JP2009520488A - ミトコンドリアをターゲティングするポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
ミトコンドリアは、エネルギー代謝、アポトーシス及び老化に中心的な役割を果たす真核細胞において見られる細胞器官である。ミトコンドリアは特異なミトコンドリアゲノムを含み、ヒトミトコンドリアは、酸化的リン酸化機構の必須成分をコードするそれ自身の16,569bpのDNA(mtDNA)の2〜10個のコピーを含む。これによって、ミトコンドリアは、タンパク質がミトコンドリア中で直接合成されるという点で核とはほとんど無関係なものとなる。ミトコンドリアDNAは、イントロンを有さない遺伝子を含む環状の2本鎖分子であるという点で、原核生物のDNAに似ており;更にその遺伝暗号は、「正常」な普遍的遺伝暗号とは異なる。
Bibikova et al.(2002)Genetics 161:1169−1175 Lloyd et al.(2005)PNAS 102:2232−2237 Porteus and Baltimore(2003)Science 300:763 Bibikova et al.(2003)Science 300:764 Urnov et al.(2005)Nature 435:646−651
本発明者らは、ミトコンドリアに対してあらゆる所望のポリペプチドを標的とすることが、単にそれにミトコンドリアターゲティング配列(MTS)を融合することによってでは可能ではないことを発見した。転写因子等のDNA結合性ポリペプチドが包含される多くのポリペプチドは、細胞過程におけるそれらの正常な役割に適するように、核局在化の方へ強く偏ると思われる。MTSの使用は、ミトコンドリアの環境に異種のDNA結合性ポリペプチドの送達に十分でないと思われる。
(a)mtDNA中の特異的部位(即ち、標的配列)と結合するDNA結合性ポリペプチド;
(b)機能的ドメインのエフェクター分子;
(c)ミトコンドリアターゲティング配列(MTS);及び
(d)核外移行配列(NES)、を含む融合タンパク質が提供される。
(a)本発明の第1の態様による核酸構築物を調製すること;及び
(b)核酸構築物を真核細胞内に導入すること、を含み、前記構築物が発現して前記ポリペプチドを産生し、そして前記ポリペプチドがミトコンドリアに入るような方法が提供される。
特に定義されない限り、本明細書に用いられる全ての技術的及び科学的な用語は、当業者(例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技法及び生化学における)によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。分子的、遺伝子的及び生化学的な方法(本明細書に参照により組み込まれるSambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.and Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology(1999)4th Ed(and periodic supplements);John Wiley&Sons,Inc.を一般に参照されたい)、化学法、医薬製剤及び患者への送達及び患者の治療のために標準的技法が用いられる。
「DNA結合性ポリペプチド」という用語には、核酸と結合又は会合し得る任意のポリペプチドが包含される。この結合又は会合は、任意の種類の可逆的又は不可逆的な会合を介することができる。「DNA結合性ポリペプチド」という用語は、本明細書において広範囲に使用される。しかしながら、DNA以外の他のタイプの核酸が関連していてもよい。従って、一般に上記の用語は「核酸結合分子」という用語と置き換えることができるということが意図される。核酸は、一般にRNA又はDNAであり、2本鎖又は1本鎖である。しかしながら、本発明の好ましい一態様において、「DNA」に対する参照は、文字通りの意味のデオキシリボ核酸を意味し、特に本発明に記載のDNA結合性タンパク質についての標的であるミトコンドリア(mt)DNAを指す。ポリペプチドは、更にミトコンドリアRNAを標的とすることができる。
B.エフェクター分子及び機能的ドメイン
本発明によれば、ミトコンドリアの効果を媒介するために、エフェクター分子又は機能的ドメインが好ましくはDNA結合性タンパク質に融合される。本発明のDNA結合性タンパク質は、遺伝子発現の調節のための転写調節ドメインと任意に会合し得る。DNA結合性タンパク質は、1つ以上の調節ドメイン、或いは2つ以上の調節ドメイン、即ち同じドメイン又は2つの異なるドメインの2つのコピーである2つ以上のドメインと共有結合又は非共有結合で会合し得る。調節ドメインは、例えば融合タンパク質の一部としてアミノ酸リンカーを介してDNA結合性タンパク質に共有結合することができる。DNA結合性タンパク質はまた、例えばロイシンジッパー、STATタンパク質N末端ドメイン又はFK506結合タンパク質等、非共有の二量体化ドメインを介して調節ドメインと会合することができる(例えば、O’Shea,Science 254:539(1991),Barahmand−Pour et al.,Curr.Top.Microbiol.Immunol.211:121−128(1996);Klemm et al.,Annu.Rev.Immunol.16:569−592(1998);Klenim et al.,Annu.Rev.Immunol.16:569−592(1998);Ho et al.,Nature 382:822−826(1996);及びPomeranz et al.,Biochem.37:965(1998)参照)。調節ドメインは、DNA結合性タンパク質のC末端又はN末端を含む任意の適切な位置でDNA結合性タンパク質と会合することができる。
