺＦＮの１もしくは３日後に与えた。ｈＦ．ＩＸは、様々なコホートの逐次採血後にＥＬＩＳＡを使用して検出した。

図１１Ａおよび１１Ｂは、処置した動物におけるｈＦ．ＩＸレベルを示している。図１１Ａは、ＥＬＩＳＡによって決定した８匹の処置した動物（０日目から２８日目）からのアカゲザル血漿におけるｈＦ．ＩＸレベルを示すグラフである。ＡＡＶ−ドナーをサルにＡＡＶ−ＺＦＮと同日、またはＡＡＶ−ＺＦＮの１もしくは２日後に与えた。図１１Ｂは、全研究期間中に達成した同じ研究からのピークｈＦ．ＩＸレベルを示している。

さらに１つの外因性ドナー配列を細胞の標的部位に組み込むための組成物および方法が本明細書で開示されている。本方法および組成物は、（ｉ）標的配列を切断する１つまたは複数のヌクレアーゼ、および（ｉｉ）ヌクレアーゼによる標的配列の切断後に標的配列に組み込まれる１つまたは複数のドナー配列の逐次的投与であって、ヌクレアーゼ（複数可）および外因性配列（複数可）の投与の間に数分間、数時間または数日間の遅延がある投与を伴う。本明細書に記載されている方法および組成物は、ヌクレアーゼ（複数可）およびドナー構築物の逐次的投与の特異的方法であって、配列の順序はヌクレアーゼおよびドナーの送達のために使用した形態に依存する方法に従うことによって、標的化ヌクレアーゼを使用した標的化遺伝子修正または外因性配列の内因性ゲノム遺伝子座への組み込みの効率を増加させる。

特に、ヌクレアーゼおよびドナーの両方がウイルス粒子として供給されるとき、ヌクレアーゼ（複数可）の投与後のドナー導入遺伝子（例えば、タンパク質をコードする配列またはｓｈＲＮＡ等のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列）の投与は、ドナーおよびヌクレアーゼを一緒に（同時に）またはより短期間もしくはより長期間遅延して投与する方法と比較して、導入遺伝子組み込みの増加をもたらす。ドナー導入遺伝子は、ヌクレアーゼ（複数可）の数分から数時間から数日後、例えば、８から７２時間後（またはその間の任意の時間）または４日後、５日後、６日後またはそれ超後に投与することができる。あるいは、ヌクレアーゼをｍＲＮＡ（複数可）として投与するとき、最初にドナー導入遺伝子を含むウイルス粒子を投与し、標的細胞に十分な時間取り込ませ、次いでヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡで処置することが好ましい。ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、ドナー（複数可）の数分から数時間から数日後、例えば、８から７２時間後（またはその間の任意の時間）または４日後、５日後、６日後またはそれ超後に投与することができる。どちらの場合も、細胞はウイルス取り込みのために十分な時間を与えられる。いかなる特定の理論に拘束されるものではないが、ヌクレアーゼおよび導入遺伝子ドナーの両方をウイルスを介して投与するとき、２種類の粒子が同じ取り込み受容体に関して競合して全体的な活性が消失する可能性がある。ウイルスの間で起こり得る別の競合様式は、それらが細胞に入った後のものである。ＺＦＮおよびドナーウイルスの両方は、核に入るためにまずエンドソームを脱出しなければならない。次に、得られる遊離の一本鎖ＡＡＶゲノムは、ａ）ドナーとして役立つか、またはｂ）転写されてＺＦＮタンパク質を産生するために、二本鎖形態に変換されなければならない。これらのステップのいずれも律速となることがあり、したがってＡＡＶ競合に対して感受性となり得る。２種類の粒子の投与の間に十分な時間をおくならば、ヌクレアーゼウイルスが取り込まれ、導入遺伝子ドナーウイルスを導入する前に、ヌクレアーゼが内因性ゲノム標的で特異的ＤＳＢを作製する作用を開始することはまた有益である。ヌクレアーゼをｍＲＮＡとして供給するとき、ｍＲＮＡはトランスフェクション手順中にすぐに取り込まれるので、取り込み受容体に関する競合は問題ではない（図１を参照のこと）。一部の特異的細胞型では（例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞）、ｍＲＮＡを介してヌクレアーゼを導入した直後にドナー−ＡＡＶで細胞を処置することが好ましい場合がある。

外因性配列は、血友病に関与する任意のタンパク質またはペプチド、例えば、Ｆ８、Ｆ．ＩＸおよび／またはそれらの機能性断片をコードすることができる。本明細書に記載されている細胞を使用し、かつ／または本明細書に記載されているように細胞を（ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて）修飾して、血友病を処置する方法も開示されている。

導入遺伝子は、タンパク質産物、例えば、細胞において欠如している、異常に発現される、および／または非機能性であるタンパク質、例えば、血友病の被験体で欠如しているタンパク質（例えば、第ＶＩＩ因子、Ｆ８、Ｆ．ＩＸ、第Ｘ因子、および／またはそれらの機能性断片）、リソソーム蓄積症の被験体で欠如しているタンパク質、異常ヘモグロビン症の被験体で欠如しているタンパク質、および／または代謝障害の被験体で欠如しているタンパク質の機能性バージョンをコードすることができる。例えば、米国特許公開第２０１２０１２８６３５号；同第２０１４００９３９１３号；同第２０１４００８０２１６号および同第２０１４０１５５４６８号を参照されたい。

本明細書に記載されているゲノム的に修飾された細胞は、細胞がｉｎ ｖｉｖｏにおいてタンパク質を産生するように、治療用タンパク質をコードする配列を被験体の１つまたは複数の細胞のゲノムに挿入するために（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおいて）、典型的には、ヌクレアーゼ媒介性（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）標的化組み込みによって修飾される。

ある特定の実施形態において、本方法は、例えば、部分肝切除によって、および／または肝細胞に細胞周期を誘導する１つもしくは複数の化合物を投与することによって、被験体の細胞、特に肝臓細胞の増殖（細胞周期に入ること）を誘導することをさらに含む。被験体には、ヒト、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ等の獣医学上の動物が挙げられるが、これらに限定されない。

概要
方法の実践、ならびに本明細書に開示の組成物の調製および使用は、別途示されない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、および当分野の技術の範囲内の関連分野における従来の技法を用いる。これらの技法は、文献内で十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９およびＴｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７および定期的最新版；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹのシリーズ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒら）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。

定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、線状または環状構造であり、かつ一本鎖または二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈されるべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分、および／またはリン酸部分において修飾されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含することができる。概して、特定のヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対合特異性を有し、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

「結合」とは、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的かつ非共有結合的な相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用のすべての構成要素が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格におけるリン酸残基と接触する）必要はない。そのような相互作用は、概して、１０^−６Ｍ^−１以下の解離定数（Ｋ_ｄ）を特徴とする。「親和性」は、結合の強度を指し、結合親和性の増加は、Ｋ_ｄの低下と相関性がある。

「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合し得る。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、それ自身に結合してホモ二量体、ホモ三量体等を形成することができ）、かつ／または、異なるタンパク質（単数または複数）の１つ以上の分子に結合し得る。結合タンパク質は、２つ以上の種類の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、およびタンパク質結合活性を有する。

「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、亜鉛イオンの配位によってその構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的な様式でＤＮＡに結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。

「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥの、その同族の（ｃｏｇｎａｔｅ）標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には、３３〜３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列に少なくともある程度の配列相同性を示す。例えば、米国特許第８，５８９，５２６号を参照されたい。

ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識へリックス領域を操作する（１つ以上のアミノ酸を改変する）ことによって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」され得る。したがって、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然タンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例には、設計および選択がある。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が主に合理的判定基準によってもたらされる非天然タンパク質である。設計のための合理的判定基準は、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計ならびに結合データの情報を格納するデータベース内の情報を処理するためのコンピュータ化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、および同第８，５８６，５２６号を参照されたく、国際公開第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号、および同第ＷＯ０３／０１６４９６号も参照されたい。

「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その生成が主にファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択等の実験によるプロセスからもたらされる天然には見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号、米国特許第５，９２５，５２３号、米国特許第６，００７，９８８号、米国特許第６，０１３，４５３号、米国特許第６，２００，７５９号、国際公開第ＷＯ９５／１９４３１号、同第ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、および同第ＷＯ０２／０９９０８４号を参照されたい。

「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられる原核生物のアルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。例えば、Ｓｗａｒｔｓら、同書、Ｇ． Ｓｈｅｎｇら、（２０１３年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１巻、６５２頁を参照されたい。「ＴｔＡｇｏ系」とは、例えば、ＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡを含む、必要な成分全てである。「組換え」とは、２つのポリヌクレオチドの間の遺伝情報の交換プロセスを指し、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）によるドナー捕捉および相同組換えが挙げられるがこれらだけに限定されない。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同組換え修復機構を介して細胞における二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）の修復中に生じるような交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝子情報の伝達をもたらすことから、「非交叉遺伝子変換」または「ショートトラクト（ｓｈｏｒｔ ｔｒａｃｔ）遺伝子変換」として広く知られている。任意の特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、そのような伝達は、切断された標的（ｂｒｏｋｅｎ ｔａｒｇｅｔ）とドナーとの間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または標的の一部になる遺伝子情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存的鎖アニーリング（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｒａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ）」、および／または関連プロセスを含み得る。そのような特殊なＨＲは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の改変をもたらす。

本開示の方法において、本明細書に記載の１つ以上の標的化されたヌクレアーゼは、標的配列（例えば、細胞クロマチン）の所定の部位で二本鎖切断を生じ、この切断領域内のヌクレオチド配列と相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドが細胞に導入され得る。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組み込みを促進することが示されている。ドナー配列は、物理的に組み込まれ得るか、またはあるいは、ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えによる切断の修復用の鋳型として使用され、その結果、ドナーにおいて見られるようなヌクレオチド配列のすべてまたは一部を細胞クロマチンに導入する。したがって、細胞クロマチン内の第１の配列を改変することができ、ある実施形態において、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列に変換することができる。したがって、「置き換える（ｒｅｐｌａｃｅ）」または「置き換え（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」という用語の使用が、あるヌクレオチド配列の、別のヌクレオチド配列による置き換え（すなわち、情報の意味において、配列の置き換え）を表し、かつあるポリヌクレオチドの別のポリヌクレオチドによる物理的または化学的置き換えは必ずしも必要としないことが理解され得る。

本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよび／またはＴＡＬＥＮのさらなる対が、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ）のために使用され得る。

細胞クロマチンにおける目的とする領域内の配列の標的化組換えおよび／または置き換えおよび／または改変のための方法のある実施形態において、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列との相同組換えによって改変される。切断領域に対する配列相同性が存在する場合、そのような相同組換えは、細胞クロマチンにおける二本鎖切断の存在によって促進される。

本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、目的とする領域のゲノム配列と相同であるが同一ではない配列を含み得、それによって、相同組換えを促進して目的とする領域内に非同一配列を挿入する。したがって、ある実施形態において、目的とする領域内の配列と相同であるドナー配列の一部は、置き換えられるゲノム配列に約８０〜９９％（またはそれらの間の任意の整数値）の配列同一性を示す。他の実施形態では、例えば、１００を超える連続した塩基対のドナー配列とゲノム配列との間で１つのヌクレオチドのみが異なる場合、ドナー配列とゲノム配列との間の相同性は９９％よりも高い。ある場合において、新しい配列が目的とする領域に導入されるように、ドナー配列の非相同部分は、目的とする領域に存在しない配列を含み得る。これらの例において、非相同配列は、概して、５０〜１，０００個の塩基対（もしくはそれらの間の任意の整数値）または目的とする領域内の配列と相同もしくは同一である１，０００を超える任意の数の塩基対の配列が隣接している。他の実施形態において、ドナー配列は、第１の配列と非相同であり、非相同組換え機構によってゲノムに挿入される。

