BR112019017138A2 - sistema e método de edição de genoma - Google Patents

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Abstract

a presente invenção refere-se a um sistema de edição de genoma para modificação direcionada a sítio de uma sequência-alvo no genoma de uma célula, o qual compreende uma variante de nuclease cas9 tendo especificidade maior comparado com a nuclease cas9 do tipo selvagem ou seu construto de expressão, e um construto de expressão compreendendo a sequência de codificação de fusão de trna-grna ou fusão de ribozima-grna, ou compreende um construto de expressão compreendendo as sequências de codificação da variante de nuclease cas9 e trna-grna ou ribozima-grna. é também provido um método para modificar geneticamente uma célula através da introdução do sistema de edição de genoma, o qual tem eficiência alta e especificidade alta.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para SISTEMA E MÉTODO DE EDIÇÃO DE GENOMA.
CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção refere-se ao campo de engenharia genética. Em particular, a presente invenção refere-se a um método de edição de genoma com alta eficiência e alta especificidade. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um método para aumento da eficiência de modificação direcionada a sítio de uma sequência-alvo em um genoma de um organismo por uma variante de nuclease Cas9 de alta especificidade.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas e sistema associado a CRISPR (CRISPR/Cas9) é a ferramenta mais popular para edição de genoma. No sistema, proteína Cas9 cliva uma sequência de DNA específica sob a orientação de um gRNA para criar uma quebra de filamento duplo (DSB). DSB pode ativar mecanismos de reparo intracelular de união de extremidade não homóloga (NHEJ) e recombinação homóloga (HR) para reparar dano a DNA em células de modo que a sequência de DNA específica é editada durante o processo de reparo. Atualmente, a proteína Cas9 mais comumente usada é Cas9 derivada de Streptococcus pyogenes (SpCas9). Uma desvantagem do sistema de edição de genoma CRISPR/Cas9 é sua baixa especificidade e efeito fora do alvo, o que limita muito a aplicação do mesmo.
[003] Permanece uma necessidade na técnica de um método e ferramenta que permitam edição de genoma de alta especificidade, eficiente.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [004] Em um aspecto, a presente invenção provê um sistema de edição de genoma para modificação direcionada a sítio de uma se
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2/30 quência-alvo no genoma de uma célula, que compreende pelo menos uma selecionada de i) a iii) que seguem:
uma variante de nuclease Cas9 e um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma fusão de tRNA-RNA-guia;
um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma variante de nuclease Cas9 e um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma fusão de tRNA-RNA-guia; e um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma variante de nuclease Cas9 e uma sequência de nucleotídeo codificando uma fusão de tRNA-RNA-guia;
em que a variante de nuclease Cas9 tem especificidade maior comparado com a nuclease Cas9 do tipo selvagem, em que a extremidade 5’ do RNA-guia é ligada à extremidade 3’ do tRNA, em que a fusão é clivada na extremidade 5’ do RNA-guia após ser transcrita na célula, desta maneira formando um RNA-guia que não carrega nucleotídeo extra na extremidade 5’.
[005] Em um segundo aspecto, a presente invenção provê um sistema de edição de genoma para modificação direcionada a sítio de uma sequência-alvo no genoma de uma célula, que compreende pelo menos uma selecionada dos i) a iii) que seguem:
uma variante de nuclease Cas9 e um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma fusão de ribozima-RNA-guia;
um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma variante de nuclease Cas9 e um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma fusão de ribozima-RNA-guia; e
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3/30 um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma variante de nuclease Cas9 e uma sequência de nucleotídeo codificando uma fusão de ribozima-RNA-guia;
em que a variante de nuclease Cas9 tem especificidade maior comparado com a nuclease Cas9 do tipo selvagem, em que a extremidade 5’ do RNA-guia é ligada à extremidade 3’ de uma primeira ribozima, em que a primeira ribozima é projetada para clivar a fusão na extremidade 5’ do RNA-guia, desta maneira formando um RNAguia que não carrega nucleotídeo extra na extremidade 5’.
[006] Em um terceiro aspecto, a presente invenção provê um método para modificar geneticamente uma célula, o qual compreende introdução do sistema de edição de genoma da presente invenção na célula, de maneira que a variante de nuclease Cas9 é direcionada a uma sequência-alvo no genoma da célula pelo RNA-guia, e resulta em substituição, deleção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos na sequência-alvo.
[007] Em um quarto aspecto, a presente invenção provê um organismo geneticamente modificado, o qual compreende uma célula geneticamente modificada produzida através do método da presente invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [008] A Figura 1 mostra as estratégias para projeto de sgRNA para sequências-alvo com nucleotídeos de extremidade 5’ diferentes quando usando U3 ou U6. A: através de fusão com tRNA, sgRNA pode ser projetado sem considerar o nucleotídeo de extremidade 5’ da sequência-alvo; B: divagem precisa de fusão de tRNA-sgRNA.
[009] A Figura 2 mostra a eficiência de edição de WT SpCas9 (SpCas9 do tipo selvagem), eSpCas9(1.0), eSpCas9(1.1), SpCas9HF1 sobre alvos de classe (1).
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4/30 [0010] A Figura 3 mostra a eficiência de edição de WT SpCas9 (SpCas9 do tipo selvagem), eSpCas9(1.0), eSpCas9(1.1), SpCas9HF1 sobre alvos de classe (2).
[0011] A Figura 4 mostra que o nucleotídeo adicional na extremidade 5’ de sgRNA afeta a eficiência de edição quando promotor U6 é usado.
[0012] A Figura 5 mostra que para o locus OsMKK4, tRNA-sgRNA pode melhorar a eficiência de edição e manter especificidade alta comparado com sgRNA.
[0013] A Figura 6 mostra que para o locus OsCDKB2, o uso de tRNA-sgRNA pode aumentar a eficiência de edição para o nível de SpCas9 do tipo selvagem, enquanto mantendo especificidade alta.
[0014] A Figura 7 mostra a especificidade de edição de variante de Cas9 para incompatibilidade entre gRNA e sequência-alvo.
[0015] A Figura 8 mostra que tRNA-sgRNA melhorou a eficiência de edição de eSPCas9(1.1) e SpCas9-HF1 para aquela de SpCas9 do tipo selvagem em células humanas.
[0016] A Figura 9 mostra a estrutura de sequência de vetor pUC57-U3-tRNA-sgRNA para expressão de fusão tRNA-sgRNA.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
1. Definição [0017] Na presente invenção, a menos que de outro modo indicado, as terminologias científicas e tecnológicas usadas aqui referem-se a significados comumente compreendidos por um versado na técnica. Também, as terminologias e procedimentos experimentais usados aqui com relação à química de proteína e nucleotídeo, biologia molecular, cultivo de célula de tecido, microbiologia, imunologia, todos pertencem a terminologias e métodos convencionais geralmente usados na técnica. Por exemplo, a recombinação de DNA padrão e tecnologia de clonagem molecular usadas aqui são bem conhecidas de um ver
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5/30 sado na técnica e são descritas em detalhes nas referências que seguem: Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory ManualCold Spring Harbor Laboratory PressCold Spring Harbor, 1989. Nesse ínterim, a fim de melhor compreender a presente invenção, definições e explicações para as terminologias relevantes são providas abaixo.
[0018] Nuclease Cas9 e Cas 9 podem ser usados intercomutavelmente aqui, que se referem a uma nuclease direcionada a RNA, incluindo a proteína Cas9 ou fragmentos da mesma (tal como uma proteína compreendendo um domínio de divagem de DNA ativo de Cas9 e/ou um domínio de ligação a gRNA de Cas9). Cas9 é um componente do sistema de edição de genoma CRISPR/Cas (repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas e seu sistema associado), que se direciona a e cliva uma sequência-alvo de DNA para formar quebras de filamento duplo de DNA (DSB) sob a orientação de um RNA-guia.