C.ミトコンドリアのターゲティングシグナル及び核外移行シグナル
ミトコンドリアターゲティングシグナル(MTS)は、当該技術分野で知られており、ミトコンドリア膜全体のパッセンジャーポリペプチドの輸送を行い、ミトコンドリア膜内のそれらの固定を促進する。通常は、MTSは、荷電性の疎水性且つヒドロキシル化されたアミノ酸残基である。MTSの例としては、ヒトチトクロームc酸化酵素サブユニットVIIIのN末端領域、ヒトATPシンターゼのサブユニットcのP1アイソフォームのN末端領域、又はアルデヒドデヒドロゲナーゼ標的配列のN末端領域が挙げられる。ミトコンドリア輸送メカニズム及びMTSは、Pfanner and Geissler,Nature Reviews Mol Cell Biol 2:339−349に概説される。ミトコンドリアにポリペプチドを送達するMTSの具体的な使用については、米国特許第2004/0072774号及びTanaka et al.,2002 J Biomed Sci 9:534−541に記載される。
D.DNA結合性タンパク質をコードする核酸ベクター
本発明によるDNA結合性タンパク質をコードする核酸は、操作及び発現用のベクター内に組み込むことができる。この文脈において、DNA結合性タンパク質は、本発明の方法に必要なNES及びMTSを含むものと理解される。ベクターを両方のクローニング目的で使用して必要な構築物を作製し、そしてミトコンドリアに対する核酸結合タンパク質の送達のために真核細胞内で構築物を発現する。
本発明の核酸構築物は、構築物内の、構築物によってコードされるDNA結合ペプチドを発現するために、真核細胞内に導入される。真核細胞は、例えば、動物細胞、菌類の細胞又は植物細胞であってよい。本発明の一実施形態において、真核細胞は、骨髄細胞、生殖系列細胞、分裂終了細胞(例えば中枢神経系の細胞)、前駆細胞及び幹細胞が包含される哺乳類の細胞である。特定の実施形態において、前記細胞は、ヒト細胞株に由来する細胞(例えばHeLa細胞)又は1次細胞が包含されるヒト細胞である。
本発明は、真核細胞内のミトコンドリアに送達されるDNA結合性タンパク質を提供するものである。DNA結合性タンパク質は、一旦ミトコンドリア内に入ると、多くの活性を媒介することができる。
本発明は、とりわけ、ミトコンドリアゲノムの修飾又はミトコンドリア遺伝子発現の調節によるミトコンドリア病の補正のための手段を提供するものである。
本発明の特定の実施形態において、DNA結合性ポリペプチドは、mtDNA内の標的配列に結合し得るものであり、in vivoでのミトコンドリア遺伝子からの発現を調節するために用いられる。
本発明のトランスジェニック生物は、好ましくは多細胞の真核生物、例えば動物、植物又は菌類である。動物としては、刺胞動物門、有櫛動物門、扁形動物門、線形動物門、環形動物門、軟体動物門、鋏角亜門、単枝亜門、甲殻亜門及び脊索動物門の系統の動物が挙げられる。単枝亜門としては、昆虫(例えば有翼昆虫)を包含する六脚上綱の亜門が挙げられる。脊索動物門としては、脊椎動物の群(例えば哺乳類、鳥、爬虫類及び両生類)が挙げられる。哺乳類の特定例としては、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、有蹄類(例えばウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ及びウマ)及び齧歯類(例えばマウス、ラット、スナネズミ及びハムスター)が挙げられる。
トランスジェニック動物を作製するための技法は、当該技術分野でよく知られている。この主題に関する有用な一般的テキストは、Houdebine,Transgenic animals−Generation and Use(Harwood Academic,1997)であり、魚からマウスやウシまでのトランスジェニック動物を作製するために用いられる技法の広範囲にわたる概要である。
トランスジェニック植物を作製する技法は、当該技術分野でよく知られている。通常は、全植物、細胞又はプロトプラストのいずれも、DNA結合性ポリペプチド又は標的DNAをコードする適切な核酸構築物で形質転換することが可能である(核酸構築物の例については上記を参照)。形質転換DNA構築物を細胞内に導入する方法は多くあるが、全てが植物細胞へのDNAの送達に適切というわけではない。適切な方法としては、アグロバクテリウム感染(とりわけ、Turpen et al.,1993,J.Virol.Methods,42:227−239)或いは例えばPEG介在形質転換、エレクトロポレーション又はDNA被覆粒子の加速によるDNAの直接的な送達が挙げられる。加速方法が一般に好ましく、例えば微粒子銃が挙げられる。米国特許第5,874,265号から得られる、トランスジェニック植物(特に単子葉植物)を作製するための代表的なプロトコールは、以下に記載される。
mtDNA標的を結合するためのジンクフィンガータンパク質のエンジニアリング及び設計
mtDNAに特異的なZFPのエンジニアリング
結合ジンクフィンガーに適切な多くの可能な標的部位は、mtDNAにおいて同定されてきた。これらは、wt mtDNAのDループ領域内の部位、並びに遺伝的障害に関与する点変異(例えばNARP T8993G)を含む配列を含む。可能な結合剤は、Sangamo BioSciences Inc.によって作製された、予め選択された2フィンガーモジュールのアーカイブから集められ、Isalan et al.(Isalan,M.,Klug,A.&Choo,Y.Nat Biotechnol 19,656−60(2001))に記載のZif268ランダム化ライブラリーに基づいた。DNA結合ドメインは、2×2設計の3フィンガー又は4フィンガーのタンパク質として設計され、選択的にそれらの標的配列を結合する能力についてテストされた。更に、非結合3フィンガータンパク質ZFP−cont及び非ミトコンドリア特異性を有する6フィンガータンパク質(Papworth,M.et al.Proc Natl Acad Sci USA 100,1621−6(2003))を対照として使用した。