本明細書に記載の方法のいずれかは、目的とする遺伝子（複数可）の発現を妨害するドナー配列の標的化組み込みによる細胞における１つ以上の標的配列の部分的または完全な不活性化のために使用され得る。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞系も提供される。

さらに、本明細書に記載の標的化組み込みの方法を用いて、１つ以上の外因性配列を組み込むこともできる。外因性核酸配列は、例えば、１つ以上の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の種類のコード配列もしくは非コード配列、ならびに１つ以上の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。加えて、外因性核酸（ドナー）配列は、１つ以上のＲＮＡ分子（例えば、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を生成し得る。

「切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）」とは、ＤＮＡ分子の共有結合の骨格の切断（ｂｒｅａｋａｇｅ）を指す。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素加水分解または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない様々な方法によって開始され得る。一本鎖切断も二本鎖切断もいずれも可能であり、二本鎖切断は、２つのはっきりと異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらし得る。ある実施形態において、融合ポリペプチドは、標的化二本鎖ＤＮＡ切断に用いられる。

「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なる）とともに、切断活性（好ましくは、二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第１および第２の切断ハーフドメイン」、「＋および−切断ハーフドメイン」、ならびに「右および左切断ハーフドメイン」という用語は、二量体化する切断ハーフドメインの対を指すために交換可能に使用される。

「操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作された切断ハーフドメイン）を有する偏性ヘテロ二量体を形成するように修飾された切断ハーフドメインである。参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７０２１８５２８号、および同第２００８／０１３１９６２号も参照されたい。

「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、線状、環状、または分岐状であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。「ドナー配列」という用語は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さであってもよく、例えば、２〜１０，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間もしくはそれらを超える任意の整数値）、好ましくは、約１００〜１，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間の任意の整数）、より好ましくは、約２００〜５００ヌクレオチド長であってもよい。

「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大半は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４をそれぞれ２つ含む八量体と会合した約１５０個の塩基対のＤＮＡを含み、（生物に応じて多様な長さの）リンカーＤＮＡは、ヌクレオソームコアの間に広がって存在する。ヒストンＨ１の分子は、概して、リンカーＤＮＡと会合している。本開示の目的のために、「クロマチン」という用語は、すべての種類の細胞核タンパク質（原核および真核の両方）を包含することを意味する。細胞クロマチンは、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方を含む。

「染色体」は、細胞のゲノムのすべてまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、その核型を特徴とし、これは、この細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合である。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含み得る。

「エピソーム」は、複製核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造物である。エピソームの例として、プラスミドおよびあるウイルスゲノムが挙げられる。

「標的部位」または「標的配列」は、結合分子が結合する核酸の一部を定義する核酸配列であるが、但し、結合に十分な条件が存在することを条件とする。

「外因性」分子は、通常は細胞に存在しないが、１つ以上の遺伝学的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞内に導入され得る分子である。「細胞における通常の存在」については、細胞の特定の発達段階および環境条件に対して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成人筋肉細胞に対して外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に対して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全型内因性分子の機能バージョン、または正常機能型内因性分子の機能不全バージョンを含み得る。

外因性分子は、とりわけ、小分子（コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成される小分子等）、または高分子（タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の修飾誘導体）、または上記の分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体であり得る。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であってもよく、線状、分岐状、または環状であってもよく、任意の長さであってもよい。核酸には、二重鎖を形成することができる核酸、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。

外因性分子は、内因性分子と同一の種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外因性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞に導入されるプラスミドもしくはエピソーム、または通常は細胞に存在しない染色体を含み得る。外因性分子を細胞に導入するための方法は、当業者に既知であり、脂質媒介導入（すなわち、中性脂質および陽イオン性脂質を含むリポソーム）、電気穿孔、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介導入、およびウイルスベクター媒介導入を含むが、これらに限定されない。外因性分子は、内因性分子と同一の種類の分子でもあり得るが、細胞が由来するものとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列は、本来はマウスまたはハムスターに由来する細胞系に導入され得る。

対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階にある特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、クロロプラスト、もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含み得る。

「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が好ましくは共有結合的に連結した分子である。サブユニット分子は、同一の化学的種類の分子であり得るか、または異なる化学的種類の分子であり得る。第１の種類の融合分子の例として、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと１つ以上のヌクレアーゼドメインまたは転写制御ドメイン、例えば、活性化ドメインまたは抑制ドメインとの間の融合物）および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第２の種類の融合分子の例として、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝結合剤と核酸との間の融合物が挙げられるが、これらに限定されない。

細胞における融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達から、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達によって生じ得、ここで、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断、およびポリペプチド連結も、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを細胞に送達するための方法は、本開示の他の個所で示される。

本開示の目的のために、「遺伝子」は、遺伝子産物（以下を参照のこと）をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域（そのような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているか否かに関わらず）を含む。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列（リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位等）、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位、および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない。

「遺伝子発現」とは、遺伝子内に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、もしくは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含む。

遺伝子発現の「調整（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調整は、遺伝子活性化および遺伝子抑制を含み得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、切断、改変、不活性化、ランダム変異）を用いて発現を調整することができる。遺伝子の不活性化とは、本明細書に記載のＺＦＰを含まない細胞と比較して遺伝子発現における任意の低下を指す。したがって、遺伝子の不活性化は、部分的または完全であり得る。

「目的とする領域」は、細胞クロマチンの任意の領域であり、例えば、遺伝子、または遺伝子内もしくは遺伝子に隣接する非コード配列等であり、そこで外因性分子に結合することが望ましい。結合は、標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組換えの目的のためであり得る。目的とする領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、クロロプラスト）、または感染ウイルスゲノムに存在し得る。目的とする領域は、遺伝子のコード領域内、転写された非コード領域（例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロン等）内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内に存在し得る。目的とする領域は、単一のヌクレオチド対と同程度に小さいか、または最大２，０００ヌクレオチド対の長さであるか、またはヌクレオチド対の任意の整数値であり得る。

「真核」細胞には、真菌細胞（酵母等）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が含まれるが、これらに限定されない。

「作用的連結」および「作用的に連結した」（または「作動可能に連結した」）という用語は、２つ以上の構成要素（配列エレメント等）の並列に関して交換可能に使用され、これらの構成要素は、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが他の構成要素のうちの少なくとも１つに及ぼす機能を媒介し得ることを可能にするように配置される。例として、プロモーター等の転写調節配列は、その転写調節配列が１つ以上の転写調節因子の存在または不在に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合にコード配列に作用的に連結される。転写調節配列は、概して、コード配列とシスに作用的に連結されるが、それに直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、たとえそれらが隣接していなくても、コード配列に作用的に連結される転写調節配列である。

融合ポリペプチドに関して、「作用的に連結した」という用語は、構成要素の各々が、そのように連結されていない場合に実行したであろう機能と同一の機能を、他の構成要素と連結して実行するという事実を指し得る。例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＰ、ＴＡＬＥ）を切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ等のエンドヌクレアーゼドメイン、メガヌクレアーゼドメイン等）に融合する融合ポリペプチドに関しては、融合ポリペプチドにおいて、ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、一方、切断（ヌクレアーゼ）ドメインが標的部位の近傍でＤＮＡを切断することができるならば、ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは作用的に連結している。ヌクレアーゼドメインはまた、ＤＮＡ結合能力を提示することができる（例えば、ＤＮＡにも結合することができるＺＦＰまたはＴＡＬＥドメインに融合したヌクレアーゼ）。同様に、ＤＮＡ結合ドメインが活性化または抑制ドメインに融合した融合ポリペプチドに関しては、融合ポリペプチドにおいて、ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／もしくはその結合部位に結合でき、一方、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することができるか、または抑制ドメインが遺伝子発現を下方制御することができるならば、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化または抑制ドメインは作用的に連結している。

タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的断片」は、その配列が、完全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、完全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一の機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子よりも多いか、少ないか、もしくは同一の数の残基を有することができ、かつ／または１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当技術分野において周知である。同様に、タンパク質の機能を決定するための方法も周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によって評価することができる。上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または相補性（遺伝子的相補性もしくは生化学的相補性の両方）によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６、米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／４４３５０号を参照されたい。

「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」は、目的とする遺伝子の発現を指示することができ、かつ遺伝子配列を標的細胞に導入し得る任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニング、および発現ビヒクル、ならびに組み込みベクターを包含する。

「セーフハーバー」遺伝子座とは、宿主細胞にいかなる有害な影響も及ぼすことなく遺伝子を挿入することができるゲノム内の遺伝子座である。挿入された遺伝子配列の発現が近隣の遺伝子からのいかなるリードスルー発現によっても撹乱されないセーフハーバー遺伝子座が最も有益である。ヌクレアーゼ（複数可）によって標的化されるセーフハーバー遺伝子座の非限定的な例には、ＣＣＲ５、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａおよびアルブミンが挙げられる。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；同第８，５８６，５２６号；米国特許公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号；同第２０１３０１７７９６０号および同第２０１３０１２２５９１号ならびに米国特許出願第１４／２７８，９０３号を参照されたい。
ヌクレアーゼ

被験体からの、または被験体における細胞のゲノムにおけるドナー配列の組み込みに有用な組成物、特に、ヌクレアーゼが本明細書に記載されている。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、天然に存在する。他の実施形態において、ヌクレアーゼは、天然に存在しない、すなわち、ＤＮＡ結合ドメインおよび／または切断ドメインにおいて操作されている。例えば、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位に結合するよう改変されていてよい（例えば、同族結合部位とは異なる部位に結合するよう操作されたメガヌクレアーゼ）。他の実施形態において、ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合および切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクタードメインＤＮＡ結合タンパク質、異種の切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインまたはｍｅｇａＴＡＬｓ：ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合タンパク質とホーミングエンドヌクレアーゼもしくはメガヌクレアーゼの間の融合物および／またはＴｔａｇｏまたは操作された単鎖ガイドＲＮＡを利用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を含む。

Ａ．ＤＮＡ結合ドメイン
ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼのＤＮＡ結合部分、Ｔｔａｇｏヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインが挙げられるがこれらに限定されない、任意のＤＮＡ結合ドメインを、本明細書に開示されている組成物および方法において使用することができる。

ＤＮＡ結合ドメインは、任意の標的配列に結合することができる。ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、内因性配列、例えば、ゲノム内のセーフハーバーに結合する。１つまたは複数のヌクレアーゼ（複数可）のＤＮＡ結合ドメインによって標的化され得るセーフハーバー遺伝子座の非限定的な例には、ＣＣＲ５、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａおよびアルブミンが挙げられる。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；同第８，５８６，５２６号；米国特許公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号および同第２０１３０１７７９６０号ならびに米国特許出願第１４／２７８，９０３号を参照されたい。

ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、天然に存在する、または操作された（天然に存在しない）メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）である。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼには、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。これらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら、（１９８９年）Ｇｅｎｅ ８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら、（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２巻、１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら、（１９９６年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら、（１９９８年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２８０巻：３４５〜３５３頁およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。操作されたメガヌクレアーゼは、例えば、米国特許公開第２００７０１１７１２８号に記載されている。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ全体として改変することができるか（すなわち、ヌクレアーゼが同族切断ドメインを含むように）、または異種の切断ドメインに融合することができる。メガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインはまた、ヌクレアーゼ活性を提示する。

他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するか、または操作された（天然には存在しない）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８９，５２６号を参照されたい。キサントモナス属の植物病原性細菌は、重要な作物に多くの病害を引き起こすことで知られている。キサントモナスの病原性は、２５個を超える異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注入する保存ＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されるタンパク質の中には、植物の転写活性化因子を模倣し、かつ植物のトランスクリプトームを操る転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターがある（Ｋａｙら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４８−６５１を参照のこと）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む。最もよく特徴付けられたＴＡＬ−エフェクターのうちの１つに、キサントモナス・カンペストリス病原型ベシカトリア由来のＡｖｒＢｓ３がある（Ｂｏｎａｓら（１９８９）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１８：１２７−１３６および国際公開第ＷＯ２０１００７９４３０号を参照のこと）。ＴＡＬ−エフェクターは、タンデム反復の集中ドメイン（ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ ｄｏｍａｉｎ）を含み、それぞれの反復は、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性に重要な約３４個のアミノ酸を含有する。加えて、これらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含む（概説については、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ Ｓ，ら（２００６）Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６３（３）：２５６−２７２を参照のこと）。加えて、植物病原性細菌である青枯病菌において、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と称される２つの遺伝子は、青枯病菌の次亜種１株ＧＭＩ１０００および次亜種４株ＲＳ１０００において、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出されている（Ｈｅｕｅｒら（２００７）Ａｐｐｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ Ｍｉｃｒｏ ７３（１３）：４３７９−４３８４を参照のこと）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおいて１，５７５ｂｐの欠失分だけ異なる。しかしながら、両方の遺伝子産物は、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。

これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデム反復に見出される配列に左右される。反復した配列には約１０２ｂｐが含まれ、反復は典型的に互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓら、同書）。反復の多型は、通常１２位および１３位に位置し、１２位および１３位の高頻度可変二残基（反復可変二残基またはＲＶＤ領域）の正体と、ＴＡＬ−エフェクターの標的配列において近接したヌクレオチドの正体との間に１対１対応があるものと考えられる（ＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ、（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６巻：１５０１頁およびＢｏｃｈら（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６巻：１５０９〜１５１２頁を参照のこと）。実験的に、これらのＴＡＬ−エフェクターのＤＮＡ認識のための天然コードは、１２位および１３位（反復可変二残基またはＲＶＤ）のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ＩＮＧがＴに結合するように決定された。これらのＤＮＡ結合反復は新たな組み合わせおよび反復数でタンパク質に組み立てられて、新たな配列と相互作用し、植物細胞において非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工的な転写因子を作製する（Ｂｏｃｈら、同書）。

操作されたＴＡＬタンパク質はＦｏｋＩ切断ハーフドメインに連結して、非定型ＲＶＤを有するＴＡＬＥＮを含むＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）を生じる。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。したがって、一部の実施形態において、ＴＡＬＥＮはＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインおよび制限エンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ＦｏｋＩ）を含む。

一部の場合において、ＴＡＬ ＤＮＡ結合ドメインはホーミングエンドヌクレアーゼ／メガヌクレアーゼに連結して「ＭｅｇａＴＡＬ」を作製している。これらの融合タンパク質は、もちろん、操作されたヌクレアーゼによるいかなる部位以外（ｏｆｆ−ｓｉｔｅ）の切断も低下させるためにメガヌクレアーゼの低い切断頻度に依存する一方、部位特異的切断を方向付けるＴＡＬ ＤＮＡ結合ドメインを活用する（Ｂｏｉｓｓｅｌ（２０１３年）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １〜１１頁を参照のこと）。

さらに他の実施形態では、ＴＡＬＥＮはコンパクトＴＡＬＥＮを含む。これらは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインがＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに連結した単鎖融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインがＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに対してどこに位置するかに応じて、ＴＡＬＥ領域によって局在させられるニッカーゼとして作用するか、または二本鎖切断を生ずることができる（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙら、（２０１３年）Ｎａｔ Ｃｏｍｍ：１〜８ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２を参照のこと）。

加えて、本明細書に記載されているＴＡＬＥＮのヌクレアーゼドメインはまた、ＤＮＡ結合機能を提示することができ、任意のＴＡＬＥＮは１つまたは複数のｍｅｇａ−ＴＡＬＥを有する追加のＴＡＬＥＮ（例えば、１つまたは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮおよび／またはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ））と組み合わせて使用することができる。

ある実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択した標的部位に結合するように操作されるという点で非天然である。例えば、例えば、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏら（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌら（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏら（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３６号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号、および米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号を参照されたく、これらすべては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して新規の結合特異性を有し得る。操作方法には、合理的設計および種々の種類の選択が含まれるが、これらに限定されない。合理的設計には、例えば、三重鎖（ｔｒｉｐｌｅｔ）（または四重鎖（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ））ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用が含まれ、各三重鎖または四重鎖ヌクレオチド配列は、特定の三重鎖または四重鎖配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と会合している。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、共有の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。

ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む例示の選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびに国際公開第ＷＯ９８／３７１８６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、および英国特許第２，３３８，２３７号に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共有の国際公開第０２／０７７２２７号に記載されている。

さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ＤＮＡ結合ドメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を用いてともに連結され得る。例示の６アミノ酸長以上のリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。

一部の実施形態において、ＴＡＬＥＮはエンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。他の実施形態において、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼはｍｅｇａ ＴＡＬである。これらのｍｅｇａ ＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびメガヌクレアーゼ切断ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは、単量体として活性があり、活性のために二量体化を必要としない（Ｂｏｉｓｓｅｌら、（２０１３年）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ：１〜１３、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１２２４を参照のこと）。

さらに他の実施形態では、ヌクレアーゼはコンパクトＴＡＬＥＮを含む。これらは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインがＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに連結した単鎖融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインがＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに対してどこに位置するかに応じて、ＴＡＬＥ領域によって局在させられるニッカーゼとして作用するか、または二本鎖切断を生ずることができる（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙら、（２０１３年）Ｎａｔ Ｃｏｍｍ：１〜８ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２を参照のこと）。加えて、ヌクレアーゼドメインはまた、ＤＮＡ結合機能を呈することができる。任意のＴＡＬＥＮは１つまたは複数のｍｅｇａ−ＴＡＬＥを有する追加のＴＡＬＥＮ（例えば、１つまたは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ））と組み合わせて使用することができる。

標的部位の選択、および融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）を設計および構築するための方法は、当業者に知られており、米国特許第６，１４０，０８１号、同第５，７８９，５３８号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、国際公開第ＷＯ９５／１９４３１号、同第ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、同第ＷＯ０２／０９９０８４号、同第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号、および同第ＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されている。

加えて、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を用いてともに連結され得る。例示の６アミノ酸長以上のリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。

一部の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインはＴｔＡｇｏ系の一部である（Ｓｗａｒｔｓら、同書；Ｓｈｅｎｇら、同書を参照のこと）。真核細胞において、遺伝子サイレンシングは、アルゴノート（Ａｇｏ）ファミリーのタンパク質によって媒介される。このパラダイムにおいて、Ａｇｏは小さな（１９〜３１ｎｔ）ＲＮＡに結合される。このタンパク質−ＲＮＡサイレンシング複合体は、小さなＲＮＡと標的の間のワトソンクリック塩基対形成を介して標的ＲＮＡを認識し、標的ＲＮＡをエンドヌクレアーゼとして（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ）切断する（Ｖｏｇｅｌ（２０１４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４４巻：９７２〜９７３頁）。対照的に、原核細胞Ａｇｏタンパク質は小さな一本鎖ＤＮＡ断片に結合し、外来性（しばしばウイルス性の）ＤＮＡを検出して除去するように機能するようである（Ｙｕａｎら、（２００５年）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ １９巻、４０５頁；Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖら、（２０１３年）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ ５１巻、５９４頁；Ｓｗａｒｔｓら、同書）。例示的な原核生物Ａｇｏタンパク質には、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のタンパク質が挙げられる。

最もよく特徴付けられた原核生物Ａｇｏタンパク質の１つは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のタンパク質である（ＴｔＡｇｏ；Ｓｗａｒｔｓら、同書）。ＴｔＡｇｏは５’リン酸基を有する１５ｎｔまたは１３〜２５ｎｔの一本鎖ＤＮＡ断片と会合する。ＴｔＡｇｏが結合したこの「ガイドＤＮＡ」は、タンパク質−ＤＮＡ複合体がＤＮＡのサードパーティー分子におけるワトソン−クリック相補的ＤＮＡ配列に結合するように方向付けるために役立つ。一旦、これらのガイドＤＮＡにおける配列情報によって標的ＤＮＡの特定が可能になったら、ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体は標的ＤＮＡを切断する。このような機構はまた、その標的ＤＮＡに結合する間のＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体の構造によって支持される（Ｇ． Ｓｈｅｎｇら、同書）。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のＡｇｏ（ＲｓＡｇｏ）は、類似の特性を有する（Ｏｌｉｖｎｉｋｏｖら、同書）。

任意のＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡは、ＴｔＡｇｏタンパク質に負荷することができる（Ｓｗａｒｔｓら、同書）。ＴｔＡｇｏ切断の特異性はガイドＤＮＡによって方向付けられるので、したがって、研究者が特定した外因性ガイドＤＮＡによって形成されるＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体は、ＴｔＡｇｏ標的ＤＮＡ切断を研究者が特定した相補的な標的ＤＮＡに方向付ける。このようにして、ＤＮＡにおいて標的化二本鎖切断を作製することができる。ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系（または他の生物由来のオルソログであるＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系）の使用によって、細胞内のゲノムＤＮＡの標的化切断が可能である。このような切断は、一本鎖または二本鎖であることができる。哺乳動物のゲノムＤＮＡの切断の場合、哺乳動物細胞における発現のために最適化されたＴｔＡｇｏコドンのバージョンを使用することが好ましい。さらに、ＴｔＡｇｏタンパク質が細胞貫通ペプチドに融合した、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて形成されたＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体で細胞を処置することが好ましい場合がある。さらに、変異誘発によって摂氏３７度で活性が増強するように改変されたＴｔＡｇｏタンパク質のバージョンを使用することが好ましい場合がある。Ａｇｏ−ＲＮＡ媒介性ＤＮＡ切断は、ＤＮＡ切断を活用するために当該分野で標準的な技法を使用する遺伝子ノックアウト、標的化遺伝子付加、遺伝子修正、標的化遺伝子欠失を含む、一連の結果に影響を及ぼすように使用することができた。

ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む。この系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔でクラスター化された短鎖反復回文配列）遺伝子座と、タンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎら、２００２年、Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３巻：１５６５〜１５７５頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０巻：４８２〜４９６頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６年、Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ １巻：７頁；Ｈａｆｔら、２００５年、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ．１巻：ｅ６０頁）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラムすることができる、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子と非コードＲＮＡエレメントの組み合わせを含有する。

