JPWO2013073653A1 - 真核細胞におけるタンパク質分解誘導方法 - Google Patents
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Abstract
植物由来のTIR1ファミリータンパク質遺伝子と、植物由来Aux/IAAファミリータンパク質の部分配列で標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子とを有する、オーキシン類により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞であって、該部分配列が、Aux/IAAファミリータンパク質のドメインII領域のN末端側及びC末端側に少なくとも2個ずつのLys残基を含む領域からなる配列、又は該配列を2個以上連結してなる配列であることを特徴とするタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞。
Description
同様に培養細胞内で発現抑制を行う方法としてsiRNA及びshRNAを細胞内に導入し、細胞内のRNA干渉反応を利用して対象遺伝子産物のmRNAを分解する方法が知られている。実際にこの方法に基づく製品も多くの会社から発売されている。しかし、この方法もmRNAレベルでの発現抑制を行うものであるため、発現抑制まで一般に24〜48時間もの時間を必要とする。また発現抑制の度合いも、対象とする因子やターゲットRNA配列に依存しており、90%以上の発現抑制を達成できる可能性はそれほど高くない。
従って、本発明の課題は、出芽酵母などの宿主を致死させず、また十分な分解能を有する新たなタンパク質誘導性真核細胞及びそれを用いたタンパク質分解誘導方法を提供するものである。
1.出芽酵母株の作製
分解目的のタンパク質をEGFPとし、NAA添加によってEGFPを分解する出芽酵母株を作製した。なお、使用した出芽酵母のプロモーター配列や遺伝子配列は、SGDウェブサイトhttp://www.yeastgenome.org/に登録されている。
pRS306−GALプラスミドベクターをSal1及びXho1で切断し、セルフライゲーションさせた。pRS306−GALプラスミドベクターは、文献(L.Drury,G.Perkins and J.Diffley“The Cdc4/34/53 pathway targets Cdc6p for proteolysis in budding yeast”EMBO J 16,5966−5976,1997)に開示されている。これにより、前記プラスミドベクターのマルチクローニングサイトにあるSalIサイトを除去した。シロイヌナズナのTIR1遺伝子(TAIR accession No.AT1G04250.1)を、下記プライマーセット1を用いたPCRで増幅し(1785bp)、この増幅物を、前記プラスミドベクターのSpe1−Not1サイトにクローニングした。得られたベクターを、pMK26という。
<プライマーセット1>
Fプライマー7(配列番号13)
5’−AGCTAGACTAGTATGCAGAAGCGAATAGCCTT−3’
Rプライマー8(配列番号14)
5’−ATCGATGCGGCCGCAGATCTGCTAGTCGACTAATCCGTTAGTAGTAATGA−3’
W303−1a
MATa ade2−1 ura3−1 his3−11,15 trp1−1 leu2−3,112 can1−100
YNK2
MATa ade2−1 his3−11,15 trp1−1 leu2−3,112 can1−100
ura3−1:URA3−GAL1−10 promoter−シロイヌナズナTIR1(pMK27 integrated)
イネTIR1遺伝子(NCBI、アクセッションNo.NM_001059194)は下記のプライマーセット2でイネcDNAライブラリーよりPCR増幅した。増幅した産物はpMK26をSpeIとSalIで処理してシロイヌナズナTIR1遺伝子を取り除いた部分にクローニングした。
<プライマーセット2>
Fプライマー
5’−GGGGATCCATGACGTACTTCCCGGAGGAGGT−3(配列番号15)
Rプライマー
5’−CCCGTCGACTAGGATTTTAACAAAATTTGGTG−3’(配列番号16)
シロイヌナズナTIR1を導入した際と同様の手法で出芽酵母にイネTIR1を導入した。
MATa ade2−1 his3−11,15 trp1−1 leu2−3,112 can1−100 ura3−1:URA3−GAL1−10 promoter−イネTIR1
1.出芽酵母株の作製
(1)内在性蛋白質Mcm4のAuxin degron(mcm4−ad)株
内在性タンパク質Mcm4を分解目的タンパク質とし、NAA添加によりこれを分解する株を作製した。内在性タンパク質Mcm4は、DNA複製に関与する必須タンパク質である。Nature Methods,Vol.6,No.12,p917(Dec.2009)に記載のPMK43を、下記プライマーセット3を用いてPCRにより増幅した。そして、得られた増幅物を用いて、直接、前記参考例1(1)で得られたTIR1発現株YNK2にトランスフォーメーションし、相同組換えによって、出芽酵母ゲノム上のMCM4 5’部分に、CUP1プロモーター−IAA17を導入した。この組換え体を、「YNK14」という。なお、ゲノムへの挿入はPCRにより確認した。
Fプライマー180(配列番号17)
5’−TTGTCCTTGGCGAGGGTGTAAGGAGATCAGTTCGCCTGAATAACCGTGTCCGTACGCTGCAGGTCGAC−3’
Rプライマー181(配列番号18)
5’−TCAATCGAGCCTACATACAGTATTGAATAGTGTTACAAAGCATAAGGATGATCGATGAATTCGAGCTCG−3’
YNK14
MATa ade2−1 his3−11,15 trp1−1 leu2−3,112 can1−100
ura3−1:URA3−GAL1−10 promoter−シロイヌナズナTIR1(pMK27 integrated)
mcm4:mcm4−ad(kanMX)
YNK4株を、NAA未添加のYPDCu寒天培地(2%ペプトン、1%酵母粉末、2%グルコース、0.1mM CuSO4、2%寒天)及び、NAA添加のYPGNAA寒天培地(2%ペプトン、1%酵母粉末、2%ガラクトース、0.1mM NAA、2%寒天)に、プレート1枚あたりの細胞数が所定の数(5×105、5×104、5×103、5×102、5×10個)となるようにスポットし、24℃で2日間培養した。そして、細胞の生育を観察した。
参考例2において、IAA17の全長タグ(1−229)(配列番号23)に代えて、IAA17(1−132)、IAA17(1−34)、IAA17(ドメインII)、IAA17(128−132)及びIAA17(65−132)(配列番号1)を導入した組換体を作製した。
得られた組換体を、参考例2(2)と同様にして、オーキシン未添加及びオーキシン添加の場合のタンパク質の分解誘導能(細胞の成育性)を観察した。
