JP5250811B2 - タンパク質分解誘導性細胞、その製造方法、および、タンパク質分解の制御方法 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Description
John S.Schneekloth et al.J.AM.CHEM.SOC.2004,126,3748−3754 Banaszynski et al.Cell 126,995−1004 Dharmasiri et al.Nature 2005,435、441−445 Kepinski and Leyser Nature 2005,435,446-451 Zenser et al. PNAS 98 2006,11795-11800
(I)前記真核細胞に、植物由来TIR1ファミリータンパク質の遺伝子を導入する工程
(II)前記真核細胞に、植物由来Aux/IAAファミリータンパク質の遺伝子を導入し、Aux/IAAファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子を形成する工程
(1)植物由来TIR1ファミリータンパク質の遺伝子を含む、植物以外の真核細胞
(2)植物由来Aux/IAAファミリータンパク質の遺伝子を含み、前記(1)の真核細胞に導入されることによって、前記Aux/IAAファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するベクター
(A)本発明のタンパク質分解制御細胞を準備する工程
(B)下記(b1)〜(b4)の少なくとも一つの処理によって、前記細胞における目的タンパク質の分解を制御する工程
(b1)前記細胞に誘導物質を添加することによって、発現した目的タンパク質の分解を誘導する
(b2)前記細胞に誘導物質を添加しないことによって、発現した目的タンパク質の分解を抑制する
(b3)前記細胞に誘導物質を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、さらに、前記誘導物質を除去して、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する
(b4) 前記細胞にオーキシン類を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、さらに、オーキシン阻害物質を添加して、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する
本発明のタンパク質分解誘導性細胞は、前述のように、誘導物質により目的タンパク質の分解が誘導される細胞であって、前記誘導物質が、オーキシン類であり、前記細胞が、非植物の真核細胞であり、前記真核細胞が、植物由来TIR1ファミリータンパク質の遺伝子と、植物由来Aux/IAAファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子とを有することを特徴とする。以下、前記TIR1ファミリータンパク質の遺伝子を「TIR1ファミリー遺伝子」、Aux/IAAファミリータンパク質の遺伝子を「Aux/IAAファミリー遺伝子」、Aux/IAAファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を「標識化目的タンパク質」、目的タンパク質の遺伝子を「目的遺伝子」という。なお、「Aux/IAA」とは、「auxin/indole−3−acetic acid」の略であり、Aux/IAAファミリータンパク質は、一般に、転写因子ARFファミリ-に結合することで、それらによる転写活性化を阻害するタンパク質として知られている。
本発明のタンパク質分解誘導性細胞の製造方法は、特に制限されないが、例えば、本発明の製造方法があげられる。すなわち、本発明のタンパク質分解誘導性細胞の製造方法は、前述のように、目的の細胞が、非植物の真核細胞であり、下記工程(I)および(II)を含むことを特徴とする。
(I)宿主である前記真核細胞に、植物由来TIR1ファミリー遺伝子を導入する工程
(II)宿主である前記真核細胞に、植物由来Aux/IAAファミリー遺伝子を導入し、前記Aux/IAAファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子を形成する工程
本実施形態は、目的遺伝子が外来遺伝子であり、ベクターを用いた組換えによって、TIR1ファミリー遺伝子とキメラ遺伝子とを導入する例である。
本実施形態は、目的遺伝子が真核細胞のゲノムDNA内に存在する場合の製造方法の一例である。目的遺伝子がゲノムDNA内に存在する形態としては、例えば、目的遺伝子が真核細胞の内在遺伝子である場合や、目的遺伝子が外来遺伝子であるが、すでに真核細胞のゲノムDNAに組み込まれている場合等があげられる。なお、特に示さない限りは、前記第1の実施形態と同様にして製造できる。
本発明のタンパク質分解誘導性細胞の製造方法は、例えば、本発明のキットを用いて行うことができる。このようなキットを使用することによって、より簡便に、本発明のタンパク質分解誘導性細胞を製造できる。
(1)植物由来TIR1ファミリーの遺伝子を含む、植物以外の真核細胞
