JP2020508046A - ゲノム編集システムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
野生型Cas9ヌクレアーゼもしくはその発現コンストラクトと比較してより高い特異性を有するCas9ヌクレアーゼバリアントと、tRNA−gRNA融合体もしくはリボザイム−gRNA融合体のコード配列を含む発現コンストラクトとを含む、またはCas9ヌクレアーゼバリアントのコード配列およびtRNA−gRNAもしくはリボザイム−gRNAのコード配列を双方とも含む発現コンストラクトを含む、細胞のゲノム内の標的配列を部位特異的に改変するためのゲノム編集システムが提供される。高い効率および高い特異性を有するゲノム編集システムを導入することによって細胞を遺伝子改変するための方法も提供される。
Description
本発明は、遺伝子工学の分野に関する。特に、本発明は、高い効率および高い特異性を有するゲノム編集方法に関する。より具体的には、本発明は、高特異性Cas9ヌクレアーゼバリアントによって生体のゲノム内の標的配列の部位特異的改変の効率を高めるための方法に関する。
発明の背景
クラスター化して規則的に間を挿んだ短い回文構造状反復およびCRISPR関連システム(CRISPR/Cas9)は、ゲノム編集のための最も人気のあるツールである。このシステムにおいて、Cas9タンパク質は、gRNAの誘導の下で特異的DNA配列を開裂させ、二本鎖切断(DSB)を引き起こす。DSBは、非相同末端結合(NHEJ)および相同組換え(HR)の細胞内修復機序を活性化させて、特異的DNA配列が修復過程の間に編集されるように、細胞内DNA損傷を修復することができる。現に、最も普遍的に使用されるCas9タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)由来のCas9(SpCas9)である。CRISPR/Cas9ゲノム編集システムの欠点の1つが、その低い特異性およびオフターゲット効果であり、これらが、このゲノム編集システムの適用を大いに制限している。
クラスター化して規則的に間を挿んだ短い回文構造状反復およびCRISPR関連システム(CRISPR/Cas9)は、ゲノム編集のための最も人気のあるツールである。このシステムにおいて、Cas9タンパク質は、gRNAの誘導の下で特異的DNA配列を開裂させ、二本鎖切断(DSB)を引き起こす。DSBは、非相同末端結合(NHEJ)および相同組換え(HR)の細胞内修復機序を活性化させて、特異的DNA配列が修復過程の間に編集されるように、細胞内DNA損傷を修復することができる。現に、最も普遍的に使用されるCas9タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)由来のCas9(SpCas9)である。CRISPR/Cas9ゲノム編集システムの欠点の1つが、その低い特異性およびオフターゲット効果であり、これらが、このゲノム編集システムの適用を大いに制限している。
効率的で高特異性のゲノム編集を可能にする方法およびツールが、当技術分野においてなおも必要とされている。
発明の概要
一態様において、本発明は、細胞のゲノム内の標的配列を部位特異的に改変するためのゲノム編集システムであって、当該ゲノム編集システムは、次のi)〜iii)、すなわち
i)Cas9ヌクレアーゼバリアント、およびtRNA−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ii)Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびtRNA−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、ならびに
iii)Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列とtRNA−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
から選択される少なくとも1つを含み、
Cas9ヌクレアーゼバリアントは、野生型Cas9ヌクレアーゼと比較してより高い特異性を有し、
ガイドRNAの5’末端は、tRNAの3’末端へ連結されており、
融合体は、細胞内で転写された後、ガイドRNAの5’末端で開裂し、それにより余分なヌクレオチドを5’末端に保有していないガイドRNAを形成する、ゲノム編集システムを提供する。
一態様において、本発明は、細胞のゲノム内の標的配列を部位特異的に改変するためのゲノム編集システムであって、当該ゲノム編集システムは、次のi)〜iii)、すなわち
i)Cas9ヌクレアーゼバリアント、およびtRNA−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ii)Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびtRNA−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、ならびに
iii)Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列とtRNA−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
から選択される少なくとも1つを含み、
Cas9ヌクレアーゼバリアントは、野生型Cas9ヌクレアーゼと比較してより高い特異性を有し、
ガイドRNAの5’末端は、tRNAの3’末端へ連結されており、
融合体は、細胞内で転写された後、ガイドRNAの5’末端で開裂し、それにより余分なヌクレオチドを5’末端に保有していないガイドRNAを形成する、ゲノム編集システムを提供する。
第二の態様において、本発明は、細胞のゲノム内の標的配列を部位特異的に改変するためのゲノム編集システムであって、当該ゲノム編集システムは、次のi)〜iii)、すなわち
i)Cas9ヌクレアーゼバリアント、およびリボザイム−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ii)Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびリボザイム−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、ならびに
iii)Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列とリボザイム−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
から選択される少なくとも1つを含み、
Cas9ヌクレアーゼバリアントは、野生型Cas9ヌクレアーゼと比較してより高い特異性を有し、
ガイドRNAの5’末端は、第一のリボザイムの3’末端へ連結されており、
第一のリボザイムは、ガイドRNAの5’末端で融合体を開裂させるよう設計されており、それにより余分なヌクレオチドを5’末端に保有していないガイドRNAを形成する、ゲノム編集システムを提供する。
i)Cas9ヌクレアーゼバリアント、およびリボザイム−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ii)Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびリボザイム−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、ならびに
iii)Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列とリボザイム−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
から選択される少なくとも1つを含み、
Cas9ヌクレアーゼバリアントは、野生型Cas9ヌクレアーゼと比較してより高い特異性を有し、
ガイドRNAの5’末端は、第一のリボザイムの3’末端へ連結されており、
第一のリボザイムは、ガイドRNAの5’末端で融合体を開裂させるよう設計されており、それにより余分なヌクレオチドを5’末端に保有していないガイドRNAを形成する、ゲノム編集システムを提供する。
第三の態様において、本発明は、本発明のゲノム編集システムを細胞内へと導入し、それによりCas9ヌクレアーゼバリアントがガイドRNAによって細胞のゲノム内の標的配列へと定方向化され、かつ標的配列中の1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失および/または付加を結果的に生じることを含む、細胞を遺伝子改変するための方法を提供する。
第四の態様において、本発明は、本発明の方法によって作製された遺伝子改変細胞を含む、遺伝子改変生体を提供する。
発明の詳細な説明
1.定義
本発明において、別段の記載がない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって通常理解される意味を指す。また、タンパク質およびヌクレオチドの化学、分子生物学、細胞および組織の培養、微生物学、免疫学に関する本明細書で使用する用語および実験手順はすべて、当技術分野で一般的に使用される用語および従来の方法に属する。例えば、本明細書で使用する標準的なDNA組換えおよび分子クローン化技術は、当業者に周知であり、次の参考文献、すなわちSambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor,1989において詳細に説明されている。その一方で、本発明をより良好に理解するために、関連用語についての定義および説明を以下に提供する。