[0019] RNA-guia e gRNA podem ser usados intercomutavelmente aqui, os quais são tipicamente compostos de moléculas de crRNA e tracrRNA formando complexos através de complemento parcial, em que crRNA compreende uma sequência que é suficientemente complementar a uma sequência-alvo para hibridização e direciona o complexo CRISPR (Cas9+crRNA+tracrRNA) para se ligar especificamente à sequência-alvo. No entanto, é conhecido na técnica que RNAguia único (sgRNA) pode ser projetado, o qual compreende as características de ambos crRNA e tracrRNA.
[0020] Como usado aqui, os termos tRNA e RNA de transferência são usados intercomutavelmente para se referir a RNAs de molécula pequena que têm a função de carregamento e transporte de aminoácidos. A molécula de tRNA geralmente consiste em uma cadeia curta de cerca de 70-90 nucleotídeos dobrada em um formato de tre
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6/30 vo. Em eucariontes, genes de tRNA no genoma são transcritos em precursores de tRNA, que são então processados em tRNA maduro após excisão das sequências adicionais 5’ e 3’ por RNase P e RNase Z.
[0021] Como usado aqui, o termo ribozima refere-se a uma molécula de RNA que tem uma função catalítica que participa na divagem e processamento de RNA através de catálise das reações de hidrólise de ligação transfosfato e fosfodiéster.
[0022] Genoma como usado aqui compreende não apenas DNA cromossomal presente no núcleo, mas também DNA de organela presente nos componentes subcelulares (por exemplo, mitocôndria, plastídeos) da célula.
[0023] Como aqui usado, organismo inclui qualquer organismo que seja adequado para edição genômica. Organismos exemplares incluem, mas não estão limitados a, mamíferos tais como humano, camundongo, rato, macaco, cachorro, porco, ovelha, gado, gato; aves tais como galinha, pato, ganso; plantas incluindo monocotiledôneas e dicotiledôneas tais como arroz, milho, trigo, sorgo, cevada, soja, amendoim, Arabidopsis e similar.
[0024] Organismo geneticamente modificado ou célula geneticamente modificada significa um organismo ou célula que contém um polinucleotídeo exógeno ou gene modificado ou sequência de controle de expressão dentro de seu genoma. Por exemplo, o polinucleotídeo exógeno é estavelmente integrado ao genoma de um organismo ou célula e herdado por gerações sucessivas. O polinucleotídeo exógeno pode ser integrado ao genoma sozinho ou como parte de um construto de DNA recombinante. O gene ou sequência de controle de expressão modificado está na sequência no genoma do organismo ou célula que compreende substituições, deleções e adições de desoxinucleotídeos simples ou múltiplas.
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7/30 [0025] O termo exógeno com relação à sequência significa uma sequência que se origina de uma espécie estranha, ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificada de sua forma nativa em composição e/ou locus genômico por intervenção humana deliberada.
[0026] Polinucleotídeo, sequência de ácido nucleico, sequência de nucleotídeo e fragmento de ácido nucleico são usados intercomutavelmente para se referir a um polímero de RNA ou DNA que é de filamento simples ou duplo, contendo opcionalmente bases de nucleotídeo sintéticas, não naturais ou alteradas. Nucleotídeos (geralmente encontrados em sua forma 5’-monofosfato) são referidos por sua designação de letra única como segue: A para adenilato ou desoxiadenilato (para RNA ou DNA, respectivamente), C para citidilato ou desoxicitidilato, G para guanilato ou desoxiguanilato, U para uridilato, T para desoxitimidilato, R para purinas (A ou G), Y para pirimidinas (C ou T), K para G ou T, Ή para A ou C ou T, I para inosina e N para qualquer nucleotídeo.
[0027] Polipeptídeo, peptideo, sequência de aminoácido e proteína são usados aqui intercomutavelmente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduo de aminoácido é um análogo químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como polímeros de aminoácido de ocorrência natural. Os termos polipeptídeo, peptideo, sequência de aminoácido e proteína são também inclusivos de modificações incluindo, mas não limitado a, glicosilação, ligação de lipídeo, sulfação, gama-carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ADP-ribosilação.
[0028] Como aqui usado, um construto de expressão refere-se a um vetor adequado para expressão de uma sequência de nucleotídeo de interesse em um organismo, tal como um vetor recombinante. Ex
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8/30 pressão refere-se à produção de um produto funcional. Por exemplo, a expressão de uma sequência de nucleotídeo pode se referir à transcrição da sequência de nucleotídeo (tal como transcrito para produzir um mRNA ou um RNA funcional) e/ou tradução de RNA em um precursor de proteína ou uma proteína madura.
[0029] Construto de expressão da invenção pode ser um fragmento de ácido nucleico linear, um plasmídeo circular, um vetor viral ou, em algumas modalidades, um RNA que pode ser traduzido (tal como um mRNA).
[0030] Construto de expressão da invenção pode compreender sequências reguladoras e sequências de nucleotídeo de interesse que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências de nucleotídeo de interesse derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira diferente daquela normalmente encontrada na natureza.
[0031] Sequência reguladora e elemento regulador são usados intercomutavelmente e referem-se a sequências de nucleotídeo localizadas a montante (sequência de não codificação 5’), dentro, ou a jusante (sequências de não codificação 3’) de uma sequência de codificação, e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA ou tradução da sequência de codificação associada. Sequências reguladoras podem incluir, mas não estão limitadas a, promotores, sequências líder de tradução, introns e sequências de reconhecimento de poliadenilação.
[0032] Promotor refere-se a um fragmento de ácido nucleico capaz de controlar a transcrição de um outro fragmento de ácido nucleico. Em algumas modalidades da presente invenção, o promotor é um promotor capaz de controlar a transcrição de um gene em uma célula, seja ele ou não derivado da célula. O promotor pode ser um promotor constitutivo ou um promotor específico de tecido ou um promotor de
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9/30 senvolvimentalmente regulado ou um promotor induzível.
[0033] Promotor constitutivo refere-se a um promotor que pode causar expressão de um gene na maioria das circunstâncias na maioria dos tipos de célula. Promotor específico de tecido e promotor preferido de tecido são usados intercomutavelmente e referem-se a um promotor que é expresso predominantemente, mas não necessariamente exclusivamente, em um tecido ou órgão, mas que pode ser também expresso em uma célula ou tipo de célula específico. Promotor desenvolvimentalmente regulado refere-se a um promotor cuja atividade é determinada por eventos desenvolvimentais. Promotor induzível expressa seletivamente uma sequência de DNA operavelmente ligada a ele em resposta a um estímulo endógeno ou exógeno (ambiental, hormônios ou sinais químicos, e outros).
[0034] Como usado aqui, o termo operavelmente ligado significa que um elemento regulador (por exemplo, mas não limitado a, uma sequência promotora, uma sequência de terminação de transcrição, e outros) está associado a uma sequência de ácido nucleico (tal como uma sequência de codificação ou uma estrutura de leitura aberta), de modo que a transcrição da sequência de nucleotídeo é controlada e regulada pelo elemento transcripcional regulador. Técnicas para ligar operativamente uma região e elemento regulador a uma molécula de ácido nucleico são conhecidas no campo.