(2)植物由来Aux/IAAファミリーの遺伝子を含み、前記(1)の真核細胞に導入されることによって、Aux/IAAファミリーのタンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するベクター
本発明のタンパク質分解誘導性細胞は、例えば、以下のような方法によってタンパク質の分解を制御できる。すなわち、本発明の分解制御方法は、誘導物質により細胞における目的タンパク質の分解を制御する分解制御方法であって、前記誘導物質が、オーキシンおよびオーキシン誘導体の少なくとも一方であり、下記工程(A)および(B)を含むことを特徴とする。
(A)本発明のタンパク質分解制御細胞を準備する工程
(B)下記(b1)〜(b4)の少なくとも一つの処理によって、前記細胞における目的タンパク質の分解を制御する工程
(b1)前記細胞にオーキシン類を添加することによって、発現した目的タンパク質の分解を誘導する
(b2)前記細胞にオーキシン類を添加しないことによって、発現した目的タンパク質の分解を抑制する
(b3)前記細胞にオーキシン類を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、さらに、前記オーキシン類を除去して、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する
(b4) 前記細胞にオーキシン類を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、さらに、オーキシン阻害物質を添加して、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する
本発明のモデル動物は、誘導物質により目的タンパク質の分解が誘導されるモデル動物であって、前記モデル動物が、ヒト以外の動物であって、前記誘導物質が、前記誘導物質が、オーキシンおよびオーキシン誘導体の少なくとも一方であり、本発明のタンパク質誘導細胞を含むことを特徴とする。
(1’)植物由来TIR1ファミリーの遺伝子を含む、動物個体
(2’)植物由来Aux/IAAファミリーの遺伝子を含み、前記(1)の真核細胞に導入されることによって、Aux/IAAファミリーのタンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するベクター
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。
分解目的のタンパク質をEGFPとし、NAA添加によってEGFPを分解する出芽酵母株を作製した。なお、使用した出芽酵母のプロモーター配列や遺伝子配列は、SGDウェブサイトhttp://www.yeastgenome.org/に登録されている。
pRS306−GALプラスミドベクターをSal1およびXho1で切断し、セルフライゲーションさせた。pRS306−GALプラスミドベクターは、文献(L.Drury,G.Perkins and J.Diffley“The Cdc4/34/53 pathway targets Cdc6p for proteolysis in budding yeast”EMBO J 16,5966−5976,1997)に開示されている。これにより、前記プラスミドベクターのマルチクローニングサイトにあるSalIサイトを除去した。シロイヌナズナのTIR1遺伝子(TAIR accession No.AT1G04250.1)を、下記プライマーセット1を用いたPCRで増幅し(1785bp)、この増幅物を、前記プラスミドベクターのSpe1−Not1サイトにクローニングした。得られたベクターを、pMK26という。
<プライマーセット1>
Fプライマー7(配列番号26)
5’−AGCTAGACTAGTATGCAGAAGCGAATAGCCTT−3’
Rプライマー8(配列番号27)
5’−ATCGATGCGGCCGCAGATCTGCTAGTCGACTAATCCGTTAGTAGTAATGA−3’
W303−1a
MATa ade2−1 ura3−1 his3−11,15 trp1−1 leu2−3,112 can1−100
YNK2
MATa ade2−1 his3−11,15 trp1−1 leu2−3,112 can1−100
ura3−1::URA3−GAL1−10 promoter−TIR1 (pMK27 integrated)
出芽酵母野生株W303−1aから抽出したゲノムDNAを鋳型として、下記プライマーセットを用いたPCRにより、ADH1プロモーター(706bp)を増幅した。増幅したADH1プロモーターを、pRS304プラスミドベクターのBamH1−EcoR1サイトにクローニングした。得られたベクターをpRS304−ADH1という。なお、pRS304プラスミドベクターは、文献(R.Sikorski and P.Hieter“A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.”Genetics,122,19−27,1989)に開示されている。
<プライマーセット2>
Fプライマー142(配列番号28)
5’−ACGTATGGATCCGGGTGTACAATATGGACTTCCTC−3’
Rプライマー143(配列番号29)
5’−ACGTATGAATTCTGTATATGAGATAGTTGATTGTATGC−3’
<プライマーセット3>