MTS−ジンクフィンガー融合タンパク質(MTS−ZFP)を作製するため、設計されたジンクフィンガーをコードするDNAは、PCRによって修飾されてc−myc(EQKLISEEDL)又はHA(YPYDVPDYA)エピトープ標識をZFPのC末端に導入し、そして固有のXhoI(5’)及びEcoRI(3’)制限部位でフランクされた。これらは、以下のN末端MTS配列の内の1つをコードする固有のXbaI(5’)及びXhoI(3’)制限部位でフランクされたPCR増幅DNA断片で結合された:(i)ヒトチトクロームc酸化酵素(C8)のサブユニットVIIIに由来する33アミノ酸(aa)プレ配列、(ii)ヒトATPシンターゼF1βサブユニット(F)に由来する51aaプレ配列、(iii)コナミドリムシATPシンターゼサブユニット6(R)に由来する109aaプレ配列、(iv)トリパノソーマブルース(T1)に由来するタンパク質MP42の54aaプレ配列、(v)トリパノソーマブルース(T2)に由来するタンパク質MP63の59aaプレ配列、及び(vi)Leishmania tarentolae(T3)に由来するタンパク質7bの64aaプレ配列(これはMTS及び更なるN末端配列を含む)。全てのMTS−ZFP構築物は、XbaI(5’)−EcoRI(3’)フラグメントとしてpcDNA3.1(−)(Invitrogen)内に挿入され、そしてそれらの配列を確認した。
プラスミドのC8−ZFP−GFP系列を作製するために、pEGFP−N2ベクター(Clontech)のBglI及びEcoRI部位内にフランクで付加され且つC末端GFPタンパク質を有するフレーム内でクローン化される固有のBglII(5’側)及びEcoRI(3’側)部位を有するC8−ZFP鋳型から、C8MTS−ジンクフィンガー及びエピトープ標識融合物をコードするDNA断片をPCR増幅した。
3−フィンガーペプチドZFPNARP及びZFPcont並びにそれらの誘導体をin vitroで合成し、既に述べた方法を用いてゲルリターデイションアッセイに供した(Moore,M.,Klug,A.&Choo,Y.Proc Natl Acad Sci USA 98,1437−41(2001))。ZFPNARPは、37bpプローブに組み込まれたNARP変異(T8993G)を含むその完全長標的部位に対して、並びにNARP−C変異(T8993C)及びwt配列を含んだ結合部位において1bp置換を有する密接に関連した部位に対してテストされた。また、適切なDNA配列に対するジンクフィンガータンパク質の結合も、更なるドメイン(例えばN末端MTS FやC末端メチラーゼドメイン)及びNESの存在下でテストされた。
哺乳類細胞のトランスフェクションの全ては、Cell Line Nucleofector(Amaxa biosystems)、バッファーキットV(Amaxa biosystems)及びQiafilter MidiPrep Kit(Qiagen)によって精製されたプラスミドDNAを用いて実施された。COS−7細胞については、プログラムA−24が製造業者によって推奨されるように用いられ、一方で細胞株143B(TK−)及び143Bについては、NARPサイブリッドプログラムI−13が実験的に最適になるように決定された。免疫検出研究のために、ジンクフィンガー構築物を一時的な系において24〜36時間発現させた。一方でメチル化の研究については、トランスフェクションの12時間後に培養培地に添加された0.5μg/mLのピューロマイシンを有するpIRESpuro3ベクター(Clontech)を使用して、hDNMT3aの触媒ドメインを含むタンパク質を60時間発現させた。
一時的に発現されたジンクフィンガータンパク質は、免疫蛍光法又は免疫ブロット法のいずれかによって解析された。免疫蛍光法のために意図された付着細胞をカバーグラス上で成長させ、そして必要であれば、ミトコンドリアを視覚化するために、培養培地に添加されたMitotracker CMXRed(Molecular Probes)で30分間染色した。次いで細胞をPBSで洗浄し、そして4%ホルムアルデヒド/PBSで直接カバーガラス上に固定した。1%TrironX−100での透過化処理及びPBSにおける洗浄の後、1:100の希釈度で使用されるエピトープ標識に対する抗体(HA標識(Roche)に対するマウスモノクローナル抗体12CA5又はc−myc(Santa Cruz)に対するマウス9E10モノクローナル抗体)を用いて、ジンクフィンガータンパク質を視覚化した。その後、1:100の希釈度で使用されるFITC(ベクター)に結合する2次抗体抗マウスIgGでインキュベーションを行った。TFAM及びmtSSBを有するZFP構築物の共局在研究については、Mitotracker染色ステップを省略した。固定細胞をTFAM又はmtSSB抗血清でインキュベートし、その後テキサスRedと結合した二次抗体で行った。次いでBioRadコンフォーカル顕微鏡を使用して免疫蛍光法について検討した。免疫ブロット分析について、ニトロセルロース膜へ移され、特異的抗体でブロットされるSDS−PAGEに、全体の細胞溶解液又はタンパク質分画(下記参照)に対応する等量のタンパク質が供される。ブロットは、HRP結合2次抗体で更にインキュベートされ、ECL(Amersham)を使用して視覚化された。
