WO2013073653A1 - 真核細胞におけるタンパク質分解誘導方法 - Google Patents

真核細胞におけるタンパク質分解誘導方法 Download PDF

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WO2013073653A1
WO2013073653A1 PCT/JP2012/079744 JP2012079744W WO2013073653A1 WO 2013073653 A1 WO2013073653 A1 WO 2013073653A1 JP 2012079744 W JP2012079744 W JP 2012079744W WO 2013073653 A1 WO2013073653 A1 WO 2013073653A1
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sequence
protein
plant
aux
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PCT/JP2012/079744
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将人 鐘巻
浩平 西村
温彦 滝澤
覚 三村
有以 小畑
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大学共同利用機関法人情報・システム研究機構
国立大学法人大阪大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1044—Preparation or screening of libraries displayed on scaffold proteins

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently inducing degradation of a target protein in eukaryotic cells.
  • Controlling the expression level of a specific protein in the cell is very useful in analyzing the function of the protein in the cell and the life phenomenon involving the protein. To this end, several methods have been developed so far based on separate principles.
  • Non-patent Documents 1 and 2 a method of performing transcriptional expression of a gene introduced into cultured cells in a tetracycline-dependent manner using a tetracycline-binding transcription repressing factor of Escherichia coli is known (Non-patent Documents 1 and 2). Transcription suppression systems based on this principle are commercially available, and many researchers have actually used them and have achieved results so far. However, since this method is a method of controlling transcription of the target gene, it often takes time for the actual protein to be removed from the cell even if expression is suppressed. In some cases, a decrease in the expression level may activate a secondary intracellular response.
  • RNA interference reaction a method for suppressing expression in a cultured cell
  • siRNA and shRNA are introduced into the cell and the mRNA of the target gene product is degraded using the intracellular RNA interference reaction.
  • many companies have released products based on this method.
  • this method also suppresses the expression at the mRNA level, it generally takes 24 to 48 hours to suppress the expression.
  • the degree of expression suppression depends on the target factor and target RNA sequence, and it is not very likely that expression suppression of 90% or more can be achieved.
  • Non-patent Document 3 Non-patent Document 3
  • Shield1 is a rapamycin-like compound, its cytotoxicity is questionable.
  • the degradation time required for expression suppression is about 4 hours, a system capable of faster degradation and removal has been desired for research on the cell cycle and the like.
  • Patent Documents 1 and 2 A method of suppressing expression by degrading the target protein in a very short time was developed (Patent Documents 1 and 2).
  • an object of the present invention is to provide a novel protein-inducible eukaryotic cell that does not let a host such as budding yeast kill, and has sufficient resolution, and a method for inducing proteolysis using the same.
  • the present inventor tried to modify the Aux / IAA family protein used as a tag, and examined the use of a partial sequence of the IAA family protein in order to reduce the size of the tag.
  • the resolution was not sufficiently improved, and when the partial sequence containing domain I was used, the resolution was not improved.
  • a sequence consisting of a region containing at least two Lys residues on the N-terminal side and C-terminal side of the domain II region of the IAA family protein, or two or more of them were ligated unexpectedly. It was found that the use of the sequence as a tag dramatically improves the resolution and does not let the host be lethal, thereby completing the present invention.
  • degradation of a target protein is induced by auxins having a plant-derived TIR1 family protein gene and a chimeric gene that expresses the target protein labeled with a plant-derived Aux / IAA family protein partial sequence.
  • a proteolytic inducible non-plant eukaryotic cell wherein the partial sequence comprises at least two Lys residues on the N-terminal side and C-terminal side of the domain II region of the Aux / IAA family protein.
  • a proteolytic-inducible non-plant eukaryotic cell characterized in that it is a sequence formed by linking two or more such sequences.
  • the present invention also provides an auxin that introduces a chimeric gene expressing a target protein labeled with a plant-derived Aux / IAA family protein partial sequence into a host non-plant eukaryotic cell.
  • a proteolysis-inducing non-plant eukaryotic cell production method in which degradation of a target protein is induced by the method, wherein the partial sequence is at least on the N-terminal side and the C-terminal side of the domain II region of the Aux / IAA family protein
  • Provided is a method for producing a proteolytic inducible non-plant eukaryotic cell, characterized in that it is a sequence comprising a region containing two Lys residues, or a sequence formed by linking two or more such sequences. It is.
  • the present invention is directed to the degradation of the target protein by auxins having a plant-derived TIR1 family protein gene and a chimeric gene expressing the target protein labeled with a plant-derived Aux / IAA family protein partial sequence.
  • a gene introduction vector for proteolytic inducible non-plant eukaryotic cells characterized in that it is a sequence comprising a region containing residues, or a sequence formed by linking two or more such sequences. .
  • the present invention provides a method for inducing degradation of a target protein in the non-plant eukaryotic cell, characterized in that auxins are added to the proteolysis-inducing non-plant eukaryotic cell.
  • the eukaryotic cell of the present invention When the eukaryotic cell of the present invention is used, cell death is not caused, and degradation of the target protein can be induced reliably and efficiently in a short time by adding auxins. It is useful as a tool in the field of drug development targeting functions.
  • IAA family protein gene It is the schematic of an IAA family protein gene. A preferred partial sequence of an IAA family protein is shown. It is a figure which shows the resolution
  • the proteolytic inducible non-plant eukaryotic cell of the present invention comprises (1) a plant-derived TIR1 family protein gene and (2) a chimeric gene that expresses a target protein labeled with a partial sequence of a plant-derived Aux / IAA family protein. And have.
  • the combination of this TIR1 family protein gene and a chimeric gene that expresses the target protein labeled with a partial sequence of the Aux / IAA family protein causes a degradation pathway based on a plant ubiquitinase complex in a non-plant eukaryotic cell. It is formed. That is, ubiquitin / proteasome proteolysis is known in various eukaryotes such as animals, plants, and fungi.
  • ubiquitin is bound to a target protein by three enzymes, ubiquitin activating enzyme (E1) -ubiquitin-conjugating enzyme (E2) -ubiquitin ligase (E3), and the polyubiquitinated target protein is specific by the proteasome. Is a system that is recognized and disassembled. As this ubiquitin ligase, an E3 ubiquitinase complex (SCF complex) has been reported. This SCF complex is composed of four subunits: F-box protein, Skp1 protein, Cullin-1 protein, and Rbx1 protein.
  • SCF complex E3 ubiquitinase complex
  • the plant SCF complex has a TIR1 family protein as an F-box protein, which is a receptor for the growth hormone auxin, and by receiving auxin, an inhibitor of auxin signal transduction system Aux / IAA It has recently been elucidated to recognize family proteins and degrade them. Therefore, the present inventor uses a plant-derived TIR1 family protein to recognize a partial sequence of the Aux / IAA family protein using auxin as an inducer and decomposes the target protein labeled with the partial sequence of the Aux / IAA family protein. Successfully functioned in eukaryotic cells other than plants.
  • the expressed target protein can be degraded at any time by adding auxins. That is, according to the proteolysis-inducible non-plant eukaryotic cell of the present invention, for example, a target protein labeled with a partial sequence of an SCF complex containing a plant-derived TIR1 family protein and an Aux / IAA family protein is expressed. Therefore, under the coexistence of auxins, the plant-derived TIR1 family protein of the SCF complex accepts auxins, thereby recognizing the partial sequence of the Aux / IAA family protein by the TIR1 family protein, and Aux / Polyubiquitination to partial sequences of IAA family proteins occurs.
  • the target protein labeled with the partial sequence of the polyubiquitinated Aux / IAA family protein is then degraded by the proteasome. For this reason, for example, it is possible to control the degradation of the expressed target protein by adding or not adding auxins.
  • the TIR1 family protein gene used in the present invention is derived from a plant. Although the kind of plant is not restrict
  • the plant-derived TIR1 family gene may be, for example, natural DNA extracted from the above-mentioned plant, for example, rice, Arabidopsis thaliana, or the like, or DNA synthesized by genetic engineering.
  • the TIR1 family gene may be, for example, DNA containing exons and introns, or may be cDNA consisting of exons.
  • the TIR1 family gene may be, for example, a full-length sequence in genomic DNA or a full-length sequence in cDNA.
  • the TIR1 family gene may be a partial sequence in genomic DNA or a partial sequence in cDNA as long as the expressed protein functions as a TIR1 family protein.
  • “functions as a TIR1 family protein” means, for example, recognition of a partial sequence of an Aux / IAA family protein in the presence of auxins. This is because if the plant-derived TIR1 family protein can recognize the partial sequence of the Aux / IAA family protein, the target protein labeled with the partial sequence of the Aux / IAA family protein can be degraded as described above. At this time, in the proteolysis-inducible non-plant eukaryotic cell of the present invention, the plant-derived TIR1 family protein together with other subunits (Skp1 protein, Cullin protein and Rbx1 protein) is an SCF complex (E3 ubiquitinase complex). Body).
  • the proteolytic inducible non-plant eukaryotic cell of the present invention preferably further has a promoter sequence that controls transcription of the plant-derived TIR1 family gene.
  • plant-derived TIR1 family proteins can be expressed more reliably.
  • the promoter is not limited and can be appropriately determined according to, for example, the type of cell.
  • the chimeric gene is a chimeric gene that expresses a target protein labeled with a partial sequence of an Aux / IAA family protein.
  • the expressed target protein may be labeled with the partial sequence of the Aux / IAA family protein, and the form thereof is not limited.
  • the expressed target protein is a fusion protein containing the target protein and the partial sequence of the Aux / IAA family protein.
  • the partial sequence of the Aux / IAA family protein may be added to either the N-terminal side or the C-terminal side of the target protein, for example.
  • the positional relationship between the target gene and the partial sequence of the Aux / IAA family gene is not limited, and both genes are functional so that the expressed target protein is labeled with the partial sequence of the Aux / IAA family protein. It suffices if they are arranged.
  • the partial sequence of the Aux / IAA family gene is preferably arranged adjacent to the upstream (5 'side) or downstream (3' side) of the target gene. As long as the target protein is expressed and labeled with a partial sequence of the Aux / IAA family protein, for example, the partial sequence of the Aux / IAA family gene may intervene inside the target gene.
