JP2015504419A - Ｔ細胞反応の選択的阻害のための抗体および方法 - Google Patents

Ｔ細胞反応の選択的阻害のための抗体および方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、抗αβＴＣＲ抗体および抗体フラグメントを用いて炎症性疾患および／または自己免疫性疾患および／または移植組織拒絶を治療するための組成物、方法、およびアッセイを提供する。抗αβＴＣＲ抗体はαβＴＣＲに結合する抗体である。ハイブリドーマＴＯＬ１０１ＭＣＢにより産生された抗αβＴＣＲ抗体もまた、提供される。抗αβＴＣＲ抗体および抗体フラグメントの治療的投与レジメンを用いて炎症性疾患、自己免疫性疾患、および組織移植拒絶を治療する方法、およびＴｒｅｇＴ細胞の数をアップレギュレートする方法もまた、提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６１／５５５，３３５号（２０１１年１１月３日出願）、同第６１／５５５，３４４号（２０１１年１１月３日出願）、同第６１／５８９，７１５号（２０１２年１月２３日出願）、同第６１／６１０，３４８号（２０１２年３月１３日出願）、および同第６１／６５４，６３１号（２０１２年６月１日出願）（それらのそれぞれの全内容は、その全体が参照により本明細書において援用される）に基づく優先権を主張する。
電子申請テキストファイルの説明
添付の電子申請テキストファイル、すなわち、配列リストのコンピューター可読形式コピー（ファイル名：TLRA_001_01WO_SeqList_ST25.txt、記録日：２０１２年１１月５日、ファイルサイズ２０キロバイト）の内容は、その全体が参照により本明細書において援用される。
分野
本発明は、（ＴＣＲ＋）Ｔ細胞免疫反応を選択的に阻害するための抗体および方法に関する。特定的には、本発明は、抗αβＴＣＲ抗体および抗体フラグメントを用いた、移植拒絶、自己免疫性疾患、および炎症性疾患の治療に関する。また、（ＴＣＲ＋）Ｔ細胞免疫反応のモジュレーターを同定するための方法およびアッセイも記載される。いくつかの実施形態では、抗αβＴＣＲ抗体は、ＴＯＬ１０１モノクローナル抗体、ＴＯＬ１０１キメラ抗体、ＴＯＬ１０１ヒト化抗体、またはそれらの変異体である。
背景
この節の記載内容は、単に本開示に関連する背景情報を提供するにすぎず、先行技術を構成するとは限らない。
Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）は、少なくとも７つの内在性膜タンパク質で構成される。末梢性Ｔ細胞の大多数では、ＴＣＲは、αＴＣＲ鎖とαβＴＣＲ鎖とからなるクローン分布したジスルフィド結合ヘテロ二量体を含有する。これらのクローン型鎖は、α鎖に対しては、可変（Ｖ）セグメント、連結（Ｊ）セグメント、定常（Ｃ）セグメント、β鎖に対しては、さらに多様性（Ｄ）セグメントに細分される。αβＴＣＲには、ＣＤ３複合体を形成する３つの不変鎖が会合する。αβＴＣＲは、抗原／ＭＨＣ認識にきわめて重要であり、一方、ＣＤ３タンパク質は、シグナル伝達で重要な役割を果たす。
αβＴＣＲ鎖の構造は、抗体の構造に類似しており、遺伝子組換えから生じる可変領域は、ＴＣＲレパートリーの大きな多様性を生じる。一方、αβＴＣＲの定常領域および膜貫通領域は、保存される。これらの保存領域は、非常に重要である。なぜなら、それらは、α鎖とβ鎖とを結合する役割を果たし、ＣＤ３タンパク質と相互作用し、かつＴＣＲ成分を小胞体から細胞表面に輸送する役割を果たすからである。定常領域内に突然変異を有する患者は、機能不十分なαβＴＣＲを有していることもあるが、一般的には、ＴＣＲをまったく発現できない。生理学的には、こうした突然変異を有する患者は、重篤免疫不全に罹患する。Journal of Clinical Investigation中の最近の研究の１つでは、αＴＣＲサブユニット定常遺伝子中の翻訳終止コドンの直後のエキソン３の最後の塩基に遺伝子損傷があると、乳児で重篤免疫不全を生じ、一生涯にわたり抗ウイルス剤および抗生物質による予防が必要になることが、複数の患者で示された（Morgan, et al., “Mutation in the TCRα subunit constant gene (TRAC) leads to a human immunodeficiency disorder characterized by a lack of TCRαβ+ T-cells”. J. Clin. Invest., Feb 2011）。
同種異系固形臓器移植後の免疫抑制介入の不在下では、ドナーおよびレシピエントの抗原提示細胞は、アロ反応性アルファベータ（αβ）Ｔ細胞に移植抗原を提供し、活性化時、炎症反応および急速アロ移植拒絶反応をもたらす。Ｔ−ヘルパー（ＣＤ４）および細胞傷害性（ＣＤ８）のＴ細胞を含むこれらのＴ細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）抗原を含めて同種異系抗原を異物として認識するので、急性臓器移植拒絶反応に決定的に関与する。ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞は、γδＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現し、一般的には、ＭＨＣとの関連でタンパク質抗原を認識するのではなく、非従来型非タンパク質抗原を認識する。γδＴ細胞は、免疫抑制移植患者がとくに影響を受けやすいさまざまな微生物感染からの保護を提供することを含めて、いくつかの観点から腎臓移植患者に有益でありうる。そのような感染は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を含む。これは、移植患者に一般的なウイルス感染であり、免疫抑制性により他の日和見感染さらには移植後リンパ球増殖性障害をもたらす可能性がある。
マウスおよびヒトにおいて、ドナーγδＴ細胞の存在は、部分的には移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防を介して、骨髄移植モデルでより良好な転帰に関連付けられるが、その機序は、完全には理解されていない。γδＴ細胞のサブセットの１つは、正常ヒトおよび大多数の肝臓移植患者の末梢血中では稀な集団であるが、「手術寛容」肝臓移植患者の末梢血中では他のγδＴ細胞サブセットと比較してより高頻度に増加する。これらの患者は、免疫抑制からの完全回避を可能にするアロ移植寛容レベルに達成したので、「手術寛容」と考えられる。この増加したγδＴ細胞サブセットは、妊娠個体で半同種異系抗原寛容に関連付けられることから、これらの細胞は、同種異系抗原に対する寛容の形成および／または維持に重要な役割を有しうることが示唆される。それに加えて、末梢性γδＴ細胞の減少は、急性および慢性の腎臓アロ移植拒絶に関連付けられ、一方、安定な非拒絶腎臓移植患者は、平均でより高いパーセントのγδＴ細胞を有する。まとめると、これらの研究から、γδＴ細胞の枯渇または不活性化を回避する免疫抑制剤は、より良好な転帰に関連付けられる。