[0035] Introdução de uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, plasmídeo, fragmento de ácido nucleico linear, RNA, etc.) ou proteína em um organismo significa que o ácido nucleico ou proteína é usado para transformar uma célula do organismo de modo que o ácido nucleico ou proteína funcione na célula. Como usado na presente invenção, transformação inclui ambas as transformações estáveis e transientes. Transformação estável refere-se à introdução de uma sequência de nucleotídeo exógena no genoma, resultando na herança
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10/30 estável de genes estranhos. Uma vez estavelmente transformada, a sequência de ácido nucleico exógena é adequadamente integrada ao genoma do organismo e qualquer uma de suas gerações sucessivas. Transformação transiente refere-se à introdução de uma molécula de ácido nucleico ou proteína em uma célula, realização de sua função sem a herança estável de um gene exógeno. Em transformação transiente, a sequência de ácido nucleico exógena não é integrada ao genoma.
2. Sistema de edição de genoma com eficiência alta e especificidade alta [0036] Foi relatado que a variante de nuclease Cas9 eSpCas9 (1.0) (K810A/K1003A/R1060A), eSpCas9(1.1) (K848A/K1003A/R1060A) de Feng Zhang e outros e a variante de nuclease Cas9 SpCas9-HF1 (N497A/R661A/Q695A/Q926A) desenvolvida por J. Keith Joung e outros são capazes de reduzir significantemente a taxa fora do alvo em edição genômica, e então têm especificidade alta. No entanto, surpreendentemente, os presentes inventores constataram que essas três variantes de nuclease Cas9, embora tendo especificidade alta, têm uma eficiência de edição de gene muito menor comparado com Cas9 do tipo selvagem.
[0037] Os presentes inventores constataram surpreendentemente que ao fundir a extremidade 5’ do RNA-guia a um tRNA, a eficiência de edição da variante de nuclease Cas9 de especificidade alta pode ser aumentada, mesmo para o nível do tipo selvagem, enquanto mantendo a especificidade alta.
[0038] Sem pretender ser limitado por nenhuma teoria, acredita-se que a redução de eficiência de edição de variantes de nuclease Cas9 de especificidade alta esteja relacionada com se a transcrição de RNA-guia pode ser precisamente iniciada ou não. Na técnica, promotores comumente usados para produção de RNA-guia in vivo incluem,
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11/30 por exemplo, promotores U6 ou U3 de snRNA, para os quais a transcrição é dirigida por polimerase de RNA III. O promotor U6 precisa iniciar transcrição em G, e então para as sequências-alvo com o primeiro nucleotídeo de A, C ou T, um G adicional estará presente na extremidade 5’ de sgRNA como transcrito. O promotor U3 inicia transcrição em A, e então para as sequências-alvo com o primeiro nucleotídeo de G, C ou T, um A adicional estará presente na extremidade 5’ de sgRNA como transcrito. Os inventores constataram que a eficiência de edição de variantes de nuclease Cas9 de especificidade alta é reduzida no caso de um nucleotídeo adicional estar presente na extremidade 5’ do sgRNA. Através de transcrição por fusão com um tRNA, devido ao mecanismo de processamento preciso de tRNA (remoção precisa de sequência adicional de 5’ e 3’ de precursor de tRNA para formar tRNA maduro), sgRNA sem nucleotídeo adicional na extremidade 5’ pode ser prontamente obtido mesmo usando promotores U6 ou U3, sem a necessidade de considerar o tipo do primeiro nucleotídeo da sequência-alvo. Desta maneira, a eficiência de edição de variantes de nuclease Cas9 de especificidade alta pode ser melhorada, e a faixa selecionável de sequências-alvo pode ser estendida. Ainda, sem pretender ser limitado pela teoria, fusão com tRNA pode aumentar o nível de expressão de sgRNA, que pode também contribuir para a melhora de eficiência de edição de variantes de nuclease Cas9 de especificidade alta.
[0039] Desta maneira, a presente invenção provê um sistema de edição de genoma para modificação direcionada a sítio de uma sequência-alvo no genoma de uma célula, que compreende pelo menos uma selecionada de i) a iii) que seguem:
uma variante de nuclease Cas9 e um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma fusão de tRNA-RNA-guia;
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12/30 um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma variante de nuclease Cas9 e um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma fusão de tRNA-RNA-guia; e um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma variante de nuclease Cas9 e uma sequência de nucleotídeo codificando uma fusão de tRNA-RNA-guia;
em que a variante de nuclease Cas9 tem especificidade maior comparado com a nuclease Cas9 do tipo selvagem, em que a extremidade 5’ do RNA-guia é ligada à extremidade 3’ do tRNA, em que a fusão é clivada na extremidade 5’ do RNA-guia após ser transcrita na célula, desta maneira formando um RNA-guia que não carrega nucleotídeo extra na extremidade 5’.
[0040] Em algumas modalidades, o tRNA e a célula a ser modificada são da mesma espécie.
[0041] Em algumas modalidades específicas, o tRNA é codificado pela sequência que segue: aacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccc tgccacggtacagacccgggttcgattcccggctggtgca (SEQ ID NO:1).
[0042] O projeto da fusão de tRNA-RNA-guia está dentro da habilidade do versado na técnica. Por exemplo, referência pode ser feita a Xie e outros, PNAS, Mar 17, 2015; vol. 112, no. 11,3570-3575.
[0043] A presente invenção também considera a fusão de um RNA-guia e uma ribozima. Com base no que é constatado na invenção que a eficiência de edição de variantes de nuclease Cas9 de especificidade alta está relacionada com a iniciação de transcrição precisa de sgRNA, ao usar a habilidade de ribozima em cortar RNA em sítio específico, é possível produzir sgRNA sem nucleotídeo adicional na extremidade 5’ através de projeto racional de uma fusão de RNA e ribozima, de modo a melhorar a eficiência de edição enquanto mantendo a
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13/30 especificidade alta.
[0044] Desta maneira, a invenção também provê um sistema de edição de genoma para modificação direcionada a sítio de uma sequência-alvo no genoma de uma célula, que compreende pelo menos uma selecionada de i) a iiii) que seguem:
uma variante de nuclease Cas9 e um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma fusão de ribozima-RNA-guia;
um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma variante de nuclease Cas9 e um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma fusão de ribozima-RNA-guia; e um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma variante de nuclease Cas9 e uma sequência de nucleotídeo codificando uma fusão de ribozima-RNA-guia;
em que a variante de nuclease Cas9 tem especificidade maior comparado com a nuclease Cas9 do tipo selvagem, em que a extremidade 5’ do RNA-guia é ligada à extremidade 3’ de uma primeira ribozima, em que a primeira ribozima é projetada para clivar a fusão na extremidade 5’ do RNA-guia, desta maneira formando um RNAguia que não carrega nucleotídeo extra na extremidade 5’.
[0045] Em uma modalidade, a extremidade 3’ do RNA-guia é ligada à extremidade 5’ de uma segunda ribozima, a segunda ribozima é projetada para clivar a fusão na extremidade 3’ do RNA-guia, dessa maneira formando um RNA-guia que não carrega nucleotídeo extra na extremidade 3’.
[0046] O projeto da primeira ribozima ou da segunda ribozima está dentro da habilidade do versado na técnica. Por exemplo, referência pode ser feita a Gao e outros, JIPB, Abr, 2014; Vol 56, Edição 4, 343Petição 870190079766, de 16/08/2019, pág. 27/110
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349.
[0047] Em uma modalidade específica, a primeira ribozima é codificada pela sequência que segue: 5'-(N)6CTGATGAGTCCGTGAGGA CGAAACGAGTAAGCTCGTC-3' (SEQ ID NO:12), em que N é independentemente selecionado de A, G, C e T e (Ν)θ refere-se a uma sequência reversamente complementar aos primeiros 6 nucleotídeos na extremidade 5’ do RNA-guia. Em uma modalidade específica, a segunda ribozima é codificada pela sequência que segue: 5’-GGCCG GCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCT TCGGCATGGCGAATGGGAC-3’ (SEQ ID NO: 13).