  • the type of the Aux / IAA family gene is not limited as long as it is a plant-derived Aux / IAA family gene. Although the kind of the plant is not limited, the Arabidopsis thaliana IAA17 gene is preferable.
  • Specific examples of the Aux / IAA family gene include, for example, IAA1 gene, IAA2 gene, IAA3 gene, IAA4 gene, IAA5 gene, IAA6 gene, IAA7 gene, IAA8 gene, IAA9 gene, IAA10 gene, IAA11 gene, IAA12 gene, IAA13 Gene, IAA14 gene, IAA15 gene, IAA16 gene, IAA17 gene, IAA18 gene, IAA19 gene, IAA20 gene, IAA26 gene, IAA27 gene, IAA28 gene, IAA29 gene, IAA30 gene, IAA31 gene, IAA32 gene, IAA33 gene and IAA34 gene Is mentioned.
  • the proteolytic-inducible non-plant eukaryotic cell may have any one kind of partial sequence of the Aux / IAA family gene, or may have two or more kinds.
  • the sequence of the Aux / IAA family gene derived from Arabidopsis thaliana is registered in TAIR (the Arabidopsis Information Resource), and the accession numbers of the respective genes are as follows.
  • IAA1 gene (AT4G14560), IAA2 gene (AT3G23030), IAA3 gene (AT1G04240), IAA4 gene (AT5G43700), IAA5 gene (AT1G15580), IAA6 gene (AT1G52830), IAA7 gene (AT3G23050), A2G23050, A2G23050, A2G23050 (AT5G65670), IAA10 gene (AT1G04100), IAA11 gene (AT4G28640), IAA12 gene (AT1G04550), IAA13 gene (AT2G33310), IAA14 gene (AT4G14550), IAA15 gene (AT1G80390), IAA0G17AT ), IA 18 genes (AT1G51950), IAA19 gene (AT3G15540), IAA20 gene (AT2G46990), IAA26 gene (AT3G16500), IAA27 gene (AT4G29890), IAA28 gene (AT5G25890), IAA29 gene (AT4G
  • the present invention provides, as a partial sequence of the Aux / IAA family protein, a sequence comprising a region containing at least two Lys residues on the N-terminal side and the C-terminal side of the domain II region of the Aux / IAA family protein, or It is characterized in that an array formed by connecting two or more arrays is used.
  • the Aux / IAA family protein is a protein having a total length of about 25 KDa as shown in FIG.
  • the domain II alone does not improve the ability to induce degradation of the target protein
  • the sequence from the N-terminal to the domain II does not improve the ability to induce degradation of the target protein.
  • a sequence comprising at least two Lys residues on the N-terminal side and C-terminal side of domain II, which does not include domain I and domain III may partially include Is used, the ability to induce degradation of the target protein is significantly improved.
  • the ability to induce degradation of the target protein is further improved.
  • Such a partial sequence is preferably 32 to 80 amino acid residues, more preferably 50 to 80 amino acid residues, still more preferably 50 to 75 amino acid residues, and further preferably 50 to 70 amino acid residues.
  • the partial sequence includes 32 to 80 amino acid residues including 2 to 5, more preferably 2 to 4 Lys residues on the N-terminal side and C-terminal side of the domain II region of the Aux / IAA family protein.
  • the sequence consisting of is more preferred.
  • FIG. 2 examples of partial sequences of IAA17, IAA16, IAA14, IAA9, IAA27, IAA4, IAA1, IAA2, IAA3, IAA8, IAA5 and IAA6 among the IAA family proteins are shown in FIG. 2 and SEQ ID NOs: 1-12.
  • a sequence comprising 50 to 80 amino acid residues including a sequence selected from these SEQ ID NOs is more preferred, and a sequence comprising 50 to 75 amino acid residues is more preferred.
  • the entire amino acid sequence of IAA17 is shown in SEQ ID NO: 23.
  • the number of linkages of the sequence is preferably 2 to 5, more preferably 2 to 4, and even more preferably 2 or 3.
  • the proteolytic-inducible non-plant eukaryotic cell of the present invention preferably further has a promoter sequence that controls transcription of the chimeric gene.
  • the target protein labeled with the partial sequence of the Aux / IAA family protein can be expressed more reliably.
  • the promoter is not limited and can be appropriately determined according to, for example, the type of cell.
  • the gene of the target protein may be an endogenous gene present in the genome of a non-plant eukaryotic cell or a foreign gene introduced into a non-plant eukaryotic cell.
  • the said foreign gene may be integrated in genomic DNA, for example, and does not need to be integrated.
  • the gene introduction vector is present as a plasmid, and in the gene introduction vector, the target gene is functionally linked to the origin of replication. preferable.
  • the host cell may be any eukaryotic cell other than a plant (non-plant), and examples thereof include cells such as animals, fungi, and protists.
  • animals include mammals such as humans, mice, rats, and rabbits, fish and amphibians such as zebrafish and Xenopus, C.I. and invertebrates such as elegans and Drosophila.
  • the cell type is not limited, for example, cultured cells such as Hela cells, CHO cells, MCF, HEK293, HepG2, NIH3T3, COS cells, DT40; primary cultured cells; hematopoietic stem cells; B cells, T cells, leukocytes Monocytes / macrophages, red blood cells, blood cells such as platelets, blood cells; fertilized oocytes; ES cells and the like.
  • other various tissue cells may be used. Examples of fungi include budding yeast and fission yeast.
  • a mammalian cell when used, it preferably has a Skp1 gene, a Cullin gene, and an Rbx1 gene. Each of these genes is preferably an endogenous gene of a mammalian cell.
  • an SCF complex is produced from proteins expressed from these genes (ie, Skp1 protein, Cullin protein and Rbx1 protein) and TIR1 family proteins expressed from rice-derived TIR1 family genes. Presumed to be composed.
  • the proteolytic inducible non-plant eukaryotic cell production method of the present invention includes, for example, (1) a step of introducing a plant-derived TIR1 family gene into a host eukaryotic cell, and (2) a host eukaryotic cell. This can be performed by introducing a partial sequence of a plant-derived Aux / IAA family gene and forming a chimeric gene that expresses the target protein labeled with the partial sequence of the Aux / IAA family protein.
  • the order of the step (1) and the step (2) is not limited and may be performed simultaneously.
  • the introduction of the plant-derived family gene in the step (1) and the introduction of the partial sequence of the Aux / IAA family gene in the step (2) may be performed using, for example, separate vectors. It is preferable to use one vector into which the derived family gene and the partial sequence of the Aux / IAA family gene are inserted.
  • the target gene may be an endogenous gene present in the genomic DNA of eukaryotic cells or a foreign gene, as described above.
  • a chimeric gene in the step (2), for example, can be formed by introducing a partial sequence of an Aux / IAA family gene into a mammalian cell and operably linking to the endogenous target gene.
  • a chimeric gene in which a partial sequence of the Aux / IAA family gene and the target gene are linked may be formed, introduced into a eukaryotic cell, and inserted into the genome by recombination with the genome.
  • the foreign gene may be introduced into the eukaryotic cell prior to the introduction of the partial sequence of the Aux / IAA family gene.
  • the target gene may be introduced into a eukaryotic cell together with a partial sequence of the Aux / IAA family gene.
  • a chimeric gene in which a partial sequence of the Aux / IAA family gene and the gene of the target protein are functionally linked in advance can be prepared and introduced into eukaryotic cells.
  • target gene is a foreign gene and a TIR1 family gene and a chimeric gene are introduced by recombination using a vector will be described.
  • a plant-derived TIR1 gene is incorporated into a vector to prepare a TIR1 gene introduction vector.
  • the type of vector is not limited, and can be appropriately determined according to, for example, the type of eukaryotic cell. Specific examples include plasmid vectors and virus vectors. Examples of the plasmid vector include pCMV, pcDNA, and pACT. Examples of the viral vector include an adenovirus expression system.
  • the TIR1 gene introduction vector preferably has a promoter sequence that controls transcription of the TIR1 family gene.
  • the promoter is not limited and can be appropriately determined according to, for example, the type of eukaryotic cell. Specific examples include CMV promoter, SV40 promoter, GAL4 binding sequence and the like.
  • the promoter is preferably operably linked upstream (5 ′ side) of the TIR1 family gene. Further, it may be a cell type-specific or organ-specific promoter.
  • a TIR1 family gene having no promoter sequence may be incorporated downstream of an endogenous promoter in a host cell or host animal individual, for example. In this case, the TIR1 family gene may be targeted to a specific gene, for example, or may be randomly incorporated.
  • the TIR1 gene introduction vector may further have a selection marker coding sequence.
  • the selection marker coding sequence is not limited, and includes a sequence encoding a marker such as a known drug resistance marker, fluorescent protein marker, cell surface receptor marker and the like.
  • the drug resistance marker is not limited, and examples thereof include a neomycin resistance marker, a puromycin resistance marker, and a hygromycin resistance marker.
  • the fluorescent protein marker include GFP (Green Fluorescent Protein), EGFP (mutant GFP: Enhanced GFP), and the like.
  • enzyme markers include luciferase and ⁇ -galactosidase.
  • selectable marker coding sequences may be synthesized by PCR or the like according to the sequence, or may be prepared from a commercially available vector having the selectable marker coding sequence.
  • the selection marker in the TIR1 gene introduction vector and the selection marker in the chimeric gene introduction vector are preferably different markers.
  • the TIR1 family gene is functionally linked to, for example, another protein gene or a tag sequence, and is a TIR1 protein labeled with a tag as a protein (for example, a fusion protein) containing the protein and the TIR1 protein. As such, it may be expressed.
  • the target gene and the partial sequence of the plant-derived Aux / IAA family gene are linked to a vector to prepare a vector for introducing a chimeric gene.
  • the chimeric gene is a gene that expresses a target protein labeled with a partial sequence of an Aux / IAA family protein.
  • the position of the target gene and the partial sequence of the Aux / IAA family gene is not limited as long as the labeled protein can be expressed as described above.
  • the partial sequence of the Aux / IAA family gene may be arranged adjacent to the upstream (5 ′ side) or downstream (3 ′ side) of the target gene. A partial sequence of an IAA family gene may intervene.