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系の１つであり、連続的４ステップで標的化ＤＮＡ二本鎖切断を行う。第一に、２種の非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第二に、ｔｒａｃｒＲＮＡが、プレｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズし、プレｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介して、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡとする。第三に、ｃｒＲＮＡにおけるスペーサーと、標的認識の追加的な要件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）のとなりの標的ＤＮＡにおけるプロトスペーサーとの間のワトソンクリック塩基対形成により、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、標的ＤＮＡにＣａｓ９を方向付ける。最後に、Ｃａｓ９が、標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を生じる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３ステップからなる：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおける、将来的な攻撃を防止するための、ＣＲＩＳＰＲアレイへの異質（ａｌｉｅｎ）ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連するタンパク質の発現ならびにアレイの発現およびプロセシングと、続く（ｉｉｉ）異質核酸のＲＮＡ媒介性干渉。したがって、細菌細胞において、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然機能に関与し、異質ＤＮＡの挿入等、機能における役割を果たす。

ある特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であり得る。ネイティブ配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、ネイティブ配列ポリペプチドと共通した定性的生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」として、対応するネイティブ配列ポリペプチドと共通した生物学的活性を有するのであれば、ネイティブ配列の断片ならびにネイティブ配列ポリペプチドおよびその断片の誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書に企図される生物学的活性とは、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的誘導体の能力である。「誘導体」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合性修飾物およびこれらの融合物の両方を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の好適な誘導体として、Ｃａｓタンパク質またはその断片の変異体、融合物、共有結合性修飾物が挙げられるがこれらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはその断片およびＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体を含むＣａｓタンパク質は、細胞から得ることができるもしくは化学的に合成することができるまたはこれら２つの手順の組み合わせによるものであることができる。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、あるいはＣａｓタンパク質を天然に産生し、より高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産生するように、または内因性Ｃａｓと同じもしくは異なるＣａｓをコードする外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であり得る。場合によっては、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するよう遺伝子操作されている。

セーフハーバーおよび他の遺伝子に標的化される例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、例えば、米国出願第１４／２７８，９０３号に開示されている。

したがって、ヌクレアーゼは、任意の遺伝子における標的部位に特異的に結合する任意のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥ、単鎖ガイドＲＮＡ）を含むことができる。

Ｂ．切断ドメイン
任意の好適な切断ドメインをＤＮＡ結合ドメインに作用的に連結して、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系等、ヌクレアーゼを形成することができる。

上に記す通り、切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の切断ドメイン、またはＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメイン）は、ＤＮＡ結合ドメインに対し異種であり得る。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼとして、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、２００２〜２００３年カタログ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加的な酵素は、公知のものである（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ Ｉ；ミクロコッカスヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ； Ｌｉｎｎら（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９３年も参照のこと）。これらの酵素（またはその機能断片）のうち１つまたは複数は、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの源として使用することができる。

同様に、上記のように、切断活性のために二量体化を必要とする切断ハーフドメインは、任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。概して、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が切断に必要とされる。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質が用いられ得る。２つの切断ハーフドメインは同一のエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能的断片）に由来し得るか、または各切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能的断片）に由来し得る。加えて、２つの融合タンパク質のそれらの各標的部位への結合が、互いに空間的定位でこれらの切断ハーフドメインを配置して、例えば二量体化によって切断ハーフドメインが機能的切断ドメインを形成することを可能にするように、２つの融合タンパク質の標的部位は、好ましくは、互いに対して配置される。したがって、ある実施形態において、標的部位の近端は、５〜８個のヌクレオチドまたは１５〜１８個のヌクレオチド分だけ離れている。しかしながら、任意の数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対は、２つの標的部位の間に介在してもよい（例えば、２〜５０個以上のヌクレオチド対）。概して、切断部位は、標的部位の間に存在する。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに配列特異的に結合し（認識部位で）、かつ結合部位でまたはその付近でＤＮＡを切断することができる。ある制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素Ｆｏｋ Ｉは、一方の鎖上でその認識部位から９ヌクレオチド離れた位置で、他方の鎖上でその認識部位から１３ヌクレオチド離れた位置でＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４、ならびにＬｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２７５−４２７９、Ｌｉら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２７６４−２７６８、Ｋｉｍら（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８３−８８７、Ｋｉｍら（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）および１つ以上のジンクフィンガー結合ドメイン（操作され得るか否かに関わらず）を含む。

その切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示のＩＩＳ型制限酵素は、Ｆｏｋ Ｉである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示の目的のために、開示される融合タンパク質において使用されるＦｏｋ Ｉ酵素の一部は、切断ハーフドメインと見なされる。したがって、ジンクフィンガー−Ｆｏｋ Ｉ融合物を用いた細胞配列の標的化二本鎖切断および／または標的化置き換えのために、それぞれＦｏｋ Ｉ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を用いて、触媒的に活性な切断ドメインを再構築することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋ Ｉ切断ハーフドメインを含む単一のポリペプチド分子を用いることもできる。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した標的化切断および標的化配列改変のためのパラメータは、本開示の他のところで提供されている。

切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持するか、または多量体化（例えば、二量体化）して機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であり得る。

例示のＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号に記載されている。さらなる制限酵素も分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを含み、これらは、本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照されたい。

ある実施形態において、切断ドメインは、例えば、すべての開示が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００７０３０５３４６号および同第２００８０１３１９６２号に記載されるように、ホモ二量体化を最小限に抑えるか、または阻止する１つ以上の操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも称される）を含む。Ｆｏｋ Ｉの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８位のアミノ酸残基は、すべてＦｏｋ Ｉ切断ハーフドメインの二量体化に影響を与える標的である。

偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋ Ｉの例示の操作された切断ハーフドメインには、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋ Ｉの４９０位および５３８位のアミノ酸残基に変異を含み、かつ第２の切断ハーフドメインが４８６位および４９９位のアミノ酸残基に変異を含む対が含まれる。

したがって、一実施形態において、４９０位における変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え、５３８位における変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え、４８６位における変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置き換え、４９９位における変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換える。具体的には、本明細書に記載の操作された切断ハーフドメインを１つの切断ハーフドメインにおいて４９０位での変異（Ｅ→Ｋ）および５３８位での変異（Ｉ→Ｋ）によって調製して「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と称される操作された切断ハーフドメインを生成し、別の切断ハーフドメインにおいて４８６位での変異（Ｑ→Ｅ）および４９９での変異（Ｉ→Ｌ）によって調製して「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と称される操作された切断ハーフドメインを生成した。本明細書に記載の操作された切断ハーフドメインは、異常な切断が最小限に抑えられるか、または無効にされる偏性ヘテロ二量体変異体である。例えば、米国特許第７，９１４，７９６号を参照されたく、この開示は、参照によりその全体がすべての目的のために組み込まれる。

ある実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、４８６、４９９、および４９６位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けられた）での変異、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で、かつ４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）変異を含む。他の実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、４９０、５３８、および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けられた）での変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、かつ５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）変異を含む。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、４９０および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対する番号付け）での変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、かつ５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される）変異を含む。（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，６２３，６１８号を参照されたい））。他の実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、「Ｓｈａｒｋｅｙ」および／または「Ｓｈａｒｋｅｙ」変異を含む（Ｇｕｏら、（２０１０年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．４００巻（１号）：９６〜１０７頁を参照のこと）。

本明細書に記載の操作された切断ハーフドメインは任意の好適な方法を用いて、例えば、米国特許第７，８８８，１２１号、同第７，９１４，７９６号、同第８，０３４，５９８号、および同第８，８２３，６１８号に記載の野生型切断ハーフドメイン（Ｆｏｋ Ｉ）の部位特異的変異誘発によって調製され得る。

あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術を用いて、核酸標的部位においてインビボで組み立てられ得る（例えば、米国特許公開２００９００６８１６４号を参照のこと）。そのようなスプリット酵素の構成要素は、別個の発現構築物のいずれかで発現され得るか、または個々の構成要素が例えば自己切断２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって分離される１つのオープンリーディングフレームにおいて連結され得る。構成要素は、個々のジンクフィンガー結合ドメインであり得るか、またはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。

ヌクレアーゼは、例えば、国際公開第ＷＯ２００９／０４２１６３号および同第２００９００６８１６４号に記載の酵母ベースの染色体系において、使用前に活性についてスクリーニングすることができる。ヌクレアーゼ発現構築物は、当技術分野で既知の方法を用いて容易に設計することができる。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号、同第８，４０９，８６１号、同第７，９７２，８５４号、同第７，９１４，７９６号、同第７，９５１，９２５号、同第７，９１９，３１３号、および米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号、および国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号を参照されたい。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化（脱抑制）され、かつグルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあり得る。

したがって、ヌクレアーゼは、ドナー（導入遺伝子）を挿入することが望ましい任意の部位を特異的に標的化する。

標的部位
上で詳細に記載されるように、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、アルブミン、Ｒｏｓａ、ＣＸＣＲ４およびＡＡＶＳ１などのセーフハーバー遺伝子座における任意の選択した配列に結合するように操作され得る。操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するＤＮＡ結合ドメインと比較して新規の結合特異性を有し得る。操作方法には、合理的設計および種々の種類の選択が含まれるが、これらに限定されない。合理的設計は、例えば、三重鎖（または四重鎖）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、各三重鎖または四重鎖ヌクレオチド配列は、特定の三重鎖または四重鎖配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と会合している。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、共有の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。ＴＡＬエフェクタードメインの合理的設計も実行され得る。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。

ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含むＤＮＡ結合ドメインに適用可能な例示の選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびに国際公開第ＷＯ９８／３７１８６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、そして英国特許第ＧＢ２，３３８，２３７号に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共有の国際公開第ＷＯ０２／０７７２２７号に記載されている。

標的部位の選択、ヌクレアーゼ、および融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）を設計および構築するための方法は、当業者に知られており、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および同第２００６０１８８９８７号に詳細に記載されている。

加えて、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガージンクフィンガータンパク質）は、例えば、５アミノ酸以上のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を用いてともに連結され得る。例示の６アミノ酸長以上のリンカー配列については、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のＤＮＡ結合ドメイン間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。米国特許第８，５８６，５２６号も参照されたい。

障害を有する被験体において異常に発現される１つまたは複数のタンパク質の機能性バージョンをコードする配列の標的化挿入によって、障害（例えば、血友病、リソソーム蓄積障害（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、代謝障害、異常ヘモグロビン症）を処置するために、被験体のゲノムにおける任意の所望の挿入部位をヌクレアーゼで切断し、タンパク質をコードする配列を保有するドナーポリヌクレオチドの標的化挿入を刺激する。ヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ゲノムにおける任意の所望の部位を標的化することができる。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、内因性セーフハーバー遺伝子座、例えば、内因性アルブミン遺伝子座を標的化する。
ドナー配列