[0048] A variante de nuclease Cas9 na invenção que tem especificidade maior comparado com nuclease Cas9 do tipo selvagem pode ser derivada de Cas9 de várias espécies, por exemplo, derivada de Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9, sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 2, sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3).
[0049] Em algumas modalidades da invenção, a variante de nuclease Cas9 é uma variante de SEQ ID NO: 2, que compreende uma substituição de aminoácido na posição 855 de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades específicas, a substituição de aminoácido na posição 855 é K855A.
[0050] Em algumas modalidades da invenção, a variante de nuclease Cas9 é uma variante de SEQ ID NO: 2, que compreende substituições de aminoácido nas posições 810, 1003 e 1060 de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades específicas, as substituições de aminoácido são respectivamente K810A, K1003A e R1060A.
[0051] Em algumas modalidades da invenção, a variante de nuclease Cas9 é uma variante de SEQ ID NO: 2, que compreende as substituições de aminoácido nas posições 848, 1003 e 1060 de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades específicas, as substituições de
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15/30 aminoácido são respectivamente K848A, K1003A e R1060A.
[0052] Em algumas modalidades da invenção, a variante de nuclease Cas9 é uma variante de SEQ ID NO: 2, que compreende substituições de aminoácido nas posições 611, 695 e 926 de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades específicas, as substituições de aminoácido são respectivamente R611 A, Q695A e Q926A.
[0053] Em algumas modalidades da invenção, a variante de nuclease Cas9 é uma variante de SEQ ID NO: 2, que compreende substituições de aminoácido nas posições 497, 611, 695 e 926 de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades específicas, as substituições de aminoácido são respectivamente N497A, R611 A, Q695A e Q926A.
[0054] Em algumas modalidades específicas da invenção, a variante de nuclease Cas9 compreende uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 4 (eSpCas9(1.0)), SEQ ID NO:5 (eSpCas9(1.1)) ou SEQ ID NO:6 (SpCas9-HF1).
[0055] Em algumas modalidades da invenção, a variante de nuclease Cas9 da invenção compreende ainda uma sequência de localização nuclear (NLS). Em geral, uma ou mais NLSs na variante de nuclease Cas9 devem ter resistência suficiente para conduzir o acúmulo da variante de nuclease Cas9 no núcleo da célula em uma quantidade suficiente para a função de edição de genoma. Em geral, a resistência da atividade de localização nuclear é determinada pelo número e posição de NLSs, e uma ou mais NLSs específicas usadas na variante de nuclease Cas9, ou uma combinação das mesmas.
[0056] Em algumas modalidades da presente invenção, as NLSs da variante de nuclease Cas9 da invenção podem estar localizadas no terminal N e/ou terminal C. Em algumas modalidades, a variante de nuclease Cas9 compreende cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais NLSs. Em algumas modalidades, a variante de nuclease Cas9 compreende cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais NLSs no ou
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16/30 próximo do terminal N. Em algumas modalidades, a variante de nuclease Cas9 compreende cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais NLSs no ou próximo do terminal C. Em algumas modalidades, a variante de nuclease Cas9 compreende uma combinação dessas, tais como uma ou mais NLSs no terminal N e uma ou mais NLSs no terminal C. Onde há mais do que uma NLS, cada NLS pode ser selecionada como independente de outras NLSs. Em algumas modalidades preferidas da invenção, a variante de nuclease Cas9 compreende duas NLSs, por exemplo, as duas NLSs estão localizadas no terminal N e no terminal C, respectivamente.
[0057] Em geral, NLS consiste em uma ou mais sequências curtas de lisina ou arginina positivamente carregada exposta na superfície de uma proteína, mas outros tipos de NLS são também conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes de NLSs incluem KKRKV(sequência de nucleotídeo 5’-AAGAAGAGAAAGGTC-3’), PKKKRKV(sequência de nucleotídeo 5’-CCCAAGAAGAAGAGGAAGGTG-3’ ou CCAAAGA AGAAGAGGAAGGTT) ou SGGSPKKKRKV(sequência de nucleotídeo 5’- TCGGGGGGGAGCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTG -3’).
[0058] Em algumas modalidades da invenção, o terminal N da variante de nuclease Cas9 compreende uma NLS com uma sequência de aminoácido mostrada por PKKKRKV. Em algumas modalidades da invenção, o terminal C da variante de nuclease Cas9 compreende uma NLS com uma sequência de aminoácido mostrada por SGGSPKKKRKV.
[0059] Ainda, a variante de nuclease Cas9 da presente invenção pode também incluir outras sequências de localização, tais como sequências de localização citoplásmicas, sequências de localização de cloroplasto, sequências de localização mitocondriais, e similar, dependendo da localização do DNA a ser editado.
[0060] Para obtenção de expressão eficaz na célula-alvo, em al
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17/30 gumas modalidades da invenção, a sequência de nucleotídeo codificando a variante de nuclease Cas9 é otimizada no códon para o organismo a partir do qual a célula a ser editada no genoma se origina.
[0061] Otimização de códon refere-se a um processo de modificação de uma sequência de ácido nucleico para expressão aumentada nas células hospedeiras de interesse através da substituição de pelo menos um códon (por exemplo, cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 ou mais códons) da sequência nativa com códons que são mais frequentemente ou sobretudo mais frequentemente usados nos genes daquela célula hospedeira enquanto mantendo a sequência de aminoácido nativa. Várias espécies exibem tendência particular para certos códons de um aminoácido particular. Tendência de códon (diferenças em uso de códon entre organismos) frequentemente se relaciona com a eficiência de tradução de RNA mensageiro (mRNA), que é por sua vez acreditada depender, dentre outras coisas, das propriedades dos códons sendo traduzidos e da disponibilidade de moléculas de RNA de transferência (tRNA) particulares. A predominância de tRNAs selecionados em uma célula é geralmente um reflexo dos códons usados com mais frequência em síntese de peptídeo. Desta maneira, genes podem ser feitos especialmente para expressão de gene ótima em um dado organismo com base em otimização de códon. Tabelas de uso de códon estão prontamente disponíveis, por exemplo, no Codon Usage Database disponível em www.kazusa.orjp/codon/ e essas tabelas podem ser adaptadas de várias maneiras. Vide Nakamura, Y. e outros, Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000 Nucl. Acids Res. 28:292 (2000).
[0062] O organismo, a partir do qual a célula que pode ser editada no genoma pelo sistema da invenção é derivada, inclui, mas não está limitado a, mamíferos tais como humano, camundongos, rato, macaco,
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18/30 cachorro, porco, ovelha, vaca e gato; aves tais como galinha, pato e ganso; plantas incluindo monocotiledôneas e dicotiledôneas, por exemplo, arroz, milho, trigo, sorgo, cevada, soja, amendoim e Arabidopsis thaliana e similar.
[0063] Em algumas modalidades específicas da invenção, a sequência de nucleotídeo otimizada no códon codificando a variante de nuclease Cas9 é como mostrado na SEQ ID NO:7(eSpCas9(1.0)), SEQ ID NO:8(eSpCas9(1.1)) ou SEQ ID NO:9(SpCas9-HF1).
[0064] Em algumas modalidades da invenção, o RNA-guia é um RNA-guia único (sgRNA). Métodos de construção de sgRNAs adequados de acordo com uma dada sequência-alvo são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Wang, Y. e outros, Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexapioid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nat. Biotechnol. 32, 947-951 (2014); Shan, Q. e outros, Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31, 686-688 (2013); Liang, Z. e outros, Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system. J Genet Genomics. 41,63-68 (2014).
[0065] Em algumas modalidades da invenção, a sequência de nucleotídeo codificando a variante de nuclease Cas9 e/ou a sequência de nucleotídeo codificando a fusão de RNA-guia são operativamente ligadas a um elemento regulador de expressão tal como um promotor.