Fプライマー139(配列番号30)
5’−CCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT−3’
Rプライマー140(配列番号31)
5’−CCGCTCGAGCACCTTTCTCTTCTTCTTGGGCACCTTTCTCTTCTTCTTGGGCACCTTTCTCTTCTTCTTTGGGCCTCCTCCTCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA−3’
<プライマーセット4>
Fプライマー143(配列番号32)
5’−ACGTATGGGCCCGGAGCTGGTGCAGGCGCTGGAGCGGGTGCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC−3’
Rプライマー144(配列番号33)
5’−ACGTATGGTACCTCACACCTTTCTCTTCTTCTTGGGC−3’
<プライマーセット5>
Fプライマー145(配列番号34)
5’−ACGTATGTCGACATGATGGGCAGTGTCGAGCTG−3’
Rプライマー146(配列番号35)
5’−ACGTATCTCGAGAGCTCTGCTCTTGCACTTCTC−3’
YNK3
MATa ade2−1 his3−11,15 trp1−1 leu2−3,112 can1−100
ura3−1::URA3−ADH1−TIR1
trp1−1::TRP1− ADH1 promoter−IAA17−EGFP (pRS304−ADH1−IAA17−EGFP integrated)
細胞株を、YPR培地(2%ペプトン、1%酵母粉末、2%ラフィノース)で25℃一晩前々培養した。得られた培養細胞を新たなYPR培地で希釈し、さらに、1×107cell/mlとなるまで前培養した。なお、前培養後に、培養液のサンプリングを行った。そして、前培養した培養細胞を遠心分離によって回収した。得られた培養細胞をYPG培地(2%ペプトン、1%酵母粉末、2%ラフィノース)に移し、さらに、25℃で40min、本培養し、TIR1の発現を誘導した。なお、TIR1発現誘導後の培養液のサンプリングを行った。そして、さらに、前記培地に終濃度0.5mMとなるように0.5M NAA(ナフタレン酢酸)を添加し、所定の時間(0、1、2、3時間)に培養液のサンプリングを行った。
サンプリングした培養液10mLを遠心分離によって集菌し、TCA法により全タンパク質を抽出した。抽出したタンパク質をSDS−PAGEで分離した後、ニトロセルロースメンブレンに転写した。抗Myc抗体(マウスモノクローナル9E10)、抗GFP抗体(マウスモノクローナル 9E1)、抗Skp1抗体(ヤギポリクローナル yC−20 Santa Cruz Biotechnology)を用いて、ウェスタンブロッティングにより、各種タンパク質の検出を行った。なお、二次抗体として、HRP標識されたIgG抗体を使用した。泳動コントロールとして、ポンソー染色により、全抽出タンパク質を検出した。シロイヌナズナTIR1遺伝子には9Mycタグを付加していることから、前記Myc抗体とのウェスタンブロッティングにより、TIR1タンパク質を検出できる。また、複合タンパク質における分解対象タンパク質EGFPは、GFP抗体とのウェスタンブロッティングにより検出できる。SkpI抗体により、Skp1タンパク質が検出できる。このSkp1タンパク質は、TIR1タンパク質とともにオーキシン受容体であるSCF複合体を構成することから、その検出によってSCF複合体の形成を確認できる。
サンプリングした培養液1mLに、8%パラホルムアルデヒド1mLを加え、10分間固定した後、前記培養液中の培養細胞をPBSで洗浄した。この培養細胞を共焦点顕微鏡により観察し、EGFPの有無を確認した。
(1)NAA添加によるEGFPの分解
NAAを添加した各培養液サンプルについてウェスタンブロット解析を行った結果を、図1に示す。同図において、「R」は、前培養用のサンプルであり、「0」は、NAA添加直後(0時間)のサンプル、「1」は、NAA添加1時間後のサンプル、「2」は、NAA添加2時間後のサンプル、「3」は、NAA添加3時間後のサンプルである。また、「−NAA」は、NAA無添加のネガティブコントロールの結果であり、「+NAA」は、NAA添加の結果である(以下、他の図においても同様)。「IAA17−EGFP−3NLS」は、IAA17とEGFPと3NLSとを含む融合タンパク質を示し、「Skp1」は、Skp1タンパク質を示し、「Tir1」は、TIR1タンパク質を示す(以下、他の図においても同様)。
添加したNAAを除去した各培養液サンプルについてウェスタンブロット解析を行った結果を、図3に示す。同図において、「R」は、前培養のサンプルであり、「G」は、TIR1発現誘導後のサンプルである。また、「0」は、NAA除去後(0時間)のサンプル、「1」は、NAA除去1時間後のサンプル、「2」は、NAA除去2時間後のサンプル、「3」は、NAA添加3時間後のサンプルである。
(3)Minimal IAA17(13aa)−EGFP−3NLS発現株