1.定義
本発明において、別段の記載がない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって通常理解される意味を指す。また、タンパク質およびヌクレオチドの化学、分子生物学、細胞および組織の培養、微生物学、免疫学に関する本明細書で使用する用語および実験手順はすべて、当技術分野で一般的に使用される用語および従来の方法に属する。例えば、本明細書で使用する標準的なDNA組換えおよび分子クローン化技術は、当業者に周知であり、次の参考文献、すなわちSambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor,1989において詳細に説明されている。その一方で、本発明をより良好に理解するために、関連用語についての定義および説明を以下に提供する。
「Cas9ヌクレアーゼ」および「Cas9」は、本明細書で互換的に使用することができ、Cas9タンパク質およびそのフラグメント(Cas9の活性のあるDNA開裂ドメインおよび/またはCas9のgRNA結合ドメインを含むタンパク質など)を含む、RNA定方向化ヌクレアーゼを指す。Cas9は、CRISPR/Cas(クラスター化して規則的に間を挿んだ短い回文構造状反復およびその関連システム)ゲノム編集システムの構成要素であり、DNA標的配列を標的としかつ開裂させ、ガイドRNAの誘導の下でDNA二本鎖切断(DSB)を形成する。
「ガイドRNA」および「gRNA」は、本明細書において互換的に使用することができ、典型的には、部分的な相補対を通じて複合体を形成するcrRNA分子およびtracrRNA分子から構成され、crRNAは、ハイブリッド形成のための標的配列と十分に相補的であり、かつCRISPR複合体(Cas9+crRNA+tracrRNA)を定方向化させて標的配列へ特異的に結合する、配列を含む。しかしながら、crRNAおよびtracrRNAの双方の特徴を含む一本鎖ガイドRNA(sgRNA)を設計できることは、当技術分野で公知である。
本明細書で使用する場合、「tRNA」および「転移RNA」という用語は、アミノ酸を保有しかつ輸送する機能を有する小分子RNAを指すために互換的に使用される。tRNA分子は通常、クローバー状へと折りたたまれる約70〜90のヌクレオチドの短鎖からなる。真核生物において、ゲノム内のtRNA遺伝子はtRNA前駆体へと転写され、このtRNA前駆体が次に、RNアーゼPおよびRNアーゼZによる5’および3’の追加の配列の切除後に成熟tRNAへと加工される。
本明細書で使用する場合、「リボザイム」という用語は、トランスリン酸エステル結合加水分解反応およびホスホジエステル結合加水分解反応を触媒することによってRNAの開裂および加工に関与する触媒機能を有するRNA分子を指す。
本明細書で使用する「ゲノム」は、核内に存在する染色体DNAだけでなく、細胞の細胞内構成要素(例えば、ミトコンドリア、プラスチド)中に存在する小器官DNAも包含する。
本明細書で使用する場合、「生体」には、ゲノム編集に適したいかなる生体も含まれる。例示的な生体としては、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ネコなどの哺乳類、ニワトリ、アヒル、ガチョウなどの家禽類、イネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、オオムギ、ダイズ、ラッカセイ、シロイヌナズナ属(Arabidopsis)などの単子葉類および双子葉類を含む植物、ならびにこれらに類するものが挙げられるが、それらに限定されない。
「遺伝子改変生体」または「遺伝子改変細胞」は、そのゲノム内に外来性ポリヌクレオチドまたは改変された遺伝子もしくは発現制御配列を含有する生体または細胞を意味する。例えば、外来性ポリヌクレオチドは、生体または細胞のゲノム内へと安定して組み込まれ、かつ連続した世代について遺伝する。外来性ポリヌクレオチドは、ゲノム単独内へとまたは組換えDNAコンストラクトの一部として組み込まれることができる。改変された遺伝子または発現制御配列とは、単一のまたは複数のデオキシヌクレオチドの置換、欠失および付加を含む、生体または細胞のゲノム内の配列である。
配列に関して「外来性の」という用語は、外来種から生じる配列、または同じ種からの場合には、人間による計画的な介在による組成物および/もしくはゲノムの遺伝子座においてその天然形態から実質的に改変された配列を意味する。
「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「核酸フラグメント」は、合成、非天然または変化したヌクレオチド塩基を場合により含有する一本鎖または二本鎖であるRNAまたはDNAのポリマーを指すために互換的に使用される。ヌクレオチド(通常、その5’−一リン酸塩形態で認められる)は、次のように一文字表記によって称される。すなわち、「A」はアデニル酸塩またはデオキシアデニル酸塩であり(それぞれRNAまたはDNAについて)、「C」はシチジル酸塩またはデオキシシチジル酸塩であり、「G」はグアニル酸塩またはデオキシグアニル酸塩であり、「U」はウリジル酸塩であり、「T」はデオキシチミジル酸塩であり、「R」はプリン(AまたはG)であり、「Y」はピリミジン(CまたはT)であり、「K」はGまたはTであり、「H」はAまたはCまたはTであり、「I」はイノシンであり、かつ「N」は何らかのヌクレオチドである。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」および「タンパク質」は、アミノ酸残基からなるポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。当該用語は、1つ以上のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマー、および天然のアミノ酸ポリマーに適用される。「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」、および「タンパク質」という用語には改変体も含まれ、これには、グリコシル化、脂質結合、硫化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびADPリボシル化が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する場合、「発現コンストラクト」とは、組換えベクターなど、生体内での関心対象のヌクレオチド配列の発現に適したベクターを指す。「発現」とは、機能的産物の生成を指す。例えば、ヌクレオチド配列の発現とは、ヌクレオチド配列の転写(転写によるmRNAまたは機能的RNAの生成など)、および/またはRNAからタンパク質前駆体もしくは成熟タンパク質への翻訳を指すことができる。
本発明の「発現コンストラクト」とは、線形核酸フラグメント、環状プラスミド、ウイルスベクター、またはいくつかの実施形態においては、翻訳可能なRNA(mRNAなど)であることができる。
本発明の「発現コンストラクト」とは、異なる源に由来する関心対象の調節配列およびヌクレオチド配列、または同じ源に由来するが天然において通常認められるものとは異なる様式で配置される関心対象の調節配列およびヌクレオチド配列を含むことができる。
「調節配列」または「調節エレメント」は互換的に使用され、コード配列の上流(5’非コード配列)に、コード配列内に、またはコード配列の下流(3’非コード配列)に位置し、かつ関連コード配列の転写、RNA加工もしくはRNA安定性、または翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含むことができるが、これらに限定されない。
「プロモーター」は、別の核酸フラグメントの転写を制御できる核酸フラグメントを指す。本発明のいくつかの実施形態において、プロモーターとは、細胞由来の如何にかかわらず、細胞内での遺伝子の転写を制御できるプロモーターである。プロモーターは、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーターまたは発生過程で調節されるプロモーターまたは誘導性プロモーターであってもよい。
「構成的プロモーター」とは、たいていの細胞型におけるたいていの状況において遺伝子の発現を生じることができるプロモーターを指す。「組織特異的プロモーター」および「組織に好ましいプロモーター」は、互換的に使用されており、1つの組織内または器官内で主として発現するが、必ずしも当該組織内または器官内でばかりではなく、1つの特定の細胞または細胞型においても発現できるプロモーターを指す。「発生過程で調節されるプロモーター」は、その活性が発生事象によって決定されるプロモーターを指す。「誘導性プロモーター」は、内在性刺激または外来性刺激(環境、ホルモン、または化学シグナルなど)に応じて、当該プロモーターへ作動可能に連結されたDNA配列を選択的に発現する。
本明細書で使用する場合、「作動可能に連結された」という用語は、調節エレメント(例えば、プロモーター配列、転写終結配列などだがこれらに限定されない)が核酸配列(コード配列またはオープンリーディングフレームなど)と会合し、それによりヌクレオチド配列の転写が転写調節エレメントによって制御されかつ調節されることを意味する。調節エレメント領域を核酸分子へ作動可能に連結するための技術は、当技術分野で公知である。