[0066] Exemplos de promotores que podem ser usados na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, promotores de polimerase (pol) I, pol II ou pol III. Exemplos de promotores pol I incluem promotor pol I de RNA de galinha. Exemplos de promotores pol II incluem, mas não estão limitados a, promotor precoce imediato de citomegalovírus (CMV), promotor de repetição terminal longa do vírus sarcoma rous (RSV-LTR) e promotor precoce imediato do vírus simiano 40 (SV40). Exemplos dos promotores pol III incluem promotor U6 e
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19/30 promotor H1. Promotor induzível tal como promotor de metalotioneína pode ser usado. Outros exemplos de promotores incluem promotor de bacteriófago T7, promotor de bacteriófago T3, promotor de βgalactosidase e promotor de bacteriófago Sp6, etc. Quando usados para plantas, promotores que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, promotor do vírus do mosaico da couve-flor 35S, promotor Ubi-1 do milho, promotor U6 do trigo, promotor U3 do arroz, promotor U3 do milho e promotor da actina do arroz, etc.
3. Método para modificar geneticamente uma célula [0067] Em um outro aspecto, a invenção provê um método para modificar geneticamente uma célula, o qual compreende: introdução do sistema de edição de genoma da invenção na célula, desta maneira a variante de nuclease Cas9 é direcionada à sequência-alvo no genoma da célula pelo RNA-guia, e resulta em substituição, deleção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos na sequência-alvo.
[0068] O projeto da sequência-alvo que pode ser reconhecida e direcionada por um complexo de cas9 e RNA-guia está dentro das habilidades técnicas de um versado comum na técnica. Em geral, a sequência-alvo é uma sequência que é complementar a uma sequência líder de cerca de 20 nucleotídeos compreendida em RNA-guia, e cuja extremidade 3’ é imediatamente adjacente ao motivo adjacente protoespaçador (PAM) NGG.
[0069] Por exemplo, em algumas modalidades da invenção, a sequência-alvo tem a estrutura: 5'-Nx-NGG-3', em que N é selecionado independentemente de A, G, C e T; X é um número inteiro de 14<X<30; NX representa X nucleotídeos contíguos e NGG é uma sequência PAM. Em algumas modalidades específicas da invenção, X é 20.
[0070] Na presente invenção, a sequência-alvo a ser modificada pode estar localizada em qualquer lugar no genoma, por exemplo, dentro de um gene funcional tal como um gene de codificação de pro
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20/30 teína ou, por exemplo, pode estar localizada em uma região reguladora de expressão de gene tal como uma região promotora ou uma região aumentadora, e desta maneira realizar a modificação funcional do dito gene ou realizar a modificação de expressão de um gene.
[0071] A substituição, deleção e/ou adição da sequência-alvo da célula pode ser detectada por T7EI, PCR/RE ou métodos de sequenciamento, vide, por exemplo, Shan, Q., Wang, Y, Li, J. & Gao, C. Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system. Nat. Protoc. 9, 2395-2410 (2014).
[0072] No método da presente invenção, o sistema de edição de genoma pode ser introduzido na célula usando vários métodos bem conhecidos do versado na técnica.
[0073] Métodos para introdução do sistema de edição de genoma da presente invenção na célula incluem, mas não estão limitados a, transfecção com fosfato de cálcio, fusão de protoplasto, eletroporação, transfecção com lipossomo, microinjeção, infecção viral (tal como um baculovírus, um vírus vaccinia, um adenovirus ou outros vírus), bombardeamento de partícula, transformação de protoplasto mediada por PEG ou transformação mediada por agrobacterium.
[0074] A célula que pode ser submetida à edição de genoma com o método da presente invenção pode ser de, por exemplo, mamíferos tais como humano, camundongo, rato, macaco, cachorro, porco, ovelha, vaca, gato; aves tais como galinha, pato e ganso; plantas incluindo monocotiledôneas e dicotiledôneas tais como arroz, milho, trigo, sorgo, cevada, soja, amendoim, Arabidopsis thaliana, etc.
[0075] Em algumas modalidades, o método da presente invenção é realizado in vitro. Por exemplo, a célula é uma célula isolada. Em algumas outras modalidades, o método da presente invenção pode ser realizado in vivo. Por exemplo, a célula é uma célula dentro de um organismo, e o sistema da presente invenção pode ser introduzido in vi
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21/30 vo na dita célula usando, por exemplo, um método mediado por vírus. Em algumas modalidades, a célula é uma célula germinativa. Em algumas modalidades, a célula é uma célula somática.
[0076] Em um outro aspecto, a presente invenção provê ainda um organismo geneticamente modificado compreendendo uma célula geneticamente modificada produzida através do método da presente invenção.
[0077] O organismo inclui, mas não é limitado a, mamíferos tais como humanos, camundongos, ratos, macacos, cachorros, porcos, ovelhas, vacas, gatos; aves tais como galinhas, patos e gansos; plantas incluindo monocotiledôneas e dicotiledôneas tais como arroz, milho, trigo, sorgo, cevada, soja, amendoins e Arabidopsis thaliana.
Exemplos
Materiais e Métodos
Construção de Vetores de Expressão Binários pJIT163-SpCas9, pJIT163-eSpCas9(1.0), pJIT163-eSpCas9(1.1) e pJIT163-SpCas9-HF1 [0078] Sequências de SpCas9, eSpCas9(1.0), eSpCas9(1.1) e SpCas9-HF1 foram otimizadas no códon para arroz. SpCas9, eSpCas9(1.0), eSpCas9(1.1) e SpCas9-HF1 foram obtidas através de mutagênese direcionada a sítio usando Fast MultiSite Mutagenesis System (TransGen) com plasmideo pJIT163-SpCas9 (SEQ ID NO:10) como o modelo.
Construção de Vetor de Expressão de sgRNA [0079] Sequências-alvo de sgRNA usadas nos experimentos são mostradas na Tabela 1 como segue:
Tabela 1. Gene-alvo e Sequência-alvo de sgRNA
sgRNA Sequência-alvo Oligo-F Oligo-R
OSCDKB2 AGGTCGGGGA GGGGACGTAC GGG GGCAAGGTCGGGGAGG GGACGTAC AAACGTACGTCCCCTCCCCG ACCT
OsMKK4 GACGTCGGCG AGGAAGGCCT CGG GGCAGACGTCGGCGAGG AAGGCCT AAACAGGCCTTCCTCGCCGA CGTC
A1 CATGGTGGGG AAAGCTTGGA GGCACATGGTGGGGAAA GCTTGGA AAACTCCAAGCTTTCCCCAC CATG
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GGG
A2 CCGGACGACGACGTCGAC- GACGG GGCACCGGACGACGACG TCGACGA AAACTCGTCGACGTCGTCGT CCGG
A3 TTGAAGTCCCT TCTAGATGGAG G GGCATTGAAGTCCCTTCT AGATGG AAACCCATCTAGAAGGGACT TCAA
A4 ACTGCGACAC CCAGATATCG TGG GGCAACTGCGACACCCA GATATCG AAACCGATATCTGGGTGTCGC AGT
PDS GTTGGTCTTTG CTCCTGCAGA GG GGCAGTTGGTCTTTGCTC CTGCAG AAACCTGCAGGAGCAAAGAC CAAC
[0080] Vetores de expressão de sgRNA: pOsU3-CDKB2-sgRNA, pOsU3-MKK4-sgRNA, pOsU3-A1-sgRNA bem como pOsU3-A2sgRNA, pOsU3-A3-sgRNA, pOsU3-A4-sgRNA e pOsU3-PDS-sgRNA são construídos com base em pOsU3-sgRNA(Addgene ID53063) conforme anteriormente descrito (Shan, Q. e outros, Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31,686-688, 2013).
