KR102544051B1 - 인간화된 ttr 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 및 사용 방법 - Google Patents

인간화된 ttr 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 및 사용 방법 Download PDF

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제프리 하이네스
수잔느 하트포드
데이빗 프렌데웨이
브라이언 잠브로비츠
앤드류 제이. 머피
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리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 및 비인간 동물 및 그러한 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 및 비인간 동물을 사용하는 방법이 제공된다. 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 세포 또는 비인간 동물은 인간 트랜스티레틴 단백질 또는 그것의 단편이 인간 트랜스티레틴으로부터 유래되는 키메릭 트랜스티레틴 단백질을 발현한다. 인간 TTR을 표적화하도록 설계된 뉴클레아제 작용제와 같은 인간-TTR-표적화 시약의 효능을 생체내에서 평가하기 위하여 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 그러한 비인간 동물을 사용하는 방법이 제공된다. 또한 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 그러한 비인간 동물의 제조 방법이 제공된다.

Description

인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 9월 29일에 출원된 미국 출원 번호 62/565,980호, 2018년 6월 1일에 출원된 미국 출원 번호 62/679,142호, 2018년 8월 21일에 출원된 미국 출원 번호 62/720,292호의 이익을 주장하며, 상기 출원의 각각은 본원에서 모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 포함된다.
EFS 웹을 통해 텍스트파일로서 제출된 서열 목록에 대한 참조
519832SEQLIST.txt 파일로 쓰여진 서열 목록은 139 킬로바이트이고, 2018년 9월 25일에 생성되었으며, 본원에 참조로 포함된다.
트랜스티레틴 (Transthyretin, TTR)은 혈청 및 뇌척수액에서 발견되고 갑상선 호르몬 및 레티놀-결합 단백질을 레티놀로 운반하는 단백질이다. 간은 TTR을 혈액으로 분비하는 한편, 맥락총(choroid plexus)은 그것을 뇌척수액으로 분비한다. TTR은 또한 망막 색소 상피에서 생성되어 유리체로 분비된다. 잘못 접혀지고 응집된 TTR은 아밀로이드 질환 노인성 전신성 아밀로이드증 (SSA), 가족성 아밀로이드 다발신경병증 (FAP), 및 가족성 아밀로이드 심근병증 (FAC)에서 다수의 조직 및 장기에서 축적된다.
TTR 아밀로이드증 질환에 대한 한 가지 유망한 치료적 접근법은 환자의 TTR 로드를 감소시키는 것이다. 그러나, 내인성 Ttr 유전자좌에서 인간-TTR-표적화 시약의 진정한 인간 표적 또는 진정한 인간 표적과 매우 근사한 표적을 제공하고, 그로써 인간화된 단백질 및 인간화된 유전자가 존재하는 TTR의 유일한 버전인 환경에서 약동학 및 약력학 연구뿐만 아니라 살아있는 동물에서 이러한 작용제의 효능 및 작용 모드를 테스트하는 것을 가능하게 하는 적합한 비인간 동물에 대한 필요성이 남아 있다.
인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 비인간 동물, 뿐만 아니라 이러한 비인간 동물의 사용 방법이 제공된다. 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 게놈 또는 세포가 또한 제공된다.
한 측면으로, 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물이 제공된다. 이러한 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물은 그것의 게놈에 TTR 코딩 서열 및 비코딩 서열 둘 다를 포함하는 인간 TTR 서열을 포함하는 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌를 포함할 수 있다. 일부 이러한 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물은 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌를 포함할 수 있고, 여기서 Ttr 코딩 서열 및 비코딩 서열 둘 다를 포함하는 내인성 Ttr 유전자좌 영역은 삭제되고 Ttr 코딩 서열 및 비코딩 서열 둘 다를 포함하는 상응하는 인간 TTR 서열로 대체될 수 있다. 선택적으로, 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 내인성 Ttr 프로모터를 포함한다. 선택적으로, 인간 TTR 서열은 내인성 Ttr 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 선택적으로, 내인성 Ttr 유전자좌의 적어도 하나의 인트론 및 적어도 하나의 엑손이 삭제되고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체될 수 있다.
일부 이러한 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 내인성 Ttr 유전자좌의 전체 Ttr 코딩 서열은 삭제되고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되었다. 선택적으로, Ttr 개시 코돈으로부터 Ttr 중단 코돈까지의 내인성 Ttr 유전자좌의 영역은 삭제되고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되었다.
일부 이러한 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 인간 TTR 3' 미번역 영역을 포함한다. 일부 이러한 비인간 동물에서, 내인성 Ttr 5' 미번역 영역은 삭제되지 않았고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되지도 않았다.
일부 이러한 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, Ttr 개시 코돈으로부터 Ttr 중단 코돈까지의 내인성 Ttr 유전자좌의 영역은 삭제되었고 상응하는 인간 TTR 서열 및 인간 TTR 3' 미번역 영역을 포함하는 인간 TTR 서열로 대체되었고, 내인성 Ttr 5' 미번역 영역은 삭제되지 않았고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되지 않았으며, 내인성 Ttr 프로모터는 삭제되지 않았고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되지 않았다. 선택적으로, 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌에서의 인간 TTR 서열은 SEQ ID NO: 18에 제시된 서열에 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 그것으로 이루어진다. 선택적으로, 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 SEQ ID NO: 1에 제시된 서열에 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 단백질을 암호화한다. 선택적으로, 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 SEQ ID NO: 90에 제시된 서열에 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 코딩 서열을 포함한다. 선택적으로, 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 SEQ ID NO: 14 또는 15에 제시된 서열에 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
일부 이러한 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 신호 펩타이드, 및 삭제되지 않았고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되지 않은 신호 펩타이드를 암호화하는 내인성 Ttr 유전자좌의 영역을 포함하는 트랜스티레틴 전구체 단백질을 암호화한다. 선택적으로, 내인성 Ttr 유전자좌의 제1 엑손은 삭제되지 않았고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되지 않았다. 선택적으로, 내인성 Ttr 유전자좌의 제1 엑손 및 제1 인트론은 삭제되지 않았고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되지 않았다. 선택적으로, 제2 Ttr 엑손의 시작부터 Ttr 중단 코돈까지의 내인성 Ttr 유전자좌 영역은 삭제되었고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되었다. 선택적으로, 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 인간 TTR 3' 미번역 영역을 포함한다.
일부 이러한 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 제2 Ttr 엑손부터 Ttr 중단 코돈까지의 내인성 Ttr 유전자좌 영역은 삭제되었고 상응하는 인간 TTR 서열 및 인간 TTR 3' 미번역 영역을 포함하는 인간 TTR 서열로 대체되었으며, 내인성 Ttr 5' 미번역 영역은 삭제되지 않았고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되지 않았으며, 내인성 Ttr 프로모터는 삭제되지 않았고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되지 않았다. 선택적으로, 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌에서 인간 TTR 서열은 SEQ ID NO: 19에 제시된 서열에 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 선택적으로, 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 SEQ ID NO: 2에 제시된 서열에 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진 단백질을 암호화한다. 선택적으로, 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 SEQ ID NO: 91에 제시된 서열에 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진 코딩 서열을 포함한다. 선택적으로, 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 SEQ ID NO: 16 또는 17에 제시된 서열에 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
일부 이러한 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 선택 카세트 또는 리포터 유전자를 포함하지 않는다. 일부 이러한 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 선택 카세트 또는 리포터 유전자를 포함한다. 일부 이러한 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물은 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌에 대해 동형접합성이다. 일부 이러한 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물은 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌에 대해 이형접합성이다.
일부 이러한 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 비인간 동물은 포유류이다. 선택적으로, 포유류는 설치류이다. 선택적으로, 설치류는 래트 또는 마우스이다. 선택적으로, 비인간 동물은 마우스이다.
다른 측면으로, 생체내에서 인간-TTR-표적화 시약의 활성을 평가하기 위하여 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 비인간 동물을 사용하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 (a) 인간-TTR-표적화 시약을 임의의 상기 비인간 동물에 투여하는 단계; 및 (b) 비인간 동물에서 인간-TTR-표적화 시약의 활성을 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 이러한 방법에서, 투여 단계는 아데노-관련 바이러스 (AAV)-매개 전달, 지질 나노입자 (LNP)-매개 전달, 또는 유체역학적 전달 (HDD)을 포함한다. 선택적으로, 투여 단계는 LNP-매개 전달을 포함하고, 선택적으로 LNP 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 2 mg/kg이다. 선택적으로, 투여 단계는 AAV8-매개 전달을 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 단계 (b)는 비인간 동물로부터 간을 분리하는 단계 및 간에서 인간-TTR-표적화 시약의 활성을 평가하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 단계 (b)는 추가로 간 이외의 장기 또는 조직에서 인간-TTR-표적화 시약의 활성을 평가하는 단계를 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 인간-TTR-표적화 시약은 게놈 편집제(genome-편집제이고, 평가 단계는 유전자 변형된 Ttr 유전자좌의 변형을 평가하는 것을 포함한다. 선택적으로, 평가 단계는 유전자 변형된 Ttr 유전자좌 내에서의 삽입 또는 삭제의 빈도를 측정하는 것을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 평가 단계는 유전자 변형된 Ttr 유전자좌에 의해 암호화된 Ttr 메신저 RNA의 발현을 측정하는 것을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 평가 단계는 유전자 변형된 Ttr 유전자좌에 의해 암호화된 TTR 단백질의 발현을 측정하는 것을 포함한다. 선택적으로, TTR 단백질의 발현을 측정하는 것은 비인간 동물에서 TTR 단백질의 혈청 수준을 측정하는 것을 포함한다. 선택적으로, 활성은 비인간 동물의 간에서 평가된다.
일부 이러한 방법에서, 인간-TTR-표적화 시약은 인간 TTR 유전자 영역을 표적화하기 위해 설계된 뉴클레아제 작용제를 포함한다. 선택적으로, 뉴클레아제 작용제는 Cas 단백질 및 인간 TTR 유전자에서 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하기 위해 설계된 가이드 RNA를 포함한다. 선택적으로, Cas 단백질은 Cas9 단백질이다. 선택적으로, 인간-TTR-표적화 시약은 추가로 외인성 도너 핵산을 포함하고, 외인성 도너 핵산은 인간 TTR 유전자와 재조합하기 위해 설계된다. 선택적으로, 외인성 ㄷ도너 핵산은 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드 (ssODN)이다.
또 다른 측면으로, 생체내에서 인간-TTR-표적화 시약의 활성을 최적화하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 (I) TTR 코딩 서열 및 비코딩 서열 둘 다를 포함하는 인간 TTR 서열을 포함하는 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌를 그것의 게놈에 포함하는 제1 비인간 동물에서 먼저 생체내에서 인간-TTR-표적화 시약의 활성을 평가하는 임의의 상기 방법을 수행하는 단계; (II) 변수를 변경하고 TTR 코딩 서열 및 비코딩 서열 둘 다를 포함하는 인간 TTR 서열을 포함하는 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌를 그것의 게놈에 포함하는 제2 비인간 동물에서 변경된 변수를 사용하여 두 번째로 단계 (I)의 방법을 수행하는 단계; 및 (III) 단계 (I)에서의 인간-TTR-표적화 시약의 활성을 단계 (II)에서의 인간-TTR-표적화 시약의 활성과 비교하고, 더 높은 활성을 초래하는 방법을 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 선택적으로, 단계 (III)은 더 높은 효능, 더 높은 정확성, 더 높은 일관성, 또는 더 높은 특이성을 초래하는 방법을 선택하는 것을 포함할 수 있다.
선택적으로, 단계 (II)에서 변경된 변수는 인간-TTR-표적화 시약을 비인간 동물에 도입하는 전달 방법이다. 선택적으로, 투여 단계는 LNP-매개 전달을 포함하고, 단계 (II)의 변경된 변수는 LNP 제제이다. 선택적으로, 단계 (II)에서 변경된 변수는 인간-TTR-표적화 시약을 비인간 동물에 도입하는 투여 경로이다. 선택적으로, 단계 (II)에서 변경된 변수는 비인간 동물에 도입된 인간-TTR-표적화 시약의 농도 또는 양이다. 선택적으로, 단계 (II)에서 변경된 변수는 비인간 동물에 도입된 인간-TTR-표적화 시약의 형태이다. 선택적으로, 단계 (II)에서 변경된 변수는 비인간 동물에 도입된 인간-TTR-표적화 시약이다.
일부 이러한 방법에서, 인간-TTR-표적화 시약은 Cas 단백질 (예컨대, Cas9 단백질) 및 인간 TTR 유전자에서 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하기 위해 설계된 가이드 RNA를 포함한다. 선택적으로, 단계 (II)에서 변경된 변수는 가이드 RNA 서열 또는 가이드 RNA 표적 서열이다. 선택적으로, Cas 단백질 및 가이드 RNA는 각각 RNA의 형태로 투여되고, 단계 (II)에서 변경된 변수는 Cas mRNA 대 가이드 RNA의 비율이다. 선택적으로, 단계 (II)에서 변경된 변수는 가이드 RNA 변형이다.
또 다른 측면으로, 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 비인간 동물의 제조 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은: (a) 비인간 동물 배아 줄기 (ES) 세포에: (i) 내인성 Ttr 유전자좌에서 표적 서열을 표적화하는 뉴클레아제 작용제; 및 (ii) 내인성 Ttr 유전자좌의 표적 서열의 5'에 상응하는 5' 상동성 팔(homology arm) 및 내인성 Ttr 유전자좌의 표적 서열의 3'에 상응하는 3' 상동성 팔이 측면에 있는 인간 TTR 서열을 포함하는 핵산 삽입물을 포함하는 표적화 벡터를 도입하는 단계, 여기서 표적화 벡터는 내인성 Ttr 유전자좌와 재조합하여 인간 TTR 서열을 포함하는 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌를 그것의 게놈에 포함하고 있는 유전자 변형된 비인간 ES 세포가 생성되는 것인 단계; (b) 유전자 변형된 비인간 ES 세포를 비인간 동물 숙주 배아에 도입하는 단계; 및 (c) 비인간 동물 숙주 배아를 대리 모체(surrogate mother)에 임신시키는 단계, 여기서 대리 모체는 그것의 게놈에 인간 TTR 서열을 포함하는 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌를 포함하는 F0 자손 유전자 변형된 비인간 동물을 생성하는 것인 단계를 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 뉴클레아제 작용제는 Cas 단백질 (예컨대, Cas9 단백질) 및 가이드 RNA를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 표적화 벡터는 길이가 적어도 10 kb이거나 또는 5' 및 3' 상동성 팔의 총 합이 적어도 10 kb의 길이인 큰 표적화 벡터이다. 일부 이러한 방법에서, 비인간 동물은 마우스 또는 래트이다. 일부 이러한 방법에서, 비인간 동물은 마우스이다.
도 1A는 인간 및 마우스 트랜스티레틴 (TTR) 전구체 단백질 (각각 SEQ ID NO: 1 및 6)의 정렬을 도시한다. 신호 펩타이드, T4 결합 도메인, 페이스(phase) 0 엑손/인트론 경계, 및 페이스 1/2 엑손/인트론 경계가 표시된다.
도 1B는 인간 및 마우스 트랜스티레틴 (TTR) 코딩 서열 (각각 SEQ ID NO: 90 및 92)의 정렬을 도시한다.
도 2는 야생형 쥐과 Ttr 유전자좌, 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 제1 버전, 및 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 제2 버전의 개략도 (비례대로가 아님)를 도시한다. 엑손, 인트론, 5' 미번역 영역 (UTRs), 3' UTR, 개시 코돈 (ATG), 중단 코돈 (TGA), 및 선택 카세트로부터의 loxP 흔적이 표시된다. 흰색 박스는 쥐과 서열을 나타내고; 검은색 박스는 인간 서열을 나타낸다.
도 3은 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 제1 버전을 생성하기 위한 표적화의 개략도 (비례대로가 아님)를 도시한다. 야생형 마우스 Ttr 유전자좌, 자가 삭제 네오마이신 (SDC-Neo) 선택 카세트가 포함된 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 F0 대립유전자 (MAID 7576), 및 SDC-Neo 선택 카세트의 제거로부터의 loxP 흔적이 포함된 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 F1 대립유전자 (MAID 7577)가 도시된다. 흰색 박스는 쥐과 서열을 나타내고; 검은색 박스는 인간 서열을 나타낸다.
도 4는 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 제2 버전을 생성하기 위한 표적화의 개략도 (비례대로가 아님)를 도시한다. 야생형 마우스 Ttr 유전자좌, SDC-Neo 선택 카세트가 포함된 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 F0 대립유전자, 및 SDC-Neo 선택 카세트의 제거로부터의 loxP 흔적이 포함된 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 F1 대립유전자가 도시된다. 흰색 박스는 쥐과 서열을 나타내고; 검은색 박스는 인간 서열을 나타낸다.
도 5A는 제1 표적화된 마우스 Ttr 유전자좌의 스크리닝을 위한 전략, 이를테면 대립유전자 손실 검정 (7576mTU, 9090mTM, 및 9090mTD), 대립유전자 획득 검정 (7576hTU, 7576hTD, Neo), 보유 검정 (9090retU, 9090retU2, 9090retU3, 9090retD, 9090retD2, 9090retD3), 및 CRISPR 가이드 (9090mTGU, mGU, 9090mTGD, 및 mGD)에 의해 방해된 영역을 커버하기 위해 설계된 CRISPR 검정의 개략도 (비례대로가 아님)를 도시한다. 흰색 박스는 쥐과 서열을 나타내고; 검은색 박스는 인간 서열을 나타낸다.
도 5B는 제2 표적화된 마우스 Ttr 유전자좌의 스크리닝을 위한 전략, 이를테면 대립유전자 손실 검정 (4552mTU, 9212mTU, 9090mTM, 9212mTD), 대립유전자 획득 검정 (7655hTU, 7576hTD, Neo), 보유 검정 (9204mretU, 9204mretD), 및 CRISPR 가이드 (mGU, mGD, 및 9212mTGD)에 의해 방해된 영역을 커버하기 위해 설계된 CRISPR 검정의 개략도 (비례대로가 아님)를 도시한다. 흰색 박스는 쥐과 서열을 나타내고; 검은색 박스는 인간 서열을 나타낸다.
도 6은 (1) 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 제1 버전 (MAID 7576; 도 3으로부터의 F0 대립유전자)에 대해 동형접합성인 F0 세대 마우스로부터의 간 샘플, (2) 야생형 마우스로부터의 간 샘플, (3) 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 제1 버전에 대해 동형접합성인 F0 세대 마우스로부터의 비장 샘플, 및 (4) 야생형 마우스로부터의 비장 샘플에서 베타-액틴 (Actb), 베타-2-마이크로글로불린 (B2M), 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 트랜스티레틴 (Mm Ttr), 및 호모 사피엔스(Homo sapiens) 트랜스티레틴 (Hs TTR) mRNA 발현을 도시한다. 더 낮은 Ct 값은 더 높은 발현을 나타낸다.
도 7A 및 7B는 혈청 및 뇌척수액 (CSF) 중의 인간 TTR 단백질 수준 (도 7A) 및 마우스 TTR 단백질 수준 (도 7B)에 대한 ELISA 검정의 결과를 도시한다. 테스트된 샘플은 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 제1 버전 (MAID 7576; 도 3으로부터의 F0 대립유전자)에 대해 동형접합성인 F0 세대 마우스로부터의 혈청 및 CSF, 인간 혈청 및 CSF 대조군, 및 마우스 (F1H4) 혈청 및 CSF 대조군을 포함하였다.
도 7C는 혈청 중의 (1) 인간 TTR 및 (2) 마우스 TTR 단백질 수준에 대한 ELISA 검정의 결과를 도시한다. 테스트된 샘플은 제1 클론 (클론 7576C-G7)으로부터 생성된 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 제1 버전 (MAID 7576; 도 3으로부터의 F0 대립유전자)에 대해 동형접합성인 F0 세대 마우스, 제2 클론 (클론 7576A-A5)으로부터 생성된 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 제1 버전 (MAID 7576; 도 3으로부터의 F0 대립유전자)에 대해 동형접합성인 F0 세대 마우스, 및 야생형 마우스 (F1H4)로부터의 혈청 샘플을 포함하였다. 마우스 혈청 및 인간 혈청이 대조군으로서 사용되었다.
도 8은 야생형 마우스 (F1H4), 제1 클론 (클론 7576C-G7)으로부터 생성된 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 제1 버전 (MAID 7576; 도 3으로부터의 F0 대립유전자)에 대해 동형접합성인 F0 세대 마우스, 및 제2 클론 (클론 7576A-A5)으로부터 생성된 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 제1 버전에 대해 동형접합성인 F0 세대 마우스로부터의 혈청 샘플에서 웨스턴 블롯에 의해 측정된 인간 TTR 단백질 발현을 도시한다. 마우스 혈청이 음성 대조군으로서 사용되었고, 인간 혈청이 양성 대조군으로서 사용되었다. 마우스 IgG가 로딩 대조군으로서 사용되었다.
도 9는 야생형 마우스 (F1H4), 제1 클론 (클론 7576C-G7)으로부터 생성된 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 제1 버전 (MAID 7576; 도 3으로부터의 F0 대립유전자)에 대해 동형접합성인 F0 세대 마우스, 및 제2 클론 (클론 7576A-A5)으로부터 생성된 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 제1 버전에 대해 동형접합성인 F0 세대 마우스로부터의 간 및 신장 샘플에서 웨스턴 블롯에 의해 측정된 인간 TTR 단백질 발현을 도시한다. 마우스 혈청이 음성 대조군으로서 사용되었고, 인간 혈청이 양성 대조군으로서 사용되었다. GAPDH가 로딩 대조군으로서 사용되었다.
도 10은 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 제1 버전 (MAID 7576; 도 3으로부터의 F0 대립유전자)에 대해 동형접합성인 F0 세대 마우스로부터 분리된 일차 간세포에서 차세대 서열분석 (NGS)에 의해 측정된, 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌에서의 퍼센트 게놈 편집 (용해된 세포의 모음으로부터 PCR 반응으로 판독된 총 수의 서열에 걸쳐 관찰된 삽입 또는 삭제의 총 수)을 도시한다. 테스트된 샘플은 미처리 간세포 및 Cas9 mRNA 및 인간 TTR을 표적화하기 위해 설계된 가이드 RNA를 함유한 지질 나노입자로 처리된 간세포를 포함하였다.
도 11A-11H는 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 제1 버전 (MAID 7576; 도 3으로부터의 F0 대립유전자)에 대해 동형접합성인 F0 세대 마우스에 Cas9 mRNA 및 인간 TTR을 표적화하기 위해 설계된 가이드 RNA를 함유한 지질 나노입자의 주입 후 14일 후에 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) (도 11A), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) (도 11B), 트라이글리세라이드 (도 11C), 콜레스테롤 (도 11 D), 고밀도 리포단백질 (HDL) (도 11E), 저밀도 리포단백질 (LDL) (도 11F), 비에스테르화 지방산 (NEFA) (도 11G), 및 알부민 (도 11H)의 혈청 화학 분석을 도시한다. U/L은 리터당 유닛을 나타내고, mg/dL은 데시리터당 밀리그램을 나타내며, mEq/L은 리터당 밀리당량을 나타내고, g/dL은 데시리터당 그램을 나타낸다.
도 12는 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 제1 버전 (MAID 7576; 도 3으로부터의 F0 대립유전자)에 대해 동형접합성인 F0 세대 마우스에 완충액 대조군 또는 Cas9 mRNA 및 인간 TTR을 표적화하기 위해 설계된 가이드 RNA를 함유한 지질 나노입자의 주입 후 14일 후에 간으로부터의 샘플에서 퍼센트 게놈 편집 (용해된 세포의 모음으로부터 PCR 반응으로 판독된 총 수의 서열에 걸쳐 관찰된 삽입 또는 삭제의 총 수)을 도시한다.
도 13은 야생형 마우스 (F1H4), 인간 TTR 플라스미드가 유체역학적 전달 (HDD)에 의해 도입된 마우스, 및 키메릭 마우스/인간 TTR 플라스미드 (엑손 1에 의해 암호화된 영역은 마우스이고, 엑손 2 내지 4에 의해 암호화된 영역은 인간임)가 HDD에 의해 도입된 마우스에서 인간 TTR의 혈청 수준을 검정하는 ELISA의 결과를 도시한다. 2개의 음성 대조군이 도시되며, 인간 혈청이 양성 대조군으로서 사용되었다.
도 14는 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 제1 버전 (MAID 7576; 도 3으로부터의 F1 대립유전자; 클론 7576B-F10으로부터 유래됨)에 대해 동형접합성인 F2 세대 마우스에 완충액 대조군 또는 Cas9 mRNA 및 인간 TTR을 표적화하기 위해 설계된 인간 TTR 가이드 RNA 1을 함유한 지질 나노입자의 주입 후 8일 후에 간 용해물에서 인간 TTR 수준을 검정하는 ELISA의 결과를 도시한다.
도 15A 및 15B는 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 제1 버전 (MAID 7576; 도 3으로부터의 F1 대립유전자; 클론 7576B-F10으로부터 유래됨)에 대해 동형접합성인 F2 세대 마우스에 완충액 대조군 또는 Cas9 mRNA 및 인간 TTR을 표적화하기 위해 설계된 인간 TTR 가이드 RNA 1을 함유한 지질 나노입자의 주입 후 8일 후에 혈청 샘플 (도 15A에서 1:5000 희석, 및 도 15B에서 1:10000 희석)에서 인간 TTR 수준을 검정하는 ELISA의 결과를 도시한다.
도 16은 hTTR7577/7577, hTTR7655/7655, hTTR7655/7656, 및 hTTR7656/7656, 및 hTTR7656/WT 마우스의 혈장 샘플에서 인간 TTR 수준을 검정하는 ELISA의 결과를 도시한다.
도 17A 및 17B는 hTTRWT/WT 및 hTTR7577/7577 마우스 (생후 3개월)의 혈장 샘플에서 인간 TTR 및 마우스 TTR 수준을 검정하는 ELISA의 결과를 도시한다. 인간 혈청이 대조군으로서 사용되었다.
도 17C는 생후 3개월의 hTTRWT/WT 및 hTTR7577/7577 마우스로부터의 간 샘플에서 mTTR (1) 및 hTTR (2) mRNA 발현을 도시한다. 더 낮은 Ct 값은 더 높은 발현을 가리킨다.
도 18은 야생형 (F1H4), hTTR7577/7577 (hTTR v1), 및 hTTR7656/7656 (hTTRv2) 마우스 (생후 2 내지 3개월)의 혈장 샘플에서 인간 TTR 수준을 검정하는 ELISA의 결과를 도시한다.
도 19는 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 제1 버전에 대해 동형접합성인 마우스에 완충액 대조군 또는 Cas9 mRNA 및 인간 TTR을 표적화하기 위해 설계된 인간 TTR 가이드 RNA 1을 함유한 지질 나노입자의 주입 후 간으로부터의 샘플에서 차세대 서열분석 (NGS)에 의해 측정된 바 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌에서의 퍼센트 게놈 편집을 도시한다.
도 20은 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌의 제1 버전에 대해 동형접합성인 마우스에 완충액 대조군 또는 Cas9 mRNA 및 인간 TTR을 표적화하기 위해 설계된 인간 TTR 가이드 RNA 1을 함유한 지질 나노입자의 주입 후 혈청 샘플에서 인간 TTR 수준을 검정하는 ELISA의 결과를 도시한다.
정의
본원에서 상호교환적으로 사용된 용어 "단백질", "폴리펩타이드", 및 "펩타이드"는 코딩된 및 코딩되지 않은 아미노산 및 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산을 포함하여, 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 포함한다. 용어는 또한 변형된 중합체, 예컨대 변형된 펩타이드 골격을 가지는 폴리펩타이드를 포함한다. 용어 "도메인"은 특정 기능 또는 구조를 가지는 단백질 또는 폴리펩타이드의 임의의 부분을 나타낸다.
단백질은 "N-말단" 및 "C-말단"을 가진다고 말한다. 용어 "N-말단"은 단백질 또는 폴리펩타이드의 시작과 관련되고, 유리 아민기 (-NH2)를 가진 아미노산에 의해 종결된다. 용어 "C-말단"은 아미노산 사슬 (단백질 또는 폴리펩타이드)의 단부와 관련되고, 유리 카르복실기 (-COOH)에 의해 종결된다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 이것들의 유사체 또는 변형된 버전을 포함한, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 포함한다. 이것은 단일-, 이중-, 및 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 및 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 또는 기타 천연의, 화학적으로 변형된, 생화학적으로 변형된, 비천연의, 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체를 포함한다.
핵산은 모노뉴클레오타이드가 한 모노뉴클레오타이드 펜토오스 고리의 5' 포스페이트가 그것의 인접한 것의 3' 산소에 포스포다이에스테르 결합을 통해 한 방향으로 부착되도록 하는 방식으로 올리고뉴클레오타이드를 만들기 위하여 반응하기 때문에 "5' 단부" 및 "3' 단부"를 가진다고 말한다. 올리고뉴클레오타이드의 단부는 만약 그것의 5' 포스페이트가 모노뉴클레오타이드 펜토오스 고리의 3' 산소에 연결되지 않으면 "5' 단부"로서 언급된다. 올리고뉴클레오타이드의 단부는 만약 그것의 3' 산소가 다른 모노뉴클레오타이드 펜토오스 고리의 5' 포스페이트에 연결되지 않으면 "3' 단부"로서 언급된다. 핵산 서열은 더 큰 올리고뉴클레오타이드의 내부에 있을지라도, 5' 및 3' 단부를 가지는 것으로 또한 말할 수 있다. 선형 또는 원형 DNA 분자에서, 별개의 요소는 "하류" 또는 3' 요소의 "상류" 또는 5'인 것으로 언급된다.
용어 "게놈상으로 통합된"은 뉴클레오타이드 서열이 세포의 게놈에 통합되도록 세포에 도입된 핵산을 나타낸다. 임의의 프로토콜이 세포의 게놈에 핵산의 안정적인 통합을 위해 사용될 수 있다.
용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구성물" 또는 "발현 카세트"는 특정 숙주 세포 또는 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 적절한 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 원하는 코딩 서열을 함유하는 재조합 핵산을 나타낸다. 원핵생물에서의 발현에 필요한 핵산 서열은 보통 프로모터, 오퍼레이터 (선택적임), 및 리보솜 결합 부위, 뿐만 아니라 다른 서열을 포함한다. 진핵 세포는 일반적으로 프로모터, 인핸서, 및 종결 및 폴리아데닐화 신호를 활용하는 것으로 알려지지만, 필요한 발현을 희생시키지 않으면서 일부 요소가 삭제되고 다른 요소가 첨가될 수 있다.
용어 "표적화 벡터"는 상동성 재조합, 비상동성 단부 연결-매개 결찰, 또는 세포의 게놈의 표적 위치에 대한 임의의 다른 재조합 수단에 의해 도입될 수 있는 재조합 핵산을 나타낸다.
용어 "바이러스 벡터"는 바이러스 기원의 적어도 한 요소를 포함하고 바이러스 벡터 입자로의 포장에 충분한 또는 포장을 허용하는 요소를 포함하는 재조합 핵산을 나타낸다. 벡터 및/또는 입자는 생체외에서 또는 생체내에서 DNA, RNA, 또는 다른 핵산을 세포에 전달할 목적으로 활용될 수 있다. 많은 형태의 바이러스 벡터가 알려져 있다.
단백질, 핵산, 및 세포와 관련하여, 용어 "분리된"은 정상적으로 제자리에 존재ㅎㄹ 수 있는 다른 세포 또는 유기체 구성요소와 관련하여 상대적으로 정제된 단백질, 핵산, 및 세포를 포함하며, 최대로 및 단백질, 핵산, 및 세포의 실질적으로 순수한 조제물을 포함한다. 용어 "분리된"은 또한 자연적으로 발생하는 대응물을 갖지 않은 단백질 및 핵산 또는 화학적으로 합성되었고 따라서 다른 단백질이나 핵산에 의해 실질적으로 오염되지 않은 단백질 또는 핵산을 포함한다. 용어 "분리된"은 또한 자연적으로 수반된 대부분의 다른 세포 구성요소 또는 유기체 구성요소 (예컨대, 다른 세포 단백질, 핵산, 또는 세포의 또는 세포외의 구성요소)로부터 분리되었거나 또는 정제된 단백질, 핵산, 또는 세포를 포함한다.
용어 "야생형"은 정상 (돌연변이, 질환, 변경, 등과 대조됨) 상태 또는 맥락에서 발견되는 구조 및/또는 활성을 가지는 실체를 포함한다. 야생형 유전자 및 폴리펩타이드는 자주 다수의 상이한 형태 (예컨대, 대립유전자)로 존재할 수 있다.
용어 "내인성 서열"은 세포 또는 비인간 동물 내에서 자연적으로 발생하는 핵산 서열을 나타낸다. 예를 들어, 비인간 동물의 내인성 Ttr 서열은 비인간 동물의 Ttr 유전자좌에서 자연적으로 발생하는 천연 Ttr 서열을 나타낸다.
"외인성" 분자 또는 서열은 그 형태로 세포에 정상적으로 존재하지 않는 분자 또는 서열을 포함한다. 정상적인 존재는 세포의 특정 발달 단계 및 환경 조건과 관련된 존재를 포함한다. 외인성 분자 또는 서열은, 예를 들어, 세포 내의 상응하는 내인성 서열의 돌연변이된 버전, 예컨대 내인성 서열의 인간화된 버전을 포함하거나, 또는 세포 내의 내인성 서열에 상응하지만 상이한 형태로 존재하는 (즉, 염색체 내에 없는) 서열을 포함할 수 있다. 대조적으로, 내인성 분자 또는 서열은 특정 환경 조건 하에서 특정 발달 단계에서 특정 세포에서 그 형태로 자연적으로 존재하는 분자 또는 서열을 포함한다.
용어 "이종성"은 핵산 또는 단백질의 맥락에서 사용될 때 핵산 또는 단백질이 동일한 분자에서 함께 자연적으로 발생하지 않는 적어도 2개의 분절을 포함하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 용어 "이종성"은, 핵산의 분절 또는 단백질의 분절과 관련하여 사용될 때, 핵산 또는 단백질이 자연적으로는 서로와 동일한 (예컨대, 함께 결합된) 관계로 발견되지 않는 둘 이상의 하위 서열을 포함하는 것을 나타낸다. 한 실례로서, 핵산 벡터의 "이종성" 영역은 자연적으로는 다른 분자와 함께 발견되지 않는 또 다른 핵산 분자 내의 또는 그것에 부착된 핵산의 분절이다. 예를 들어, 핵산 벡터의 이종성 영역은 자연적으로는 코딩 서열과 함께 발견되지 않는 서열에 의해 플랭킹된 코딩 서열을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 단백질의 "이종성" 영역은 자연적으로는 다른 펩타이드 분자와 함께 발견되지 않는 또 다른 펩타이드 분자 내의 또는 그것에 부착된 아미노산의 분절이다 (예컨대, 융합 단백질, 또는 태그 달린 단백질). 유사하게, 핵산 또는 단백질은 이종성 라벨 또는 이종성 분비 또는 국지화 서열을 포함할 수 있다.
"코돈 최적화"는 아미노산을 명시하는 3-염기쌍 코돈 조합의 다중성에 의해 나타나는 바와 같이, 코돈의 축퇴성이란 장점을 가지며, 일반적으로 천연 아미노산 서열을 유지하는 한편 천연 서열의 적어도 한 코돈을 숙주 세포의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 특히 숙주 세포에서의 증강된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 포함한다. 예를 들어, Cas9 단백질을 암호화하는 핵산은 자연적으로 발생하는 핵산 서열과 비교하여, 박테리아 세포, 효모 세포, 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 햄스터 세포, 또는 임의의 다른 숙주 세포를 포함한, 주어진 원핵 또는 진핵 세포에서 더 높은 빈도로 사용되는 코돈을 치환하기 위해 변형될 수 있다. 코돈 용법 표는, 예를 들어, "코돈 용법 데이터베이스"에서 쉽게 활용 가능하다. 이들 표는 다양한 방법으로 적응될 수 있다. Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Research 28:292 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조. 특정 숙주에서의 발현을 위한 특정 서열의 코돈 최적화에 대한 컴퓨터 알고리즘 또한 활용 가능하다 (예컨대, Gene Forge).
용어 "유전자좌"는 유전자 (또는 유의미한 서열), DNA 서열, 폴리펩타이드-암호화 서열의 특정 위치, 또는 유기체의 게놈의 염색체상의 위치를 나타낸다. 예를 들어, "Ttr 유전자좌"는 Ttr 유전자, Ttr DNA 서열, 트랜스티레틴-암호화 서열의 특정 위치, 또는 이러한 서열이 있는 것으로서 확인된 유기체의 게놈의 염색체 상에서의 Ttr 위치를 나타낼 수 있다. "Ttr 유전자좌"는 예를 들어, 인핸서, 프로모터, 5' 및/또는 3' 미번역 영역 (UTR), 또는 이것들의 조합을 포함한, Ttr 유전자의 조절 요소를 포함할 수 있다.
용어 "유전자"는 생성물 (예컨대, RNA 생성물 및/또는 폴리펩타이드 생성물)을 암호화하고 유전자가 전장(full-length) mRNA (5' 및 3' 미번역 서열을 포함함)에 상응하도록 비코딩 인트론으로 방해된 코딩 영역 및 5' 및 3' 단 부 둘 다에서 코딩 영역에 인접하여 위치한 서열을 포함하는 염색체에서의 DNA 서열을 나타낸다. 용어 "유전자"는 또한 조절 서열 (예컨대, 프로모터, 인핸서, 및 전사 인자 결합 부위), 폴리아데닐화 신호, 내부 리보솜 유입 부위, 사일런서, 격리 서열(insulating sequence), 및 기질 부착 영역을 포함하는 다른 비코딩 서열을 포함한다. 이들 서열은 유전자의 코딩 영역에 가깝게 (예컨대, 10 kb 내에) 또는 먼 곳에 있을 수 있고, 유전자의 전사 및 발현의 수준 또는 속도에 영향을 준다.
용어 "대립유전자"는 유전자의 변이 형태를 나타낸다. 일부 유전자는 염색체 상에서 동일한 위치, 유전자 유전자좌에서 보이는 다양한 상이한 형태를 가진다. 이배체 유기체는 각각의 유전자 유전자좌에서 2개의 대립유전자를 가진다. 대립유전자의 각 쌍은 특정 유전자 유전자좌의 유전자형을 나타낸다. 유전자형은 만약 그것이 특정 유전자좌에서 2개의 동일한 대립유전자라면 동형접합성인 것으로 기술되고 두 대립유전자가 상이하다면 이형접합성인 것으로 기술된다.
유전자의 "코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은 엑손으로 구성된, 단백질을 암호화는 유전자의 DNA 또는 RNA의 부분으로 이루어진다. 영역은 5' 단부에서 개시 코돈에서 시작하고 3' 단분에서 중단 코돈에서 종결된다.
"프로모터"는 보통 특정 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 적절한 전사 개시 부위에서 RNA 합성을 개시하도록 RNA 중합효소 II를 지시할 수 있는 TATA 박스를 포함하는 DNA의 조절 영역이다. 프로모터는 추가적으로 전사 개시 속도에 영향을 주는 다른 영역을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 프로모터 서열은 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드의 전사를 조절한다. 프로모터는 본원에 개시된 하나 이상의 세포 유형 (예컨대, 진핵 세포, 비인간 포유류 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 만능 세포, 1세포기 배아, 분화 세포, 또는 이것들의 조합)에서 활성일 수 있다. 프로모터는, 예를 들어, 구성적으로 활성인 프로모터, 조건부 프로모터, 유도성 프로모터, 일시적으로 제한된 프로모터 (예컨대, 발달상 조절된 프로모터), 또는 공간적으로 제한된 프로모터 (예컨대, 세포-특이적 또는 조직-특이적 프로모터)일 수 있다. 프로모터의 실례는, 예를 들어, WO 2013/176772 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다.
"작동 가능한 연결" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 구성요소들이 정상적으로 기능하고 구성요소 중 적어도 하나가 다른 구성요소 중 적어도 하나에 대해 발휘되는 기능을 매개할 수 있도록 둘 이상의 구성요소 (예컨대, 프로모터와 다른 서열 요소)의 병렬 배치를 포함한다. 예를 들어, 프로모터는 만약 프로모터가 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 대한 반응으로 코딩 서열의 전사 수준을 제어한다면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 작동 가능한 연결은 서로 연속적으로 존재하거나 트란스로 작용하는 그러한 서열을 포함할 수 있다 (예컨대, 조절 서열은 코딩 서열의 전사를 제어하기 위해 일정 거리에서 작용할 수 있다).
핵산의 "상보성"은 그것의 핵염기 기의 방향으로 인해 핵산의 한 가닥에 있는 뉴클레오타이드 서열이 반대쪽의 핵산 가닥에 있는 다른 서열과 수소 결합을 형성하는 것을 의미한다. DNA에서 상보하는 염기는 전형적으로 A와 T 및 C와 G이다. RNA에서는, 그것은 전형적으로 C와 G 및 U와 A이다. 상보성은 완벽하거나 실질적인/충분한 것일 수 있다. 두 핵산 사이의 완벽한 상보성은 두 핵산이 듀플렉스에서 모든 염기가 왓슨 크릭 쌍형성에 의해 상보하는 염기에 결합하는 듀플렉스를 형성할 수 있음을 의미한다. "실질적인" 또는 "충분한" 상보하는은 한 가닥의 서열이 반대쪽 가닥의 서열에 완전하게 및/또는 완벽하게 상보하지는 않지만, 혼성화 조건 (예컨대, 염 농도 및 온도)의 환경에서 안정적인 하이브리드 복합체를 형성하기 위해 두 가닥의 염기 사이에 충분한 결합이 일어나는 것을 의미한다. 이러한 조건은 혼성화된 가닥의 Tm (용융 온도)를 예측하기 위한 서열 및 가닥 수학적 계산을 사용함으로써, 또는 기본적인 방법을 사용하여 Tm의 실험적 측정에 의해 예측될 수 있다. Tm은 두 핵산 가닥 사이에 형성된 혼성화 복합체 집단이 50% 변성되는 (즉, 이중 가닥 핵산 분자 집단이 절반이 단일 가닥으로 분해됨) 온도를 포함한다. Tm보다 낮은 온도에서, 혼성화 복합체의 형성이 우선시되는 반면, Tm보다 높은 온도에서, 혼성화 복합체의 용융 또는 가닥의 분리가 우선시된다. Tm은 1 M NaCl 수용액에서, 예컨대 Tm=81.5+0.41(% G+C)를 사용함으로써 공지된 G+C 함량을 가진 핵산에 대해 추정될 수 있지만, 다른 알려진 Tm 계산은 핵산 구조 특성을 고려한다.