  • the chimeric gene introduction vector preferably has a promoter sequence that controls transcription of the chimeric gene. Examples of the promoter include those described above.
  • the vector for introducing a chimeric gene may further have a selection marker coding sequence as described above.
  • the aforementioned TIR1 gene introduction vector and chimeric gene introduction vector are introduced into a eukaryotic cell that is a host cell (step (1) and step (2)).
  • the order of introducing both vectors is not limited.
  • the method for introducing the vector is not particularly limited, and can be appropriately determined according to, for example, the type of vector to be used and the type of host cell.
  • Examples of the introduction method include a calcium phosphate precipitation method, a DEAE dextran transfection method, and an electroporation method.
  • methods using a retrovirus vector, an adenovirus vector, and the like can be given.
  • an expression vector into which a TIR1 gene and a chimeric gene are inserted it is efficient to use an expression vector into which a TIR1 gene and a chimeric gene are inserted.
  • IRES ribosome binding site inside mRNA
  • the present inventor efficiently produced an expression vector by linking a rice-derived TIR1 family gene between a virus-derived promoter and IRES, and linking the chimeric gene downstream thereof, and It was found that degradation of the target protein was rapidly induced (see WO 2010/125620 pamphlet).
  • the promoter of this expression vector include CMV promoter, SV40 promoter and the like, and CMV promoter is preferable.
  • the target gene when the target gene is present in the genomic DNA, for example, when the target gene is an endogenous gene of a eukaryotic cell, or the target gene is a foreign gene, it has already been incorporated into the genomic DNA of the eukaryotic cell. In this case, it can be manufactured as follows.
  • an Aux / IAA family gene introduction vector into which a partial sequence of the Aux / IAA family gene is inserted is used.
  • This vector for gene transfer is, for example, a partial sequence of an Aux / IAA family gene at a site where a target protein can be labeled with a partial sequence of an Aux / IAA family protein during protein expression of eukaryotic genomic DNA.
  • the gene introduction vector has a structure in which a target gene in genomic DNA and a partial sequence of the Aux / IAA family gene are functionally linked to form a chimeric gene by recombination with genomic DNA. That's fine.
  • a chimera gene introduction vector can be constructed by a person skilled in the art from, for example, the locus of a target gene in genomic DNA, its sequence, and the like.
  • the target protein is induced to degrade.
  • Degradation of the target protein is reliable and extremely rapid. For example, it is almost completely decomposed in 15 to 30 minutes.
  • the amount of auxin added is not limited and can be appropriately determined according to, for example, the type of auxin.
  • a specific example is 1 ⁇ M to 1 mM, preferably 20 ⁇ M to 500 ⁇ M.
  • auxins examples include 1-naphthalene acetic acid (NAA) and indole-3-acetic acid.
  • NAA 1-naphthalene acetic acid
  • a group of compounds having the same physiological activity as NAA and the like can be mentioned, for example, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 4-chlorophenoxyacetic acid, (2,4,5-trichlorophenoxy) acetic acid.
  • a precursor that has physiological activity of auxin by metabolism can also be used.
  • a substance that is converted to a substance having auxin activity by esterase or ⁇ -oxidase in the host cell is preferable. Specific examples include indole-3-acetic acid methyl ester and indole-3-butyric acid.
  • Auxins may be added to the medium containing the cells.
  • the degradation of the target protein can be promptly induced by the addition of the auxins, the influence of the target protein can be examined by comparing with the case where the auxins are not added. More specifically, a method for suppressing degradation of a newly expressed target protein by adding auxins to the cell to induce degradation of the expressed target protein and then removing the auxin; After the auxins are added to induce the degradation of the expressed target protein, an auxin inhibitor can be added to check the degradation of the newly expressed target protein.
  • Reference example 1 Production of Saccharomyces cerevisiae strain
  • the promoter sequence and gene sequence of the budding yeast used can be found on the SGD website http: // www. yeastgenome. org /.
  • Arabidopsis TIR1-expressing yeast strain (YNK2)
  • the pRS306-GAL plasmid vector was cut with Sal1 and Xho1 and self-ligated.
  • the pRS306-GAL plasmid vector is described in the literature (L. Dury, G. Perkins and J. Diffley “The Cdc4 / 34/53 pathway targets Cdc6p for proteases in bunding yeast,” 1997, 59-59. Yes. Thereby, the SalI site in the multicloning site of the plasmid vector was removed.
  • An Arabidopsis TIR1 gene (TAIR accession No.
  • AT1G04250.1 was amplified by PCR using the following primer set 1 (1785 bp), and the amplified product was cloned into the Spe1-Not1 site of the plasmid vector.
  • the obtained vector is called pMK26.
  • the SalI-BglII fragment was cleaved from the pYM18 plasmid vector to excise the 9Myc tag portion (435 bp), and this was cloned into the SalI-BglII site of the vector pMK26.
  • the pYM18 plasmid vector is described in the literature (C. Janke, M. Magiera, N. Rathfelder, C. Taxis, S. Reber, H. Maekawa, A. Moreno-Borchart, G. Doenges, E. Schroisl, E. Schiebel, E. and Schiebel. M. Knop.
  • the obtained vector is called pMK27.
  • This vector pMK27 was cut with Stu1 inside the URA3 marker, transformed into the budding yeast wild strain W303-1a, and the plasmid vector was inserted into the URA3 site on the budding yeast genome by homologous recombination.
  • the obtained recombinant was designated as an Arabidopsis TIR1 expression strain “YNK2”.
  • YNK2 a vector-derived GAL1-10 promoter is arranged upstream of the TIR1 gene.
  • W303-1a MATa ade2-1 ura3-1 his3-11, 15 trp1-1 leu2-3, 112 can1-100 YNK2 MATa ade2-1 his3-11, 15 trp1-1 leu2-3, 112 can1-100 ura3-1: URA3-GAL1-10 promoter-Arabidopsis TIR1 (pMK27 integrated)
  • Rice TIR1-expressing yeast strain preparation Rice TIR1 gene (NCBI, Accession No. NM_001059194) was PCR amplified from a rice cDNA library with the following primer set 2. The amplified product was cloned into a portion where pMK26 was treated with SpeI and SalI to remove the Arabidopsis TIR1 gene.
  • Reference example 2 Production of Saccharomyces cerevisiae strain (1) Auxin degron (mcm4-ad) strain of endogenous protein Mcm4 A strain was prepared by using the endogenous protein Mcm4 as a target protein for degradation and adding NAA. The endogenous protein Mcm4 is an essential protein involved in DNA replication. Nature Methods, Vol. 6, no. 12, p917 (Dec. 2009) was amplified by PCR using the following primer set 3. Then, using the obtained amplification product, the TIR1 expression strain YNK2 obtained in Reference Example 1 (1) was directly transformed, and by homologous recombination, the MCM4 5 ′ portion on the budding yeast genome was transformed into CUP1 Promoter-IAA17 was introduced. This recombinant is referred to as “YNK14”. The insertion into the genome was confirmed by PCR.
  • Primer 180 (SEQ ID NO: 17) 5'-TTGTCCTTGGCGAGGGTGTAAGGAGATCAGTTCGCCTGAATAACCGTGTCCGTACGCTGCAGGTCGAC-3 '
  • R primer 181 (SEQ ID NO: 18) 5'-TCAATCGAGCCTACATACAGTATTGAATAGTGTTACAAAGCATAAGGATGATCGATGAATTCGAGCTCG-3 '
  • YNK14 MATa ade2-1 his3-11, 15 trp1-1 leu2-3, 112 can1-100 ura3-1: URA3-GAL1-10 promoter-Arabidopsis TIR1 (pMK27 integrated) mcm4: mcm4-ad (kanMX)
  • YNK4 strain was added to YPDCu agar medium (2% peptone, 1% yeast powder, 2% glucose, 0.1 mM CuSO 4 , 2% agar) without NAA and YPGNAA agar medium with NAA ( 2% peptone, 1% yeast powder, 2% galactose, 0.1 mM NAA, 2% agar) and a predetermined number of cells per plate (5 ⁇ 10 5 , 5 ⁇ 10 4 , 5 ⁇ 10 3 5 ⁇ 10 2 , 5 ⁇ 10), and cultured at 24 ° C. for 2 days. Cell growth was observed.
  • Example 1 In Reference Example 2, instead of the full-length tag (1-229) (SEQ ID NO: 23) of IAA17, IAA17 (1-132), IAA17 (1-34), IAA17 (Domain II), IAA17 (128-132) and A recombinant into which IAA17 (65-132) (SEQ ID NO: 1) was introduced was prepared. In the same manner as in Reference Example 2 (2), the obtained recombinant was observed for the ability to induce protein degradation (cell growth) when auxin was not added and auxin was added.
  • FIG. The figure shows the results of culturing at 24 ° C.
  • the number of cells spotted from the left is 5 ⁇ 10 5 , 5 ⁇ 10 4 , 5 ⁇ 10 3 , 5 ⁇ 10 2 , and 5 ⁇ 10 for each strain.
  • the figure on the left side of the figure is a growth image of cells when auxin is not added and the center figure is when auxin is added.
  • the right side is a schematic design of the chimeric gene.
  • FIG. 3 clearly shows that the resolution of IAA17 (1-94) and IAA17 (Domain II) was clearly reduced compared to the case where the full length of IAA17 was used as a degradation tag.
  • the resolution of IAA17 (1-132), IAA17 (28-132) and IAA17 (65-132) is equal to or higher than the total length of IAA17.
  • IAA17 (65-132) Codes part of the short IAA 17.
  • Example 2 Full-length IAA17 or IAA17 (65-132) was added to the C-terminus of Psf2, which is involved in chromosome replication in Saccharomyces cerevisiae.
  • pMK43 has the same sequence as pMK43 for adding full-length IAA and pMK43 for adding IAA17 (65-132), but the full-length IAA17 portion is modified to IAA17 (65-132) using the following primer set: DNA amplification was carried out by PCR using pMK68 as a template.
  • the obtained strain expressing Psd2-IAA17 (65-132) has a predetermined number of cells per plate (5 ⁇ 10 5 , 5 ⁇ 10 4 , 5 ⁇ 10 3 , 5 ⁇ 10 2 , 5 ⁇ 10) and cultured at 24 ° C. for 2 days. Then, cell growth was observed.