BrdUを使用する143B(TK−)wt又はT8993Gサイブリッド細胞におけるmtDNAの代謝標識化は、Garrido et al.(Garrido,N.et al.Mol Biol Cell 14,1583−96(2003))に従って、以下の改変を行って実施された。15μMの終濃度でのトランスフェクションの12時間後にBrdUを添加し、細胞を18〜24時間インキュベートした。固定化、透過化処理(上記参照)及び脱水/再水和ステップの後、DNAは、2MのHClで10分間変性され、次いでPBS及びddH2Oで大量に洗浄された。mAb抗BrdU(Roche)及びTexas Redに結合した2次抗マウス抗体を使用して、組み込まれたBrdUを検出した。
Minczuk et al(Minczuk,M.et al.Nucleicr Acids Res 30,5074−86(2002))に記載されるように、143B wt又はT8993Gサイブリッド細胞に由来するミトコンドリアを単離した。次いで、図3Bに示す濃度でプロテイナーゼKで補充された1×IB緩衝液(40mMのトリス−HCl、pH7.4、25mMのNaCl及び5mMのMgCl2)中でミトコンドリアの分画をインキュベートした。ZFPタンパク質構築物を検出するために、タンパク含有量について正規化される細胞成分分画を抗HA−mAbで解析した。また、前記分画を確認するために、マーカータンパク質(抗TFAM血清及び抗GAPDH mAb(Abcam))に対する抗体を使用するブロット法を実施した。
シトシンのメチル化の研究のための全体の細胞DNAサンプルは、DNeasy Tissue Kit(Qiagen)を使用して単離され、そしてEZ DNA Methylation Kit(Zymo Research)を使用して製造業者の説明書に従って重亜硫酸塩変換に供された。その結果生じるDNAは、重亜硫酸塩変換mtDNAのH鎖に特異的なプライマーを使用するmtDNAフラグメントのPCR増幅のための鋳型として用いられた。その結果生じるPCR産物は、TOPO−TA Cloning Kit for Sequencing(Invitrogen)を用いてクローン化され、そしてそれらの配列が解析された。
ミトコンドリアにZFPを送達するための戦略
ジンクフィンガーは、大部分が核内で働くために進化的に適応したDNA結合性タンパク質である。核局在化シグナル(NLS)が存在しない場合でさえ、それらは多くの場合核内に局在する(Papworth,M.,Kolasinska,P.&Minczuk,M.Gene in press(2005))。mtDNAを操作するデザイナーZFPを使用するために、それらは、ミトコンドリアに効果的に標的とされなければならないと同時に、毒性であり得る核DNAへの結合を回避するために核に不在でなければならない(具体例は、Papworm et al.Proc Natl Acad Sci USA 100,1621−6(2003)に考察される)。大部分のミトコンドリアのタンパク質は、核内遺伝子によってコードされ、切断可能なN末端ミトコンドリアのターゲティング配列(MTS)によって細胞質から取り込まれる。MTSは、長さ及び組成が大きく異なり、種々のタンパク質に合わせて個別に調整されると思われる(Pfanner,N.&Geissler,A.Nat Rev Mol Cell Biol 2,339−49(2001))。N末端にMTSを融合することによって、ミトコンドリアに各種の外来性のタンパク質を送達することが可能になる。
Zif268の主鎖に作製された4フィンガー(F1、F2、F3及びF4)を含むジンクフィンガーペプチド(ZFP)のファミリーを選択してmtDNAの配列を結合させた。連続した12bp結合部位(リンカーなしでクローンによって結合)、又は12bp結合部位の中に1bpギャップを含む非連続の部位(F2とF3との間にGGGリンカーを含むクローンによって結合)のいずれかがある。連続したフィンガーのDNA接触ヘリックスのアミノ酸配列(αヘリックスの先頭に対してアミノ酸位が−1〜6)は、ボールド体(ZFP配列)で、直接DNAと接触するアミノ酸と共に各クローンについて示される。ヒトATPアーゼ(Fで示される)のF1βサブユニット又はヒトチトクロームc酸化酵素(C8)のサブユニットVIIIのN末端ミトコンドリアターゲティング配列をZFPに融合し、免疫蛍光法によって更なるC末端GFP(必要な場合、C8−ZFP−GFP)の有無についてそれらの細胞内局在化を解析した。クローンは、核(N)のみ、ミトコンドリアのみ(M)並びに大部分はミトコンドリア(M/N)又は大部分は核(N/M)のいずれかの同一の細胞内のミトコンドリアと核との混合を含む細胞内局在化の各種のパターンを示した。
MTS F(表1に示されるZFPクローン番号及び配列)を含む多くのZFPタンパク質は、C末端NESに融合され、そして更なるドメイン(GFP(F−GFP−ZFP−NES)、hDNMT3aメチラーゼ(F−ZFP−meth−NES)の触媒ドメイン或いはGFP及びhDNMT3a(F−GFP−ZFP−meth−NES)の触媒ドメインの両方が包含される)に結合する際にミトコンドリアに入るその能力についてテストされた。個々のクローンの細胞内局在化は、免疫蛍光法を用いて評価され、タンパク質がミトコンドリア内にのみ位置する場合はミトコンドリア(M)と記載され、ミトコンドリアに選好性を有する両コンパートメント内にタンパク質が認められる場合はミトコンドリア−核(M/N)と記載された。COS−7と143Bのいずれにおいても同じ結果が得られた。
特定のmtDNA配列を結合するミトコンドリア標的化ZFPの作製