"혼성화 조건"은 한 핵산 가닥이 상보하는 가닥 상호작용 및 수소 결합에 의해 제2 핵산 가닥에 결합하여 혼성화 복합체를 생성하는 누적 환경을 포함한다. 이러한 조건은 핵산을 함유한 수성 또는 유기 용액의 화학적 구성요소 및 그것들의 농도 (예컨대, 염, 킬레이트화제, 포름아미드), 및 혼합물의 온도를 포함한다. 다른 인자, 예컨대 인큐베이션 시간의 길이 또는 반응 챔버 크기가 환경에 기여할 수 있다. 예컨대, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.sup.nd ed., pp. 1.90-1.91, 9.47-9.51, 1 1.47-11.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
혼성화는 두 핵산이 상보하는 서열을 함유하는 것을 필요로 하지만, 염기 사이의 미스매치도 가능하다. 두 핵산 사이의 혼성화에 적절한 조건은 잘 알려져 있는 변수인 핵산의 길이 및 상보 정도에 좌우된다. 두 뉴클레오타이드 서열 간 상보 정도가 클수록, 그 서열을 가지는 핵산의 하이브리드에 대한 용융 온도 (Tm) 값이 더 커진다. 짧은 구간의 상보성 (예컨대 35개 이하, 30개 이하, 25개 이하, 22개 이하, 20개 이하, 또는 18개 이하의 뉴클레오타이드에 걸친 상보성)을 가진 핵산 사이의 혼성화의 경우, 미스매치의 위치가 중요해진다 (Sambrook et al., 상기 동일, 11.7-11.8 참조). 전형적으로, 혼성화 가능한 핵산에 대란 길이는 적어도 약 10개 뉴클레오타이드이다. 혼성화 가능한 핵산에 대한 예시적인 최소 길이는 적어도 약 15개 뉴클레오타이드, 적어도 약 20개 뉴클레오타이드, 적어도 약 22개 뉴클레오타이드, 적어도 약 25개 뉴클레오타이드, 및 적어도 약 30개 뉴클레오타이드를 포함한다. 나아가, 온도 및 세척 용액 염 농도가 상보 영역의 길이 및 상보 정도와 같은 인자에 따라 필요에 따라 조정될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드의 서열은 특이적으로 혼성화 가능하도록 그것의 표적 핵산의 서열에 대해 100% 상보할 필요는 없다. 더욱이, 폴리뉴클레오타이드는 개재하는 또는 인접한 분절이 혼성화 사건에 포함되지 않도록 하나 이상의 분절에 혼성화할 수 있다 (예컨대, 루프 구조 또는 헤어핀 구조). 폴리뉴클레오타이드 (예컨대, gRNA)는 표적화될 표적 핵산 서열 내의 표적 영역에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 상보성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 20개의 뉴클레오타이드 중 18개가 표적 영역에 상보하고, 따라서 특이적으로 혼성화할 gRNA는 90% 상보성을 나타낼 것이다. 이 실례에서, 나머지 비상보 뉴클레오타이드는 클러스터링되거나 상보하는 뉴클레오타이드와 산재될 수 있고 서로 또는 상보하는 뉴클레오타이드에 연속적일 필요는 없다.
핵산 내의 핵산 서열의 특정 구간 사이의 퍼센트 상보성은 기본적으로 BLAST 프로그램 (염기성 국소 정렬 조사 도구) 및 PowerBLAST 프로그램 (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Zhang and Madden (1997) Genome Res. 7:649-656, (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨))을 사용하여 또는 Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489, (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)의 알고리즘을 사용하는, 디폴트 세팅을 사용하는 Gap 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, 버전 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)을 사용함으로써 측정될 수 있다.
본원에서 제공된 방법 및 조성물은 다양한 상이한 구성요소를 사용한다. 설명 전체를 통해 일부 구성요소는 활성 변이체 및 단편을 가질 수 있다. 이러한 구성요소는, 예를 들어, Cas 단백질, CRISPR RNA, tracrRNA, 및 가이드 RNA를 들 수 있다. 이들 구성요소의 각각에 대한 생물학적 활성은 본원의 다른 곳에서 기술된다. 용어 "기능적"은 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는 단백질 또는 핵산 (또는 그것의 단편 또는 변이체)의 선천적인 능력을 나타낸다. 이러한 생물학적 활성 또는 기능으로는, 예를 들어, 가이드 RNA 및 표적 DNA 서열에 결합하는 Cas 단백질의 능력을 들 수 있다. 기능적 단편 또는 변이체의 생물학적 기능은 원래의 것과 비교하여 동일하거나 실제로 변화될 수 있지만 (예컨대, 그것의 특이성 또는 선택성 또는 효능과 관련하여), 기본적인 생물학적 기능은 보유된다.
용어 "변이체"는 집단에서 가장 만연된 서열과 (예컨대, 한 뉴클레오타이드만큼) 상이한 뉴클레오타이드 서열 또는 집단에서 가장 만연된 서열과 (예컨대, 한 아미노산만큼) 상이한 단백질 서열을 나타낸다.
용어 "단편"은 단백질을 언급할 때 전장 단백질보다 짧거나 더 적은 아미노산을 가지는 단백질을 의미한다. 용어 "단편"은 핵산을 의미할 때 전장 핵산보다 짧거나 더 적은 뉴클레오타이드를 가지는 핵산을 의미한다. 단편은, 예를 들어, N-말단 단편 (즉, 단백질의 C-말단부 부분의 제거), C-말단 단편 (즉, 단백질의 N-말단부의 제거), 또는 내부 단편일 수 있다.
두 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 명시된 비교 창에 걸쳐 최대의 상응성을 위해 정렬될 때 동일한 두 서열의 잔기를 언급한다. 서열 동일성의 백분율이 단백질을 언급하는데 사용될 때, 동일하지 않은 잔기 위치는 자주 보존성 아미노산 치환에 의해 상이하며, 이때 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성 (예컨대, 전하 또는 소수성)을 가진 다른 아미노산 잔기에 대해 치환되며 따라서 분자의 기능적 특성을 변화하지 않는다. 서열이 보존성 치환에서 상이할 때, 퍼센트 서열 동일성은 치환의 보존성 성질을 교정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 보존성 치환에 의해 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 가진 것으로 말할 수 있다. 이런 조정을 만들기 위한 수단은 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이것은 전체 미스매치보다는 오히려 부분으로서 보존성 치환을 채점하는 것을 포함하며, 그로써 백분율 서열 동일성을 증가시킨다. 그러므로, 예를 들어, 동일한 아미노산이 1의 점수로 제공되고 비보존성 치환이 0의 점수로 제공되면, 보존성 치환은 0과 1 사이의 점수로 제공된다. 보존성 치환의 채점은, 예컨대 프로그램 PC/유전자 (IntelliGenetics, Mountain View, California)에서 실행된 것과 같이 계산된다.
"서열 동일성의 백분율"은 비교 창에 걸친 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 측정된 값 (완벽하게 매치된 잔기의 최대 수)을 포함하고, 여기서 비교 창의 폴리뉴클레오타이드 서열의 부분은 두 서열의 최적 정렬에 대한 참조 서열 (첨가 또는 삭제를 포함하지 않음)과 비교하여 첨가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다. 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열에서 발생하여 매치된 위치의 수를 만들어내는 위치의 수를 측정하고, 매치된 위치의 수를 비교 창의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과를 100으로 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 다르게 명시되지 않는 한 (예컨대, 더 짧은 서열이 연결된 이종성 서열을 포함함), 비교 창은 비교되는 두 서열의 더 짧은 서열의 전체 길이이다.
다르게 진술되지 않는 한, 서열 동일성/유사성 값은 다음의 파라미터를 사용하여 GAP 버전 10을 사용하여 얻어진 값을 포함한다: 50의 GAP 웨이트 및 3의 길이 웨이트, 및 nwsgapdna.cmp 채점 매트릭스를 사용하는 뉴클레오타이드 서열에 대한 % 동일성 및 % 유사성; 8의 GAP 웨이트 및 2의 길이 웨이트, 및 BLOSUM62 채점 매트릭스를 사용하는 아미노산 서열에 대한 % 동일성 및 % 유사성; 또는 이것들의 임의의 동등한 프로그램. "동등한 프로그램"은, 문제의 임의의 2개 서열에 대해, GAP 버전 10에 의해 생성된 상응하는 정렬과 비교할 때 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 매치 및 동일한 퍼센트 서열 동일성을 가지는 정렬을 생성하는 임의의 서열 비교 프로그램을 포함한다.
용어 "보존성 아미노산 치환"은 서열에 정상적으로 존재하는 아미노산의 유사한 크기, 전하, 또는 극성의 상이한 아미노산으로의 치환을 나타낸다. 보존성 치환의 실례로는 이소류신, 발린, 또는 류신과 같은 비극성 (소수성) 잔기의 또 다른 비극성 잔기에 대한 치환을 들 수 있다. 마찬가지로, 보존성 치환의 실례로 아르기닌과 리신 사이, 글루타민과 아스파라긴 사이, 또는 글리신과 세린 사이와 같은 한 극성 (친수성) 잔기의 다른 것에 대한 치환을 들 수 있다. 추가적으로, 리신, 아르기닌, 또는 히스티딘과 같은 염기성 잔기의 다른 것에 대한 치환, 또는 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 한 산성 잔기의 다른 산성 잔기에 대한 치환이 보존성 치환의 추가적인 실례이다. 비보존성 치환의 실례로는 이소류신, 발린, 류신, 알라닌, 또는 메티오닌과 같은 비극성 (소수성) 아미노산 잔기의 시스테인, 글루타민, 글루탐산 또는 리신과 같은 극성 (친수성) 잔기에 대한 및/또는 극성 잔기의 비극성 잔기에 대한 치환을 들 수 있다. 전형적인 아미노산 분류가 하기 표 1에 요약된다.
아미노산 분류
알라닌 Ala A 비극성 중성 1.8
아르기닌 Arg R 극성 양성 -4.5
아스파라긴 Asn N 극성 중성 -3.5
아스파르트산 Asp D 극성 음성 -3.5
시스테인 Cys C 비극성 중성 2.5
글루탐산 Glu E 극성 음성 -3.5
글루타민 Gln Q 극성 중성 -3.5
글리신 Gly G 비극성 중성 -0.4
히스티딘 His H 극성 양성 -3.2
이소류신 Ile I 비극성 중성 4.5
류신 Leu L 비극성 중성 3.8
리신 Lys K 극성 양성 -3.9
메티오닌 Met M 비극성 중성 1.9
페닐알라닌 Phe F 비극성 중성 2.8
프롤린 Pro P 비극성 중성 -1.6
세린 Ser S 극성 중성 -0.8
트레오닌 Thr T 극성 중성 -0.7
트립토판 Trp W 비극성 중성 -0.9
티로신 Tyr Y 극성 중성 -1.3
발린 Val V 비극성 중성 4.2
"상동성" 서열 (예컨대, 핵산 서열)은 공지의 참조 서열에 동일하거나 실질적으로 유사한 서열을 포함하여서, 그것은 예를 들어, 공지의 참조 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일하다. 상동성 서열은, 예를 들어, 병렬상동(orthologous) 서열 및 직렬상동(paralogous) 서열을 포함할 수 있다. 상동성 유전자는, 예를 들어, 전형적으로 종분화 사건 (병렬상동 유전자) 또는 유전자 복제 사건 (직렬상동 유전자) 중 어느 하나를 통해 공통 조상 DNA 서열로부터 내려온다. "병렬상동" 유전자는 공통 조상 유전자로부터 종분화에 의해 진화된 상이한 종의 유전자를 포함한다. 오르톨로그(Ortholog)는 전형적으로 진화 과정에서 동일한 기능을 보유한다. "직렬상동" 유전자는 게놈 내에서의 복제에 의해 관련된 유전자를 포함한다. 파랄로그(Paralog)는 진화 과정에서 새로운 기능으로 진화할 수 있다.
용어 "시험관내"는 인공적인 환경을 포함하며 인공적인 환경 (예컨대, 테스트 튜브) 내에서 일어나는 과정 또는 반응을 나타낸다. 용어 "생체내"는 천연 환경 (예컨대, 세포 또는 유기체 또는 신체)을 포함하며 천연 환경 내에서 일어나는 과정 또는 반응을 나타낸다. 용어 "생체외"는 개체의 신체로부터 제거된 세포를 포함하며 그러한 세포 내에서 일어나는 과정 또는 반응을 나타낸다.
용어 "리포터 유전자"는 내인성 또는 이종성 프로모터 및/또는 인핸서 요소에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자 서열을 포함하는 구성물이 프로모터 및/또는 인핸서 요소의 활성화에 필요한 인자를 함유한 (또는 함유하도록 만들어진) 세포에 도입될 때 쉽게 그리고 정량화하여 검정되는 유전자 생성물 (전형적으로 효소)을 암호화하는 서열을 가지는 핵산을 나타낸다. 리포터 유전자의 실례로, 한정하는 것은 아니지만, 베타-갈락토시다제 (lacZ)를 암호화하는 유전자, 박테리아 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (cat) 유전자, 반딧불이 루시퍼라제 유전자, 베타-글루쿠로니다제 (GUS)를 암호화하는 유전자, 및 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 들 수 있다. "리포터 단백질"은 리포터 유전자에 의해 암호화된 단백질을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바 용어 "형광 리포터 단백질"은 형광이 리포터 단백질로부터 직접적으로, 형광성 기질 상의 리포터 단백질의 활성으로부터, 또는 형광 태그가 달린 화합물에 대한 결합 친화성을 가진 단백질로부터 유래할 수 있는 형광을 기반으로 검출 가능한 리포터 단백질을 의미한다. 형광 단백질의 실례로 녹색 형광 단백질 (예컨대, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, eGFP, 에메랄드, 아자미 그린(Azami Green), 단량체 아자미 그린, CopGFP, AceGFP, 및 ZsGreenl), 황색 형광 단백질 (예컨대, YFP, eYFP, 시트린(Citrine), 비너스(Venus), YPet, PhiYFP, 및 ZsYellowl), 청색 형광 단백질 (예컨대, BFP, eBFP, eBFP2, 아즈라이트(Azurite), mKalamal, GFPuv, 사파이어, 및 T-사파이어), 청록색 형광 단백질 (예컨대, CFP, eCFP, 진청색(Cerulean), CyPet, AmCyanl, 및 Midoriishi-Cyan), 적색 형광 단백질 (예컨대, RFP, mKate, mKate2, mPlum, DsRed 단량체, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-단량체, HcRed-Tandem, HcRedl, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry, 및 Jred), 오렌지색 형광 단백질 (예컨대, mOrange, mKO, Kusabira-Orange, 단량체 Kusabira-Orange, mTangerine, 및 tdTomato), 및 세포에서의 존재가 유동 세포분석법에 의해 검출될 수 있는 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 들 수 있다.
이중 가닥 절단 (DSB)에 대한 반응으로의 수복은 주로 2가지 보존된 DNA 수복 경로: 상동성 재조합 (HR) 및 비상동성 말단 연결 (NHEJ)에 의해 일어난다. Kasparek & Humphrey (2011) Seminars in Cell & Dev. Biol. 22:886-897 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 마찬가지로, 외인성 도너 핵산에 의해 매개된 표적 핵산의 수복은 두 폴리뉴클레오타이드 사이의 유전자 정보 교환의 임의 과정을 포함할 수 있다.
용어 "재조합"은 두 폴리뉴클레오타이드 사이의 유전자 정보 교환의 임의 과정을 포함하고 임의의 메커니즘에 의해 일어날 수 있다. 재조합은 상동성 인도 수복 (HDR) 또는 상동성 재조합 (HR)을 통해 일어날 수 있다. HDR 또는 HR은 뉴클레오타이드 서열 상동성을 필요로 할 수 있는 핵산 수복의 형태를 포함하며, "표적" 분자 (즉, 이중 가닥 절단을 겪은 분자)의 수복을 위한 주형으로서 "도너" 분자를 사용하고, 도너로부터 표적으로의 유전자 정보의 전달로 이어진다. 임의의 특정 이론에 얽매이기를 바라지 않지만, 이러한 전달은 절단된 표적 및 도너 사이에서 형성되는 이종듀플렉스 DNA의 미스매치 교정, 및/또는 도너가 표적의 일부가 될 유전자 정보를 재합성하기 위해 사용되는 합성-의존성 가닥 어닐링, 및/또는 관련된 과정을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 도너 폴리뉴클레오타이드, 도너 폴리뉴클레오타이드의 일부분, 도너 폴리뉴클레오타이드의 복사물, 또는 도너 폴리뉴클레오타이드의 복사물의 일부분은 표적 DNA에 통합된다. Wang et al. (2013) Cell 153:910-918; Mandalos et al. (2012) PLOS ONE 7:e45768:1-9; 및 Wang et al. (2013) Nat Biotechnol. 31:530-532 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
NHEJ는 상동성 주형을 필요로 하지 않으면서 절단 단부의 또 다른 절단 단부에의 또는 외인성 서열에의 직접적인 결찰에 의한 핵산의 이중 가닥 절단의 수복을 포함한다. NHEJ에 의한 비연속 서열의 결찰은 자주 이중 가닥 절단 부위 가까이에서 삭제, 삽입, 또는 전위를 초래할 수 있다. 예를 들어, NHEJ는 또한 절단 단부의 외인성 도너 핵산 단부와의 직접 결찰을 통해 외인성 도너 핵산의 표적화된 통합 (즉, NHEJ-기반 포획)을 초래한다. 이러한 NHEJ-매개된 표적화된 통합은 상동성 인도 수복 (HDR) 경로가 쉽게 사용 가능하지 않을 때 (예컨대, 비분할 세포, 일차 세포, 및 상동성-기반 DNA 수복이 빈약하게 수행되는 세포에서) 외인성 도너 핵산의 삽입에 바람직할 수 있다. 이에 더불어, 상동성 인도 수복과 대조적으로, 절단 부위의 측면의 서열 동일성의 큰 영역과 관련된 지식은 필요하지 않으며, 이것은 그것에 대한 게놈 서열의 지식이 한정된 게놈을 가진 유기체 안에 표적화된 삽입을 시도할 때에 유익할 수 있다. 통합은 외인성 도너 핵산과 절단된 게놈 서열 사이의 블런트 단부의 결찰을 통해, 또는 절단된 게놈 서열에서 뉴클레아제 작용제에 의해 생성된 오버행과 부합하는 오버행이 측면에 있는 외인성 도너 핵산을 사용하여 스티키 단부 (즉, 5' 또는 3' 오버행을 가지는 단부)의 결찰을 통해 진행될 수 있다. 예컨대, US 2011/020722, WO 2014/033644, WO 2014/089290, 및 Maresca et al. (2013) Genome Res. 23(3):539-546 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 만약 블런트 단부가 결찰되면, 단편 연결을 위해 필요한 미세상동성 영역을 생성하기 위해 표적 및/또는 도너 절제가 필요할 수 있고, 이것은 표적 서열에서 원치 않는 변경을 생성할 수 있다.
용어 "항원 결합 단백질"은 항원에 결합하는 임의의 단백질을 포함한다. 항원 결합 단백질의 실례는 항체, 항체의 항원 결합 단편, 다중특이적 항체 (예컨대, 이중특이적 항체), scFV, 비스-scFV, 디아바디, 트라이아바디, 테트라바디, V-NAR, VHH, VL, F(ab), F(ab)2, DVD (이중 가변 도메인 항원 결합 단백질), SVD (단일 가변 도메인 항원 결합 단백질), 이중특이적 T-세포 인게이저(engager) (BiTE), 또는 데이비스바디(Davisbody)를 들 수 있다 (미국 특허 제 8,586,713호, 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
용어 "항원"은 전체 분자거나 분자 내 도메인이거나간에, 물질에 대한 결합 특이성을 가진 항체의 생성을 유도할 수 있는 물질을 나타낸다. 용어 항원은 또한 야생형 숙주 유기체에서 자기 인식에 의해 항체 생성을 유도하지는 못하지만, 면역학적 내성을 파괴하기 위하여 적절한 유전자 조작이 이루어진 숙주 동물에서 그러한 반응을 유도할 수 있는 물질을 포함한다.
용어 "에피토프"는 항원 결합 단백질 (예컨대, 항체)이 결합하는 항원 상의 부위를 나타낸다. 에피토프는 하나 이상의 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된(juxtaposed) 연속적인 아미노산 또는 비연속적인 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 연속적 아미노산으로부터 형성된 에피토프 (선형 에피토프로도 알려져 있음)는 전형적으로 변성 용매에 노출시 보유되는 반면 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프 (형태적 에피토프로도 알려져 있음)는 전형적으로 변성 용매로 처리시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 적어도 3개, 보다 통상적으로는 적어도 5개 또는 8 내지 10개의 아미노산을 독특한 공간적 형태로 포함한다. 에피토프의 공간적 형태를 결정하는 방법은, 예를 들어, x-선 결정학 및 2차원 핵자기공명을 들 수 있다. 예컨대, Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996) (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
본원에서 기술되는 것과 같은 항체 파라토프는 일반적으로 이종성 에피토프를 특이적으로 인식하는 최소 상보성 결정 영역 (CDR) (예컨대, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 CDR3 영역)을 포함한다.
용어 "항체"는 4개의 폴리펩타이드 사슬, 즉 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 면역글로불린 분자이다. 각 중쇄는 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인을 포함한다: CH1, CH2 및 CH3. 각 경쇄는 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함한다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 프레임워크 영역 (FR)으로 명명된 보다 보존된 영역이 사이에 끼어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 명명된 초가변성 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단 방향으로 다음의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 약칭될 수 있고; 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 약칭될 수 있다). 용어 "고친화성" 항체는 그것의 표적 에피토프와 관련하여 약 of 10-9 M 이하 (예컨대, 약 1Х10-9 M, 1Х10-10 M, 1Х10-11 M, 또는 약 1Х10-12 M)의 KD 를 가지는 항체를 나타낸다. 한 구체예에서, KD는 표면 플라즈몬 공명, 예컨대 BIACORETM에 의하여 측정되고; 다른 구체예에서, KD는 ELISA에 의하여 측정된다.
항원 결합 단백질의 그것의 표적 항원에 대한 특이적 결합은 적어도 106, 107, 108, 109, 또는 1010 M-1의 친화성으로의 결합을 포함한다. 특이적 결합은 적어도 하나의 비관련 표적에 대해 발생하는 비특이적 결합과 크기에 있어 검출 가능할 정도로 더 높고 구별할 수 있다. 특이적 결합은 특정 작용기 또는 특정 공간적 피트 사이의 결합의 형성의 결과 (예컨대, 자물쇠와 열쇠 유형)일 수 있는 반면 비특이적 결합은 보통 반 데르 발스 힘의 결과이다. 그러나 특이적 결합은 반드시 항원 결합 단백질이 오직 하나의 표적에만 결합하는 것을 암시하는 것은 아니다.
용어 "안티센스 RNA"는 세포에서 전사되는 메신저 RNA 가닥에 상보하는 단일 가닥 RNA를 나타낸다.
용어 "작은 간섭 RNA (siRNA)"는 전형적으로 RNA 간섭 (RNAi) 경로를 유도하는 이중 가닥 RNA 분자를 나타낸다. 이들 분자는 길이가 다를 수 있고 (일반적으로 18 내지 30 염기쌍임) 안티센스 가닥에서 그것들의 표적 mRNA에 대한 다양한 정도의 상보성을 함유한다. 전체는 아니지만, 일부의 siRNA는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 5' 또는 3' 단부에 쌍을 이루지 않은 오버행 염기를 가지고 있다. 용어 "siRNA"는 2개의 별도의 가닥의 듀플레스뿐만 아니라, 듀플렉스 영역을 포함하는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 단일 가작을 포함한다. 이중 가닥 구조는, 예를 들어, 길이가 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 뉴클레오타이드 미만일 수 있다. 예를 들어, 이중 가닥 구조는 약 21-23개 뉴클레오타이드 길이, 약 19-25개 뉴클레오타이드 길이, 또는 약 19-23개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
용어 "짧은 헤어핀 RNA (shRNA)"는 헤어핀 구조에서 자체 혼성화하고 프로세싱시 RNA 간섭 (RNAi) 경로를 유도할 수 있는 RNA 염기의 단일 가닥을 나타낸다. 이들 분자는 길이가 다를 수 있다 (일반적으로 약 50-90개 뉴클레오타이드의 길이, 또는 일부 경우에, microRNA-적응 shRNA의 경우 최대 250개 이상의 뉴클레오타이드 길이). shRNA 분자는 siRNA를 형성하기 위해 세포 내에서 가공될 수 있고, 그것은 결국 유전자 발현을 녹다운시킬 수 있다. shRNA는 벡터에 통합될 수 있다. 용어 "shRNA"는 또한 그것으로부터 짧은, 헤어핀 RNA 분자가 전사될 수 있는 DNA 분자를 나타낸다.
하나 이상의 인용된 요소를 "포함하는" 조성물 또는 방법은 구체적으로 인용되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질을 "포함하는" 조성물은 단백질을 단독으로 또는 다른 성분과 함께 함유할 수 있다. 전환 문구인 "본질적으로 ~으로 이루어지는"은 청구항의 범주가 그 청구항에서 인용된 명시된 요소 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들을 포함하는 것으로 해석되어야 하는 것을 의미한다. 그러므로, 용어 "본질적으로 ~으로 이루어지는"은 본 발명의 청구범위에서 사용될 때 "포함하는"과 동등하게 해석되는 것으로 의도된 것은 아니다.
"선택적인" 또는 "선택적으로"는 후속적으로 기술된 사건 또는 상황이 일어날 수도 있고 일어나지 않을 수도 있음을 의미하며 그런 기술이 사건 또는 상황이 일어나는 경우 및 일어나지 않는 경우를 포함하는 것을 의미한다.
값의 범위의 표시는 그 범위 내의 또는 그 범위를 규정하는 모든 정수, 및 그 범위 내의 정수에 의해 규정된 모든 하위범위를 포함한다.
맥락으로부터 분명히 다르지 않는 한, 용어 "약"은 진술된 값의 표준 측정 오차 (예컨대, SEM) 내의 값을 포함한다.
용어 "및/또는"은 하나 이상의 관련된 열거된 항목의 임의의 및 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안으로 해석될 때 ("또는") 조합의 부족을 나타내고 포함한다.
용어 "또는"은 특정 목록의 임의의 한 구성원을 나타내고 또한 그 목록의 구성원의 임의의 조합을 포함한다.
단수 형태를 나타내는 용어들은 맥락이 분명하게 다른 것을 표시하지 않는 한 복수의 대상물을 포함한다. 예를 들어, 용어 "단백질" 또는 "적어도 한 단백질"은 복수의 단백질, 및 그것들의 혼합물을 포함할 수 있다.
실질적으로 유의한 것은 p≤0.05를 의미한다.
상세한 설명
I. 개요
본원에는 게놈에 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 및 비인간 동물 및 그러한 비인간 동물 세포 및 비인간 동물의 사용 방법이 개시된다. 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 세포 또는 비인간 동물은 인간 트랜스티레틴 단백질 또는 인간 트랜스티레틴 단백질의 하나 이상의 단편을 포함하는 키메릭 트랜스티레틴 단백질을 발현한다. 이러한 비인간 동물 세포 및 비인간 동물은 인간-TTR-표적화제 (예컨대, CRISPR/Cas9 게놈 편집화제)의 전달 또는 효능을 생체외에서 또는 생체내에서 평가하기 위해 사용될 수 있고 생체외 또는 생체내에서 그러한 작용체의 효능의 전달을 최적화하는 방법에 사용될 수 있다.
본원에 개시된 비인간 동물 세포 및 비인간 동물의 일부에서, 대부분의 또는 모든 인간 TTR 게놈 DNA는 상응하는 병렬상동 비인간 동물 Ttr 유전자좌에 삽입된다. 본원에 개시된 비인간 동물 세포 및 비인간 동물의 일부에서, 대부분의 또는 모든 비인간 동물 Ttr 게놈 DNA는 상응하는 병렬상동 인간 TTR 게놈 DNA로 일대일 대체된다. cDNA 삽입을 가진 비인간 동물과 비교하여, 발현 수준은, 보존된 조절자 요소가 온전하게 남겨질 가능성이 더 크고, RNA 프로세싱이 진행되는 스플라이싱된 전사물이 cDNA보다 더 안정적이기 때문에, 인트론-엑손 구조 및 스플라이싱 기계가 유지될 때 더 높아야 한다. 대조적으로, 비인간 동물 Ttr 유전자좌로 (예컨대, 5' UTR의 인공적인 베타-글로빈 인트론의 삽입과 함께) 인간 TTR cDNA의 삽입은 비인간 동물 Ttr의 제1 엑손 및 인트론 내에 함유된 것과 같은 보존된 조절 요소를 없앨 것이다. 비인간 동물 게놈 서열을 상응하는 병렬상동 인간 게놈 서열로 대체하는 것 또는 인간 TTR 게놈 서열을 상응하는 병렬상동 비인간 Ttr 유전자좌에 삽입하는 것은 내인성 Ttr 유전자좌로부터 트랜스유전자의 충실한 발현을 초래할 가능성이 더 많다. 유사하게, 내인성 비인간-동물 Ttr 유전자좌보다 오히려 무작위 게놈 유전자좌에서 인간-TTR-코딩 서열이 형질전환으로 삽입된 형질전환 비인간 동물은 Ttr 발현의 내인성 조절을 정확하게 반영하지는 않을 것이다. 대부분의 또는 모든 비인간 동물 게놈 DNA를 일대일로 상응하는 병렬상동 인간 게놈 DNA로 대체하는 것 또는 인간 TTR 게놈 서열을 상응하는 병렬상동 비인간 Ttr 유전자좌에 삽입하는 결과로 유발된 인간화된 TTR 대립유전자는 인간-TTR-표적화 시약 (예컨대, 인간 TTR을 표적화하기 위하여 설계된 CRISPR/Cas9 시약)의 진정한 인간 표적 또는 진정한 인간 표적의 밀접한 근사치를 제공할 것이고, 그로써 살아 있는 동물에서 이러한 작용제의 효능 및 작용 방식뿐만 아니라 인간화된 단백질 및 인간화된 유전자가 존재하는 TTR의 유일한 버전인 환경에서 약동학 및 약력학 연구의 시험을 가능하게 한다.
II. 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 비인간 동물
본원에 개시된 세포 및 비인간 동물은 그것의 게놈에 인간화된 TTR 유전자좌를 포함한다. 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 세포 또는 비인간 동물은 인간 트랜스티레틴 단백질 또는 천연 트랜스티레틴 단백질의 하나 이상의 단편이 인간 트랜스티레틴의 상응하는 단편으로 대체되어 있는 부분적으로 인간화된, 키메릭 트랜스티레틴 단백질을 발현한다.
A. 트랜스티레틴 (TTR)
본원에서 기술된 세포 및 비인간 동물은 인간화된 트랜스티레틴 (Ttr) 유전자좌를 포함한다. 트랜스티레틴 (TTR)은 주로 간에서 합성되지만 맥락총에 의해서도 생성되는 127-아미노산, 55 kDa 혈청 및 뇌척수액 수송 단백질이다. 이것은 또한 프리알부민, 티록신결합 프리알부민, ATTR, TBPA, CTS, CTS1, HEL111, HsT2651, 및 PALB로도 언급되어 왔다. 천연 상태에서, TTR은 테트라머로서 존재한다. 동형접합체에서, 단일-테트라머는 동일한 127-아미노산 베타 시트-풍부 하위유닛을 포함한다. 이형접합체에서, TTR 테트라머는 전형적으로 통계학적 방식으로 조합된 변이체 및/또는 야생형 하위유닛으로 구성될 수 있다. TTR은 혈청 및 뇌척수액 둘 다에서 티록신(T4) 및 레티놀-결합 RBP (레티놀-결합 단백질)를 운반하는데 기여한다.
문맥으로부터 다르게 나타나지 않는 한, 인간 트랜스티레틴 (TTR) 또는 그것의 단편 또는 도메인에 대한 언급은, 동위체 및 대립유전자 변이체를 포함한 천연, 야생형 인간 아미노산 서열을 포함한다. 트랜스티레틴 전구체 단백질은 신호 서열 (전형적으로 20개 아미노산)을 포함하는 반면, 성숙한 트랜스티레틴 단백질은 그렇지 않다. 예시적인 TTR 폴리펩타이드 서열은 수탁 번호 NP_000362.1 (NCBI) 및 P02766.1 (UniProt) (동일함, 각각 SEQ ID NO: 1로 제시됨)로 표시된다. 잔기는 UniProt 수탁 번호 P02766.1에 따라, 잔기 1로 표시된 성숙한 단백질 (즉, 20개 아미노산 신호 서열을 포함하지 않음)의 제1 아미노산으로 넘버링될 수 있다. 임의의 다른 TTR 단백질에서, 잔기는 최대 정렬을 기반으로 UniProt 수탁 번호 P02766.1의 상응하는 잔기에 따라 넘버링된다.
인간 TTR 유전자는 염색체 18에 위치하고 4개의 엑손 및 3개의 인트론을 포함한다. 예시저인 인간 TTR 유전자는 GenBank 수탁 번호 NG_009490.1 (SEQ ID NO: 3)로 표시된 서열의 잔기 5001 내지 12258이다. SEQ ID NO: 3의 4개의 엑손은 각각 잔기 1-205, 1130-1260, 3354-3489, 및 6802-7258을 포함한다. SEQ ID NO: 3의 TTR 코딩 서열은 잔기 137-205, 1130-1260, 3354-3489, 및 6802-6909를 포함한다. 예시적인 인간 TTR mRNA는 NCBI 수탁 번호 NM_000371.3 (SEQ ID NO: 4)으로 표시된다.
마우스 Ttr 유전자는 염색체 18에 존재하고 또한 4개의 엑손 및 3개의 인트론을 포함한다. 예시적인 마우스 Ttr 유전자는 GenBank 수탁 번호 NC_000084.6 (SEQ ID NO: 5)으로 표시된 잔기 20665250 내지 20674326이다. SEQ ID NO: 5의 4개의 엑손은 각각 잔기 1-258, 1207-1337, 4730-4865, 및 8382-9077을 포함한다. SEQ ID NO:5의 Ttr 코딩 서열은 잔기 190-258, 1207-1337, 4730-4865, 및 8382-8489를 포함한다. 예시적인 마우스 TTR 단백질은 UniProt 수탁 번호 P07309.1 또는 NCBI 수탁 번호 NP_038725.1 (동일함, 각각 SEQ ID NO: 6으로 제시됨)로 표시된다. 예시적인 마우스 Ttr mRNA는 NCBI 수탁 번호 NM_013697.5 (SEQ ID NO: 7)로 표시된다.
예시적인 래트 TTR 단백질은 is designated by UniProt 수탁 번호 P02767로 표시된다. 예시적인 돼지 TTR 단백질은 UniProt 수탁 번호 P50390으로 표시된다. 예시적인 닭 TTR 단백질은 UniProt 수탁 번호 P27731로 표시된다. 예시적인 소 TTR 단백질은 UniProt 수탁 번호 O46375로 표시된다. 예시적인 양 TTR 단백질은 UniProt 수탁 번호 P12303으로 표시된다. 예시적인 침팬지 TTR 단백질은 UniProt 수탁 번호 Q5U7I5로 표시된다. 예시적인 오랑우탄 TTR 단백질은 UniProt 수탁 번호 Q5NVS2로 표시된다. 예시적인 토끼 TTR 단백질은 UniProt 수탁 번호 P07489로 표시된다. 예시적인 시노몰구스 원숭이 (마카크 원숭이) TTR 단백질은 UniProt 수탁 번호 Q8HXW1로 표시된다.
트랜스티레틴 (TTR) 아밀로이드증은 TTR로 구성된 아밀로이드 피브릴의 병원체성, 잘못 접혀진 TTR 및 세포외 침착을 특징으로 하는 전신성 장애이다. TTR 아밀로이드증은 일반적으로 (환경적 또는 유전자적 상태로 인한) 천연 TTR 테트라머 형태의 탈안정화에 의해 유발되어, 다양한 장기 및 조직에서 축적되는 아밀로이드 피브릴로의 TTR의 분해, 잘못 접힘, 및 응집으로 이어져서, 점진적인 기능장애를 유발한다. 분해된 단량체는 잘못 접혀진 단백질 응집체 및 아밀로이드 피브릴을 형성할 경향을 가진다.
인간에서, 야생형 TTR 테트라머 및 돌연변이 및 야생형 하위유닛으로 구성된 혼합된 테트라머는 전부 분해되고, 잘못 접히고, 그리고 응집될 수 있고, 이때 아밀로이드 생성 과정은 유사분열후 조직의 축퇴로 이어진다. 그러므로, TTR 아밀로이드증은 TTR의 돌연변이로부터 유발되는 또는 돌연변이되지 않은, 잘못 접혀진 TTR로부터 유발되는 병원성 잘못 접혀진 TTR에 의해 유발된 질환을 포함한다.
노인성 전신성 아밀로이드증 (SSA) 및 노인성 심장 아밀로이드증 (SCA)은 심장의 심근세포 외부 및 내부에 야생형 TTR 아밀로이드의 침착으로부터 유발되는 아밀로이드증의 연령 관련 유형이다. TTR 아밀로이드증은 또한 유전성 (가족성) 아밀로이드증의 가장 흔한 형태로, TTR 단백질을 탈안정화시키는 돌연변이에 의해 유발된다. TTR 유전자의 점 돌연변이와 관련된 TTR 아밀로이드증으로 가족성 아밀로이드 다발신경병증 (FAP), 가족성 아밀로이드 심근병증 (FAC), 및 중추신경계 선택성 아밀로이드증 (CNSA)을 들 수 있다.
B. 인간화된 TTR 유전자좌
본원에 개시된 인간화된 TTR 유전자좌는 전체 Ttr 유전자가 상응하는 병렬상동 인간 TTR 서열로 대체되어있는 Ttr 유전자좌이거나, 또는 Ttr 유전자의 일부분만이 상응하는 병렬상동 인간 TTR 서열로 대체된 (즉, 인간화된) Ttr 유전자좌일 수 있다. 인간화된 TTR 유전자좌는 또한 상응하는 병렬상동 내인성 서열을 대체하지 않고 내인성 Ttr 유전자좌에 삽입된 인간 TTR 서열을 포함할 수 있다. 내인성 Ttr 서열의 특정 분절에 상응하는 인간 TTR 서열은 인간 TTR 및 내인성 Ttr이 최적으로 정렬될 때 내인성 Ttr 서열의 특정 분절과 정렬되는 인간 TTR 영역을 나타낸다. 선택적으로, 인간 TTR 서열은 비인간 동물에서의 코돈 이용법을 기반으로 코돈-최적화되기 위해 변형된다. 대체된 또는 삽입된 (즉, 인간화된) 영역은 엑손과 같은 코딩 영역, 인트론과 같은 비코딩 영역, 미번역 영역, 또는 조절 영역 (예컨대, 프로모터, 인핸서, 또는 전사 억압자-결합 요소), 또는 이것들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
인간화된 TTR 유전자좌는 내인성 Ttr 유전자좌 영역이 삭제되어 있고 상응하는 병렬상동 인간 TTR 서열 (예컨대, 병렬상동 야생형 인간 TTR 서열)로 대체된 것이다. 대안적으로, 인간화된 TTR 유전자좌는 인간 TTR 유전자좌의 영역이 상응하는 내인성 비인간-동물 Ttr 유전자좌에 삽입되어 있는 것이다. 한 실례로서, 대체된 또는 삽입된 내인성 Ttr 유전자좌 영역은 코딩 서열 (즉, 엑손의 전부 또는 일부) 및 비코딩 서열 (즉, 인트론의 전부 또는 일부) 둘 다, 예컨대 적어도 하나의 엑손 및 적어도 하나의 인트론을 포함할 수 있다. 예를 들어, 대체된 또는 삽입된 영역은 적어도 하나의 엑손 및 적어도 하나의 인트론을 포함할 수 있다. 코딩 서열 및 비코딩 서열 둘 다를 포함하는 대체된 또는 삽입된 영역은 연속적인 내인성 Ttr 유전자좌 영역일 수 있고, 이것은 대체된 또는 삽입된 코딩 서열과 대체된 또는 삽입된 비코딩 서열 사이에 개재하는 서열이 없음을 의미한다. 예를 들어, 대체된 또는 삽입된 영역은 적어도 하나의 엑손 및 적어도 하나의 인접한 인트론을 포함할 수 있다. 대체된 또는 삽입된 영역은 내인성 Ttr 유전자좌의 하나의 엑손, 2개의 엑손, 3개의 엑손, 4개의 엑손, 또는 모든 엑손을 포함할 수 있다. 삽입된 인간 TTR 서열은 인간 TTR 유전자의 하나의 엑손, 2개의 엑손, 3개의 엑손, 4개의 엑손, 또는 모든 엑손을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 대체된 영역은 내인성 Ttr 유전자좌의 하나의 인트론, 2개의 인트론, 3개의 인트론, 또는 모든 인트론을 포함할 수 있다. 삽입된 인간 TTR 서열은 인간 TTR 유전자의 하나의 인트론, 2개의 인트론, 3개의 인트론, 또는 모든 인트론을 포함할 수 있다. 선택적으로, 내인성 Ttr 유전자좌의 하나 이상의 인트론 및/또는 하나 이상의 엑손은 변형되지 않은 채로 남아 있다 (즉, 삭제되거나 대체되지 않는다). 예를 들어, 내인성 Ttr 유전자좌의 제1 엑손은 변형되지 않은 채로 남아 있을 수 있다. 유사하게, 내인성 Ttr 유전자좌의 제1 엑손 및 제1 인트론은 변형되지 않은 채로 남아 있을 수 있다.
한 특정 실례에서, 트랜스티레틴 전구체 단백질에 대한 전체 코딩 서열은 삭제되고 상응하는 병렬상동 인간 TTR 서열로 대체될 수 있다. 예를 들어, 개시 코돈에서 시자하여 중간 코돈에서 끝나는 내인성 Ttr 유전자좌 영역이 삭제되고 상응하는 병렬상동 인간 TTR 서열로 대체될 수 있다. 다른 특정 실례에서, 인간 트랜스티레틴 전구체 단백질에 대한 전체 코딩 서열이 삽입될 수 있다. 예를 들어, 개시 코돈에서 시자하여 중간 코돈에서 끝나는 인간 TTR 유전자좌 영역이 삽입될 수 있다.
조절 서열을 포함하는 측면의 미번역 영역이 또한 인간화될 수 있다. Ttr 유전자좌의 제1 엑손은 전형적으로 개시 코돈 상류의 5' 미번역 영역을 포함한다. 마찬가지로, Ttr 유전자좌의 마지막 엑손은 전형적으로 중간 코돈 하류의 3' 미번역 영역을 포함한다. Ttr 개시 코돈의 상류 영역 및 Ttr 중단 코돈의 하류 영역은 변형되지 않거나 또는 삭제되고 상응하는 병렬상동 인간 TTR 서열로 대체될 수 있다. 예를 들어, 5' 미번역 영역 (UTR), 3' UTR, 또는 5' UTR과 3' UTR 둘 다 인간화되거나, 또는 5' UTR, 3'UTR, 또는 5' UTR 및 3' UTR 둘 다가 내인성으로 유지될 수 있다. 한 특정 실례에서, 5' UTR은 내인성으로 남아 있는다. 다른 특정 실례에서, 3' UTR은 인간화되지만, 5' UTR은 내인성으로 남아 있는다. 또 다른 특정 실례에서, 5' UTR은 내인성으로 남아 있고, 인간 TTR 3' UTR이 내인성 Ttr 유전자좌에 삽입된다. 예를 들어, 인간 TTR 3' UTR은 내인성 3' UTR을 대체하거나 내인성 3' UTR을 대체하지 않고 삽입될 수 있다 (예컨대, 그것은 내인성 3' UTR의 상류에 삽입될 수 있다).
트랜스티레틴 전구체 단백질의 하나 이상의 도메인을 암호화하는 내인성 Ttr 유전자좌의 하나 이상의 영역이 인간화될 수 있다. 마찬가지로, 트랜스티레틴 전구체 단백질의 하나 이상의 도메인을 암호화하는 내인성 Ttr 유전자좌의 하나 이상의 영역은 변형되지 않은 채로 남아 있을 수 있다 (즉, 삭제되거나 대체되지 않는다). 예를 들어, 트랜스티레틴 전구체 단백질은 전형적으로 N-말단에서 신호 펩타이드를 가진다. 신호 펩타이드는, 예를 들어, 약 20개 아미노산의 길이일 수 있다. 신호 펩타이드를 암호화하는 내인성 Ttr 유전자좌 영역은 변형되지 않은 채로 남아 있거나 (즉, 삭제나 대체되지 않음), 또는 삭제되고 상응하는 병렬상동 인간 TTR 서열로 대체될 수 있다. 유사하게, 항-인간-TTR 항원 결합 단백질에 의해 인식되는 에피토프를 암호화하는 내인성 Ttr 유전자좌 영역이 인간화될 수 있다.