  • Example 3 In order to test whether multiple linked IAA17 (65-132) functions more, various modified IAA17 shown in FIG. 5 were added to the C-terminal of Sld3 involved in chromosomal replication in Saccharomyces cerevisiae.
  • the following primers are used for addition: pMK43 for full-length IAA addition, pMK68 for IAA17 (65-132) addition, pMK43 for multiple IAA17 (65-132) addition, but in the full-length IAA17 part PMK74 with 2 ⁇ IAA17 (65-132) and pMK77 with 3 ⁇ IAA17 (65-132) were used as templates.
  • the obtained DNA was purified, it was transformed into the YNK2 strain, and the target DNA was inserted downstream of the SLD2 gene by homologous recombination. Insertion into the genome was confirmed by PCR.
  • the number of cells per plate was a predetermined number (5 ⁇ 10 5 , 5 ⁇ 10 4 , 5 ⁇ 10 3). 5 ⁇ 10 2 , 5 ⁇ 10), and cultured at 24 ° C. for 2 days. Then, cell growth was observed.

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Abstract

　出芽酵母などの宿主を致死させず、また十分な分解能を有する新たなタンパク質誘導性真核細胞及びそれを用いたタンパク質分解誘導方法を提供する。　植物由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子と、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子とを有する、オーキシン類により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞であって、該部分配列が、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインII領域のＮ末端側及びＣ末端側に少なくとも２個ずつのＬｙｓ残基を含む領域からなる配列、又は該配列を２個以上連結してなる配列であることを特徴とするタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞。

Description

真核細胞におけるタンパク質分解誘導方法
　本発明は真核細胞において目的タンパク質の分解を効率良く誘導する方法に関する。
　細胞内で特定のタンパク質の発現量をコントロールすることは、細胞内におけるそのタンパク質の機能及びそのタンパク質が関与する生命現象を解析する上において非常に有用である。この目的のために、これまで別個の原理に基づく複数の方法が開発されている。
　例えば、大腸菌のテトラサイクリン結合性転写抑制因子を利用して、培養細胞内に導入した遺伝子の転写発現をテトラサイクリン依存的に行う方法が知られている（非特許文献１、２）。この原理に基づく転写抑制システムは市販されており、多くの研究者が実際に利用してこれまで成果を上げてきた。しかしながら、この方法は目的遺伝子の転写制御を行う方法であるため、発現抑制を行っても実際のタンパク質が細胞内から除去されるまでに時間がかかる場合が多く、場合によっては、目的タンパク質の部分的発現量低下が二次的な細胞内応答反応を活性化してしまう場合もある。
　同様に培養細胞内で発現抑制を行う方法としてｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡを細胞内に導入し、細胞内のＲＮＡ干渉反応を利用して対象遺伝子産物のｍＲＮＡを分解する方法が知られている。実際にこの方法に基づく製品も多くの会社から発売されている。しかし、この方法もｍＲＮＡレベルでの発現抑制を行うものであるため、発現抑制まで一般に２４～４８時間もの時間を必要とする。また発現抑制の度合いも、対象とする因子やターゲットＲＮＡ配列に依存しており、９０％以上の発現抑制を達成できる可能性はそれほど高くない。
　最近になり、標的タンパク質に分解誘導タグを導入し、そのタグの分解制御を行うことによりタンパク質の発現を制御する方法が実用化され始めてきた。ラパマイシン結合タンパク質ＦＫＢＰ１２を改変したタンパク質は、ラパマイシン類似化合物であるＳｈｉｅｌｄ１に結合すると安定化され、結合しないと不安定化し細胞内で分解される。この性質を利用して、目的タンパク質にこのＦＫＢＰ１２由来タンパク質を融合して、Ｓｈｉｅｌｄ１依存的に発現制御を行う方法が発表された（非特許文献３）。この方法は一般にＳｈｉｅｌｄ１除去により標的タンパク質を４時間程度で分解するとされており、必要なプラスミドセット等が発売されている。この方法ではタンパク質を安定発現させるためにはＳｈｉｅｌｄ１を常に培地に添加する必要があるが、Ｓｈｉｅｌｄ１がラパマイシン類似化合物であるためにその細胞毒性に疑問がある。また、発現抑制に必要な分解時間も４時間程度という点から、細胞周期などの研究にはより素早い分解除去が可能なシステムが望まれてきた。
　かかる実情から本発明者は、植物ホルモンオーキシンによって誘導される植物特異的なタンパク質分解に着目し、この分解経路を出芽酵母や哺乳類細胞に導入し、オーキシンを培地に添加することで１５～３０分というごく短時間で目的タンパク質を分解することにより発現抑制する方法を開発した（特許文献１、２）。
特開２００８－１８７９５８号公報 国際公開第２０１０／１２５６２０号パンフレット
Ｇｏｓｓｅｎ　ａｎｄ　Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，５５４７－５５５１，１９９２ Ｇｏｓｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８，１７６６－１７６９，１９９５ Ｂａｎａｚｙｎｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ．Ｃｅｌｌ，１２６，９９５－１００４，２００６
　しかしながら、前記特許文献１及び２において用いられたタグは、植物Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質であるが、出芽酵母における成育必須の因子にタグを付加すると致死となってしまうことがあること、またこのタグは分解が十分でないためにオーキシンを添加しても表現系がみられない場合もあった。
　従って、本発明の課題は、出芽酵母などの宿主を致死させず、また十分な分解能を有する新たなタンパク質誘導性真核細胞及びそれを用いたタンパク質分解誘導方法を提供するものである。
　そこで、本発明者は、タグとして用いるＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の改変を試み、タグのサイズを縮小化すべく、ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列の利用を検討した。しかしながら、ＩＡＡファミリータンパク質のドメインII領域のみを用いても十分な分解能の向上は見られず、一方ドメインＩを含む部分配列を用いても分解能の向上はみられなかった。そこでさらに検討を続けたところ、全く意外にもＩＡＡファミリータンパク質のドメインII領域のＮ末端側及びＣ末端側に少なくとも２個ずつのＬｙｓ残基を含む領域からなる配列、又はこれを２個以上連結した配列をタグとして用いれば、分解能が飛躍に向上し、かつ宿主を致死させないことを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、植物由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子と、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子とを有する、オーキシン類により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞であって、該部分配列が、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインII領域のＮ末端側及びＣ末端側に少なくとも２個ずつのＬｙｓ残基を含む領域からなる配列、又は該配列を２個以上連結してなる配列であることを特徴とするタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞を提供するものである。
　また、本発明は、宿主非植物真核細胞に、植物由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子と、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子を導入する、オーキシン類により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞の製造法であって、該部分配列が、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインII領域のＮ末端側及びＣ末端側に少なくとも２個ずつのＬｙｓ残基を含む領域からなる配列、又は該配列を２個以上連結してなる配列であることを特徴とするタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞の製造法を提供するものである。
　また、本発明は、植物由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子と、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子とを有する、オーキシン類により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞用の遺伝子導入用ベクターであって、該部分配列が、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインII領域のＮ末端側及びＣ末端側に少なくとも２個ずつのＬｙｓ残基を含む領域からなる配列、又は該配列を２個以上連結してなる配列であることを特徴とするタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞用の遺伝子導入用ベクターを提供するものである。
　さらに本発明は、上記のタンパク質分解誘導性の非植物性真核細胞に、オーキシン類を添加することを特徴とする、該非植物真核細胞における目的タンパク質の分解誘導方法を提供するものである。
　本発明の真核細胞を用いれば、細胞の致死もなく、オーキシン類の添加により短時間で確実にかつ効率的に目的タンパク質の分解が誘導できることから、所定のタンパク質の機能解析、所定のタンパク質の機能をターゲットにした医薬開発等の分野におけるツールとして有用である。
ＩＡＡファミリータンパク質遺伝子の概略図である。 ＩＡＡファミリータンパク質の好ましい部分配列を示す。 各組換体の分解能を示す図である。 各組換体の分解能を示す図である。 各組換体の分解能を示す図である。