感染および悪性疾患のリスクを増大させる可能性のある不必要に非特異的な、長期間の、または無制限の免疫抑制に患者を晒すことなく、非マイトジェン方式で特異的αβＴ細胞を選択的に不活性化可能な作用剤に対して、医療の必要性が満たされない状態が存在する。γδＴ細胞は、感染性因子からの保護に重要なメディエーターであり、ＣＤ２５、ＣＤ５２、およびＣＤ３の発現を含めて、αβＴ細胞と共通したいくつかの特徴を共有する。したがって、現在使用されている導入療法は、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、アレムツズマブ、バシリキシマブ、およびダクリズマブを含めて、アロ反応性Ｔ細胞だけでなくγδＴ細胞およびＮＫ細胞をも標的とする。γδＴ細胞に損傷を与えずにαβＴＣＲのみを標的とすることにより急性臓器拒絶の予防または炎症性もしくは自己免疫性の疾患の治療を行うより特異的な方法は、日和見感染および悪性疾患の発生に関してより少ないリスクを有すると同時に現在使用されているＴ細胞標的化抗体と類似のまたはそれよりも良好な有効性を提供しうる。いくつかのαβＴＣＲ特異的抗体の発生が試みられてきたが、十分な臨床的有効性および許容可能な安全性プロファイルの両方を呈するものはなかった。したがって、炎症性疾患、自己免疫性疾患、およびアロ移植拒絶を含む疾患および病態で有効性を呈すると同時に最小限の有害作用を呈するαβＴＣＲ特異的抗体の必要性が存在する。
概要
とくに定義されていないかぎり、本明細書で用いられる科学技術用語はすべて、当該技術が属する技術分野の当業者により一般に理解されているものと同一の意味を有する。本技術の実施または試験にあたり本明細書に記載のものと類似のもしくは等価な方法および材料を使用することが可能であるが、好適な方法および材料を以下に記載する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示的なものにすぎず、それらに限定しようとするものではない。本明細書に記載の刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献はすべて、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾を生じた場合、定義を含む本明細書が優先するものとする。
本発明は、抗αβＴＣＲ抗体および抗体フラグメントを用いて炎症性疾患および／または自己免疫性疾患および／または移植組織拒絶を治療するための組成物、方法、およびアッセイを提供する。特定の実施形態では、本発明は、１日あたり単回用量の抗αβＴＣＲ抗体のみを用いて自己免疫性疾患を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体は、ＴＯＬ１０１モノクローナル抗体、ＴＯＬ１０１キメラ抗体、ＴＯＬ１０１ヒト化抗体、またはそれらの変異体である。ＴＯＬ１０１モノクローナル抗体は、ヒトαβＴＣＲに結合するマウスモノクローナルＩｇＭ抗体であり、ＴＯＬ１０１マスターセルバンク（ＭＣＢ）と称されるハイブリドーマにより産生される。ＴＯＬ１０１を産生するＴＯＬ１０１ＭＣＢハイブリドーマは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedures）の規定に基づいて米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）（10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209）に２０１２年１１月２日に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号＿が割り当てられた。
一態様では、本発明は、αβＴＣＲに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する単離されたハイブリドーマ細胞系を提供する。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞系は、ＴＯＬ１０１ＭＣＢである。他の態様では、本発明は、αβＴＣＲに結合するかつハイブリドーマＴＯＬ１０１ＭＣＢにより産生された抗体と等価なまたは対応するアミノ酸残基でグリコシル化される単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。本発明の他の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、ハイブリドーマＴＯＬ１０１ＭＣＢにより産生されたＴＯＬ１０１またはその断片である。
一実施形態では、本発明に係る単離された抗体またはそのフラグメントは、Ｔ細胞上のαβＴＣＲへの結合時にサイトカインの産生を引き起こさない。さらなる実施形態では、本発明に係る単離された抗体またはそのフラグメントは、Ｔ細胞上のαβＴＣＲへの結合時に腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−２、および／またはインターロイキン−６の産生を引き起こさない。他の実施形態では、本発明に係る単離された抗体またはそのフラグメントは、Ｔ細胞上のαβＴＣＲへの結合時にサイトカイン放出症候群に関連付けられるレベルのサイトカインを産生しない。さらなる実施形態では、サイトカイン放出症候群に関連付けられるサイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、インターロイキン−２、および／またはインターロイキン−６である。他の実施形態では、本発明に係る単離された抗体またはそのフラグメントは、Ｔ細胞上のαβＴＣＲへの結合時に５００ｐｇ／ｍＬ未満のＴＮＦ−αの産生を引き起こす。他の実施形態では、本発明に係る単離された抗体またはそのフラグメントは、Ｔ細胞上のαβＴＣＲへの結合時に５００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＦＮ−γの産生を引き起こす。他の実施形態では、本発明に係る単離された抗体またはそのフラグメントは、Ｔ細胞上のαβＴＣＲへの結合時に５００ｐｇ／ｍＬ未満のインターロイキン−２の産生を引き起こす。他の実施形態では、本発明に係る単離された抗体またはそのフラグメントは、Ｔ細胞上のαβＴＣＲへの結合時に５００ｐｇ／ｍＬ未満のインターロイキン−６の産生を引き起こす。