상응하는 병렬상동 서열에 의한 대체 정도 또는 인간 TTR 서열의 삽입 정도에 따라, 조절 서열, 예컨대 프로모터는 내인성이거나, 대체하는 또는 삽입된 인간 병렬상동 서열이 제공될 수 있다. 예를 들어, 인간화된 TTR 유전자좌는 내인성 비인간 동물 Ttr 프로모터를 포함할 수 있다. 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌에서 트랜스티레틴 전구체 단백질에 대한 코딩 서열은 내인성 Ttr 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 인간 TTR 서열은 내인성 Ttr 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
특정 실례로서, 인간화된 TTR 유전자좌는 삭제되고 상응하는 병렬상동 인간 TTR 서열로 대체되는 내인성 Ttr 유전자좌 영역 또는 삽입되는 인간 TTR 유전자좌가 Ttr 개시 코돈으로부터 중단 코돈까지의 영역을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 것일 수 있다. 삽입되는 인간 TTR 서열은 추가로 인간 TTR 3' UTR을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간화된 TTR 유전자좌에 있는 인간 TTR 서열은 3' UTR의 TTR 개시 코돈으로부터 끝까지의 영역을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 선택적으로, 변형된 내인성 Ttr 유전자좌의 Ttr 코딩 서열은 내인성 Ttr 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 인간화된 TTR 유전자좌에 있는 인간 TTR 서열은 SEQ ID NO: 18에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 인간화된 TTR 유전자좌는 SEQ ID NO: 14 또는 15에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 인간화된 TTR 유전자좌에 있는 코딩 서열 (CDS)은 SEQ ID NO: 90 (또는 동일한 단백질을 암호화하는 그것의 축퇴물)에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 그 결과 얻어지는, 인간화된 TTR 유전자좌에 의해 암호화된 인간 트랜스티레틴 전구체 단백질은 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다.
다른 특정 실례로서, 인간화된 TTR 유전자좌는 내인성 Ttr 유전자좌 영역이 삭제되고 상응하는 병렬상동 인간 TTR 서열로 대체되는 것이거나 또는 삽입되는 인간 TTR 유전자좌의 영역은 제2 Ttr 엑손의 개시 코돈으로부터 중단 코돈까지의 영역을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 삽입되는 인간 TTR 서열은 추가로 인간 TTR 3' UTR을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간화된 TTR 유전자좌에 있는 인간 TTR 서열은 3' UTR의 제2 인간 TTR 엑손의 개시 코돈으로부터 끝까지의 영역을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 선택적으로, 변형된 내인성 Ttr 유전자좌의 Ttr 코딩 서열은 내인성 Ttr 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 인간화된 TTR 유전자좌에 있는 인간 TTR 서열은 SEQ ID NO: 19에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 인간화된 TTR 유전자좌는 SEQ ID NO: 16 또는 17에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 인간화된 TTR 유전자좌에 있는 코딩 서열 (CDS)은 SEQ ID NO: 91 (또는 동일한 단백질을 암호화하는 그것의 축퇴물)에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 그 결과 얻어지는, 인간화된 TTR 유전자좌에 의해 암호화된 키메릭 트랜스티레틴 전구체 단백질은 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다.
인간화된 TTR 유전자좌로부터 발현된 TTR 단백질은 전체적으로 인간 TTR 단백질 또는 키메릭 내인성/인간 TTR 단백질일 수 있다 (예컨대, 비인간 동물이 마우스, 키메릭 마우스/인간 TTR 단백질인 경우). 예를 들어, 트랜스티레틴 전구체 단백질의 신호 펩타이드는 내인성일 수 있고, 단백질의 나머지는 인간일 수 있다. 대안적으로, 트랜스티레틴 전구체 단백질의 N-말단이 내인성일 수 있고, 단백질의 나머지가 인간일 수 있다. 예를 들어, N-말단 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 아미노산은 내인성일 수 있고, 나머지는 인간일 수 있다. 특정 실례에서, N-말단의 23개 아미노산은 내인성이고, 단백질의 나머지는 인간이다.
선택적으로, 인간화된 TTR 유전자좌는 다른 요소를 포함할 수 있다. 그러한 요소의 실례로는 선택 카세트, 리포터 유전자, 재조합효소 인식 부위, 또는 다른 요소를 들 수 있다. 한 실례로서, 인간화된 TTR 유전자좌는 재조합효소 인식 서열 (예컨대, loxP 부위)이 측면에 있는 제거 가능한 선택 카세트 (예컨대, 자기 삭제 선택 카세트)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간화된 TTR 유전자좌는 다른 요소가 없을 수 있다 (예컨대, 선택 카세트가 없거나 및/또는 리포터 유전자가 없을 수 있다). 적합한 리포터 유전자 및 리포터 단백질의 실례는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 적합한 선택 마커의 실례로는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (neor), 하이드로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 (hygr), 퓨로마이신-N-아세틸트랜스퍼라제 (puror), 블라스티시딘 S 탈아민효소 (bsrr), 크산틴/구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (gpt), 및 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제 (HSV-k)를 들 수 있다. 재조합효소의 실례로는 Cre, Flp, 및 Dre 재조합효소를 들 수 있다. Cre 재조합효소 유전자의 한 실례는 Crei이며, 여기에서 Cre 재조합효소를 암호화하는 2개의 엑손이 원핵 세포에서의 그것의 발현을 방지하기 위해 인트론에 의해 분리된다. 이러한 재조합효소는 핵에의 국지화를 용이하게 하기 위한 핵 국지화 신호 (예컨대, NLS-Crei)를 추가로 포함할 수 있다. 재조합효소 인식 부위는 부위-특이적 재조합효소에 의해 인식되고 재조합 사건에 대한 기질로서 작용할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 재조합효소 인식 부위의 실례로는 FRT, FRT11, FRT71, attp, att, rox, 및 loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, 및 lox5171과 같은 lox 부위를 들 수 있다.
리포터 유전자 또는 선택 카세트와 같은 다른 요소는 재조합효소 인식 부위가 측면에 있는 자기 삭제 카세트일 수 있다. 예컨대, US 8,697,851 및 US 2013/0312129 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 실례로서, 자기 삭제 카세트는 마우스 Prm1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Crei 유전자 (인트론에 의해 분리된, Cre 재조합효소를 암호화하는 2개의 엑손을 포함함) 및 인간 유비퀴틴 프로모터에 작동 가능하게 연결된 네오마이신 내성 유전자를 포함한다. Prm1 프로모터를 사용함으로써, 자기 삭제 카세트는 FO 동물의 수컷 생식 세포에서 특이적으로 삭제될 수 있다. 선택 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 표적화되는 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 프로모터의 실례는 본원의 다른 곳에서 기술된다. 또 다른 특정 실례로서, 자기 삭제 선택 카세트는 하나 이상의 프로모터 (예컨대, 인간 유비퀴틴 및 EM7 프로모터 둘 다)에 작동 가능하게 연결된 하이드로마이신 내성 유전자 코딩 서열, 이어서 폴리아데닐화 신호, 이어서 하나 이상의 프로모터 (예컨대, mPrm1 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 Crei 코딩 서열, 이어서 또 다른 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있고, 여기서 전체 카세트는 loxP 부위가 측면에 있다.
인간화된 TTR 유전자좌는 또한 조건부 대립유전자일 수 있다. 예를 들어, 조건부 대립유전자는, US 2011/0104799 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 것과 같은 다중기능성 대립유전자이다. 예를 들어, 조건부 대립유전자는: (a) 표적 유전자의 전사와 관련하여 센스 방향의 작동 서열; (b) 센스 또는 안티센스 방향의 약물 선택 카세트 (DSC); (c) 안티센스 방향의 관심의 뉴클레오타이드 서열 (NSI); 및 (d) 역 방향의 반전 모듈에 의한 조건부 (COIN, 엑손-스플릿팅 인트론 및 반전 가능한 유전자-트랩-유사 모듈을 활용함)를 포함할 수 있다. 예컨대, US 2011/0104799를 참조한다. 조건부 대립유전자는 제1 재조합효소에 노출될 때 재조합하여 (i) 작동 서열 및 DSC가 없고; 그리고 (ii) 센스 방향으로 NSI 및 안티센스 방향으로 COIN을 함유하는 조건부 대립유전자를 형성하는 재조합 가능한 유닛을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, US 2011/0104799를 참조한다.
C. 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 및 비인간 동물
본원의 다른 곳에서 기술되는 것과 같은 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 및 비인간 동물이 제공된다. 게놈, 세포, 또는 비인간 동물은 인간화된 TTR 유전자좌에 대해 이형접합성이거나 동형접합성일 수 있다. 이배체 유기체는 또한 각 유전자 유전자좌에서 2개의 대립유전자를 가진다. 대립유전자의 각 쌍은 특정 유전자 유전자좌의 유전자형을 나타낸다. 유전자형은 만약 특정 유전자좌에 2개의 동일한 대립유전자가 있다면 동형접합성으로 기술되고 두 대립유전자가 상이하다면 이형접합성으로 기술된다.
본원에 제공된 비인간 동물 게놈 또는 세포는, 예를 들어, Ttr 유전자좌 또는 인간 TTR 유전자좌에 대해 상동하는 또는 병령상동하는 게놈 유전자좌를 포함하는 임의의 비인간 세포일 수 있다. 게놈은 세포로부터 유래되거나 또는 세포, 예를 들어, 동물 세포, 포유류 세포, 비인간 포유류 세포, 및 인간 세포를 포함하는 진핵세포일 수 있다. 용어 "동물"은 포유류, 어류, 및 조류를 포함한다. 포유류 세포는, 예를 들어, 비인간 포유류 세포, 설치류 세포, 래트 세포, 마우스 세포, 또는 햄스터 세포를 포함한다. 다른 비인간 포유류로는, 예를 들어, 비인간 영장류, 원숭이, 유인원, 오랑우탄, 고양이, 개, 토끼, 말, 가축 (예컨대, 암소, 숫소 등과 같은 소 종; 양, 염소 등과 같은 양 종; 및 돼지 및 야생돼지와 같은 돼지 종)을 들 수 있다. 가축화된 동물 및 경작용 동물 또한 포함된다. 용어 "비인간"은 인간을 배제한다.
세포는 또한 미분화 또는 분화된 상태의 임의의 유형일 수 있다. 예를 들어, 세포는 전능성(totipotent) 세포, 만능 세포 (예컨대, 인간 만능 세포 또는 마우스 배아 줄기 (ES) 세포 또는 래트 ES 세포와 같은 비인간 만능 세포), 또는 비만능 세포일 수 있다. 전능성 세포는 임의의 세포 유형에 대해 발생할 수 있는 미분화 세포를 포함하며, 만능 세포는 하나 이상의 분화 세포 유형으로 발달하는 능력을 가진 미분화 세포를 포함한다. 이러한 만능 및/또는 전능성 세포는, 예를 들어, ES 세포 또는 ES-유사 세포, 예컨대 유도된 만능 줄기 (iPS) 세포일 수 있다. ES 세포는 배아에 도입될 때 배아로 발달하는 임의의 조직에 기여할 수 있는 배아-유래 전능성 또는 만능 세포를 포함한다. ES 세포는 배반포의 내세포 집단으로부터 유래될 수 있고 3개의 척추동물 배엽층 (내배엽, 외배엽 및 중배엽) 중 임의의 것의 세포로 분화될 수 있다.
본원에서 제공된 세포는 또한 색식 세포 (예컨대, 정자 또는 난모세포)일 수 있다. 세포는 유사분열적으로 유능한 세포 또는 유사분열적으로 비활성인 세포, 감수분열적으로 유능한 세포 또는 감수분열적으로 비활성인 세포일 수 있다. 유사하게, 세포는 또한 일차 체세포성 세포 또는 일차 체세포성 세포가 아닌 세포일 수 있다. 체세포성 세포는 배우자(gamete), 생식 세포, 생식세포, 또는 미분화 줄기 세포가 아닌 임의의 세포를 포함한다. 예를 들어, 세포는 간 세포, 예컨대 간모세포 또는 간세포일 수 있다.
본원에 제공된 적합한 세포는 또한 일차 세포를 포함한다. 일차 세포는 유기체, 장기, 또는 조직으로부터 직접 분리된 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 일차 세포는 형질전환되지도 않고 불멸의 것도 아닌 세포를 포함한다. 그것은 이전에 조직 배양으로 계대되지 않았거나 이전에 조직 배양으로 계대되었지만 조직 배양으로 무한하게 계대될 수 없는 유기체, 장기, 또는 조직으로부터의 임의의 세포를 포함한다. 이러한 세포는 종래 기법에 의해 분리될 수 있고, 예를 들어, 간세포를 들 수 있다.
본원에 제고오딘 다른 적합한 세포는 불멸화된 세포를 들 수 있다. 불멸화된 세포는 정상적으로는 무한하게 증식할 수 없겠지만, 돌연변이 또는 변경으로 인해, 정상적인 세포 노화를 피하고 대신 분할을 유지할 수 있는 다세포 유기체로부터의 세포를 포함한다. 이러한 돌연변이 또는 변경은 자연적으로 일어나거나 또는 의도적으로 유도될 수 있다. 불멸화된 세포주의 특정 실례는 HepG2 인간 간암 세포주이다. 수많은 유형의 불멸화된 세포가 잘 알려져 있다. 불멸화된 또는 일차 세포는 재조합 유전자 또는 단백질의 배양 또는 발현에 전형적으로 사용되는 세포를 포함한다.
본원에 제공된 세포는 또한 1세포기 배아 (즉, 수정된 난모세포 또는 접합체)를 포함한다. 이러한 1세포기 배아는 임의의 유전자 배경으로부터 유래될 수 있고 (예컨대, 마우스의 경우 BALB/c, C57BL/6, 129, 또는 이것들의 조합), 새로운 것이거나 냉동될 수 있으며, 자연적인 사육 또는 시험관내 수정으로부터 유래될 수 있다.
본원에 제공된 세포는 정상적이거나, 건강한 세포이거나, 또는 병에 걸린 또는 돌연변이-포함 세포일 수 있다.
특정 실례에서, 비인간 동물 세포는 배아 줄기 (ES) 세포 또는 간 세포, 예컨대 마우스 또는 래트 ES 세포 또는 간 세포일 수 있다.
본원에서 기술되는 것과 같이 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 비인간 동물은 본원의 다른 곳에서 기술되는 방법에 의해 만들어질 수 있다. 용어 "동물"은 포유류, 어류, 및 조류를 포함한다. 비인간 포유류는, 예를 들어, 비인간 영장류, 원숭이, 유인원, 오랑우탄, 고양이, 개, 말, 토끼, 설치류 (예컨대, 마우스, 래트, 햄스터, 및 기니아 피그), 및 가축 (예컨대, 암소, 숫소 등과 같은 소 종; 양, 염소 등과 같은 양 종; 및 돼지 및 야생돼지와 같은 돼지 종)을 들 수 있다. 가축화된 동물 및 경작용 동물 또한 포함된다. 용어 "비인간 동물"은 인간을 배제한다. 바람직한 비인간 동물은, 예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 및 래트를 들 수 있다.
비인간 동물은 임의의 유전자 배경으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 적합한 마우스는 129 스트레인, C57BL/6 스트레인, 129와 C57BL/6의 혼합, BALB/c 스트레인, 또는 Swiss Webster 스트레인으로부터 유래될 수 있다. 129 스트레인의 실례로는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (예컨대, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 및 129T2를 들 수 있다. 예컨대, Festing et al. (1999) Mammalian Genome 10:836 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. C57BL 스트레인의 실례로는 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/Kal_wN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola를 들 수 있다. 적합한 마우스는 또한 상기 언급한 129 스트레인과 상기 언급한 C57BL/6 스트레인의 혼합 (예컨대, 50% 129 및 50% C57BL/6)으로부터 유래될 수 있다. 마찬가지로, 적합한 마우스는 상기 언급한 129 스트레인의 혼합 또는 상기 언급한 BL/6 스트레인의 혼합 (예컨대, 129S6 (129/SvEvTac) 스트레인)으로부터 유래될 수 있다.
유사하게, 래트는, 예를 들어, ACI 래트 스트레인, 다크 아구티 (Dark Agouti, DA) 래트 스트레인, Wistar 래트 스트레인, LEA 래트 스트레인, 스프라그 다울리 (Sprague Dawley, SD) 래트 스트레인, 또는 Fisher F344 또는 Fisher F6과 같은 Fischer 래트 스트레인을 포함한 임의의 래트 스트레인으로부터 유래될 수 있다. 래트는 또한 상기 열거한 둘 이상의 스트레인의 혼합으로부터 유도된 스트레인으로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 적합한 래트는 DA 스트레인 또는 ACI 스트레인으로부터 유래될 수 있다. ACI 래트 스트레인은 블랙 아구티를 가지는 것으로 특성화되며, 흰색 배 및 발과 RT1 av1 할로타입을 가진다. 이러한 스트레인은 Harlan Laboratories를 포함한 다양한 공급처로부터 이용 가능하다. 다크 아구티 (DA) 래트 스트레인은 아구티 외피 및 RT1 av1 할로타입을 가지는 것으로 특성화된다. 이러한 래트는 Charles River 및 Harlan Laboratories를 포함한 다양한 공급처로부터 이용 가능하다. 일부 적합한 래트는 사육된 래트 스트레인으로부터 유래될 수 있다. 예컨대, US 2014/0235933 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
III. 생체내 또는 생체외에서 인간-TTR-표적화 시약의 효능을 평가하기 위해 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 비인간 동물의 사용 방법
생체내 또는 생체외에서 인간-TTR-표적화 시약 (예컨대, 치료 분자 또는 복합체)의 전달 또는 효능을 평가 또는 최적화하기 위해 본원의 다른 곳에서 기술된 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 비인간 동물을 사용하는 다양한 방법이 제공된다. 비인간 동물이 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하기 때문에, 비인간 동물은 인간 TTR-표적화 시약의 효능을 보다 정확하게 반영할 것이다. 이러한 비인간 동물은, 본원에 개시된 비인간 동물이 무작위 게놈 유전자좌에서 인간 TTR 서열의 유전자도입성 삽입보다는 인간화된 내인성 Ttr 유전자좌를 포함하고, 인간화된 내인성 Ttr 유전자좌는 인공 cDNA 서열보다는 코딩 및 비코딩 영역으로부터 병렬상동 인간 게놈 TTR 서열을 포함하기 때문에, 특히 인간 TTR 유전자를 표적화하도록 설계된 게놈-편집 시약을 테스트하는 데 유용하다.
A. 생체내 또는 생체외에서 인간-TTR-표적화 시약의 효능을 테스트하는 방법
본원의 다른 곳에서 기술된 인간화된 TTR 유전자를 포함하는 비인간 동물을 사용하여 생체내에서 인간-TTR-표적화 시약의 전달 또는 효능을 평가하기 위한 다양한 방법이 제공된다. 이러한 방법은 (a) 비인간 동물에 인간-TTR-표적화 시약을 도입하는 단계 (즉, 비인간 동물에 인간-TTR-표적화 시약을 투여하는 단계; 및 (b) 인간-TTR-표적화 시약의 활성을 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
인간-TTR-표적화 시약은 인간 TTR 유전자좌 (인간 TTR 유전자), 인간 TTR mRNA, 또는 인간 트랜스티레틴 단백질을 표적화하는 임의의 생물학적 또는 화학적 작용제일 수 있다. 인간-TTR-표적화 시약의 실례는 본원의 다른 곳에서 개시되고, 예를 들어, 게놈-편집제를 포함한다. 예를 들어, 인간-TTR-표적화 시약은 TTR-표적화 핵산 (예컨대, CRISPR/Cas 가이드 RNA, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 또는 작은 간섭 RNA (siRNA)) 또는 TTR-표적화 단백질 (예컨대, Cas9와 같은 Cas 단백질, ZFN, 또는 TALEN)을 암호화하는 핵산일 수 있다. 대안적으로, 인간-TTR-표적화 시약은 TTR-표적화 항체 또는 항원 결합 단백질, 또는 인간 TTR을 표적화하는 임의의 다른 큰 분자 또는 작은 분자일 수 있다.
이러한 인간-TTR-표적화 시약은 본원의 다른 곳에서 개시된 임의의 전달 방법 (예컨대, AAV, LNP, 또는 HDD)에 의해 및 임의의 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 치료 복합체 및 분자의 전달 수단 및 투여 경로는 본원의 다른 곳에서 보다 상세하게 설명된다. 특정 방법에서, 시약은 AAV-매개 전달을 통해 전달된다. 예를 들어, AAV8은 간을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 다른 특정 방법에서, 시약은 LNP-매개 전달에 의해 전달된다. 또 다른 특정 방법에서, 시약은 수력학적 전달 (HDD)에 의해 전달된다. 용량은 임의의 적합한 용량일 수 있다. 예를 들어, 시약 (예컨대, Cas9 mRNA 및 gRNA)이 LNP-매개 전달에 의해 전달되는 일부 방법에서, 용량은 약 0.01 내지 약 10 mg/kg, 약 0.01 내지 약 5 mg/kg, 약 0.01 내지 약 4 mg/kg, 약 0.01 내지 약 3 mg/kg, 약 0.01 내지 약 2 mg/kg, 약 0.01 내지 약 1 mg/kg, 약 0.1 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 내지 약 6 mg/kg; 약 0.1 내지 약 5 mg/kg, 약 0.1 내지 약 4 mg/kg, 약 0.1 내지 약 3 mg/kg, 약 0.1 내지 약 2 mg/kg, 약 0.1 내지 약 1 mg/kg, 약 0.3 내지 약 10 mg/kg, 약 0.3 내지 약 6 mg/kg; 약 0.3 내지 약 5 mg/kg, 약 0.3 내지 약 4 mg/kg, 약 0.3 내지 약 3 mg/kg, 약 0.3 내지 약 2 mg/kg, 약 0.3 내지 약 1 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 또는 약 3 mg/kg일 수 있다. 특정 실례에서, 용량은 약 0.1 내지 약 6 mg/kg; 약 0.1 내지 약 3 mg/kg, 또는 약 0.1 내지 약 2 mg/kg일 수 있다. 특정 실례에서, 인간-TTR-표적화 시약은 게놈 편집 시약이고, LNP 용량은 약 1 mg/kg이며, 인간화된 TTR 유전자좌에서 퍼센트 게놈 편집은 약 70% 내지 약 80%이다. 다른 특정 실례에서, 인간-TTR-표적화 시약은 게놈 편집 시약이고, LNP 용량은 약 0.3 mg/kg이며, 퍼센트 편집은 약 50% 내지 약 80%이다. 또 다른 특정 실례에서, 인간-TTR-표적화 시약은 게놈 편집 시약이고, LNP 용량은 약 0.1 mg/kg이며, 퍼센트 편집은 약 20% 내지 약 80%이다. 또 다른 특정 실례에서, LNP 용량은 약 1 mg/kg이고, 혈청 TTR 수준은 대조군 수준의 약 0% 내지 약 10% 또는 약 0% 내지 약 35%로 감소된다. 또 다른 특정 실례에서, LNP 용량은 약 0.3 mg/kg이고, 혈청 TTR 수준은 대조군 수준의 약 0% 내지 약 20% 또는 약 0% 내지 약 95%로 감소된다. 또 다른 특정 실례에서, LNP 용량은 약 0.1 mg/kg이고, 혈청 TTR 수준은 대조군 수준의 약 0% 내지 약 60% 또는 약 0% 내지 약 99%로 감소된다.
인간-TTR-표적화 시약의 활성을 평가하는 방법은 잘 알려져 있고 본원의 다른 곳에서 제공된다. 활성의 평가는 본원의 다른 곳에서 개시된 임의의 세포 유형, 임의의 조직 유형, 또는 임의의 장기 유형에서 이루어질 수 있다. 일부 방법에서, 활성의 평가는 간 세포에서 이루어진다. 만약 TTR-표적화 시약이 게놈 편집 시약 (예컨대, 뉴클레아제 작용제)이면, 이러한 방법은 인간화된 TTR 유전자좌의 변형을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 한 예로서, 평가하는 단계는 인간화된 TTR 유전자좌에서 비상동성 말단 연결 (NHEJ) 활성을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 이것은, 예를 들어, 인간화된 TTR 유전자좌 내에서 삽입 또는 삭제의 빈도를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 평가하는 단계는 비인간 동물로부터 분리된 하나 이상의 세포에서 인간화된 TTR 유전자좌를 서열분석하는 것을 포함할 수 있다 (예컨대, 차세대 서열분석). 평가는 비인간 동물로부터 표적 장기 (예컨대, 간) 또는 조직을 분리하는 단계 및 표적 장기 또는 조직에서 인간화된 TTR 유전자좌의 변형을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 평가는 또한 표적 장기 또는 조직 내의 둘 이상의 상이한 세포 유형에서 인간화된 TTR 유전자좌의 변형을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 유사하게, 평가는 비인간 동물로부터 비표적 장기 또는 조직 (예컨대, 둘 이상의 비표적 장기 또는 조직)을 분리하는 단계 및 비표적 장기 또는 조직에서 인간화된 TTR 유전자좌의 변형을 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
이러한 방법은 또한 인간화된 TTR 유전자좌에 의해 생성된 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계, 또는 인간화된 TTR 유전자좌에 의해 암호화된 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질 수준은 특정 세포, 조직, 또는 장기 유형 (예컨대, 간)에서 측정될 수 있고, 또는 분비된 수준은 혈청에서 측정될 수 있다. 인간화된 TTR 유전자좌로부터 발현된 Ttr mRNA 또는 단백질의 발현을 평가하는 방법은 본원의 다른 곳에서 제공되며 잘 알려져 있다.
생체내에서 활성을 평가하기 위한 상기 제공된 다양한 방법은 본원의 다른 곳에서 기술되는 것과 같이 생체외에서 인간-TTR-표적화 시약의 활성을 평가하기 위해 또한 사용될 수 있다.
한 실례로서, 만약 인간-TTR-표적화 시약이 게놈 편집 시약 (예컨대, 뉴클레아제 작용제)이면, 인간화된 TTR 유전자좌에서의 퍼센트 편집이 (예컨대, 간 세포에서) 평가될 수 있다. 예를 들어, 퍼센트 편집 (예컨대, 용해된 세포의 모음으로부터 PCR 반응에서 판독된 서열의 총 수에 대해 관찰된 삽입 또는 삭제의 총 수)은 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는, 예를 들어, 약 1% 내지 약 99%, 약 10% 내지 약 99%, 약 20% 내지 약 99%, 약 30% 내지 약 99%, 약 40% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 99%, 약 60% 내지 약 99%, 약 1% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%,약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 또는 약 60% 내지 약 80%일 수 있다.
다른 실례로서, 혈청 TTR 수준이 평가될 수 있다. 예를 들어, 혈청 TTR 수준은 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는, 예를 들어, 약 1% 내지 약 99%, 약 10% 내지 약 99%, 약 20% 내지 약 99%, 약 30% 내지 약 99%, 약 40% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 99%, 약 60% 내지 약 99%, 약 70% 내지 약 99%, 약 80% 내지 약 99%, 약 1% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 또는 약 80% 내지 약 90% 감소될 수 있다.
일부 방법에서, 인간-TTR-표적화 시약은 인간 TTR 유전자를 표적화하는 뉴클레아제 작용제, 예컨대 CRISPR/Cas 뉴클레아제 작용제이다. 이러한 방법은, 예를 들어: (a) 비인간 동물에 인간 TTR 유전자를 절단하기 위해 설계된 뉴클레아제 작용제 (예컨대, Cas9와 같은 Cas 단백질 및 인간 TTR 유전자에서 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하기 위해 설계된 가이드 RNA)를 도입하는 단계; 및 (b) 인간화된 TTR 유전자좌의 변형을 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
CRISPR/Cas 뉴클레아제의 경우에, 예를 들어, 인간화된 TTR 유전자좌의 변형은 가이드 RNA가 Cas 단백질과 복합체를 형성하고 인간화된 TTR 유전자좌로 Cas 단백질을 지정하고, Cas/가이드 RNA 복합체가 가이드 RNA 표적 서열을 절단하여 (예컨대, 도너 서열이 존재하지 않으면 비상동성 말단 연결 (NHEJ)을 통해) 세포에 의한 수복을 촉발시킬 때 유도될 것이다.
선택적으로, 둘 이상의 가이드 RNA가 도입될 수 있고, 각각은 인간 TTR 유전자 내에서 상이한 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하기 위해 설계된 것이다. 예를 들어, 2개의 가이드 RNA가 2개의 가이드 RNA 표적 서열 사이의 게놈 서열을 삭제하기 위해 설계될 수 있다. 인간화된 TTR 유전자좌의 변형은 제1 가이드 RNA가 Cas 단백질과 복합체를 형성하고 Cas 단백질을 인간화된 TTR 유전자좌로 지정하며, 제2 가이드 RNA가 Cas 단백질과 복합체를 형성하고 Cas 단백질을 인간화된 TTR 유전자좌로 지정하며, 제1 Cas/가이드 RNA 복합체가 제1 가이드 RNA 표적 서열을 절단하고, 제2 Cas/가이드 RNA 복합체가 제2 가이드 RNA 표적 서열을 절단하여, 개재 서열의 절단을 초래할 때 유도될 것이다.
선택적으로, 인간 TTR 유전자와 재조합할 수 있는 외인성 도너 핵산이 또한 비인간 동물에 도입된다. 선택적으로, 뉴클레아제 작용제 또는 Cas 단백질은 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같이 외인성 도너 핵산에 묶일 수 있다. 인간화된 TTR 유전자좌의 변형은, 예를 들어, 가이드 RNA가 Cas 단백질과 복합체를 형성하고 Cas 단백질을 인간화된 TTR 유전자좌로 지정하며, Cas/가이드 RNA 복합체가 가이드 RNA 표적 서열을 절단하고, 인간화된 TTR 유전자좌가 외인성 도너 핵산과 재조합하여 인간화된 TTR 유전자좌가 변형될 때 유도될 것이다. 외인성 도너 핵산은 인간화된 TTR 유전자좌와, 예를 들어, 상동성 인도 수복 (HDR)을 통해 또는 NHEJ-매개 삽입을 통해 재조합할 수 있다. 임의의 유형의 외인성 도너 핵산이 사용될 수 있고, 그 실례는 본원의 다른 곳에서 제공된다.
B. 생체내 또는 생체외에서 인간-TTR-표적화 시약의 전달 또는 효능을 최적화하는 방법
인간-TTR-표적화 시약의 세포 또는 비인간 동물로의 전달을 최적화하는 또는 생테내에서 인간-TTR-표적화 시약의 활성 또는 효능을 최적화하는 다양한 방법이 제공된다. 이러한 방법은, 예를 들어: (a) 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 제1 비인간 동물 또는 제1 세포에서 첫 번째로 상기 기술된 인간-TTR-표적화 시약의 효능을 테스트하는 방법을 수행하는 단계; (b) 변수를 변경하고 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 제2 비인간 동물 (즉, 동일한 종의) 또는 제2 세포에서 변경된 변수로 두 번째로 방법을 수행하는 단계; 및 (c) 단계 (a)에서의 인간-TTR-표적화 시약의 활성을 단계 (b)에서의 인간-TTR-표적화 시약의 활성과 비교하고, 더 높은 활성을 초래하는 방법을 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
인간-TTR-표적화 시약의 전달, 효능, 또는 활성을 측정하는 방법은 본원의 다른 곳에서 개시된다. 예를 들어, 이러한 방법은 인간화된 TTR 유전자좌의 변형을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 인간화된 TTR 유전자좌의 보다 효과적인 변형은 비인간 동물 또는 세포 내에서 원하는 효과에 따라 다른 것을 의미할 수 있다. 예를 들어, 인간화된 TTR 유전자좌의 보다 효과적인 변형은 더 높은 수준의 변형, 더 높은 정확도, 더 높은 일관성, 또는 더 높은 특이성 중 하나 이상 또는 전부를 의미할 수 있다. 인간화된 TTR 유전자좌의 더 높은 수준의 변형 (즉, 더 높은 효능)은 특정 표적 세포 유형 내에서, 특정 표적 조직 내에서, 또는 특정 표적 장기 (예컨대, 간) 내에서 표적화되는 세포의 더 높은 백분율을 의미한다. 더 높은 정확도는 인간화된 TTR 유전자좌의 보다 정확한 변형을 나타낸다 (예컨대, 가외의 의도하지 않은 삽입 및 삭제 (예컨대, NHEJ indel) 없이 동일한 변형을 갖거나 원하는 변형을 갖는 표적화된 세포의 더 높은 백분율). 더 높은 일관성은 한 유형 이상의 세포, 조직, 또는 장기가 치료되고 있다면 표적화된 세포, 조직, 또는 장기의 상이한 유형 중에서 인간화된 TTR 유전자좌의 보다 일관된 변형을 나타낸다 (예컨대, 간 내에서 더 큰 수의 세포 유형의 변형). 만약 특정 장기가 치료되고 있다며, 더 높은 일관성은 또한 그 장기 (예컨대, 간) 내에서 모든 위치에서 보다 일관된 변형을 나타낼 수 있다. 더 높은 특이성은 표적화된 게놈 유전자좌 또는 유전자좌들과 관련하여 더 높은 특이성, 표적화된 세포 유형과 관련하여 더 높은 특이성, 또는 표적화된 장기와 관련하여 더 높은 특이성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 증가된 게놈 유전자좌 특이성은 표적외 게놈 유전자좌의 더 적은 변형을 나타낸다 (예컨대, 표적 게놈 유전자와의 변형 대신 또는 그에 더불어 의도되지 않은, 표적외 게놈 유전자좌에서의 변형을 갖는 표적화된 세포의 더 낮은 백분율). 마찬가지로, 증가된 세포 유형, 조직, 또는 장기 유형 특이성은 만약 특정 세포 유형, 조직 유형, 또는 장기 유형이 치료되고 있다면 표적외 세포 유형, 조직 유형, 또는 장기 유형의 더 적은 변형을 나타낸다 (예컨대, 특정 장기 (예컨대, 간)가 표적화될 때, 의도된 표적이 아닌 장기 또는 조직의 세포의 변형이 더 적다).
변경되는 변수는 임의의 파라미터일 수 있다. 한 실례로서, 변경된 변수는 포장 또는 인간-TTR-표적화 시약 또는 시약들이 세포 또는 비인간 동물에 도입되는 전달 방법일 수 있다. 전달 방법, 예컨대 LNP, HDD, 및 AAV의 실례는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 예를 들어, 변경된 변수는 AAV 혈청형일 수 있다. 유사하게, 투여단계는 LNP-매개 전달을 포함할 수 있고, 변경된 변수는 LNP 제제일 수 있다. 다른 실례로서, 변경된 변수는 인간-TTR-표적화 시약 또는 시약들을 세포 또는 비인간 동물에 도입하기 위한 투여 경로일 수 있다. 투여 경로의 실례, 예컨대 정맥내, 유리체내, 뇌실질내, 및 비강 주입은 본원의 다른 곳에서 개시된다.
또 다른 실례로서, 변경된 변수는 도입되는 인간-TTR-표적화 시약 또는 시약들의 농도 또는 양일 수 있다. 또 다른 실례로서, 변경된 변수는 도입되는 또 다른 인간-TTR-표적화 시약 (예컨대, 가이드 RNA, Cas 단백질, 또는 외인성 도너 핵산)의 농도 또는 양에 관련된 도입되는 한 인간-TTR-표적화 시약 (예컨대, 가이드 RNA, Cas 단백질, 또는 외인성 도너 핵산)의 농도 또는 양일 수 있다.
또 다른 실례로서, 변경된 변수는 시약의 활성 또는 효능을 평가하는 타이밍과 관련된 인간-TTR-표적화 시약 또는 시약들을 도입하는 타이밍일 수 있다. 또 다른 실례로서, 변경된 변수는 인간-TTR-표적화 시약 또는 시약들이 도입되는 시기의 수 또는 빈도일 수 있다. 또 다른 실례로서, 변경된 변수는 도입되는 또 다른 인간-TTR-표적화 시약 (예컨대, 가이드 RNA, Cas 단백질, 또는 외인성 도너 핵산)의 도입 타이밍과 관련된 도입되는 한 인간-TTR-표적화 시약 (예컨대, 가이드 RNA, Cas 단백질, 또는 외인성 도너 핵산)의 도입 타이밍일 수 있다.
또 다른 실례로서, 변경된 변수는 인간-TTR-표적화 시약 또는 시약들이 도입되는 형태일 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 DNA의 형태로 또는 RNA의 형태로 도입될 수 있다. Cas 단백질 (예컨대, Cas9)은 DNA의 형태로, RNA의 형태로, 또는 단백질의 형태로 (예컨대, 가이드 RNA와 복합체를 형성하여) 도입될 수 있다. 외인성 도너 핵산은 DNA, RNA, 단일 가닥, 이중 가닥, 선형, 원형, 등일 수 있다. 유사하게, 각각의 구성요소는 안정성을 위해, 표적외 영향을 감소시키기 위하여, 전달을 용이하게 위하여, 등의 목적으로 다양한 조합의 변형을 포함할 수 있다. 또 다른 실례로서, 변경된 변수는 도입되는 인간-TTR-표적화 시약 또는 시약들일 수 있다 (예컨대, 상이한 서열을 가진 상이한 가이드 RNA를 도입하는 것, 상이한 Cas 단백질을 도입하는 것 (예컨대, 상이한 서열을 가진 상이한 Cas 단백질, 또는 상이한 서열을 갖지만 동일한 Cas 단백질 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 도입하는 것), 또는 상이한 서열을 갖는 상이한 외인성 도너 핵산을 도입하는 것).
특정 실례에서, 인간-TTR-표적화 시약은 Cas 단백질 및 인간 TTR 유전자에서 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하도록 설계된 가이드 RNA를 포함한다. 이러한 방법에서, 변경된 변수는 가이드 RNA 서열 및/또는 가이드 RNA 표적 서열일 수 있다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질 및 가이드 RNA는 각각 RNA의 형태로 투여될 수 있고, 변경된 변수는 Cas mRNA 대 가이드 RNA의 비율 (예컨대, LNP 제제에서)일 수 있다. 일부 이러한 방법에서, 변경된 변수는 가이드 RNA 변형일 수 있다 (예컨대, 변형을 가진 가이드 RNA는 변형이 없는 가이드 RNA와 비교된다).
C. 인간-TTR-표적화 시약
인간-TTR-표적화 시약은 인간 TTR 유전자, 인간 TTR mRNA, 또는 인간 TTR 단백질을 표적화하는 임의의 시약일 수 있다. 예를 들어, 그것은 인간 TTR 유전자 내의 표적 서열을 절단하는 뉴클레아제 작용제와 같은 게놈 편집 시약일 수 있거나, 인간 TTR mRNA를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있거나, 인간 TTR 단백질의 에피토프를 표적화하는 항원 결합 단백질일 수 있거나, 또는 인간 TTR을 표적화하는 작은 분자일 수 있다. 본원에서 개시된 방법에서 인간-TTR-표적화 시약은 공지된 인간-TTR-표적화 시약이거나, 추정되는 TTR-표적화 시약 (예컨대, 인간 TTR을 표적화하도록 설계된 후보 시약)이거나, 또는 인간-TTR-표적화 활성에 대해 스크리닝되는 시약일 수 있다.
(1) 인간 TTR 유전자를 표적화하는 뉴클레아제 작용제
인간-TTR-표적화 시약은 인간 TTR 유전자 내의 표적 서열을 절단하는 뉴클레아제 작용제와 같은 게놈 편집 시약일 수 있다. 뉴클레아제 표적 서열은 닉(nick) 또는 이중 가닥 절단이 뉴클레아제 작용제에 의해 유도되는 곳인 DNA 서열을 포함한다. 뉴클레아제 작용제에 대한 표적 서열은 세포에 대해 내인성 (또는 천연)일 수 있거나 또는 표적 서열이 세포에 대해 외인성일 수 있다. 세포에 대해 외인성인 표적 서열은 세포의 게놈에서 자연적으로 발생하지 않는다. 표적 서열은 또한 당업자가 표적 유전자좌에 위치하기를 바라는 관심의 폴리뉴클레오타이드에 대해 외인성일 수 있다. 일부 경우에, 표적 서열은 숙주 세포의 게놈에 오직 한번만 존재한다.
표적 서열의 길이는 다를 수 있고, 예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 쌍의 경우 약 30-36 bp (즉, 각 ZFN에 대해 약 15-18 bp), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)의 경우 약 36 bp, 또는 CRISPR/Cas9 가이드 RNA의 경우 약 20 bp인 표적 서열을 들 수 있다.
원하는 표적 서열에서 닉 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 임의의 뉴클레아제 작용제는 본원에서 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 자연적으로 발생하는 또는 천연 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 작용제가 원하는 표적 서열에서 닉 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 한 사용될 수 있다. 대안적으로, 변형된 또는 조작된 뉴클레아제 작용제가 사용될 수 있다. "조작된 뉴클레아제 작용제"는 특이적으로 인식하기 위하여 그것의 천연 형태로부터 조작된 (변형된 또는 유래된) 또는 원하는 표적 서열에서 닉 또는 이중 가닥 절다을 유도하는 뉴클레아제를 포함한다. 그러므로, 조작된 뉴클레아제 작용제는 천연, 자연적으로 발생하는 뉴클레아제 작용제로부터 유래될 수 있거나 또는 인공적으로 생성되거나 합성될 수 있다. 조작된 뉴클레아제는 표적 서열에 닉 또는 이중 가닥 절단을 유도할 수 있고, 예를 들어, 여기서 표적 서열은 천연 (조작되지 않은 또는 변형되지 않은) 뉴클레아제 작용제에 의해 인식될 수 있는 서열이 아니다. 뉴클레아제 작용제의 변형은 단백질 절단제에서 한 아미노산 또는 핵산 절단제에서 한 뉴클레오타이드만큼 작은 것일 수 있다. 표적 서열 또는 다른 DNA에서 닉 또는 이중 가닥 절단을 생성하는 것은 본원에서 표적 서열 또는 다른 DNA를 "자르기" 또는 "절단하는 것"으로서 언급될 수 있다.
예시된 표적 서열의 활성 변이체 및 단편이 또한 제공된다. 이러한 활성 변이체는 주어진 표적 서열에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있고, 여기서 활성 변이체는 생물학적 활성을 보유하며 따라서 뉴클레아제 작용제에 의해 서열-특이적 방식으로 인식될 수 있고 절단될 수 있다. 뉴클레아제 작용제에 의한 표적 서열의 이중 가닥 절단을 측정하기 위한 검정은 잘 알려져 있다. 예컨대, Frendewey et al. (2010) Methods in Enzymology 476:295-307 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
뉴클레아제 작용제의 표적 서열은 Ttr 유전자좌의 어느 곳에든지 또는 가까이에 배치될 수 있다. 표적 서열은 Ttr 유전자의 코딩 영역 내에, 또는 유전자의 발현에 영향을 미치는 조절 영역 내에 위치할 수 있다. 뉴클레아제 작용제의 표적 서열은 인트론, 엑손, 프로모터, 인핸서, 조절 영역, 또는 임의의 비단백질 코딩 영역에 위치할 수 있다.