生体内への核酸分子(例えば、プラスミド、線形核酸フラグメント、RNAなど)またはタンパク質の「導入」は、当該核酸またはタンパク質が生体の細胞内で機能するよう、当該細胞を形質転換するために使用されることを意味する。本発明で使用する場合、「形質転換」は、安定した形質転換および一過性の形質転換の双方を含む。「安定した形質転換」は、結果として外来遺伝子の安定した遺伝を生じる、ゲノム内への外来ヌクレオチド配列の導入を指す。いったん安定して形質転換されると、外来核酸配列は、生体およびその連続した世代のいずれかのゲノム内へと安定して組み込まれる。「一過性の形質転換」は、外来遺伝子の安定した遺伝なくその機能を実行する、細胞内への核酸分子またはタンパク質の導入を指す。一過性の形質転換において、外来核酸配列は、ゲノム内へと組み込まれることはない。
2.高い効率および高い特異性を有するゲノム編集システム
Feng ZhangらのCas9ヌクレアーゼバリアントeSpCas9(1.0)(K810A/K1003A/R1060A)、eSpCas9(1.1)(K848A/K1003A/R1060A)、およびJ.Keith Joungらによって開発されたCas9ヌクレアーゼバリアントSpCas9−HF1(N497A/R661A/Q695A/Q926A)は、ゲノム編集におけるオフターゲット率を有意に低減させることができ、したがって高い特異性を有する。しかしながら、驚くべきことに、本発明者らは、これら3つのCas9ヌクレアーゼバリアントが、高い特異性を有するものの、野生型Cas9と比較して非常により低い遺伝子編集効率を有することを発見した。
2.高い効率および高い特異性を有するゲノム編集システム
Feng ZhangらのCas9ヌクレアーゼバリアントeSpCas9(1.0)(K810A/K1003A/R1060A)、eSpCas9(1.1)(K848A/K1003A/R1060A)、およびJ.Keith Joungらによって開発されたCas9ヌクレアーゼバリアントSpCas9−HF1(N497A/R661A/Q695A/Q926A)は、ゲノム編集におけるオフターゲット率を有意に低減させることができ、したがって高い特異性を有する。しかしながら、驚くべきことに、本発明者らは、これら3つのCas9ヌクレアーゼバリアントが、高い特異性を有するものの、野生型Cas9と比較して非常により低い遺伝子編集効率を有することを発見した。
本発明者らは驚くべきことに、ガイドRNAの5’末端をtRNAへ融合させることによって、高い特異性を維持しつつ、高特異性Cas9ヌクレアーゼバリアントの編集効率を野生型レベルに高めることさえ可能であることを発見した。
いかなる理論による制限をも意図するものではないが、高特異性Cas9ヌクレアーゼバリアントの編集効率の低減は、ガイドRNAの転写が正確に開始されることができるか否かに関連すると考えられている。当技術分野において、ガイドRNAを生体内で生成するために通常使用されるプロモーターとしては、例えば、その転写がRNAポリメラーゼIIIによって駆動されるU6snRNAプロモーターまたはU3snRNAプロモーターが挙げられる。U6プロモーターは、Gにおける転写を開始するために必要とし、したがって、A、CまたはTの第一のヌクレオチドを有する標的配列について、追加のGは、転写されるとsgRNAの5’末端に存在することになる。U3プロモーターは、Aにおける転写を開始し、したがって、G、CまたはTの第一のヌクレオチドを有する標的配列について、追加のAは、転写されるとsgRNAの5’末端に存在することになる。本発明者らは、追加のヌクレオチドがsgRNAの5’末端に存在する場合に、高特異性Cas9ヌクレアーゼバリアントの編集効率が低減することを発見した。tRNAを正確に加工する(tRNA前駆体の5’および3’の追加的な配列を正確に除去して成熟tRNAを形成する)機序によるtRNAとの融合転写によって、追加のヌクレオチドを5’末端に有さないsgRNAは、U6プロモーターまたはU3プロモーターを用いる場合でさえ、標的配列の第一のヌクレオチドの型を考慮する必要なく、容易に得ることができる。それにより、高特異性Cas9ヌクレアーゼバリアントの編集効率を改善でき、標的配列の選択可能な範囲を拡大することができる。加えて、いかなる理論による制限をも意図するものではないが、tRNAとの融合によって、sgRNAの発現レベルを高めることができ、このことも、高特異性Cas9ヌクレアーゼバリアントの編集効率の改善に寄与し得る。
それゆえ、本発明は、次のi)〜iii)、すなわち
i)Cas9ヌクレアーゼバリアント、およびtRNA−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ii)Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびtRNA−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、ならびに
iii)Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列とtRNA−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
から選択される少なくとも1つを含む、細胞のゲノム内の標的配列を部位特異的に改変するためのゲノム編集システムであって、
Cas9ヌクレアーゼバリアントは、野生型Cas9ヌクレアーゼと比較してより高い特異性を有し、
ガイドRNAの5’末端は、tRNAの3’末端へ連結されており、
融合体は、細胞内で転写された後にガイドRNAの5’末端で開裂し、それにより余分なヌクレオチドを5’末端に保有していないガイドRNAを形成する、ゲノム編集システムを提供する。
i)Cas9ヌクレアーゼバリアント、およびtRNA−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ii)Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびtRNA−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、ならびに
iii)Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列とtRNA−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
から選択される少なくとも1つを含む、細胞のゲノム内の標的配列を部位特異的に改変するためのゲノム編集システムであって、
Cas9ヌクレアーゼバリアントは、野生型Cas9ヌクレアーゼと比較してより高い特異性を有し、
ガイドRNAの5’末端は、tRNAの3’末端へ連結されており、
融合体は、細胞内で転写された後にガイドRNAの5’末端で開裂し、それにより余分なヌクレオチドを5’末端に保有していないガイドRNAを形成する、ゲノム編集システムを提供する。
いくつかの実施形態において、改変されることになっているtRNAおよび細胞は、同種由来である。
いくつかの具体的な実施形態において、tRNAは、次の配列、すなわちaacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtacagacccgggttcgattcccggctggtgca(配列番号1)によってコードされる。
tRNA−ガイドRNA融合体の設計は、当業者の技術の内である。例えば、Xie et al.,PNAS,Mar 17,2015; vol.112,no.11,3570〜3575を参照することができる。
本発明は、ガイドRNAとリボザイムとの融合体も考慮する。高特異性Cas9ヌクレアーゼバリアントの編集効率がsgRNAの正確な転写開始に関するという、本発明において発見されたことに基づいて、特異的な部位におけるRNAを切断するリボザイムの能力を用いることによって、高い特異性を維持しながら編集効率を改善するよう、RNAとリボザイムとの融合体の合理的な設計によって、5’末端における追加のヌクレオチドなしでsgRNAを生成することができる。
それゆえ、本発明は、次のi)〜iii)、すなわち
i)Cas9ヌクレアーゼバリアント、およびリボザイム−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ii)Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびリボザイム−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、ならびに
iii)Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列とリボザイム−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
から選択される少なくとも1つを含む、細胞のゲノム内の標的配列を部位特異的に改変するためのゲノム編集システムであって、
Cas9ヌクレアーゼバリアントは、野生型Cas9ヌクレアーゼと比較してより高い特異性を有しており、
ガイドRNAの5’末端は、第一のリボザイムの3’末端へ連結されており、
第一のリボザイムは、ガイドRNAの5’末端で融合体を開裂させるよう設計され、それにより余分なヌクレオチドを5’末端に保有していないガイドRNAを形成する、ゲノム編集システムも提供する。