次のステップは、特定のmtDNA配列に選択的に結合するZFPを作製することであった。このために、我々は、mtDNA内の9bp配列GCCCGGGCCを結合するように設計された、ミトコンドリアに標的化された3フィンガータンパク質F−ZFPNARPを作製した(図2A)。太字のGは、mtDNA内の8993位にあり、ミトコンドリア病(神経原性筋力低下、失調及び色素性網膜炎(NARP)並びに母性遺伝性リー症候群(MILS))の原因となる突然変異を示す。野生型(wt)配列は、この位置にTを有する。ゲルリターデイションアッセイ(図2B)によって評価されるように、in vitroにおけるFZFPNARPは、具体的にはGCCCGGGCCを含むオリゴヌクレオチドを結合した。それに対して、GCCCTGGCC(wt)かGCCCCGGCCのいずれかを含むオリゴヌクレオチドは、F−ZFPNARPによって結合されなかった(図2B)。更に、ZFPのin vitroにおける結合の研究によって、NESの付加はDNA結合に影響を及ぼさなかったことが示された(データは示されない)。FZFPNARPとしての同一サイズの対照(F−ZFPcont)は、テストされた3つのDNA配列のいずれとも結合せず(図2B)、それ故にミトコンドリアに対してZFPを標的とする任意の非配列特異的効果についての対照として更に使用することが可能であった。それ故、F−ZFPNARPは、T8993G変異を含む配列と非常に特異的に結合するが、単一のbpによって異なるwt mtDNAには結合しない。
特定のmtDNA配列に対するキメラZFP−メチラーゼの標的化
次のステップは、F−ZFPNAKPが、選択的に突然変異体GCCCGGGCC mtDNA配列に活性を修飾するDNAを導くことができるかどうかについて検討することであった。DNA修飾活性として、我々は、ヒトDNMT3a DNAメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインを選択した。この酵素は、基質としてS−アデノシルメチオニン(SAM)を使用して5−メチルシトシン(m5C)に対するCpG部位において主にシトシンをメチル化する。Zif268に由来するZFP及び触媒DNAメチルトランスフェラーゼドメインを含むキメラタンパク質は、in vitro(Xu,G.L.&Bestor,T.H.Nat Genet 17,376−8(1997);McNamara,A.R.,Hurd,P.J.,Smith,A.E.&Ford,K.G.Nucleic Acids Res 30,3818−30(2002))及びin vivo(Carvin,C.D.,Parr,R.D.&Kladde,M.P.Nucleic Acids Res 31,6493−501(2003))において配列特異的DNAメチル化に触媒作用を及ぼすことが既に示されている。ヒトmtDNAにおける内在性のシトシンのメチル化は極めて限定的であるが(Shmookler Reis,R.J.&Goldstein,S.J Biol Chem 258,9078−85(1983);Maekawa,M.et al.Clin Chem 50,1480−1(2004))、SAMはミトコンドリアの中に存在する(Agrimi,G.et al.Biochem J 379,183−90(2004))。メチラーゼを使用することの主要な長所は、その活性が配列特異的な5Cメチル化の程度によって容易に評価され得るということにある(Frommer,M.et al.Proc Natl Acad Sci USA 89,1827−31(1992))。
キメラZFPメチラーゼによるmtDNAの配列特異的in vivoメチル化
最終の目的は、F−ZFPNARP−meth−NESが、標的とされたGCCCGGGCC配列に隣接したCpG部位においてシトシンの5Cメチル化を選択的に増加させたかどうかを判定することである。F−ZFPNARP−meth−NES構築物は、mtDNAにおいて8993位でGを含むNARP細胞において発現され、そして更にこの位置でTを有するwt細胞で発現された。F−ZFPNARP−meth−NESによるmtDNAメチル化の配列特異性を評価するために、我々は重亜硫酸塩法を使用した(Frommer, M.et al.Proc Natl Acad Sci USA 89,1827−31(1992))。この技法は、m5Cを変化させずに残しつつDNAを重亜硫酸塩で処理して全てのシトシンをウラシルに変換することからなる。F−ZFPNARP−meth−NES又は対照構築物(図4)でトランスフェクトされたwt又はNARP細胞のいずれかに由来する全体のDNAが抽出され、次いで目的のGCCCGGGCC配列を含む重亜硫酸塩変換mtDNA H鎖の120bpフラグメントがPCRによって増幅され、クローン化された。2つの独立した実験からの統計学的に有意な数のクローンが構築物ごとにランダムに選択され、シーケンスされ、そして対照配列と比較して、どのシトシンがメチル化されたのかを示した(図7及び8参照)。GCCCGGGCC配列を囲むCpGジヌクレオチドのメチル化は、F−ZFPNARP−meth−NESを発現するNARP細胞に由来するクローンの23%に認められた(図4、右)。それに対して、F−ZFPNARP−meth−NESを発現するwt細胞において、類似の領域におけるCpGメチル化の程度は約6倍低く、CpGメチル化の背景レベルと区別がつかなかった。同様に、F−ZFPcont−meth−NESがNARP細胞において発現された場合、解析された領域においてCpGメチル化の約6倍低かった。ZFPのないミトコンドリアに標的化されたメチラーゼドメイン、F−meth−NES(図3A参照)は、NARP細胞において発現され、更にF−ZFPNARP−meth−NESよりもCpGメチル化レベルのはるかな低下(2.6倍)を引き起こした。更に、F−meth−NES対照は、全ての解析された領域の全体にわたって広がったメチル化されたGpG部位を示した(図4、左)。F−meth−NESと比較した、wt細胞において発現したF−ZFPcontmeth−NES又はF−ZFPNARP−meth−NESについて認められたメチル化レベルの低下は、既に報告されたようにZFPに対する融合によるメチルトランスフェラーゼDNAの親和性の低下に起因する可能性があった(Xu,G.L.&Bestor,T.H.Nat Genet 17,376−8(1997))。これらの対照によって、F−ZFPNARP−meth−NESの発現におけるGCCCGGGCC配列の周辺のCpGメチル化の増加は、ミトコンドリアにおけるメチラーゼの存在の単純な結果ではなかったことが示される。更にまた、CpGメチル化の増加は、GCCCGGGCC配列へのF−ZFPNARP−meth−NESの配列特異的結合の結果であるが、それは、この部位(領域380〜570及び13500〜13650)から非常に離れたmtDNAの他の領域におけるCpGメチル化の増加が認められなかったためであった。