Construção de Vetores de Expressão de tRNA-sqRNA [0081] Vetores de expressão de tRNA-sgRNA são construídos com base no vetorpUC57-U3-tRNA-sgRNA (SEQ ID NO:11, Figura 6). Um vetor linear é obtido após digestão de pUC57-U3-tRNA-sgRNA com Bsal, os oligo-F e oligo-R correspondentes são anelados e conectados ao vetor linear, e as etapas subsequentes são similares para a construção dos vetores de expressão de sgRNA.
Tabela 2. Genes-alvo e Sequências de nucleotídeo para Construção de Vetores de Expressão de tRNA-sgRNA
sgRNA Sequência-alvo Oligo-F Oligo-R
OsCDKB2 AGGTCGGGGAGG GGACGTACGGG TGCAAGGTCGGGGAG GGGACGTAC AAACGTACGTCCCCTCCCC GACCT
OsMKK4 GACGTCGGCGAGG AAGGCCTCGG TGCAGACGTCGGCGA GGAAGGCCT AAACAGGCCTTCCTCGCCGA CGTC
A1 CATGGTGGGGAAA GCTTGGAGGG TGCACATGGTGGGGAA AGCTTGGA AAACTCCAAGCTTTCCCCAC CATG
A2 CCGGACGACGACG TCGACGACGG TGCACCGGACGACGAC GTCGACGA AAACTCGTCGACGTCGTCGT CCGG
A3 TTGAAGTCCCTTCT TGCATTGAAGTCCCTT AAACCCATCTAGAAGGGACT
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AGATGGAGG CTAGATGG TCAA
A4 ACTGCGACACCCA GATATCGTGG TGCACTGCGACACCC AGATATCG AAACCGATATCTGGGTGTCG CAGT
PDS GTTGGTCTTTGCTC CTGCAGAGG TGCAGTTGGTCTTTGC TCCTGCAG AAACCTGCAGGAGCAAAGAC CAAC
Ensaios de protoplasto [0082] Cultivar de arroz nipponbare é usado na pesquisa. Transformação de protoplasto é realizada como descrito abaixo. Transformação é realizada com 10 pg de cada plasmídeo através de transfecção mediada por PEG. Protoplastos foram coletados após 48 h e DNA foi extraído para ensaio de PCR-RE.
Preparação e transformação de protoplasto de arroz
1) Bainha de folha das mudas foi usada para isolamento de protoplasto e cortada em cerca de 0,5 mm de largura com uma lâmina afiada;
2) Imediatamente após a incisão, transferida para solução de Mannitol 0,6M e posta no escuro por 10 min;
3) Solução de Manitol foi removida através de filtragem e os produtos foram transferidos para solução de enzimólise e evacuados por 30 min;
4) Enzimólise foi realizada por 5-6 h no escuro com agitação suave (agitador de descolorização, velocidade 10);
5) Após término da enzimólise, um volume igual de W5 foi adicionado, agitação horizontal por 10 s para liberar protoplastos;
6) Protoplastos foram filtrados em um tubo de centrífuga de fundo redondo de 50 ml com uma membrana de náilon de 40 pm e lavados com solução W5;
7) Centrifugação horizontal 250 g por 3 min para precipitar os protoplastos, o sobrenadante foi descartado;
8) Protoplastos foram ressuspensos adicionando 10 ml de W5 e então centrifugados a 250 g por 3 min e o sobrenadante foi des
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24/30 cartado;
9) Uma quantidade apropriada de solução MMG foi adicionada para ressuspender os protoplastos para uma concentração de 2x106/ml;
Nota: todas as etapas acima foram realizadas em temperatura ambiente;
10) 10-20 pg de plasmídeo, 200 pl de protoplasto (cerca de 4x105 células) e 220 μΙ de solução de PEG fresca foram adicionados a um tubo de centrífuga de 2 ml, misturados e postos em temperatura ambiente no escuro por 10-20 minutos para induzir transformação;
11) Após o término da transformação, 880 μΙ de solução W5 foram lentamente adicionados, e os tubos foram suavemente virados de cabeça para baixo para mistura, centrifugados na horizontal 250 g por 3 min e o sobrenadante foi descartado;
12) Os produtos foram ressuspensos em 2 ml de solução Wl, transferidos para uma placa de seis poços, cultivados em temperatura ambiente (ou 25° C) no escuro. Para extração de DNA genômico de protoplasto, os produtos precisaram ser cultivados por 48 h. Identificação de Mutação por Sequenciamento Profundo
Análise de sequenciamento profundo é realizada com referência a Liang, Z., Chen, K., Li, T, Zhang, Y., Wang, Y., Zhao, Q., Liu, J., Zhang, H., Liu, C., Ran, Y., e outros, (2017). Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications 8, 14261.
Exemplo 1: comparação de capacidades de edição de WT SpCas9 e variantes da mesma para sitios-alvo [0083] WT SpCas9, eSpCas9(1.0), eSpCas9(1.1) e SpCas9-HF1 foram respectivamente construídas em um vetor de expressão transiente pJIT163, e as expressões de WT SpCas9, eSpCas9(1.0), eSpCas9(1.1) e SpCas9-HF1 são conduzidas por um promotor do gene
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25/30 da ubiquitina do milho. sgRNAs foram construídos no vetor pOsU3sgRNA e a expressão de sgRNAs é conduzida pelo promotor OsU3. Protoplastos de arroz foram transformados, e DNA de protoplasto foi extraído para análise PCR-RE para avaliar a eficiência de mutação. Cinco sítios-alvo (A1, A2, A3, A4 e PDS, vide Figura 2 e Figura 3) são selecionados para comparar a diferença de capacidades de edição de SpCas9 do tipo selvagem e eSpCas9(1.0), eSpCas9(1.1) e SpCas9HF1.
[0084] O promotor OsU3 tem que iniciar a transcrição com o nucleotídeo A e, desta maneira, o projeto dos vetores de expressão de sgRNA para os sítios-alvo pode ser dividido em duas condições como segue:
[0085] se o primeiro nucleotídeo na extremidade 5’ da sequênciaalvo de sgRNA desejada (20 pb) for qualquer um de G/T/C, como o promotor U3 inicia transcrição com um A, um A a mais será adicionado à extremidade 5’ do sgRNA transcrito e, ainda, o sgRNA transcrito não pode ser totalmente compatível com a sequência-alvo. Vetor de expressão de sgRNA pode ser construído como U3+AN20 na Figura 1, enquanto N20 é a sequência-alvo, A é 0 nucleotídeo adicional na extremidade 5’;
[0086] Se 0 primeiro nucleotídeo na extremidade 5’ da sequênciaalvo de sgRNA desejada (20 pb) for A, ele pode ser usado pelo promotor U3 para iniciação de transcrição, e desta maneira nenhum nucleotídeo adicional existirá na extremidade 5’ do sgRNA transcrito. Vetor de expressão de sgRNA pode ser construído como U3+AN19 na Figura 1, enquanto AN19 é a sequência-alvo.
[0087] Os sítios-alvo selecionados A1, A2, A3 e PDS pertencem aos sítios-alvo de classe (1), e 0 sítio alvo A4 pertence aos sítios-alvo de classe (2).
[0088] Os resultados do experimento mostram (Figura 2) que as
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26/30 eficiências de edição de eSpCas9(1.0), eSpCas9(1.1) e SpCas9-HF1 para os sítios-alvo de classe (1) são extremamente baixas. A diferença das eficiências de edição de eSpCas9(1.0), eSpCas9(1.1) e SpCas9HF1 e a eficiência de edição de WT SpCas9 não é significante para sítios-alvo de classe (2). Isso mostra que o nucleotídeo adicional na extremidade 5’ do sgRNA resultante da transcrição pode reduzir as eficiências de edição de eSpCas9(1.0), eSpCas9(1.1) e SpCas9-HF1.
