KR102404845B1 - 인간화된 자가면역 질환 동물 모델 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자가면역 환자의 세포 및/또는 이로부터 유래한 조직으로 인간화된 마우스의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 인간화된 자가면역 마우스는, 인간 세포가 마우스의 혈액 및 여러 조직에서 잘 생착되어 있으며, 자가면역 질환 환자의 면역 상태를 잘 반영하고 있으므로, 이를 환자의 면역 상태를 모니터링하기 위한 전임상 모델로 사용할 수 있을뿐만 아니라, 자가면역 질환 치료 물질 또는 피부 이식 면역억제제의 스크리닝에 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 인간화된 자가면역 질환 동물 모델 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 자가면역 환자의 세포 및/또는 이로부터 유래한 조직으로 인간화된 마우스의 용도에 관한 것이다.
자가면역질환은 체내의 면역체계가 정상적이고 건강한 조직이나 기관 또는 기타 체내 성분 등을 공격하게 되는 질환을 의미한다. 다수의 자가면역 질병은 인체의 면역이상 반응으로부터 기인하며 자가 파괴를 유발한다. 유명한 예는 류마티스 관절염 (RA), 전신경화증 (SSc), 전신홍반루푸스 (SLE), 경피증, 다발근육염, 피부근육염, 아나필락시스 자반증, 쇼그렌 증후군 등을 포함한다. 원발 쓸개관 간경화증 (PBC), 만성 활성 간염, 및 하시모토 갑상선염과 같은 기타 질병은 모두 자가면역 질병과 관련된다.
이 중, 피부경화증(Systemic scleroderma) 또는 전신경화증(Systemic Sclerosis, SSc)은 피부 섬유모세포에 의한 세포외 매트릭스 내로의 과도한 단백질 침착을 특징으로 하는, 피부 섬유증으로도 지칭되는 진행성 쇠약화 자가면역 장애이다. SSc는 활성화된 섬유아세포(fibroblast)가 콜라겐(collagen) 등의 결합조직 구성물질을 과도하게 생성하는데 기인하며, 피부를 비롯하여 혈관, 위장관 계통, 폐, 신장 및 근육 관절 등의 결합 조직에 변화를 일으켜 그 기능의 결함을 초래한다. SSc는 SSc는 그 발병 부위에 따라, 피부 경화가 팔꿈지 이하의 손, 무릎 이하의 발, 얼굴에서만 발생되는 제한성(limited) 타입과, 이보다 더 많은 부위, 즉 팔꿈치 이상, 무릎 이상의 피부와 몸통에서도 피부가 딱딱해지는 변화가 나타나면서 신장, 폐 등의 내부 장기 침범이 동반되는 확산성(diffuse) 타입으로 크게 분류된다. 제한성 SSc를 보이는 환자는 90% 이상의 5년 생존율을 보이나, 미만성 SSc를 보이는 환자의 예후는 좋지 않아 50∼70% 정도에 그치는 5년 생존율을 나타낸다. 확산성 피부 질환을 갖는 환자는 종종 피부에서 독특한 마커, 예컨대, I형 인터페론(IFN)-유도된 유전자의 상향조절을 보여준다. IFN이 피부 섬유증에서 일정한 역할을 수행한다는 생각을 뒷받침하는 것은 만성 바이러스 감염에 대한 IFN 치료를 받은 환자에서 발생하는 피부경화증의 최근 보고이다 (Varga & Abraham (2007) J. Clin. Invest. 117:557-567 및 Coelho et al. (2008) Immunol. Lett. 118:110-115). SSc의 병변은 조직의 섬유증(tissue fibrosis), 세소혈관(細小血管, small blood vessel)의 맥관 장애(vasculopathy), 자가항체에 의한 특이적 자가면역반응 (autoimmune disease) 등의 증상으로 특징될 수 있다. 특히 자가면역반응은 면역 체계의 이상에 의하여 외부의 물질이 아니라 인체 내에 존재하는 물질에 대해 항체를 형성함으로써 여러 가지 면역질환을 일으키는 현상으로, 자가면역에 의한 질환은 SSc를 비롯하여 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome) 및 근염(myositis) 등이 있다.