뉴클레아제 작용제의 한 유형은 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)이다. TAL 이펙터 뉴클레아제는 원핵 또는 진핵 유기체의 게놈의 특이적 표적 서열에서 이중 가닥 절단을 만들기 위해 사용될 수 있는 서열-특이적 뉴클레아제의 한 부류이다. TAL 이펙터 뉴클레아제는 천연 또는 조작된 전사 활성화제-유사 (TAL) 이펙터, 또는 그것의 기능성 부분을 엔도뉴클레아제의 촉매성 도메인, 예컨대, 예를 들어, FokI에 융합시킴으로써 생성된다. 독특한, 모듈 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인은 잠재적으로 임의의 주어진 DNA 인식 특이성을 가지는 단백질의 설계를 허용한다. 그러므로, TAL 이펙터 뉴클레아제의 DNA 결합 도메인은 특이적 DNA 표적 부위를 인식하도록, 그로써 원하는 표적 서열에서 이중 가닥 절단을 만들도록 조작될 수 있다. WO 2010/079430; Morbitzer et al. (2010) PNAS 10.1073/pnas.1013133107; Scholze & Boch (2010) Virulence 1:428-432; Christian et al. Genetics (2010) 186:757-761; Li et al. (2010) Nuc. Acids Res. (2010) doi:10.1093/nar/gkq704; 및 Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143-148 (이들은 각각 그 전문이 참조로 본원에 포함됨)을 참조한다.
적합한 TAL 뉴클레아제, 및 적합한 TAL 뉴클레아제의 제조 방법의 실례는, 예컨대, US 2011/0239315 A1, US 2011/0269234 A1, US 2011/0145940 A1, US 2003/0232410 A1, US 2005/0208489 A1, US 2005/0026157 A1, US 2005/0064474 A1, US 2006/0188987 A1, 및 US 2006/0063231 A1 (이들은 각각 그 전문이 참조로 본원에 포함됨)에서 개시된다. 다양한 구체예에서, TAL 이펙터 뉴클레아제는, 예컨대, 관심의 유전자좌 또는 관심의 게놈 유전자좌의 표적 핵산 서열에서 또는 그 가까이에서 절단하도록 조작되며, 여기서 표적 핵산 서열은 표적화 벡터에 의해 변형될 서열에 있거나 그 가까이에 있다. 본원에 제공된 다양한 방법 및 조성물과 함께 사용하기에 적합한 TAL 뉴클레아제로는 본원에 기술된 표적화 벡터에 의해 변형될 표적 핵산 서열에서 또는 그 가까이에서 결합하도록 특이적으로 설계된 것을 들 수 있다.
일부 TALEN에서, TALEN의 각 단량체는 2개의 초가변 잔기를 통해 단일 염기쌍을 인식하는 33-35 TAL 반복부를 포함한다. 일부 TALEN에서, 뉴클레아제 작용제는 FokI 엔도뉴클레아제와 같은 독립적인 뉴클레아제에 작동 가능하게 연결된 TAL-반복-기반 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메릭 단백질이다. 예를 들어, 뉴클레아제 작용제는 제1 TAL-반복-기반 DNA 결합 도메인 및 제2 TAL-반복-기반 DNA 결합 도메인을 포함할 수 있고, 여기서 제1 및 제2 TAL-반복-기반 DNA 결합 도메인의 각각은 FokI 뉴클레아제에 작동 가능하게 연결되며, 제1 및 제2 TAL-반복-기반 DNA 결합 도메인은 다양한 길이 (12-20 bp)의 스페이서 서열에 의해 분리된 표적 DNA 서열의 각 가닥에서 2개의 연속적인 표적 DNA 서열을 인식하고, FokI 뉴클레아제 하위유닛은 표적 서열에서 이중 가닥 절단을 만드는 활성 뉴클레아제를 생성하기 위하여 이량체화한다.
본원에 개시된 다양한 방법 및 조성물에서 사용된 뉴클레아제 작용제는 추가로 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 포함할 수 있다. 일부 ZFN에서, ZFN의 각 단량체는 3개 이상의 아연 핑거-기반 DNA 결합 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 아연 핑거-기반 DNA 결합 도메인은 3 bp 하위부위에 결합한다. 다른 ZFN에서, ZFN은 FokI 엔도뉴클레아제와 같은 독립적인 뉴클레아제에 작동 가능하게 연결된 아연 핑거-기반 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메릭 단백질이다. 예를 들어, 뉴클레아제 작용제는 제1 ZFN 및 제2 ZFN을 포함할 수 있고, 여기서 제1 ZFN 및 제2 ZFN의 각각은 FokI 뉴클레아제 하위유닛에 작동 가능하게 연결되며, 제1 및 제2 ZFN은 약 5-7 bp의 스페이서에 의해 분리된 표적 DNA 서열의 각 가닥에서 2개의 연속적인 표적 DNA 서열을 인식하고, FokI 뉴클레아제 하위유닛은 이중 가닥 절단을 만드는 활성 뉴클레아제를 생성하기 위하여 이량체화한다. 예컨대, US20060246567; US20080182332; US20020081614; US20030021776; WO/2002/057308A2; US20130123484; US20100291048; WO/2011/017293A2; 및 Gaj et al. (2013) Trends in Biotechnology, 31(7):397-405 (이들은 각각 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
또 다른 유형의 뉴클레아제 작용제는 메가뉴클레아제이다. 메가뉴클레아제는 보존된 서열 모티프를 기반으로 4개 패밀리로 분류되었고, 패밀리는 LAGLIDADG, GIY-YIG, H-N-H, 및 His-Cys 박스 패밀리이다. 이들 모티프는 금속 이온의 배위(coordination) 및 포스포다이에스테르 결합의 가수분해에 참여한다. 메가뉴클레아제는 그것의 긴 표적 서열에 대해, 그리고 그것의 DNA 기질의 일부 서열 다형태를 용인하는데 있어 주목할만하다. 메가뉴클레아제 도메인, 구조 및 기능은 알려져 있고, 예를 들어, Guhan and Muniyappa (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38:199-248; Lucas et al., (2001) Nucleic Acids Res 29:960-9; Jurica and Stoddard, (1999) Cell Mol Life Sci 55:1304-26; Stoddard, (2006) Q Rev Biophys 38:49-95; 및 Moure et al., (2002) Nat Struct Biol 9:764를 참조한다. 일부 실례에서, 자연적으로 발생하는 변이체 및/또는 조작된 유도체 메가뉴클레아제가 사용된다. 동역학, 보조인자 상호작용, 발현, 최적 조건, 및/또는 표적 서열 특이성의 변형 방법, 및 활성에 대한 스크리닝 방법이 알려져 있다. 예컨대, Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:2952-62; Chevalier et al., (2002) Mol Cell 10:895-905; Gimble et al., (2003) Mol Biol 334:993-1008; Seligman et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:3870-9; Sussman et al., (2004) J Mol Biol 342:31-41; Rosen et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:4791-800; Chames et al., (2005) Nucleic Acids Res 33:e178; Smith et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:e149; Gruen et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:e29; Chen and Zhao, (2005) Nucleic Acids Res 33:e154; WO2005105989; WO2003078619; WO2006097854; WO2006097853; WO2006097784; 및 WO2004031346 (이들은 각각 그 전문이 참조로 본원에 포함됨)을 참조한다.
임의의 메가뉴클레아제, 이를테면, 예를 들어, I-SceI, I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-CeuI, I-CeuAIIP, I-CreI, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-TliI, I-PpoI, PI-PspI, F-SceI, F-SceII, F-SuvI, F-TevI, F-TevII, I-AmaI, I-AniI, I-ChuI, I-CmoeI, I-CpaI, I-CpaII, I-CsmI, I-CvuI, I-CvuAIP, I-DdiI, I-DdiII, I-DirI, I-DmoI, I-HmuI, I-HmuII, I-HsNIP, I-LlaI, I-MsoI, I-NaaI, I-NanI, I-NcIIP, I-NgrIP, I-NitI, I-NjaI, I-Nsp236IP, I-PakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PbpIP, I-SpBetaIP, I-ScaI, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomI, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp6803I, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiSTe3bP, I-TdeIP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAIP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MtuI, PI-MtuHIP PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-Rma43812IP, PI-SpBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-ThyI, PI-TliI, PI-TliII, 또는 이것들의 임의의 활성 변이체 또는 단편이 사용될 수 있다.
메가뉴클레아제는, 예를 들어, 12 to 40 염기쌍의 이중 가닥 DNA 서열을 인식할 수 있다. 일부 경우에, 메가뉴클레아제는 게놈에서 하나의 완벽하게 매치된 표적 서열을 인식한다.
일부 메가뉴클레아제는 호우밍(homing) 뉴클레아제이다. 한 유형의 호우밍 뉴클레아제는, 예를 들어, I-SceI, I-CreI, 및 I-Dmol을 포함한 호우밍 뉴클레아제의 LAGLIDADG 패밀리이다.
뉴클레아제 작용제는 하기에서 더 상세하게 기술되는 CRISPR/Cas 시스템을 추가로 포함할 수 있다.
뉴클레아제 작용제 (즉, 조작된 뉴클레아제 작용제)의 활성 변이체 및 단편이 또한 제공된다. 이러한 활성 변이체는 천연 뉴클레아제 작용제에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있고, 여기서 활성 변이체는 원하는 표적 서열에서 절단하는 능력을 보유하며 따라서 닉 또는 이중 가닥 절단 유도 활성을 보유한다. 예를 들어, 본원에 기술된 임의의 뉴클레아제 작용제는 천연 엔도뉴클레아제 서열로부터 변형될 수 있고 천연 뉴클레아제 작용제에 의해 인식되지 않는 표적 서열에서 닉 또는 이중 가닥 절단을 인식하고 유도하도록 설계될 수 있다. 그러므로, 일부 조작된 뉴클레아제는 상응하는 천연 뉴클레아제 작용제 표적 서열과 상이한 표적 서열에서 닉 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 특이성을 가진다. 닉 또는 이중 가닥 절단 유도 활성에 대한 검정은 알려져 있고 일반적으로 표적 서열을 함유한 DNA 기질에 대한 엔도뉴클레아제의 전체 활성 및 특이성을 측정한다.
뉴클레아제 작용제는 임의의 공지된 수단에 의해 세포 또는 비인간 동물에 도입될 수 있다. 뉴클레아제 작용제를 암호화하는 폴리펩타이드는 세포 또는 비인간 동물에 직접 도입될 수 있다. 대안적으로, 뉴클레아제 작용제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 세포 또는 비인간 동물에 도입될 수 있다. 뉴클레아제 작용제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 도입될 때, 뉴클레아제 작용제는 일시적으로, 또는 조건부로, 또는 구성적으로 세포 내에서 발현될 수 있다. 뉴클레아제 작용제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 발현 카세트에 함유될 수 있고 조건부 프로모터, 유도성 프로모터, 구성성 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 프로모터의 실례는 본원의 다른 곳에서 논의된다. 대안적으로, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 작용제를 암호화하는 mRNA로서 세포에 도입될 수 있다.
뉴클레아제 작용제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 세포의 게놈에 안정적으로 통합될 수 있고 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 뉴클레아제 작용제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 표적화 벡터에 있을 수 있다.
뉴클레아제 작용제가 뉴클레아제 작용제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 도입을 통해 세포에 제공되는 경우, 이러한 뉴클레아제 작용제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레아제 작용제를 암호화하는 자연적으로 발생하는 폴리뉴클렐오타이드와 비교하여, 관심의 세포에서 더 높은 빈도의 용법을 가지는 코돈을 치환하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 작용제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포 또는 관심의 임의의 다른 숙주 세포를 포함한, 관심의 주어진 진핵 세포에서 자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교하여, 더 높은 빈도의 용법을 가지는 코돈을 치환하기 위해 변형될 수 있다.
(2) 인간 TTR 유전자를 표적화하는 CRISPR/Cas 시스템
특정 유형의 인간-TTR-표적화 시약은 인간 TTR 유전자를 표적화하는 CRISPR/Cas 시스템일 수 있다. CRISPR/Cas 시스템은 Cas 유전자의 발현, 또는 그것의 활성을 지시하는 데 관여하는 전사물 및 기타 요소를 포함한다. CRISPR/Cas 시스템은, 예를 들어, 타입 I, 타입 II, 또는 타입 III 시스템일 수 있다. 대안적으로, CRISPR/Cas 시스템은 타입 V 시스템 (예컨대, 하위타입 V-A 또는 하위타입 V-B)일 수 있다. 본원에 개시된 조성물 및 방법에서 사용된 CRISPR/Cas 시스템은 자연적으로 발생하지 않는 것일 수 있다. "자연적으로 발생하지 않는" 시스템은 사람 손의 포함을 나타내는 어떤 것, 예컨대 시스템의 하나 이상의 구성요소가 그것의 자연적으로 발생하는 상태로부터 변경되거나 돌연변이되는 것, 그것이 자연적으로 자연계에서 관련된 적어도 하나의 다른 구성요소가 실질적으로 없는 것, 또는 그것이 자연적으로 관련되지 않은 적어도 하나의 다른 구성요소와 관련되는 것을 포함한다. 예를 들어, 자연적으로 발생하지 않는 CRISPR/Cas 시스템은 gRNA 및 자연적으로 함께 발생하지 않는 Cas 단백질, 자연적으로 발생하지 않는 Cas 단백질, 또는 자연적으로 발생하지 않는 gRNA를 포함하는 CRISPR 복합체를 사용할 수 있다.
Cas 단백질 및 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드. Cas 단백질은 일반적으로 가이드 RNA (gRNA, 하기에서 보다 상세하게 설명됨)와 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 RNA 인식 또는 결합 도메인을 포함한다. Cas 단백질은 또한 뉴클레아제 도메인 (예컨대, DNase 또는 RNase 도메인), DNA-결합 도메인, 헬라카제 도메인, 단백질-단백질 상호작용 도메인, 이량체화 도메인, 및 기타 도메인을 포함할 수 있다. 일부의 이러한 도메인 (예컨대, DNase 도메인)은 천연 Cas 단백질로부터 유래될 수 있다. 다른 이러한 도메인은 변형된 Cas 단백질을 만들기에 위해 첨가될 수 있다. 뉴클레아제 도메인은 핵산 분자의 공유 결합의 절단을 포함하는, 핵산 절단에 대한 촉매적 활성을 가진다. 절단은 블런트 단부 또는 엇갈린(staggered) 단부를 생성할 수 있고, 그것은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 예를 들어, 야생형 Cas9 단백질은 전형적으로 블런트 절단 생성물을 생성할 것이다. 대안적으로, 야생형 Cpf1 단백질 (예컨대, FnCpf1)은 5-뉴클레오타이드 5' 오버행을 가진 절단 생성물을 초래할 수 있고, 이때 절단은 표적화되지 않는 가닥 상의 PAM 서열로부터 18번째 쌍 다음에 및 표적화된 가닥 상의 23번째 염기 뒤에서 일어난다. Cas 단백질은 표적 게놈 유전자좌에서 이중 가닥 절단 (예컨대, 블런트 단부를 가진 이중 가닥 절단)을 생성하기 위해 전체 절단 활성을 가질 수 있거나, 또는 그것은 표적 게놈 유전자좌에서 단일 가닥 절단을 생성하는 닉카아제(nickase)일 수 있다.
Cas 단백질의 실례로는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9 (Csn1 또는 Csx12), Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (CasA), Cse2 (CasB), Cse3 (CasE), Cse4 (CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cu1966, 및 이것들의 상동체 또는 변형된 버전을 들 수 있다.
예시적인 Cas 단백질은 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질로부터 유래된 단백질이다. Cas9 단백질은 타입 II CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래되고 전형적으로 보존된 구조와 4개의 핵심 모티프를 공유한다. 모티프 1, 2, 및 4는 RuvC-유사 모티프이고, 모티프 3은 HNH 모티프이다. 예시적인 Cas9 단백질은 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코쿠스 종(Streptococcus sp.), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 노카르디옵시스 다쏜빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티나에스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바실루스 아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실루스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실루스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실루스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 마이크로실라 마리나(Microscilla marina), 부르콜데리알레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 종(Polaromonas sp.), 크로코파에라 왓소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 종(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코쿠스 종(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시룹터 벡시이(Caldicelulosiruptor becscii), 칸디다투스 데술포룬디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필루스(Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨룸 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실루스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실루스 페록시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 종(Marinobacter sp.), 니트로소코쿠스 할로필루스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코쿠스 왓소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로플랑크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박터 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼 (Methanohalobium evestigatum), 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스퍼미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 종(Nostoc sp.), 아르트로스피라 막시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 종(Arthrospira sp.), 링비아 종(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 종(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina), 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 또는 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)로부터 유래된다. Cas9 패밀리 구성원의 추가적인 실례는 WO 2014/131833 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된다. S. 피오게네스로부터의 Cas9 (SpCas9) (SwissProt 수탁 번호 Q99ZW2로 지정됨)가 예시적인 Cas9 단백질이다. 녹농균으로부터의 Cas9 (SaCas9) (UniProt 수탁 번호 J7RUA5로 지정됨)가 또 다른 예시의 Cas9 단백질이다. 캄필로박터 제주니로부터의 Cas9 (CjCas9) (UniProt 수탁 번호 Q0P897로 지정됨)가 또 다른 예시의 Cas9 단백질이다. 예컨대, Kim et al. (2017) Nat. Comm. 8:14500 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. SaCas9는 SpCas9보다 작으며, CjCas9는 SaCas9 및 SpCas9 둘보다 작다. 예시적인 Cas9 단백질 서열은 SEQ ID NO: 94를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다. Cas9 단백질을 암호화하는 예시적인 DNA는 SEQ ID NO: 93을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다.
Cas 단백질의 또 다른 실례는 Cpf1 (프레보텔라 및 프란시셀라 1로부터의 CRISPR) 단백질이다. Cpf1은 Cas9의 특징적인 아르기닌-풍부 클러스트에 대한 대응부분과 함께 Cas9의 상응하는 도메인에 상동하는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유한 큰 단백질 (약 1300개 아미노산)이다. 그러나, Cpf1은 HNH 도메인을 포함한 긴 삽입물을 함유하는 Cas9와는 대조적으로, Cas9 단백질에 존재하는 HNH 뉴클레아제 도메인이 없고, RuvC-유사 도메인은 Cpf1 서열에서 연속적이다. 예컨대, Zetsche et al. (2015) Cell 163(3):759-771 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 예시적인 Cpf1 단백질은 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis) 1, 프란시셀라 툴라렌시스 하위종 노비시다(Francisella tularensis subsp. novicida), 프레보텔라 알벤시스(Prevotella albensis), 라크노스피라세아에 박테리움(Lachnospiraceae bacterium MC2017 1), 부티리비브릭 프로테오클라스티쿠스(Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리아 박테리움(Peregrinibacteria bacterium) GW2011_GWA2_33_10, 파르쿠박테리아 박테리움(Parcubacteria bacterium) GW2011_GWC2_44_17, 스미텔라 종(Smithella sp.) SCADC, 아시드아미노코쿠스 종(Acidaminococcus sp.) BV3L6, 라크노스피라세아에 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) MA2020, 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼(Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스(Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리(Moraxella bovoculi) 237, 펩토스피라 이나다이(Leptospira inadai), 라크노스피라세아에 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) ND2006, 포르피로모나스 세레비오리카니스(Porphyromonas crevioricanis) 3, 프레보텔라 디시엔스(Prevotella disiens), 및 포르피로모나스 마카카에(Porphyromonas macacae)로부터 유래된다. 프란시셀라 노비시다 U112로부터의 Cpf1 U112 (FnCpf1; UniProt 등록 번호 A0Q7Q2로 지정됨)가 예시적인 Cpf1 단백질이다.
Cas 단백질은 야생형 단백질 (즉, 자연계에서 발생하는 것), 변형된 Cas 단백질 (즉, Cas 단백질 변이체), 또는 야생형 또는 변형된 Cas 단백질의 단편일 수 있다. Cas 단백질은 또한 야생형 또는 변형된 Cas 단백질의 촉매적 활성과 관련하여 활성 변이체 또는 단편일 수 있다. 촉매적 활성과 관련하여 활성 변이체 또는 단편은 야생형 또는 변형된 Cas 단백질 또는 그것의 일부분에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있고, 여기서 활성 변이체는 원하는 절단 부위에서 절단하는 능력을 보유하며 따라서 닉 유도 또는 이중 가닥 절단 유도 활성을 보유한다. 닉 유도 또는 이중 가닥 절단 유도 활성에 대한 검정은 알려져 있고 일반적으로 절단 부위를 함유한 DNA 기질에 대한 Cas 단백질의 전체 활성 및 특이성을 측정한다.
Cas 단백질은 핵산 결합 친화성, 핵산 결합 특이성, 및 효소 활성 중 하나 이상을 증가 또는 감소시키도록 변형될 수 있다. Cas 단백질은 또한 단백질의 임의의 다른 활성 또는 특성, 예컨대 안정성을 변경시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질의 하나 이상의 뉴클레아제 도메인은 변형되거나, 삭제되거나, 또는 비활성화될 수 있고, 또는 Cas 단백질은 단백질의 기능에 본질적이지 않은 도메인을 제거하거나 또는 Cas 단백질의 활성 또는 특성을 최적화 (예컨대, 증강 또는 감소)하기 의해 절단될 수 있다.
변형된 Cas 단백질의 한 실례는 변형된 SpCas9-HF1 단백질로, 비특이적 DNA 접촉을 감소시키도록 설계된 변경 (N497A/R661A/Q695A/Q926A)을 은닉하는 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9의 고충실도 변이체이다. 예컨대, Kleinstiver et al. (2016) Nature 529(7587):490-495 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 변형된 Cas 단백질의 다른 실례는 표적외 영향을 감소시키기 위해 설계된 변형된 eSpCas9 변이체 (K848A/K1003A/R1060A)이다. 예컨대, Slaymaker et al. (2016) Science 351(6268):84-88 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 다른 SpCas9 변이체로 K855A 및 K810A/K1003A/R1060A를 들 수 있다.
Cas 단백질은 적어도 하나의 뉴클레아제 도메인, 예컨대 DNase 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 야생형 Cpf1 단백질은 일반적으로, 아마도 다이머 구성의 표적 DNA의 두 가닥을 절단하는 RuvC-유사 도메인을 포함한다. Cas 단백질은 또한 적어도 2개의 뉴클레아제 도메인, 예컨대 DNase 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 야생형 Cas9 단백질은 일반적으로 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인 및 HNH-유사 뉴클레아제 도메인을 포함한다. RuvC 및 HNH 도메인은 각각 이중 가닥 DNA의 상이한 가닥을 절단하여 DNA에 이중 가닥 절단을 만들 수 있다. 예컨대, Jinek et al. (2012) Science 337:816-821 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
뉴클레아제 도메인의 하나 이상 또는 전부는 그것들이 더 이상 기능적이지 않거나 감소된 뉴클레아제 활성을 가지는 한 삭제되거나 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 만약 뉴클레아제 도메인 중 하나가 Cas9 단백질에서 삭제되거나 돌연변이되면, 그 결과로 얻어지는 Cas9 단백질은 닉카아제로서 언급될 수 있고 이중 가닥 DNA 내의 가이드 RNA 표적 서열에서 이중 가닥 절단이 아닌 단일 가닥 절단을 생성할 수 있다 (즉, 그것은 둘 다가 아니라, 상보하는 가닥 또는 비상보하는 가닥 중 하나를 절단할 수 있다). 만약 뉴클레아제 도메인이 둘 다 삭제되거나 돌연변이되면, 그 결과로 얻어지는 Cas 단백질 (예컨대, Cas9)은 이중 가닥 DNA의 양 가닥을 절단하는 능력이 감소될 것이다 (예컨대, 뉴클레아제-널(null) 또는 뉴클레아제-비활성 Cas 단백질, 또는 촉매적으로 비활성인 Cas 단백질 (dCas)). Cas9를 닉카아제로 전환시키는 돌연변이의 실례는 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9의 RuvC 도메인에서의 D1OA (Cas9의 위치 10에서 아스파테이트의 알라닌으로의) 돌연변이이다. 마찬가지로, 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9의 HNH 도메인에서 H939A (아미노산 위치 839에서 히스티딘에서 알라닌으로), H840A (아미노산 위치 840에서 히스티딘에서 알라닌으로), 또는 N863A (아미노산 위치 N863에서 아스파리긴에서 알라닌으로)는 Cas9를 닉카아제로 전환시킬 수 있다. Cas9를 닉카아제로 전환시키는 돌연변이의 다른 실례는 스트렙토코쿠스 써모필루스로부터의 Cas9에 대한 상응하는 돌연변이를 포함한다. 예컨대, Sapranauskas et al. (2011) Nucleic Acids Research 39:9275-9282 및 WO 2013/141680 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 이러한 돌연변이는 부위-특정 돌연변이생성, PCR-매개된 돌연변이생성, 또는 전체 유전자 합성과 같은 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 닉카아제를 생성하는 다른 돌연변이의 실례는, 예를 들어, WO 2013/176772 및 WO 2013/142578 (각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다. 만약 모든 뉴클레아제 도메인이 Cas 단백질에서 삭제되거나 돌연변이되면 (예컨대, 뉴클레아제 도메인이 둘 다 as 단백질에서 삭제되거나 돌연변이되면), 그 결과의 Cas 단백질 (예컨대, Cas9)은 이중 가닥 DNA의 양 가닥을 절단하는 능력이 감소될 것이다 (예컨대, 뉴클레아제-널 또는 뉴클레아제-비활성 Cas 단백질). 한 특정 실례는 D10A/H840A S. 피오게네스 Cas9 이중 돌연변이 또는 S. 피오게네스 Cas9와 최적으로 정렬될 때 다른 종으로부터의 Cas9에서의 상응하는 이중 돌연변이이다. 또 다른 특정 실례는 D10A/N863A S. 피오게네스 Cas9 이중 돌연변이 또는 S. 피오게네스 Cas9와 최적으로 정렬될 때 다른 종으로부터의 Cas9에서의 상응하는 이중 돌연변이이다.
스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9 단백질의 촉매 도메인에서의 비활성화 돌연변이의 실례가 또한 알려져 있다. 예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9 효소 (SaCas9)는 뉴클레아제-비활성 Cas 단백질을 생성하기 위하여 위치 N580에 치환 (예컨대, N580A 치환) 및 위치 D10에서 치환 (예컨대, D10A 치환)을 포함할 수 있다. 예컨대, WO 2016/106236 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
Cpf1 단백질의 촉매 도메인에서의 비활성화 돌연변이의 실례가 또한 알려져 있다. 프란시셀라 노비시다 U112로부터의 Cpf1 단백질 (FnCpf1), 아시드아미노코쿠스 종 BV3L6으로부터의 Cpf1 단백질 (AsCpf1), 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006으로부터의 Cpf1 단백질 (LbCpf1), 및 모락셀라 보보쿨리 237로부터의 Cpf1 단백질 (MbCpf1 Cpf1)을 참조하면, 이러한 돌연변이는 AsCpf1의 위치 908, 993, 또는 1263 또는 Cpf1 오르토로그의 상응하는 위치, 또는 LbCpf1의 위치 832, 925, 947, 또는 1180 또는 Cpf1 오르토로그의 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는, 예를 들어 AsCpf1의 돌연변이 D908A, E993A, 및 D1263A 또는 Cpf1 오르토로그에서의 상응하는 돌연변이, 또는 LbCpf1의 D832A, E925A, D947A, 및 D1180A 또는 Cpf1 오르토로그에서의 상응하는 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예컨대, US 2016/0208243 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
Cas 단백질 (예컨대, 뉴클레아제-활성 Cas 단백질 또는 뉴클레아제-비활성 Cas 단백질)은 또한 융합 단백질로서 이종성 폴리펩타이드에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 절단 도메인 또는 에피유전자 변형 도메인에 융합될 수 있다. WO 2014/089290 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. Cas 단백질은 또한 이종성 폴리펩타이드에 융합되어 증가된 또는 감소된 안정성을 제공할 수 있다. 융합된 도메인 또는 이종성 폴리펩타이드는 N-말단에, C-말단에, 또는 또는 Cas 단백질 내에 내부적으로 위치할 수 있다.
한 실례로서, Cas 단백질은 세포이하(subcellular) 국지화를 제공하는 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드에 융합될 수 있다. 이러한 이종성 폴리펩타이드로는, 예를 들어, 하나 이상의 핵 국지화 신호 (NLS), 예컨대 핵에 대한 표적화의 경우 모노파타이트(monopartite) SV40 NLS 및/또는 바이파타이트(bipartite) 알파-임포르틴(importin) NLS, 미토콘드리아에 대한 표적화의 경우 미토콘드리아 국지화 신호, ER 보유 신호, 등을 들 수 있다. 예컨대, Lange et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:5101-5105 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 이러한 세포이하 국지화 신호는 N-말단에, C-말단에, 또는 Cas 단백질 내에 어느 곳에든지 위치할 수 있다. NLS는 염기성 아미노산의 구간을 포함할 수 있고, 모노파타이트 서열 또는 바이파타이트 서열일 수 있다. 선택적으로, Cas 단백질은 N-말단에서의 NLS (예컨대, 알파-임포르틴 NLS 또는 모노파타이트 NLS) 및 C-말단에서의 NLS (예컨대, SV40 NLS 또는 모노파타이트 NLS)를 포함한, 둘 이상의 NLS를 포함할 수 있다. Cas 단백질은 또한 N-말단에서의 둘 이상의 NLS 및/또는 C-말단에서의 둘 이상의 NLS를 포함할 수 있다.
Cas 단백질은 또한 세포-침투 도메인 또는 단백질 형질도입 도메인에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 세포-침투 도메인은 HIV-1 TAT 단백질, 인간 B형 간염 바이러스로부터의 TLM 세포-침투 모티프, MPG, Pep-1, VP22, 단순 포진 바이러스로부터의 세포 침투 펩타이드, 또는 폴리아르기닌 펩타이드 서열로부터 유래될 수 있다. 예컨대, WO 2014/089290 및 WO 2013/176772 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 세포-침투 도메인은 N-말단에, C-말단에, 또는 Cas 단백질 내에 어느 곳에든지 위치할 수 있다.
Cas 단백질은 또한 추적 또는 정제를 용이하게 하기 위하여 이종성 폴리펩타이드, 예컨대 형광 단백질, 정제 태그, 또는 에피토프 태그에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 형광 단백질의 실례로는 녹색 형광 단백질 (예컨대, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, eGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFP, AceGFP, Zs녹색l), 황색 형광 단백질 (예컨대, YFP, eYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellowl), 청색 형광 단백질 (예컨대, eBFP, eBFP2, Azurite, mKalamal, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), 청록색 형광 단백질 (예컨대, eCFP, Cerulean, CyPet, AmCyanl, Midoriishi-Cyan), 적색 형광 단백질 (예컨대, mKate, mKate2, mPlum, DsRed monomer, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomer, HcRed-Tandem, HcRedl, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry, Jred), 오렌지색 형광 단백질 (예컨대, mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Monomeric Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato), 및 임의의 기타 적합한 형광 단백질을 들 수 있다. 태그의 실례로는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토오스 결합 단백질, 티오레독신 (TRX), 폴리(NANP), 탠덤 친화성 정제 (TAP) 태그, myc, AcV5, AU1 , AU5, E, ECS, E2, FLAG, 헤마글루티닌 (HA), nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1 , T7, V5, VSV-G, 히스티딘 (His), 비오틴 카르복실 담체 단백질 (BCCP), 및 칼모둘린을 들 수 있다.
Cas 단백질은 또한 외인성 도너 핵산 또는 표지된 핵산에 묶일 수 있다. 이러한 묶임 (즉, 물리적 연결)은 공유 상호작용 또는 비공유 상호작용을 통해 달성될 수 있고, 묶임은 직접적이거나 (예컨대, 직접적인 융합 또는 화학적 콘쥬게이션을 통해, 이것은 단백질 상의 시스테인 또는 리신 잔기의 변형 또는 인테인 변형을 통해 달성될 수 있음), 또는 하나 이상의 개재 링커 또는 스트렙트아비딘 또는 압타머와 같은 어댑터 분자를 통해 달성될 수 있다. 예컨대, Pierce et al. (2005) Mini Rev. Med. Chem. 5(1):41-55; Duckworth et al. (2007) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46(46):8819-8822; Schaeffer and Dixon (2009) Australian J. Chem. 62(10):1328-1332; Goodman et al. (2009) Chembiochem. 10(9):1551-1557; 및 Khatwani et al. (2012) Bioorg. Med. Chem. 20(14):4532-4539 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 단백질-핵산 콘쥬게이트를 합성하기 위한 비공유 전략은 비오틴-스트렙트아비딘 및 니켈-히스티딘 방법을 포함한다. 공유 단백질-핵산 콘쥬게이트는 기능화된 핵산 및 단백질을 광범위한 화학을 사용하여 적절하게 연결함으로써 합성될 수 있다. 이들 화학의 일부는 올리고뉴클레오타이드의 단백질 표면 상의 아미노산 잔기에의 직접적인 부착을 포함하며 (예컨대, 리신 아민 또는 시스테인 티올), 한편 다른 보다 복잡한 계획은 단백질의 번역 후 변형 또는 촉매성 또는 반응성 단백질 도메인의 포함을 필요로 한다. 단백질의 핵산에의 공유 부착 방법으로는, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 단백질 리신 또는 시스테인 잔기에의 화학적 가교결합, 발현된 단백질 결찰, 화학효소 방법, 및 광압타머의 사용을 들 수 있다. 외인성 도너 핵산 또는 표지된 핵산은 C-말단, N-말단, 또는 Cas 단백질 내의 내부 영역에 묶일 수 있다. 한 실례에서, 외인성 도너 핵산 또는 표지된 핵산은 Cas 단백질의 C-말단 또는 N-말단에 묶인다. 마찬가지로, Cas 단백질은 5' 단부, 3' 단부, 또는 외인성 도너 핵산 또는 표지된 핵산 내의 내부 영역에 묶일 수 있다. 즉, 외인성 도너 핵산 또는 표지된 핵산은 임의의 방향 및 극성으로 묶일 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 외인성 도너 핵산 또는 표지된 핵산의 5' 단부 또는 3' 단부에 묶일 수 있다.
Cas 단백질은 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 단백질, 예컨대 gRNA와 복합체를 형성한 Cas 단백질의 형태로 제공될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질은 Cas 단백질을 암호화하는 핵산, 예컨대 RNA (예컨대, 메신저 RNA (mRNA)) 또는 DNA 형태로 제공될 수 있다. 선택적으로, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 특정 세포 또는 유기체에서 단백질로의 효율적인 번역을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 박테리아 세포, 효모 세포, 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 또는 관심의 임의의 다른 숙주 세포에서 자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교하여 더 높은 빈도의 용법을 가지는 코돈을 치환하기 위해 변형될 수 있다. Cas 단백질을 암호화하는 핵산이 세포에 도입될 때, Cas 단백질은 세포에서 일시적으로, 조건부로, 또는 구성적으로 발현될 수 있다.
mRNA로서 제공된 Cas 단백질은 개선된 안정성 및/또는 면역원성 특성을 위해 변형될 수 있다. 변형은 mRNA 내의 하나 이상의 뉴클레오사이드에 대해 이루어질 수 있다. mRNA 핵염기에 대한 화학적 변형의 실례는 수도우리딘, 1-매틸-수도우리딘, 및 5-메틸-시티딘을 포함한다. 예를 들어, N1-메틸 수도우리딘을 함유한 캡핑된 및 폴리아데닐화된 Cas mRNA가 사용될 수 있다. 마찬가지로, Cas mRNA는 유사한 코돈을 사용하는 우리딘의 고갈에 의해 변형될 수 있다.
Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 세포의 게놈에 안정적으로 통합될 수 있고 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 발현 구성물의 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 발현 구성물은 관심의 유전자 또는 다른 핵산 서열 (예컨대, Cas 유전자)의 발현을 지시할 수 있는 임의의 핵산 구성물을 포함하고 이러한 관심의 핵산 서열을 표적 세포로 전달할 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 핵산 삽입물을 포함하는 표적화 벡터 및/또는 gRNA를 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터에 있을 수 있다. 대안적으로, 그것은 핵산 삽입물을 포함하는 표적화 벡터 및/또는 gRNA를 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터와 다른 벡터 또는 플라스미드에 있을 수 있다. 발현 구성물에서 사용될 수 있는 프로모터는, 예를 들어, 진핵 세포, 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 비인간 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 햄스터 세포, 토끼 세포, 만능 세포, 배아 줄기 (ES) 세포, 또는 접합체 중 하나 이상에서 활성인 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는, 예를 들어, 조건부 프로모터, 유도성 프로모터, 구성성 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 선택적으로, 프로모터는 한 방향으로 Cas 단백질 및 다른 방향으로 가이드 RNA 둘 다의 발현을 구동하는 양방향성 프로모터일 수 있다. 이러한 양방향성 프로모터는 (1) 3개의 외부 제어 요소: 원위 서열 요소 (DSE), 근위 서열 요소 (PSE), 및 TATA 박스를 함유하는 완전한, 종래의, 단일양방향성 Pol III 프로모터; 및 (2) PSE 및 역방향으로 DSE의 5' 말단에 융합된 TATA 박스를 포함하는 제2 염기성 Pol III 프로모터로 이루어질 수 있다. 예를 들어, H1 프로모터에서, DSE는 PSE 및 TATA 박스에 인접하고, 프로모터는 역방향의 전사가 U6 프로모터로부터 유래된 TATA 박스 및 PSE에 첨부됨으로써 제어되는 하이브리드 프로모터를 생성함으로써 양방향성이 되는 경향이 있을 수 있다. 예컨대, US 2016/0074535 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. Cas 단백질을 암호화하는 유전자 및 가이드 RNA를 발현하기 위한 양방향성 프로모터의 사용은 동시에 전달을 용이하게 하기 위한 압축 발현 카세트의 생성을 가능하게 한다.
가이드 RNA . "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 Cas 단백질 (예컨대, Cas9 단백질)에 결합하여 Cas 단백질을 표적 DNA 내의 특정 위치로 표적화하는 RNA 분자이다. 가이드 RNA는 2개의 분절: "DNA-표적화 분절" 및 "단백질-결합 분절"을 포함할 수 있다. "분절"은 분자의 섹션 또는 영역, 예컨대 RNA에서 연속적인 뉴클레오타이드 구간을 포함한다. 일부 gRNA, 예컨대 Cas9에 대한 gRNA는 2개의 별도의 RNA 분자: "활성화제-RNA" (예컨대, tracrRNA) 및 "표적자-RNA" (예컨대, CRISPR RNA 또는 crRNA)를 포함할 수 있다. 다른 gRNA는 "단일-분자 gRNA", "단일-가이드 RNA", 또는 "sgRNA"로도 불릴 수 있는 단일 RNA 분자 (단일 RNA 폴리뉴클레오타이드)이다. 예컨대, 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함된 WO 2013/176772, WO 2014/065596, WO 2014/089290, WO 2014/093622, WO 2014/099750, WO 2013/142578, 및 WO 2014/131833을 참조한다. Cas9의 경우, 예를 들어, 단일-가이드 RNA는 tracrRNA에 (예컨대, 링커를 통해) 융합된 crRNA를 포함할 수 있다. Cpf1의 경우, 예를 들어, 표적 서열에의 결합 및/또는 표적 서열의 절단을 달성하기 위해 crRNA만이 필요하다. 용어 "가이드 RNA" 및 "gRNA"는 이중 분자 (즉, 모듈식) gRNA 및 단일 분자 gRNA를 둘 다 포함한다.
예시적인 2-분자 gRNA는 crRNA-유사 ("CRISPR RNA" 또는 "표적자-RNA" 또는 "crRNA" 또는 "crRNA 반복부") 분자 및 상응하는 tracrRNA-유사 ("트랜스-작용 CRISPR RNA" 또는 "활성화제-RNA" 또는 "tracrRNA") 분자를 포함한다. crRNA는 gRNA의 DNA-표적화 분절 (단일 가닥) 및 gRNA의 단백질-결합 분절의 dsRNA 듀플렉스의 절반을 형성하는 뉴클레오타이드 (즉, crRNA 꼬리) 구간 둘 다를 포함한다. DNA-표적화 분절의 하류 (3')에 위치한 crRNA 꼬리의 실례는 GUUUUAGAGCUAUGCU (SEQ ID NO: 87)를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 본원에서 개시된 임의의 DNA-표적화 분절은 crRNA를 형성하기 위하여 SEQ ID NO: 87의 5' 단부에 연결될 수 있다.
상응하는 tracrRNA (활성화제-RNA)는 gRNA의 단백질-결합 분절의 dsRNA 듀플렉스의 다른 절반을 형성하는 뉴클레오타이드 구간을 포함한다. crRNA의 뉴클레오타이드 구간은 gRNA의 단백질-결합 도메인의 dsRNA 듀플렉스를 형성하기 위하여 tracrRNA의 뉴클레오타이드 구간에 상보하고 그것과 혼성화한다. 이와 같이, 각각의 crRNA는 상응하는 tracrRNA를 가진다고 말할 수 있다. tracrRNA 서열의 실례는 AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU (SEQ ID NO: 88)를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
crRNA 및 tracrRNA 둘 다 필요한 시스템에서, crRNA 및 상응하는 tracrRNA는 gRNA를 형성하기 위하여 혼성화한다. crRNA만이 요구되는 시스템에서, crRNA는 gRNA일 수 있다. crRNA는 추가적으로 반대쪽 가닥 (즉, 상보하는 가닥)에 혼성화함으로써 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 단일 가닥의 DNA-표적화 분절을 제공한다. 만약 세포 내에서의 변형을 위해 사용된다면, 주어진 crRNA 또는 tracrRNA 분자의 정확한 서열은 RNA 분자가 사용될 종에 특이적인 것이 되도록 설계될 수 있다. 예컨대, 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함된 Mali et al. (2013) Science 339:823-826; Jinek et al. (2012) Science 337:816-821; Hwang et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31:227-229; Jiang et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31:233-239; 및 Cong et al. (2013) Science 339:819-823을 참조한다.
주어진 gRNA의 DNA-표적화 분절 (crRNA)은 표적 DNA의 서열에 상보하는 뉴클레오타이드 서열 (즉, 가이드 RNA 표적 서열의 반대쪽 가닥 상의 가이드 RNA 인식 서열의 상보하는 가닥)을 포함한다. gRNA의 DNA-표적화 분절은 혼성화 (즉, 염기쌍 형성)를 통해 서열-특이적 방식으로 표적 DNA와 상호작용한다. 그로써, DNA-표적화 분절의 뉴클레오타이드 서열은 달라질 수 있고 gRNA와 표적 DNA가 상호작용하게 될 표적 DNA 내의 위치를 결정할 수 있다. 대상 gRNA의 DNA-표적화 분절은 표적 DNA 내의 임의의 원하는 서열에 혼성화하기 위해 변형될 수 있다. 자연적으로 발생하는 crRNA는 CRISPR/Cas 시스템 및 유기체에 따라 상이하지만 자주, 21 내지 46개 뉴클레오타이드의 길이를 가진 2개의 직접 반복부 (DR)가 옆에 있는, 21 내지 72개 뉴클레오타이드 길이의 표적화 분절을 함유한다 (예컨대, 모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함된 WO 2014/131833 참조). 스트렙토코쿠스 피오게네스의 경우에, DR은 36개 뉴클레오타이드 길이이며 표적화 분절은 30개 뉴클레오타이드 길이이다. 3'에 위치한 DR은 상응하는 tracrRNA에 상보하고 그것과 혼성화하며, 결국 Cas 단백질에 결합한다.