[0089] Similar ao promotor OsU3, promotor U6 do milho (TaU6) tem que iniciar a transcrição com o nucleotídeo G e, desta maneira, o projeto dos vetores de expressão de sgRNA para os sítios-alvo pode ser dividido em duas condições como segue:
[0090] se o primeiro nucleotídeo na extremidade 5’ da sequênciaalvo de sgRNA (20pb) desejada for qualquer um de A/T/C, como o promotor U6 inicia transcrição com um G, um G a mais será adicionado à extremidade 5’ do sgRNA transcrito e, ainda, o sgRNA transcrito não pode ser completamente compatível com a sequência-alvo;
[0091] se o primeiro nucleotídeo na extremidade 5’ da sequênciaalvo de sgRNA (20 pb) desejada for G, ele pode ser usado pelo promotor U6 para iniciação de transcrição e, desta maneira, nenhum nucleotídeo adicional existirá na extremidade 5’ do sgRNA transcrito.
[0092] O sítio-alvo de OsPDS pertence aos sítios-alvo de classe (2). Promotor TaU6 foi adicionado para conduzir a transcrição de GNw e GN20, sgRNAs contra sítio-alvo de OsPDS, onde GN20 pode imitar os sítios-alvo de classe (1), a saber, com um G adicional na extremidade 5’ do sgRNA.
Tabela 3. Gene-alvo e sequências de oligonucleotídeo para construção de vetores de expressão de TaU6-sgRNA
sgRNA Sequência-alvo Oligo-F Oligo-R
OsPDS-GNig GTTGGTCTTTGCTC CTGCAGAGG GGCGTTGGTCTT TGCTCCTGCAG AAACCTGCAGGAGCAAAGA CCAA
OSPDS-GN20 GTTGGTCTTTGCTC CTGCAGAGG GGCGGTTGGTCT TTGCTCCTGCAG AAACCTGCAGGAGCAAAGAC CAAC
[0093] Os resultados mostram (Figura 2) que um G adicional na
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27/30 extremidade 5’ do sgRNA reduz significantemente a eficiência de edição de eSpCas9(1.0), eSpCas9(1.1) e SpCas9-HF1.
Exemplo 2: aumento de eficiência de adição de variantes de Cas9 por fusão de tRNA-sgRNA [0094] De acordo com o resultado do Exemplo 1, um fator importante que influencia as eficiências de edição de eSpCas9(1.0), eSpCas9(1.1) e SpCas9-HF1 é se o sgRNA é precisamente iniciado ou não.
[0095] De acordo com relato anterior, fusão de tRNA à extremidade 5’ de um sgRNA pode suprarregular a expressão do sgRNA e resultar em divagem precisa na extremidade 5’ do sgRNA, e desta maneira evitando nucleotídeo adicional na extremidade 5’ do sgRNA. (Vide Xie, K., Minkenberg, B., Yang, Y Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system. Proc Natl Acad Sci USA. 2015 Mar 17; 112(11):3570-5. doi: 10.1073/pnas. 1420294112. Epub 2015 Mar 2.) [0096] sgRNA para cada sitio-alvo no Exemplo 1 foi fundido a tRNA e expresso sob o controle do promotor OsU3. Experimentos foram realizados através do método do Exemplo 1 com tRNA-sgRNA ao invés de sgRNAs. Com mostrado na Figura 2, para os sítios-alvo A1, A2, A3 e PDS, as eficiências de edição de eSpCas9(1.0), eSpCas9(1.1) e SpCas9-HF1 são significantemente aumentadas usando tRNA-sgRNAs ao invés de sgRNAs.
Exemplo 3: influências de fusão de tRNA-sgRNA para especificidade de edição de variantes de Cas9
3.1 Sítio-alvo de 0sMKK4 de Arroz [0097] Um sítio-alvo GACGTCGGCGAGGAAGGCCTCGG em gene MKK4 de arroz foi selecionado para projetar sgRNA e tRNAsgRNA. Este sítio-alvo tem dois sítios fora do alvo possíveis como mostrado na Figura 5. Um vetor para expressão de sgRNA ou tRNA
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28/30 sgRNA e vetores para expressão de WTSpCas9, eSpCas9(1.0), eSpCas9(1.1) e SpCas9-HF1 foram respectivamente cotransformados em protoplastos de arroz. Dois dias após transformação, DNA de protoplasto foi extraído, e fragmentos genômicos do sítio-alvo e dos sítios fora do alvo foram amplificados usando primers específicos. Taxas de mutação dos três sítios foram analisadas usando tecnologia de sequenciamento de segunda geração.
[0098] O resultado do experimento é mostrado na Figura 5:
[0099] quando sgRNAs foram usados, comparado com
WTSpCas9, eSpCas9(1.0), eSpCas9(1.1) e SpCas9-HF1 têm efeito fora do alvo extremamente baixo, mas têm eficiências de edição significantemente menores.
[00100] Quando tRNA-sgRNAs foram usados, a eficiência de edição de cada grupo foi aumentada, no entanto, eSpCas9(1.0), eSpCas9(1.1) e SpCas9-HF1 podem manter especificidade relativamente alta. Particularmente para SpCas9-HF1, apenas mutação de nível extremamente baixo pode ser detectada para ambos os sítios fora do alvo. Dessa maneira, a combinação de tRNA-sgRNA e SpCa9-HF1 é particularmente adequada para edição de genoma com eficiência alta e especificidade alta.
3.2 Sítio-alvo de OsCDKB2 de arroz [00101] Um sítio-alvo AGGTCGGGGAGGGGACGTACGGG em gene de arroz OsCDKB2 foi selecionado para projetar sgRNA. Esse sítioalvo tem três sítios fora do alvo possíveis como mostrado na Figura 6. Um vetor para expressão de sgRNA ou tRNA-sgRNA e vetores para expressão de WTSpCas9, eSpCas9(1.0), eSpCas9(1.1) e SpCas9HF1 foram respectivamente cotransformados em protoplastos de arroz. Dois dias após transformação, DNA de protoplasto foi extraído, e fragmentos genômicos do sítio-alvo e dos sítios fora do alvo foram amplificados usando primers específicos. Taxas de mutação dos qua
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29/30 tro sítios foram analisadas através de sequenciamento profundo.
[00102] Os resultados do experimento são mostrados na Figura 6. As eficiências de edição de eSpCas9(1.0), eSpCas9(1.1) e SpCas9HF1 para os sítios-alvo são efetivamente aumentadas usando tRNAsgRNA ao invés de sgRNA. Em particular, a eficiência de edição de SpCas9-HF1 pode ser restaurada para um nível do tipo selvagem, e especificidade alta pode ser mantida. Como essa sequência-alvo começa com um A, pelo qual o promotor U3 pode iniciar transcrição precisamente, a eficiência de edição aumentada pode resultar do nível de expressão aumentado de sgRNA devido à fusão com tRNA.
Exemplo 4: edição de especificidade de variantes de Cas9 para incompatibilidade entre gRNA e sequência-alvo [00103] Quando projetando sgRNA para um sítio-alvo GACGTC GGCGAGGAAGGCCTCGG em gene de arroz MKK4, incompatibilidades de duas bases adjacentes foram artificialmente introduzidas (purina para purina e pirimidina para pirimidina). Edição sob a condição que sgRNA não pode ser totalmente compatível com o sítio-alvo foi detectada. É considerado como fora do alvo se edição puder ser detectada. Os experimentos foram realizados de uma maneira similar àquela no Exemplo 3.1.