SSc에 대해 뚜렷한 예방 및 치료 효과를 나타내는 조성물이 알려져 있지 않아, 현재의 SSc 치료는 대표적 병변인 염증과 경피증을 억제할 수 있는 여러 가지 약물을 혼합하여 병의 진행을 다소 막는 수준에 그치고 있다.
본 발명의 목적은 인간화된 자가면역 질환 마우스 및 이의 제작 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 자가면역 질환 치료 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 자가면역 질환 환자의 피부 이식 후 면역 상태를 모니터링하는 방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 피부 이식에 대한 면역억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 인간화된 자가면역 질환 마우스 및 이의 제작 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 자가면역 질환 치료 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 자가면역 질환 환자의 피부 이식 후 면역 상태를 모니터링하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 피부 이식에 대한 면역억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 인간화된 자가면역 마우스는, 인간 세포가 마우스의 혈액 및 여러 조직에서 잘 생착되어 있으며, 자가면역 질환 환자의 면역 상태를 잘 반영하고 있으므로, 이를 환자의 면역 상태를 모니터링하기 위한 전임상 모델로 사용할 수 있을뿐만 아니라, 자가면역 질환 치료 물질 또는 피부 이식 면역억제제의 스크리닝에 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 전신경화증 인간화 마우스 모델 SS 1 수립 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 전신경화증 인간화 마우스 모델 SS 2 수립 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 전신경화증 인간화 마우스 모델들의 혈액 내 인간 세포 생착을 확인한 도이다:
a: 실시예 1-1의 전신경화증 인간화 마우스 모델; 및
b: 실시예 1-2의 전신경화증 인간화 마우스 모델.
도 4는 실시예 1-1의 전신경화증 인간화 마우스 모델에서의 인간 항체 IgG의 존재를 확인한 도이다:
Nor HC: 정상인 유래 PBMC 주입군; 및
SS: 전신경화증 유래 PBMC 주입군.
도 5는 본 발명의 전신경화증 인간화 마우스 모델들의 피부 및 폐 조직 내 인간 세포 (T 세포 및 B 세포)의 생착을 확인한 도이다:
a: 실시예 1-1의 전신경화증 인간화 마우스 모델;
b: 실시예 1-2의 전신경화증 인간화 마우스 모델;
HC: 정상인 유래 PBMC 주입군 (또는 PBMC 주입 및 피부 조직 이식군); 및
SSc: 전신경화증 환자 유래 PBMC 주입군 (또는 PBMC 주입 및 피부 조직 이식군).
도 6은 본 발명의 전신경화증 인간화 마우스 모델들의 피부, 폐 및 비장 조직을 H&E 염색법으로 분석한 도이다:
a: 실시예 1-1의 전신경화증 인간화 마우스 모델;
b: 실시예 1-2의 전신경화증 인간화 마우스 모델;
HC: 정상인 유래 PBMC 주입군 (또는 PBMC 주입 및 피부 조직 이식군); 및
SSc: 전신경화증 환자 유래 PBMC 주입군 (또는 PBMC 주입 및 피부 조직 이식군).
도 7은 본 발명의 전신경화증 인간화 마우스 모델들의 피부 및 폐 조직을 Masson’s Trichrome 염색법으로 분석한 도이다:
a: 실시예 1-1의 전신경화증 인간화 마우스 모델;
b: 실시예 1-2의 전신경화증 인간화 마우스 모델;
HC: 정상인 유래 PBMC 주입군 (또는 PBMC 주입 및 피부 조직 이식군); 및
SSc: 전신경화증 환자 유래 PBMC 주입군 (또는 PBMC 주입 및 피부 조직 이식군).