DNA-표적화 분절은 적어도 약 12개 뉴클레오타이드, 적어도 약 15개 뉴클레오타이드, 적어도 약 17개 뉴클레오타이드, 적어도 약 18개 뉴클레오타이드, 적어도 약 19개 뉴클레오타이드, 적어도 약 20개 뉴클레오타이드, 적어도 약 25개 뉴클레오타이드, 적어도 약 30개 뉴클레오타이드, 적어도 약 35개 뉴클레오타이드, 또는 적어도 약 40개 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 이러한 DNA-표적화 분절은 약 12개 뉴클레오타이드 내지 약 100개 뉴클레오타이드, 약 12개 뉴클레오타이드 내지 약 80개 뉴클레오타이드, 약 12개 뉴클레오타이드 내지 약 50개 뉴클레오타이드, 약 12개 뉴클레오타이드 내지 약 40개 뉴클레오타이드, 약 12개 뉴클레오타이드 내지 약 30개 뉴클레오타이드, 약 12개 뉴클레오타이드 내지 약 25개 뉴클레오타이드, 또는 약 12개 뉴클레오타이드 내지 약 20개 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, DNA 표적화 분절은 약 15개 뉴클레오타이드 내지 약 25개 뉴클레오타이드 (예컨대, 약 17개 뉴클레오타이드 내지 약 20개 뉴클레오타이드, 또는 약 17개 뉴클레오타이드, 약 18개 뉴클레오타이드, 약 19개 뉴클레오타이드, 또는 약 20개 뉴클레오타이드)일 수 있다. 예컨대, 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함된 US 2016/0024523을 참조한다. 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9의 경우, 전형적인 DNA-표적화 분절은 16개 내지 20개 뉴클레오타이드의 길이 또는 17개 내지 20개 뉴클레오타이드의 길이이다. 스타필로코쿠스 아우레우스로부터의 Cas9의 경우, 전형적인 DNA-표적화 분절은 21개 내지 23개 뉴클레오타이드의 길이이다. Cpf1의 경우, 전형적인 DNA-표적화 분절은 적어도 16개 뉴클레오타이드의 길이 또는 적어도 18개 뉴클레오타이드의 길이이다.
TracrRNA는 임의의 형태 (예컨대, 전장 tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA)로 있을 수 있고 다양한 길이의 것일 수 있다. 이것은 1차 전사물 또는 프로세싱된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, tracrRNA (단일-가이드 RNA의 부분으로서 또는 2-분자 gRNA의 부분으로서 별도의 분자로서)는 야생형 tracrRNA 서열의 전부 또는 일부 (예컨대, 야생형 tracrRNA 서열의 약 20개 이상, 26개 이상, 32개 이상, 45개 이상, 48개 이상, 54개 이상, 63개 이상, 67개 이상, 85개 이상, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 야생형 tracrRNA 서열의 실례는 171개-뉴클레오타이드, 89개-뉴클레오타이드, 75개-뉴클레오타이드, 및 65개-뉴클레오타이드 버전을 포함한다. 예컨대, 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함된 Deltcheva et al. (2011) Nature 471:602-607; WO 2014/093661을 참조한다. 단일-가이드 RNA (sgRNA) 내의 tracrRNA의 실례는 sgRNA의 +48, +54, +67, 및 +85 버전 내에서 찾을 수 있는 tracrRNA 분절을 포함하고, 여기서 "+n"은 야생형 tracrRNA의 +n개까지의 뉴클레오타이드가 sgRNA에 포함된 것을 가리킨다. US 8,697,359 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
DNA-표적화 분절과 표적 DNA 내의 가이드 RNA 인식 서열의 상보하는 가닥 사이의 퍼센트 상보성은 적어도 60% (예컨대, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)일 수 있다. DNA-표적화 분절과 표적 DNA 내의 가이드 RNA 인식 서열의 상보하는 가닥 사이의 퍼센트 상보성은 약 20개의 연속적인 뉴클레오타이드에 걸쳐 적어도 60%일 수 있다. 실례로서, DNA-표적화 분절과 표적 DNA 내의 가이드 RNA 인식 서열의 상보하는 가닥 사이의 퍼센트 상보성은 표적 DNA의 상보하는 가닥 내의 가이드 RNA 인식 서열의 상보하는 가닥의 5' 단부에서 14개의 연속적인 뉴클레오타이드에 걸쳐 100%이고 나머지에 대해서는 0%로 낮다. 이러한 경우에, DNA-표적화 분절은 14개 뉴클레오타이드 길이인 것으로 여겨질 수 있다. 또 다른 실례로서, DNA-표적화 분절과 표적 DNA 내의 가이드 RNA 인식 서열의 상보하는 가닥 사이의 퍼센트 상보성은 표적 DNA의 상보하는 가닥 내의 가이드 RNA 인식 서열의 상보하는 가닥의 5' 단부에서 7개의 연속적인 뉴클레오타이드에 걸쳐 100%이고 나머지에 대해서는 0%로 낮다. 이러한 경우에, DNA-표적화 분절은 7개 뉴클레오타이드 길이인 것으로 여겨질 수 있다. 일부 가이드 RNA에서, DNA-표적화 분절 내의 적어도 17개의 뉴클레오타이드는 표적 DNA에 상보한다. 예를 들어, DNA-표적화 분절은 20개 뉴클레오타이드 길이일 수 있고 가이드 RNA 인식 서열의 상보하는 가닥과 1, 2, 또는 3개의 미스매치를 포함할 수 있다. 바람직하게, 미스매치는 프로토스페이서(protospacer) 인접 모티프 (PAM) 서열에 인접하지 않는다 (예컨대, 미스매치는 DNA-표적화 분절의 5' 단부에 있거나, 또는 미스매치는 PAM 서열로부터 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19 염기쌍 떨어져 있다).
gRNA의 단백질-결합 분절은 서로에 대해 상보하는 뉴클레오타이드의 2개 구간을 포함할 수 있다. 단백질-결합 분절의 상보하는 뉴클레오타이드는 이중 가닥 RNA 듀플렉스 (dsRNA)를 형성하기 위하여 혼성화한다. 대상 gRNA의 단백질-결합 분절은 Cas 단백질과 상호작용하고, gRNA는 결합된 Cas 단백질을 DNA-표적화 분절을 통해 표적 DNA 내의 특정 뉴클레오타이드 서열로 향하게 한다.
단일-가이드 RNA는 DNA-표적화 분절 및 스캐폴드 서열 (즉, 가이드 RNA의 단백질-결합 또는 Cas-결합 서열)을 가진다. 예를 들어, 이러한 가이드 RNA는 5' DNA-표적화 분절 및 3' 스캐폴드 서열을 가진다. 예시적인 스캐폴드 서열은 다음을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다: GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU (버전 1; SEQ ID NO: 89); GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (버전 2; SEQ ID NO: 8); GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (버전 3; SEQ ID NO: 9); 및 GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (버전 4; SEQ ID NO: 10). 임의의 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 가이드 RNA는, 예를 들어, 가이드 RNA의 3' 단부 상의 임의의 예시적인 가이드 RNA 스캐폴드 서열에 융합된 가이드 RNA의 5' 단부 상의 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 즉, 본원에 개시된 임의의 DNA-표적화 분절은 단일 가이드 RNA (키메라 가이드 RNA)를 형성하기 위하여 SEQ ID NO: 89, 8, 9, 또는 10 중 임의의 하나의 5' 단부에 연결될 수 있다. 본원의 다른 곳에서 개시된 가이드 RNA 버전 1, 2, 3, 및 4는 각각 스캐폴드 버전 1, 2, 3, 및 4와 연결된 DNA-표적화 분절 (즉, 가이드 서열 또는 가이드)을 나타낸다.
가이드 RNA는 추가적인 바람직한 특징 (예컨대, 변형된 또는 조절된 안정성; 세포 이하 표적화; 형광 표지로의 추적; 단백질 또는 단백질 복합체에 대한 결합 부위; 등)을 제공하는 변형 또는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 변형의 실례로는, 예를 들어, 5' Cap (예컨대, 7-메틸구아닐레이트 Cap (m7G)); 3' 폴리아데닐화된 꼬리 (즉, 3' 폴리(A) 꼬리); 리보스위치(riboswitch) 서열 (예컨대, 단백질 및/또는 단백질 복합체에 의한 조절된 안정성 및/또는 조절된 접근성을 허용하기 위한 것임); 안정성 제어 서열; dsRNA 듀플렉스를 형성하는 서열 (즉, 헤어핀); RNA를 세포이하 위치로 표적화하는 변형 또는 서열 (예컨대, 핵, 미토콘드리아, 엽록체, 등); 추적을 제공하는 변형 또는 서열 (예컨대, 형광 분자에 대한 직접 콘쥬게이션, 형광 검출을 용이하게 하는 모이어티에 대한 콘쥬게이션, 형광 검출을 허용하는 서열, 등); 단백질 (예컨대, DNA 메틸트랜스퍼라제, DNA 탈메틸화효소, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제, 히스톤 탈아세틸화효소, 등을 포함한, DNA에 작용하는 단백질)에 대한 결합 부위를 제공하는 변형 또는 서열; 및 이것들의 조합을 포함한다. 변형의 다른 실례는 조작된 스템 루프 듀플렉스 구조, 조작된 벌지 영역(bulge region), 스템 루프 듀플렉스 구조의 조작된 헤어핀 3', 또는 이것들의 임의의 조합을 포함한다. 예컨대, US 2015/0376586 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 벌지는 crRNA-유사 영역 및 최소 tracrRNA-유사 영역으로 만들어진 듀플렉스 내에서 뉴클레오타이드의 쌍을 형성하지 않은 영역일 수 있다. 벌지는 듀플렉스의 한쪽에 쌍을 형성하지 않은 5'-XXXY-3'를 포함할 수 있고, 여기서 X는 임의의 퓨린일 수 있고 Y는 반대쪽 가닥의 뉴클레오타이드와 동요쌍 (wobble pair)을 형성할 수 있는 뉴클레오타이드일 수 있으며, 듀플렉스의 반대쪽에 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드 영역을 포함할 수 있다.
미변형 핵산은 분해되기 쉬운 것일 수 있다. 외인성 핵산은 또한 선천성 면역 반응을 유도할 수 있다. 변형은 안정성을 도입하고 면역원성을 감소시키는 것을 도울 수 있다. 가이드 RNA는, 예를 들어, 다음 중 하나 이상을 포함하는, 변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다: (1) 포스포다이에스테르 골격 결합에서 비-연결용 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 다 및/또는 연결용 포스페이트 산소의 하나 이상의 변경 또는 대체; (2) 리보오스 당의 성분의 변경 또는 대체, 예컨대 리보오스 당에서 2' 하이드록실의 변경 또는 대체; (3) 포스페이트 모이어티의 디포스포 링커 (dephospho linker)로의 대체; (4) 자연적으로 발생하는 핵염기의 변형 또는 대체; (5) 리보오스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형; (6) 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부 또는 5' 단부의 변형 (예컨대, 모이어티의 말단 포스페이트 기 또는 콘쥬게이션의 제거, 변형 또는 대체; 및 (7) 당의 변형. 다른 가능한 가이드 RNA 변형으로는 우라실 또는 폴리-우라실 트랙트의 변형 또는 대체를 포함한다. 예컨대, 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함된 WO 2015/048577 및 US 2016/0237455를 참조한다. 유사한 변형이 Cas-암호화 핵산, 예컨대 Cas mRNA에 대해 이루어질 수 있다.
한 실례로서, 가이드 RNA의 5' 또는 3' 단부에 있는 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 결합을 포함할 수 있다 (예컨대, 염기는 포스포로티오에이트 기인 변형된 포스페이트 기를 가질 수 있다). 예를 들어, 가이드 RNA는 가이드 RNA의 5' 또는 3' 단부에 있는 2, 3, 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 결합을 포함할 수 있다. 다른 실례로서, 가이드 RNA의 5' 및/또는 3' 단부에 있는 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형을 가질 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 가이드 RNA의 5' 및/또는 3' 단부 (예컨대, 5' 단부)에 있는 2, 3, 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드에서 2'-O-메틸 변형을 포함할 수 있다. 예컨대, 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함된 WO 2017/173054 A1 및 Finnor et al. (2018) Cell Reports 22:1-9를 참조한다. 한 특정 실례에서, 가이드 RNA는 처음 3개의 5' 및 3' 말단 RNA 잔기에서 2'-O-메틸 유사체 및 3' 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함한다. 다른 특정 실례에서, 가이드 RNA는 Cas9 단백질과 상호작용하지 않는 모든 2'OH 기가 2'-O-메틸 유사체로 대체되도록 변형되고, Cas9와 최소한으로 상호작용하는 가이드 RNA의 꼬리 영역은 5' 및 3' 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합으로 변형된다. 예컨대, Yin et al. (2017) Nat. Biotech. 35(12):1179-1187 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 변형된 가이드 RNA의 다른 실례는, 예컨대 WO 2018/107028 A1 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 제공된다.
가이드 RNA는 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, gRNA는 RNA의 형태로, 2개의 분자 (별도의 crRNA 및 tracrRNA)로서 또는 한 분자 (sgRNA)로서, 선택적으로 Cas 단백질과의 복합체 형태로 제공될 수 있다. gRNA는 또한 gRNA를 암호화하는 DNA의 형태로 제공될 수 있다. gRNA를 암호화하는 DNA는 단일 RNA 분자 (sgRNA) 또는 별도의 RNA 분자 (예컨대, 별도의 crRNA 및 tracrRNA)를 암호화할 수 있다. 후자의 경우에, gRNA를 암호화하는 DNA는 한 DNA 분자로서 또는 각각 crRNA 및 tracrRNA를 암호화하는 별도의 DNA 분자로서 제공될 수 있다.
gRNA가 DNA의 형태로 제공될 때, gRNA는 세포에서 일시적으로, 조건부로, 또는 구성적으로 발현된다. gRNA를 암호화하는 DNA는 세포의 게놈에 안정적으로 통합되고 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, gRNA를 암호화하는 DNA는 발현 구성물에서 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, gRNA를 암호화하는 DNA는 이종성 핵산, 예컨대 Cas 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터에 있을 수 있다. 대안적으로, 그것은 Cas 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터와 다른 벡터 또는 플라스미드에 있을 수 있다. 이러한 발현 구성물에 사용될 수 있는 프로모터는, 예를 들어, 진핵 세포, 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 비인간 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 햄스터 세포, 토끼 세포, 만능 세포, 배아 줄기 (ES) 세포, 성인 줄기 세포, 발달상으로 제한된 선조 세포, 유도된 만능 줄기 (iPS) 세포, 단일 세포 단계 배아 중 하나 이상에서 활성인 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는, 예를 들어, 조건부 프로모터, 유도성 프로모터, 구성성 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터는 또한, 예를 들어, 양방향 프로모터일 수 있다. 적합한 프로모터의 구체적인 실례로는 RNA 중합효소 III 프로모터, 예컨대 인간 U6 프로모터, 래트 U6 중합효소 III 프로모터, 또는 마우스 U6 중합효소 III 프로모터를 들 수 있다.
대안적으로, gRNA는 다양한 다른 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, gRNA는 시험관내 전사에 의해, 예를 들어, T7 RNA 중합효소를 사용하여 제조될 수 있다 (예컨대, 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함된 WO 2014/089290 및 WO 2014/065596을 참조함). 가이드 RNA는 또한 화학적 합성에 의해 제조된 합성적으로 제조된 분자일 수 있다.
가이드 RNA 인식 서열 및 가이드 RNA 표적 서열. 용어 "가이드 RNA 인식 서열"은 결합에 충분한 조건이 존재한다면, gRNA의 DNA-표적화 분절이 결합하게 될 표적 DNA에 존재하는 핵산 서열을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 가이드 RNA 인식 서열은 표적 이중 가닥 DNA의 양 가닥을 포함한다 (즉, 가이드 RNA가 혼성화하는 상보하는 가닥 상의 서열 및 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 인접한 비상보성 가닥 상의 상응하는 서열). 본원에서 사용되는 용어 "가이드 RNA 표적 서열"은 구체적으로 PAM에 인접한 비상보성 가닥 상의 서열을 나타낸다 (즉, PAM의 상류 또는 5'). 즉, 가이드 RNA 표적 서열은 상보하는 가닥 상의 가이드 RNA가 혼성화하는 서열에 상응하는 비상보성 가닥 상의 서열을 나타낸다. 가이드 RNA 표적 서열은 가이드 RNA의 DNA-표적화 분절과 동등하지만, 우라실 대신 티민을 가진다. 한 실례로서, Cas9 효소에 대한 가이드 RNA 표적 서열은 5'-NGG-3' PAM에 인접한 비상보성 가닥 상의 서열을 나타낼 것이다. 가이드 RNA 인식 서열은 가이드 RNA가 상보성을 가지도록 설계된 서열을 포함하고, 이때 가이드 RNA 인식 서열의 상보하는 가닥과 가이드 RNA의 DNA-표적화 분절 사이의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 전체 상보성은 반드시 요구되는 것은 아니며, 단 혼성화를 유발하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있어야 한다. 가이드 RNA 인식 서열 또는 가이드 RNA 표적 서열은 또한 하기에서 보다 상세하게 기술되는, Cas 단백질에 대한 절단 부위를 포함한다. 가이드 RNA 인식 서열 또는 가이드 RNA 표적 서열은, 예를 들어, 세포의 핵 또는 세포질에 또는 세포의 소기관, 예컨대 미토콘드리아 또는 엽록체 내에 위치할 수 있는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
표적 DNA 내의 가이드 RNA 인식 서열은 Cas 단백질 또는 gRNA에 의해 표적화될 수 있다 (즉, 결합되거나, 그것과 혼성화하거나, 또는 그것에 상보할 수 있다). 적합한 DNA/RNA 결합 조건은 세포에 일반적으로 존재하는 생리적 조건을 포함한다. 다른 적합한 DNA/RNA 결합 조건 (예컨대, 세포-유리 시스템에서의 조건)이 알려져 있다 (예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다). Cas 단백질 또는 gRNA에 상보하고 그것과 혼성화하는 표적 DNA의 가닥은 "상보하는 가닥"으로 언급될 수 있고, "상보하는 가닥"에 상보하는 (그러므로 Cas 단백질 또는 gRNA에 상보하지 않는) 표적 DNA의 가닥은 "비상보성 가닥" 또는 "주형 가닥"으로 언급될 수 있다.
Cas 단백질은 gRNA의 DNA-표적화 분절이 결합하게 될 표적 DNA에 존재하는 핵산 서열 내에 있거나 외부에 있는 부위에서 핵산을 절단할 수 있다. "절단 부위"는 Cas 단백질이 단일 가닥 절단 또는 이중 가닥 절단을 생성하는 핵산의 위치를 포함한다. 예를 들어, CRISPR 복합체 (가이드 RNA 인식 서열의 상보하는 가닥에 혼성화되고 Cas 단백질과 복합체를 형성한 gRNA를 포함함)의 형성은 gRNA의 DNA-표적화 분절이 결합하게 될 표적 DNA에 존재하는 핵산 서열에 또는 그것과 가까이에 (예컨대, 그것으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개, 또는 그 이상의 염기쌍 내에) 있는 하나 또는 두 가닥의 절단을 초래할 수 있다. 만약 절단 부위가 gRNA의 DNA-표적화 분절이 결합하게 될 핵산 서열의 외부에 있다면, 절단 부위는 여전히 "가이드 RNA 인식 서열" 또는 가이드 RNA 표적 서열 내에 있는 것으로 여겨진다. 절단 부위는 핵산의 오직 한 가닥에만 또는 양 가닥에 있을 수 있다. 절단 부위는 핵산의 양 가닥 상의 동일한 위치에 있을 수 있거나 각 가닥의 상이한 부위에 있을 수 있다 (엇갈린 단부 (즉, 오버행)를 생성함). 엇갈린 단부는, 예를 들어, 각각이 상이한 가닥 상의 상이한 절단 부위에서 단일 가닥 절단을 생성함으로써 이중 가닥 절단을 생성하는 2개의 Cas 단백질을 사용함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 오버행 서열이 생성되도록 제1 닉카아제는 이중 가닥 DNA (dsDNA)의 제1 가닥에서 단일 가닥 절단을 생성할 수 있고, 제2 닉카아제는 dsDNA의 제2 가닥에서 단일 가닥 절단을 생성할 수 있다. 일부 경우에, 제1 가닥 상의 닉카아제의 가이드 RNA 인식 서열 또는 가이드 RNA 표적 서열은 제2 가닥 상의 닉카아제의 가이드 RNA 인식 서열 또는 가이드 RNA 표적 서열로부터 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500, 또는 1,000개의 염기쌍만큼 떨어져 있다.
Cas 단백질에 의한 표적 DNA의 부위-특이적 결합 및/또는 절단은 (i) gRNA와 표적 DNA 사이의 염기쌍 형성 상보성 및 (ii) 표적 DNA에서, 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)로 불리는 짧은 모티프 둘 다에 의해 결정된 위치에서 발생할 수 있다. PAM은 가이드 RNA가 혼성화하는 가닥의 반대쪽에 있는 비상보성 가닥에서 가이드 RNA 표적 서열의 옆에 있을 수 있다. 선택적으로, 가이드 RNA 표적 서열은 3' 단부에서 PAM이 옆에 있을 수 있다. 대안적으로, 가이드 RNA 표적 서열은 5' 단부에서 PAM이 옆에 있을 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질의 절단 부위는 PAM 서열의 하류 또는 상류로 약 1 내지 약 10개 또는 약 2 내지 약 5개 염기쌍 (예컨대, 3개 염기쌍)일 수 있다. 일부 경우에 (예컨대, 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9 또는 밀접하게 관련된 Cas9가 사용될 때), 비상보성 가닥의 PAM 서열은 5'-N1GG-3'일 수 있고, 여기서 N1은 임의의 DNA 뉴클레오타이드이며 표적 DNA의 비상보성 가닥의 가이드 RNA 인식 서열의 바로 3'에 있다 (즉, 가이드 RNA 표적 서열의 바로 3'). 그로써, 상보하는 가닥의 PAM 서열은 5'-CCN2-3'가 될 것이고, 여기서 N2는 임의의 DNA 뉴클레오타이드이며 표적 DNA의 상보하는 가닥의 가이드 RNA 인식 서열의 바로 5'에 있다. 일부의 이러한 경우에, N1 및 N2는 상보할 수 있고 N1 - N2 염기쌍은 임의의 염기쌍일 수 있다 (예컨대, N1=C 및 N2=G; N1=G 및 N2=C; N1=A 및 N2=T; 또는 N1=T, 및 N2=A). 스타필로코쿠스 아우레우스로부터의 Cas9의 경우에, PAM은 NNGRRT 또는 NNGRR일 수 있고, 여기서 N은 A, G, C, 또는 T일 수 있고, R은 G 또는 A일 수 있다. 캄필로박터 제주니로부터의 Cas9의 경우에, PAM은, 예를 들어, NNNNACAC 또는 NNNNRYAC일 수 있고, 여기서 N은 A, G, C, 또는 T일 수 있으며, R은 G 또는 A일 수 있다. 일부 경우에 (예컨대, FnCpf1의 경우에), PAM 서열은 5' 단부의 상류일 수 있고 서열 5'-TTN-3'를 가진다.
PAM 서열 외의 가이드 RNA 표적 서열 또는 가이드 RNA 표적 서열의 실례는 하기에서 제공된다. 예를 들어, 가이드 RNA 표적 서열은 Cas9 단백질에 의해 인식된 NGG 모티프 직전의 20개-뉴클레오타이드 DNA 서열일 수 있다. 이러한 가이드 RNA 표적 서열 플러스 PAM 서열의 실례는 GN19NGG (SEQ ID NO: 11) 또는 N20NGG (SEQ ID NO: 12)이다. 예컨대, WO 2014/165825 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 5' 단부에 있는 구아닌은 세포에서 RNA 중합효소에 의한 전사를 용이하게 할 수 있다. 가이드 RNA 표적 서열 플러스 PAM 서열의 다른 실례는 시험관내에서 T7 중합효소에 의한 전사를 용이하게 하기 위해 5' 단부에 2개의 구아닌 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다 (예컨대, GGN20NGG; SEQ ID NO: 13). 예컨대, WO 2014/065596 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 다른 가이드 RNA 표적 서열 플러스 PAM 서열은 SEQ ID NO: 11 내지 13의, 5' G 또는 GG 및 3' GG 또는 NGG를 포함한, 4 내지 22개 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 또 다른 가이드 RNA 표적 서열은 SEQ ID NO: 11 내지 13의, 14 내지 20개 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다.
가이드 RNA 인식 서열 또는 가이드 RNA 표적 서열은 세포에 대해 내인성 또는 외인성인 임의의 핵산 서열일 수 있다. 가이드 RNA 인식 서열 또는 가이드 RNA 표적 서열은 유전자 생성물 (예컨대, 단백질)을 암호화하는 서열 또는 비코딩 서열 (예컨대, 조절 서열)이거나 둘 다를 포함할 수 있다.
(3) 인간 TTR 유전자를 표적화하는 외인성 도너 핵산
본원에 개시된 조성물 및 방법은 뉴클레아제 작용제로의 인간화된 TTR 유전자좌의 절단 후에 인간화된 TTR 유전자좌를 변형시키기 위해 외인성 도너 핵산을 이용할 수 있다. 이러한 방법에서, 뉴클레아제 작용제는 단일 가닥 절단 (닉) 또는 이중 가닥 절단을 생성하기 위하여 인간화된 TTR 유전자좌를 절단하고, 외인성 도너 핵산은 비-상동성 단부 연결 (NHEJ)-매개된 결찰을 통해 또는 상동성 인도 수복 사건을 통해 인간화된 TTR 유전자좌와 재조합한다. 선택적으로, 외인성 도너 핵산으로의 수복은 표적화된 대립유전자가 뉴클레아제 작용제에 의해 재표적화될 수 없도록 가이드 뉴클레아제 표적 서열을 제거 또는 파괴한다.
외인성 도너 핵산은 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)을 포함할 수 있고, 이것들은 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있으며, 이것들은 선형 또는 원형 형태일 수 있다. 예를 들어, 외인성 도너 핵산은 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드 (ssODN)일 수 있다. 예컨대, Yoshimi et al. (2016) Nat. Commun. 7:10431 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 예시적인 외인성 도너 핵산은 약 50개 뉴클레오타이드 내지 약 5 kb 길이이거나, 약 50개 뉴클레오타이드 내지 약 3 kb 길이이거나, 또는 약 50 내지 약 1,000개 뉴클레오타이드 길이이다. 다른 예시적인 외인성 도너 핵산은 길이가 약 40 내지 약 200개 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 외인성 도너 핵산은 약 50 내지 60개, 60 내지 70개, 70 내지 80개, 80 내지 90개, 90 내지 100개, 100 내지 110개, 110 내지 120개, 120 내지 130개, 130 내지 140개, 140 내지 150개, 150 내지 160개, 160 내지 170개, 170 내지 180개, 180 내지 190개, 또는 190 내지 200개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 대안적으로, 외인성 도너 핵산은 약 50 내지 100개, 100 내지 200개, 200 내지 300개, 300 내지 400개, 400 내지 500개, 500 내지 600개, 600 내지 700개, 700 내지 800개, 800 내지 900개, 또는 900 내지 1000개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 대안적으로, 외인성 도너 핵산은 약 1 내지 1.5, 1.5 내지 2, 2 내지 2.5, 2.5 내지 3, 3 내지 3.5, 3.5 내지 4, 4 내지 4.5, 또는 4.5 내지 5 kb 길이일 수 있다. 대안적으로, 외인성 도너 핵산은, 예를 들어, 5 kb 이하, 4.5 kb 이하, 4 kb 이하, 3.5 kb 이하, 3 kb 이하, 2.5 kb 이하, 2 kb 이하, 1.5 kb 이하, 1 kb 이하, 900개 뉴클레오타이드 이하, 800개 뉴클레오타이드 이하, 700개 뉴클레오타이드 이하, 600개 뉴클레오타이드 이하, 500개 뉴클레오타이드 이하, 400개 뉴클레오타이드 이하, 300개 뉴클레오타이드 이하, 200개 뉴클레오타이드 이하, 100개 뉴클레오타이드 이하, 또는 50개 뉴클레오타이드 이하의 길이일 수 있다. 외인성 도너 핵산 (예컨대, 표적화 벡터)은 또한 더 길 수 있다.
한 실례에서, 외인성 도너 핵산은 약 80개 뉴클레오타이드 내지 약 200개 뉴클레오타이드 길이인 ssODN이다. 다른 실례에서, 외인성 도너 핵산은 약 80개 뉴클레오타이드 내지 약 3 kb 길이인 ssODN이다. 이러한 ssODN은, 예를 들어, 각각 약 40개 뉴클레오타이드 및 약 60개 뉴클레오타이드 길이인 상동성 팔을 가질 수 있다. 이러한 ssODN은 또한, 예를 들어, 각각 약 30개 뉴클레오타이드 내지 100개 뉴클레오타이드 길이인 상동성 팔을 가질 수 있다. 상동성 팔은 대칭적이거나 (예컨대, 각각 40개 뉴클레오타이드 또는 각각 60개 뉴클레오타이드 길이), 또는 그것들은 비대칭적일 수 있다 (예컨대, 한 상동성 팔은 36개 뉴클레오타이드 길이이고, 한 상동성 팔은 91개 뉴클레오타이드 길이이다).
외인성 도너 핵산은 추가적인 바람직한 특징 (예컨대, 변형된 또는 조절된 안정성; 형광 표지로의 추적 또는 검출; 단백질 또는 단백질 복합체에 대한 결합 부위; 등등)을 제공하는 변형 또는 서열을 포함할 수 있다. 외인성 도너 핵산은 하나 이상의 형광 표지, 정제 태그, 에피토프 태그, 또는 이것들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 외인성 도너 핵산은 하나 이상의 형광 표지 (예컨대, 형광 단백질 또는 다른 형광단 또는 염료), 예컨대 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 형광 표지를 포함할 수 있다. 예시적인 형광 표지로 형광단, 예컨대 플루오레세인 (예컨대, 6-카르복시플루오레세인 (6-FAM)), 텍사스 레드, HEX, Cy3, Cy5, Cy5.5, 퍼시픽 블루, 5-(및-6)-카르복시테트라메틸로다민 (TAMRA), 및 Cy7을 들 수 있다. 광범위한 형광 염료가 올리고뉴클레오타이드를 표지하기 위해 상업적으로 활용될 수 있다 (예컨대, Integrated DNA Technologies사 제품). 이러한 형광 표지 (예컨대, 내부 형광 표지)는, 예를 들어, 외인성 도너 핵산의 단부와 부합하는 돌출된 단부를 가진 절단된 표적 핵산에 직접 통합된 외인성 도너 핵산을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 표지 또는 태그는 외인성 도너 핵산의 5' 단부에, 3' 단부에, 또는 내부에 있을 수 있다. 예를 들어, 외인성 도너 핵산은 5' 단부에서 Integrated DNA Technologies사의 IR700 형광단 (5'IRDYE®700)과 콘쥬게이션될 수 있다.
외인성 도너 핵산은 또한 인간화된 TTR 유전자좌에서 통합될 DNA의 분절을 포함하는 핵산 삽입물을 포함할 수 있다. 인간화된 TTR 유전자좌에서의 핵산 삽입물의 통합은 관심의 핵산 서열의 인간화된 TTR 유전자좌로의 첨가, 관심의 핵산 서열의 인간화된 TTR 유전자좌에서의 삭제, 또는 관심의 핵산 서열의 인간화된 TTR 유전자좌에서의 대체 (즉, 삭제 및 삽입)를 초래할 수 있다. 일부 외인성 도너 핵산은 인간화된 TTR 유전자좌에서 임의의 상응하는 삭제 없이 인간화된 TTR 유전자좌에서 핵산 삽입물의 삽입을 위해 설계된다. 다른 외인성 도너 핵산은 핵산 삽입물의 임의의 상응하는 삽입 없이 인간화된 TTR 유전자좌에서 관심의 핵산 서열을 삭제하도록 설계된다. 또 다른 외인성 도너 핵산은 인간화된 TTR 유전자좌에서 관심의 핵산 서열을 삭제하고 그것을 핵산 삽입물로 대체하도록 설계된다.
삭제되는 및/또는 대체되는 인간화된 TTR 유전자좌에서의 핵산 삽입물 또는 상응하는 핵산은 다양한 길이일 수 있다. 삭제되는 및/또는 대체되는 인간화된 TTR 유전자좌에서의 예시적인 핵산 삽입물 또는 상응하는 핵산은 약 1개 뉴클레오타이드 내지 약 5 kb 길이이거나 약 1개 뉴클레오타이드 내지 약 1,000개 뉴클레오타이드 길이이다. 예를 들어, 삭제되는 및/또는 대체되는 인간화된 TTR 유전자좌에서의 핵산 삽입물 또는 상응하는 핵산은 약 1 내지 10개, 10 내지 20개, 20 내지 30개, 30 내지 40개, 40 내지 50개, 50 내지 60개, 60 내지 70개, 70 내지 80개, 80 내지 90개, 90 내지 100개, 100 내지 110개, 110 내지 120개, 120 내지 130개, 130 내지 140개, 140 내지 150개, 150 내지 160개, 160 내지 170개, 170 내지 180개, 180 내지 190개, 또는 190 내지 120개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 마찬가지로, 삭제되는 및/또는 대체되는 인간화된 TTR 유전자좌에서의 핵산 삽입물 또는 상응하는 핵산은 1 내지 100개, 100 내지 200개, 200 내지 300개, 300 내지 400개, 400 내지 500개, 500 내지 600개, 600 내지 700개, 700 내지 800개, 800 내지 900개, 또는 900 내지 1000개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 마찬가지로, 삭제되는 및/또는 대체되는 인간화된 TTR 유전자좌에서의 핵산 삽입물 또는 상응하는 핵산은 약 1 내지 1.5, 1.5 내지 2, 2 내지 2.5, 2.5 내지 3, 3 내지 3.5, 3.5 내지 4, 4 내지 4.5, 또는 4.5 내지 5 kb 길이이거나 더 길 수 있다.
핵산 삽입물은 대체를 위해 표적화된 서열의 전부 또는 일부에 상동하거나 이종상동하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 삽입물은 인간화된 TTR 유전자좌에서 대체를 위해 표적화된 서열과 비교하여 하나 이상의 점 돌연변이 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상)를 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 이러한 점 돌연변이는 암호화된 폴리펩타이드에 보존성 아미노산 치환 (예컨대, 아스파르트산 [Asp, D]의 글루탐산 [Glu, E]으로의 치환)을 초래할 수 있다.
비-상동성-단부-연결-매개된 삽입을 위한 도너 핵산. 일부 외인성 도너 핵산은 인간화된 TTR 유전자좌에서 뉴클레아제-매개된 절단에 의해 생성된 하나 이상의 오버행에 상보하는 5' 단부 및/또는 3' 단부에서 짧은 단일 가닥 영역을 가진다. 이들 오버행은 또한 5' 및 3' 상동성 팔로서 언급될 수 있다. 예를 들어, 일부 외인성 도너 핵산은 인간화된 TTR 유전자좌에서 5' 및/또는 3' 표적 서열에서 뉴클레아제-매개된 절단에 의해 생성된 하나 이상의 오버행에 상보하는 5' 단부 및/또는 3' 단부에서 짧은 단일 가닥 영역을 가진다. 일부 이러한 외인성 도너 핵산은 5' 단부에서만 또는 3' 단부에서만 상보하는 영역을 가진다. 예를 들어, 일부 이러한 외인성 도너 핵산은 인간화된 TTR 유전자좌에서 5' 표적 서열에서 생성된 오버행에 상보하는 5' 단부에서만 또는 인간화된 TTR 유전자좌에서 3' 표적 서열에서 생성된 오버행에 상보하는 3' 단부에서만 상보하는 영역을 가진다. 다른 이러한 외인성 도너 핵산은 5' 및 3' 단부 둘 다에서 상보하는 영역을 가진다. 예를 들어, 다른 이러한 외인성 도너 핵산은 5' 및 3' 단부, 예컨대, 각각 인간화된 TTR 유전자좌에서 뉴클레아제-매개된 절단에 의해 생성된 제1 및 제2 오버행에 상보하는 두 단부에서 모두 상보하는 영역을 가진다. 예를 들어, 만약 외인성 도너 핵산이 이중 가닥이면, 단일 가닥 상보하는 영역은 도너 핵산의 상부 가닥의 5' 단부 및 도너 핵산의 하부 가닥의 5' 단부로부터 연장되어 각 단부 상에 5' 오버행을 생성할 수 있다. 대안적으로, 단일 가닥 상보하는 영역은 도너 핵산의 상부 가닥의 3' 단부로부터 및 주형의 하부 가닥의 3' 단부로부터 연장되어 3' 오버행이 생성될 수 있다.
상보하는 영역은 외인성 도너 핵산과 표적 핵산 사이의 결찰을 촉진하기에 충분한 임의의 길이를 가질 수 있다. 예시적인 상보하는 영역은 약 1개 내지 약 5개 뉴클레오타이드 길이, 약 1개 내지 약 25개 뉴클레오타이드 길이, 또는 약 5개 내지 약 150개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 예를 들어, 상보하는 영역은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 대안적으로, 상보하는 영역은 약 5 내지 10개, 10 내지 20개, 20 내지 30개, 30 내지 40개, 40 내지 50개, 50 내지 60개, 60 내지 70개, 70 내지 80개, 80 내지 90개, 90 내지 100개, 100 내지 110개, 110 내지 120개, 120 내지 130개, 130 내지 140개, 또는 140 내지 150개 뉴클레오타이드 길이이거나, 또는 더 길 수 있다.
이러한 상보하는 영역은 닉카아제의 2개 쌍에 의해 생성된 오버행에 상보할 수 있다. 엇갈린 단부를 가진 2개의 이중 가닥 절단은 제1 이중 가닥 절단을 생성하기 위해 DNA의 반대쪽 가닥을 절단하는 제1 및 제2 닉카아제, 및 제2 이중 가닥 절단을 생성하기 위해 DNA의 반대쪽 가닥을 절단하는 제3 및 제4 닉카아제를 사용함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 제1, 제2, 제3, 및 제4 가이드 RNA와 상응하는 제1, 제2, 제3, 및 제4 가이드 RNA 표적 서열을 절개하기 위하여 사용될 수 있다. 제1 및 제2 가이드 RNA 표적 서열은 제1 및 제2 닉카아제에 의해 DNA의 제1 및 제2 가닥 상에 생성된 닉이 이중 가닥 절단을 생성하도록 (즉, 제1 절단 부위가 제1 및 제2 가이드 RNA 표적 서열 내에 있는 닉을 포함하도록) 제1 절단 부위를 생성하기 위해 배치될 수 있다. 마찬가지로, 제3 및 제4 가이드 RNA 표적 서열은 제3 및 제4 닉카아제에 의해 DNA의 제1 및 제2 가닥 상에 생성된 닉이 이중 가닥 절단을 생성하도록 (즉, 제2 절단 부위가 제3 및 제4 가이드 RNA 표적 서열 내에 있는 닉을 포함하도록) 제2 절단 부위를 생성하기 위해 배치될 수 있다. 바람직하게, 제1 및 제2 가이드 RNA 표적 서열 및/또는 제3 및 제4 가이드 RNA 표적 서열 내의 닉은 오버행을 생성하는 오프-셋 닉일 수 있다. 오프셋 창은, 예를 들어, 적어도 약 5 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp 또는 그 이상일 수 있다. 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함된 Ran et al. (2013) Cell 154:1380-1389; Mali et al. (2013) Nat. Biotech.31:833-838; 및 Shen et al. (2014) Nat. Methods 11:399-404를 참조한다. 이러한 경우에, 이중 가닥 외인성 도너 핵산은 제1 및 제2 가이드 RNA 표적 서열 내의 닉에 의해 및 제3 및 제4 가이드 RNA 표적 서열 내의 닉에 의해 생성된 오버행에 상보하는 단일 가닥 상보하는 영역으로 설계될 수 있다. 이러한 외인성 도너 핵산은 그런 후 비-상동성-단부-연결-매개된 결찰에 의해 삽입될 수 있다.
상동성 인도 수복에 의한 삽입을 위한 도너 핵산 . 일부 외인성 도너 핵산은 상동성 팔을 포함한다. 만약 외인성 도너 핵산이 또한 핵산 삽입물을 포함한다면, 상동성 팔은 핵산 삽입물 옆에 있을 수 있다. 언급의 용이성을 위해, 상동성 팔은 본원에서 5' 및 3' (즉, 상류 및 하류) 상동성 팔로서 언급된다. 이 용어들은 외인성 도너 핵산 내의 핵산 삽입물에 대한 상동성 팔의 상대적인 위치를 나타낸다. 5' 및 3' 상동성 팔은 인간화된 TTR 유전자좌 내의 영역에 상응하며, 본원에서 각각 "5' 표적 서열" 및 "3' 표적 서열"로서 언급된다.
상동성 팔 및 표적 서열은 두 영역이 상동 재조합 반응을 위한 기질로서 작용하기 위해 서로에 대해 충분한 수준의 서열 동일성을 공유할 때 서로에 대해 "상응하는"이거나 또는 "상응한다". 용어 "상동성"은 상응하는 서열에 대해 동일하거너 서열 동일성을 공유하는 DNA 서열을 포함한다. 주어진 표적 서열과 외인성 도너 핵산에서 찾을 수 있는 상응하는 상동성 팔 사이의 서열 동일성은 상동 재조합이 일어나는 것을 허용할 임의의 정도의 서열 동일성일 수 있다. 예를 들어, 외인성 도너 핵산 (또는 이것의 단편)의 상동성 팔과 표적 서열 (또는 이것의 단편)에 의해 공유된 서열 동일성의 양은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성일 수 있어서, 서열은 상동 재조합을 진행하게 된다. 게다가, 상동성 팔과 상응하는 표적 서열 사이의 상응하는 상동성 영역은 상동 재조합을 촉진하기에 충분한 임의의 길이를 가질 수 있다. 예시적인 상동성 팔은 약 25개 뉴클레오타이드 내지 약 2.5 kb 길이이거나, 약 25개 뉴클레오타이드 내지 약 1.5 kb 길이이거나, 또는 약 25개 내지 약 500개 뉴클레오타이드 길이이다. 예를 들어, 주어진 상동성 팔 (또는 각각의 상동성 팔) 및/또는 상응하는 표적 서열은 약 25 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 250, 250 내지 300, 300 내지 350, 350 내지 400, 400 내지 450, 또는 450 내지 500 뉴클레오타이드 길이인 상응하는 상동성 영역을 포함할 수 있어서, 상동성 팔은 표적 핵산 내의 상응하는 표적 서열과 상동 재조합을 진행하기에 충분한 상동성을 가지게 된다. 대안적으로, 주어진 상동성 팔 (또는 각각의 상동성 팔) 및/또는 상응하는 표적 서열은 약 0.5 kb 내지 약 1 kb, 약 1 kb 내지 약 1.5 kb, 약 1.5 kb 내지 약 2 kb, 또는 약 2 kb 내지 약 2.5 kb 길이인 상응하는 상동성 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상동성 팔은 각각 약 750개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 상동성 팔은 대칭적이거나 (각각 거의 동일한 크기의 길이임), 또는 비대칭적일 수 있다 (하나가 다른 하나보다 더 길다).