　本発明のタンパク質分解誘導性非植物真核細胞は、（１）植物由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子と、（２）植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子とを有する。このＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子と、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子との組み合せは、非植物真核細胞内で植物のユビキチン化酵素複合体に基づく分解経路を形成させたものである。すなわち、動物、植物、菌類等の種々の真核生物において、ユビキチン／プロテアソーム系のタンパク質分解が知られている。この分解システムは、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）－ユビキチン結合酵素（Ｅ２）－ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）という３つの酵素によって、ターゲットタンパク質にユビキチンが結合され、ポリユビキチン化されたターゲットタンパク質がプロテアソームによって特異的に認識され、分解されるシステムである。このユビキチンリガーゼとして、Ｅ３ユビキチン化酵素複合体（ＳＣＦ複合体）が報告されている。このＳＣＦ複合体は、Ｆ－ｂｏｘタンパク質、Ｓｋｐ１タンパク質、Ｃｕｌｌｉｎ－１タンパク質及びＲｂｘ１タンパク質という４つのサブユニットから構成されている。植物のＳＣＦ複合体について、Ｆ－ｂｏｘタンパク質としてＴＩＲ１ファミリータンパク質を有し、これが成長ホルモンであるオーキシンの受容体となっており、オーキシンを受容することによって、オーキシン情報伝達系の抑制因子Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を認識して、前記タンパク質を分解することが、近年解明された。そこで、本発明者は、オーキシンを誘導物質として、植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質により、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列を認識させ、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で標識化した目的タンパク質を分解する系を、植物以外の真核細胞において機能させることに成功したのである。
　本発明のタンパク質分解誘導性非植物細胞であれば、オーキシン類の添加によって、任意の時期に、発現した目的タンパク質を分解できる。つまり、本発明のタンパク質分解誘導性非植物真核細胞によれば、例えば、植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質を含むＳＣＦ複合体及びＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で標識化された目的タンパク質が発現する。このため、オーキシン類の共存下であれば、前記ＳＣＦ複合体の植物由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質がオーキシン類を受容し、これによってＴＩＲ１ファミリータンパク質によるＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列の認識、ならびに、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列へのポリユビキチン化が生じる。そして、プロテアソームによって、ポリユビキチン化Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で標識化された目的タンパク質が分解される。このため、例えば、オーキシン類の添加、無添加によって、発現した目的タンパク質の分解を制御することが可能である。
　本発明に用いられるＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子は、植物由来のものである。ここで植物の種類は制限されないが、例えばシロイヌナズナ、イネ、ヒャクニチソウ、マツ、シダ、ヒメツリガネゴケ等が挙げられる。なお、宿主細胞が哺乳類細胞の場合は、イネが好ましい。当該植物由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子としては、ＴＩＲ１遺伝子、ＡＦＢ１遺伝子、ＡＦＢ２遺伝子、ＡＦＢ３遺伝子、ＦＢＸ１４遺伝子、ＡＦＢ５遺伝子が挙げられるが、ＴＩＲ１遺伝子が特に好ましい。より具体的には、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に登録されているアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００１０５９１９４（ＧｅｎｅＩＤ：４３３５６９６）、Ｏｓ０４ｇ０３９５６００もしくは同データベース登録の、アクセッションＮｏ．ＥＡＹ９３９３３、ＯｓＩ＿１５７０７の遺伝子が好ましい。
　前記植物由来ＴＩＲ１ファミリー遺伝子は、例えば、前記の植物、例えばイネ、シロイヌナズナ等から抽出した天然のＤＮＡでもよいし、遺伝子工学によって合成したＤＮＡであってもよい。また、前記ＴＩＲ１ファミリー遺伝子は、例えば、エキソンとイントロンを含むＤＮＡでもよいし、エキソンからなるｃＤＮＡであってもよい。前記ＴＩＲ１ファミリー遺伝子は、例えば、ゲノムＤＮＡにおける全長配列又はｃＤＮＡにおける全長配列であってもよい。また、前記ＴＩＲ１ファミリー遺伝子は、発現したタンパク質が、ＴＩＲ１ファミリータンパク質として機能する範囲において、ゲノムＤＮＡにおける部分配列又はｃＤＮＡにおける部分配列であってもよい。本発明において、「ＴＩＲ１ファミリータンパク質として機能する」とは、例えば、オーキシン類の存在下で、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列を認識することを意味する。植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質がＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列を認識できれば、前述のようにＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で標識化された目的タンパク質を分解できるからである。この際、本発明のタンパク質分解誘導性非植物真核細胞においては、植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質が、他のサブユニット（Ｓｋｐ１タンパク質、Ｃｕｌｌｉｎタンパク質及びＲｂｘ１タンパク質）とともに、ＳＣＦ複合体（Ｅ３ユビキチン化酵素複合体）を形成していると推測される。
　本発明のタンパク質分解誘導性非植物真核細胞は、前記植物由来ＴＩＲ１ファミリー遺伝子の転写を制御するプロモーター配列をさらに有することが好ましい。これによって、より確実に植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質を発現できる。前記プロモーターは、制限されず、例えば、細胞の種類等に応じて適宜決定できる。
　本発明において、前記キメラ遺伝子は、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で標識化された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子である。発現した目的タンパク質は、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で標識化されていればよく、その形態は制限されないが、例えば、目的タンパク質とＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列とを含む融合タンパク質であることが好ましい。Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列は、例えば、目的タンパク質のＮ末側及びＣ末側のいずれに付加されてもよい。
　また、目的遺伝子とＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の部分配列の位置関係は、制限されず、発現した目的タンパク質が、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で標識化されるように、両遺伝子が機能的に配置されていればよい。具体例として、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の部分配列は、前記目的遺伝子の上流（５’側）又は下流（３’側）に隣接して配置されていることが好ましい。目的タンパク質が発現され、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で標識化される限りにおいて、例えば、目的遺伝子の内部に、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の部分配列が介在してもよい。
　前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子は、植物由来のＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子であれば、その種類は制限されない。前記植物の種類は、制限されないがシロイヌナズナＩＡＡ１７遺伝子が好ましい。Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の具体例としては、例えば、ＩＡＡ１遺伝子、ＩＡＡ２遺伝子、ＩＡＡ３遺伝子、ＩＡＡ４遺伝子、ＩＡＡ５遺伝子、ＩＡＡ６遺伝子、ＩＡＡ７遺伝子、ＩＡＡ８遺伝子、ＩＡＡ９遺伝子、ＩＡＡ１０遺伝子、ＩＡＡ１１遺伝子、ＩＡＡ１２遺伝子、ＩＡＡ１３遺伝子、ＩＡＡ１４遺伝子、ＩＡＡ１５遺伝子、ＩＡＡ１６遺伝子、ＩＡＡ１７遺伝子、ＩＡＡ１８遺伝子、ＩＡＡ１９遺伝子、ＩＡＡ２０遺伝子、ＩＡＡ２６遺伝子、ＩＡＡ２７遺伝子、ＩＡＡ２８遺伝子、ＩＡＡ２９遺伝子、ＩＡＡ３０遺伝子、ＩＡＡ３１遺伝子、ＩＡＡ３２遺伝子、ＩＡＡ３３遺伝子及びＩＡＡ３４遺伝子等が挙げられる。前記タンパク質分解誘導性非植物真核細胞は、いずれか一種の前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の部分配列を有していてもよいし、二種類以上を有していてもよい。例えば、シロイヌナズナ由来のＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の配列は、ＴＡＩＲ（ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）に登録されており、各遺伝子のアクセッションナンバーは、次のとおりである。ＩＡＡ１遺伝子（ＡＴ４Ｇ１４５６０）、ＩＡＡ２遺伝子（ＡＴ３Ｇ２３０３０）、ＩＡＡ３遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４２４０）、ＩＡＡ４遺伝子（ＡＴ５Ｇ４３７００）、ＩＡＡ５遺伝子（ＡＴ１Ｇ１５５８０）、ＩＡＡ６遺伝子（ＡＴ１Ｇ５２８３０）、ＩＡＡ７遺伝子（ＡＴ３Ｇ２３０５０）、ＩＡＡ８遺伝子（ＡＴ２Ｇ２２６７０）、ＩＡＡ９遺伝子（ＡＴ５Ｇ６５６７０）、ＩＡＡ１０遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４１００）、ＩＡＡ１１遺伝子（ＡＴ４Ｇ２８６４０）、ＩＡＡ１２遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４５５０）、ＩＡＡ１３遺伝子（ＡＴ２Ｇ３３３１０）、ＩＡＡ１４遺伝子（ＡＴ４Ｇ１４５５０）、ＩＡＡ１５遺伝子（ＡＴ１Ｇ８０３９０）、ＩＡＡ１６遺伝子（ＡＴ３Ｇ０４７３０）、ＩＡＡ１７遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４２５０）、ＩＡＡ１８遺伝子（ＡＴ１Ｇ５１９５０）、ＩＡＡ１９遺伝子（ＡＴ３Ｇ１５５４０）、ＩＡＡ２０遺伝子（ＡＴ２Ｇ４６９９０）、ＩＡＡ２６遺伝子（ＡＴ３Ｇ１６５００）、ＩＡＡ２７遺伝子（ＡＴ４Ｇ２９０８０）、ＩＡＡ２８遺伝子（ＡＴ５Ｇ２５８９０）、ＩＡＡ２９遺伝子（ＡＴ４Ｇ３２２８０）、ＩＡＡ３０遺伝子（ＡＴ３Ｇ６２１００）、ＩＡＡ３１遺伝子（ＡＴ３Ｇ１７６００）、ＩＡＡ３２遺伝子（ＡＴ２Ｇ０１２００）、ＩＡＡ３３遺伝子（ＡＴ５Ｇ５７４２０）及びＩＡＡ３４遺伝子（ＡＴ１Ｇ１５０５０）。