他の実施形態では、本発明に係る単離された抗体またはそのフラグメントは、Ｔ細胞上のαβＴＣＲに結合し、その際、抗体は、αβＴＣＲに結合してＴ細胞上のαβＴＣＲおよびＣＤ３の表面発現を低減し、かつ抗体は、Ｔ細胞を枯渇させない。他の実施形態では、本発明に係る単離された抗体またはそのフラグメントは、αβＴＣＲへの結合時にＡＫＴまたはＥＲＫのリン酸化を引き起こす。他の実施形態では、本発明に係る単離された抗体またはそのフラグメントは、αβＴＣＲ＋Ｔ細胞の６０％未満でカルシウムフラックスを引き起こす。さらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、αβＴＣＲ＋Ｔ細胞の５０％未満でカルシウムフラックスを引き起こす。さらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、αβＴＣＲ＋Ｔ細胞の４０％未満でカルシウムフラックスを引き起こす。さらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、αβＴＣＲ＋Ｔ細胞の３０％未満でカルシウムフラックスを引き起こす。さらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、αβＴＣＲ＋Ｔ細胞の２０％未満でカルシウムフラックスを引き起こす。さらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、αβＴＣＲ＋Ｔ細胞の１５％未満でカルシウムフラックスを引き起こす。またさらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、αβＴＣＲ＋Ｔ細胞の１０％未満でカルシウムフラックスを引き起こす。他の実施形態では、本発明に係る単離された抗体またはそのフラグメントは、ＩＰ２６、３ａ８、およびＴ１０Ｂ９を含めてαβＴＣＲに特異的な他の抗体の結合を低減する。一実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、αβＴＣＲへのモノクローナル抗体Ｔ１０Ｂ９、３ａ８、またはＩＰ２６の結合を約１０％〜約１００％低減する。さらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、αβＴＣＲへのモノクローナル抗体Ｔ１０Ｂ９、３ａ８、またはＩＰ２６の結合を約４０％〜約９０％低減する。またさらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、αβＴＣＲへのモノクローナル抗体Ｔ１０Ｂ９、３ａ８、またはＩＰ２６の結合を約６０％〜約８０％低減する。そのほかのさらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、αβＴＣＲへのモノクローナル抗体Ｔ１０Ｂ９、３ａ８、またはＩＰ２６の結合を少なくとも８０％低減する。他の実施形態では、単離された抗体またはそのフラグメントは、Ｔ細胞上のαβＴＣＲに結合し、その際、抗体またはそのフラグメントの架橋は、Ｔ細胞の増殖を引き起こさない。本明細書で用いられる場合、「架橋」という用語は、抗体を固相プラスチック表面上などに固定することを意味する。
一実施形態では、本発明は、３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３）および３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３）が、ハイブリドーマＴＯＬ１０１ＭＣＢにより産生された抗体の軽鎖相補性決定領域および重鎖相補性決定領域である、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。他の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号３、４、および５を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる。他の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号６、７、および８に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体またはその抗原結合フラグメントが、ネズミ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、またはＦ（ａｂ）’フラグメントある、αβＴＣＲに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
一実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、αβＴＣＲに結合し、限定されるものではないが、放射性同位体、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、ビオチン、または毒素を含めて、検出可能標識にカップリングされる。
一実施形態では、本発明に係る単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｔ細胞上のαβＴＣＲを結合し、抗体または抗原結合フラグメントの架橋後、Ｔ細胞の増殖を引き起こさない。
一態様では、本発明は、抗体またはフラグメントがαβＴＣＲに結合するように、治療上有効量の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを必要とされるヒト患者に投与することを含む、炎症性疾患、自己免疫性疾患、または移植組織拒絶の治療、それらの発生の予防、またはそれらの症状の改善もしくは軽減のための方法を提供する。他の態様では、本発明は、治療上有効量の抗αβＴＣＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを必要とされるヒト患者に投与することを含む、炎症性疾患、自己免疫性疾患、または移植組織に対する反応の治療、それらの発生の予防、それらの症状の改善もしくは軽減のためにＴ細胞免疫反応を阻害する方法を提供する。本発明に係る抗体またはそのフラグメントによる検出、診断、治療、予後予測、改善、またはモニターを行いうる炎症性疾患、自己免疫性疾患、または移植組織拒絶としては、喘息、アレルギー、アレルギー性気道炎症、アレルギー性脳脊髄炎、自己免疫性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、反応性関節炎、乾癬性関節炎、仙腸骨炎、孤立性急性前部ブドウ膜炎、未分化脊椎関節症、１型糖尿病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、糸球体腎炎、橋本甲状腺炎、グレーブス病、強皮症、セリアック病、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、乾癬、接触性皮膚炎、グッドパスチャー症候群、アジソン病、ウェゲナー肉芽腫症、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、リウマチ性多発性筋痛症、ベーチェット病、ギラン・バレー症候群、種々の血管炎、ブドウ膜網膜炎、甲状腺炎、重症筋無力症、免疫グロブリン腎症、心筋炎、進行性全身性硬化症、臓器移植拒絶、混合性結合組織拒絶、および移植片対宿主病が含まれるが、これらに限定されるものではない。