도 8은 본 발명의 실시예 1-2의 전신경화증 인간화 마우스 모델의 피부 및 폐 조직을 섬유증 마커로 염색한 도이다:
HC: 정상인 유래 PBMC 주입 및 피부 조직 이식군; 및
SSc: 전신경화증 환자 유래 PBMC 주입 및 피부 조직 이식군..
도 2는 본 발명의 전신경화증 인간화 마우스 모델 SS 2 수립 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 전신경화증 인간화 마우스 모델들의 혈액 내 인간 세포 생착을 확인한 도이다:
a: 실시예 1-1의 전신경화증 인간화 마우스 모델; 및
b: 실시예 1-2의 전신경화증 인간화 마우스 모델.
도 4는 실시예 1-1의 전신경화증 인간화 마우스 모델에서의 인간 항체 IgG의 존재를 확인한 도이다:
Nor HC: 정상인 유래 PBMC 주입군; 및
SS: 전신경화증 유래 PBMC 주입군.
도 5는 본 발명의 전신경화증 인간화 마우스 모델들의 피부 및 폐 조직 내 인간 세포 (T 세포 및 B 세포)의 생착을 확인한 도이다:
a: 실시예 1-1의 전신경화증 인간화 마우스 모델;
b: 실시예 1-2의 전신경화증 인간화 마우스 모델;
HC: 정상인 유래 PBMC 주입군 (또는 PBMC 주입 및 피부 조직 이식군); 및
SSc: 전신경화증 환자 유래 PBMC 주입군 (또는 PBMC 주입 및 피부 조직 이식군).
도 6은 본 발명의 전신경화증 인간화 마우스 모델들의 피부, 폐 및 비장 조직을 H&E 염색법으로 분석한 도이다:
a: 실시예 1-1의 전신경화증 인간화 마우스 모델;
b: 실시예 1-2의 전신경화증 인간화 마우스 모델;
HC: 정상인 유래 PBMC 주입군 (또는 PBMC 주입 및 피부 조직 이식군); 및
SSc: 전신경화증 환자 유래 PBMC 주입군 (또는 PBMC 주입 및 피부 조직 이식군).
도 7은 본 발명의 전신경화증 인간화 마우스 모델들의 피부 및 폐 조직을 Masson’s Trichrome 염색법으로 분석한 도이다:
a: 실시예 1-1의 전신경화증 인간화 마우스 모델;
b: 실시예 1-2의 전신경화증 인간화 마우스 모델;
HC: 정상인 유래 PBMC 주입군 (또는 PBMC 주입 및 피부 조직 이식군); 및
SSc: 전신경화증 환자 유래 PBMC 주입군 (또는 PBMC 주입 및 피부 조직 이식군).
도 8은 본 발명의 실시예 1-2의 전신경화증 인간화 마우스 모델의 피부 및 폐 조직을 섬유증 마커로 염색한 도이다:
HC: 정상인 유래 PBMC 주입 및 피부 조직 이식군; 및
SSc: 전신경화증 환자 유래 PBMC 주입 및 피부 조직 이식군..
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
일 측면에서, 본 발명은 면역결핍 마우스에 자가면역 질환 환자 유래 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)이 주입된, 인간화된 자가면역 질환 마우스에 관한 것이다.
일 구현예에서, 자가면역 질환은 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 버거병(Berger's disease), 만성 피로 증후군, 크론병(Crohn's disease), 피부근육염, 섬유근육통, 그레이브스병(Graves' disease), 하시모토(Hashimoto's) 갑상선염, 특발성 혈소판감소성 자반증, 편평태선, 다발성 경화증, 중증근육무력증, 건선, 류마티스 발열, 류마티스 관절염, 피부경화증 (전신경화증), 쇼그렌(Sjogren's) 증후군, 전신홍반루푸스, 1형 당뇨병, 궤양성 결장염 및 백반증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 전신경화증(피부경화증)인 것이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간화된 자가면역 질환 마우스는 자가면역 질환 환자 유래 PBMC를 역분화시킨 역분화 줄기세포(induced Pluripotent Stem cell, iPSc)로 제작한 피부 조직을 추가로 이식될 수 있다.