我々は、ミトコンドリアに対して酵素的に活性なキメラZFPを標的とすることが可能であることを示した。従来のMTSは、信頼性が高いミトコンドリアの局在化を確実にするには十分でなかった。そして我々は、MTSと共にNESを融合タンパク質のC末端に組み込む必要があった。この再ルーチング戦略は、ZFPsがミトコンドリアのみに向けられたことを確実にすることに効果的であったことを立証した。核局在化が問題を含む場合、C末端NESを組み込むこの戦略は、ミトコンドリアを標的としたZFPsの使用に必須であるだけでなく、ミトコンドリア及び他の細胞器官に対してタンパク質を標的とすることに一般的に用いることが可能である。in vitro研究におけるように、ミトコンドリアの中で、ZFPは正確に折りたたまれ、そして適当なDNA配列を同じ配列識別に結合した。重要なことに、このZFPは、ミトコンドリアにおいて発現された場合、既に報告された核ZFPsと同様に、確認された9個の塩基対の内の単一の点変異によって異なる突然変異体とwt mtDNAとの間を区別することができた(Choo,Y.,Sanchez−Garcia,I.&Klug,A.Nature 372,642−5(1994))。前記ZFPは、DNA修飾酵素活性をmtDNAの特定の位置に標的化した。原理の証明としてここで選択された活性はメチラーゼドメインであった。その理由は、配列特異的なメチル化は、活性が真に配列依存的であるかどうかを確認するために容易に評価され得るからである。これによって、ZFPに対するメチラーゼの結合がmtDNAの配列特異的な修飾につながったことが確認された。各種の配列特異性を有する広範囲にわたるZFPを設計することが可能であるため、ここで報告されるアプローチは、ミトコンドリア内のDNA配列のかなりの範囲に対する選択的な標的化に有用であり得た。このことは、ZFPが特定のエフェクタードメインに結合し、次いでミトコンドリア内の所定のDNA配列と結合することに向けられることを可能にする。例えば、ヌクレアーゼドメインに結合したZFPは、wt mtDNAを無損傷のままにして変異を選択的に分解するために使用することが可能である。これは、異種形成(heteroplasmic)ミトコンドリア病に対する可能な治療として使用することが可能である。
Claims (36)
- ミトコンドリアターゲティング配列(MTS)及び核外移行シグナル(NES)に融合されたDNA結合性ポリペプチドをコードするコード配列を含む核酸構築物。
- 前記DNA結合性ポリペプチドがミトコンドリアに対して異種である、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記DNA結合性ポリペプチドがジンクフィンガーポリペプチド(ZFP)である、請求項1又は請求項2に記載の核酸構築物。
- 前記ZFPが2個、3個又はそれ以上のジンクフィンガーを含む、請求項3に記載の核酸構築物。
- 前記DNA結合性ポリペプチドがミトコンドリアゲノムにおける標的配列と結合する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- 前記標的配列が疾患と関連するDNA領域内に存在する、請求項5に記載の核酸構築物。
- 前記疾患が、LHON(レーベル遺伝性視神経症);MM(ミトコンドリアミオパシー);AD(アルツハイマー病);LIMM(致死性小児性ミトコンドリアミオパシー(Lethal Infantile Mitochondrial Myopathy));ADPD(アルツハイマー病及びパーキンソン病);MMC(母性ミオパシー及び心筋症(Maternal Myopathy and Cardiomyopathy));NARP(神経原性筋力低下、失調及び色素性網膜炎;この遺伝子座の別の表現型はリー病として報告される)、FICP(致死性小児性心筋症プラス(Fatal Infantile Cardiomyopathy Plus)、MELAS関連心筋症)、MELAS(ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス及び脳卒中様発作)、LDYT(レーベル遺伝性視神経症及びジストニー)、MERRF(ミオクローヌス癲癇及び赤色ぼろ筋線維)、MHCM(母性遺伝性肥大性心筋症)、CPEO(慢性進行性外眼筋麻痺)、KSS(キーンズ・セイアー症候群)、DM(糖尿病)、DMDF(糖尿病+難聴)、CIPO(ミオパシー及び眼筋麻痺を伴う慢性的腸偽閉塞(Chronic Intestinal Pseudoobstruction with myopathy and Ophthalmoplegia))、DEAF(母性遺伝性難聴又はアミノグリコシド誘導性難聴)、PEM(進行性脳症)、SNHL(感音難聴)、老化、脳筋症、FBSN(家族性両側性線条体壊死)、PEO及びSNE(亜急性壊死性脳症)からなる群から選択される、請求項6に記載の核酸構築物。
- 前記DNA結合性ポリペプチドがDNA結合性ポリペプチドのライブラリーから選択される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- 前記DNA結合性ポリペプチドが、ファージディスプレイ、ツーハイブリッド選択及び細菌ディスプレイからなる群から選択される1つ以上の方法によって、ランダム化された変異体ポリペプチドのライブラリーから選択される、請求項4に記載の核酸構築物。