１つまたは複数のＤＮＡ配列を含む任意のドナー配列は、本明細書に記載されている方法を使用して組み込むことができる。タンパク質が異常に発現される（欠如している、および／または非機能性である）障害を処置するために、ドナー配列（「外因性配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも呼ばれる）は、ドナー組み込み後に機能性タンパク質をコードして発現する配列を生じるようにタンパク質の機能性バージョンをコードする配列またはその一部を含む。好適なタンパク質の非限定的な例には、血友病の処置のための凝固因子タンパク質導入遺伝子、例えば、第ＶＩＩ因子（Ｆ７）、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８）、第ＩＸ因子（Ｆ９もしくはＦ．ＩＸもしくはＦＩＸ）および／または第Ｘ因子（Ｆ１０もしくはＦＸ）が挙げられ、これらのタンパク質の機能性断片が含まれる。ある特定の実施形態において、Ｆ８タンパク質のＢ−ドメインが欠失している。例えば、Ｃｈｕａｈら、（２００３年）Ｂｌｏｏｄ １０１巻（５号）：１７３４〜１７４３頁を参照されたい。他の実施形態において、導入遺伝子は、ドナー組み込み後に機能性Ｆ．ＩＸタンパク質をコードして発現する配列を生じるために、機能性Ｆ．ＩＸタンパク質をコードする配列またはその一部を含む。米国特許出願第１４／５６５，０１４号も参照されたい。

ドナー分子は、内因性遺伝子の全部、一部が発現するか、または全く発現しないように、内因性遺伝子に挿入することができる。例えば、本明細書に記載されているような機能性タンパク質配列を含む導入遺伝子は、内因性アルブミンの一部が導入遺伝子とともに発現するか、または全く発現しないように内因性アルブミン遺伝子座に挿入することができる。

ドナー（導入遺伝子）配列は、融合タンパク質（複数可）（例えば、ヌクレアーゼ）の発現と逐次的に（例えば、その前または後に）細胞に導入される。ドナーポリヌクレオチドは、ドナーポリヌクレオチドとドナーポリヌクレオチドが相同性を有するゲノム配列との間の相同組換え（または相同組換え修復）を支持するために、ゲノム配列に対して十分相同性（連続または不連続領域）を含有することができるか、あるいは、ドナー配列は非ＨＤＲ機構（例えば、ＮＨＥＪドナー捕捉）によって組み込まれ得、この場合、ドナーポリヌクレオチド（例えば、ベクター）が細胞クロマチンにおける目的の領域に相同な配列を含有する必要はない。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号および同第７，９７２，８４３号ならびに米国特許第８，７０３，４８９号ならびに米国特許公開第２０１１０２８１３６１号および同第２０１１０２０７２２１号を参照されたい。

ドナー配列はまた、内因性遺伝子の遺伝子修正または改変のために使用することができる。このようなドナーは、内因性遺伝子における変異を修正するために使用されるオリゴヌクレオチドであり得るか、または遺伝子産物特性の改善を付与するように野生型配列を改変するために使用することができる。ドナーはまた、コード配列、調節配列または他の非コード配列における配列を修正または改変するために使用することができる。

ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖、二本鎖または部分的に一本鎖および部分的に二本鎖であってもよく、線状または環状（例えば、ミニサークル）形態で細胞に導入され得る。例えば、米国特許第８，７０３，４８９号ならびに米国特許出願公開第２０１１０２８１３６１号および同第２０１１０２０７２２１号を参照されたい。線状形態で導入される場合、当業者に公知の方法により、ドナー配列の末端を保護することができる（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）。例えば、１つまたは複数のジデオキシヌクレオチド残基が、線状分子の３’末端に付加される、および／または自己相補的オリゴヌクレオチドが、一方または両方の末端に連結される。例えば、Ｃｈａｎｇら（１９８７年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４巻：４９５９〜４９６３頁；Ｎｅｈｌｓら（１９９６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２巻：８８６〜８８９頁を参照されたい。分解から外因性ポリヌクレオチドを保護するための追加的な方法として、末端アミノ基（複数可）の付加、ならびに例えばホスホロチオエート、ホスホルアミデートおよびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基等の修飾ヌクレオチド間結合の使用が挙げられるがこれらに限定されない。ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーターおよび抗生物質耐性をコードする遺伝子等、追加的な配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として、リポソームまたはポロキサマー等の作用物質と複合体形成した核酸として導入することができる、あるいはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス）により送達することができる。

ドナーは一般に、その発現が、組み込み部位における内因性プロモーター（例えば、ドナーが患者のアルブミン遺伝子座に組み込まれる場合の内因性アルブミンプロモーター）により駆動されるように挿入される。したがって、導入遺伝子は、代表的に、その発現を駆動する制御エレメント（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）を欠く（例えば、「プロモーターのない構築物」ともいわれる）。それにも拘わらず、ドナーが、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、組み込みの際に機能性タンパク質の発現を駆動する構成的プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的（例えば、肝臓または血小板特異的）プロモーターを含んでいてもよいことは明白である。

ドナー配列は、選択した任意の標的部位に特異的に組み込むことができ、それによって伝統的な遺伝子療法におけるランダム組み込みに関連した問題を排除することができる。

内因性（例えば、アルブミン）配列が導入遺伝子とともに発現するとき、内因性配列は完全長配列（野生型もしくは変異体）または部分配列であり得る。好ましくは、アルブミン配列は機能性である。ある特定の実施形態において、内因性配列は、（内因性遺伝子座由来または導入遺伝子の一部として）導入遺伝子とともに発現することができるアルブミン配列である。これらの完全長または部分アルブミン配列の機能の非限定的な例として、導入遺伝子（例えば、治療用遺伝子）により発現されるポリペプチドの血清半減期の増加および／または担体としての作用が挙げられる。

さらに、発現に必要とされないが、外因性配列は、転写または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドおよび／またはポリアデニル化シグナルをコードする配列を含むこともできる。

ドナー配列のいずれかは、１つまたは複数の以下の修飾：コドン最適化（例えば、ヒトコドンへの）および／または１つもしくは複数のグリコシル化部位の付加を含むことができる。例えば、ＭｃＩｎｔｏｓｈら、（２０１３年）Ｂｌｏｏｄ（１７巻）：３３３５〜４４頁を参照されたい。

送達
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載のタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段によってインビボまたはエクスビボで送達され得る。

本明細書に記載のヌクレアーゼを送達する方法は、例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号に記載されており、これらのすべての開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物も、ジンクフィンガータンパク質（複数可）、ＴＡＬＥＮタンパク質（複数可）および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のうちの１つ以上をコードする配列を含むベクターを用いて送達され得る。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター等を含むが、これらに限定されない任意のベクター系を用いてもよい。米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号も参照されたく、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。さらに、これらのベクターのいずれも必要とされる配列のうちの１つ以上を含み得ることは明らかである。したがって、１つ以上のヌクレアーゼおよびドナー構築物が細胞に導入される場合、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、同一のベクター上または異なるベクター上に担持され得る。複数のベクターが使用される場合、各ベクターは、１つまたは複数のヌクレアーゼおよび／もしくはドナー構築物をコードする配列を含み得る。ある特定の実施形態において、導入遺伝子およびヌクレアーゼ（複数可）の両方を運ぶために１つのベクターを使用する。他の実施形態において、２つのベクターを使用し（同じまたは異なる種類のベクター）、一方のベクターがヌクレアーゼ（複数可）（例えば、ＺＦＮ対の左右のＺＦＮ、例えば、２Ａペプチドを有する）を運び、一方が導入遺伝子を運ぶ。さらに他の実施形態において、３つのベクターを使用して、第１のベクターがヌクレアーゼ対の一方のヌクレアーゼ（例えば、左ＺＦＮ）を運び、第２のベクターがヌクレアーゼ対の他方のヌクレアーゼ（例えば、右ＺＦＮ）を運び、第３のベクターが導入遺伝子を運ぶ。

ドナーおよび／またはヌクレアーゼは、任意の好適な濃度で使用することができる。ある特定の実施形態において、ドナーおよび別々のヌクレアーゼベクター（複数可）を同じ濃度で使用する。他の実施形態において、ドナーおよび別々のヌクレアーゼベクター（複数可）を異なる濃度で、例えば、１つのベクターが他の２、３、４、５、１０倍またはそれ超で使用する（例えば、ドナーベクター（複数可）はヌクレアーゼベクター（複数可）よりも多い）。ＡＡＶベクターを送達のために使用するとき、例えば、ドナーおよび／またはヌクレアーゼを含むウイルスベクター（複数可）は、用量当たり１×１０^８〜１×１０^１３粒子の間である（例えば、細胞または動物）。

従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入方法を用いて、ヌクレアーゼおよびドナー構築物をコードする核酸を細胞（例えば、哺乳類細胞）および標的組織に導入することができる。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマー等の送達ビヒクルとの複合型の核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスを含む。操作されたＤＮＡ結合タンパク質およびこれらの結合タンパク質を含む融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ送達の概説については、例えば、Ｒｅｂａｒ（２００４年）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｒｕｇｓ １３巻（７号）：８２９〜８３９頁；Ｒｏｓｓｉら、（２００７年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２５巻（１２号）：１４４４〜１４５４頁ならびに一般的な遺伝子送達の文献、例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）、Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７（１９９３）、Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６（１９９３）、Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５（１９９３）、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）、Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６（１９９５）、Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４（１９９５）、Ｈａｄｄａｄａら，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｍ（編）（１９９５）、およびＹｕら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６（１９９４）を参照されたい。

核酸の非ウイルス送達の方法は、電気穿孔、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および作用物質によって強化されたＤＮＡの取り込みを含む。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を用いたソノポレーションも、核酸の送達のために使用され得る。

さらなる例示の核酸送達系は、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃによって提供されるものを含む（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照のこと）。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性脂質および中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第ＷＯ９１／１７４２４号、同第ＷＯ９１／１６０２４号に記載のものを含む。

免疫脂質複合体等の標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅら，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）、Ｇａｏ ｅｔら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照のこと）。

さらなる送達方法は、送達される核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）へのパッケージングの使用を含む。これらのＥＤＶは、二重特異性抗体を用いて標的組織に特異的に送達され、この抗体の一方のアームは、標的組織に対する特異性を有し、他方のアームは、ＥＤＶに対する特異性を有する。この抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、その後、ＥＤＶは、エンドサイトーシスによって細胞内に運び込まれる。一旦細胞内に運び込まれると、その内容物は放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（７）：６４３を参照のこと）。

操作されたヌクレアーゼおよび／またはドナーをコードする核酸を送達するためのＲＮＡウイルスベースのまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルス負荷量を核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与され得るか（インビボ）、またはインビトロで細胞を処置するために使用され得、修飾細胞が患者に投与される（エクスビボ）。ヌクレアーゼおよび／またはドナーを送達するための従来のウイルスベースの系は、遺伝子導入用のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスによる遺伝子導入方法を用いて可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、高い形質導入効率が多くの異なる細胞型および標的組織において観察されている。

レトロウイルスの向性を、外来性エンベロープタンパク質を組み込むことによって変化させ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡張することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入するか、または感染させることができ、かつ典型的には高いウイルス力価を生成するレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有する、シス作用性の長い末端反復配列からなる。最小のシス作用ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、これはその後、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで恒久的な導入遺伝子の発現を提供するために用いられる。一般に用いられているレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびこれらの組み合わせに基づくベクターを含む（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照のこと）。

一過性の発現が好ましい用途において、アデノウイルスベースの系を用いることができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において極めて高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高力価かつ高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純なシステムにおいて大量に生成することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターも、細胞を標的核酸で形質導入するために、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ生成において、かつインビボおよびエクスビボ遺伝子治療手順のために用いられる（例えば、Ｗｅｓｔら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、国際公開第ＷＯ９３／２４６４１号、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ９４：１３５１（１９９４）を参照のこと）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０（１９８４）、およびＳａｍｕｌｓｋｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含むいくつかの出版物に記載されている。