i)Cas9ヌクレアーゼバリアント、およびリボザイム−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ii)Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびリボザイム−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、ならびに
iii)Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列とリボザイム−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
から選択される少なくとも1つを含む、細胞のゲノム内の標的配列を部位特異的に改変するためのゲノム編集システムであって、
Cas9ヌクレアーゼバリアントは、野生型Cas9ヌクレアーゼと比較してより高い特異性を有しており、
ガイドRNAの5’末端は、第一のリボザイムの3’末端へ連結されており、
第一のリボザイムは、ガイドRNAの5’末端で融合体を開裂させるよう設計され、それにより余分なヌクレオチドを5’末端に保有していないガイドRNAを形成する、ゲノム編集システムも提供する。
一実施形態において、ガイドRNAの3’末端は、第二のリボザイムの5’末端へ連結されており、第二のリボザイムは、ガイドRNAの3’末端で融合体を開裂させるよう設計され、それにより余分なヌクレオチドを3’末端に保有していないガイドRNAを形成する。
第一のリボザイムまたは第二のリボザイムの設計は、当業者の技術範囲内である。例えば、Gao et al.,JIPB,Apr,2014; Vol 56,Issue 4,343〜349を参照することができる。
1つの具体的な実施形態において、第一のリボザイムは、次の配列、すなわち5’−(N)6CTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTC−3’(配列番号12)によってコードされ、ここで、Nは、A、G、C、およびTから独立して選択され、かつ(N)6は、ガイドRNAの5’末端で最初の6個のヌクレオチドとは逆相補的な配列を指す。1つの具体的な実施形態において、第二のリボザイムは、次の配列、すなわち5’−GGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGAC−3’(配列番号13)によってコードされる。
野生型Cas9ヌクレアーゼと比較してより高い特異性を有する、本発明におけるCas9ヌクレアーゼバリアントは、種々の種のCas9に、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)のCas9(SpCas9、ヌクレオチド配列を配列番号2に示し、アミノ酸配列を配列番号3に示す)に由来することができる。
本発明のいくつかの実施形態において、Cas9ヌクレアーゼバリアントは、配列番号2の位置855においてアミノ酸置換を含む、配列番号2のバリアントである。いくつかの具体的な実施形態において、位置855におけるアミノ酸置換はK855Aである。
本発明のいくつかの実施形態において、Cas9ヌクレアーゼバリアントは、配列番号2の位置810、1003および1060におけるアミノ酸置換を含む、配列番号2のバリアントである。いくつかの具体的な実施形態において、アミノ酸置換はそれぞれ、K810A、K1003AおよびR1060Aである。
本発明のいくつかの実施形態において、Cas9ヌクレアーゼバリアントは、配列番号2の位置848、1003および1060におけるアミノ酸置換を含む、配列番号2のバリアントである。いくつかの具体的な実施形態において、アミノ酸置換はそれぞれ、K848A、K1003AおよびR1060Aである。
本発明のいくつかの実施形態において、Cas9ヌクレアーゼバリアントは、配列番号2の位置611、695および926におけるアミノ酸置換を含む、配列番号2のバリアントである。いくつかの具体的な実施形態において、アミノ酸置換はそれぞれ、R611A、Q695AおよびQ926Aである。
本発明のいくつかの実施形態において、Cas9ヌクレアーゼバリアントは、配列番号2の位置497、611、695および926におけるアミノ酸置換を含む、配列番号2のバリアントである。いくつかの具体的な実施形態において、アミノ酸置換はそれぞれ、N497A、R611A、Q695AおよびQ926Aである。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、Cas9ヌクレアーゼバリアントは、配列番号4(eSpCas9(1.0))、配列番号5(eSpCas9(1.1))または配列番号6(SpCas9−HF1)において示されるアミノ酸配列を含む。
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のCas9ヌクレアーゼバリアントは、核局在化配列(NLS)をさらに含む。概して、Cas9ヌクレアーゼバリアントにおける1つ以上のNLSは、細胞の核内でのCas9ヌクレアーゼバリアントの、ゲノム編集機能のために十分な量の蓄積を駆動するのに十分な強度を有するべきである。概して、核局在化活性の強度は、NLSの数および位置、ならびにCas9ヌクレアーゼバリアントにおいて使用する1つ以上の具体的なNLS、またはこれらの組み合わせによって決まる。
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のCas9ヌクレアーゼバリアントのNLSは、N末端および/またはC末端に位置することができる。いくつかの実施形態において、Cas9ヌクレアーゼバリアントは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれより多数のNLSを含む。いくつかの実施形態において、Cas9ヌクレアーゼバリアントは、N末端にまたはN末端の近くに約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれより多数のNLSを含む。いくつかの実施形態において、Cas9ヌクレアーゼバリアントは、C末端にまたはC末端の近くに約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれより多数のNLSを含む。いくつかの実施形態において、Cas9ヌクレアーゼバリアントは、N末端にある1つ以上のNLSおよびC末端にある1つ以上のNLSなど、NLSの組み合わせを含む。1つを超えるNLSがある場合、各NLSは、他のNLSとは独立しているものとして選択することができる。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、Cas9ヌクレアーゼバリアントは、2つのNLSを含み、例えば、この2つのNLSはそれぞれ、N末端およびC末端に位置する。
概して、NLSは、タンパク質の表面上に曝露した正に帯電しているリジンまたはアルギニンからなる1つ以上の短い配列からなるが、他の型のNLSも当技術分野で公知である。NLSの非限定的な例としては、KKRKV(ヌクレオチド配列5’−AAGAAGAGAAAGGTC−3’)、PKKKRKV(ヌクレオチド配列5’−CCCAAGAAGAAGAGGAAGGTG−3’またはCCAAAGAAGAAGAGGAAGGTT)、またはSGGSPKKKRKV(ヌクレオチド配列5’−TCGGGGGGGAGCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTG−3’)が挙げられる。
本発明のいくつかの実施形態において、Cas9ヌクレアーゼバリアントのN末端は、PKKKRKVによって示されるアミノ酸配列を有するNLSを含む。本発明のいくつかの実施形態において、Cas9ヌクレアーゼバリアントのC末端は、SGGSPKKKRKVによって示されるアミノ酸配列を有するNLSを含む。
加えて、本発明のCas9ヌクレアーゼバリアントは、編集されることになっているDNAの位置によって、細胞質局在化配列、染色質局在化配列、ミトコンドリア局在化配列、およびこれらに類するものなど、他の局在化配列も含むことができる。
標的細胞における有効な発現を得るために、本発明のいくつかの実施形態において、Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列は、ゲノム編集されることになっている細胞が由来する生体に対してコドンが最適化されている。
コドンの最適化は、天然のアミノ酸配列を維持しながら、天然の配列の少なくとも1つのコドン(例えば、約1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、または約1超、2超、3超、4超、5超、10超、15超、20超、25超、50超、またはそれより多数のコドン)を、関心対象の宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、当該宿主細胞における発現の亢進のために核酸配列を改変する過程を指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特定のバイアスを呈する。コドンのバイアス(生体間でのコドンの使用の差)はしばしば、伝令RNA(mRNA)の翻訳の効率と相関しており、このことは順に、とりわけ、翻訳されるコドンの特性、および特定の転移RNA(tRNA)分子の利用可能性によると考えられている。細胞内での選択されたtRNAの優性は一般的に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンを反映している。したがって、遺伝子を、コドンの最適化に基づく所与の生体における最適な遺伝子発現のために調製することができる。コドン使用表は、例えば、www.kazusa.orjp/codon/において入手可能な「コドン使用データベース」において容易に入手可能であり、これらの表は、いくつかの方法において応用することができる。Nakamura,Y.,et al.“Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000” Nucl.Acids Res.28: 292(2000)を参照されたい。