[00104] Os resultados dos experimentos foram mostrados na Figura
7. Quando tRNA-sgRNA é usado, variantes de SpCas9 mostraram sensibilidade maior a incompatibilidades entre gRNA e a sequênciaalvo (particularmente a incompatibilidade mais próxima de qualquer uma das extremidades).
Exemplo 5: edição de eficiência e especificidade de variantes de Cas9 em células 293 de rim embriônicas humanas [00105] sgRNAs foram projetados contra uma sequência-alvo GGTGAGTGAGTGTGTGCGTGTGG dentro de gene VEGFA humano. U6:sgRNA-GNi9 e U6:tRNA-sgRNA-N2o representam que os sgRNAs
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30/30 transcritos com promotor U6 são de 20 nt de comprimento e completamente compatíveis com a sequência-alvo; U6:sgRNA-GN20 representa que o sgRNA transcrito com promotor U6 é de 21 nt de comprimento e contém um G adicional na extremidade 5’.
[00106] Os resultados do ensaio T7E1 mostram (Figura 8) que WT Cas9 exibe eficiência de edição similar quando sgRNA transcrito com estratégias diferentes foi usado. No entanto, as eficiências de edição de eSpCas9(1.1) e SpCas9-HF1 foram significantemente reduzidas quando o sgRNA contém um nucleotídeo adicional na extremidade 5’. E ao usar as fusões de tRNA-sgRNA, as eficiências de edição de eSpCas9(1.1) e SpCas9-HF1 foram aumentadas para aquelas de WT Cas9 ou ainda mais.
[00107] Com relação à edição de especificidade, WT Cas9 resultou em edição fora do alvo em ambos os sítios fora do alvd e fora do alvo
2. eSpCas9(1.1) e SpCas9-HF1 não resultaram em edição fora do alvo quando fusões de tRNA-sgRNA foram usadas.
Tabela 4: gene-alvo e sequência de oligonucleotídeo para construção de vetores de expressão de sgRNA
sgRNA Sequência-alvo Oligo-F Oligo-R
VEGFA-GN19 GGTGAGTGAGTGTG TGCGTGTGG CACCGGTGAGTGAGTGTG TGCGTG AAACCACGCACAC ACTCACTCACC
VEGFA-GN20 GGTGAGTGAGTGTG TGCGTGTGG CACCGGGTGAGTGAGTGT GTGCGTG AAACCACGCACAC ACTCACTCACCC
VEGFA-tRNA-N2o GGTGAGTGAGTGTG TGCGTGTGG CACCGaacaaagcaccagtggt ctagtggtagaatagtaccctgccac ggtacagacccgggttcgattcccg gctggtgcaGGTGAGTGAGT GTGTGCGTG AAACCACGCACACA CTCACTCACCtgcacc agccgggaatcgaacccgg gtctgtaccgtggcagggta ctattctaccactagaccact ggtgctttgttC
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Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Sistema de edição de genoma para modificação direcionada a sítio de uma sequência-alvo no genoma de uma célula caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma selecionada de i) a iii) que seguem:
    i) uma variante de nuclease Cas9 e um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma fusão de tRNA-RNA-guia;
    ii) um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma variante de nuclease Cas9 e um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma fusão de tRNA-RNA-guia; e iii) um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma variante de nuclease Cas9 e uma sequência de nucleotídeo codificando uma fusão de tRNA-RNAguia;
    em que a variante de nuclease Cas9 tem especificidade maior comparado com a nuclease Cas9 do tipo selvagem, em que a extremidade 5’ do RNA-guia é ligada à extremidade 3’ do tRNA, em que a fusão é clivada na extremidade 5’ do RNA-guia após ser transcrita na célula, desta maneira formando um RNA-guia que não carrega nucleotídeo extra na extremidade 5’.
  2. 2. Sistema de edição de genoma para modificação direcionada a sítio de uma sequência-alvo no genoma de uma célula caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma selecionada de i) a iii) que seguem:
    i) uma variante de nuclease Cas9 e um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma fusão de ribozima-RNA-guia;
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    2/4 ii) um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma variante de nuclease Cas9 e um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma fusão de ribozima-RNA-guia; e iii) um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma variante de nuclease Cas9 e uma sequência de nucleotídeo codificando uma fusão de ribozimaRNA-guia;
    em que a variante de nuclease Cas9 tem especificidade maior comparado com a nuclease Cas9 do tipo selvagem, em que a extremidade 5’ do RNA-guia é ligada à extremidade 3’ de uma primeira ribozima, em que a primeira ribozima é projetada para clivar a fusão na extremidade 5’ do RNA-guia, desta maneira formando um RNAguia que não carrega nucleotídeo extra na extremidade 5’.
  3. 3. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tRNA e a célula a serem modificados são derivados da mesma espécie.
  4. 4. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tRNA é codificado por uma sequência como mostrado na SEQ ID NO: 1.
  5. 5. Sistema, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a variante de nuclease Cas9 é uma variante de SEQ ID NO: 2 e compreende uma substituição de aminoácido na posição 855 de SEQ ID NO: 2, por exemplo, a substituição de aminoácido é K855A.
  6. 6. Sistema, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a variante de nuclease Cas9 é uma variante de SEQ ID NO: 2 e compreende substituições de aminoácido nas posições 810, 1003 e 1060 de SEQ ID NO: 2, por exemplo, as substitui-
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    3/4 ções de aminoácido são K810A, K1003A e R1060A.
  7. 7. Sistema, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a variante de nuclease Cas9 é uma variante da SEQ ID NO: 2 e compreende substituições de aminoácido nas posições 848, 1003 e 1060 de SEQ ID NO: 2, por exemplo, as substituições de aminoácido são K848A, K1003A e R1060A.
  8. 8. Sistema, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a variante de nuclease Cas9 é uma variante de SEQ ID NO: 2 e compreende substituições de aminoácido nas posições 611, 695 e 926 de SEQ ID NO: 2, por exemplo, as substituições de aminoácido são R611 A, Q695A e Q926A.
  9. 9. Sistema, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a variante de nuclease Cas9 é uma variante de SEQ ID NO: 2 e compreende substituições de aminoácido nas posições 497, 611,695 e 926 de SEQ ID NO: 2, por exemplo, as substituições de aminoácido são N497A, R611 A, Q695A e Q926A.
  10. 10. Sistema, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a variante de nuclease Cas9 compreende uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:6.
  11. 11. Sistema, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeo codificando a variante de nuclease Cas9 é otimizada no códon para o organismo a partir do qual a célula a ser modificada é derivada.
  12. 12. Sistema, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o RNA-guia é um RNA-guia simples (sgRNA).
  13. 13. Método para modificar geneticamente uma célula caracterizado pelo fato de que compreende: introdução do sistema como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 na célula e desta maneira a variante de nuclease Cas9 é direcionada à sequência-alvo
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    4/4 no genoma da célula pelo RNA-guia, e resulta em substituição, deleção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos na sequência-alvo.
  14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a célula é derivada de mamíferos tais como humano, camundongo, rato, macaco, cachorro, porco, ovelha, vaca e gato; aves tais como galinha, pato e ganso; plantas incluindo monocotiledôneas e dicotiledôneas tais como arroz, milho, trigo, sorgo, cevada, soja, amendoim e Arabidopsis thaliana.
  15. 15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 14, caracterizado pelo fato de que o sistema é introduzido na célula através de um método selecionado de: transfecção com fosfato de cálcio, fusão de protoplasto, eletroporação, transfecção com lipossomo, microinjeção, infecção viral (tal como um baculovírus, um vírus vaccinia, um adenovirus ou outros vírus), bombardeamento de partícula, transformação de protoplasto mediada por PEG ou transformação mediada por agrobacterium.
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