- 前記DNA結合性タンパク質の調製において合理的な設計が用いられる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- 前記DNA結合性ポリペプチドが機能的ドメインに融合される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- 前記機能的ドメインが転写活性化ドメイン又は転写抑制ドメインである、請求項11に記載の核酸。
- 前記機能的ドメインがDNA修飾酵素から得られる、請求項11に記載の核酸構築物。
- 前記DNA修飾酵素が、DNAメチラーゼ及びIIs型制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインからなる群から選択される、請求項13に記載の核酸構築物。
- 前記MTSがミトコンドリアタンパク質のシグナルペプチドである、請求項1〜14のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- 前記MTSが、ヒトチトクロームc酸化酵素サブユニットVIII、ヒトATPシンターゼのサブユニットcのP1アイソフォーム、ヒトATPシンターゼのF1βサブユニット、アルデヒドデヒドロゲナーゼターゲティング配列及びBCS1タンパク質からなる群から選択されるタンパク質から得られる、請求項1〜15のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- 前記NESが、MMVの非構造タンパク質2、プロテインキナーゼ阻害剤、HIV−1 Rev及びMAPキナーゼキナーゼ、MVM NS2、NMD3、An3、IκBα、サイクリンB1及びTFIIIAからなる群から選択されるタンパク質から得られる、請求項1〜16のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- 前記NESが、LALKLAGLDIN(プロテインキナーゼ阻害剤)、LQLPPLERLTLD(HIV−1 Rev)及びLGLKLEELELE(MAPキナーゼキナーゼ)、MTKKFGTLTI(MVM NS2)、LAEMLEDLHI(NMD3)、LDQQF−AGLDL(An3)、MVKELQEIRL(IκBα)、LCQAFSDVIL(サイクリンB1)及びLPVLENLTL(サイクリンB1)からなる群から選択される、請求項17に記載の核酸構築物。
- ミトコンドリアDNA(mtDNA)において目的配列を改変するための融合タンパク質であって、
(a)mtDNA内の標的配列と結合するDNA結合性ポリペプチドであって、該標的配列は、該目的配列の中又は近くに存在する、DNA結合性ポリペプチド;
(b)mtDNAを修飾する機能的ドメイン;
(c)ミトコンドリアターゲティング配列(MTS);及び
(d)核外移行配列(NES)、
を含む、融合タンパク質。 - 前記機能的ドメインが、メチラーゼ及び制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択されるタンパク質から得られる、請求項19に記載の融合タンパク質。
- 前記機能的ドメインがエンドヌクレアーゼのDNA切断ドメインである、請求項20に記載の融合タンパク質。
- 前記エンドヌクレアーゼがIIs型制限エンドヌクレアーゼである、請求項20又は請求項21に記載の融合タンパク質。
- 前記DNA結合性ポリペプチドがジンクフィンガーポリペプチド(ZFP)である、請求項19〜22のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜18のいずれか1項に記載の核酸構築物によってコードされる融合タンパク質。
- 請求項1〜18のいずれか1項に記載の核酸構築物を含む細胞。
- 請求項18〜24のいずれか1項に記載のタンパク質を含む細胞。
- (a)請求項1〜18のいずれか1項に記載の核酸構築物を調製するステップ;及び
(b)前記核酸構築物を真核細胞内に導入するステップ、を含むミトコンドリアにポリペプチドを送達する方法であって、該構築物が前記ポリペプチドを産生するように発現され、そして該ポリペプチドがミトコンドリアに入る、方法。 - (a)請求項13又は請求項14に記載の核酸構築物を調製するステップ;及び
(b)前記核酸構築物を真核細胞内に導入するステップ、を含むミトコンドリアDNA内の配列を改変する方法であって、該構築物が前記ポリペプチドを産生するように発現され、そして該ポリペプチドがミトコンドリアに入る、方法。 - 請求項13又は請求項14に記載の核酸構築物内に含まれる前記MTSがミトコンドリアタンパク質のシグナルペプチドである、請求項28に記載の方法。
- 前記MTSが、ヒトチトクロームc酸化酵素サブユニットVIII、ヒトATPシンターゼのサブユニットcのP1アイソフォーム、ヒトATPシンターゼのF1βサブユニット及びアルデヒドデヒドロゲナーゼターゲティング配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる、請求項29に記載の方法。
- 前記NESが、MMVの非構造タンパク質2、プロテインキナーゼ阻害剤、HIV−1 Rev及びMAPキナーゼキナーゼ、MVM NS2、NMD3、An3、IκBα、サイクリンB1及びTFIIIAからなる群から選択されるタンパク質から得られる、請求項27に記載の方法。
- ミトコンドリアにおける遺伝子発現の調節のための、ミトコンドリアに対して異種のDNA結合性ポリペプチドの使用。
- 前記DNA結合性ポリペプチドが、DNA結合ドメイン及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質である、請求項32に記載の使用。
- 前記DNA結合性ポリペプチドがジンクフィンガーポリペプチドである、請求項32又は請求項33に記載の使用。