IAAコード遺伝子として、IAA17ドメインIIの13アミノ酸領域のコード配列を使用した発現株を作製した。まず、シロイヌナズナのゲノムDNAを鋳型として、下記プライマーセット6を用いたPCRによって、IAA17ドメインIIの13アミノ酸領域(QVVGWPPVRSYRK)のコード領域を増幅した(39bp)。他方、前記(2)で作製したベクターpRS304−ADH1−IAA17−EGFPをSalI−ApaIで処理し、IAA17のコード領域を除去し、この部分に、前述の増幅物をクローニングした。このベクターを、pRS304−ADH1−minimal IAA17 (13aa)−EGFP−3NLSという。
<プライマーセット6>
Fプライマー212(配列番号36)
5’−ACGTATGGGCCCCTTCCGGTATGATCTCACCG−3’
Rプライマー213(配列番号37)
5’−ACGTATGTCGACATGCAAGTTGTGGGATGGCCACC−3’
YNK5
MATa ade2−1 his3−11,15 trp1−1 leu2−3,112 can1−100
ura3−1::URA3−ADH1−TIR1
trp1−1::TRP1− ADH1 promoter−minimal IAA17 (13aa)−EGFP (pRS304−ADH1−minimal IAA17 (13aa)−EGFP−3NLS integrated)
この結果を図4に示す。また、同図には、前記実施例1で作製したIAA17−EGFP−3NLS発現株(YNK3)の結果をあわせて示す。同図において、左4レーンが、YNK3の結果、右4レーンがYNK5の結果である。また、「Minimal IAA17(13aa)−EGFP−3NLS」は、IAA17の13アミノ酸領域とEGFPと3NLSとを含む融合タンパク質を示す。
(4)内在性蛋白質Mcm4のAuxin degron(mcm4−ad)株
内在性タンパク質Mcm4を分解目的タンパク質とし、NAA添加によりこれを分解する株を作製した。内在性タンパク質Mcm4は、DNA複製に関与するタンパク質である。
<プライマーセット7>
Fプライマー142(配列番号38)
5’−ACGTATGAATTCTGTATATGAGATAGTTGATTGTATGC−3’
Rプライマー172(配列番号39)
5’−ATACGTGGTACCGAGCTCTGGCACCCGCTCCAGCGCCTGCACCAGCTCCCAAGTCCTTAGATTCAATTTGAAGTTCTTCCTCGAGAGCTCTGCTCTTGCACTTCTC−3’
<プライマーセット8>
Fプライマー180(配列番号40)
5’−TTCTTTAAGAACATCTTCAATACTAAATAAGACAACCCATCTTCAGTTATATTAAGGCGCGCCAGATCTG−3’
Rプライマー181(配列番号41)
5’−GAGCTGGAGTTATTATCCTCTTTTGTTGGAGAGCTAGACTGTTGAGACATGGCACCCGCTCCAGCGCCTG−3’
YNK4
MATa ade2−1 his3−11,15 trp1−1 leu2−3,112 can1−100
ura3−1::URA3−GAL1−10 promoter−TIR1 (pMK27 integrated)
mcm4::CUP1 promoter−mcm4−ad (kanMX)
YNK4株を、NAA未添加のYPDCu寒天培地(2%ペプトン、1%酵母粉末、2%グルコース、0.1mM CuSO4、2%寒天)および、NAA添加のYPGNAA寒天培地(2%ペプトン、1%酵母粉末、2%ガラクトース、0.1mM NAA、2%寒天)に、プレート1枚あたりの細胞数が所定の数(3.3×105、3.3×104、3.3×103、3.3×102、3.3×10個)となるようにスポットし、25℃で二日間培養した。そして、細胞の成育を観察した。コントロールとして、出芽酵母野生株W303−1aおよび実施例1で作製したYNK2株についても同様に生育を観察した。
Claims (15)
- 誘導物質により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解誘導性細胞であって、
前記誘導物質が、オーキシン誘導体である1−ナフタレン酢酸であり、
前記細胞が、ヒト受精卵、ならびに、ヒト胚およびヒト個体内の細胞を除く非植物の真核細胞であり、
前記真核細胞が、シロイヌナズナ由来TIR1ファミリータンパク質の遺伝子と、植物由来Aux/IAAファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子とを有することを特徴とするタンパク質分解誘導性細胞。 - 前記Aux/IAAファミリータンパク質の遺伝子が、IAA1遺伝子、IAA2遺伝子、IAA3遺伝子、IAA4遺伝子、IAA5遺伝子、IAA6遺伝子、IAA7遺伝子、IAA8遺伝子、IAA9遺伝子、IAA10遺伝子、IAA11遺伝子、IAA12遺伝子、IAA13遺伝子、IAA14遺伝子、IAA15遺伝子、IAA16遺伝子、IAA17遺伝子、IAA18遺伝子、IAA19遺伝子、IAA20遺伝子、IAA26遺伝子、IAA27遺伝子、IAA28遺伝子、IAA29遺伝子、IAA30遺伝子、IAA31遺伝子、IAA32遺伝子、IAA33遺伝子およびIAA34遺伝子からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項1記載のタンパク質分解誘導性細胞。