少なくとも６つのウイルスベクターのアプローチが、臨床試験における遺伝子導入に現在利用可能であり、それらは、形質導入剤を生成するためにヘルパー細胞系に挿入される遺伝子による欠損ベクターの補完に関与するアプローチを利用する。

ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験に使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら，Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８−３０５（１９９５）、Ｋｏｈｎら，Ｎａｔ． Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）、Ｍａｌｅｃｈら，ＰＮＡＳ ９４：２２ １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療用ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０（１９９５））。５０％以上の形質導入効率が、ＭＦＧ−Ｓパッケージングベクターにおいて観察されている（Ｅｌｌｅｍら，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）、Ｄｒａｎｏｆｆら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。

組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損性および非病原性パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく有望な代替の遺伝子送達系である。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノムへの組み込みに起因した効率的な遺伝子導入および安定した導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特徴である（Ｗａｇｎｅｒら，Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２−３（１９９８）、Ｋｅａｒｎｓら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。他のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０またはシュードタイプ化ＡＡＶ（ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ２／５、およびＡＡＶ２／６ならびに任意の新規ＡＡＶ血清型）の例が挙げられる）も本発明に従って使用することができる。

複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で生成することができ、いくつかの異なる細胞型を容易に感染させる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えるように操作され、その後、複製欠損ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増幅する。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉に見出されるもの等の非分裂の分化細胞を含む複数の種類の組織をインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、高い輸送能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射での抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療を含んだ（Ｓｔｅｒｍａｎら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例として、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：１ ５−１０（１９９６）、Ｓｔｅｒｍａｎら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７ １０８３−１０８９（１９９８）、Ｗｅｌｓｈら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）、Ａｌｖａｒｅｚら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）、Ｔｏｐｆら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）、Ｓｔｅｒｍａｎら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）が挙げられる。

宿主細胞を感染させることができるウイルス粒子を形成するために、パッケージング細胞が使用される。そのような細胞は、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞を含む。遺伝子治療に用いられるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする生産細胞系によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組み込み（適切な場合）に必要な最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。失われたウイルス機能は、パッケージング細胞系によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療に用いられるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組み込みに必要なＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含む細胞系内にパッケージングされる。細胞系は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。このヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のため、相当な量でパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性の高い熱処理によって減少させることができる。

多くの遺伝子治療の用途において、特定の組織型に対して高度の特異性を有する遺伝子治療ベクターが送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上のウイルスのコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることにより、所与の細胞型に対して特異性を有するように改変され得る。リガンドは、目的とする細胞型上に存在することが知られている受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するように改変することができ、その組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現するあるヒト乳がん細胞を感染させることを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、かつ、ウイルスが細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルスと標的細胞とのペアにまで拡張することができる。例えば、繊維状ファージは、実質的に任意の選択された細胞受容体に対する特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように操作され得る。上記の説明は、主としてウイルスベクターに適用されるが、同一の原理が非ウイルスベクターにも適用され得る。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取り込みを好む特定の取り込み配列を含むように操作され得る。

遺伝子治療ベクターは、以下に記載されるように、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所適用による個々の患者への投与によってインビボで送達することができる。あるいは、ベクターは、細胞、例えば、個々の患者から移植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）または万能ドナーの造血幹細胞等にエクスビボで送達することもでき、その後、該細胞が、通常はベクターを組み込んだ細胞の選択後に、患者に再移植される。

ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）は、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。あるいは、裸のＤＮＡは投与され得る。投与は、注射、注入、局所適用、および電気穿孔を含むが、これらに限定されない、通常、血液または組織細胞との最終的な接触へと分子を導入するために用いられる経路のうちのいずれかによる。そのような核酸を投与する好適な方法は、利用可能であって、かつ当業者に周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が用いられてもよいが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりも即時的かつより効果的な反応を提供することができる。

本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドおよび／またはドナー導入遺伝子ポリヌクレオチド）の導入に好適なベクターは、非組み込み型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）を含む。例えば、Ｏｒｙら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３８２−１１３８８、Ｄｕｌｌら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｙら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０、Ｆｏｌｌｅｎｚｉら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：２１７−２２２、米国特許公開第２００９／０５４９８５号を参照されたい。

薬学的に許容されるキャリアは、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によっても部分的に決定される。したがって、以下に記載されるように、多種多様な薬学的組成物の好適な製剤が利用可能である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７版，１９８９を参照のこと）。

ヌクレアーゼコード配列およびドナー構築物が同一または異なる系を用いて送達され得ることは明らかである。例えば、ヌクレアーゼおよびドナーは、同じベクターによって運ばれてもよい。あるいは、ドナーポリヌクレオチドは、プラスミドによって運ばれてもよく、１つ以上のヌクレアーゼは、ＡＡＶベクターによって運ばれてもよい。さらに、同一または異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内投与および／または筋肉内注射）によって異なるベクターが投与されてもよい。本明細書に記載されている方法において、ベクターは逐次的に投与され、典型的には最初にヌクレアーゼ（複数可）を投与して、その後導入遺伝子を投与する。ヌクレアーゼ（複数可）および／または導入遺伝子の複数回投与を実施することができる。

したがって、本開示は、タンパク質が異常に発現される任意の障害のｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおける処置を含む。処置することができる疾患の非限定的な例には、血友病（例えば、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９および／またはＦ１０のヌクレアーゼ媒介性組み込みを介して）、リソソーム蓄積症、代謝疾患、異常ヘモグロビン症および他の遺伝性疾患が含まれる。例えば、米国特許公開第２０１２０１２８６３５号；同第２０１４００９３９１３号；同第２０１４００８０２１６号および同第２０１４０１５５４６８号を参照されたい。

組成物は、血清、肝臓または標的細胞における治療用ポリペプチドの所望の濃度を得るために有効な量でヒト患者に投与される。投与は、ポリヌクレオチドを所望の標的細胞に送達する任意の手段によって行うことができる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの両方の方法が企図される。門脈への静脈内注射は、好ましい投与方法である。他のｉｎ ｖｉｖｏ投与様式には、例えば、肝臓の葉もしくは胆管への直接注射および肝動脈を通るものを含む肝臓に対して遠位の静脈内注射、肝実質への直接注射、肝動脈を介した注射、ならびに／または胆道系を通る逆行性注射が含まれる。Ｅｘ ｖｉｖｏ様式の投与には、切除した肝細胞または肝臓の他の細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける形質導入、続く形質導入し切除した肝細胞をヒト患者の門脈血管系、肝実質または胆道系へ戻す注入が含まれる、例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６巻：３３５〜３４１頁を参照されたい。

投与するヌクレアーゼ（複数可）およびドナーの有効量は、患者毎および目的の治療用ポリペプチドによって変化する。したがって、有効量は、組成物を投与する医師によって最も良く決定され、適切な投与量は、当業者によって容易に決定され得る。組み込みおよび発現のために十分な時間をおいた後（典型的に、例えば、４〜１５日間）、治療用ポリペプチドの血清または他の組織レベルを分析し、投与前の初期レベルと比較して、投与する量が低すぎるか、正しい範囲内か、または高すぎるかを決定する。初期およびその後の投与の好適なレジメンはまた可変であるが、初期投与、必要ならばその後の投与によって代表される。その後の投与は、毎日から毎年から数年毎の可変の間隔で投与することができる。当業者であれば、送達ベクターの免疫抑制によって形質導入の阻害または遮断を回避するために、適切な免疫抑制技法が推奨され得ることを理解する、例えば、Ｖｉｌｑｕｉｎら、（１９９５年）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、６巻：１３９１〜１４０１頁を参照されたい。

エクスビボ投与用の製剤およびインビボ投与用の製剤は両方ともに、液体中の懸濁液または乳化液を含む。有効成分は、多くの場合、薬学的に許容され、かつ有効成分と相溶性のある賦形剤と混合される。好適な賦形剤は、例えば、水、食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等、およびそれらの組み合わせを含む。加えて、組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、または医薬組成物の有効性を増強する他の試薬等の少量の補助物質を含有してもよい。

以下の実施例は、ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む、本開示の例示的な実施形態に関する。これが、例証のみを目的としており、他のヌクレアーゼ、例えば、操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）および／または天然に存在するもしくは操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインおよび異種切断ドメインの融合物、ＴＡＬＥＮ（ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメインおよび制限エンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼドメイン）、Ｔｔａｇｏヌクレアーゼおよび／または操作された単鎖ガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用することができることが理解されよう。

（実施例１）
ヒト初代肝細胞におけるＺＦＮ−ヌクレアーゼ（ｍＲＮＡ）およびドナー−ＡＡＶの添加順序の最適化
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＺＦＮをコードするｍＲＮＡによるトランスフェクションに関してＡＡＶドナー添加の最適な時期を特定するために、ヒト初代肝細胞（Ｃｅｌｓｉｓ）を使用した。肝細胞培養物全てについて、以下の方法および条件を使用した。肝細胞基本培地、ＨＢＭ（Ｌｏｎｚａ）１０ｍｌ中のマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）２５０μｌの混合物でコーティングし、各ウェルを混合物１５０μｌで覆った２４または４８ウェル細胞培養皿（ＶＷＲ）を使用した。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。解凍／平板培養培地は、ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ培地（Ｃｅｌｓｉｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１８ｍｌおよびＴｏｒｐｅｄｏ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｉｘ（Ｃｅｌｓｉｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）４００μｌを組み合わせることによって調製した。一旦、プレートを調製したら、細胞（Ｃｅｌｓｉｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、平板培養可能な（ｐｌａｔｅａｂｌｅ）雄アカゲザルの肝細胞、平板培養可能な女性ヒト肝細胞）を液体窒素気相から３７℃の水浴に直接移した。バイアルは、細胞が完全に解凍するまでゆっくり撹拌した。

細胞は、予め加温した解凍／平板培養培地５ｍｌを含有するコニカルチューブ５０ｍｌに直接移した。細胞を完全に移すために、バイアルは解凍／平板培養培地１ｍｌで洗浄した。細胞は、チューブをゆっくり回旋することによって再懸濁させた。少量のアリコート（２０μｌ）を取り出して、細胞計数を実施し、トリパンブルー溶液１：５（Ｃｅｌｌｇｒｏ）を使用して細胞生存能を決定した。次に、細胞を７５×ｇで５分間遠心分離した。上清を完全にデカンテーションし、細胞を１×１０ｅ６細胞／ｍｌで再懸濁した。マトリゲル混合物をウェルから吸引し、細胞を４８ウェル皿に２×１０ｅ５細胞／ウェルで接種した。次に細胞を３７℃／５％ ＣＯ２インキュベーター内でインキュベートした。形質導入／トランスフェクションの時点で、細胞を維持培地ＨＣＭ（ＬｏｎｚａおよびＨＣＭ（商標）ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（商標））に切り替えた。

この実験のための肝細胞は、ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングした２４ウェルプレート（ウェル当たり２ｅ５細胞）に接種し、回復させるために２４時間処置しないままにした。細胞はＨＣＭ（商標）（Ｌｏｎｚａ）で維持した。接種して２４時間後、ｈＡＬＢ特異的相同アームに隣接した、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子タンパク質をコードするＤＮＡドナーを含有するＡＡＶ２／６粒子のＭＯＩ １ｅ５に細胞を曝露した。これらの実験において、ＡＡＶウイルスは標準ＨＥＫ２９３産生プロトコール（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら、（１９９８年）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５巻：９３８〜９４５頁を参照のこと）を使用して調製した。