본 발명에서 용어, "환자"는 인간, 유인원, 원숭이, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 마우스, 래트, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.
본 발명에서 용어,"면역결핍 마우스"는 하나 또는 그 이상의 하기 목록에 의해 특징되는 마우스를 의미한다: T 세포 및 B 세포와 같은 기능적 면역 세포의 결함; DNA 복구 결함; 림프구에서 항원 특이적 수용체를 코딩하는 유전자의 재배치 상의 결함; 및 IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgA와 같은 면역 기능 분자들의 결함. 일 구현예에서, 면역결핍 마우스는 면역 기능에 관여하는 Rag1 및 Rag2와 같은 유전자의 하나 이상의 결핍에 의해 특징될 수 있으며 (Oettinger et al, Science, 248:1517-1523, 1990; 및 Schatz et al, Cell, 59:1035-1048, 1989), 면역결핍 마우스는 마우스에서 비정상적인 면역 기능을 초래하는 이들 또는 다른 결함을 가질 수 있다.
특히 유용한 면역결핍 마우스 종자(strains)는 Shultz et al, , J Immunol, 174: 6477-6489, 2005에 상세히 기재된 바와 같이 일반적으로 NOD scid 감마 (NSG) 마우스를 의미하는 NOD, Cg-Prkdc scid Il2rg tml Wjl /SzJ 및 일반적으로 NRG 마우스를 의미하는 NOD.Cg-Rag1 tmlMom Il2rg tml Wjl /SzJ (Shultz et al, Clin Exp Immunol, 154(2):270-284, 2008)가 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 NSG 마우스를 사용하였다.
본 발명에서 용어, "중증 복합성 면역결핍증(severe combined immune deficiency; SCID)"은 T 세포의 부재 및 B 세포 기능의 부재를 특징으로 하는 증상을 의미한다. SCID 돌연변이는 기능적 B 세포 및 T 세포의 결손을 야기시키는 돌연변이를 말한다. 예를 들면, SCID 마우스 (CB-17-Prkdc scid )는 B 세포 수용체 (B cell receptor: BCR) 및 T 세포 수용체(T cell receptor: TCR)의 재배열에 결함이 있어, 기능적 B 세포 및 T 세포의 결손이 야기된다. 상기 NSG (NOD scid gamma) 마우스는 NOD/SCID γnull 마우스 또는 NOD/SCID IL-2RγKO 마우스라고도 한다. NSG 마우스는 잭슨 라보라토리 (The Jackson Laboratory)의 레오나르드 슐츠 박사 (Dr Leonard Shultz)의 실험실에서 개발되었다. 상기 NSG 마우스는 잭슨 라보라토리로부터 상업적으로 구입하거나, 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다 (Shultz LD, et al, J Immunol 2005; 169: 204-209). 예를 들면, NSG 마우스는 C57BL/6J-γ null마우스와 NOD/SCID 마우스를 9회 역교배 (backcross mating)하여 얻어질 수 있다. NSG 마우스는 기능적 T 세포 및 기능적 B 세포가 결여되어 있고, 대식구 기능이 감소되어 있고, NK 세포 또는 NK 활성이 제거되어 있고, 수지상 세포 기능이 감소되어 있는 것으로 알려져 있다. NSG 마우스는 NOD/SCID 마우스 또는 β2-마이크로글로불린-결여 NOD/LtSz-SCID (NOD/SCID/β2m null)에 비하여 이종조직 (xenograft)의 생착율(engraftment level)이 높은 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 상기 용어들 "NOD scid 감마"와 "NSG는 상호 교환되어 사용될 수 있다. Cg-Prkdc scid NSG 마우스는 NOD/ShiLtJ를 바탕으로 한 다중 면역 결핍, 중증 복합성 면역결핍증 및 인터루킨-2 수용체 감마 사슬의 완전한 넉아웃(knockout)을 가지고 있다. 그 결과, NSG 마우스는 사이토카인 신호가 결핍되어 있다. NSG 마우스는 IL2R-γ (감마 c) 발현의 결핍, 검출 가능한 혈청 면역 글로불린의 부존재, 용혈 보체 부존재, 성숙한 T 림프구의 부존재 및 성숙한 NK 세포의 부존재로 특징된다.