- 請求項19〜24のいずれか1項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
- ミトコンドリア病の治療のための医薬組成物の調製における請求項1〜18のいずれか1項に記載の核酸構築物の使用。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101469247B1 (ko) * | 2012-10-31 | 2014-12-09 | 전남대학교산학협력단 | 미토콘드리아 활성을 조절하는 세포증식 억제 단백질 및 그의 용도 |
Families Citing this family (11)
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---|---|---|---|---|
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KR102267495B1 (ko) * | 2019-08-07 | 2021-06-22 | 연세대학교 산학협력단 | 미토콘드리아 타겟팅용 폴리펩타이드 및 그 용도 |
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IL307834A (en) * | 2021-04-22 | 2023-12-01 | Prec Biosciences Inc | Transgenic meganonucleases targeting human mitochondrial genomes |
CN114134129B (zh) * | 2021-11-19 | 2022-11-29 | 上海生物芯片有限公司 | 一种线粒体定位多肽、定位系统及其应用 |
WO2023242844A1 (en) * | 2022-06-15 | 2023-12-21 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Method and therapeutic agent for treatment of disease or disorder associated with impaired firing rate and/or mitochondrial calcium homeostasis |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005229946A (ja) * | 2004-02-20 | 2005-09-02 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 細胞質局在化dna及びその製造方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001052620A2 (en) * | 2000-01-21 | 2001-07-26 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions to modulate expression in plants |
AU2002211021A1 (en) * | 2000-11-06 | 2002-05-15 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of searching for gene encoding nuclear transport protein |
JP2005507650A (ja) * | 2001-08-01 | 2005-03-24 | セロミックス インコーポレイテッド | 新規融合タンパク質及び分子結合に関するアッセイ |
US20040072774A1 (en) * | 2002-02-23 | 2004-04-15 | Giovanni Manfredi | Methods for expressing and targeting mitochondrial-DNA-encoded peptides and uses thereof |
-
2005
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-
2015
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005229946A (ja) * | 2004-02-20 | 2005-09-02 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 細胞質局在化dna及びその製造方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN6012011597; Nucleic Acids Res. Vol. 31, No. 22, 2003, p. 6493-6501 * |
JPN6012011599; Nucleic Acids Symp. Ser. Vol. 48, 2004, p. 99-100 * |
JPN6012011601; Gene Vol. 366, 20051117, p. 27-38 * |
JPN6012011603; J. Control. Release Vol. 98, 2004, p. 379-393 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101469247B1 (ko) * | 2012-10-31 | 2014-12-09 | 전남대학교산학협력단 | 미토콘드리아 활성을 조절하는 세포증식 억제 단백질 및 그의 용도 |
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