　本発明は、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列として、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインII領域のＮ末端側及びＣ末端側に少なくとも２個ずつのＬｙｓ残基を含む領域からなる配列、又は該配列を２個以上連結してなる配列を使用する点に特徴がある。このような特定の部分配列を使用することにより、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質全長やドメインII領域等を使用する場合に比べて、目的タンパク質の分解誘導能が向上し、かつ細胞の死亡が抑制され、安定した目的タンパク質分解誘導性が得られる。
　Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質は、図１に示すように全長２５ＫＤａ程度のタンパク質であり、Ｎ末端側からドメインＩ、ドメインII、ドメインIII及びドメインIV等を有する。このうち、ドメインIIだけでも目的タンパク質の分解誘導能の向上はみられず、Ｎ末端からドメインIIまでの配列でも目的タンパク質の分解誘導能の向上はみられない。これに対し、ドメインIIのＮ末端側とＣ末端側に少なくとも２個ずつのＬｙｓ残基を含む領域であって、ドメインＩを含まず、ドメインIIIは一部含んでいてもよい領域からなる配列を使用すれば、目的タンパク質の分解誘導能が顕著に向上する。また、当該配列を２個以上連結した配列を使用すると、目的タンパク質の分解誘導能がさらに向上する。
　このような部分配列としては、３２～８０アミノ酸残基が好ましく、５０～８０アミノ酸残基がより好ましく、５０～７５アミノ酸残基がさらに好ましく、５０～７０アミノ酸残基がさらに好ましい。
　前記部分配列としては、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインII領域のＮ末端側及びＣ末端側に２～５個ずつ、より好ましくは２～４個ずつのＬｙｓ残基を含む３２～８０アミノ酸残基からなる配列がより好ましい。
　ここでＩＡＡファミリータンパク質のうち、ＩＡＡ１７、ＩＡＡ１６、ＩＡＡ１４、ＩＡＡ９、ＩＡＡ２７、ＩＡＡ４、ＩＡＡ１、ＩＡＡ２、ＩＡＡ３、ＩＡＡ８、ＩＡＡ５及びＩＡＡ６の部分配列の例を図２及び配列番号１～１２に示す。本発明においては、これらの配列番号から選ばれる配列を含む５０～８０アミノ酸残基からなる配列がさらに好ましく、５０～７５アミノ酸残基からなる配列がさらに好ましい。なお、ＩＡＡ１７の全アミノ酸配列を配列番号２３に示す。
　また、該配列の連結数は２～５個が好ましく、２～４個がより好ましく、２又は３個がさらに好ましい。
　本発明のタンパク質分解誘導性非植物真核細胞は、さらに、前記キメラ遺伝子の転写を制御するプロモーター配列を有することが好ましい。これによって、より確実に、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で標識化された目的タンパク質を発現できる。前記プロモーターは、制限されず、例えば、細胞の種類等に応じて適宜決定できる。
　本発明において、前記目的タンパク質の遺伝子は、非植物真核細胞のゲノムに存在する内在の遺伝子でもよいし、非植物真核細胞に導入された外来の遺伝子であってもよい。また、前記外来遺伝子は、例えば、ゲノムＤＮＡに組み込まれてもよいし、組み込まれていなくてもよい。前者の場合、例えば、外来遺伝子を連結した遺伝子導入ベクター等によって、ゲノムＤＮＡ中に組み込まれた状態である。また、後者の場合、例えば、前記遺伝子導入用ベクター等が、プラスミドとして存在している状態であり、前記遺伝子導入用ベクターにおいて、前記目的遺伝子は、複製起点に機能的に連結されていることが好ましい。
　本発明において、宿主細胞は、植物以外（非植物）の真核生物の細胞であればよく、例えば、動物、菌類、原生生物等の細胞が挙げられる。動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ等の哺乳類、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル等の魚類や両生類、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓやショウジョウバエ等の無脊椎動物が挙げられる。また、その細胞の種類も制限されず、例えば、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＣＦ、ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ細胞、ＤＴ４０等の培養細胞；初代培養細胞；造血幹細胞；Ｂ細胞、Ｔ細胞、白血球、単球・マクロファージ、赤血球、血小板等の血球系細胞、血液細胞；受精卵母細胞；ＥＳ細胞等が挙げられる。また、その他の各種組織細胞等でもよい。また、菌類としては、例えば、出芽酵母、分裂酵母等が挙げられる。
　本発明において、哺乳類細胞を用いる場合は、Ｓｋｐ１遺伝子、Ｃｕｌｌｉｎ遺伝子、及び、Ｒｂｘ１遺伝子を有することが好ましい。これらの各遺伝子は、哺乳類細胞の内在遺伝子であることが好ましい。本発明のタンパク質分解誘導性哺乳類細胞では、これらの遺伝子から発現したタンパク質（すなわち、Ｓｋｐ１タンパク質、Ｃｕｌｌｉｎタンパク質及びＲｂｘ１タンパク質）と、イネ由来ＴＩＲ１ファミリー遺伝子から発現したＴＩＲ１ファミリータンパク質とから、ＳＣＦ複合体が構成されると推測される。
　本発明のタンパク質分解誘導性非植物真核細胞の製造方法は、例えば（１）宿主である真核細胞に、植物由来ＴＩＲ１ファミリー遺伝子を導入する工程、（２）宿主である真核細胞に、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の部分配列を導入し、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で標識化された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子を形成する工程によって行うことができる。
　本発明において、前記工程（１）及び工程（２）の順序は制限されず、同時に行ってもよい。前記工程（１）における植物由来ファミリー遺伝子の導入と、前記工程（２）におけるＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の部分配列の導入とは、例えば、それぞれ別個のベクターを用いて行ってもよいが、前記植物由来ファミリー遺伝子及び前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の部分配列が挿入された一つのベクターを用いて行うのが好ましい。
　本発明において、目的遺伝子は、前述のように、真核細胞のゲノムＤＮＡに存在する内在遺伝子でもよいし、外来遺伝子であってもよい。前記内在遺伝子の場合、前記工程（２）において、例えば、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の部分配列を哺乳類細胞に導入し、内在の目的遺伝子に機能的に連結させることによってキメラ遺伝子を形成できる。また、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の部分配列と目的遺伝子とを連結させたキメラ遺伝子を形成し、これを真核細胞に導入し、ゲノムとの組換えによりキメラ遺伝子をゲノムに挿入してもよい。
　目的遺伝子が外来遺伝子の場合、例えば、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の部分配列の導入に先立って、外来遺伝子を前記真核細胞に導入してもよい。また、目的遺伝子が外来遺伝子の場合、例えば、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の部分配列とともに、真核細胞に導入してもよい。具体的には、予め、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の部分配列と目的タンパク質の遺伝子とが機能的に連結したキメラ遺伝子を作製し、これを真核細胞に導入することもできる。
　目的遺伝子が外来遺伝子であり、ベクターを用いた組換えによって、ＴＩＲ１ファミリー遺伝子とキメラ遺伝子とを導入する例について説明する。
　まず、植物由来ＴＩＲ１遺伝子をベクターに組み込み、ＴＩＲ１遺伝子導入用ベクターを作製する。ベクターの種類は、制限されず、例えば、真核細胞の種類等に応じて適宜決定できる。具体例として、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。前記プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ、ｐＡＣＴ等が挙げられ、前記ウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルス発現系等が挙げられる。
　ＴＩＲ１遺伝子導入用ベクターは、前記ＴＩＲ１ファミリー遺伝子の転写を制御するプロモーター配列を有することが好ましい。前記プロモーターとしては、制限されず、例えば、真核細胞の種類等に応じて適宜決定できる。具体例としては、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＧＡＬ４結合配列等が挙げられる。前記プロモーターは、通常、ＴＩＲ１ファミリー遺伝子の上流（５’側）に機能的に連結することが好ましい。さらに、細胞種特異的、器官特異的プロモーターでもよい。また、プロモーター配列をもたないＴＩＲ１ファミリー遺伝子を、例えば、宿主細胞や宿主動物個体における内在プロモーターの下流に組み込んでも良い。この場合、ＴＩＲ１ファミリー遺伝子を、例えば、特定遺伝子にターゲッティングしてもよいし、ランダムに組み込んでもよい。
　また、真核細胞への導入の有無を確認できることから、ＴＩＲ１遺伝子導入用ベクターは、さらに、選択マーカーコード配列を有してもよい。前記選択マーカーコード配列としては、制限されず、公知の薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、細胞表面レセプターマーカー等のマーカーをコードする配列が挙げられる。前記薬剤耐性マーカーとしては、制限されず、例えば、ネオマイシン耐性マーカー、ピューロマイシン耐性マーカー、ハイグロマイシン耐性マーカー等が挙げられる。前記蛍光タンパク質マーカーとしては、例えば、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＧＦＰ（変異型ＧＦＰ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ＧＦＰ）等が挙げられる。また、酵素マーカーとしては、例えば、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ等が挙げられる。これらの選択マーカーコード配列は、その配列にしたがってＰＣＲ等により合成してもよいし、前記選択マーカーコード配列を有する市販のベクターから調製することもできる。なお、ＴＩＲ１遺伝子導入用ベクターと後述するキメラ遺伝子導入用ベクターとを併用する場合、前記ＴＩＲ１遺伝子導入用ベクターにおける選択マーカーと、キメラ遺伝子導入用ベクターにおける選択マーカーは、異なるマーカーであることが好ましい。さらに、ＴＩＲ１ファミリー遺伝子は、例えば、他のタンパク質遺伝子又はタグ配列と機能的に連結させ、前記タンパク質とＴＩＲ１タンパク質とを含むタンパク質（例えば、融合タンパク質）として、また、タグで標識化されたＴＩＲ１タンパク質として、発現させてもよい。
　他方、目的遺伝子及び植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の部分配列をベクターに連結して、キメラ遺伝子の導入用ベクターを作製する。キメラ遺伝子とは、前述のように、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で標識化された目的タンパク質を発現する遺伝子である。前記ベクターにおいて、前記目的遺伝子とＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の部分配列との位置は、制限されず、前述のように、標識化タンパク質を発現できる関係であればよい。具体例として、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の部分配列は、前記目的遺伝子の上流（５’側）又は下流（３’側）に隣接して配置されてもよく、目的遺伝子の内部に、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の部分配列が介在してもよい。