同日または２４、４８または７２時間後それぞれに、ヒトアルブミン特異的ＺＦＮ対３５３６４−ＥＬＤ−２Ａ−３５３９６−ＫＫＲをコードするｍＲＮＡ（自己切断２Ａペプチド配列によって隔てられた３５３６４／３５３９６対の両ヌクレアーゼをコードする単鎖ｍＲＮＡ）１μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクトした。（ヒトアルブミン特異的ＺＦＮ対３５３６４／３５３９６の記載については米国特許公開第２０１３０１７７９８３号を参照のこと）。

肝細胞の上清は７日後に採取し、ＳＥＡＰ活性を測定した（ＳＥＡＰレポーター遺伝子アッセイ；Ｒｏｃｈｅ）。

結果は、ＺＦＮ ｍＲＮＡのトランスフェクションは、ＡＡＶドナーを添加して２４時間後または４８時間後が最適であることを示した（図２）。対照的に、同日のまたは７２時間離したＺＦＮドナーの送達は、著しく効率が悪かった。
（実施例２）
ＮＨＰ初代肝細胞におけるＺＦＮ−ヌクレアーゼ（ｍＲＮＡ）およびドナー−ＡＡＶ添加の添加順序の最適化

より臨床的に関連のある導入遺伝子ドナーを使用して実施例１の最適化条件を試験するために、ヒト第９因子（ｈＦ９）遺伝子をドナーとして利用し、ＮＨＰ（アカゲザル）初代肝細胞で試験した。肝細胞は、前述のようにマトリゲルでコーティングした４８ウェルプレートに接種し（ウェル当たり２ｅ５細胞）、回復させるために２４時間処置しないままにした。接種して２４時間後、２７６ヌクレオチド（左）および１００ヌクレオチド（右）それぞれのアカゲザルアルブミン特異的相同アームに隣接したｈＦ９導入遺伝子を含有するＡＡＶ２／６粒子のＭＯＩ ３ｅ５に細胞を曝露した（図３を参照のこと）。ドナーＡＡＶを送達して２４時間後または４８時間後に、アカゲザルアルブミン特異的ＺＦＮ ３７８０４−ＥＬＤ／４３０４３−ＫＫＲまたは３６８０６−ＦｏｋＩ ＷＴ／３５３９６−ＦｏｋＩ ＷＴのいずれかをコードする単鎖ｍＲＮＡ（単鎖ＺＦＮ ｍＲＮＡ当たり０．５μｇ）の２つの異なる対を前述のようにトランスフェクトした。（様々なアルブミン特異的ＺＦＮ対の記載については米国特許公開第２０１３０１７７９８３号ならびに米国特許出願第１４／５６５，０１４号および同第１４／５６５，０１４号を参照のこと）。この実施例において、２つのＺＦＮは、実施例１で記載したように２Ａ融合ペプチドによって隔てられた１つのＲＮＡではなく、別々のｍＲＮＡとして送達した。

肝細胞の上清を毎日採取し、４日目から１０日目の上清（ｍＲＮＡトランスフェクションは１日目である）はヒトＦ．ＩＸタンパク質に対するＥＬＩＳＡによって、アカゲザルＦ．ＩＸタンパク質とヒトＦ．ＩＸとを区別することができる一次抗体（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析した。結果は、導入遺伝子ドナーを運ぶＡＡＶを添加して２４時間後のＺＦＮ ｍＲＮＡのトランスフェクションが導入遺伝子発現に最適であることを示した（図３Ｃを参照のこと）。

これらの結果は、ウェスタン分析によって検出した、３７８０４／４３０４３対を使用してＺＦＮをコードするｍＲＮＡをトランスフェクションしてから９〜２４時間後の間にピークがあるＮＨＰ肝細胞で観察されたＺＦＮ発現プロファイルと一致している（図４）。ＺＦＮ発現は、抗Ｆｏｋ Ｉ一次抗体を使用する標準的ウェスタンブロットプロトコールによってモニターした。
（実施例３）
ＮＨＰ肝細胞におけるＺＦＮ−ヌクレアーゼ（ＡＡＶ２／６）およびｈＦ９−ドナー（ＡＡＶ２／６）添加の最適化

ＺＦＮ−ＡＡＶおよびドナー−ＡＡＶの遅延添加も、同日添加よりもすぐれているかどうかを明らかにするために、ＡＡＶ２／６ウイルスベクターを使用してＺＦＮおよびドナーの両方を細胞に送達するｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＡＡＶ形質導入系を調べた。細胞は前述のように調製し、ＡＡＶ２／６（ＺＦＮ−ＡＡＶまたはドナー−ＡＡＶ）は培地で予め希釈したウイルスストックを添加することによって細胞に導入して、ＺＦＮおよびドナーの両方をＮＨＰ（アカゲザル）初代肝細胞に送達した。ウイルスは細胞で２４時間維持し、次に肝細胞培地を交換した。さらに、上清は毎日採取し、アカゲザルＦ．ＩＸタンパク質とヒトＦ．ＩＸとを区別することができる一次抗体（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＥＬＩＳＡによってｈＦ．ＩＸ分泌を試験した。

これらの実験では、ＮＨＰ（アカゲザル）初代肝細胞は、２つの霊長類アルブミン特異的ＺＦＮ３６８０６または３５３９６のうちの１つを含有するＡＡＶ２／６ウイルスおよびドナー（霊長類アルブミン相同アームを有するｈＦ９導入遺伝子）を含むＡＡＶ２／６ウイルスで形質導入した。２種類のウイルスは、同日に導入するか、またはＺＦＮ−ＡＡＶを最初に送達し、次にドナー−ＡＡＶを７、２４もしくは４８時間後に送達した。ドナー−ＡＡＶとＺＦＮ−ＡＡＶとの比は５：１で、得られた感染多重度（ＭＯＩ）は単一のＺＦＮ−ＡＡＶ当たり３ｅ５（総ＺＦＮ ＭＯＩ：６ｅ５）およびドナー−ＡＡＶについては３ｅ６であった。

結果は、収集した全時点において細胞上清中で検出されたｈＦ．ＩＸ発現は、ドナー−ＡＡＶをＺＦＮ−ＡＡＶの２４時間後に送達したとき最高であったことを示した（図５Ａを参照のこと）。

次に、ドナー−ＡＡＶとＺＦＮ−ＡＡＶの比を変化させ、前記のように同時に送達するか、またはドナー−ＡＡＶをＺＦＮ−ＡＡＶの７、２４もしくは４８時間後に送達した。以前の結果と同様に、ＺＦＮ−ＡＡＶの２４時間後のＡＡＶ−ドナーの送達は、この実験において導入遺伝子発現を成功させた（図５Ｂを参照のこと）。
（実施例４）
ＮＨＰ肝細胞における末端捕捉を介したＺＦＮ−ヌクレアーゼ（ＡＡＶ２／６）およびｈＦ９−ドナー（ＡＡＶ２／６）添加の最適化

実施例３において、ｈＦ９導入遺伝子は、アカゲザルアルブミン遺伝子におけるＺＦＮ切断部位の周囲の領域に相同な相同アームに隣接し、これは、相同組換え対を介して、またはＮＨＥＪ依存性末端捕捉によって導入遺伝子の組み込みを可能にした。次に、ドナーはアカゲザルアルブミン遺伝子に相同ではない相同アーム（相同アームはヒトＦ９遺伝子に相同である）で設計した。したがって、このドナーの組み込みは、ＮＨＥＪ依存性末端捕捉のみによって起こる必要があった。

実験条件は、実施例３で記載した条件であり、ここではＺＦＮ−ＡＡＶを添加し、その後ドナー−ＡＡＶをすぐに、または７、２４もしくは４８時間後に添加した。前記と同様に、細胞上清を収集し、ｈＦ．ＩＸタンパク質発現を分析した。結果（図６を参照のこと）は、ドナーＡＡＶトランスフェクションに先立つ２４時間の遅延が組み込み機構と独立した最大導入遺伝子発現に最適であることを実証した。
（実施例５）
ＮＨＰ肝細胞におけるＺＦＮ−ヌクレアーゼ（ＡＡＶ２／６）およびｈＦ９−ドナー（ＡＡＶ２／６）添加の最適化

以前の実施例の結果に基づいて、導入遺伝子（例えば、ｈＦ．ＩＸ）発現の増加はヌクレアーゼ（ＺＦＮ）発現および活性に密接に関連しているものと考えられる。したがって、ＺＦＮを最初に送達し、次にドナーを含有するＡＡＶを２４時間後に送達する最適化条件は、最初の２４時間のドナーＡＡＶの非存在下でＺＦＮ活性の増加をもたらし得、次にドナー組み込み／導入遺伝子発現（ｈＦ．ＩＸ分泌）の増加を引き起こす。

これを試験するため、ＮＨＰ（アカゲザル）初代肝細胞を、アカゲザルアルブミン特異的ＺＦＮ対（３７８０４：４３０４３）およびヒトアルブミン遺伝子座に相同な相同アームに隣接したｈＦ９導入遺伝子ドナーで処置したが、これは、ｈＦ９導入遺伝子の組み込みがＮＨＥＪ依存性末端捕捉によってのみ起こり得ることを意味する。ＺＦＮ活性およびドナー組み込みの両方に対するＺＦＮ：ドナー比の影響を観察するために、様々なドナー：ＺＦＮ１：ＺＦＮ２比（２：１：１、６：１：１および１０：１：１）も調べた。これらの実験において、ＺＦＮをコードするＡＡＶ２／６のＭＯＩは、単一のＺＦＮ当たり３ｅ５（総ＺＦＮ ＭＯＩ：６ｅ５）で固定し、したがって、他の条件のＡＡＶ２／６ドナーＭＯＩはそれぞれ６ｅ５（２：１：１）、１．８ｅ６（６：１：１）および３ｅ６（１０：１：１）であった。

ＮＨＰ（アカゲザル）初代肝細胞（Ｃｅｌｓｉｓ）は前述のように接種し、ＺＦＮおよびドナーを含むＡＡＶの両方は前述のように送達した。

実験は２つのプレートで並行して実施した。第１のプレートはＺＦＮ添加の４日後に採取し、ゲノムＤＮＡを抽出し（Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡマイクロキットを使用する）以下のようにＺＦＮ活性を分析した。簡単に説明すると、切断部位を含む領域をＰＣＲによって増幅し、増幅後、ＰＣＲ産物をＭｉＳｅｑハイスループット配列決定分析によって製造者（Ｉｌｕｍｉｎａ）の指示に従って配列決定した。

第２のプレートについては、第１のプレートの条件のように２連の実験条件を使用し、上清を３つの時点：ＺＦＮ添加の２日後、ＺＦＮ添加の５日後（３〜５日目の上清を組み合わせた）およびＺＦＮ添加の８日後（６〜８日目の上清を組み合わせた）に収集した。次に、これらの上清はアカゲザルＦ．ＩＸタンパク質とヒトＦ．ＩＸとを区別することができる一次抗体（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分泌されたｈＦ．ＩＸタンパク質について試験した。さらに、前述のように配列決定することによってＺＦＮ活性を分析するために、細胞を８日目に採取してゲノムＤＮＡを抽出した。