出芽酵母の染色体複製に関与するPsf2のC末端に、全長のIAA17もしくはIAA17(65−132)を付加した。付加するためには、下記プライマーセットを用いて全長IAA付加にはpMK43、IAA17(65−132)付加にはpMK43と同様の配列をもつが、全長IAA17部分がIAA17(65−132)に改変されているpMK68を鋳型としてPCRによりDNA増幅を行った。
5’−AAATACATTCTATGCCCATTAACTAGGATACCACAACAAGTACATATATAATCGATGAATTCGAGCTCG−3’(配列番号20)
しかしながら、全長IAA17を持つ株は作成することができなかった。このことはタグ付加が致死性を引き起こす可能性を示している。一方、同様の方法でIAA17(65−132)の付加は問題無く行うことができた。また、得られたPsd2−IAA17(65−132)を発現する株はプレート1枚あたりの細胞数が所定の数(5×105、5×104、5×103、5×102、5×10個)となるようにスポットし、24℃で2日間培養した。そして、細胞の成育を観察した。その結果、Psd2−IAA17(65−132)を発現する株はNAAを添加した培地では成育することができなかった(図4、+auxin)。このことは、細胞内でPsf2−IAA17(65−132)が分解されていることを示している。
複数連結したIAA17(65−132)がより機能するかどうか試すために、出芽酵母の染色体複製に関与するSld3のC末端に図5に示す様々な改変型IAA17を付加した。付加には下記のプライマーを用いて、全長IAA付加にはpMK43、IAA17(65−132)付加にはpMK68、複数個のIAA17(65−132)付加にはpMK43と同様であるが全長IAA17部分に2×IAA17(65−132)をもつpMK74、3×IAA17(65−132)をもつpMK77を鋳型として用いた。
5’−TTTAATTGTATACTCAAAGGCCCCCGAAGTGCGAAATTGTTGTAGCTTAGATCGATGAATTCGAGCTCG−3’(配列番号22)
Claims (10)
- 植物由来のTIR1ファミリータンパク質遺伝子と、植物由来Aux/IAAファミリータンパク質の部分配列で標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子とを有する、オーキシン類により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞であって、該部分配列が、Aux/IAAファミリータンパク質のドメインII領域のN末端側及びC末端側に少なくとも2個ずつのLys残基を含む領域からなる配列、又は該配列を2個以上連結してなる配列であることを特徴とするタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞。
- 前記部分配列が、Aux/IAAファミリータンパク質のドメインII領域のN末端側及びC末端側に2〜5個ずつのLys残基を含む32〜80アミノ酸残基からなる配列、又は該配列を2〜4個連結してなる配列である請求項1記載のタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞。
- 前記部分配列が、配列番号1〜12から選ばれる配列を含む50〜80アミノ酸残基からなる配列、又は該配列を2〜4個連結してなる配列である請求項1又は2記載のタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞。
- 宿主非植物真核細胞に、植物由来のTIR1ファミリータンパク質遺伝子と、植物由来Aux/IAAファミリータンパク質の部分配列で標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子を導入する、オーキシン類により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞の製造法であって、該部分配列が、Aux/IAAファミリータンパク質のドメインII領域のN末端側及びC末端側に少なくとも2個ずつのLys残基を含む領域からなる配列、又は該配列を2個以上連結してなる配列であることを特徴とするタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞の製造法。
- 前記部分配列が、Aux/IAAファミリータンパク質のドメインII領域のN末端側及びC末端側に2〜5個ずつのLys残基を含む32〜80アミノ酸残基からなる配列、又は該配列を2〜4個連結してなる配列である請求項4記載のタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞の製造法。
- 前記部分配列が、配列番号1〜12から選ばれる配列を含む32〜80アミノ酸残基からなる配列、又は該配列を2〜4個連結してなる配列である請求項4又は5記載のタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞の製造法。
- 植物由来のTIR1ファミリータンパク質遺伝子と、植物由来Aux/IAAファミリータンパク質の部分配列で標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子とを有する、オーキシン類により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞用の遺伝子導入用ベクターであって、該部分配列が、Aux/IAAファミリータンパク質のドメインII領域のN末端側及びC末端側に少なくとも2個ずつのLys残基を含む領域からなる配列、又は該配列を2個以上連結してなる配列であることを特徴とするタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞用の遺伝子導入用ベクター。
- 前記部分配列が、Aux/IAAファミリータンパク質のドメインII領域のN末端側及びC末端側に2〜5個ずつのLys残基を含む32〜80アミノ酸残基からなる配列、又は該配列を2〜4個連結してなる配列である請求項7記載のタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞用の遺伝子導入用ベクター。
- 前記部分配列が、配列番号1〜12から選ばれる配列を含む32〜80アミノ酸残基からなる配列、又は該配列を2〜4個連結してなる配列である請求項7又は8記載のタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞用の遺伝子導入用ベクター。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載の非植物性真核細胞に、オーキシン類を添加することを特徴とする、該非植物真核細胞における目的タンパク質の分解誘導方法。
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