뉴클레아제 작용제가 외인성 도너 핵산과 함께 사용될 때, 5' 및 3' 표적 서열은 뉴클레아제 절단 부위에서 단일 가닥 절단 (닉) 또는 이중 가닥 절단시에 표적 서열과 상동성 팔 사이의 상동 재조합 사건의 발생을 촉진하기 위하여 바람직하게 뉴클레아제 절단 부위에 충분히 근접하여 (예컨대, 가이드 RNA 표적 서열에 충분히 가깝게) 배치된다. 용어 "뉴클레아제 절단 부위"는 닉 또는 이중 가닥 절단이 뉴클레아제 작용제 (예컨대, 가이드 RNA와 복합체를 형성한 Cas9 단백질)에 의해 생성되는 DNA 서열을 포함한다. 외인성 도너 핵산의 5' 및 3' 상동성 팔에 상응하는 표적화된 유전자좌 내의 표적 서열은 만약 거리가 예컨대 뉴클레아제 절단 부위에서 단일 가닥 절단 또는 이중 가닥 절단시에 5' 및 3' 표적 서열과 상동성 팔 사이의 상동 재조합 사건의 발생을 촉진하기 위한 것이라면 뉴클레아제 절단 부위에 "충분히 근접하여 배치"된다. 그러므로, 외인성 도너 핵산의 5' 및/또는 3' 상동성 팔에 상응하는 표적 서열은, 예를 들어, 주어진 뉴클레아제 절단 부위의 적어도 1개 뉴클레오타이드 내에, 또는 주어진 뉴클레아제 절단 부위의 적어도 10개 뉴클레오타이드 내지 약 1,000개 뉴클레오타이드 내에 있을 수 있다. 실례로서, 뉴클레아제 절단 부위는 적어도 하나 또는 둘 다의 표적 서열 바로 옆에 있을 수 있다.
외인성 도너 핵산의 상동성 팔에 상응하는 표적 서열과 뉴클레아제 절단 부위의 공간적 관계는 달라질 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 뉴클레아제 절단 부위에 대해 5'에 위치할 수 있거나, 표적 서열은 뉴클레아제 절단 부위에 대해 3'에 위치할 수 있거나, 또는 표적 서열은 뉴클레아제 절단 부위 옆에 있을 수 있다.
(4) 다른 인간-TTR-표적화 시약
임의의 다른 공지된 또는 추정되는 인간-TTR-표적화 시약의 활성은 또한 본원에서 개시된 비인간 동물을 사용하여 평가될 수 있다. 유사하게, 임의의 다른 분자는 본원에서 개시된 비인간 동물을 사용하여 인간-TTR-표적화 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
다른 인간-TTR-표적화 시약의 실례로는 RNA 간섭 (RNAi)을 통해 작용하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (예컨대, siRNA 또는 shRNA)를 들 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ASO) 또는 안티센스 RNA는 표적화된 단백질을 암호화하는 RNA에 대해 선택적으로 결합하고 그로써 번역을 방지함으로써 표적화된 단백질의 발현을 방지하도록 설계된 뉴클레오타이드의 짧은 합성 스트링이다. 이들 화합물은 잘 특성화된 왓슨-크릭 염기쌍 형성 (혼성화)을 통해 높은 친화성 및 선택성으로 RNA에 결합한다. RNA 간섭 (RNAi)은 RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC)에 결합되는 작은 간섭 RNA (siRNA)가 표적 메신저 RNA (mRNA)의 절단을 매개하는 유전자 발현을 제어하기 위한 내인성 세포 메카니즘이다. 인간-TTR-표적화 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 실례는 알려져 있다. 예컨대, Ackermann et al. (2012) Amyloid Suppl 1:43-44 및 Coelho et al. (2013) N. Engl. J. Med. 369(9):819-829 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
다른 인간-TTR-표적화 시약으로 인간 TTR 에피토프에 특이적으로 결합하도록 설계된 항체 또는 항원 결합 단백질을 들 수 있다.
다른 인간-TTR-표적화 시약으로는 소분자 시약을 들 수 있다. 이러한 소분자 시약의 한 실례는 타파미디스로, 이것은 트랜스티레틴 (TTR) 단백질의 정확하게 접혀진 테트라머 형태의 동적 안정화에 의해 기능한다. 예컨대, Hammarstrom et al. (2003) Science 299:713-716 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
D. 비인간 동물 또는 세포에 인간-TTR-표적화 시약의 투여
본원에 개시된 방법은 비인간 동물 또는 세포에 핵산, 단백질, 핵산-단백질 복합체, 또는 단백질 복합체를 포함한, 다양한 분자 (예컨대, 치료 분자 또는 복합체와 같은 인간-TTR-표적화 시약)를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. "도입하는 것"은 세포 내부에 또는 비인간 동물 내의 세포 내부에 접근하게 되는 방식으로 분자 (예컨대, 핵산 또는 단백질)를 세포 또는 비인간 동물에 제공하는 것을 포함한다. 도입하는 것은 임의의 수단에 의해 달성될 수 있고, 둘 이상의 구성요소 (예컨대, 구성요소 중 두 개, 또는 구성요소의 전부)는 세포 또는 비인간 동물에 동시에 또는 임의의 조합으로 순차적으로 도입될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 세포 또는 비인간 동물에 가이드 RNA의 도입 전에 도입될 수 있거나, 또는 가이드 RNA의 도입 후에 도입될 수 있다. 다른 실례로서, 외인성 도너 핵산은 Cas 단백질 및 가이드 RNA의 도입 전에 도입되거나, 또는 그것은 Cas 단백질 및 가이드 RNA의 도입 후에 도입될 수 있다 (예컨대, 외인성 도너 핵산은 Cas 단백질 및 가이드 RNA의 도입보다 약 1, 2, 3, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 또는 72시간 전 또는 후에 투여될 수 있다). 예컨대, US 2015/0240263 및 US 2015/0110762 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 이에 더불어, 둘 이상의 구성요소는 세포 또는 비인간 동물로 동일한 전달 방법 또는 상이한 전달 방법에 의해 도입될 수 있다. 유사하게, 둘 이상의 구성요소는 비인간 동물로 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의해 도입될 수 있다.
일부 방법에서, CRISPR/Cas 시스템의 구성요소가 비인간 동물 또는 세포에 도입된다. 가이드 RNA는 비인간 동물 또는 세포에 RNA 형태로 (예컨대, 시험관내 전사된 RNA) 또는 가이드 RNA를 암호화하는 DNA의 형태로 도입될 수 있다. DNA의 형태로 도입될 때, 가이드 RNA를 암호화하는 DNA는 비인간 동물의 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 AAV를 통해 전달되고 생체내에서 U6 프로모터 하에 발현될 수 있다. 이러한 DNA는 하나 이상의 발현 구성물에 있을 수 있다. 예를 들어, 이러한 발현 구성물은 단일 핵산 분자의 구성요소일 수 있다. 대안적으로, 그것은 둘 이상의 핵산 분자 중에서 임의의 조합으로 분리될 수 있다 (즉, 하나 이상의 CRISPR RNA를 암호화하는 DNA 및 하나 이상의 tracrRNA를 암호화하는 DNA는 별도의 핵산 분자의 구성요소일 수 있다).
마찬가지로, Cas 단백질은 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 단백질, 예컨대 gRNA와 복합체를 형성한 Cas 단백질의 형태로 제공될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질은 Cas 단백질을 암호화하는 핵산, 예컨대 RNA (예컨대, 메신저 RNA (mRNA)) 또는 DNA의 형태로 제공될 수 있다. 선택적으로, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 특정 세포 또는 유기체에서 단백질로의 효율적인 번역에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 또는 관심의 임의의 다른 숙주 세포에서, 자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교하여 더 높은 빈도의 용법을 가지는 코돈을 치환하기 위해 변형될 수 있다. Cas 단백질을 암호화하는 핵산이 비인간 동물로 도입될 때, Cas 단백질은 비인간 동물에서 일시적으로, 조건부로, 또는 구성적으로 발현될 수 있다.
Cas 단백질 또는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산은 발현 구성물에서 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 발현 구성물은 관심의 유전자 또는 다른 핵산 서열 (예컨대, Cas 유전자)의 발현을 지시할 수 있고 관심의 이러한 핵산 서열을 표적 세포에 전달할 수 있는 임의의 핵산 구성물을 포함한다. 예를 들어, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 하나 이상의 gRNA를 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터에 있을 수 있다. 대안적으로, 그것은 하나 이상의 gRNA를 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터와 별도의 벡터 또는 플라스미드에 있을 수 있다. 발현 구성물에서 사용될 수 있는 적합한 프로모터는, 예를 들어, 진핵 세포, 인간 세포, 비-인간 세포, 포유류 세포, 비-인간 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 햄스터 세포, 토끼 세포, 만능 세포, 배아 줄기 (ES) 세포, 성체 줄기 세포, 발달상으로 제한된 선조 세포, 유도된 만능 줄기 (iPS) 세포, 또는 단일 세포 단계 배아 중 하나 이상에서 활성인 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는, 예를 들어, 조건부 프로모터, 유도성 프로모터, 구성성 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 선택적으로, 프로모터는 한 방향으로 Cas 단백질의 발현 및 다른 방향으로 가이드 RNA의 발현을 둘 다 구동하는 양방향성 프로모터일 수 있다. 이러한 양방향성 프로모터는 (1) 3개의 외부 제어 요소: 원위 서열 요소 (DSE), 근위 서열 요소 (PSE), 및 TATA 박스를 함유하는 완전한, 종래의, 단일방향 Pol III 프로모터; 및 (2) PSE 및 역방향으로 DSE의 5' 말단에 융합된 TATA 박스를 포함하는 제2 염기 Pol III 프로모터로 이루어질 수 있다. 예를 들어, H1 프로모터에서, DSE는 PSE 및 TATA 박스에 인접하고, 프로모터는 역방향으로의 전사가 U6 프로모터로부터 유래된 PSE 및 TATA 박스를 첨부함으로써 제어되는 하이브리드 프로모터를 생성함으로써 양방향성이 될 수 있다. 예컨대, US 2016/0074535 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. Cas 단백질 및 가이드 RNA를 암호화하는 유전자를 발현하기 위한 양방향성 프로모터의 사용은 동시에 전달을 용이하게 하기 위하여 압축 발현 카세트의 생성을 가능하게 한다.
비인간 동물 또는 세포에 도입된 분자 (예컨대, Cas 단백질 또는 가이드 RNA)는 도입된 분자의 안정성을 증가시키는 (예컨대, 분해 생성물이 한계값 아래로, 예컨대 출발 핵산 또는 단백질의 0.5 중량% 아래로 유지되는 주어진 보관 조건 (예컨대, -20℃, 4℃, 또는 주변 온도) 하의 기간을 연장시키는; 또는 생체내에서 안정성을 증가시키는) 담체를 포함하는 조성물에 제공될 수 있다. 이러한 담체의 비제한적인 실례는 폴리(락트산) (PLA) 마이크로스피어, 폴리(D,L-락틱-코글리콜릭-산) (PLGA) 마이크로스피어, 리포솜, 미셸, 역미셸, 지질 코클레이트, 및 지질 미세소관을 포함한다.
핵산 또는 단백질의 세포 또는 비인간 동물로의 도입을 허용하기 위한 다양한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 핵산을 다양한 세포 유형으로 도입하는 방법은 알려져 있고, 예를 들어, 안정적인 트랜스펙션 방법, 일시적인 트랜스펙션 방법, 및 바이러스-매개된 방법을 포함한다.
핵산 서열을 세포로 도입하기 위한 프로토콜뿐만 아니라 트랜스펙션 프로토콜은 달라질 수 있다. 비제한적인 트랜스펙션 방법으로 리포솜; 나노입자; 인산 칼슘 (Graham et al. (1973) Virology 52 (2): 456-67, Bacchetti et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (4): 1590-4, 및 Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York: W. H. Freeman and Company. pp. 96-97); 덴드리머; 또는 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민과 같은 양이온 중합체를 사용하는 화학물질-기반 트랜스펙션 방법을 들 수 있다. 비-화학물질 방법은 전기천공법, 초음파처리법, 및 광학 트랜스펙션을 들 수 있다. 입자-기반 트랜스펙션은 유전자 총, 또는 자석-보조 트랜스펙션의 사용을 포함한다 (Bertram (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-28). 바이러스 방법 또한 트랜스펙션을 위해 사용될 수 있다.
핵산 또는 단백질의 세포로의 도입은 또한 전기천공법에 의해, 세포질내 주입에 의해, 바이러스 감염에 의해, 아데노바이러스에 의해, 아데노 관련 바이러스에 의해, 렌티바이러스에 의해, 레트로바이러스에 의해, 트랜스펙션에 의해, 지질-매개된 트랜스펙션에 의해, 또는 뉴클레오펙션(nucleofection)에 의해 매개될 수 있다. 뉴클레오펙션은 핵산 기질이 세포질로뿐만 아니라 핵 막을 통해 핵 안으로 전달되는 것을 가능하게 하는 개선된 전기천공 기술이다. 더불어, 본원에 개시된 방법에서 뉴클레오펙션의 사용은 전형적으로 정규 전기천공법보다 훨씬 적은 수 (예컨대, 정규 전기천공법에 의한 7백만개와 비교하여 단지 약 2백만개)의 세포를 필요로 한다. 한 실례에서, 뉴클레오펙션은 LONZA® NUCLEOFECTORTM 시스템을 사용하여 수행된다.
핵산 또는 단백질의 세포 (예컨대, 접합체)로의 도입은 또한 마이크로주입에 의해 달성될 수 있다. 접합체 (즉, 단일 세포 단계 배아)에서, 마이크로주입은 모체의 및/또는 모 전핵으로 또는 세포질로 들어갈 수 있다. 만약 마이크로주입이 오직 하나의 전핵으로만 일어난다면, 모 전핵이 그것의 큰 크기로 인해 바람직하다. mRNA의 마이크로주입은 바람직하게는 세포질 안으로 일어나며 (예컨대, mRNA를 번역 기계로 직접 전달하기 위하여), 한편 Cas 단백질 또는 Cas 단백질 또는 RNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 마이크로주입은 핵/전핵 안으로 이루어지는 것이 바람직하다. 대안적으로, 마이크로주입은 핵/전핵 및 세포질 둘 다로의 주입에 의해 수행될 수 있다: 바늘이 먼저 핵/전핵으로 도입될 수 있고 제1 양이 주입될 수 있으며, 단일 세포 단계 배아로부터 바늘이 제거되면서 제2 양이 세포질로 주입될 수 있다. 만약 Cas 단백질이 세포질에 주입되면, Cas 단백질은 바람직하게 핵/전핵으로의 전달을 보장하기 위해 핵 국지화 신호를 포함한다. 마이크로주입을 수행하기 위한 방법은 잘 알려져 있다. 예컨대, Nagy et al. (Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003, Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)를 참조하고; 또한 Meyer et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:15022-15026 및 Meyer et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109:9354-9359를 참조한다.
핵산 또는 단백질을 세포 또는 비인간 동물로 도입하기 위한 다른 방법으로, 예를 들어, 벡터 전달, 입자-매개된 전달, 엑소좀-매개된 전달, 지질 나노입자-매개된 전달, 세포-침투-펩타이드-매개된 전달, 또는 이식가능한 장치-매개된 전달을 들 수 있다. 특정 실례로서, 핵산 또는 단백질은 폴리(락트산) (PLA) 마이크로스피어, 폴리(D,L-락틱-코글리콜릭-산) (PLGA) 마이크로스피어, 리포좀, 미셸, 역미셸, 지질 코클레이트, 또는 지질 미세소관과 같은 담체로 세포 또는 비인간 동물에 도입될 수 있다. 비인간 동물에의 전달의 일부 특정 실례는 유체역학적 전달, 바이러스-매개된 전달 (예컨대, 아데노 관련 바이러스 (AAV)-매개된 전달), 및 지질 나노입자-매개된 전달을 포함한다.
핵산 및 단백질의 세포 또는 비인간 동물로의 도입은 유체역학적 전달 (HDD)에 의해 달성될 수 있다. 유체역학적 전달은 생체내에서 세포내 DNA 전달을 위한 방법으로서 출현되었다. 실질 세포에의 유전자 전달을 위해, 필수 DNA 서열만이 선택된 혈관을 통해 주입됨으로써, 현재 바이러스 및 합성 벡터와 관련된 안전성 문제가 제거된다. 혈류로 주입될 때, DNA는 혈액에 접근할 수 있는 상이한 조직의 세포에 도달할 수 있다. 유체역학적 전달은 크고 막-불침투성인 화합물이 실질 세포로 들어가는 것을 방지하는 내피세포와 세포 막의 물리적 장벽을 극복하기 위하여 순환의 비압축성 혈액으로의 많은 양의 용액의 신속한 주입에 의해 생성된 힘을 사용한다. DNA의 전달에 더불어, 이 방법은 생체내에서 RNA, 단백질, 및 다른 작은 화합물의 효율적인 세포내 전달에 유용하다. 예컨대, Bonamassa et al. (2011) Pharm. Res. 28(4):694-701 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
핵산의 도입은 또한 바이러스-매개된 전달, 예컨대 AAV-매개된 전달 또는 렌티바이러스-매개된 전달에 의해 달성될 수 있다. 다른 예시적인 바이러스/바이러스 벡터로 레트로바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 및 헤르페스 단순 바이러스를 들 수 있다. 바이러스는 분할 세포, 비분할 세포, 또는 분할 및 비분할 세포 둘 다를 감염시킬 수 있다. 바이러스는 숙주 게놈으로 통합되거나 대안적으로 숙주 게놈으로 통합되지 않을 수 있다. 이러한 바이러스는 또한 감소된 면역력을 갖도록 조작될 수 있다. 바이러스는 복제 경합성이거나 복제 결핍성일 수 있다 (예컨대, 비리온 복제 및/또는 포장의 추가적인 회기에 필요한 하나 이상의 유전자가 결핍됨). 바이러스는 일시적인 발현, 장기 지속되는 발현 (예컨대, 적어도 1주, 2주, 1개월, 2개월, 또는 3개월), 또는 영구적인 발현 (예컨대, Cas9 및/또는 gRNA의 발현)을 유발할 수 있다. 예시적인 바이러스 역가 (예컨대, AAV 역가)는 1012, 1013, 1014, 1015, 및 1016 벡터 게놈/mL을 포함한다.
ssDNA AAV 게놈은 상보하는 DNA 가닥의 합성을 허용하는 2개의 역 말단 반복부가 옆에 있는, 2개의 오픈 리딩 프레임, Rep 및 Cap으로 이루어진다. AAV 이동 플라스미드(transfer plasmid)를 구성할 때, 도입유전자는 2개의 ITR 사이에 배치되고, Rep 및 Cap은 트랜스로 공급될 수 있다. Rep 및 Cap에 더불어, AAV는 아데노바이러스로부터의 유전자를 함유한 헬퍼 플라스미드를 필요로 할 수 있다. 이들 유전자 (E4, E2a, 및 VA)는 AAV 복제를 매개하였다. 예를 들어, 이동 플라스미드, Rep/Cap, 및 헬퍼 플라스미드는 감염성 AAV 입자를 생성하기 위하여 아데노바이러스 유전자 E1+를 함유한 HEK293 세포로 트랜스펙션될 수 있다. 대안적으로, Rep, Cap, 및 아데노바이러스 헬퍼 유전자는 단일 플라스미드로 조합될 수 있다. 유사한 포장 세포 및 방법이 다른 바이러스, 예컨대 레트로바이러스에 대해 사용될 수 있다.
AAV의 다중 혈청형이 확인되었다. 이들 혈청형은 그것들이 감염시키는 세포 유형 (즉, 그것의 향성(tropism))이 상이하여서, 특이적 세포 유형의 우선적인 형질도입이 허용된다. CNS 조직에 대한 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8, 및 AAV9를 포함한다. 심장 조직에 대한 혈청형은 AAV1, AAV8, 및 AAV9를 포함한다. 신장 조직에 대한 혈청형은 AAV2를 포함한다. 폐 조직에 대한 혈청형은 AAV4, AAV5, AAV6, 및 AAV9를 포함한다. 췌장 조직에 대한 혈청형은 AAV8을 포함한다. 광 수용기 세포에 대한 혈청형은 AAV2, AAV5, 및 AAV8을 포함한다. 망막 색소 상피 조직에 대한 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, 및 AAV8을 포함한다. 골격근 조직에 대한 혈청형은 AAV1, AAV6, AAV7, AAV8, 및 AAV9를 포함한다. 간 조직에 대한 혈청형은 AAV7, AAV8, 및 AAV9, 및 특히 AAV8을 포함한다.
향성은 상이한 바이러스 혈청형으로부터의 캡시드 및 게놈을 혼합하는 것인 거짓분류(pseudotyping)를 통해 추가로 개선될 수 있다. 예를 들어 AAV2/5는 혈청형 5로부터의 캡시드에 포장된 혈청형 2의 게놈을 함유한 바이러스를 나타낸다. 거짓분류된 바이러스의 사용은 형질도입 효율을 개선할 수 있을뿐 아니라, 향성을 변경시킬 수 있다. 상이한 혈청형으로부터 유래된 하이브리드 캡시드는 또한 바이러스 향성을 변경시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, AAV-DJ는 8개의 혈청형으로부터의 하이브리드 캡시드를 함유하고 생체내에서 광범위한 세포 유형을 가로지르는 높은 감염성을 나타낸다. AAV-DJ8은 AAV-DJ의 특성을 나타내지만 뇌 흡수가 증강된 또 다른 실례이다. AAV 혈청형은 또한 돌연변이를 통해 개선될 수 있다. AAV2의 돌연변이 변형의 실례는 Y444F, Y500F, Y730F, 및 S662V를 포함한다. AAV3의 돌연변이 변형의 실례는 Y705F, Y731F, 및 T492V를 포함한다. AAV6의 돌연변이 변형의 실례는 S663V 및 T492V를 포함한다. 다른 거짓분류된/변형된 AAV 변이체로는 AAV2/1, AAV2/6, AAV2/7, AAV2/8, AAV2/9, AAV2.5, AAV8.2, 및 AAV/SASTG를 들 수 있다.
도입유전자 발현을 가속화하기 위하여, 자체-상보하는 AAV (scAAV) 변이체가 사용될 수 있다. AAV가 AAV의 단일 가닥 DNA 게놈의 상보하는 가닥을 합성하기 위해 세포의 DNA 복제 기계에 좌우되기 때문에, 도입유전자 발현이 지연될 수 있다. 이런 지연을 해결하기 위하여, 감염시에 자발적으로 어닐링될 수 있는 상보하는 서열을 함유하는 scAAV가 사용될 수 있어서, 숙주 세포 DNA 합성에 대한 필요조건이 제거된다. 그러나, 단일 가닥 AAV (ssAAV) 벡터도 사용될 수 있다.
포장 능력을 증가시키기 위하여, 더 긴 도입유전자는 2개의 AAV 이동 플라스미드 사이에서 분열될 수 있는데, 첫 번째는 3' 스플라이스 도너로 및 두 번째는 5' 스플라이스 억셉터로 분열될 수 있다. 세포의 동시 감염시, 이들 바이러스는 콘카테머(concatemer)를 형성하며, 함께 스플라이싱되고, 전장 도입유전자가 발현될 수 있다. 이것이 더 긴 도입유전자 발현을 허용하긴 하지만, 발현은 덜 효율적이다. 능력을 증가시키기 위한 유사한 방법은 상동 재조합을 이용한다. 예를 들어, 도입유전자는 2개의 이동 플라스미드 사이에서 나누어질 수 있지만 실질적인 서열은 동시발현이 상동 재조합 및 전장 도입유전자의 발현을 유도하도록 중복된다.
핵산 및 단백질의 도입은 또한 지질 나노입자 (LNP)-매개된 전달에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, LNP-매개된 전달은 Cas mRNA와 가이드 RNA의 조합 또는 Cas 단백질과 가이드 RNA의 조합을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법을 통한 전달은 일시적인 Cas 발현을 초래하고, 생분해성 지질은 클리어런스를 개선시키고, 허용성을 개선시키며, 면역원성을 감소시킨다. 지질 제제는 생물학적 분자의 세포 흡수를 개선시키면서 그것이 분해되는 것으로부터 보호할 수 있다. 지질 나노입자는 분자내 힘에 의해 서로 물리적으로 회합된 다수의 지질 분자를 포함하는 입자이다. 이들은 마이크로스피어 (단일층 및 다중층 소포, 예컨대 리포좀을 포함함), 에멀션에 분산된 상, 미셸, 또는 현탁액의 내부 상을 포함한다. 이러한 지질 나노입자는 전달을 위해 하나 이상의 핵산 또는 단백질을 캡슐화하기 위해 사용될 수 있다. 양이온성 지질을 함유한 제제는 핵산과 같은 다가음이온을 전달하는 데 유용하다. 포함될 수 있는 다른 지질은 중성 지질 (즉, 대전되지 않은 또는 양성이온성 지질), 음이온성 지질, 트랜스펙션을 증강시키는 헬퍼 지질, 및 나노입자가 생체내에서 존재할 수 있는 시간의 길이를 증가시키는 스텔스 지질 (stealth lipid)이다. 적합한 양이온성 지질, 중성 지질, 음이온성 지질, 헬퍼 지질, 및 스텔스 지질의 실례는 WO 2016/010840 A1 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 찾을 수 있다. 예시적인 지질 나노입자는 양이온성 지질 및 하나 이상의 다른 구성요소를 포함할 수 있다. 한 실례에서, 다른 구성요소는 콜레스테롤과 같은 헬퍼 지질을 포함할 수 있다. 다른 실례에서, 다른 구성요소는 콜레스테롤과 같은 헬퍼 지질 및 DSPC와 같은 중성 지질을 포함할 수 있다. 또 다른 실례에서, 다른 구성요소는 콜레스테롤과 같은 헬퍼 지질, DSPC와 같은 선택적 중성 지질, 및 S010, S024, S027, S031, 또는 S033과 같은 스텔스 지질을 포함할 수 있다.
LNP는 다음 중 하나 이상 또는 전부를 함유할 수 있다: (i) 캡슐화 및 엔도솜 탈출을 위한 지질; (ii) 안정화를 위한 중성 지질; (iii) 안정화를 위한 헬퍼 지질; 및 (iv) 스텔스 지질. 예컨대, Finn et al. (2018) Cell Reports 22:1-9 및 WO 2017/173054 A1 (각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 특정 LNP에서, 내용물은 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 특정 LNP에서, 내용물은 Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 암호화하는 mRNA, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
캡슐화 및 엔도솜 탈출을 위한 지질은 양이온성 지질일 수 있다. 지질은 또한 생분해성 지질, 예컨대 생분해성 이온화 지질일 수 있다. 적합한 지질의 한 실례는 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트로도 불리는, (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-다이에노에이트인 지질 A 또는 LP01이다. 예컨대, Finn et al. (2018) Cell Reports 22:1-9 및 WO 2017/173054 A1 (각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 적합한 지질의 다른 실례는 ((5-((다이메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,1-다이일)비스(데카노에이트)로도 불리는, ((5-((다이메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,1-다이일)비스(데카노에이트)인 지질 B이다. 적합한 지질의 또 다른 실례는 2-((4-(((3-(다이메틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-다이일(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-다이에노에이트)인 지질 C이다. 적합한 지질의 또 다른 실례는 3-(((3-(다이메틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)-13-(옥타노일옥시)트라이데실 3-옥틸운데카노에이트인 지질 D이다. 다른 적합한 지질로 헵타트라이아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(다이메틸아미노)부타노에이트 (Dlin-MC3-DMA (MC3)으로도 알려져 있음)를 들 수 있다.
본원에서 기술된 LNP에 사용하기에 적합한 일부 이러한 지질은 생체내에서 생분해성이다. 예를 들어, 이러한 지질을 포함하는 LNP는 지질의 적어도 75%가 8, 10, 12, 24, 또는 48시간, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 또는 10일 이내에 혈장으로부터 제거되는 것들이다. 다른 실례로서, LNP의 적어도 50%는 8, 10, 12, 24, 또는 48시간, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 또는 10일 이내에 혈장으로부터 제거된다.
이러한 지질은 그것이 사용되는 매질의 pH에 따라 이온화될 수 있다. 예를 들어, 약산성 매질에서, 지질은 양자화될 수 있고, 그로써 양성 전하를 가진다. 역으로, 약염기성 매질, 예컨대, pH가 대략 7.35인 혈액에서, 지질은 양자화될 수 없고, 따라서 전하를 갖지 않는다. 일부 구체예에서, 지질은 적어도 약 9, 9.5, 또는 10의 pH에서 양자화될 수 있다. 이러한 지질이 전하를 갖는 능력은 그것의 고유한 pKa와 관련된다. 예를 들어, 지질은, 독립적으로, 약 5.8 내지 약 6.2 범위의 pKa를 가질 수 있다.
중성 지질은 LNP를 안정화시키고 가공을 개선시키는 기능을 한다. 적합한 중성 지질의 실례로 다양한 중성, 비전하 또는 양성이온성 지질을 들 수 있다. 본 개시에 사용하기에 적합한 중성 인지질의 실례는, 한정하는 것은 아니지만, 5-헵타데실벤젠-1,3-다이올 (레조르시놀), 다이팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 다이스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 포스포콜린 (DOPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC), 포스파티딜콜린 (PLPC), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DAPC), 포스파티딜에탄올아민 (PE), 난 포스파티딜콜린 (EPC), 다이라우로일포스파티딜콜린 (DLPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC), 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린 (MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린 (PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린 (PSPC), 1,2-다이아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DBPC), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린 (SPPC), 1,2-다이에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DEPC), 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린 (POPC), 리소포스파티딜 콜린, 다이올레오일 포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 다이리놀레오일포스파티딜콜린 다이스테아로일포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 다이미리스토일 포스파티딜에탄올아민 (DMPE), 다이팔미토일 포스파티딜에탄올아민 (DPPE), 팔미토일올레오일 포스파티딜에탄올아민 (POPE), 리소포스파티딜에탄올아민, 및 이것들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 중성 인지질은 다이스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC) 및 다이미리스토일 포스파티딜 에탄올아민 (DMPE)으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
헬퍼 지질은 트랜스펙션을 증강시키는 지질을 포함한다. 헬퍼 지질이 트랜스펙션을 증강시키는 메커니즘은 입자 안정성을 증강시키는 것을 포함할 수 있다. 특정한 경우에, 헬퍼 지질은 막 융합생성성(fusogenicity)을 증강시킬 수 있다. 헬퍼 지질로는 스테로이드, 스테롤, 및 알킬 레조르시놀을 들 수 있다. 적합한 헬퍼 지질의 실례로는 콜레스테롤, 5-헵타데실 레조르시놀, 및 콜레스테롤 헤미석시네이트를 들 수 있다. 한 실례에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 헤미석시네이트일 수 있다.
스텔스 지질로는 나노입자가 생체내에서 존재할 수 있는 시간의 길이를 변경시키는 지질을 들 수 있다. 스텔스 지질은, 예를 들어, 입자 응집을 감소시키고 입자 크기를 제어함으로써 제제화 과정을 보조할 수 있다. 스텔스 지질은 LNP의 약동학적 특성을 조절할 수 있다. 적합한 스텔스 지질로 지질 모이어티에 결합된 친수성 헤드기를 가진 지질을 들 수 있다.
스텔스 지질의 친수성 헤드기는, 예를 들어, PEG (때때로 폴리(에틸렌 옥사이드)로도 언급됨), 폴리(옥사졸린), 폴리(비닐 알코올), 폴리(글리세롤), 폴리(N- 비닐 피롤리돈), 폴리아미노산, 및 폴리 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드를 기반으로 한 중합체로부터 선택된 중합체를 포함할 수 있다. 용어 PEG는 임의의 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 폴리알킬렌 에테르 중합체를 의미한다. 특정 LNP 제제에서, PEG는, PEG 2000으로도 불리는 PEG-2K로, 약 2,000 달톤의 평균 분자량을 가진다. 예컨대, WO 2017/173054 A1 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
스텔스 지질의 지질 모이어티는, 예를 들어, 독립적으로 약 C4 내지 약 C40 포화 또는 불포화 탄소 원자를 포함하는 알킬 사슬 길이를 가지는 다이알킬글리세롤 또는 다이알킬글리카미드 기를 포함하는 것들을 포함하여, 다이아실글리세롤 또는 다이아실글리카미드로부터 유래될 수 있고, 여기서 사슬은 예를 들어, 아미드 또는 에스테르와 같은 작용기를 하나 이상 포함할 수 있다. 다이알킬글리세롤 또는 다이알킬글리카미드 기는 하나 이상의 치환된 알킬기를 추가로 포함할 수 있다.
한 실례로서, 스텔스 지질은 PEG-다이라우로일글리세롤, PEG-다이미리스토일글리세롤 (PEG-DMG), PEG-다이팔미토일글리세롤, PEG-다이스테아로일글리세롤 (PEG- DSPE), PEG-다이라우릴글리카미드, PEG-다이미리스틸글리카미드, PEG-다이팔미토일글리카미드, 및 PEG-다이스테아로일글리카미드, PEG-콜레스테롤 (1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카르복사미도-3',6'-다이옥사옥타닐]카바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB (3,4-다이테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에테르), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (PEG2k- DMG), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (PEG2k-DSPE), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (PEG2k-DSG), 폴리(에틸렌 글리콜)-2000-다이메타크릴레이트 (PEG2k-DMA), 및 1,2-다이스테아릴옥시프로필-3-아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (PEG2k-DSA)으로부터 선택될 수 있다. 한 특정 실례에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG일 수 있다.
LNP는 제제의 구성요소 지질의 상이한 각각의 몰 비를 포함할 수 있다. CCD 지질의 몰%는, 예를 들어, 약 30 몰% 내지 약 60 몰%, 약 35 몰% 내지 약 55 몰%, 약 40 몰% 내지 약 50 몰%, 약 42 몰% 내지 약 47 몰%, 또는 약 45%일 수 있다. 헬퍼 지질의 몰%는, 예를 들어, 약 30 몰% 내지 약 60 몰%, 약 35 몰% 내지 약 55 몰%, 약 40 몰% 내지 약 50 몰%, 약 41 몰% 내지 약 46 몰%, 또는 약 44 몰%일 수 있다. 중성 지질의 몰%는, 예를 들어, 약 1 몰% 내지 약 20 몰%, 약 5 몰% 내지 약 15 몰%, 약 7 몰% 내지 약 12 몰%, 또는 약 9 몰%일 수 있다. 스텔스 지질의 몰%는, 예를 들어, 약 1 몰% 내지 약 10 몰%, 약 1 몰% 내지 약 5 몰%, 약 1 몰% 내지 약 3 몰%, 약 2 몰%, 또는 약 1 몰%일 수 있다.
LNP는 생분해성 지질의 양으로 대전된 아민기 (N)와 캡슐화될 핵산의 음으로 대전된 포스페이트 기 (P) 사이에 상이한 비율을 가질 수 있다. 이것은 식 N/P에 의해 수학적으로 표현될 수 있다. 예를 들어, N/P 비율은 약 0.5 내지 약 100, 약 1 내지 약 50, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 7, 약 3 내지 약 5, 약 4 내지 약 5, 약 4, 약 4.5, 또는 약 5일 수 있다.
N/P 비율은 또한 약 4 내지 약 7 또는 약 4.5 내지 약 6일 수 있다. 특정 실례에서, N/P 비율은 4.5 또는 6일 수 있다.
일부 LNP에서, 내용물은 Cas mRNA 및 gRNA를 포함할 수 있다. Cas mRNA 및 gRNA는 상이한 비율로 있을 수 있다. 예를 들어, LNP 제제는 약 25:1 내지 약 1:25의 범위, 약 10:1 내지 약 1:10의 범위, 약 5:1 내지 약 1:5의 범위, 또는 약 1:1의 Cas mRNA 대 gRNA 핵산의 비율을 포함할 수 있다. 대안적으로, LNP 제제는 약 1:1 내지 약 1:5, 또는 약 10:1의 Cas mRNA 대 gRNA 핵산의 비율을 포함할 수 있다. 대안적으로, LNP 제제는 약 1:10, 25:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5, 1:10, 또는 1:25의 Cas mRNA 대 gRNA 핵산의 비율을 포함할 수 있다. 대안적으로, LNP 제제는 약 1:1 내지 약 1:2의 Cas mRNA 대 gRNA 핵산의 비율을 포함할 수 있다. 특정 실례에서, Cas mRNA 대 gRNA의 비율은 약 1:1 또는 약 1:2일 수 있다.
일부 LNP에서, 내용물은 외인성 도너 핵산 및 gRNA를 포함할 수 있다. 외인성 도너 핵산 및 gRNA는 상이한 비율로 있을 수 있다. 예를 들어, LNP 제제는 약 25:1 내지 약 1:25 범위, 약 10:1 내지 약 1:10 범위, 약 5:1 내지 약 1:5 범위, 또는 약 1:1의 외인성 도너 핵산 대 gRNA 핵산 비율을 포함할 수 있다. 대안적으로, LNP 제제는 약 1:1 내지 약 1:5, 약 5:1 내지 약 1:1, 약 10:1, 또는 약 1:10의 외인성 도너 핵산 대 gRNA 핵산 비율을 포함할 수 있다. 대안적으로, LNP 제제는 약 1:10, 25:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5, 1:10, 또는 1:25의 외인성 도너 핵산 대 gRNA 핵산 비율을 포함할 수 있다.
적합한 LNP의 특정 실례는 4.5의 질소-대-포스페이트 (N/P) 비율을 가지며 생분해성 양이온 지질, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG2k-DMG를 45:44:9:2 몰비로 함유한다. 생분해성 양이온 지질은 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트로도 불리는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-다이에노에이트일 수 있다. 예컨대, Finn et al. (2018) Cell Reports 22:1-9 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. Cas9 mRNA는 가이드 RNA에 대한 중량 기준으로 1:1 비율일 수 있다. 적합한 LNP의 또 다른 특정 실례는 Dlin-MC3-DMA (MC3), 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG-DMG를 50:38.5:10:1.5 몰비로 함유한다.
적합한 LNP의 또 다른 특정 실례는 6의 질소-대-포스페이트 (N/P) 비율을 가지며 50:38:9:3 몰비의 생분해성 양이온 지질, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG2k-DMG를 함유한다. 생분해성 양이온 지질은 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트로도 언급되는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-다이에노에이트일 수 있다. Cas9 mRNA는 가이드 RNA에 대해 중량 기준으로 1:2 비율일 수 있다.
전달 양식은 면역원성을 감소시키기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, Cas 단배길 및 gRNA는 상이한 양식에 의해 (예컨대, 이중 양식 전달) 전달될 수 있다. 이들 상이한 양식은 상이한 약역학 또는 약동학 특성을 대상 전달된 분자 (예컨대, Cas 또는 그것을 암호화하는 핵산, gRNA 또는 암호화하는 핵산, 또는 외인성 도너 핵산/수복 주형)에 부여할 수 있다. 예를 들어, 상이한 양식은 상이한 조직 분포, 상이한 반감기, 또는 상이한 일시적 분포를 초래할 수 있다. 일부 전달 양식 (예컨대, 자율적인 복제 또는 게놈 통합에 의해 세포에서 지속되는 핵산 벡터의 전달)은 분자의 보다 지속적인 발현 및 존재를 초래하는 반면, 다른 전달 약식은 일시적이고 덜 지속적이다 (예컨대, RNA 또는 단백질의 전달). 보다 일시적인 방식으로 Cas 단백질의 전달, 예를 들어 mRNA 또는 단백질로서의 전달은 Cas/gRNA 복합체가 유일하게 존재하고 짧은 기간 동안 활성이며 MHC 분자에 의해 세포 표면에 나타나는, 박테리아에서 유래된 Cas 효소로부터의 펩타이드에 의해 유발된 면역원성을 감소시킬 수 있는 것을 확실하게 해줄 수 있다. 이러한 일시적인 전달은 또한 표적 외 변형의 가능성을 감소시킬 수 있다.
생체내 투여는, 예를 들어, 비경구, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 척수강내, 복강내, 국소적, 비강내, 또는 근육내를 포함한 임의의 적합한 경로에 의한 것일 수 있다. 전신적 투여 양식은, 예를 들어, 경구 및 비경구 경로를 포함한다. 비경구 경로의 실례는 정맥내, 동맥내, 골내, 근육내, 피부내, 피하, 비강내, 및 복강내 경로를 들 수 있다. 특정 실례는 정맥내 주입이다. 비강 주입 및 유리체내 주사가 다른 특정 실례이다. 국소적 투여 양식으로는, 예를 들어, 척수강내, 뇌실내, 뇌실질내 (예컨대, 선조체 (예컨대, 미상 선조체 안으로 또는 피각 안으로), 뇌피질, 중심 전회(precentral gyrus), 해마 (예컨대, 치아 이랑 또는 CA3 영역 안으로), 측두 피질, 편도체, 전방 피질, 시상, 소뇌, 수질, 시상하부, 중뇌덮개(tectum), 피개(tegmentum), 또는 흑질로의 국지화된 뇌실질내 전달), 안구내, 안와내, 결막하, 유리체내, 망막하, 및 경골 경로를 포함한다. 전신적으로 (예를 들어, 정맥내로) 투여될 때와 비교하여 국소적으로 (예를 들어, 뇌실질내로 또는 유리체내로) 투여될 때 유의하게 더 적은 양 (전신적 접근법과 비교하여)의 구성요소가 효과를 발휘할 수 있다. 국소적 투여 양식은 또한 치료적으로 효과적인 양의 구성요소가 전신적으로 투여될 때 발생할 수 있는 잠재적으로 독성인 부작용의 발생을 감소 또는 제거할 수 있다.
생체내 투여는, 예를 들어, 비경구, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 척수강내, 복강내, 국소적, 비강내, 또는 근육내를 포함한 임의의 적합한 경로에 의한 것일 수 있다. 특정 실례는 정맥내 주입이다. 가이드 RNA 및/또는 Cas 단백질 (또는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산)을 포함한 조성물은 하나 이상의 생리적으로 및 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 제제화될 수 있다. 제제는 선택된 투여 경로에 좌우될 수 있다. 용어 "제약학적으로 허용되는"은 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제가 제제의 다른 성분과 부합하고 그것의 수령체에 실질적으로 유해하지 않은 것을 의미한다.
투여 빈도 및 복용량의 수는 다른 요인들 중에서도 외인성 도너 핵산, 가이드 RNA, 또는 Cas 단백질 (또는 가이드 RNA 또는 Cas 단백질을 암호화하는 핵산)의 반감기 및 투여 경로에 따라 좌우될 수 있다. 핵산 또는 단백질의 세포 또는 비인간 동물로의 도입은 한 번에 또는 일정 기간 동안 여러 번 수행될 수 있다. 예를 들어, 도입은 일정 기간 동안 적어도 2회, 일정 기간 동안 적어도 3회, 일정 기간 동안 적어도 4회, 일정 기간 동안 적어도 5회, 일정 기간 동안 적어도 6회, 일정 기간 동안 적어도 7회, 일정 기간 동안 적어도 8회, 일정 기간 동안 적어도 9회, 일정 기간 동안 적어도 10회, 일정 기간 동안 적어도 11회, 일정 기간 동안 적어도 12회, 일정 기간 동안 적어도 13회, 일정 기간 동안 적어도 14회, 일정 기간 동안 적어도 15회, 일정 기간 동안 적어도 16회, 일정 기간 동안 적어도 17회, 일정 기간 동안 적어도 18회, 일정 기간 동안 적어도 19회, 또는 일정 기간 동안 적어도 20회 수행될 수 있다.
E. 생체내에서 또는 생체외에서 인간-TTR-표적화 시약의 전달, 활성, 또는 효능의 측정
본원에서 개시된 방법은 추가로 인간-TTR-표적화 시약의 활성을 검출 또는 측정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 만약 인간-TTR-표적화 시약이 게놈 편집 시약 (예컨대, 인간 TTR 유전자좌를 표적화하기 위해 설계된 CRISPR/Cas)이면, 측정 단계는 변형에 대해 인간화된 TTR 유전자좌를 평가하는 것을 포함할 수 있다.