本発明のシステムによってゲノム編集されることができる細胞が由来する生体には、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシおよびネコなどの哺乳類、ニワトリ、アヒルおよびガチョウなどの家禽類、ならびに単子葉類および双子葉類、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、オオムギ、ダイズ、ラッカセイおよびシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)を含む植物、ならびにこれらに類するものが含まれるが、それらに限定されない。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするコドンの最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号7(eSpCas9(1.0))、配列番号8(eSpCas9(1.1))または配列番号9(SpCas9−HF1)に示されるとおりである。
本発明のいくつかの実施形態において、ガイドRNAとは、一本鎖ガイドRNA(sgRNA)である。所与の標的配列による適切なsgRNAを構築する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Wang,Y.et al.Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew.Nat.Biotechnol.32,947〜951(2014)、Shan,Q.et al.Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR−Cas system.Nat.Biotechnol.31,686〜688(2013)、Liang,Z.et al.Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system.J Genet Genomics.41,63〜68(2014)を参照されたい。
本発明のいくつかの実施形態において、Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列、および/またはガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターなどの発現調節エレメントへ作動可能に連結されている。
本発明において使用することができるプロモーターの例としては、ポリメラーゼ(pol)Iプロモーター、polIIプロモーターまたはpolIIIプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。polIプロモーターの例としては、ニワトリRNApolIプロモーターが挙げられる。polIIプロモーターの例としては、サイトメガロウイルス最初期(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長鎖末端リピート(RSV−LTR)プロモーターおよびサルウイルス40(SV40)最初期プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。polIIIプロモーターの例としては、U6プロモーターおよびH1プロモーターが挙げられる。メタロチオネインプロモーターなどの誘導性プロモーターを使用することができる。プロモーターの他の例としては、T7バクテリオファージプロモーター、T3バクテリオファージプロモーター、β−ガラクトシダーゼプロモーターおよびSp6バクテリオファージプロモーターなどが挙げられる。植物に使用した場合に、使用することができるプロモーターには、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、トウモロコシUbi−1プロモーター、コムギU6プロモーター、イネU3プロモーター、トウモロコシU3プロモーターおよびイネアクチンプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
3.細胞を遺伝子改変するための方法
別の態様において、本発明は、本発明のゲノム編集システムを細胞へ導入し、それによりCas9ヌクレアーゼバリアントがガイドRNAによって細胞のゲノム内標的配列を標的とし、結果的に標的配列における1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失および/または付加を生じる、細胞を遺伝子改変するための方法を提供する。
3.細胞を遺伝子改変するための方法
別の態様において、本発明は、本発明のゲノム編集システムを細胞へ導入し、それによりCas9ヌクレアーゼバリアントがガイドRNAによって細胞のゲノム内標的配列を標的とし、結果的に標的配列における1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失および/または付加を生じる、細胞を遺伝子改変するための方法を提供する。
Cas9およびガイドRNA複合体によって認識されかつ標的とされることができる標的配列の設計は、当業者の技術の内である。概して、標的配列とは、ガイドRNAにおいて含まれる約20個のヌクレオチドのリーダー配列と相補的な配列であり、その3’末端は、プロトスペーサー付近のモチーフ(PAM)NGGのすぐ近くにある。
例えば、本発明のいくつかの実施形態において、標的配列は、構造:5’−NX−NGG−3’を有し、ここで、Nは、A、G、C、およびTから独立して選択され、Xは14≦X≦30の整数であり、NXはX個の連続したヌクレオチドを表し、かつNGGはPAM配列である。本発明のいくつかの具体的な実施形態において、Xは20である。
本発明において、改変されることになっている標的配列は、ゲノム内のいかなるところへも、例えば、タンパク質コード遺伝子などの機能的遺伝子内に位置することができ、または例えば、プロモーター領域もしくはエンハンサー領域などの遺伝子発現調節領域の中に位置することができ、それにより当該遺伝子の機能的改変を達成することができ、または遺伝子発現の改変を達成することができる。
細胞の標的配列における置換、欠失および/または付加は、T7EI、PCR/REまたは配列決定法によって検出することができ、例えば、Shan,Q.,Wang,Y.,Li,J.& Gao,C.Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system.Nat.Protoc.9,2395〜2410(2014)を参照されたい。
本発明の方法において、ゲノム編集システムは、当業者に周知の種々の方法を用いて細胞内へと導入することができる。
本発明のゲノム編集システムを細胞内へと導入するための方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リポソームトランスフェクション、微量注射、ウイルス感染(バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよび他のウイルスなど)、微粒子銃、PEG仲介プロトプラスト形質転換またはアグロバクテリウム仲介形質転換が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の方法を用いたゲノム編集へ供することができる細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシおよびネコなどの哺乳類、ニワトリ、アヒルおよびガチョウなどの家禽類、ならびにイネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、オオムギ、ダイズ、ラッカセイおよびシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)などの単子葉類および双子葉類を含む植物などに由来することができる。
いくつかの実施形態において、本発明の方法は試験管内で実施される。例えば、細胞は単離された細胞である。いくつかの他の実施形態において、本発明の方法は、生体内で実施することができる。例えば、細胞は生体内の細胞であり、本発明のシステムは、例えばウイルス仲介法を用いることによって、当該細胞内へと生体内導入することができる。いくつかの実施形態において、細胞は生殖細胞である。いくつかの実施において、細胞は体細胞である。
別の態様において、本発明は、本発明の方法によって作製された遺伝子改変細胞を含む遺伝子改変生体をさらに提供する。
生体には、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシおよびネコなどの哺乳類、ニワトリ、アヒルおよびガチョウなどの家禽類、ならびにイネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、オオムギ、ダイズ、ラッカセイおよびシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)などの単子葉類および双子葉類を含む植物が挙げられるが、これらに限定されない。