一実施形態では、本発明に係る抗体またはその抗原結合フラグメントは、αβＴＣＲに結合し、かつ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定したときに抗体またはそのフラグメントが投与されたヒト患者の２０％未満でヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応を引き起こす。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、αβＴＣＲに結合し、かつＥＬＩＳＡにより測定したときに抗体またはそのフラグメントが投与されたヒト患者の１０％未満または５％未満でＨＡＭＡ反応を引き起こす。
一実施形態では、本発明はまた、ハイブリドーマＴＯＬ１０１ＭＣＢにより産生された抗体の軽鎖および重鎖の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含む抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列で哺乳動物宿主細胞をトランスフェクトすることと、宿主細胞を培養することと、αβＴＣＲに結合する、宿主細胞により産生された抗体またはそのフラグメントを単離することと、を含む、単離された抗体またはそのフラグメントの産生方法を提供する。一実施形態では、この方法により産生された抗体またはそのフラグメントは、Ｔ細胞上のαβＴＣＲおよびＣＤ３の表面発現を低減し、かつＴ細胞を枯渇させない。他の実施形態では、この方法により産生された単離された抗体またはそのフラグメントは、配列番号３および４を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列はさらに、配列番号５を含む。またさらなる実施形態では、この方法により産生された単離された抗体は、ＴＯＬ１０１である。
他の態様では、本発明は、ＴＣＲ＋Ｔ細胞活性化を抑制する治療用化合物の同定方法を提供する。さらなる実施形態では、この方法は、次の工程、すなわち、（ａ）ＴＣＲ−抗αβＴＣＲ複合体を形成するように操作可能な条件下でαβＴ細胞レセプター（αβＴＣＲ）またはそのフラグメントと抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントとを接触させる工程と、（ｂ）ＴＣＲ−抗αβＴＣＲ複合体と候補化合物とを接触させる工程と、（ｃ）ＴＣＲまたはそのフラグメントへの抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントの結合をモジュレートする候補化合物の能力を決定する工程と、（ｄ）前記候補化合物が抗ＣＤ３抗体の存在下で休止Ｔ細胞を活性化するかを決定する工程と、を含み、前記ＴＣＲまたはそのフラグメントへの前記抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントの結合をモジュレートすることおよび休止Ｔ細胞を活性化できないことは、前記候補化合物が治療用化合物であることの指標となる。さらなる態様では、本発明は、炎症性疾患、自己免疫性疾患、または移植組織拒絶の治療方法を包含する。この方法は、抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを約１４ｍｇ／日〜約５２ｍｇ／日の量で必要とされる被験体に投与する工程を含む。ただし、抗体は、ハイブリドーマＴＯＬ１０１ＭＣＢから産生される。
一実施形態では、本発明は、αβＴＣＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを約７ｍｇ／日〜約５８ｍｇ／日の量で必要とされる被験体に投与することを含む、自己免疫性疾患、炎症性疾患、または移植組織拒絶の治療方法を提供する。さらなる実施形態では、抗αβＴＣＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、ハイブリドーマＴＯＬ１０１ＭＣＢから産生される。さらなる実施形態では、抗αβＴＣＲ抗体またはそのフラグメントは、７ｍｇ／日、１４ｍｇ／日、２１ｍｇ／日、２８ｍｇ／日、３０ｍｇ／日、３２ｍｇ／日、３４ｍｇ／日、３５ｍｇ／日、３６ｍｇ／日、３８ｍｇ／日、４０ｍｇ／日、４２ｍｇ／日、４４ｍｇ／日、４６ｍｇ／日、４８ｍｇ／日、５０ｍｇ／日、５２ｍｇ／日、５４ｍｇ／日、５６ｍｇ／日、もしくは５８ｍｇ／日、またはそれらの組合せの量で投与される。
一実施形態では、本発明は、１日目に１４ｍｇ、２日目に２１ｍｇ、３日目に２８ｍｇ、４日目に４２ｍｇ、および５日目に４２ｍｇを含む投与スケジュールでαβＴＣＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、自己免疫性疾患、炎症性疾患、または移植組織拒絶の治療方法を提供する。さらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、１日目に１４ｍｇ、２日目に２１ｍｇ、３日目に２８ｍｇ、４日目に４２ｍｇ、５日目に４２ｍｇ、および６日目に４２ｍｇを含む投与スケジュールで投与される。一実施形態では、αβＴＣＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、１日１回投与される。