상기 인간화된 마우스 모델을 전임상 연구에 사용함으로써, 환자 특이 이종이식 (예를 들어, 환자-유래 이종 이식된 암)을 상기 인간화된 마우스 모델에서 연구할 수 있다. 임의의 시험 화합물 또는 약물을 상기 인간화된 마우스 모델에 하나 또는 그 이상의 투약 요법에 따라 투여함으로써, 이들 시험 화합물 또는 약물의 효과, 안전성 (예, 면역계에 대한 여하한 관련 부작용) 및 효능을 연구할 수 있다. 이러한 방법은 면역 종양학이나 면역 조절제, 또는 질병 조직 (예, 암, 자가 면역 질환)과 면역계 사이의 상호 작용을 포함하는 연구에 특히 효과적이다.
상기 인간화된 마우스 모델은 생착된(engrafted) 인간 조혈계의 존재 하에 임의의 환자-유래 이종 이식을 연구하는 데에도 사용될 수 있다. 여기에는 종양 조직학 연구, 오믹 연구 또는 프로파일링 (프로테오믹(proteomic), 게노믹(genomic, 메타블로믹(metablomic 등)이 포함된다. 특정 구현예들에 있어서, 연구 중인 환자-유래 이종 이식에 관한 정보는 마우스 종양 생물학 데이터베이스 (MTB)에서 얻을 수 있으며, 이는 실험 모델을 선택하고, 특정 암에서 돌연변이의 패턴을 검토하고, 암 스펙트럼 전반에 걸쳐 돌연변이가 통상적으로 발생하는 유전자들을 동정하는 것과 같은 분야의 연구자를 돕기 위해 고안되었다.
일 측면에서, 본 발명은 면역결핍 마우스에 자가면역 질환 환자로부터 분리한 PBMC를 주입하는 단계를 포함하는, 인간화된 자가면역 질환 마우스를 제작하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 면역결핍 마우스에 자가면역 질환 환자로부터 분리한 PBMC와 피부 조직을 함께 이식할 수 있고, 상기 피부 조직은 동일한 자가면역 질환 환자로부터 분리한 PBMC를 역분화 줄기세포로 유도하여 제작한 피부 조직일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 인간화된 자가면역 질환 마우스에 후보 물질을 처리하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환 치료 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환 환자로부터 분리한 PBMC를 역분화 줄기세포로 유도하는 단계; 역분화 줄기세포로 피부 조직을 제작하는 단계; 자가면역 질환 환자로부터 분리한 PBMC와 상기 단계 2)의 피부 조직을 면역결핍 마우스에 이식하는 단계; 및 마우스의 면역 상태를 모니터링하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환 환자의 피부 이식 후 면역 상태를 모니터링하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환 환자로부터 분리한 PBMC를 역분화 줄기세포로 유도하는 단계; 역분화 줄기세포로 피부 조직을 제작하는 단계; 자가면역 질환 환자로부터 분리한 PBMC와 상기 단계 2)의 피부 조직을 면역결핍 마우스에 이식하는 단계; 및 상기 마우스에 후보 물질을 처리하는 단계를 포함하는, 피부 이식에 대한 면역억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간화된 전신경화증 동물 모델 수립
1-1. PBMC 주입 모델
인간 면역 시스템을 탑재한 전신경화증 인간화 마우스 모델 (아바타 모델)을 수립하기 위해, NSG 마우스에 인간 유래 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)을 정맥내 주사하고 피부경화증(Systemic Sclerosis, SSc)을 관찰하였다 (도 1). 구체적으로, NSG 마우스에 정상인 또는 전신경화증 환자의 PBMC를 5x106/mice로 정맥내 주사한 뒤, 4주 동안 피부경화증을 관찰하였다.