　前記ベクターとしては、制限されず、前述と同様のものが挙げられる。また、キメラ遺伝子導入用ベクターは、前記キメラ遺伝子の転写を制御するプロモーター配列を有することが好ましい。前記プロモーターとしては、前述のようなものが挙げられる。また、真核細胞への導入の有無を確認できることから、キメラ遺伝子導入用ベクターは、さらに、前述のような選択マーカーコード配列を有してもよい。
　そして、宿主細胞である真核細胞に、前述のＴＩＲ１遺伝子導入用ベクター、ならびに、キメラ遺伝子導入用ベクターを導入する（工程（１）及び工程（２））。前記両ベクターの導入順序は、制限されない。
　ベクターの導入方法は、特に制限されず、例えば、使用するベクターの種類や宿主細胞の種類等に応じて、適宜決定できる。導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクョン法、エレクトロポレーション法が挙げられ、この他にも、レトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター等を用いた方法が挙げられる。
　本発明においては、ＴＩＲ１遺伝子とキメラ遺伝子とが挿入された発現ベクターを用いるのが、効率的である。具体的には、ウイルス由来のプロモーターとＩＲＥＳ（ｍＲＮＡ内部のリボソーム結合サイト）を有するベクターに、これらの遺伝子を挿入して使用するのが好ましい。通常このようなｐＩＲＥＳベクターは、ウイルス由来のプロモーターとＩＲＥＳの間に発現させようとする目的遺伝子を挿入して使用するように設計されている。しかし、本発明者は、ウイルス由来のプロモーターとＩＲＥＳとの間にイネ由来のＴＩＲ１ファミリー遺伝子を連結し、その下流に前記キメラ遺伝子を連結してなる発現ベクターを作製することにより、効率良く、かつ迅速に目的タンパク質の分解が誘導されることを見出した（国際公開第２０１０／１２５６２０号パンフレット参照）。この発現ベクターのプロモーターとしてはＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等が挙げられるが、ＣＭＶプロモーターが好ましい。
　また、目的遺伝子がゲノムＤＮＡ内に存在する場合、例えば、目的遺伝子が真核細胞の内在遺伝子である場合や、目的遺伝子が外来遺伝子であるが、すでに真核細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれている場合は、次のようにして製造できる。この場合、キメラ遺伝子導入用ベクターに代えて、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の部分配列を挿入したＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子導入用ベクターを使用する。この遺伝子導入用ベクターは、例えば、真核細胞のゲノムＤＮＡに対して、タンパク質発現の際、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で目的タンパク質を標識化できる部位に、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の部分配列が組み込まれる構造であることが好ましい。つまり、前記遺伝子導入用ベクターの構造は、ゲノムＤＮＡとの組換えによって、ゲノムＤＮＡ内の目的遺伝子とＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の部分配列とが機能的連結して、キメラ遺伝子を形成するものであればよい。このようにＡｕｘ／ＩＡＡファミリーの部分配列が組み込まれることによって、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリーの部分配列で標識化された目的タンパク質を発現できる。なお、キメラ遺伝子導入用ベクターは、例えば、ゲノムＤＮＡにおける目的遺伝子の遺伝子座やその配列等から、当業者であれば構築可能である。
　本発明のタンパク質分解誘導性真核細胞にオーキシン類を作用させれば、目的タンパク質の分解が誘導される。その目的タンパク質の分解は、確実でありかつ極めて速やかである。例えば、１５～３０分でほぼ完全に分解される。
　目的タンパク質の分解誘導において、オーキシン類の添加量は、制限されず、例えば、オーキシン類の種類に応じて適宜決定できる。具体例としては、１μＭ～１ｍＭであり、好ましくは２０μＭ～５００μＭ培地に添加する。
　オーキシンとしては、例えば、１－ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、インドール－３－酢酸等が挙げられる。また、この他にも、前記ＮＡＡ等と同様の生理活性を有する化合物群が挙げられ、例えば、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸、４－クロロフェノキシ酢酸、（２，４，５－トリクロロフェノキシ）酢酸、１－ナフタレンアセトアミド、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸、４－パラクロロ酢酸等がある。例えば、代謝によってオーキシンの生理活性を有することとなる前躯体も使用できる。例えば、宿主細胞におけるエステラーゼやβ－酸化酵素によりオーキシン活性を有する物質に変換される物質が好ましい。具体例としては、例えば、インドール－３－酢酸メチルエステルやインドール－３－酪酸等が挙げられる。
　オーキシン類の添加は、前記細胞を含有する培地に対して行えばよい。
　このように、オーキシン類の添加により目的タンパク質の分解が速やかに誘導できるので、オーキシン類を添加しない場合と対比することにより、目的タンパク質の影響を検討することができる。より具体的には、前記細胞にオーキシン類を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、前記オーキシン類を除去して、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する方法；前記細胞にオーキシン類を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、オーキシン阻害物質を添加して、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する方法等によって検討することができる。
　次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。
参考例１
１．出芽酵母株の作製
　分解目的のタンパク質をＥＧＦＰとし、ＮＡＡ添加によってＥＧＦＰを分解する出芽酵母株を作製した。なお、使用した出芽酵母のプロモーター配列や遺伝子配列は、ＳＧＤウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／に登録されている。
（１）シロイヌナズナＴＩＲ１発現酵母株（ＹＮＫ２）
　ｐＲＳ３０６－ＧＡＬプラスミドベクターをＳａｌ１及びＸｈｏ１で切断し、セルフライゲーションさせた。ｐＲＳ３０６－ＧＡＬプラスミドベクターは、文献（Ｌ．Ｄｒｕｒｙ，Ｇ．Ｐｅｒｋｉｎｓ　ａｎｄ　Ｊ．Ｄｉｆｆｌｅｙ“Ｔｈｅ　Ｃｄｃ４／３４／５３　ｐａｔｈｗａｙ　ｔａｒｇｅｔｓ　Ｃｄｃ６ｐ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ　ｉｎ　ｂｕｄｄｉｎｇ　ｙｅａｓｔ”ＥＭＢＯ　Ｊ　１６，５９６６－５９７６，１９９７）に開示されている。これにより、前記プラスミドベクターのマルチクローニングサイトにあるＳａｌＩサイトを除去した。シロイヌナズナのＴＩＲ１遺伝子（ＴＡＩＲ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＴ１Ｇ０４２５０．１）を、下記プライマーセット１を用いたＰＣＲで増幅し（１７８５ｂｐ）、この増幅物を、前記プラスミドベクターのＳｐｅ１－Ｎｏｔ１サイトにクローニングした。得られたベクターを、ｐＭＫ２６という。
＜プライマーセット１＞
Ｆプライマー７（配列番号１３）
５’－ＡＧＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＣＡＧＡＡＧＣＧＡＡＴＡＧＣＣＴＴ－３’
Ｒプライマー８（配列番号１４）
５’－ＡＴＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＡＧＴＣＧＡＣＴＡＡＴＣＣＧＴＴＡＧＴＡＧＴＡＡＴＧＡ－３’
　ｐＹＭ１８プラスミドベクターからＳａｌＩ－Ｂｇｌ II断片を切断して、９Ｍｙｃタグ部分（４３５ｂｐ）を切り出し、これを、前記ベクターｐＭＫ２６のＳａｌＩ－ＢｇｌIIサイトにクローニングした。ｐＹＭ１８プラスミドベクターは、文献（Ｃ．Ｊａｎｋｅ，Ｍ．Ｍａｇｉｅｒａ，Ｎ．Ｒａｔｈｆｅｌｄｅｒ，Ｃ．Ｔａｘｉｓ，Ｓ．Ｒｅｂｅｒ，Ｈ．Ｍａｅｋａｗａ，Ａ．Ｍｏｒｅｎｏ－Ｂｏｒｃｈａｒｔ，Ｇ．Ｄｏｅｎｇｅｓ，Ｅ．Ｓｃｈｗｏｂ，Ｅ．Ｓｃｈｉｅｂｅｌ，ａｎｄ　Ｍ．Ｋｎｏｐ．“Ａ　ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　ｔｏｏｌｂｏｘ　ｆｏｒ　ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ　ｔａｇｇｉｎｇ　ｏｆ　ｙｅａｓｔ　ｇｅｎｅｓ：ｎｅｗ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｍｏｒｅ　ｍａｒｋｅｒｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅｓ．”Ｙｅａｓｔ　２１，９７４－９６２，２００４）に開示されている。得られたベクターをｐＭＫ２７という。このベクターｐＭＫ２７を、ＵＲＡ３マーカー内部にあるＳｔｕ１で切断して、出芽酵母野生株Ｗ３０３－１ａにトランスフォーメーションし、相同組換えによって、前記プラスミドベクターを出芽酵母ゲノム上のＵＲＡ３部位に挿入した。得られた組換え体を、シロイヌナズナＴＩＲ１発現株「ＹＮＫ２」とした。なお、ＹＮＫ２において、ＴＩＲ１遺伝子の上流には、ベクター由来のＧＡＬ１－１０プロモーターが配置されている。
　野生株Ｗ３０３－１ａ及びＹＮＫ２の遺伝型を以下に示す。
Ｗ３０３－１ａ
ＭＡＴａ　ａｄｅ２－１　ｕｒａ３－１　ｈｉｓ３－１１，１５　ｔｒｐ１－１　ｌｅｕ２－３，１１２　ｃａｎ１－１００
ＹＮＫ２
ＭＡＴａ　ａｄｅ２－１　ｈｉｓ３－１１，１５　ｔｒｐ１－１　ｌｅｕ２－３，１１２　ｃａｎ１－１００
ｕｒａ３－１：ＵＲＡ３－ＧＡＬ１－１０　ｐｒｏｍｏｔｅｒ－シロイヌナズナＴＩＲ１（ｐＭＫ２７　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）
イネＴＩＲ１発現酵母株作製法
　イネＴＩＲ１遺伝子（ＮＣＢＩ、アクセッションＮｏ．ＮＭ＿００１０５９１９４）は下記のプライマーセット２でイネｃＤＮＡライブラリーよりＰＣＲ増幅した。増幅した産物はｐＭＫ２６をＳｐｅＩとＳａｌＩで処理してシロイヌナズナＴＩＲ１遺伝子を取り除いた部分にクローニングした。
＜プライマーセット２＞
Ｆプライマー
５’－ＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＡＣＴＴＣＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＴ－３（配列番号１５）
Ｒプライマー
５’－ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＧＡＴＴＴＴＡＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＧＴＧ－３’（配列番号１６）
　シロイヌナズナＴＩＲ１を導入した際と同様の手法で出芽酵母にイネＴＩＲ１を導入した。
＜イネＴＩＲ１発現酵母株の遺伝型＞
ＭＡＴａ　ａｄｅ２－１　ｈｉｓ３－１１，１５　ｔｒｐ１－１　ｌｅｕ２－３，１１２　ｃａｎ１－１００　ｕｒａ３－１：ＵＲＡ３－ＧＡＬ１－１０　ｐｒｏｍｏｔｅｒ－イネＴＩＲ１
参考例２
１．出芽酵母株の作製
（１）内在性蛋白質Ｍｃｍ４のＡｕｘｉｎ　ｄｅｇｒｏｎ（ｍｃｍ４－ａｄ）株