一態様では、本発明は、１日目に１４ｍｇ、２日目に２１ｍｇ、３日目に２８ｍｇ、４日目に４２ｍｇ、および５日目に４２ｍｇを含む投与スケジュールでαβＴＣＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、必要とされる被験体における調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の誘導方法を提供する。さらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、１日目に１４ｍｇ、２日目に２１ｍｇ、３日目に２８ｍｇ、４日目に４２ｍｇ、５日目に４２ｍｇ、および６日目に４２ｍｇを含む投与スケジュールで投与される。一実施形態では、被験体に存在する全血１ミリリットルあたりのＴｒｅｇの濃度は、被験体において全血１ミリリットルあたりＴｒｅｇのベースラインレベルが得られるように投与スケジュールの開始前に決定される。いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇは、表現型がＣＤ２＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ１２７ｌｏのＴｒｅｇである。いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇの数は、特異的細胞表面マーカーおよびフローサイトメトリーを用いて決定される。いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇの誘導方法が提供される。この場合、被験体は、アロ反応性Ｔ細胞の阻害、または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性の阻害、またはアロ反応の免疫抑制、または自己免疫反応の阻害、または組織の移植前、移植中、もしくは移植後のアロ反応もしくは自己免疫反応の阻害、予防、もしくはブロック、または移植片対宿主疾患の阻害、抑制、もしくはブロック、または炎症性疾患もしくは自己免疫性疾患での自己免疫反応の予防、治療、もしくは抑制が必要な状態である。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を添付の図面および以下の説明に示す。さらなる適用範囲は、本明細書に提供された説明から明らかになるであろう。説明および特定の実施例は、例示を目的とすることが意図されているにすぎず、本開示の範囲を限定することは意図されていないことを理解すべきである。
図面
本明細書に記載の図面は、例示を目的としたものにすぎず、本開示の範囲を限定することはなんら意図されていない。
図１は、ＴＯＬ１０１が一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で増殖を抑制することを例示する棒グラフを示している。 図２は、さまざまな濃度のＴＯＬ１０１の存在下における一方向ＭＬＲでのＴ細胞増殖の時間経過の線グラフを示している。 図３は、さまざまな濃度の遊離形態対架橋形態のＴＯＬ１０１の存在下におけるＴ細胞増殖の棒グラフを示している。 図４は、抗ＣＤ３媒介Ｔ細胞増殖のＴＯＬ１０１媒介抑制を示す棒グラフを示している。 図５は、活性化表現型およびナイーブ表現型のαβＴＣＲ＋Ｔ細胞に対するＴＯＬ１０１の特異性を例示するフローサイトメトリーピクトグラムを示している。 図６は、一方向混合リンパ球反応における活性化αβＴＣＲ＋Ｔ細胞サブセットに対するＴＯＬ１０１の特異性を例示するフローサイトメトリーピクトグラムを示している。 図７は、新鮮単離末梢血単核細胞のメモリーサブセットαβＴＣＲ＋Ｔ細胞に対するＴＯＬ１０１の特異性を例示するフローサイトメトリーピクトグラムを示している。 図８は、一方向混合リンパ球反応における刺激後の新鮮単離末梢血単核細胞のメモリーサブセットαβＴＣＲ＋Ｔ細胞に対するＴＯＬ１０１の特異性を例示するフローサイトメトリーピクトグラムを示している。 図９は、新鮮単離末梢血単核細胞の抗ＣＤ３活性化後のＴＯＬ１０１の結合減少を例示するフローサイトメトリーピクトグラムを示している。 図１０は、Ｔ細胞でのＺＡＰ７０リン酸化のヒストグラムおよび抗ＣＤ３媒介ＺＡＰ７０リン酸化を低減するＴＯＬ１０１の能力を示している。 図１１Ａは、さまざまな条件下におけるＴ細胞でのＥＲＫ／ｐ３８リン酸化のヒストグラムおよび抗ＣＤ３処理Ｔ細胞でのリン酸化ＥＲＫを誘導するＴＯＬ１０１の能力を示している。図１１Ｂは、各条件下におけるＥＲＫ／ｐ３８リン酸化の生の値を示している。 図１２Ａは、抗ＣＤ３および／またはＴＯＬ１０１の存在下および不在下におけるＴ細胞でのＳＴＡＴ１リン酸化のヒストグラムを示している。図１２Ｂは、各条件下におけるＥＲＫ／ｐ３８リン酸化の生の値を示している。 図１３Ａは、抗ＣＤ３および／またはＴＯＬ１０１の存在下および不在下におけるＴ細胞でのＳＴＡＴ３リン酸化のヒストグラムを示している。図１３Ｂは、各条件下におけるＥＲＫ／ｐ３８リン酸化の生の値を示している。 図１４Ａは、抗ＣＤ３および／またはＴＯＬ１０１の存在下および不在下におけるＴ細胞でのＳＴＡＴ５リン酸化のヒストグラムを示している。図１４Ｂは、各条件下におけるＥＲＫ／ｐ３８リン酸化の生の値を示している。 図１５Ａは、抗ＣＤ３および／またはＴＯＬ１０１の存在下および不在下におけるＴ細胞でのＳＴＡＴ６リン酸化のヒストグラムを示している。図１５Ｂは、各条件下におけるＥＲＫ／ｐ３８リン酸化の生の値を示している。 図１６は、ＴＯＬ１０１を用いた腎臓移植レシピエントの治療のためのプロトコルおよび対応する臨床エンドポイントを示している。 図１７は、図１６の治療プロトコルに対する投与スケジュールの概略図を示している。 図１８は、さまざまな濃度のＴＯＬ１０１の存在下におけるヒト患者ＣＤ３カウント数の時間経過の線グラフを示している。 図１９は、２週間にわたる２８ｍｇＴＯＬ１０１療法でのＴ細胞反応を表す線グラフを示しており、投与期間中、ＴＣＲ複合体を含まないＴ細胞が存在することが示される。 図２０は、ＴＯＬ１０１の存在下におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗アロ抗原反応の抑制の棒グラフを示している。 図２１は、複数の時間点で過去のｒＡＴＧデータと比較したときのＴＯＬ１０１注入患者から得られたサンプルを用いたサイトカイン放出アッセイの線グラフを示している。 図２２は、一定期間にわたる０．２８および１．４ｍｇ投与量のＴＯＬ１０１の生物学的利用能の時間経過の線グラフを示している。結果は、ＴＯＬ１０１の血漿中レベルとして表されている。 図２３は、一定期間にわたる７および１４ｍｇ投与量のＴＯＬ１０１の生物学的利用能の時間経過の線グラフを示している。結果は、ＴＯＬ１０１の血漿中レベルとして表されている。 図２４は、一定期間にわたる２８ｍｇ投与量のＴＯＬ１０１の生物学的利用能の時間経過の線グラフを示している。結果は、ＴＯＬ１０１の血漿中レベルとして表されている。 図２５は、Beckman Coulter Flow-Count Flourospheres手順を用いて全血から得られたＴ細胞カウント数のフローサイトメトリー結果を示している。ゲート処理結果は、ＴＯＬ１０１と共にインキュベートした後のＣＤ２、ＣＤ３、およびＣＤ４５発現の指標となる。 図２６は、ＴＯＬ１０１に暴露した後の一定期間にわたるＴ細胞表現型発現マーカーＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８の変化を例示する線グラフを示している。 