1-2. PBMC 및 이로부터 유도된 피부 조직 이식 모델
인간 면역 시스템을 탑재한 전신경화증 인간화 마우스 모델 (아바타 모델)을 수립하기 위해, 피부경화증 환자의 PBMC를 분리하여 역분화 줄기세포로 유도하고 이로부터 제작한 피부조직과 피부경화증 환자의 PBMC 5x106/mice를 NSG 마우스에 이식하여 피부경화증 환자의 혈액과 피부를 가진 전신경화증 인간화 마우스 모델을 제작하였다 (도 2).
실시예 2. 전신경화증 인간화 동물 모델 수립 확인
2-1. 전신경화증 인간화 동물 모델의 혈액 내 인간 세포 확인
상기 실시예 1-1 및 1-2에서 수립한 전신경화증 인간화 마우스 모델 수립을 확인하기 위해, 인간 세포의 생착을 혈액 내 T 세포 및 B 세포를 분석함으로써 확인하였다. 구체적으로, 실시예 1-1의 전신경화증 인간화 마우스 (정상인 PBMC 주입군 및 전신경화증 환자 PBMC 주입군) 및 실시예 1-2의 전신경화증 인간화 마우스 (PBMC 주입과 피부이식을 같이 진행한, 대조군 및 전신경화증 인간화 마우스군)들로부터 혈액을 수득한 뒤, 인간 CD4, CD8 및 CD19 항체와 반응하여 양성인 세포를 유세포 분석을 통해 분석한 결과, 정상인과 전신경화증 환자의 PBMC주입에 의해 마우스 혈액 내 인간 CD4+T, CD8+T, Cd19+T 세포가 검출되는 것으로 보아 인간 세포가 잘 생착된 것으로 나타났다 (실시예 1-1 및 실시예 1-2 각각 도 3a 및 3b). 또한, 인간화 유도마우스의 혈청으로부터 IgG 레벨을 ELISA로 측정한 결과, 정상인 대비 환자의 PBMC 주입군에서 IgG 레벨이 현저히 증가한 것을 알 수 있었다 (도 4).
2-2. 전신경화증 인간화 동물 모델의 피부 및 폐 조직 내 인간 세포 확인
상기 실시예 1-1 및 1-2에서 수립한 전신경화증 인간화 마우스 모델에서의 조직 내 인간 세포의 생착을 확인하기 위하여, 실시예 1-1의 전신경화증 인간화 마우스 및 실시예 1-2의 전신경화증 인간화 마우스들을 희생시켜 피부 조직 및 폐를 적출한 뒤, 적출한 조직은 포르말린으로 고정한 후, 파라핀에 임베딩하여 5㎛ 두께의 절편을 생성하였다. 조직 내 면역세포를 관찰하기 위해 상기 절편 슬라이드에서 인간 CD4, CD8, CD19 항체와 반응시켜 면역조직화학분석을 수행하였다. 그 결과, 실시예 1-1의 정상인과 전신경화증 환자의 PBMC를 주입한 경우 (도 5a)와 실시예 1-2의 정상인과 전신경화증 환자의 PBMC 주입 및 피부 이식한 경우 (도 5b) 모두에서, 마우스 피부조직과 폐 조직 내 인간 CD4+T, CD8+T, Cd19+T 세포가 검출되어 인간 세포가 잘 생착된 것을 알 수 있었다.