표적화된 유전자 변형을 가지는 세포를 확인하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 스크리닝은 모 염색체의 대립유전자의 변형 (MOA)을 평가하기 위한 정량적인 검정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 정량적 검정은 정량적 PCR, 예컨대 실시간 PCR (qPCR)을 통해 수행될 수 있다. 실시간 PCR은 표적 유전자좌를 인식하는 제1 프라이머 세트 및 비표적화 참조 유전자좌를 인식하는 제2 프라이머 세트를 활용한다. 프라이머 세트는 증폭된 서열을 인식하는 형광 프로브를 포함할 수 있다. 적합한 정량적 검정의 다른 실례는 형광-매개된 인시튜 혼성화 (FISH), 비교용 게놈 혼성화, 등온 DNA 증폭, 고정된 프로브(들)에 대한 정량적 혼성화, INVADER® 프로브, TAQMAN® Molecular Beacon 프로브, 또는 ECLIPSETM 프로브 기술을 들 수 있다 (예컨대, US 2005/0144655 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조).
차세대 서열분석 (NGS)이 또한 스크리닝에 사용될 수 있다. 차세대 서열분석은 또한 "NGS" 또는 "대규모 병렬 서열분석" 또는 "고처리량 서열분석"으로서 언급될 수 있다. NGS는 표적화된 유전자 변형의 정확한 성질 및 그것이 세포 유형 또는 조직 유형 또는 장기 유형을 가로질러 일관되는지를 규정하기 위해 MOA 검정에 더불어 스크리닝 도구로서 사용될 수 있다.
비인간 동물에서 인간화된 TTR 유전자좌의 변형을 평가하는 것은 임의의 조직 또는 장기로부터의 임의의 세포 유형에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 평가는 동일한 조직 또는 장기로부터의 다중 세포 유형에서 또는 조직 또는 장기 내의 다중 위치로부터의 세포에서 이루어질 수 있다. 이것은 표적 조직 또는 장기 내의 어떤 세포 유형이 표적화되는지 또는 조직 또는 장기의 어떤 부분이 TTR-표적화 시약에 의해 도달되는지에 대한 정보를 제공할 수 있다. 다른 실례로서, 평가는 조직의 다중 유형에서 또는 다중 장기에서 이루어질 수 있다. 특정 조직, 장기, 또는 세포 유형이 표적화되는 방법에서, 이것은 어떻게 효과적으로 그 조직 또는 장기가 표적화되는지 및 다른 조직 또는 장기에서 표적 외 효과가 있는지의 여부에 대한 정보를 제공할 수 있다.
만약 시약이 인간화된 TTR 유전자좌를 비활성화하거나, 인간화된 TTR 유전자좌의 발현에 영향을 미치거나, 인간화된 TTR mRNA의 번역을 방지하거나, 또는 인간화된 TTR 단백질을 제거하기 위해 설계된다면, 측정 단계는 인간화된 TTR mRNA 또는 단백질 발현을 평가하는 것을 포함할 수 있다. 이런 측정은 간 내에서 또는 간 내의 특정 세포 유형 또는 영역 내에서 이루어지거나, 또는 분비된 인간화된 TTR 단백질의 혈청 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
인간화된 TTR 단백질의 생성 및 분비는 임의의 공지된 수단에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 발현은 공지된 검정을 사용하여 비인간 동물의 간에서 암호화된 mRNA의 수준 또는 비인간 동물의 간에서 암호화된 단백질의 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 인간화된 TTR 단백질의 분비는 공지된 검정을 사용하여 비인간 동물에서 암호화된 인간화된 TTR 단백질의 혈장 수준 또는 혈청 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다.
IV. 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 비인간 동물의 제조 방법
본원의 다른 곳에서 개시된 바와 같은 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 비인간 동물의 제조 방법이 제공된다. 유전자 변형된 유기체를 제조하기 위한 임의의 편리한 방법 또는 프로토콜은 이러한 유전자 변형된 비인간 동물을 제조하기에 적합하다. 예컨대, Cho et al. (2009) Current Protocols in Cell Biology 42:19.11:19.11.1-19.11.22 및 Gama Sosa et al. (2010) Brain Struct. Funct. 214(2-3):91-109 (각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 이러한 유전자 변형된 비인간 동물은, 예를 들어, 표적화된 Ttr 유전자좌에서 유전자 녹-인(knock-in)을 통해 생성될 수 있다.
예를 들어, 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 비인간 동물의 제조 방법은: (1) 만능 세포의 게놈을 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하도록 변형시키는 단계; (2) 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 만능 세포를 확인 또는 선택하는 단계; (3) 유전자 변형된 만능 세포를 비인간 동물 숙주 배아로 도입하는 단계; 및 (4) 숙주 세포를 대리 모체에 이식하고 임신시키는 단계를 포함할 수 있다. 선택적으로, 변형된 만능 세포 (예컨대, 비-인간 ES 세포)를 포함하는 숙주 배아는 이식되기 전의 배반포 단계가 F0 비인간 동물을 생성하기 위해 대리 모체에 이식되고 임신될 때까지 인큐베이션될 수 있다. 대리 모체는 그런 후 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 F0 세대 비인간 동물을 생성할 수 있다.
방법은 변형된 표적 게놈 유전자좌 (즉, 인간화된 TTR 유전자좌)를 가지는 세포 또는 동물을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다양한 방법이 표적화된 유전자 변형을 가지는 세포 및 동물을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
스크리닝 단계는, 예를 들어, 모 염색체의 대립유전자의 변형 (MOA)을 평가하기 위한 정량적 검정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 정량적 검정은 정량적 PCR, 예컨대 실시간 PCR (qPCR)을 통해 수행될 수 있다. 실시간 PCR은 표적 유전자좌를 이식하는 제1 프라이머 세트 및 비표적화된 참조 유전자좌를 인식하는 제2 프라이머 세트를 활용할 수 있다. 프라이머 세트는 증폭된 서열을 인식하는 형광 프로브를 포함할 수 있다.
적합한 정량적 검정의 다른 실례는 형광-매개된 제자리 혼성화 (FISH), 비교 게놈 혼성화, 등온 DNA 증폭, 고정된 프로브(들)에 대한 정량적 혼성화, INVADER® 프로브, TAQMAN® Molecular Beacon 프로브, 또는 ECLIPSETM 프로브 기술을 포함한다 (예컨대, US 2005/0144655 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조).
적합한 만능 세포의 실례는 배아 줄기 (ES) 세포 (예컨대, 마우스 ES 세포 또는 래트 ES 세포)이다. 변형된 만능 세포는, 예를 들어, (a) 5' 및 3' 표적 부위에 상응하는 5' 및 3' 상동성 팔이 옆에 있는 삽입물 핵산을 포함하는 하나 이상의 표적화 벡터를 세포에 도입하는 단계, 여기서 삽입물 핵산은 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하며; 및 (b) 내인성 Ttr 유전자좌에 통합된 삽입물 핵산을 게놈에 포함하는 적어도 하나의 세포를 확인하는 단계에 의한 재조합을 통해 생성될 수 있다. 대안적으로, 변형된 만능 세포는 (a) 세포에: (i) 내인성 Ttr 유전자좌 내의 표적 서열에서 닉 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 뉴클레아제 작용제; 및 (ii) 표적 서열에 충분히 가까운 곳에 위치한 5' 및 3' 표적 부위에 상응하는 5' 및 3' 상동성 팔이 옆에 있는 삽입물 핵산을 포함하는 하나 이상의 표적화 벡터, 여기서 삽입물 핵산은 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 것인 표적화 벡터를 도입하는 단계; 및 (c) 내인성 Ttr 유전자좌에서 변형 (예컨대, 삽입물 핵산의 통합)을 포함하는 적어도 하나의 세포를 확인하는 단계에 의해 생성될 수 있다. 원하는 표적 서열에 닉 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 임의의 뉴클레아제 작용제가 사용될 수 있다. 적합한 뉴클레아제의 실례는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, 및 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR)/CRISPR-관련 (Cas) 시스템 또는 이러한 시스템의 구성요소 (예컨대, CRISPR/Cas9)를 포함한다. 예컨대, US 2013/0309670 및 US 2015/0159175 (각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
특정 실례에서, 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 비인간 동물의 제조 방법은: (a) 비인간 동물 배아 줄기 (ES) 세포에: (i) 내인성 Ttr 유전자좌의 표적 서열을 표적화하는 뉴클레아제 작용제; 및 (ii) 내인성 Ttr 유전자좌의 5' 표적 서열에 상응하는 5' 상동성 팔 및 내인성 Ttr 유전자좌의 3' 표적 서열에 상응하는 3' 상동성 팔이 측면에 있는 인간 TTR 서열을 포함하는 핵산 삽입물을 포함하는 표적화 벡터를 도입하는 단계, 여기서 표적화 벡터는 게놈에 인간 TTR 서열을 포함하는 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 비인간 ES 세포를 생성하기 위해 내인성 Ttr 유전자좌와 재조합되는 단계; (b) 유전자 변형된 비인간 ES 세포를 비인간 동물 숙주 배아에 도입하는 단계; 및 (c) 비인간 동물 숙주 배아를 대리 모체에 임신시키는 단계, 여기서 대리 모체는 그것의 게놈에 인간 TTR 서열을 포함하는 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌를 포함하는 F0 자손 유전자 변형된 비인간 동물을 생산하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 이러한 방법에서, 뉴클레아제 작용제는 Cas 단백질 (예컨대, Cas9 단백질) 및 내인성 Ttr 유전자좌에서 표적 서열을 표적화하는 가이드 RNA를 포함할 수 있지만, 다른 적합한 뉴클레아제 작용제 또한 사용될 수 있다. CRISPR/Cas 및 CRISPR/Cas9 시스템은 본원의 다른 곳에서 보다 상세하게 기술된다. 선택적으로, 둘 이상 (예컨대, 3 또는 4개)의 뉴클레아제 작용제 (예컨대, 가이드 RNA)가 사용될 수 있다. 표적 서열(들)은 내인성 Ttr 유전자좌 내의 임의의 적합한 표적 서열일 수 있다. 예를 들어, 표적 서열(들)은 개시 코돈 및/또는 중단 코돈의 약 10개, 약 20개, 약 30개, 약 40개, 약 50개, 약 100개, 약 200개, 약 300개, 약 400개, 약 500개, 약 1000개 뉴클레오타이드, 약 2000개, 약 3000개, 약 4000개, 또는 약 5000개 뉴클레오타이드 (예컨대, 개시 코돈에 가까운 한 개의 표적 서열 및 중단 코돈에 가까운 한 개의 표적 서열) 내에 있을 수 있다.
일부 이러한 방법에서, 표적화 벡터는 길이가 적어도 10 kb인 큰 표적화 벡터 또는 5' 및 3' 상동성 팔의 총 합이 적어도 10 kb 길이인 것이지만, 다른 유형의 외인성 도너 핵산 또한 사용될 수 있고 잘 알려져 있다. 5' 및 3' 상동성 팔은 각각, 인간 TTR 삽입물에 의해 대체되는 영역 측면에 있거나 또는 인간 TTR 삽입물 핵산이 삽입될 영역 측면에 있는 5' 및 3' 표적 서열에 상응할 수 있다. 외인성 도너 핵산 또는 표적화 벡터는 상동성 인도 수복을 통해 표적 유전자좌와 재조합되거나 또는 인간화된 TTR 유전자좌를 생성하기 위해 NHEJ-매개 삽입을 통해 삽입될 수 있다.
도너 세포는 임의의 단계에서, 예컨대 배반포 단계 또는 전-상실기 (즉, 4 세포 단계 또는 8 세포 단계)에서 숙주 배아에 도입될 수 있다. 생식선을 통해 유전자 변형을 전달할 수 있는 자손이 생성된다. 예컨대, 미국 특허 제 7,294,754호 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
대안적으로, 본원의 다른 곳에서 기술된 비인간 동물의 제조 방법은: (1) 단일 세포 단계 배아를 만능 세포를 변형시키기 위해 상기 기술된 방법을 사용하여 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하도록 변형시키는 단계; (2) 유전자 변형된 배아를 선택하는 단계; 및 (3) 유전자 변형된 배아를 대리 모체에 이식하고 임신시키는 단계를 포함할 수 있다. 생식선을 통해 유전자 변형을 전달할 수 있는 자손이 생성된다.
핵 전달 기법이 비인간 포유류 동물을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 간단히 설명하면, 핵 전달 방법은 (1) 난모세포를 적출하거나 적출된 난모세포를 제공하는 단계; (2) 적출된 난모세포와 조합될 도너 세포 또는 핵을 분리 또는 제공하는 단계; (3) 적출된 난모세포에 세포 또는 핵을 삽입하여 재구성된 세포를 형성하는 단계; (4) 배아를 형성하기 위하여 동물의 자궁에 재구성된 세포를 이식하는 단계; 및 (5) 배아가 발달하도록 허용하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법에서, 비록 난모세포가 또한 살아있는 동물의 난관 및/또는 난소로부터도 분리될 수 있긴 하지만, 난모세포는 일반적으로 죽은 동물로부터 회수된다. 난모세포는 적출 전에 잘 알려져 있는 다양한 배지에서 성숙될 수 있다. 난모세포의 적출은 많은 잘 알려져 있는 방식으로 수행될 수 있다. 재구성된 세포를 형성하기 위한 도너 세포 또는 핵의 적출된 난모세포로의 삽입은 융합 전 투명대(zona pellucida) 아래에서 도너 세포의 미세주입에 의한 것일 수 있다. 융합은 접촉/융합 평면을 가로지르는 DC 전기 펄스의 적용 (전기융합)에 의해, 세포의 융합-촉진 화학물질, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜에의 노출에 의해, 또는 비활성화된 바이러스, 예컨대 Sendai 바이러스에 의해 유도될 수 있다. 재구성된 세포는 핵 도너 및 수령체 난모세포의 융합 전에, 중에, 및/또는 후에 전기적 및/또는 비전기적 수단에 의해 활성화될 수 있다. 활성화 방법은 전기 펄스, 화학적으로 유도된 충격, 정자에 의한 침투, 난모세포에서 이가 양이온의 수준의 증가, 및 난모세포에서 세포 단백질의 인산화의 감소 (키나아제 억제제에 의함)를 포함한다. 활성화된 재구성된 세포, 또는 배아는 잘 알려져 있는 배지에서 배양된 후 동물의 자궁에 전달될 수 있다. 예컨대, US 2008/0092249, WO 1999/005266, US 2004/0177390, WO 2008/017234, 및 미국 특허 제 7,612,250호 (각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
본원에 제공된 다양한 방법은 유전자 변형된 F0 동물의 세포가 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 비-인간 F0 동물의 생성을 허용한다. F0 동물을 생성하기 위해 사용된 방법에 따라, 인간화된 TTR 유전자좌를 가지는 F0 동물 내의 세포 수는 달라질 것으로 인지된다. 예를 들어, VELOCIMOUSE® 방법을 통해 상응하는 유기체로부터의 전-상실기 배아 (예컨대, 8-세포 단계 마우스 배아)로의 도너 ES 세포의 도입은 F0 동물의 더 큰 백분율의 세포 집단이 표적화된 유전자 변형을 포함하는 관심의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 세포를 포함하는 것을 허용한다. 예를 들어, 비인간 F0 동물에 기여하는 세포의 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 86%, 87%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 표적화된 변형을 가지는 세포 집단을 포함할 수 있다.
유전자 변형된 F0 동물의 세포는 인간화된 TTR 유전자좌에 대해 이형접합성이거나 또는 인간화된 TTR 유전자좌에 대해 동형접합성일 수 있다.
상기 또는 하기에서 인용된 모든 특허 출원, 웹사이트, 다른 출판물, 등록 번호 등은 각각의 별개의 항목이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함된 것으로 표시된 것과 같은 정도로 모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 포함된다. 만약 상이한 버전의 서열이 상이한 시점의 등록 번호와 관련된다면, 본 출원의 유효 출원일의 등록 번호와 관련된 버전을 의미한다. 유효 출원일은 실제 출원일 또는 적용된다면 등록 번호를 언급하는 우선권 출원의 출원일보다 앞선 것을 의미한다. 마찬가지로, 만약 상이한 버전의 출판물, 웹사이트 등이 상이한 시점에 공개된다면, 다르게 표시되지 않는 한, 출원의 유효 출원일에 가장 최근에 공개된 버전을 의미한다. 발명의 임의의 특징, 단계, 요소, 구체예, 또는 측면은 구체적으로 다르게 표시되지 않는 한 임의의 다른 것과 함께 사용될 수 있다. 비록 본 발명이 명료성과 이해를 목적으로 예시 및 실례에 의해 어느 정도 상세하게 기술되었지만, 특정 수정 및 변형이 첨부된 청구범위의 범주 내에서 실시될 수 있다는 것이 명백할 것이다.
서열의 간단한 설명
첨부되는 서열 목록에 열거된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 염기에 대한 표준 문자 약어, 및 아미노산에 대한 3-문자 코드를 사용하여 제시된다. 뉴클레오타이드 서열은 서열의 5' 단부에서 시작하여 3' 단부를 향해 (즉, 각 라인의 좌측에서 우측으로) 진행되는 표준 관례를 따른다. 각 뉴클레오타이드 서열의 한 가닥만이 제시되지만, 상보하는 가닥이 표시된 가닥에 대한 임의의 참조에 의해 포함되는 것으로 이해된다. 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 제공될 때, 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 그것의 코돈 축퇴성 변이체가 또한 제공되는 것으로 이해된다. 아미노산 서열은 서열의 아미노 말단에서 시작하여 카르복시 말단을 향해 (즉, 각 라인의 좌측에서 우측으로) 진행되는 표준 관례를 따른다.
서열의 설명.
SEQ ID NO 유형 설명
1 단백질 인간 TTR 단백질 NP_000362.1 및 P02766.1
2 단백질 예상된 키메릭 마우스/인간 TTR 단백질 - 인간화 V2
3 DNA 인간 TTR 유전자 NG_009490.1
4 DNA 인간 TTR mRNA NM_000371.3
5 DNA 마우스 Ttr 유전자 NC_000084.6
6 단백질 마우스 TTR 단백질 P07309.1 및 NP_038725.1
7 DNA 마우스 Ttr mRNA NM_013697.5
8 RNA 일반적인 가이드 RNA 스캐폴드 v.2
9 RNA 일반적인 가이드 RNA 스캐폴드 v.3
10 RNA 일반적인 가이드 RNA 스캐폴드 v.4
11 DNA 일반적인 가이드 RNA 표적 서열 + PAM v.1
12 DNA 일반적인 가이드 RNA 표적 서열 + PAM v.2
13 DNA 일반적인 가이드 RNA 표적 서열 + PAM v.3
14 DNA 예상된 인간화 V1 - F0, SDC Pmci2 UbiNeo 카세트를 포함함
15 DNA 예상된 인간화 V1 - F1, 카세트-삭제됨
16 DNA 예상된 인간화 V2 - F0, SDC Pmci2 UbiNeo 카세트를 포함함
17 DNA 예상된 인간화 V2 - F1, 카세트-삭제됨
18 DNA 인간화된 TTR V1에 삽입된 인간 TTR 서열
19 DNA 인간화된 TTR V2에 삽입된 인간 TTR 서열
20 DNA 마우스 Ttr 유전자좌 - 개시 코돈에서 중단 코돈까지
21 DNA 9090retU3 - F 프라이머
22 DNA 9090retU2 - F 프라이머
23 DNA 9090retU - F 프라이머
24 DNA 9090mTGU - F 프라이머
25 DNA 7576mTU - F 프라이머
26 DNA 9090mTM - F 프라이머
27 DNA 7576mTD - F 프라이머
28 DNA 9090mTGD - F 프라이머
29 DNA 9090retD - F 프라이머
30 DNA 9090retD2 - F 프라이머
31 DNA 9090retD3 - F 프라이머
32 DNA 7576hTU - F 프라이머
33 DNA 7576hTD - F 프라이머
34 DNA Neo - F 프라이머
35 DNA 7655hTU - F 프라이머
36 DNA 9212mTU - F 프라이머
37 DNA 9212mTGD - F 프라이머
38 DNA 7655mTU - F 프라이머
39 DNA 7655mTD - F 프라이머
40 DNA 9204mretD - F 프라이머
41 DNA 9204mretU - F 프라이머
42 DNA 4552mTU - F 프라이머
43 DNA 9090retU3 - R 프라이머
44 DNA 9090retU2 - R 프라이머
45 DNA 9090retU - R 프라이머
46 DNA 9090mTGU - R 프라이머
47 DNA 7576mTU - R 프라이머
48 DNA 9090mTM - R 프라이머
49 DNA 7576mTD - R 프라이머
50 DNA 9090mTGD - R 프라이머
51 DNA 9090retD - R 프라이머
52 DNA 9090retD2 - R 프라이머
53 DNA 9090retD3 - R 프라이머
54 DNA 7576hTU - R 프라이머
55 DNA 7576hTD - R 프라이머
56 DNA Neo - R 프라이머
57 DNA 7655hTU - R 프라이머
58 DNA 9212mTU - R 프라이머
59 DNA 9212mTGD - R 프라이머
60 DNA 7655mTU - R 프라이머
61 DNA 7655mTD - R 프라이머
62 DNA 9204mretD - R 프라이머
63 DNA 9204mretU - R 프라이머
64 DNA 4552mTU - R 프라이머
65 DNA 9090retU3 - 프로브
66 DNA 9090retU2 - 프로브
67 DNA 9090retU - 프로브
68 DNA 9090mTGU - 프로브
69 DNA 7576mTU - 프로브
70 DNA 9090mTM - 프로브
71 DNA 7576mTD - 프로브
72 DNA 9090mTGD - 프로브
73 DNA 9090retD - 프로브
74 DNA 9090retD2 - 프로브
75 DNA 9090retD3 - 프로브
76 DNA 7576hTU - 프로브
77 DNA 7576hTD - 프로브
78 DNA Neo - 프로브
79 DNA 7655hTU - 프로브
80 DNA 9212mTU - 프로브
81 DNA 9212mTGD - 프로브
82 DNA 7655mTU - 프로브
83 DNA 7655mTD - 프로브
84 DNA 9204mretD - 프로브
85 DNA 9204mretU - 프로브
86 DNA 4552mTU - 프로브
87 RNA crRNA 꼬리
88 RNA tracrRNA
89 RNA 일반적인 가이드 RNA 스캐폴드 v.1
90 DNA 인간화된 TTR CDS v1.0
91 DNA 인간화된 TTR CDS v2.0
92 DNA 마우스 TTR CDS
93 DNA Cas9 DNA 서열
94 단백질 Cas9 단백질 서열
실시예
실시예 1. 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 마우스의 생성
TTR 아밀로이드증 질환에 대한 한 가지 유망한 치료적 접근법은 게놈 편집 기술, 예컨대 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 유전자의 비활성화에 의해 환자의 TTR 로드를 감소시키는 것이다. CRISPR/Cas9 치료법의 개발을 보조하기 위하여, 에서 표적화된 변형을 가진 마우스를 개발하였다.
만들어진 제1 Ttr 대립유전자는 마우스 트랜스티레틴 코딩 서열이 완전히 삭제되고 인간 TTR 유전자의 병렬상동 부분으로 대체된 것이었다. 마우스 Ttr 개시 코돈으로부터 상류로 33.7 kb의 서열을 포함하는 5' 상동성 팔 및 마우스 Ttr 중단 코돈의 하류로 34.5 kb 서열을 포함하는 큰 표적화 벡터를 생성하여, 인간 TTR 개시 코돈으로부터 마지막 인간 TTR 엑손 (엑손 4, 인간 3' UTR을 포함함)의 끝까지 대략 7.1 kb 병렬상동 인간 TTR 서열 및 loxP 부위가 측면에 있는 자가 삭제 네오마이신 선택 카세트 (SDC Neo)로 마우스 Ttr 개시 코돈으로부터 마우스 Ttr 중단 코돈까지의 대략 8.3 kb 영역을 대체하였다. 도 3을 참조한다. SDC Neo 카세트는 5'로부터 3' 쪽으로 다음의 구성요소를 포함한다: loxP 부위, 마우스 프로타민(Prm1) 프로모터, Crei (인트론을 포함하도록 최적화된 Cre 코딩 서열), 폴리A, 인간 유비퀴틴 프로모터, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (neor) 코딩 서열, 폴리A, loxP. 인간화된 대립유전자를 생성하기 위하여, 마우스 Ttr 유전자좌를 표적화하는 CRISPR/Cas9 구성요소를 큰 표적화 벡터와 함께 F1H4 마우스 배아 줄기 세포에 도입하였다. 도 5A 및 표 3에 제시된 프라이머 및 프로브를 사용하는 대립유전자 상실 검정, 대립유전자 획득 검정, 보유 검정, 및 CRISPR 검정을 수행하여 마우스 Ttr 대립유전자의 인간화를 확인하였다. 대립유전자 상실 검정, 대립유전자 획득 검정, 및 보유 검정은, 예를 들어, US 2014/0178879; US 2016/0145646; WO 2016/081923; 및 Frendewey et al. (2010) Methods Enzymol. 476:295-307 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된다. CRISPR 검정은 CRISPR gRNA에 의해 파괴되는 영역을 포함하도록 설계된 TAQMAN® 검정이다. CRISPR gRNA가 indel (삽입 또는 삭제)을 절단하고 생성할 때, TAQMAN® 검정은 증폭하지 못할 것이고 따라서 CRISPR 절단을 보고한다. SDC Neo 카세트가 있는 버전 및 SDC Neo 카세트가 삭제된 후의 버전을 도 3에 도시한다. F0 마우스를 그런 후 VELOCIMOUSE® 방법을 사용하여 생성하였다. 예컨대, US 7,576,259; US 7,659,442; US 7,294,754; US 2008/007800; 및 Poueymirou et al. (2007) Nature Biotech. 25(1):91-99 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
F0 세대 마우스 (50% C57BL/6NTac 및 50% 129S6/SvEvTac)를 클론 7576A-A5, 7576C-G7, 및 7576B-F10을 포함한, 다수의 인간화된 ES 세포 클론으로부터 생성하였다. F0 세대 마우스에서 예상된 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌에 대한 서열을 SEQ ID NO: 14에 제시하며 SDC Neo 카세트를 포함한다. F1 및 F2 세대 마우스 (75% C57BL/6NTac 및 25% 129S6/SvEvTac)를 그런 후 사육에 의해 생성하였다. F1 및 F2 세대 마우스에서 예상된 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌에 대한 서열을 SEQ ID NO: 15에 제시하며, SDC Neo 카세트를 포함하지 않는다.
인간 및 마우스 트랜스티레틴 전구체 단백질 서열의 비교를 도 1A에 나타내고, 인간 및 마우스 트랜스티레틴 코딩 서열의 비교를 도 1B에 나타내며, 야생형 마우스 Ttr 유전자좌 및 최종 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌 (SDC Neo 카세트가 삭제된 인간화된 TTR 버전 1)를 보여주는 개략도를 도 2에 나타낸다. 개시 코돈으로부터 중단 코돈까지의 내인성 마우스 Ttr 유전자좌 서열을 SEQ ID NO: 20에 제공한다. SDC Neo 카세트가 있을 때와 SDC Neo 카세트가 없을 때의 예상된 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌에 대한 서열을 각각 SEQ ID NO: 14 및 15에 제시한다. 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌에 의해 암호화된 예상된 트랜스티레틴 전구체 단백질을 SEQ ID NO: 1에 제시한다. 이 대립유전자는 인간 TTR CRISPR/Cas9 치료법의 진정한 인간 표적을 제공함으로써, 인간 단백질이 존재하는 TTR의 유일한 버전인 환경에서 약동학 및 약력학뿐만 아니라 살아있는 동물에서 CRISPR/Cas9 치료법의 효능 및 작용 방식의 실험을 가능하게 한다.
대립유전자 상실 검정, 대립유전자 획득 검정, 보유 검정, 및 CRISPR 검정을 위한 프라이머 및 프로브.
검정 전방향 프라이머 역방향 프라이머 프로브
9090retU3 CACAGACAATCAGACGTACCAGTA
(SEQ ID NO: 21)		 GGGACATCTCGGTTTCCTGACTT
(SEQ ID NO: 43)		 TCATGTAATCTGGCTTCAGAGTGGGA
(SEQ ID NO: 65)
9090retU2 CCAGCTTTGCCAGTTTACGA(SEQ ID NO: 22) TCCACACTACTGAACTCCACAA
(SEQ ID NO: 44)		 TGGGAGGCAATTCTTAGTTTCAATGGA
(SEQ ID NO: 66)
9090retU TTGGACGGTTGCCCTCTT(SEQ ID NO: 23) CGGAACACTCGCTCTACGAAA
(SEQ ID NO: 45)		 TCCCAAAGGTGTCTGTCTGCACA
(SEQ ID NO: 67)
9090mTGU GATGGCTTCCCTTCGACTCTTC(SEQ ID NO: 24) GGGCCAGCTTCAGACACA
(SEQ ID NO: 46)		 CTCCTTTGCCTCGCTGGACTGG
(SEQ ID NO: 68)
7576mTU CACTGACATTTCTCTTGTCTCCTCT(SEQ ID NO: 25) CCCAGGGTGCTGGAGAATCCAA
(SEQ ID NO: 47)		 CGGACAGCATCCAGGACTT
(SEQ ID NO: 69)
9090mTM GGGCTCACCACAGATGAGAAG(SEQ ID NO: 26) GCCAAGTGTCTTCCAGTACGAT
(SEQ ID NO: 48)		 AGAAGGAGTGTACAGAGTAGAACTGGACA
(SEQ ID NO: 70)
7576mTD CACTGTTCGCCACAGGTCTT(SEQ ID NO: 27) GTTCCCTTTCTTGGGTTCAGA
(SEQ ID NO: 49)		 TGTTTGTGGGTGTCAGTGTTTCTACTC
(SEQ ID NO: 71)
9090mTGD GCTCAGCCCATACTCCTACA(SEQ ID NO: 28) GATGCTACTGCTTTGGCAAGATC
(SEQ ID NO: 50)		 CACCACGGCTGTCGTCAGCAA
(SEQ ID NO: 72)
9090retD GCCCAGGAGGACCAGGAT(SEQ ID NO: 29) CCTGAGCTGCTAACACGGTT
(SEQ ID NO: 51)		 CTTGCCAAAGCAGTAGCATCCCA
(SEQ ID NO: 73)
9090retD2 GGCAACTTGCTTGAGGAAGA(SEQ ID NO: 30) AGCTACAGACCATGCTTAGTGTA
(SEQ ID NO: 52)		 AGGTCAGAAAGCAGAGTGGACCA
(SEQ ID NO: 74)
9090retD3 GCAGCAACCCAGCTTCACTT(SEQ ID NO: 31) TGCCAGTTTAGGAGGAATATGTTC
(SEQ ID NO: 53)		 CCCAGGCAATTCCTACCTTCCCA
(SEQ ID NO: 75)
7576hTU ACTGAGCTGGGACTTGAAC(SEQ ID NO: 32) CTGAGGAAACAGAGGTACCAGATAT
(SEQ ID NO: 54)		 TCTGAGCATTCTACCTCATTGCTTTGGT
(SEQ ID NO: 76)
7576hTD TGCCTCACTCTGAGAACCA(SEQ ID NO: 33) AGTCACACAGTTCTGTCAAATCAG
(SEQ ID NO: 55)		 AGGCTGTCCCAGCACCTGAGTCG
(SEQ ID NO: 77)
Neo GGTGGAGAGGCTATTCGGC(SEQ ID NO: 34) GAACACGGCGGCATCAG
(SEQ ID NO: 56)		 TGGGCACAACAGACAATCGGCTG
(SEQ ID NO: 78)
7655hTU GGCCGTGCATGTGTTCAG(SEQ ID NO: 35) TCCTGTGGGAGGGTTCTTTG
(SEQ ID NO: 57)		 AAGGCTGCTGATGACACCTGGGA
(SEQ ID NO: 79)
9212mTU GGTTCCCATTTGCTCTTATTCGT(SEQ ID NO: 36) CCCTCTCTCTGAGCCCTCTA
(SEQ ID NO: 58)		 AGATTCAGACACACACAACTTACCAGC
(SEQ ID NO: 80)
9212mTGD CCCACACTGCAGAAGGAAACTTG(SEQ ID NO: 37) GCTGCCTAAGTCTTTGGAGCT
(SEQ ID NO: 59)		 AGACCTGCAATTCTCTAAGAGCTCCACA
(SEQ ID NO: 81)
7655mTU GGTTCCCATTTGCTCTTATTCGT(SEQ ID NO: 38) CCCTCTCTCTGAGCCCTCTA
(SEQ ID NO: 60)		 AGATTCAGACACACACAACTTACCAGC
(SEQ ID NO: 82)
7655mTD CCAGCTTAGCATCCTGTGAACA(SEQ ID NO: 39) GAGAGGAGAGACAGCTAGTTCTAAC
(SEQ ID NO: 61)		 TTGTCTGCAGCTCCTACCTCTGGG
(SEQ ID NO: 83)
9204mretD GGCAACTTGCTTGAGGAAGA(SEQ ID NO: 40) AGCTACAGACCATGCTTAGTGTA
(SEQ ID NO: 62)		 AGGTCAGAAAGCAGAGTGGACCA
(SEQ ID NO: 84)
9204mretU TGTGGAGTTCAGTAGTGTGGAG(SEQ ID NO: 41) GCCCTCTTCATACAGGAATCAC
(SEQ ID NO: 63)		 TTGACATGTGTGGGTGAGAGATTTTACTG
(SEQ ID NO: 85)
4552mTU CACTGACATTTCTCTTGTCTCCTCT(SEQ ID NO: 42) CGGACAGCATCCAGGACTT
(SEQ ID NO: 64)		 CCCAGGGTGCTGGAGAATCCAA
(SEQ ID NO: 86)
실시예 2. 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 마우스의 특성화.
클론 7576A-A5 및 7576C-G7로부터의 인간화된 TTR 마우스 F0 집단을 다음으로 특성화하였다. 도 6에서 나타낸 것과 같이, 인간화된 TTR mRNA는 생후 8주령의, 동형접합성 F0 세대 인간화된 TTR 마우스에서 왕성하게 발현되었다. 각 조직으로부터의 동등한 질량의 RNA를 RT-qPCR에 의해 검정하였다. 유전형당 5마리의 마우스를 검정하였고, 샘플당 4개의 기술적 복제물을 만들었다. 각 조직은 추출된 RNA를 가졌다. 게놈 DNA를 그것이 qPCR 반응을 더 이상 할 수 없도록 분해하였다. RNA를 역전사하였고, 인간 TTR 및 마우스 Ttr에 대해 특이적인 검정을 사용하여 인간 TTR 전사물 및 마우스 Ttr 전사물을 각각 검출하였다. 예상과 같이, 동형접합성 인간화된 TTR 마우스는 간에서 인간 TTR의 유의한 발현을 보였고 (30 미만의 ct 값), 한편, 야생형 마우스는 30 이상의 ct 값을 보였는데, 이것은 인간 TTR의 발현이 없음을 나타낸다. 대조적으로, 야생형 마우스는 간에서 마우스 Ttr의 유의한 발현을 보인 한편, 동형접합성 인간화된 TTR 마우스는 30 이상의 ct 값을 보였고, 이것은 마우스 TTR의 내인성 발현이 없음을 나타낸다.
생후 8주령의 동형접합성 F0 세대 인간화된 TTR 마우스의 혈청 및 뇌척수액에서 인간 TTR 및 마우스 TTR 단백질 수준을 평가하기 위해 ELISA 검정을 실시하였다. 인간 TTR ELISA 키트 (Aviva Systems Biology; Cat No.: OKIA00081; 혈청의 경우 1:250 희석; CSF의 경우 1:1000 희석)를 사용하여 인간 TTR 수준을 평가하였다. 마우스 TTR ELISA 키트 (Aviva Systems Biology; Cat No: OKIA00111; 혈청의 경우 1:4000 희석; CSF의 경우 1:10000 희석)를 사용하여 마우스 TTR 수준을 평가하였다. 인간 혈청 및 인간 CSF를 인간 TTR에 대한 양성 대조군 및 마우스 TTR에 대한 음성 대조군으로서 사용하였고, F1H4 혈청 및 F1H4 CSF를 인간 TTR에 대한 음성 대조군 및 마우스 TTR에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. 도 7A에서 나타낸 것과 같이, 인간 TTR은 인간화된 TTR 마우스로부터의 혈청에서 검출되었지만 야생형 (F1H4) 마우스로부터의 혈청에서는 검출되지 않았다. 도 7B에서 나타낸 것과 같이, 마우스 TTR은 인간화된 TTR 마우스로부터의 혈청에서 검출되었지만 야생형 마우스 혈청에서는 검출되지 않았다. 혈청 중의 인간 및 마우스 TTR 수준을 2개의 별도의 인간화된 마우스 Ttr ES 세포 클론: 7576C-G7 및 7576A-A5로부터 유래된 인간화된 TTR 마우스에서 추가로 평가하였다. 도 7C에서 나타낸 것과 같이, 인간 TTR은 클론 7576A-A5로부터 유래된 인간화된 TTR 마우스의 혈청에서 검출되었다.
인간 TTR 단백질 발현을 또한 생후 8주령의 동형접합성 인간화된 TTR 마우스에서 혈청 샘플, 간 샘플, 및 신장 샘플에 대한 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다. 그 결과를 도 8 및 9에 나타낸다. 혈청 샘플 (웰당 총 5 μL 부피)을 Laemlli 완충액 (SDS 및 베타-머캡토에탄올을 함유함)에서 끓이고 4 내지 20% 변성 구배 겔 (항-TTR 항체: 1:1000; Abcam; ab75815) 상에서 분해시켰다. 마우스 IgG (항 마우스 IgG-HRP: 1:7500, Jackson ImmunoResearch)를 로딩 대조군으로서 사용하였다. 그룹당 3마리의 마우스를 인간화된 마우스 Ttr 클론 7576C-G7 및 7576A-A5에 대해 테스트하였다. 그룹당 5마리 마우스를 야생형 마우스 대조군 (F1H4)에 대해 테스트하였다. 마우스 혈청 및 인간 혈청을 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용하였다. 도 8에서 나타낸 것과 같이, 인간 TTR을 두 인간화된 마우스 Ttr 클론으로부터의 혈청에서 전부 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다.
간 및 신장 샘플 (웰당 100 μg 총 단백질)을 Laemlli 완충액 (SDS 및 베타-머캡토에탄올을 함유함)에서 끓이고 4 내지 20% 변성 구배 겔 (항-TTR 항체: 1:1000; Abcam; ab75815) 상에서 분해시켰다. GAPDH (항-GAPDH: 1:2000, Santa Cruz)를 로딩 대조군으로서 사용하였다. 그룹당 3마리 마우스를 인간화된 마우스 Ttr 클론 7576C-G7 및 7576A-A5에 대해 테스트하였다. 그룹당 5마리 마우스를 야생형 마우스 대조군 (F1H4)에 대해 테스트하였다. 마우스 혈청 및 인간 혈청을 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용하였다. 도 9에서 나타낸 것과 같이, 인간 TTR은 클론 7576A-A5로부터 생성된 두 동형접합성 인간화된 TTR 마우스에서 웨스턴 블롯에 의해 검출되었다.
요약하면, TTR HumIn (TTR7576/7576) F0 마우스는 검출 가능한 양의 순환하는 hTTR을 가지는 것으로 나타났다. 이에 더불어, 클론 7576C-A5로부터의 마우스는 간 및 혈장에서 검출 가능한 양의 hTTR을 가졌다.
본 발명자들은 네오마이신 약물 선택 카세트의 제거가 인간 TTR의 분비를 증가시킬 수 있을 것으로 가설을 세웠다. 인간 TTR 수준을, 네오마이신 선택 카세트를 가진 전체 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌에 대해 동형접합성인 생후 5주령의 마우스 (TTR7576/7576), 네오마이신 선택 카세트를 가진 전체 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌에 대해 이형접합성인 마우스 (TTR7576/WT), 네오마이신 선택 카세트가 없는 전체 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌에 대해 이형접합성인 마우스 (TTR7577/WT), 및 야생형 마우스 (F1H4)에 대한 비말단, 턱밑하 출혈로부터의 혈장 샘플에서 측정하였다. 인간 TTR 수준을 AssayPro 인간 TTR (hTTR) ELISA 키트 (cat no.: EP3010-1; 1:40000 희석)로 검정하였다. 마우스 TTR 혈청 수준을 Aviva Systems Biology 마우스 TTR (mTTR) ELISA 키트 (cat no. OKIA00111; 1:4000 희석)로 검정하였다. AssayPro 인간 TTR ELISA 키트는 앞서 인간 TTR을 검출하는 데에는 특이적이었으나 마우스 TTR에 대해서는 그렇지 않은 것으로 결정되었고, Aviva Systems Biology 마우스 TTR ELISA 키트는 앞서 마우스 TTR을 검출하는 데에는 특이적이었으나 인간 TTR에 대해서는 그렇지 않은 것으로 결정되었다 (데이터 미도시). 표 4에서 나타낸 것과 같이, 네오마이신 선택 카세트의 제거는 혈청에서 인간 TTR 수준의 통계학적으로 유의미한 증가를 초래하였다. MAID7576은 네오마이신 선택 카세트를 가진 인간화된 TTR 유전자좌를 나타낸다. MAID7577은 네오마이신 선택 카세트가 제거된 인간화된 TTR 유전자좌를 나타낸다. 향상된 인간 TTR mRNA 발현을 또한 간에서 관찰하였다 (데이터 미도시). hTTR 및 mTTR에 대해 이형접합성인 마우스 (TTR-WT7576/WT 및 TTR-WT7577/WT)는 아마도 이종체성 (예컨대, 교차-TTR 종) 상호작용으로부터의 증가된 안정성으로 인해, 증가된 순환 hTTR을 가졌다.
순환하는 인간 및 마우스 TTR 수준.
TTR 7576/7576 TTR 7576/WT TTR 7577/WT F1H4
mTTR, μg/mL (SD) N.D. 207.62 (15.39) 359.9 (38.07)** 919.96 (79.73)
hTTR, μg/mL (SD) 0.61 (0.43) 28.507 (5.61) 39.93 (3.70)** N.D.
혈청 및 간 TTR 수준을 또한 상이한 클론: 7576B-F10으로부터 생성된 F2 세대 동형접합성 인간화된 TTR 마우스 (그룹당 3마리)에서 측정하였다. 도 14 (Tris-식염수 수크로오스 (TSS) 대조군 샘플)에서 나타낸 것과 같이, 인간 TTR은 간 샘플에서 1000 ng/mL 이상의 수준으로 검출되었다. 도 15A 및 15B (TSS 샘플)에서 나타낸 것과 같이, 인간 TTR은 혈청 샘플에서 80,000 ng/mL 이상의 수준으로 검출되었다.
다른 실험에서, 생후 3개월째의 TTR WT HumIn (v1.0, hTTR7577/7577, 클론 B-F10) F2 동형접합성 마우스로부터의 턱밑하 출혈을 통해 혈액을 수집하였다. hTTR 수준을 종-특이적 ELISA 키트 (hTTR, Aviva, cat # OKIA00081; mTTR, Aviva, cat # OKIA00111)를 사용하여 혈장에서 측정하였다. 도 17A 및 17B 및 표 5에서 나타낸 것과 같이, hTTR은 TTR WT HumIn (v1.0, 클론 B-F10) F2 동형접합성 마우스의 순환으로 52.1 +/- 10.7 μg/mL의 수준으로 분비되었고, 이때 mTTR은 검출 가능한 수준이 아니었다. 야생형 대조군 마우스 (F1H4) 및 WT HumIn (v1.0, hTTR7577/7577, 클론 B-F10) 마우스로부터의 간 샘플에서 mTTR 및 hTTR의 mRNA 수준을 도 17C에 도시한다.
혈장 hTTR 및 mTTR 수준.
hTTR, μg/mL (SD) mTTR, μg/mL (SD)
TTRWT/WT N.D. 831.5 (129.9)
TTR7577/7577 52.1 (10.7) 검출할 수 없음
인간 혈청 234.5 (n.a.) 검출할 수 없음
실시예 3. 생체외 및 생체내에서 인간 TTR 을 표적화하는 가이드 RNA를 테스트하기 위한 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 마우스의 용도.