図２７は、αβＴＣＲ＋Ｔ細胞に対するＴＯＬ１０１の作用機序の概略図である。概略図は、ＴＯＬ１０１が細胞を枯渇させることなく細胞表面からのＴＣＲ複合体の除去を引き起こすことを示している。 図２８は、ＴＯＬ１０１の用量漸増レジメンで投与を受けた臨床試験患者におけるＴｒｅｇ誘導を示す線グラフである。 図２９は、ＴＯＬ１０１結合およびＴｒｅｇ誘導の初期段階の概略図である。 図３０は、図２９から続く概略図であり、用量漸増レジメンで与えられたときにＴＯＬ１０１がＴｒｅｇを誘導する可能性のある経路を示している。 図３１Ａ〜３１Ｅは、ＴＯＬ１０１治療ヒト臨床試験被験体におけるＴＮＦ（パネルＡ）、ＩＦＮ−γ（パネルＢ）、ＩＬ６（パネルＣ）、ＩＬ１β（パネルＤ）、およびＩＬ２（パネルＥ）のレベルを示す線グラフである。図３１Ｆは、ＴＯＬ１０１第２相臨床試験におけるヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）誘導のレベルを示す棒グラフである。 図３２は、ＴＯＬ１０１第２相臨床試験で登録された患者のＣＤ３カウント数のリストである。 図３３Ａ〜３３Ｃは、第２相ＴＯＬ１０１臨床試験の有効性の尺度を示している。パネルＡは、生検確認急性拒絶率さらには患者生存および移植片生着を示す線グラフである（移植トリプルエンドポイントとして一般に参照される）。パネルＢは、推定糸球体濾過率を示す線グラフである。パネルＣは、ＴＯＬ１０１第２相試験における患者の測定糸球体濾過率を示すクラスターグラフである。 図３４は、αβＴＣＲに対するＴＯＬ１０１の特異性を示す一群のフローサイトメトリードットプロットおよびヒストグラムを示しており、抗体がα鎖に結合することが示唆される。 図３５は、一方向ＭＬＲでのＴＯＬ１０１によるＩＦＮ−γの抑制を例示する一群の棒グラフを示している。 図３６は、ＴＯＬ１０１がＣＤ２８誘導増殖をモジュレートしないことを示している。 図３７は、イオノマイシン、抗ＣＤ３、またはＴＯＬ１０１で刺激されたＣＤ４Ｔ細胞のカルシウムフラックスを示している。 図３８は、抗ＣＤ３処理および培地対照と比較してＴＯＬ１０１処理後の熱ショックタンパク質２７、ｐ３８ａＭＡＰＫタンパク質活性化キナーゼ、およびＡＫＴ２のタンパク質リン酸化を示している。ＮＤ＝検出されず。 図３９は、ゲート処理戦略および二方向ＭＬＲでのＴＯＬ１０１によるＦｏｘＰ３誘導を示している。 図４０は、ＴＯＬ１０１アミノ酸配列に由来するｓｃＦＶの模式的構造およびアミノ酸配列（配列番号９）（パネルＡ）、還元性条件下および非還元性条件下でのｓｃＦＶのＳＤＳ ｐａｇｅ（パネルＢ）、ならびにＣＤ８Ｔ細胞およびＣＤ４Ｔ細胞に結合するｓｃＦＶの能力を示すフローサイトメトリー（パネルＣ）を示している。
詳細な説明
技術に関する以下の説明は、１つ以上の本発明の主題、製造、および使用を本質的に単に例示したものにすぎず、本出願もしくは本出願に基づく優先権を主張して出願されうる他の出願またはそれらから生じる特許で特許請求された任意の特定の本技術の範囲、適用、または使用を限定することを意図したものでいない。以下の定義および限定されるものではないがガイドラインは、本明細書に示される技術の説明を精査したものとみなされなければならない。
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、ジスルフィド結合により相互結合された４本のポリペプチド鎖、すなわち、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖で構成された免疫グロブリン分子を意味するものとする。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略記される）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略記される）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬの領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が介在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分可能である。各可変領域（ＶＨまたはＶＬ）は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称される３つのＣＤＲを含有する。各可変領域はまた、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と称される４つのフレームワークサブ領域を含有する。抗体という用語は、たとえばＩｇＧおよびＩｇＭをはじめとするすべてのタイプの抗体を包含する。いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＭであり、いくつかの実施形態では、ＩｇＭは重合五量体を形成する。
本明細書で用いられる場合、抗体に関して「抗体フラグメント」および「抗原結合フラグメント」という用語は、インタクト抗体と同一の抗原に結合可能なインタクト抗体の一部を意味する。抗体フラグメントの例としては、線状抗体、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異的抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。抗体フラグメントは、好ましくは、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域の少なくとも一部を保持する。
「抗αβＴＣＲ抗体または抗αβＴＣＲ抗体フラグメント」という用語は、ヒトＴ細胞レセプターのα鎖、ヒトＴ細胞レセプターのβ鎖、またはヒトＴ細胞レセプターのα鎖およびβ鎖の両方に結合する抗体または抗体フラグメントを意味する。
本明細書で用いられる場合、「ＴＯＬ１０１抗体」という表現は、ヒトαβＴＣＲに結合するかつハイブリドーマＴＯＬ１０１マスターセルバンク（ＭＣＢ）から産生されるネズミ抗αβＴＣＲモノクローナルＩｇＭ抗体を意味する。本明細書で用いられる場合、「マスターセルバンク」という用語は、均一性および安定性を確保すべく一緒に処理された完全に特徴付けられた細胞の培養物を意味する。典型的には、ＭＣＢは、特定のモノクローナル抗体の安定かつ均一な供給源を提供すべく試験され決定されたハイブリドーマ細胞系である。ＴＯＬ１０１ＭＣＢは、２０１２年１１月２日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号＿が割り当てられた。
ＴＯＬ１０１は、配列番号３：