実施例
材料および方法
二成分発現ベクターpJIT163−SpCas9、pJIT163−eSpCas9(1.0)、pJIT163−eSpCas9(1.1)およびpJIT163−SpCas9−HF1の構築
SpCas9、eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1の配列をイネについてコドンの最適化を行った。SpCas9、eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1は、pJIT163−SpCas9プラスミド(配列番号10)をテンプレートとして用いるFast MultiSite Mutagenesis System(TransGen)を用いる部位特異的変異誘発によって得た。
材料および方法
二成分発現ベクターpJIT163−SpCas9、pJIT163−eSpCas9(1.0)、pJIT163−eSpCas9(1.1)およびpJIT163−SpCas9−HF1の構築
SpCas9、eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1の配列をイネについてコドンの最適化を行った。SpCas9、eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1は、pJIT163−SpCas9プラスミド(配列番号10)をテンプレートとして用いるFast MultiSite Mutagenesis System(TransGen)を用いる部位特異的変異誘発によって得た。
sgRNA発現ベクターの構築
本実験において使用されるsgRNA標的配列を次のとおり表1に示す。
本実験において使用されるsgRNA標的配列を次のとおり表1に示す。
sgRNA発現ベクターであるpOsU3−CDKB2−sgRNA、pOsU3−MKK4−sgRNA、pOsU3−A1−sgRNA、ならびにpOsU3−A2−sgRNA、pOsU3−A3−sgRNA、pOsU3−A4−sgRNAおよびpOsU3−PDS−sgRNAを、先に説明されているpOsU3−sgRNA(Addgene ID53063)に基づいて構築する(Shan,Q.et al.Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR−Cas system.Nat.Biotechnol.31,686〜688,2013)。
tRNA−sgRNA発現ベクターの構築
tRNA−sgRNA発現ベクターを、pUC57−U3−tRNA−sgRNAベクター(配列番号11、図6)に基づいて構築する。BsaIを用いたpUC57−U3−tRNA−sgRNAの消化後に線形ベクターを得、対応する順方向オリゴおよび逆方向オリゴをアニーリングし、線形ベクターへと結合し、その後の工程は、sgRNA発現ベクターの構築と同様である。
tRNA−sgRNA発現ベクターを、pUC57−U3−tRNA−sgRNAベクター(配列番号11、図6)に基づいて構築する。BsaIを用いたpUC57−U3−tRNA−sgRNAの消化後に線形ベクターを得、対応する順方向オリゴおよび逆方向オリゴをアニーリングし、線形ベクターへと結合し、その後の工程は、sgRNA発現ベクターの構築と同様である。
プロトプラストアッセイ
イネ品種日本晴を本研究に使用する。プロトプラスト形質転換は、以下に説明するとおり実施する。形質転換は、PEG仲介トランスフェクションによって、各プラスミド10μgを用いて行う。プロトプラストを48時間後に収集し、DNAをPCR−REアッセイのために抽出した。
イネ品種日本晴を本研究に使用する。プロトプラスト形質転換は、以下に説明するとおり実施する。形質転換は、PEG仲介トランスフェクションによって、各プラスミド10μgを用いて行う。プロトプラストを48時間後に収集し、DNAをPCR−REアッセイのために抽出した。
イネプロトプラストの調製および形質転換
1)播種の葉鞘をプロトプラスト単離に使用し、鋭利な刃で幅約0.5mmへと切断した。
1)播種の葉鞘をプロトプラスト単離に使用し、鋭利な刃で幅約0.5mmへと切断した。
2)切断直後、0.6Mマンニトール溶液中に移し、暗所で10分間置いた。
3)マンニトール溶液を濾過によって除去し、生成物を酵素分解溶液中へと移し、30分間真空排気した。
4)酵素分解を暗所で5〜6時間、緩徐に振盪しながら実施した(脱色振盪器、速度10)。
5)酵素分解の完了後、等容積のW5を添加し、10秒間水平振盪してプロトプラストを放出させた。
6)プロトプラストを50mlの丸底遠心チューブ内へと40μmのナイロン膜で濾過し、W5溶液で洗浄した。
7)250gの横形遠心分離を3分間行って、プロトプラストを沈殿させ、上清を廃棄した。
8)10mlのW5を添加することによってプロトプラストを再懸濁し、次いで250gで3分間遠心分離し、上清を廃棄した。
9)適量のMMG溶液を添加してプロトプラストを2×106/mlの濃度まで再懸濁した。
注:上記の工程は、すべて室温で行った。
10)10〜20μgのプラスミド、200μlのプロトプラスト(約4×105個の細胞)、および220μlの新鮮なPEG溶液を2mlの遠心チューブに入れ、混合し、かつ室温で暗所で10〜20分間置いて、形質転換を誘導した。
11)形質転換の完了後、880μlのW5溶液を緩徐に添加し、チューブを混合のために緩徐に転倒混和し、250gの横形遠心分離を3分間行い、上清を廃棄した。
12)生成物を2mlのWI溶液中に再懸濁し、6ウェルプレートへ移し、室温(または25℃)で暗所で培養した。プロトプラストゲノムDNA抽出のために、生成物は48時間培養する必要がある。
ディープシーケンシングによる変異同定
ディープシーケンシング分析は、Liang,Z.,Chen,K.,Li,T.,Zhang,Y.,Wang,Y.,Zhao,Q.,Liu,J.,Zhang,H.,Liu,C.,Ran,Y.,et al.(2017).Efficient DNA−free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes.Nature Communications 8,14261を参照して実施する。
ディープシーケンシング分析は、Liang,Z.,Chen,K.,Li,T.,Zhang,Y.,Wang,Y.,Zhao,Q.,Liu,J.,Zhang,H.,Liu,C.,Ran,Y.,et al.(2017).Efficient DNA−free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes.Nature Communications 8,14261を参照して実施する。
実施例1:標的部位に対するWT SpCas9およびそのバリアントの編集能力の比較
WT SpCas9、eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1をそれぞれ一過性発現ベクターpJIT163内に構築し、WT SpCas9、eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1の発現をトウモロコシユビキチン遺伝子プロモーターによって駆動する。sgRNAをpOsU3−sgRNAベクター内に構築し、sgRNAの発現をOsU3プロモーターによって駆動する。イネプロトプラストを形質転換し、プロトプラストDNAをPCR−RE分析のために抽出し、変異効率を査定した。5つの標的部位(A1、A2、A3、A4およびPDS)(図2および図3を参照されたい)を選択して、野生型SpCas9ならびにeSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1の編集能力の違いを比較する。
WT SpCas9、eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1をそれぞれ一過性発現ベクターpJIT163内に構築し、WT SpCas9、eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1の発現をトウモロコシユビキチン遺伝子プロモーターによって駆動する。sgRNAをpOsU3−sgRNAベクター内に構築し、sgRNAの発現をOsU3プロモーターによって駆動する。イネプロトプラストを形質転換し、プロトプラストDNAをPCR−RE分析のために抽出し、変異効率を査定した。5つの標的部位(A1、A2、A3、A4およびPDS)(図2および図3を参照されたい)を選択して、野生型SpCas9ならびにeSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1の編集能力の違いを比較する。
OsU3プロモーターは、ヌクレオチドAで転写を開始しなければならず、それゆえ、標的部位についてのsgRNA発現ベクターの設計を、次のように2つの条件に分けることができる。
(1)所望のsgRNA標的配列(20bp)の5’末端における第一のヌクレオチドが、G/T/Cのいずれか1つである場合、U3プロモーターはAで転写を開始するので、転写されたsgRNAの5’末端へ追加のAが付加され、さらに、転写されたsgRNAは、標的配列と完全にマッチすることができない。sgRNA発現ベクターは、図1においてU3+AN20として構築することができるのに対し、N20は標的配列であり、Aは5’末端における追加のヌクレオチドである。