　内在性タンパク質Ｍｃｍ４を分解目的タンパク質とし、ＮＡＡ添加によりこれを分解する株を作製した。内在性タンパク質Ｍｃｍ４は、ＤＮＡ複製に関与する必須タンパク質である。Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１２，ｐ９１７（Ｄｅｃ．２００９）に記載のＰＭＫ４３を、下記プライマーセット３を用いてＰＣＲにより増幅した。そして、得られた増幅物を用いて、直接、前記参考例１（１）で得られたＴＩＲ１発現株ＹＮＫ２にトランスフォーメーションし、相同組換えによって、出芽酵母ゲノム上のＭＣＭ４　５’部分に、ＣＵＰ１プロモーター－ＩＡＡ１７を導入した。この組換え体を、「ＹＮＫ１４」という。なお、ゲノムへの挿入はＰＣＲにより確認した。
＜プライマーセット３＞
Ｆプライマー１８０（配列番号１７）
５’－TTGTCCTTGGCGAGGGTGTAAGGAGATCAGTTCGCCTGAATAACCGTGTCCGTACGCTGCAGGTCGAC－３’
Ｒプライマー１８１（配列番号１８）
５’－TCAATCGAGCCTACATACAGTATTGAATAGTGTTACAAAGCATAAGGATGATCGATGAATTCGAGCTCG－３’
　ＹＮＫ１４の遺伝型を以下に示す。
ＹＮＫ1４
ＭＡＴａ　ａｄｅ２－１　ｈｉｓ３－１１，１５　ｔｒｐ１－１　ｌｅｕ２－３，１１２　ｃａｎ１－１００
ｕｒａ３－１：ＵＲＡ３－ＧＡＬ１－１０　ｐｒｏｍｏｔｅｒ－シロイヌナズナＴＩＲ１（ｐＭＫ２７　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）
ｍｃｍ４：ｍｃｍ４－ａｄ（ｋａｎＭＸ）
２．出芽酵母株の生育実験
　ＹＮＫ４株を、ＮＡＡ未添加のＹＰＤＣｕ寒天培地（２％ペプトン、１％酵母粉末、２％グルコース、０．１ｍＭ　ＣｕＳＯ4、２％寒天）及び、ＮＡＡ添加のＹＰＧＮＡＡ寒天培地（２％ペプトン、１％酵母粉末、２％ガラクトース、０．１ｍＭ　ＮＡＡ、２％寒天）に、プレート１枚あたりの細胞数が所定の数（５×１０5、５×１０4、５×１０3、５×１０2、５×１０個）となるようにスポットし、２４℃で２日間培養した。そして、細胞の生育を観察した。
実施例１
　参考例２において、ＩＡＡ１７の全長タグ（１－２２９）（配列番号２３）に代えて、ＩＡＡ１７（１－１３２）、ＩＡＡ１７（１－３４）、ＩＡＡ１７（ドメインII）、ＩＡＡ１７（１２８－１３２）及びＩＡＡ１７（６５－１３２）（配列番号１）を導入した組換体を作製した。
　得られた組換体を、参考例２（２）と同様にして、オーキシン未添加及びオーキシン添加の場合のタンパク質の分解誘導能（細胞の成育性）を観察した。
　これらの結果を図３に示す。同図は、２４℃における培養結果であり、各株について、左から、スポットした細胞数が５×１０5、５×１０4、５×１０3、５×１０2、５×１０個である。また、図中の左側の図は、オーキシン未添加、中央の図はオーキシン添加の場合の細胞の成育像である。右側は、キメラ遺伝子の設計概略図である。
　図３から、ＩＡＡ１７の全長を分解タグにした場合に比べて、ＩＡＡ１７（１－９４）やＩＡＡ１７（ドメインII）では、分解能が明らかに低下した。一方、ＩＡＡ１７（１－１３２）、ＩＡＡ１７（２８－１３２）及びＩＡＡ１７（６５－１３２）では、ＩＡＡ１７全長と同等又はそれ以上の分解能がみられ、その中ではＩＡＡ１７（６５－１３２）は、一番短いＩＡＡ１７の一部をコードしている。
実施例２
　出芽酵母の染色体複製に関与するＰｓｆ２のＣ末端に、全長のＩＡＡ１７もしくはＩＡＡ１７（６５－１３２）を付加した。付加するためには、下記プライマーセットを用いて全長ＩＡＡ付加にはｐＭＫ４３、ＩＡＡ１７（６５－１３２）付加にはｐＭＫ４３と同様の配列をもつが、全長ＩＡＡ１７部分がＩＡＡ１７（６５－１３２）に改変されているｐＭＫ６８を鋳型としてＰＣＲによりＤＮＡ増幅を行った。
５’－CAGCATCTCTTACCGCTGGTACTGAAAATGATGAAGAAGAATTCAATATTCGTACGCTGCAGGTCGAC－３’（配列番号１９）
５’－AAATACATTCTATGCCCATTAACTAGGATACCACAACAAGTACATATATAATCGATGAATTCGAGCTCG－３’（配列番号２０）
　得られたＤＮＡを精製した後、ＹＮＫ２株にトランスフォーメーションし、相同組換えによりＰＳＦ２遺伝子の下流に目的のＤＮＡを挿入した。ゲノムへの挿入はＰＣＲにより確認を行った。
　しかしながら、全長ＩＡＡ１７を持つ株は作成することができなかった。このことはタグ付加が致死性を引き起こす可能性を示している。一方、同様の方法でＩＡＡ１７（６５－１３２）の付加は問題無く行うことができた。また、得られたＰｓｄ２－ＩＡＡ１７（６５－１３２）を発現する株はプレート１枚あたりの細胞数が所定の数（５×１０5、５×１０4、５×１０3、５×１０2、５×１０個）となるようにスポットし、２４℃で２日間培養した。そして、細胞の成育を観察した。その結果、Ｐｓｄ２－ＩＡＡ１７（６５－１３２）を発現する株はＮＡＡを添加した培地では成育することができなかった（図４、＋ａｕｘｉｎ）。このことは、細胞内でＰｓｆ２－ＩＡＡ１７（６５－１３２）が分解されていることを示している。
実施例３
　複数連結したＩＡＡ１７（６５－１３２）がより機能するかどうか試すために、出芽酵母の染色体複製に関与するＳｌｄ３のＣ末端に図５に示す様々な改変型ＩＡＡ１７を付加した。付加には下記のプライマーを用いて、全長ＩＡＡ付加にはｐＭＫ４３、ＩＡＡ１７（６５－１３２）付加にはｐＭＫ６８、複数個のＩＡＡ１７（６５－１３２）付加にはｐＭＫ４３と同様であるが全長ＩＡＡ１７部分に２×ＩＡＡ１７（６５－１３２）をもつｐＭＫ７４、３×ＩＡＡ１７（６５－１３２）をもつｐＭＫ７７を鋳型として用いた。
５’－ATAGCTCAAAAAGGAGAGTAAGAAGACGTTTATTTGCTCCAGAATCCACACGTACGCTGCAGGTCGAC－３’（配列番号２１）
５’－TTTAATTGTATACTCAAAGGCCCCCGAAGTGCGAAATTGTTGTAGCTTAGATCGATGAATTCGAGCTCG－３’（配列番号２２）
　得られたＤＮＡを精製した後、ＹＮＫ２株にトランスフォーメーションし、相同組換えによりＳＬＤ２遺伝子の下流に目的のＤＮＡを挿入した。ゲノムへの挿入はＰＣＲにより確認を行った。
　得られた株を、ＮＡＡを含む培地（＋ａｕｘｉｎ）もしくはＮＡＡを含まない培地（－ａｕｘｉｎ）においてプレート１枚あたりの細胞数が所定の数（５×１０5、５×１０4、５×１０3、５×１０2、５×１０個）となるようにスポットし、２４℃で２日間培養した。そして、細胞の成育を観察した。
　その結果、図５に示すように、全長ＩＡＡ１７ならびにＩＡＡ１７（６５－１３２）を付加した株は弱い生育阻害しか観察されなかった。このことは、細胞内において、Ｓｌｄ２－ＩＡＡ１７ならびにＳｌｄ２－ＩＡＡ１７（６５－１３２）の分解が十分に効率的ではないことを示している。一方、２×ＩＡＡ１７（６５－１３２）、３×ＩＡＡ１７（６５－１３２）を付加した場合、その数の増加に応じて生育阻害が強くなることが明らかになった。このことは、複数個のＩＡＡ１７（６５－１３２）がもとの全長ＩＡＡ１７やＩＡＡ１７（６５－１３２）よりも分解効率が高いということを示している。

Claims (10)

  1. 　植物由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子と、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子とを有する、オーキシン類により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞であって、該部分配列が、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインII領域のＮ末端側及びＣ末端側に少なくとも２個ずつのＬｙｓ残基を含む領域からなる配列、又は該配列を２個以上連結してなる配列であることを特徴とするタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞。
  2. 　前記部分配列が、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインII領域のＮ末端側及びＣ末端側に２～５個ずつのＬｙｓ残基を含む３２～８０アミノ酸残基からなる配列、又は該配列を２～４個連結してなる配列である請求項１記載のタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞。
  3. 　前記部分配列が、配列番号１～１２から選ばれる配列を含む５０～８０アミノ酸残基からなる配列、又は該配列を２～４個連結してなる配列である請求項１又は２記載のタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞。
  4. 　宿主非植物真核細胞に、植物由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子と、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子を導入する、オーキシン類により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞の製造法であって、該部分配列が、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインII領域のＮ末端側及びＣ末端側に少なくとも２個ずつのＬｙｓ残基を含む領域からなる配列、又は該配列を２個以上連結してなる配列であることを特徴とするタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞の製造法。
  5. 　前記部分配列が、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインII領域のＮ末端側及びＣ末端側に２～５個ずつのＬｙｓ残基を含む３２～８０アミノ酸残基からなる配列、又は該配列を２～４個連結してなる配列である請求項４記載のタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞の製造法。
  6. 　前記部分配列が、配列番号１～１２から選ばれる配列を含む３２～８０アミノ酸残基からなる配列、又は該配列を２～４個連結してなる配列である請求項４又は５記載のタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞の製造法。
  7. 　植物由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子と、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分配列で標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子とを有する、オーキシン類により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞用の遺伝子導入用ベクターであって、該部分配列が、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインII領域のＮ末端側及びＣ末端側に少なくとも２個ずつのＬｙｓ残基を含む領域からなる配列、又は該配列を２個以上連結してなる配列であることを特徴とするタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞用の遺伝子導入用ベクター。
  8. 　前記部分配列が、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインII領域のＮ末端側及びＣ末端側に２～５個ずつのＬｙｓ残基を含む３２～８０アミノ酸残基からなる配列、又は該配列を２～４個連結してなる配列である請求項７記載のタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞用の遺伝子導入用ベクター。
  9. 　前記部分配列が、配列番号１～１２から選ばれる配列を含む３２～８０アミノ酸残基からなる配列、又は該配列を２～４個連結してなる配列である請求項７又は８記載のタンパク質分解誘導性の非植物真核細胞用の遺伝子導入用ベクター。
  10. 　請求項１～３のいずれか１項記載の非植物性真核細胞に、オーキシン類を添加することを特徴とする、該非植物真核細胞における目的タンパク質の分解誘導方法。
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