結果は、ＡＡＶ−ＺＦＮおよびＡＡＶ−ドナーの同日での形質導入が、ＺＦＮ単独での形質導入と比較してＺＦＮ活性の低下を引き起こすことを示した。配列決定分析によって、ＺＦＮおよびドナー−ＡＡＶ粒子が同日に形質導入された場合、試料中の全ＺＦＮ：ドナー比において４日目および８日目にインデルが少ないことが検出された（図７を参照のこと）。対照的に、最初にＡＡＶ−ＺＦＮを、次に２４時間後にＡＡＶ−ドナーを添加したとき、ＺＦＮ活性（インデル％）はＺＦＮ：ドナー比に関係なくＺＦＮのみのトランスフェクション試料と同じであった。

予測通り、ＺＦＮ活性はまた、ＥＬＩＳＡによって検出すると、ｈＦ９導入遺伝子組み込みの指標であるｈＦ．ＩＸタンパク質分泌と相関した。前記のように、最適化した送達条件によって、ＺＦＮ：ドナー比に関係なく２倍超のｈＦ．ＩＸ分泌の増加がもたらされる。
（実施例６）
マウスにおけるＺＦＮ−ヌクレアーゼ（ＡＡＶ２／８）およびｈＦ９−ドナー（ＡＡＶ２／８）のずらされた（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）添加のｉｎ ｖｉｖｏ試験

最適化したＡＡＶ−ＺＦＮ／ＡＡＶ−ドナー添加条件はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて使用できるかどうかを試験するため、マウスアルブミン特異的ＺＦＮ ３０７２５：３０７２４およびＺＦＮ切断部位の周囲のマウスアルブミン遺伝子に相同な相同アームに隣接したｈＦ９導入遺伝子ドナー（米国特許公開第２０１３０１７７９８３号で記載されたような操作された切断ドメインを有するＺＦＮ３０７２４および２０７２５）を使用して、いくつかの添加戦略をマウスで一緒に試験した。

Ｃ５７／Ｂｌ６マウス（５匹のコホート）に、ＡＡＶ−ＺＦＮのみのウイルスゲノム（ＶＧ） １．５ｅ１１（総量）またはドナー：ＺＦＮ比３：１を表すＡＡＶ−ドナーおよびＡＡＶ−ＺＦＮ ９ｅ１１（総量）をコードするＡＡＶ２／８を注射した。この研究について、ドナー−ＡＡＶを最初に送達し、次にＺＦＮ−ＡＡＶを２４時間後に送達するか（群１）；ＺＦＮ−ＡＡＶおよびドナー−ＡＡＶの両方を同時に投与するか（群２）；ＺＦＮ−ＡＡＶを最初に送達し、次にドナー−ＡＡＶを２４時間後に送達するか（群３）；またはＺＦＮ−ＡＡＶを最初に送達し、ドナー−ＡＡＶを７２時間後に送達するか（群４）；またはＺＦＮ−ＡＡＶを最初に送達し、ドナー−ＡＡＶを１２０時間後に送達した（群５）。これらの研究において、米国特許公開第２０１２０１２８６３５号に記載されたように、いずれも尾静脈に注射することによって送達した。全群におけるＺＦＮ送達の７日後に、血漿中におけるｈＦ．ＩＸ分泌を分析するために、異なる群の逐次採血を実施した。

７日目に実施したヒトｈＦ．ＩＸのＥＬＩＳＡ（親和性）によって、ドナー−ＡＡＶを最初に添加することは、ＺＦＮ−ＡＡＶおよびドナー−ＡＡＶを同日における添加と区別できないことが明らかになった（図８を参照のこと）。対照的に、ドナー−ＡＡＶをＺＦＮ−ＡＡＶの２４時間後または７２時間後に投与した場合、血漿中におけるｈＦ．ＩＸのレベルは、同日に投与するよりもそれぞれ２倍から３倍高かった。対照的に、ＺＦＮの１２０時間後のドナーの投与は、ｈＦ９発現の完全な欠如を引き起こした。確率分析（スチューデントＴ検定）は、ドナーおよびＺＦＮを同日に与えたマウスからの試料、またはドナーを２４時間前に与えたマウスからの試料と、ＺＦＮ−ＡＡＶを投与されて３日後にドナー−ＡＡＶを与えたマウスからの試料と比較して有意な差があることを示した。

同じく７日目に殺処分された付随マウス群からの肝臓組織のゲノムＤＮＡの分析は、より高いｈＦ．ＩＸ発現が、アルブミン遺伝子修飾のより高いレベルと相関しており、ＺＦＮ−ＡＡＶの３日後にドナー−ＡＡＶが投与されたとき２倍高いことを示した（図９Ａを参照のこと）。さらに、ＺＦＮ−ＡＡＶの３日後にドナー−ＡＡＶを投与されたマウスで観察された標的化遺伝子修飾のレベルは、ＺＦＮ−ＡＡＶのみを投与された群と同様であった。これは、実施例５で示したｉｎ ｖｉｔｒｏにおける結果と一致した。しかし、ＺＦＮ−ＡＡＶによる形質導入効率（２倍体ゲノム当たりのＶＧを検出することによってアッセイした）は全群について同じであったが、ＺＦＮ発現レベルは、標準的ウェスタンブロット分析によって分析すると、ＺＦＮ−ＡＡＶを単独で送達したときか、またはドナー−ＡＡＶをＺＦＮ−ＡＡＶの３日後に送達したとき（図９Ｂ）、ドナー−ＡＡＶをＺＦＮ−ＡＡＶの前または同時に与えたときと比較して高かった。

異なる投薬コホートの血清ｈＦ．ＩＸレベルを、時間をわたり分析すると、導入遺伝子の長期発現が観察される（図１０）。導入遺伝子発現は、ＡＡＶ−ＺＦＮによる形質導入の７７日後でも検出することができる。群全てが認識可能な導入遺伝子発現を達成するが、ＡＡＶ−ドナーウイルスの添加の３日前のＡＡＶ−ＺＦＮの形質導入によって最も速い発現の増加が達成される。
（実施例７）
ＮＨＰにおけるＺＦＮ−ヌクレアーゼ（ＡＡＶ２／８）およびｈＦ９−ドナー（ＡＡＶ２／８．２）のずらされた添加のｉｎ ｖｉｖｏ試験

最適化したＡＡＶ ＺＦＮ／ＡＡＶ ドナー添加条件がｉｎ ｖｉｖｏにおいてＮＨＰでも使用できるかどうかを試験するため、アカゲザルにおいて、アカゲザルアルブミン特異的ＺＦＮ３７８０４：４３０４３およびＺＦＮ切断部位の周囲のアカゲザルアルブミン遺伝子に相同な相同アームに隣接したｈＦ９導入遺伝子ドナーを使用して、いくつかの異なる添加戦略を使用する研究を実施する。これらの実験において、ＺＦＮ−ＡＡＶはそれぞれ単一のＺＦＮコード配列を含有し、ＺＦＮ対を送達するためには、２種類のＺＦＮ−ＡＡＶ粒子型を与える。ＺＦＮ−ＡＡＶウイルス粒子は一緒に８：１：１比（ドナー：ＺＦＮ１：ＺＦＮ２）でＡＡＶ−ドナー粒子と共に与え、サルの対にＺＦＮ−ＡＡＶおよびドナー−ＡＡＶを同日に与えるか、またはドナー−ＡＡＶの１日もしくは３日前にＺＦＮ−ＡＡＶを与える。血清ｈＦ．ＩＸを試験するために逐次採血を、時間をわたり実施する。

結果は、動物がＺＦＮ−ＡＡＶを投与される時点とドナー−ＡＡＶを投与される時点との間の１から３日間の遅延が、２８日目までは導入遺伝子の最も迅速な発現をもたらすことを示した（図１１Ａ）。研究期間中（＞３０週間）の全動物のｈＦ．ＩＸピークレベルの分析によって、検出可能なレベルのｈ．ＦＩＸを発現する５匹の動物のうち、発現が最高である３匹の動物はＡＡＶ−ＺＦＮ粒子の１または２日後にＡＡＶ−ドナー粒子で処置されていたことが明らかになった（図１１Ｂ）。

総合すると、これらのデータは、ヌクレアーゼおよびドナー導入遺伝子の別々の投与が導入遺伝子発現の有意な増強を示した（同日投与と比較して３倍）ことを示している。したがって、ヌクレアーゼ（複数可）および導入遺伝子の逐次投与は、両者をウイルス粒子またはｍＲＮＡとして、投与間を数時間から数日間遅延させて送達するとき、導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介性組み込みを増強することができる。

本明細書に言及されているあらゆる特許、特許出願および刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

理解を明確にするために、例示および実施例として本開示を詳細に提示してきたが、当業者であれば、本開示の精神または範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正を実施してよいことが明らかとなろう。したがって、前述の記載および実施例は、限定的に解釈するべきではない。

Claims (18)

1. 単離された細胞の標的配列に外因性配列を組み込む方法であって、（ｉ）前記標的配列を切断する１つまたは複数のヌクレアーゼ、および（ｉｉ）前記１つまたは複数のヌクレアーゼによる前記標的配列の切断後に前記標的配列に組み込まれる１つまたは複数のドナー配列を逐次的に投与するステップを含み、前記逐次的投与の間に少なくとも２４時間の遅延がある、方法。
2. 前記逐次的投与の間の前記遅延が、２４時間〜７２時間の間である、請求項１に記載の方法。
3. 前記１つまたは複数のヌクレアーゼが、前記１つまたは複数のドナー配列の前に投与される、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記１つまたは複数のドナー配列が、前記１つまたは複数のヌクレアーゼの前に投与される、請求項１または２に記載の方法。
5. 前記１つまたは複数のヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
6. 前記１つまたは複数のヌクレアーゼが、ニッカーゼである、請求項５に記載の方法。
7. 前記１つもしくは複数のヌクレアーゼおよび／または前記１つもしくは複数のドナー配列が、プラスミド、ウイルスベクターを使用して、またはＲＮＡ、ミニサークルもしくは線状ＤＮＡ形態で投与される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
8. 前記１つもしくは複数のヌクレアーゼおよび／または前記１つもしくは複数のドナー配列が、ウイルスベクターを使用して投与される、請求項３に記載の方法。
9. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項８に記載の方法。
10. 前記１つまたは複数のヌクレアーゼが、ＲＮＡとして投与される、請求項４に記載の方法。
11. 前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記１つまたは複数のドナー配列が、少なくとも１つのタンパク質産物を発現する、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
13. 前記タンパク質産物が、障害において非機能性である、欠損している、または異常に発現されるタンパク質の機能性バージョンである、請求項１２に記載の方法。
14. 前記標的配列が、内因性遺伝子座である、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
15. 前記内因性遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、請求項１４に記載の方法。
16. 被験体において欠如または欠損している機能性タンパク質を提供する方法であって、請求項１３に記載の方法に従って１つまたは複数のドナー配列を、単離された細胞に組み込むステップ、および前記単離された細胞を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
17. 前記細胞が幹細胞である、請求項１６に記載の方法。
18. 被験体において欠如または欠損している機能性タンパク質を提供する方法であって、請求項１３に記載の方法に従って１つまたは複数のドナー配列を、前記被験体の細胞に組み込むステップを含む、方法。