(2)所望のsgRNA標的配列(20bp)の5’末端における第一のヌクレオチドがAである場合、転写を開始するためにU3プロモーターによって使用されることができ、それゆえ、追加のヌクレオチドは、転写されたsgRNAの5’末端には存在しない。sgRNA発現ベクターは、図1においてU3+AN19として構築することができるのに対し、AN19は標的配列である。
選択された標的部位A1、A2、A3およびPDSはクラス(1)の標的部位に属し、標的部位A4はクラス(2)の標的部位に属する。
本実験結果は、クラス(1)の標的部位に対するeSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1の編集効率が極度に低いことを示す。eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1の編集効率とWT SpCas9の編集効率との違いは、クラス(2)の標的部位に対しては有意ではない。このことは、転写から結果として生じるsgRNAの5’末端における追加のヌクレオチドが、eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1の編集効率を低減させることができることを示す。
OsU3プロモーターと同様に、トウモロコシU6プロモーター(TaU6)は、ヌクレオチドGで転写を開始しなければならず、それゆえ、標的部位に対するsgRNA発現ベクターの設計を、次のように2つの条件に分けることができる。
(1)所望のsgRNA標的配列(20bp)の5’末端における第一のヌクレオチドがA/T/Cのいずれか1つである場合、U6プロモーターがGで転写を開始するので、転写されたsgRNAの5’末端に追加のGが付加され、さらに、転写されたsgRNAは、標的配列と完全にマッチすることができない。
(2)所望のsgRNA標的配列(20bp)の5’末端における第一のヌクレオチドがGである場合、転写を開始するためにU6プロモーターによって使用されることができ、それゆえ、追加のヌクレオチドは、転写されたsgRNAの5’末端に存在しない。
OsPDS標的部位は、クラス(2)の標的部位に属する。TaU6プロモーターを使用して、OsPDS標的部位に対するGN19sgRNAおよびGN20sgRNAの転写を駆動し、ここで、GN20は、クラス(1)の標的部位を、すなわちsgRNAの5’末端における追加のGで模倣することができる。
本結果は、sgRNAの5’末端における1つの追加のGが、eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1の編集効率を有意に低減させることを示す(図2)。
実施例2:tRNA−sgRNA融合によるCas9バリアントの編集効率の上昇
実施例1の結果によると、eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1の編集効率に影響する重要な因子は、sgRNAが正確に開始されているか否かである。
実施例1の結果によると、eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1の編集効率に影響する重要な因子は、sgRNAが正確に開始されているか否かである。
先行報告によると、tRNAとsgRNAの5’末端との融合は、sgRNAの発現を上方調節し、結果的にsgRNAの5’末端における正確な開裂を生じ、それによりsgRNAの5’末端における追加のヌクレオチドを回避する(Xie K,Minkenberg B,Yang Y.Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA−processing system.Proc Natl Acad Sci U S A.2015 Mar 17; 112(11): 3570〜3575.doi: 10.1073/pnas.1420294112.Epub 2015 Mar 2を参照されたい)。
実施例1における各標的部位に対するsgRNAをtRNAと融合させて、OsU3プロモーターの制御下で発現させた。実施例1における方法によって、sgRNAの替わりにtRNA−sgRNAを用いて、実験を実施した。図2に示すように、標的部位A1、A2、A3およびPDSに対して、eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1の編集効率は、sgRNAの替わりにtRNA−sgRNAを用いると有意に上昇する。
実施例3:Cas9バリアントの編集特異性へのtRNA−sgRNA融合体の影響
3.1 イネOsMKK4標的部位
イネ遺伝子MKK4における標的部位GACGTCGGCGAGGAAGGCCTCGGを選択して、sgRNAおよびtRNA−sgRNAを設計した。この標的部位は、図5に示すような2つの可能なオフターゲット部位を有する。sgRNAまたはtRNA−sgRNAを発現させるためのベクター、ならびにWTSpCas9、eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1を発現させるためのベクターをそれぞれ、イネプロトプラスト内へと同時形質転換した。形質転換の2日後、プロトプラストDNAを抽出し、標的部位およびオフターゲット部位のゲノムフラグメントを、特異的プライマーによって増幅した。この3つの部位の変異率を、第二世代配列決定技術を用いて分析した。
3.1 イネOsMKK4標的部位
イネ遺伝子MKK4における標的部位GACGTCGGCGAGGAAGGCCTCGGを選択して、sgRNAおよびtRNA−sgRNAを設計した。この標的部位は、図5に示すような2つの可能なオフターゲット部位を有する。sgRNAまたはtRNA−sgRNAを発現させるためのベクター、ならびにWTSpCas9、eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1を発現させるためのベクターをそれぞれ、イネプロトプラスト内へと同時形質転換した。形質転換の2日後、プロトプラストDNAを抽出し、標的部位およびオフターゲット部位のゲノムフラグメントを、特異的プライマーによって増幅した。この3つの部位の変異率を、第二世代配列決定技術を用いて分析した。
本実験結果を図5に示す。
sgRNAを使用すると、WTSpCas9と比較して、eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1は、極度に低いオフターゲット効果を有するが、有意により低い編集効率を有する。
tRNA−sgRNAを使用すると、各群の編集効率は上昇したが、eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1は比較的高い特異性を維持できる。特にSpCas9−HF1に対しては、極度に低レベルの変異のみを2つのオフターゲット部位について双方とも検出することができる。それゆえ、tRNA−sgRNAとSpCas9−HF1との組み合わせは、高い効率および高い特異性を有するゲノム編集に特に適している。
3.2 イネOsCDKB2標的部位
イネ遺伝子OsCDKB2における標的部位AGGTCGGGGAGGGGACGTACGGGを選択して、sgRNAを設計した。この標的部位は、図6に示すように3つの可能なオフターゲット部位を有する。sgRNAまたはtRNA−sgRNAを発現させるためのベクターならびにWTSpCas9、eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1を発現させるためのベクターをそれぞれ、イネプロトプラスト内へと同時形質転換した。形質転換の2日後、プロトプラストDNAを抽出し、特異的プライマーを使用することによって標的部位およびオフターゲット部位のゲノムフラグメントを増幅した。この4つの部位の変異率をディープシーケンシングによって分析した。
イネ遺伝子OsCDKB2における標的部位AGGTCGGGGAGGGGACGTACGGGを選択して、sgRNAを設計した。この標的部位は、図6に示すように3つの可能なオフターゲット部位を有する。sgRNAまたはtRNA−sgRNAを発現させるためのベクターならびにWTSpCas9、eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1を発現させるためのベクターをそれぞれ、イネプロトプラスト内へと同時形質転換した。形質転換の2日後、プロトプラストDNAを抽出し、特異的プライマーを使用することによって標的部位およびオフターゲット部位のゲノムフラグメントを増幅した。この4つの部位の変異率をディープシーケンシングによって分析した。
本実験結果を図6に示す。標的部位に対するeSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1の編集効率は、sgRNAの替わりにtRNA−sgRNAを用いることによって有効に上昇する。特に、SpCas9−HF1の編集効率は、野生型のレベルまで復元させることができ、高い特異性を維持できる。この標的配列はAで開始するので、AによってU3プロモーターが転写を正確に開始することができ、編集効率の上昇が、tRNAとの融合体によるsgRNAの発現レベルの上昇から結果的に生じるのかもしれない。
実施例4:gRNAと標的配列とのミスマッチに対するCas9バリアントの編集特異性