Figure 2015504419
のポリヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖を有する。
ＴＯＬ１０１は、配列番号４：
Figure 2015504419
のポリヌクレオチドによりコードされる重鎖を有する。
ＴＯＬ１０１は、配列番号５：
Figure 2015504419
のポリヌクレオチド配列によりコードされるＪ鎖を有する。
ＴＯＬ１０１軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号６：
Figure 2015504419
で表される。
ＴＯＬ１０１重鎖のアミノ酸配列は、配列番号７：
Figure 2015504419
で表される。
ＴＯＬ１０１Ｊ鎖のアミノ酸配列は、配列番号８：
Figure 2015504419
で表される。
本明細書で用いられる場合、「αβＴＣＲ」は、哺乳動物ＴＣＲの哺乳動物αサブユニットと哺乳動物βサブユニットとのヘテロ二量体を含みうる。いくつかの実施形態では、哺乳動物αサブユニットは、ヒトαサブユニットのアミノ酸配列、たとえば、配列番号１：
Figure 2015504419
のアミノ酸配列を含みうる。
いくつかの実施形態では、哺乳動物βサブユニットは、ヒトβサブユニットのアミノ酸配列、たとえば、配列番号２：
Figure 2015504419
のアミノ酸配列を含みうる。
いくつかの実施形態では、例示的なヒトαβＴＣＲは、配列番号１および２のサブユニットαβを含むヘテロ二量体でありうる。いくつかの実施形態では、ヒトαβＴＣＲまたはそのフラグメントは、配列番号１および２の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトαβＴＣＲは、配列番号１または２の少なくとも一部を含む部分またはフラグメントを含みうる。
本明細書で用いられる場合、「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、主に抗原結合に関与する領域を意味する。軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３）および重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）が存在する。これらの６つのＣＤＲを構成する残基は、KabatおよびChothiaにより、次のように、すなわち、軽鎖可変領域中の残基２４〜３４（ＣＤＲＬ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲＬ２）、および残基８９〜９７（ＣＤＲＬ３）、ならびに重鎖可変領域中の残基３１〜３５（ＣＤＲＨ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲＨ２）、および残基９５〜１０２（ＣＤＲＨ３）（Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.（参照により本明細書において援用される））として、さらには軽鎖可変領域中の残基２６〜３２（ＣＤＲＬ１）、残基５０〜５２（ＣＤＲＬ２）、および残基９１〜９６（ＣＤＲＬ３）、ならびに重鎖可変領域中の残基２６〜３２（ＣＤＲＨ１）、残基５３〜５５（ＣＤＲＨ２）、および残基９６〜１０１（ＣＤＲＨ３）（Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917（参照により本明細書において援用される））として、特徴付けられてきた。特定の実施形態では、本明細書で用いられる「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、Kabat定義およびChothia定義の両方を包含する残基（すなわち、軽鎖可変領域中の残基２４〜３４（ＣＤＲＬ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲＬ２）、および残基８９〜９７（ＣＤＲＬ３）、ならびに残基２６〜３５（ＣＤＲＨ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲＨ２）、および残基９５〜１０２（ＣＤＲＨ３））を含む。また、本明細書で用いられる場合、明記されていないかぎり、ＣＤＲ残基の番号付けは、Kabatに従う。特定の実施形態では、本発明は、ヒトフレームワーク内にＴＯＬ１０１の６つのＣＤＲで構成されたヒト化抗体を提供する（たとえば、寄託されたハイブリドーマの配列決定を行って、当技術分野で公知の技術に従って組換えによりヒト化抗体を構築する）。
本明細書で用いられる場合、「フレームワーク」という用語は、本明細書に定義されたＣＤＲ残基以外の可変領域の残基を意味する。フレームワークを構成する４つの個別のフレームワークサブ領域、すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４が存在する。フレームワークサブ領域が軽鎖または重鎖の可変領域に存在するかを示すために、サブ領域略号に「Ｌ」または「Ｈ」が追加されることもある（たとえば、「ＦＲＬ１」は、軽鎖可変領域のフレームワークサブ領域１を示す）。明記されていないかぎり、フレームワーク残基の番号付けは、Kabatに従う。特定の実施形態では、抗αβＴＣＲ抗体またはそのフラグメントは、完全でないフレームワークを有しうることが、留意すべき点である（たとえば、それらは、４つのサブ領域の１つ以上を含有するにすぎないフレームワークの一部を有しうる）。
本明細書で用いられる場合、「完全ヒトフレームワーク」という用語は、ヒトで天然に見いだされるアミノ酸配列を有するフレームワーを意味する。完全ヒトフレームワークの例としては、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ、およびＰＯＭが含まれるが、これらに限定されるものではない（たとえば、Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA、およびWu et al., (1970) J. Exp. Med. 132, 211-250（両方とも参照により本明細書において援用される）を参照されたい）。特定の実施形態では、本発明に係るヒト化抗体は、完全ヒトフレームワークまたはＴＯＬ１０１のネズミＣＤＲを収容するように変化させた１個以上のアミノ酸を有するフレームワークを有する。