실시예 3. 전신경화증 인간화 동물 모델의 조직 분석
3-1. H&E 염색 분석
상기 실시예 1-1에서 수립한 전신경화증 인간화 마우스 모델의 피부, 폐 및 비장 조직과, 실시예 1-2에서 수립한 전신경화증 인간화 마우스 모델의 피부 및 폐 조직을 조직학적으로 분석하기 위하여, 실시예 1-1의 전신경화증 인간화 마우스 SS 1의 피부, 폐 및 비장 조직, 및 실시예 1-2의 전신경화증 인간화 마우스의 피부 및 폐 조직을 H&E(haematoxylin and eosin) 염색하였다. 구체적으로, 적출한 조직은 포르말린으로 고정한 후, 파라핀에 임베딩하여 5㎛ 두께의 절편을 생성하였으며, H&E 염색을 위하여 절편 슬라이드를 자일렌(xylene)으로 탈파라핀화하였다. 이 후, 헤마톡실린(Hematoxylin)으로 세포핵을, 에오신(eosin)으로 세포질을 염색하여 조직의 병리를 비교분석하였다. 그 결과, PBMC만 주입한 모델 (실시예 1-1) (도 6a) 및 PBMC 주입과 피부이식을 동시에 한 모델 (실시예 1-2) (도 6b)에서 모두 전신경화증 인간화 마우스의 피부와 폐 조직에서 정상인 대비 염증세포의 침윤이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
3-2. Masson’s Trichrome 염색 분석
상기 실시예 1-1 및 1-2에서 수립한 전신경화증 인간화 마우스 모델의 피부 및 폐 조직의 섬유화를 조직학적으로 분석하기 위하여, 실시예 1-1의 전신경화증 인간화 마우스 및 실시예 1-2의 전신경화증 인간화 마우스들을 희생시켜 피부 및 폐 조직을 Masson’s Trichrome 염색하였다. 구체적으로, 슬라이드 조직 절편을 자일렌으로 탈파라핀하여 Bouin 용액으로 매염한 후, Weigert’iron 헤마톡실린으로 핵은을 염색하였다. Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution으로 세포질과 근섬유를 염색하여 교원섬유와 근섬유, 세포질 모두 적색으로 염색한 뒤, 다음 단계에 Phosphotungstic/phosphomolybdic acid로 교원섬유(collagen)를 탈색시킨 후, 아닐린 블루로 교원섬유를 염색하여 청색으로 염색하여, 각 조직의 섬유화를 비교분석하였다. 그 결과, PBMC만 주입한 모델 (실시예1-1) (도 7a) 및 PBMC 주입과 피부이식을 동시에 한 모델 (실시예1-2) (도 7b) 모두에서 전신경화증 인간화 마우스의 피부와 폐 조직에서 콜라겐 침착이 정상인 대비 현저하게 증가한 것을 확인하였다.
3-3. 섬유증 마커 염색 분석
상기 실시예 1-2에서 수립한 전신경화증 인간화 마우스 모델의 피부 및 폐 조직의 섬유화를 조직학적으로 분석하기 위하여, 실시예 1-2의 전신경화증 인간화 마우스들을 희생시켜 피부 및 폐 조직을 상기 실시예들에서와 같이 준비한 후, 섬유증 마커인 α-sma 항체를 이용하여 염색하여 섬유화 정도를 확인하였다. 그 결과, 실시예 1-2의 전신경화증 인간화 마우스 모델에서 피부와 폐 조직 모두에서 섬유화가 정상인 대비 현저함을 확인할 수 있었다 (도 8).
Claims (8)
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- 1) 피부경화증 환자로부터 분리한 PBMC를 역분화 줄기세포로 유도하는 단계;
2) 역분화 줄기세포로 피부 조직을 제작하는 단계;
3) 피부경화증 환자로부터 분리한 PBMC와 상기 단계 2)의 피부 조직을 면역결핍 마우스에 이식하는 단계; 및
4) 마우스의 CD4+T, CD8+T, CD19+T의 인간 면역 세포를 모니터링하는 단계를 포함하는, 피부경화증 환자의 피부 이식 후 면역 상태를 모니터링하는 방법.
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