- 前記Aux/IAAファミリータンパク質の遺伝子が、Aux/IAAファミリータンパク質のドメインII領域に対応する、前記Aux/IAAファミリータンパク質の遺伝子の部分配列である、請求項1または2記載のタンパク質分解誘導性細胞。
- 前記Aux/IAAファミリータンパク質の遺伝子が、シロイヌナズナ由来の遺伝子である、請求項1から3のいずれか一項に記載のタンパク質分解誘導性細胞。
- 前記TIR1ファミリータンパク質の遺伝子が、TIR1遺伝子、AFB1遺伝子、AFB2遺伝子、AFB3遺伝子、FBX14遺伝子およびAFB5遺伝子の少なくとも一つである、請求項1から4のいずれか一項に記載のタンパク質分解誘導性細胞。
- 前記目的タンパク質の遺伝子が、前記真核細胞のゲノムに存在する内在の遺伝子、または、前記真核細胞に導入された外来の遺伝子である、請求項1から5のいずれか一項に記載のタンパク質分解誘導性細胞。
- 前記真核細胞が、哺乳類動物の細胞または酵母細胞である、請求項1から6のいずれか一項に記載のタンパク質分解誘導性細胞。
- 誘導物質により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解誘導性細胞の製造方法であって、目的の細胞が、ヒト受精卵、ならびに、ヒト胚およびヒト個体内の細胞を除く非植物の真核細胞であり、下記工程(I)および(II)を含むことを特徴とする製造方法。
(I)宿主細胞である前記真核細胞に、シロイヌナズナ由来TIR1ファミリータンパク質の遺伝子を導入する工程
(II)宿主細胞である前記真核細胞に、植物由来Aux/IAAファミリータンパク質の遺伝子と目的タンパク質とを連結したキメラ遺伝子を導入する工程 - 前記Aux/IAAファミリータンパク質の遺伝子が、IAA1遺伝子、IAA2遺伝子、IAA3遺伝子、IAA4遺伝子、IAA5遺伝子、IAA6遺伝子、IAA7遺伝子、IAA8遺伝子、IAA9遺伝子、IAA10遺伝子、IAA11遺伝子、IAA12遺伝子、IAA13遺伝子、IAA14遺伝子、IAA15遺伝子、IAA16遺伝子、IAA17遺伝子、IAA18遺伝子、IAA19遺伝子、IAA20遺伝子、IAA26遺伝子、IAA27遺伝子、IAA28遺伝子、IAA29遺伝子、IAA30遺伝子、IAA31遺伝子、IAA32遺伝子、IAA33遺伝子およびIAA34遺伝子からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項8に記載の製造方法。
- 前記Aux/IAAファミリータンパク質の遺伝子が、Aux/IAAファミリータンパク質のドメインII領域に対応する、前記Aux/IAAファミリータンパク質の遺伝子の部分配列である、請求項8または9記載の製造方法。
- 前記Aux/IAAファミリータンパク質の遺伝子が、シロイヌナズナ由来の遺伝子である、請求項8〜10のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記TIR1ファミリータンパク質の遺伝子が、TIR1遺伝子、AFB1遺伝子、AFB2遺伝子、AFB3遺伝子、FBX14遺伝子、および、AFB5遺伝子の少なくとも一つである、請求項8〜11のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記真核細胞が、哺乳類動物の細胞または酵母細胞である、請求項8〜12のいずれか一項に記載の製造方法。
- 請求項8〜13のいずれか一項に記載のタンパク質分解誘導性細胞の製造方法に使用するキットであって、下記(1)の宿主細胞および下記(2)の遺伝子導入用ベクターを含むことを特徴とするキット。
(1)シロイヌナズナ由来TIR1ファミリーの遺伝子を含む、ヒト受精卵、ならびに、ヒト胚およびヒト個体内の細胞を除く植物以外の真核細胞
(2)植物由来Aux/IAAファミリータンパク質の遺伝子と目的タンパク質とを連結したキメラ遺伝子を含む発現ベクター - 誘導物質により細胞における目的タンパク質の分解を誘導する、タンパク質の分解制御方法であって、前記誘導物質が、オーキシン誘導体である1−ナフタレン酢酸であり、下記工程(A)および(B)を含むことを特徴とする誘導方法。
(A)請求項1から7のいずれか一項に記載のタンパク質分解制御細胞を準備する工程
(B)下記(b1)〜(b4)の少なくとも一つの処理によって、前記細胞における目的タンパク質の分解を制御する工程
(b1)前記細胞に誘導物質を添加することによって、発現した目的タンパク質の分解を誘導する
(b2)前記細胞に誘導物質を添加しないことによって、発現した目的タンパク質の分解を抑制する
(b3)前記細胞に誘導物質を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、さらに、前記誘導物質を除去して、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する
(b4) 前記細胞に1−ナフタレン酢酸を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、さらに、オーキシン阻害物質を添加して、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する
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