F0 세대 인간화된 TTR 마우스 집단을 그런 후 생체외 및 생체내에서 인간 TTR을 표적화하는 가이드 RNA를 테스트하기 위해 사용하였다. 개념의 증거로서, 인간 TTR 가이드 RNA를 먼저 클론 7576C-G7로부터 생성된 F0 세대 인간화된 TTR 마우스로부터 분리한 일차 간세포에서 테스트하였다. huTTR hI/hI 마우스로부터의 간을 1X PenStrep을 함유한 50 mL의 간 관류 배지와, 이어서 50 mL 간 소화 배지 (HBSS, 100mM CaCl2, 500mM HEPES, 콜라게나제)로 관류하였다. 간이 소화된 것으로 나타난 후에, 그것을 1X PenStrep 및 L-글루타민을 함유한 세척 배지에 넣었다. 간을 찢고 부드럽게 흔들어줌으로써 간으로부터 간세포를 방출시켰다. 세포가 방출된 후에, 그것을 70 μm 메시 필터를 통과시키고 50 g에서 4분 동안 4℃에서 회전시켰다. 펠릿을 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 그런 후 펠릿을 20 mL의 38 내지 40% 퍼콜에 재현탁하고 200 g에서 10분 동안 4℃에서 회전시켰다. 펠릿을 2회 세척하고 플레이팅 배지 (Williams E 배지, 1X Penstrep, 1X L-글루타민, 5% FBS)에 재현탁하였다. 세포를 24-웰 콜라겐-코팅된 조직 배양 플레이트에 웰당 300,000개 세포로 플레이팅하였다. 세포를 6 내지 18시간 동안 부착되도록 한 후, 플레이팅 배지를 FBS가 없는 배지로 대체하였다. 사용한 시약은 표 6에 나타낸다.
일차 간세포의 분리를 위한 시약.
물질 카탈로그 번호
간 관류 배지 Gibco [17701-038]
HBSS (1x) Gibco [14175-079]
간세포 세척 배지 Gibco [17704-024]
Williams E 배지 Gibco [A12176-01]
Penstrep (100x) Gibco [15140163]
L-글루타민 (200mM) Gibco [25030081]
FBS 보충물 Gibco [A13450]
HEPES Gibco [15630080]
콜라겐 Gibco [A1048301]
아세트산 Sigma [A6283]
리버라제 TM Roche [TM05401119001]
일차 간세포 해동 및 플레이팅 보충물 Gibco [CM3000]
일차 간세포 유지 보충물 Gibco [CM4000]
퍼콜 GE [17-0891-01]
지질 나노입자 (LNP) (Cas9 mRNA + 인간 TTR gRNA (버전 1 및 2, 각각 인간 TTR 엑손 2를 표적화함)를 함유함)를 분리 후 24시간 후에 간세포에 첨가하였다. 간단히 설명하면, 각 웰에 대해, LNP를 500 μL의 3% 마우스 혈청을 함유한 간세포 유지 배지 중의 500 ng의 농도로 첨가하고 5분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이팅된 세포를 세척하고 배지 중의 500 μL의 인큐베이션된 LNP를 각 웰에 첨가하였다. 48시간 후, DNA 용해물을 세포로부터 제조하고, 차세대 서열분석을 테스트한 각 가이드 RNA에 대해 수행하였다.
도 10에서 나타낸 것과 같이, 인간화된 TTR 유전자에서의 편집을 인간화된 TTR 마우스로부터 분리된 일차 간세포에서 두 가이드 RNA로 볼 수 있었다. 인간 TTR 가이드 RNA 1은 20.4%의 편집 효율을 가졌고, 인간 TTR 가이드 RNA 2는 7.53%의 편집 효율을 가졌다. 유사한 결과를 엑손 3을 표적화하는 인간 TTR 가이드 RNA에 대해 관찰하였다 (편집 효율은 17.37%임; 데이터 미도시). 편집 효율은 차세대 서열분석에 의해 측정되는 것과 같이 용해된 세포 모음으로부터의 PCR 반응에서 서열 판독의 총 수에 대해 관찰된 삽입 또는 삭제의 총 수를 나타낸다.
다음에, 인간 TTR 가이드 RNA 1 및 2를 인간화된 TTR 마우스의 생체내에서 테스트하였다. 클론 번호 7576A-A5 및 7576C-G7로부터의 F0 세대 인간화된 TTR 마우스 (Ttr hI/hI )를 사용하였다. 3개의 동물 그룹을 표 7에 나타낸 것과 같은 새로운 LNP로 표적화하였다.
LNP 연구를 위한 동물 그룹.
그룹 설명
1 TtrhI/hI 1M 1F A-A5 및 2M 1F C-G7: LNP(gRNA1)@ 2mg/kg
2 TtrhI/hI 1M 1F A-A5 및 2M 1F C-G7: LNP(gRNA2) @ 2mg/kg
3 TtrhI/hI 1M A-A5 및 2M C-G7: Tris-식염수 수크로오스
LNP를 인간 TTR 가이드 RNA 및 하나의 NLS를 가지며 HA 태그가 없는 Cas9를 암호화하는 mRNA로 제제화하였다. LNP는 4.5의 질소-대- 포스페이트 (N/P) 비율을 가졌고 45:44:9:2 몰비의 양이온 지질, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 함유하였다. 본원에서 기술된 시험관내 및 생체내 LNP 실험에서 사용한 양이온 지질은 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트로도 언급되는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-다이에노에이트였다. 각각에서 (가이드 RNA):(Cas9 mRNA) 비율은 중량 기준으로 1:1이었다. 추가적인 LNP 제제의 상세한 설명을 표 8에 제공한다.
인간 TTR LNP 제제.
인간 TTR 가이드 RNA RNA (mg/mL) 캡슐화 Z-avg (nm) PDI 수 평균 (nm)
1 0.46 96% 95.22 0.053 77.51
2 0.61 97% 94.91 0.016 76.77
마우스를 주입 전에 체중을 측정하고, 전달 부피가 마우스당 200 ml이 되도록 LNP (Cas9 mRNA + 인간 TTR gRNA를 함유함)를 Tris-식염수 수크로오스에 희석함으로써 2 mg/kg의 용량으로 제조하였다. 전달은 꼬리 정맥 주사를 통한 정맥내 전달이었다. 8 내지 14일 후에, 마우스를 안락사시키고, 혈청을 간 조직과 함께 수득하였다. 조직을 DNA 용해물에 처리한 후 그것을 차세대 서열분석 (NGS)에 의해 분석하였다.
간 효소 ALT, AAT, 트라이글리세라이드, 총 콜레스테롤, HDL, LDL, 비에스테르화 지방산 (NEFA), 및 알부민에 대한 혈청 화학 분석은 다양한 치료 그룹 사이에서 통계학적 차이를 보이지 않았다. 도 11A 내지 11H를 참조한다. 유사한 결과를 엑손 3을 표적화하는 인간 TTR 가이드 RNA에 대해 관찰하였다 (데이터 미도시).
NGS는 인간 TTR gRNA 1 (평균 42.8%) 및 인간 TTR gRNA 2 (평균 36.0%)에 대하여 간에서 유의한 편집을 보였다. 도 12를 참조한다. 편집 효율은 용해된 세포 모음으로부터의 PCR 반응의 서열 판독의 총 수에 대해 관찰된 삽입 또는 삭제의 총 수를 나타낸다. 다른 조직에서 유전자 편집의 수준은 최소이거나 통계학적으로 무의미한 수준으로 관찰되었다 (데이터 미도시).
다음에, 인간 TTR 가이드 RNA 1을 클론 번호 7576B-F10으로부터의 F2 세대, 동형접합성 인간화된 TTR 마우스에서 생체내에서 테스트하였다. 동물을 투약 전에 용량 계산을 위해 체중을 측정한 후 투여 후 24시간 동안 복지에 대해 모니터링하였다. 동물을 상기 기술된 것과 같이 인간 TTR 가이드 RNA 1 및 Cas9를 암호화하는 mRNA로 제제화된 LNP로 1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 및 0.1 mg/kg으로 정맥내 투여하였다. Tris-식염수 수크로오스를 대조군으로서 사용하였다. 그룹당 3마리의 마우스를 테스트하였다. 검시할 때 (투여 후 8일 후), 분석을 위해 간 및 혈액 (혈청의 경우)을 수집하였다. 간에서 관찰된 의 퍼센트 편집은 인간 TTR 가이드 RNA 1 및 Cas9를 암호화하는 mRNA로 제제화된 LNP의 1 mg/kg의 용량에서 50.7%였고, 0.3 mg/kg의 용량에서는 13.0%였으며, 0.1 mg/kg의 용량에서 2.3%였고, 대조군 마우스에서는 0.1% 미만의 편집이 관찰되었다. 그런 후 인간 TTR 수준을 투약이 이루어진 마우스로부터의 간 용해물 및 혈청에서 측정하였다. 간을 RIPA 및 100 mg/mL의 프로테아제 억제제에 용해시켰다. 인간 TTR ELISA 키트 (Aviva Systems Biology; Cat No.: OKIA00081; 간 용해물의 경우 1:100 희석; 혈청의 경우 1:5000 또는 1:10000 희석)를 사용하여 인간 TTR 수준을 평가하였다. 도 14에서 나타낸 것과 같이, 1000 ng/mL 이상의 수준의 인간 TTR이 대조군 동물로부터의 간 용해물에서 측정되었고, 이들 수준은 인간 TTR 가이드 RNA 1 및 Cas9를 암호화하는 mRNA로 제제화된 LNP의 1 mg/kg이 투여된 동물에서 50% 이상 감소하였다. 도 15A 및 15B에서 나타낸 것과 같이, 인간 TTR을 대조군 동물로부터의 혈청에서 80,000 ng/mL 이상의 수준으로 측정하였고, 인간 TTR 수준은 인간 TTR 가이드 RNA 1 및 Cas9를 암호화하는 mRNA로 제제화된 LNP의 1 mg/kg이 투여된 동물에서 66% 감소하였다.
다음에, 3개의 상이한 인간 TTR 가이드 RNA (인간 TTR 가이드 RNA 3, 4, 및 5)를 동형접합성 인간화된 TTR 마우스에서 생체내에서 테스트하였다. LNP 제제는 가이드 RNA에 대하여 중량 기준으로 1:2 비율의 Cas9 mRNA를 함유하였다. LNP는 각각 50:38:9:3 몰비의, 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트)로도 불리는 양이온 지질 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-다이에노에이트, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG2k-DMG를 함유하였고, 6의 N:P 비율을 가졌다.
먼저, 인간화된 TTR 유전자좌에서의 편집을 평가하였다. 마우스를 주입 전에 체중을 측정하였고, LNP(Cas9 mRNA + 인간 TTR gRNA를 함유함)를 1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 및 0.1 mg/kg (그룹당 n = 5마리 마우스)의 용량으로 제조하였다. 전달은 꼬리 정맥 주사를 통한 정맥내 전달이었다. 상기에서 기술된 것과 같이, 마우스를 나중에 안락사시키고, 혈청을 간 조직과 함께 수득하였다. 조직을 DNA 용해물에 처리한 후 그것을 차세대 서열분석 (NGS)에 의해 분석하였다. NGS는 테스트한 모든 용량에서 각각의 인간 TTR gRNA에 대해 용량 의존성 방식으로 간에서 유의한 편집을 보였다. 도 19를 참조한다. 간 편집 결과를 NGS 분석을 위한 관심의 영역을 증폭시키기 위해 설계한 프라이머를 사용하여 측정하였다.
두 번째로, 혈청 TTR 수준을 평가하였다. 용량 게산을 위하여 마우스를 투여 전에 체중을 측정하였다. 마우스를 상기에서 기술된 것과 같이 인간 TTR 가이드 RNA 3, 4, 또는 5 및 Cas9를 암호화하는 mRNA로 제제화된 LNP로 1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 및 0.1 mg/kg (그룹당 n = 5마리 마우스)으로 정맥내 투여하였다. LNP 제제는 가이드 RNA에 대하여 중량 기준으로 1:2 비율의 Cas9 mRNA를 함유하였다. LNP는 각각 50:38:9:3 몰비의, 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트)로도 불리는 양이온 지질 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-다이에노에이트, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG2k-DMG를 함유하였고, 6의 N:P 비율을 가졌다. Tris-식염수 수크로오스를 대조군으로서 사용하였다. 상기에서 기술된 것과 같이, 혈액 (혈청의 경우)을 나중에 분석을 위해 수집하였다. 그런 후 인간 TTR 수준을 투약한 마우스로부터의 혈청에서 측정하였다. 인간 혈청 TTR 수준을 상기에서 기술한 것과 같이 평가하였다. 도 20에서 나타낸 것과 같이, 인간 TTR 수준은 모든 용량에서 각각의 가이드 RNA가 투여된 마우스에서 용량 의존성 방식으로 유의하게 감소하였다.
실시예 4. 마우스 신호 서열을 가진 키메릭 마우스/인간 TTR 단백질을 암호화하는 인간화된 TTR 유전자좌를 포함하는 마우스의 생성.
본 발명자들은 TTR의 마우스 신호 서열이 hTTR 분비를 보다 왕성한 수준으로 증강시킬 수 있을 것으로 가설을 세웠다. 마우스 Ttr (mTtr) 신호 서열 + hTTR ("m/hTTR")을 위한 cDNA 삽입물을 함유하는 유체역학적 전달 (HDD) 플라스미를 구성하였다. 하기 표 9에 열거한, cDNA 삽입물을 가진 pRG977 벡터를 사용하는 HDD 구성물을 HDD를 통해 각각 생후 59일 된 수컷 C57/BL6 마우스에 주사하였다. HDD 후 4일 후에 턱밑하 혈액에 대해 ELISA를 수행하였다. F1H4 혈장 및 인간 혈청을 각각 음성 및 양성 대조군으로서 ELISA에 포함시켰다.
HDD 실험의 요약.
HDD 구성물 마우스 수 체중; g (SD) cDNA 삽입물
Nanoluc 8마리 21.5 (2.23) Nanoluc
대조군 단백질 7마리 22.8 (1.40) 대조군 단백질
hTTR 8마리 23.4 (0.74) hTTR 신호 서열 + hTTR
m/hTTR 8마리 22.9 (0.66) mTTR 신호 서열 + hTTR
결과를 도 13에 도시한다. 야생형 C57/BL6 마우스에서의 HDD는 TTR의 마우스 신호 서열을 활용하는 것이 인간 신호 서열 TTR + hTTR ("hTTR")과 비교했을 때 실제로 혈장으로의 hTTR 분비를 증가시킨 것으로 드러났다. 이것은 C57/BL6 마우스가 왕성한 hTTR 분비를 초래할 TTR 구성물을 예측하는 데 사용될 수 있음을 입증하였다.
이들 결과를 토대로, 제2 엑손의 출발 코돈으로부터 중간 코돈까지 마우스 Ttr 유전자좌의 영역이 삭제되고 인간 TTR 유전자의 병렬상동 부분으로 대체되었지만 또한 인간 TTR 유전자의 3' UTR을 포함하는, 제2 인간화된 TTR 대립유전자를 생성하였다. 마우스 Ttr 유전자의 제2 엑손으로부터 상류의 36 kb 서열을 포함하는 5' 상동성 팔 및 마우스 Ttr 중단 코돈의 하류의 34.5 kb 서열을 포함하는 큰 표적화 벡터를 생성하여, 인간 TTR 유전자의 제2 엑손의 개시 코돈으로부터 마지막 인간 TTR 엑손 (엑손 4, 인간 3' UTR을 포함함)의 끝까지 대략 6.1 kb 병렬상동 인간 TTR 서열 및 loxP 부위가 측면에 있는 자가 삭제 네오마이신 선택 카세트 (SDC Neo)로 마우스 Ttr 유전자의 제 2 엑손의 개시 코돈으로부터 마우스 Ttr 중단 코돈까지의 대략 7.3 kb 영역을 대체하였다. 도 4를 참조한다. 인간화된 대립유전자를 생성하기 위하여, 마우스 Ttr 유전자좌를 표적화하는 CRISPR/Cas9 구성요소를 F1H4 마우스 배아 줄기 세포에 큰 표적화 벡터와 함께 도입하였다. 도 5B 및 표 3에 제시한 프라이머 및 프로브를 사용하는 대립유전자 상실 검정, 대립유전자 획득 검정, 및 보유 검정을 수행하여 마우스 Ttr 대립유전자의 인간화를 확인하였다. SDC Neo 카세트가 있는 버전 및 SDC Neo 카세트가 삭제된 후의 버전을 도 4에 나타낸다. 그런 후 VELOCIMOUSE® 방법을 사용하여 F0 마우스를 생성하였다.
인간 및 마우스 트랜스티레틴 전구체 단백질 서열의 비교를 도 1A에 도시하고, 인간 및 마우스 트랜스티레틴 코딩 서열의 비교를 도 1B에 도시하며, 야생형 마우스 Ttr 유전자좌 및 최종 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌 (SDC Neo 카세트가 삭제된 인간화된 TTR 버전 2)를 도 2에 도시한다. SDC Neo 카세트가 있거나 SDC Neo 카세트가 없는 예상된 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌에 대한 서열을 각각 SEQ ID NO: 16 및 17에 제시한다. MAID7655는 네오마이신 선택 카세트가 있는 인간화된 TTR 유전자좌 (마우스 신호 서열을 유지함)를 나타낸다. MAID7656은 네오마이신 선택 카세트가 제거된 인간화된 TTR 유전자좌 (마우스 신호 서열을 유지함)를 나타낸다. 인간화된 마우스 Ttr 유전자좌 (키메릭 마우스/인간 TTR 단백질)에 의해 암호화된 예상된 트랜스티레틴 전구체 단백질을 SEQ ID NO: 2에 제시한다.
그런 다음 인간 TTR ELISA 키트 (Aviva Systems Biology; Cat No.: OKIA00081; 1:2000 희석)를 사용하여 생후 1 내지 3개월의 상이한 버전의 인간화된 TTR 마우스에서 혈청 인간 TTR 수준을 평가하였다. 마우스는 야생형 대조군 마우스 및 야생형, MAID7577, MAID7655, 및 MAID7656 대립유전자의 다양한 조합을 가진 마우스를 포함하였다. MAID7577은 네오마이신 선택 카세트가 제거된 인간화된 TTR 유전자좌를 나타낸다. MAID7655는 네오마이신 선택 카세트가 있는 인간화된 TTR 유전자좌 (마우스 신호 서열을 유지함)를 나타낸다. MAID7656은 네오마이신 선택 카세트가 제거된 인간화된 TTR 유전자좌 (마우스 신호 서열을 유지함)를 나타낸다. 데이터를 도 16 및 표 10에 요약한다. 도 16에서 나타낸 것과 같이, hTTR7577/7577 마우스 (클론 B-F10)는 약 55 μg/mL의 순환하는 hTTR을 가졌고, 이것은 유의미하지만 야생형 마우스 또는 인간 혈청에서의 생리적 수준보다는 낮다. 마우스 TTR 신호 서열을 가진 인간화된 TTR 마우스 (hTTR7655/7655, hTTR7655/7656, 및 hTTR7656/7656)는 인간 TTR 신호 서열을 가진 인간화된 TTR 마우스 (hTTR7577/7577)와 비교할 때 증가된 분비 TTR 수준을 갖지 못하였다.
혈장 TTR 수준.
스트레인 설명 hTTR, μg/mL (SD) mTTR, μg/mL (SD)
F1H4 야생형 대조군 마우스 N.D. 920 (79.7)
V1.0 hTTR7577/7577 인간화된 TTR 유전자좌, 카세트 삭제됨 54.41 (14.36) N.D.
V2.0 hTTR7655/7655 마우스 TTR 신호 서열을 포함한 인간화된 TTR 유전자좌, 카세트 삭제됨 37.42 (2.461) N.D.
V2.0 hTTR7656/7656 마우스 TTR 신호 서열을 포함한 인간화된 TTR 유전자좌, 카세트 삭제됨 34.88 (n.a.) N.D.
V2.0 hTTR7655/7656 마우스 TTR 신호 서열을 포함한 인간화된 TTR 유전자좌, 한 대립유전자에서는 카세트 삭제되지만 다른 대립유전자에서는 존재함 33.86 (2.827) N.D.
V2.0 hTTR7656/WT 마우스 TTR 신호 서열을 포함한 이형접합성 인간화된 TTR 유전자좌, 카세트 삭제됨 18.36 (1.233) 57.50 (4.264)
인간 혈청 인간 혈청 대조군 234.5 (n.a.) N.D.
그런 후 인간 TTR ELISA 키트 (Aviva Systems Biology; Cat No.: OKIA00081; 1:2000 희석)를 사용하여 또 다른 실험에서 생후 2 내지 3개월의 상이한 버전의 인간화된 TTR 마우스에서 혈장 인간 TTR 수준을 평가하였다. 마우스는 야생형 대조군 마우스 (표지된 F1H4) 및 MAID7577 또는 MAID7656 대립유전자에 대해 동형접합성인 마우스를 포함하였다. MAID7577은 네오마이신 선택 카세트가 제거된 인간화된 TTR 유전자좌를 나타낸다. MAID7656은 네오마이신 선택 카세트가 제거된 인간화된 TTR 유전자좌 (마우스 신호 서열을 유지함)를 나타낸다. 데이터를 도 18 및 표 11에 요약한다. 도 18에서 나타낸 것과 같이, hTTR7577/7577 마우스 (hTTR v1)는 약 55 μg/mL의 순환하는 hTTR을 가졌고, 이것은 유의미하지만 야생형 마우스 또는 인간 혈청에서의 생리적 수준보다는 낮다. 마우스 TTR 신호 서열을 가진 인간화된 TTR 마우스 (hTTR7656/7656; hTTRv2)는 인간 TTR 신호 서열을 가진 인간화된 TTR 마우스 (hTTR7577/7577)와 비교할 때 증가된 분비 TTR 수준을 가졌다.
혈장 hTTR 수준.
TTR 스트레인 hTTR, μg/mL (SD)
hTTR v1 54.41(14.36)
hTTR v2 88.45 (1.465)
F1H4 검출할 수 없음
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> NON-HUMAN ANIMALS COMPRISING A HUMANIZED TTR LOCUS AND METHODS OF USE <130> 57766-519832 <150> US 62/565,980 <151> 2017-09-29 <150> US 62/679,142 <151> 2018-06-01 <150> US 62/720,292 <151> 2018-08-21 <160> 94 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 147 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ser His Arg Leu Leu Leu Leu Cys Leu Ala Gly Leu Val Phe 1 5 10 15 Val Ser Glu Ala Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu 20 25 30 Met Val Lys Val Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val 35 40 45 Ala Val His Val Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe 50 55 60 Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr 65 70 75 80 Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu 100 105 110 Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Ile Ala 115 120 125 Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Thr Asn 130 135 140 Pro Lys Glu 145 <210> 2 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Met Ala Ser Leu Arg Leu Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Leu Val Phe 1 5 10 15 Val Ser Glu Ala Gly Pro Ala Gly Thr Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu 20 25 30 Met Val Lys Val Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val 35 40 45 Ala Val His Val Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe 50 55 60 Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr 65 70 75 80 Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu 100 105 110 Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Ile Ala 115 120 125 Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Thr Asn 130 135 140 Pro Lys Glu 145 <210> 3 <211> 7258 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gttgactaag tcaataatca gaatcagcag gtttgcagtc agattggcag ggataagcag 60 cctagctcag gagaagtgag tataaaagcc ccaggctggg agcagccatc acagaagtcc 120 actcattctt ggcaggatgg cttctcatcg tctgctcctc ctctgccttg ctggactggt 180 atttgtgtct gaggctggcc ctacggtgag tgtttctgtg acatcccatt cctacattta 240 agattcacgc taaatgaagt agaagtgact ccttccagct ttgccaacca gcttttatta 300 ctagggcaag ggtacccagc atctattttt aatataatta attcaaactt caaaaagaat 360 gaagttccac tgagcttact gagctgggac ttgaactctg agcattctac ctcattgctt 420 tggtgcatta ggtttgtaat atctggtacc tctgtttcct cagatagatg atagaaataa 480 agatatgata ttaaggaagc tgttaatact gaattttcag aaaagtatcc ctccataaaa 540 tgtatttggg ggacaaactg caggagatta tattctggcc ctatagttat tcaaaacgta 600 tttattgatt aatctttaaa aggcttagtg aacaatattc tagtcagata tctaattctt 660 aaatcctcta gaagaattaa ctaatactat aaaatgggtc tggatgtagt tctgacatta 720 ttttataaca actggtaaga gggagtgact atagcaacaa ctaaaatgat ctcaggaaaa 780 cctgtttggc cctatgtatg gtacattaca tcttttcagt aattccactc aaatggagac 840 ttttaacaaa gcaactgttc tcaggggacc tattttctcc cttaaaattc attatacaca 900 tccctggttg atagcagtgt gtctggaggc agaaaccatt cttgctttgg aaacaattac 960 gtctgtgtta tactgagtag ggaagctcat taattgtcga cacttacgtt cctgataatg 1020 ggatcagtgt gtaattcttg tttcgctcca gatttctaat accacaaaga ataaatcctt 1080 tcactctgat caattttgtt aacttctcac gtgtcttctc tacacccagg gcaccggtga 1140 atccaagtgt cctctgatgg tcaaagttct agatgctgtc cgaggcagtc ctgccatcaa 1200 tgtggccgtg catgtgttca gaaaggctgc tgatgacacc tgggagccat ttgcctctgg 1260 gtaagttgcc aaagaaccct cccacaggac ttggttttat cttcccgttt gcccctcact 1320 tggtagagag aggctcacat catctgctaa agaatttaca agtagattga aaaacgtagg 1380 cagaggtcaa gtatgccctc tgaaggatgc cctctttttg ttttgcttag ctaggaagtg 1440 accaggaacc tgagcatcat ttaggggcag acagtagaga aaagaaggaa tcagaactcc 1500 tctcctctag ctgtggtttg caaccctttt gggtcacaga acactttatg taggtgatga 1560 aaagtaaaca ttctatgccc agaaaaaatg cacagataca cacacataca aaatcatata 1620 tgtgatttta ggagtttcac agattccctg gtgtccctgg gtaacaccaa agctaagtgt 1680 ccttgtctta gaattttagg aaaaggtata atgtgtatta acccattaac aaaaggaaag 1740 gaattcagaa atattattaa ccaggcatct gtctgtagtt aatatggatc acccaaaacc 1800 caaggctttt gcctaatgaa cactttgggg cacctactgt gtgcaaggct gggggctgtc 1860 aagctcagtt aaaaaaaaaa agatagaaga gatggatcca tgaggcaaag tacagcccca 1920 ggctaatccc acgatcaccc gacttcatgt ccaagagtgg cttctcacct tcattagcca 1980 gttcacaatt ttcatggagt ttttctacct gcactagcaa aaacttcaag gaaaatacat 2040 attaataaat ctaagcaaag tgaccagaag acagagcaat caggagaccc tttgcatcca 2100 gcagaagagg aactgctaag tatttacatc tccacagaga agaatttctg ttgggtttta 2160 attgaacccc aagaaccaca tgattcttca accattattg ggaagatcat tttcttaggt 2220 ctggttttaa ctggcttttt atttgggaat tcatttatgt ttatataaaa tgccaagcat 2280 aacatgaaaa gtggttacag gactattcta agggagagac agaatggaca ccaaaaatat 2340 tccaatgttc ttgtgaatct tttccttgca ccaggacaaa aaaaaaaaga agtgaaaaga 2400 agaaaggagg aggggcataa tcagagtcag taaagacaac tgctattttt atctatcgta 2460 gctgttgcag tcaaatggga agcaatttcc aacattcaac tatggagctg gtacttacat 2520 ggaaatagaa gttgcctagt gtttgttgct ggcaaagagt tatcagagag gttaaatata 2580 taaaagggaa aagagtcaga tacaggttct tcttcctact ttaggttttc cactgtgtgt 2640 gcaaatgata ctccctggtg gtgtgcagat gcctcaaagc tatcctcaca ccacaaggga 2700 gaggagcgag atcctgctgt cctggagaag tgcagagtta gaacagctgt ggccacttgc 2760 atccaatcat caatcttgaa tcacagggac tctttcttaa gtaaacatta tacctggccg 2820 ggcacggtgg ctcacgcctg taatcccagc actttgggat gccaaagtgg gcatatcatc 2880 tgaggtcagg agttcaagac cagcctggcc aacatggcaa aactccgtct ttatgaaaaa 2940 tacaaaaatt agccaggcat ggtggcaggc gcctgtaatc ccagctaatt gggaggctga 3000 ggctggagaa tcccttgaat ctaggaggca gaggttgcag tgagctgaga tcgtgccatt 3060 gcactccagc ctgggtgaca agagtaaaac tctgtctcaa aaaaaaaaaa ttatacctac 3120 attctcttct tatcagagaa aaaaatctac agtgagcttt tcaaaaagtt tttacaaact 3180 ttttgccatt taatttcagt taggagtttt ccctacttct gacttagttg aggggaaatg 3240 ttcataacat gtttataaca tgtttatgtg tgttagttgg tgggggtgta ttactttgcc 3300 atgccatttg tttcctccat gcgtaactta atccagactt tcacacctta taggaaaacc 3360 agtgagtctg gagagctgca tgggctcaca actgaggagg aatttgtaga agggatatac 3420 aaagtggaaa tagacaccaa atcttactgg aaggcacttg gcatctcccc attccatgag 3480 catgcagagg tgagtataca gaccttcgag ggttgttttg gttttggttt ttgcttttgg 3540 cattccagga aatgcacagt tttactcagt gtaccacaga aatgtcctaa ggaaggtgat 3600 gaatgaccaa aggttccctt tcctattata caagaaaaaa ttcacaacac tctgagaagc 3660 aaatttcttt ttgactttga tgaaaatcca cttagtaaca tgacttgaac ttacatgaaa 3720 ctactcatag tctattcatt ccactttata tgaatattga tgtatctgct gttgaaataa 3780 tagtttatga ggcagccctc cagaccccac gtagagtgta tgtaacaaga gatgcaccat 3840 tttatttctc gaaaacccgt aacattcttc attccaaaac acatctggct tctcggaggt 3900 ctggacaagt gattcttggc aacacatacc tatagagaca ataaaatcaa agtaataatg 3960 gcaacacaat agataacatt taccaagcat acaccatgtg gcagacacaa ttataagtgt 4020 tttccatatt taacctactt aatcctcagg aataagccac tgaggtcagt cctattatta 4080 tccccatctt atagatgaag aaaatgaggc accaggaagt caaataactt gtcaaaggtc 4140 acaagactag gaaatacaca agtagaaatg tttacaatta aggcccaggc tgggtttgcc 4200 ctcagttctg ctatgcctcg cattatgccc caggaaactt tttcccttgt gaaagccaag 4260 cttaaaaaaa gaaaagccac atttgtaacg tgctctgttc ccctgcctat ggtgaggatc 4320 ttcaaacagt tatacatgga cccagtcccc ctgccttctc cttaatttct taagtcattt 4380 gaaacagatg gctgtcatgg aaatagaatc cagacatgtt ggtcagagtt aaagatcaac 4440 taattccatc aaaaatagct cggcatgaaa gggaactatt ctctggctta gtcatggatg 4500 agactttcaa ttgctataaa gtggttcctt tattagacaa tgttaccagg gaaacaacag 4560 gggtttgttt gacttctggg gcccacaagt caacaagaga gccccatcta ccaaggagca 4620 tgtccctgac tacccctcag ccagcagcaa gacatggacc ccagtcaggg caggagcagg 4680 gtttcggcgg cgcccagcac aagacattgc ccctagagtc tcagccccta ccctcgagta 4740 atagatctgc ctacctgaga ctgttgtttg cccaagagct gggtctcagc ctgatgggaa 4800 ccatataaaa aggttcactg acatactgcc cacatgttgt tctctttcat tagatcttag 4860 cttccttgtc tgctcttcat tcttgcagta ttcattcaac aaacattaaa aaaaaaaaaa 4920 agcattctat gtgtggaaca ctctgctaga tgctgtggat ttagaaatga aaatacatcc 4980 cgacccttgg aatggaaggg aaaggactga agtaagacag attaagcagg accgtcagcc 5040 cagcttgaag cccagataaa tacggagaac aagagagagc gagtagtgag agatgagtcc 5100 caatgcctca ctttggtgac gggtgcgtgg tgggcttcat gcagcttctt ctgataaatg 5160 cctccttcag 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Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu 850 855 860 Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu 865 870 875 880 Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala 885 890 895 Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg 900 905 910 Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu 915 920 925 Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser 930 935 940 Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val 945 950 955 960 Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp 965 970 975 Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His 980 985 990 Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr 995 1000 1005 Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr 1010 1015 1020 Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys 1025 1030 1035 Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe 1040 1045 1050 Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro 1055 1060 1065 Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys 1070 1075 1080 Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln 1085 1090 1095 Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser 1100 1105 1110 Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala 1115 1120 1125 Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser 1130 1135 1140 Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys 1145 1150 1155 Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile 1160 1165 1170 Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe 1175 1180 1185 Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile 1190 1195 1200 Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys 1205 1210 1215 Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu 1220 1225 1230 Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His 1235 1240 1245 Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln 1250 1255 1260 Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu 1265 1270 1275 Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn 1280 1285 1290 Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro 1295 1300 1305 Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr 1310 1315 1320 Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile 1325 1330 1335 Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr 1340 1345 1350 Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp 1355 1360 1365 Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys 1370 1375 1380 Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1385 1390

Claims (60)

  1. TTR 코딩 서열 및 비코딩 서열을 둘 다 포함하는 인간 TTR 서열을 포함하는 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌를 게놈에 포함하는 설치류로서,
    유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 내인성 Ttr 프로모터를 포함하고, 인간 TTR 서열은 내인성 Ttr 프로모터에 작동 가능하게 연결되며,
    유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 인간 TTR 3' 미번역 영역을 포함하고,
    내인성 Ttr 5' 미번역 영역은 삭제되지 않았고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되지 않았으며, 그리고:
    (I) 내인성 Ttr 유전자좌의 전체 Ttr 코딩 서열은 삭제되었고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되었으며, Ttr 개시 코돈으로부터 Ttr 중단 코돈까지의 내인성 Ttr 유전자좌 영역은 삭제되었고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되었거나; 또는
    (II) 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 신호 펩타이드를 포함하는 트랜스티레틴 전구체 단백질을 암호화하며, 신호 펩타이드를 암호화하는 내인성 Ttr 유전자좌의 영역은 삭제되지 않았고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되지 않았으며, 내인성 Ttr 유전자좌의 제1 엑손은 삭제되지 않았고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되지 않았으며, 제2 Ttr 엑손의 개시로부터 Ttr 중단 코돈까지의 내인성 Ttr 유전자좌의 영역은 삭제되었고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되었고, 설치류가 마우스 또는 래트인, 설치류.
  2. 제1항에 있어서, Ttr 개시 코돈으로부터 Ttr 중단 코돈까지의 내인성 Ttr 유전자좌 영역은 삭제되었고 상응하는 인간 TTR 서열 및 인간 TTR 3' 미번역 영역을 포함하는 인간 TTR 서열로 대체되었으며, 그리고
    내인성 Ttr 5' 미번역 영역은 삭제되지 않았고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되지 않았으며, 그리고
    내인성 Ttr 프로모터는 삭제되지 않았고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되지 않은 것을 특징으로 하는 설치류.
  3. 제2항에 있어서,
    (i) 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌에서 인간 TTR 서열은 SEQ ID NO: 18에 제시된 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나;
    (ii) 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 SEQ ID NO: 1에 제시된 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 암호화하거나;
    (iii) 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 SEQ ID NO: 90에 제시된 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 코딩 서열을 포함하거나; 또는
    (iv) 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 SEQ ID NO: 14 또는 15에 제시된 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 설치류.
  4. 제1항에 있어서, 제2 Ttr 엑손으로부터 Ttr 중단 코돈까지의 내인성 Ttr 유전자좌 영역은 삭제되었고 상응하는 인간 TTR 서열 및 인간 TTR 3' 미번역 영역을 포함하는 인간 TTR 서열로 대체되었으며,
    내인성 Ttr 유전자좌의 제1 엑손 및 제1 인트론은 삭제되지 않았고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되지 않았으며, 그리고
    내인성 Ttr 5' 미번역 영역은 삭제되지 않았고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되지 않았으며, 그리고
    내인성 Ttr 프로모터는 삭제되지 않았고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되지 않은 것을 특징으로 하는 설치류.
  5. 제4항에 있어서,
    (i) 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌에서 인간 TTR 서열은 SEQ ID NO: 19에 제시된 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나;
    (ii) 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 SEQ ID NO: 2에 제시된 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 단백질을 암호화하거나;
    (iii) 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 SEQ ID NO: 91에 제시된 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 코딩 서열을 포함하거나; 또는
    (iv) 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 SEQ ID NO: 16 또는 17에 제시된 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 설치류.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 선택 카세트 또는 리포터 유전자를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 설치류.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌에 대해 동형접합성인 것을 특징으로 하는 설치류.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 마우스인 것을 특징으로 하는 설치류.
  9. 인간-TTR-표적화 시약의 활성을 평가하는 방법으로서,
    인간-TTR-표적화 시약이 투여된 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 설치류에서 인간-TTR-표적화 시약의 활성을 평가하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 투여 단계는: (1) 아데노-관련 바이러스 (AAV)-매개 전달, 선택적으로 여기서 설치류는 AAV8-매개 전달에 의해 인간 TTR-표적화 시약이 투여되었고; (2) 지질 나노입자 (LNP)-매개 전달, 선택적으로 여기서 LNP 용량은 0.1 mg/kg 내지 2 mg/kg이며; 또는 (3) 유체역학적 전달 (HDD)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 인간-TTR-표적화 시약의 활성은 설치류로부터 분리된 간에서 평가되고, 선택적으로 방법은 간 이외의 분리된 장기 또는 조직에서 인간-TTR-표적화 시약의 활성을 평가하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제9항에 있어서, 인간-TTR-표적화 시약은 게놈-편집제이고, 평가 단계는 유전자 변형된 Ttr 유전자좌의 변형을 평가하는 것을 포함하며, 선택적으로 평가 단계는 유전자 변형된 Ttr 유전자좌 내에서의 삽입 또는 삭제의 빈도를 측정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제9항에 있어서, 평가 단계는 유전자 변형된 Ttr 유전자좌에 의해 암호화된 Ttr 메신저 RNA의 발현을 측정하거나 또는 유전자 변형된 Ttr 유전자좌에 의해 암호화된 TTR 단백질의 발현을 측정하는 것을 포함하고, 선택적으로 TTR 단백질의 발현을 측정하는 것은 설치류에서 TTR 단백질의 혈청 수준을 측정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제9항에 있어서, 인간-TTR-표적화 시약은 인간 TTR 유전자의 영역을 표적화하도록 설계된 뉴클레아제 작용제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 뉴클레아제 작용제는 Cas 단백질 및 인간 TTR 유전자에서 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하도록 설계된 가이드 RNA를 포함하고, 선택적으로 Cas 단백질은 Cas9 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 인간-TTR-표적화 시약은 외인성 도너 핵산을 추가로 포함하고, 외인성 도너 핵산은 인간 TTR 유전자와 재조합하도록 설계되며, 선택적으로 외인성 도너 핵산은 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드 (ssODN)인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 생체내에서 인간-TTR-표적화 시약의 활성을 최적화하는 방법으로서,
    (a) TTR 코딩 서열 및 비코딩 서열 둘 다를 포함하는 인간 TTR 서열을 포함하는 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌를 게놈에 포함하는 제1 설치류에서 먼저 제9항의 방법을 수행하는 단계;
    (b) 변수를 변경하고 TTR 코딩 서열 및 비코딩 서열 둘 다를 포함하는 인간 TTR 서열을 포함하는 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌를 게놈에 포함하는 제2 설치류에서 변경된 변수를 사용하여 두 번째로 단계 (a)의 방법을 수행하는 단계; 및
    (c) 단계 (a)에서의 인간-TTR-표적화 시약의 활성을 단계 (b)에서의 인간-TTR-표적화 시약의 활성과 비교하고, 더 높은 활성을 초래하는 방법을 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    (I) 단계 (b)에서 변경된 변수는 인간-TTR-표적화 시약을 설치류에 도입하는 전달 방법 또는 투여 경로이고, 선택적으로 투여 단계는 LNP-매개 전달을 포함하며, 단계 (b)에서 변경된 변수는 LNP 제제이거나;
    (II) 단계 (b)에서 변경된 변수는 설치류에 도입된 인간-TTR-표적화 시약의 농도 또는 양이거나;
    (III) 단계 (b)에서 변경된 변수는 설치류에 도입된 인간-TTR-표적화 시약의 형태이거나;
    (IV) 단계 (b)에서 변경된 변수는 설치류에 도입된 인간-TTR-표적화 시약이거나; 또는
    (V) 인간-TTR-표적화 시약은 Cas 단백질 및 인간 TTR 유전자에서 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하도록 설계된 가이드 RNA를 포함하고, (1) 단계 (b)에서 변경된 변수는 가이드 RNA 서열 또는 가이드 RNA 표적 서열이거나, (2) Cas 단백질 및 가이드 RNA는 각각 RNA의 형태로 투여되고, 단계 (b)에서 변경된 변수는 Cas mRNA 대 가이드 RNA의 비율이거나, 또는 (3) 단계 (b)에서 변경된 변수는 가이드 RNA 변형인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. TTR 코딩 서열 및 비코딩 서열을 둘 다 포함하는 인간 TTR 서열을 포함하는 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌를 게놈에 포함하는 설치류 세포로서,
    유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 내인성 Ttr 프로모터를 포함하고, 인간 TTR 서열은 내인성 Ttr 프로모터에 작동 가능하게 연결되며,
    유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 인간 TTR 3' 미번역 영역을 포함하고,
    내인성 Ttr 5' 미번역 영역은 삭제되지 않았고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되지 않았으며, 그리고:
    (I) 내인성 Ttr 유전자좌의 전체 Ttr 코딩 서열은 삭제되었고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되었으며, Ttr 개시 코돈으로부터 Ttr 중단 코돈까지의 내인성 Ttr 유전자좌 영역은 삭제되었고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되었거나; 또는
    (II) 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌는 신호 펩타이드를 포함하는 트랜스티레틴 전구체 단백질을 암호화하며, 신호 펩타이드를 암호화하는 내인성 Ttr 유전자좌의 영역은 삭제되지 않았고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되지 않았으며, 내인성 Ttr 유전자좌의 제1 엑손은 삭제되지 않았고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되지 않았으며, 제2 Ttr 엑손의 개시로부터 Ttr 중단 코돈까지의 내인성 Ttr 유전자좌의 영역은 삭제되었고 상응하는 인간 TTR 서열로 대체되었고, 설치류가 마우스 또는 래트인, 설치류 세포.
  20. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 설치류의 제조 방법으로서,
    (I) (a) 만능 설치류 세포의 게놈을 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌를 포함하도록 변형시키는 단계;
    (b) 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 만능 설치류 세포를 확인 또는 선택하는 단계;
    (c) 유전자 변형된 만능 설치류 세포를 설치류 숙주 배아로 도입하는 단계; 및
    (d) 설치류 숙주 배아를 대리 설치류 모체에 이식하고 임신시키는 단계; 또는
    (II) (a) 설치류 단일 세포 단계 배아의 게놈을 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌를 포함하도록 변형시키는 단계;
    (b) 유전자 변형된 내인성 Ttr 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 설치류 단일 세포 단계 배아를 선택하는 단계; 및
    (c) 유전자 변형된 설치류 단일 세포 단계 배아를 대리 설치류 모체에 이식하고 임신시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  21. 삭제
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