イネ遺伝子MKK4における標的部位GACGTCGGCGAGGAAGGCCTCGGについてsgRNAを設計するとき、2つの隣接した塩基のミスマッチを人工的に導入した(プリンに対してはプリン、かつピリミジンに対してはピリミジン)。sgRNAがこの標的部位と完全にマッチすることができない条件下での編集を検出した。編集を検出することができる場合、オフターゲットとしてみなす。本実験は、実施例3.1における実験と同様の方法で実施した。
イネ遺伝子MKK4における標的部位GACGTCGGCGAGGAAGGCCTCGGについてsgRNAを設計するとき、2つの隣接した塩基のミスマッチを人工的に導入した(プリンに対してはプリン、かつピリミジンに対してはピリミジン)。sgRNAがこの標的部位と完全にマッチすることができない条件下での編集を検出した。編集を検出することができる場合、オフターゲットとしてみなす。本実験は、実施例3.1における実験と同様の方法で実施した。
本実験結果を図7に示した。tRNA−sgRNAを使用した場合に、SpCas9バリアントは、gRNAと標的配列とのミスマッチ(特に、いずれかの末端に対してより近いミスマッチ)に対してより高い感受性を示した。
実施例5:ヒト胚性腎293細胞におけるCas9バリアントの編集効率および編集特異性
ヒトVEGFA遺伝子内の標的配列GGTGAGTGAGTGTGTGCGTGTGGに対してsgRNAを設計した。U6:sgRNA−GN19およびU6:tRNA−sgRNA−N20は、U6プロモーターで転写されたsgRNAが長さ20ntであり、かつ標的配列と完全にマッチすることを表し、U6:sgRNA−GN20は、U6プロモーターで転写されたsgRNAが長さ21ntであり、かつ追加のGを5’末端に含有することを表す。
ヒトVEGFA遺伝子内の標的配列GGTGAGTGAGTGTGTGCGTGTGGに対してsgRNAを設計した。U6:sgRNA−GN19およびU6:tRNA−sgRNA−N20は、U6プロモーターで転写されたsgRNAが長さ20ntであり、かつ標的配列と完全にマッチすることを表し、U6:sgRNA−GN20は、U6プロモーターで転写されたsgRNAが長さ21ntであり、かつ追加のGを5’末端に含有することを表す。
T7E1アッセイの結果は、異なる戦略で転写されたsgRNAを使用したとき、WT Cas9が同様の編集効率を呈することを示す(図8)。しかしながら、sgRNAが追加のヌクレオチドを5’末端に含有するとき、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1の編集効率は、有意に低減した。さらに、tRNA−sgRNA融合体を用いることによって、eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1の編集効率は、WT Cas9の編集効率までまたはそれより高くにさえ上昇した。
編集特異性に関して、WT Cas9は、オフターゲット1およびオフターゲット2の両部位においてオフターゲット編集を結果的に生じた。eSpCas9(1.1)およびSpCas9−HF1は、tRNA−sgRNA融合体を使用したとき、オフターゲット編集を結果的に生じなかった。
Claims (15)
- 次のi)〜iii)、すなわち
i)Cas9ヌクレアーゼバリアント、およびtRNA−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ii)Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびtRNA−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、ならびに
iii)Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列とtRNA−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
から選択される少なくとも1つを含む、細胞のゲノム内の標的配列を部位特異的に改変するためのゲノム編集システムであって、
前記Cas9ヌクレアーゼバリアントは、野生型Cas9ヌクレアーゼと比較してより高い特異性を有し、
前記ガイドRNAの5’末端は、前記tRNAの3’末端へ連結されており、
前記融合体は、細胞内で転写されたのち、前記ガイドRNAの前記5’末端で開裂し、それにより余分なヌクレオチドを前記5’末端に保有していないガイドRNAを形成する、ゲノム編集システム。 - 次のi)〜iii)、すなわち
i)Cas9ヌクレアーゼバリアント、およびリボザイム−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ii)Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびリボザイム−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、ならびに
iii)Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列とリボザイム−ガイドRNA融合体をコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
から選択される少なくとも1つを含む、細胞のゲノム内の標的配列を部位特異的に改変するためのゲノム編集システムであって、
前記Cas9ヌクレアーゼバリアントは、野生型Cas9ヌクレアーゼと比較してより高い特異性を有し、
前記ガイドRNAの5’末端は、第一のリボザイムの3’末端へ連結されており、
前記第一のリボザイムは、前記ガイドRNAの前記5’末端で前記融合体を開裂させるよう設計され、それにより余分なヌクレオチドを前記5’末端に保有していないガイドRNAを形成する、ゲノム編集システム。 - 改変されることになっているtRNAおよび細胞が、同じ種に由来する、請求項1記載のシステム。
- 前記tRNAが、配列番号1において示される配列によってコードされる、請求項1記載のシステム。
- 前記Cas9ヌクレアーゼバリアントが配列番号2のバリアントであり、かつ配列番号2の位置855におけるアミノ酸置換を含み、例えば、前記アミノ酸置換がK855Aである、請求項1または2記載のシステム。
- 前記Cas9ヌクレアーゼバリアントが配列番号2のバリアントであり、かつ配列番号2の位置810、1003および1060においてアミノ酸置換を含み、例えば、前記アミノ酸置換がK810A、K1003AおよびR1060Aである、請求項1または2記載のシステム。
- 前記Cas9ヌクレアーゼバリアントが配列番号2のバリアントであり、かつ配列番号2の位置848、1003および1060においてアミノ酸置換を含み、例えば、前記アミノ酸置換がK848A、K1003AおよびR1060Aである、請求項1または2記載のシステム。
- 前記Cas9ヌクレアーゼバリアントが配列番号2のバリアントであり、かつ配列番号2の位置611、695および926においてアミノ酸置換を含み、例えば、前記アミノ酸置換がR611A、Q695AおよびQ926Aである、請求項1または2記載のシステム。
- 前記Cas9ヌクレアーゼバリアントが配列番号2のバリアントであり、かつ配列番号2の位置497、611、695および926においてアミノ酸置換を含み、例えば、前記アミノ酸置換がN497A、R611A、Q695AおよびQ926Aである、請求項1または2記載のシステム。
- 前記Cas9ヌクレアーゼバリアントが配列番号4、配列番号5または配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1または2記載のシステム。
- 前記Cas9ヌクレアーゼバリアントをコードする前記ヌクレオチド配列が、改変されることになっている前記細胞が由来する生体についてコドンが最適化されている、請求項1または2記載のシステム。
- 前記ガイドRNAが一本鎖ガイドRNA(sgRNA)である、請求項1または2記載のシステム。
- 細胞を遺伝子改変するための方法であって、請求項1から12までのいずれか1項記載のシステムを前記細胞へ導入し、かつそれにより前記Cas9ヌクレアーゼバリアントが前記ガイドRNAによって前記細胞の前記ゲノム内の前記標的配列へ定方向化され、かつ前記標的配列中の1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失および/または付加を結果的に生じることを含む、方法。
- 前記細胞が、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシおよびネコなどの哺乳類、ニワトリ、アヒルおよびガチョウなどの家禽類、ならびにイネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、オオムギ、ダイズ、ラッカセイおよびシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)などの単子葉類および双子葉類を含む植物に由来する、請求項13記載の方法。
- 前記システムが、リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リポソームトランスフェクション、微量注射、ウイルス感染(バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよび他のウイルスなど)、微粒子銃、PEG仲介プロトプラスト形質転換およびアグロバクテリウム仲介形質転換から選択される方法によって前記細胞内へと導入される、請求項13または14記載の方法。
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