本明細書で用いられる場合、「ヒト化」抗体とは、組換え技術を用いて一般に調製され、非ヒト種の免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を有し、かつ分子の残りの免疫グロブリン構造がヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく、キメラ分子を意味する。抗原結合部位は、定常ドメインに融合された完全な可変ドメインまたは可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域にグラフトされた相補性決定領域（ＣＤＲ）のみのいずれかを含みうる。抗原結合部位は、野生型でありうるかまたは１つ以上のアミノ酸置換により修飾されうる。これにより、一般的には、ヒト個体において免疫原としての定常領域は排除されるが、一般的には、外来可変領域に対する免疫反応の可能性は残る。他の手法では、ヒト由来の定常領域を提供するだけでなく、できるかぎりヒトに近い形態で再構成すべく可変領域を修飾することにも重点が置かれる。重鎖および軽鎖の可変領域は両方とも、所与の種で比較的保存されるかつＣＤＲに対する足場を提供すると推定される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）によりフランキングされた、対象の抗原に応じて異なるかつ結合能を決定する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有することが知られている。特定の抗原に対して非ヒト抗体を調製する場合、非ヒト抗体に由来するＣＤＲを修飾されるヒト抗体中に存在するＦＲ上にグラフトすることにより、可変領域を「再構成」または「ヒト化」することが可能である。種々の抗体へのこの手法の適用は、Sato, K., et al., (1993) Cancer Res 53 :851-856、Riechmann, L., et al., (1988) Nature 332:323-327、Verhoeyen, M., et al., (1988) Science 239:1534-1536、Kettleborough, C. A., et al., (1991) Protein Engineering 4:773-3783、Maeda, H., et al., (1991) Human Antibodies Hybridoma 2:124-134、Gorman, S. D., et al., (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:4181-4185、Tempest, P. R., et al., (1991) Bio/Technology 9:266-271、Co, M. S., et al., (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873、Carter, P., et al., (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289、およびCo, M. S. et al., (1992) J Immunol 148:1149-1154（それらはすべて、参照により本明細書において援用される）により報告された。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、すべてのＣＤＲ配列を保存する（たとえば、寄託されたＴＯＬ１０１抗体の６つのＣＤＲをすべて含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、元の抗体（たとえば、元のＴＯＬ１０１抗体）に対して改変された１つ以上（１、２、３、４、５、６）のＣＤＲ（元の抗体の１つ以上のＣＤＲ「に由来する」１つ以上のＣＤＲと称されることもある）を有する。
本明細書で用いられる場合、「被験体」および「患者」という用語は、哺乳動物などの任意の動物を意味する。本明細書で用いられる「哺乳動物」という用語は、ヒト、非ヒト霊長動物、類人猿、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、ならびに当技術分野で一般に知られている科学研究で利用される哺乳動物、たとえば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、およびフェレットを含めて、哺乳動物に分類される任意の哺乳動物を意味する。本発明の好ましい実施形態では、哺乳動物はヒトである。
本明細書で用いられる場合、「精製された」または「精製する」という用語は、サンプルからの汚染物質の除去を意味する。たとえば、αβＴＣＲ特異的抗体は、汚染性非免疫グロブリンタンパク質の除去により精製されうる。また、同一の抗原に結合しない免疫グロブリンの除去により精製される。非免疫グロブリンタンパク質の除去および／または特定の抗原に結合しない免疫グロブリンの除去により、サンプル中の抗原特異的免疫グロブリンのパーセントが増加する。他の例では、組換え抗原特異的ポリペプチドは、細菌宿主細胞、真核宿主細胞、または哺乳動物宿主細胞で発現され、ポリペプチドは、宿主細胞タンパク質の除去により精製される。それにより、サンプル中の組換え抗原特異的ポリペプチドのパーセントが増加する。
本明細書で用いられる場合、「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を意味する。「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域または（たとえば、増大または低減されたエフェクター機能を有する）変異Ｆｃ領域でありうる。
本明細書で用いられる場合、Ｆｃ領域は、（たとえば、被験体において）生物学的活性の活性化または低下に関与する「エフェクター機能」を有しうる。エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面レセプター（たとえば、Ｂ細胞レセプターＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。そのようなエフェクター機能は、Ｆｃ領域と結合ドメイン（たとえば、抗体可変ドメイン）とを組み合わせることを必要としうる。また、種々のアッセイ（たとえば、Ｆｃ結合アッセイ、ＡＤＣＣアッセイ、ＣＤＣアッセイなど）を用いて評価可能である。
本明細書で用いられる場合、「単離された」抗体または抗体フラグメントは、同定されてその天然環境の成分から分離および／または回収されたものである。その天然環境の汚染成分は、抗体またはそのフラグメントの診断的または治療的使用を妨害するおそれのある物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質または非タンパク質の溶質を含みうる。特定の実施形態では、単離された抗体は、（１）ローリー法により決定したときに９５重量％超、好ましくは９９重量％超のポリペプチドに、（２）スピニングカップシークエネーターを用いて少なくとも１５残基のＮ末端もしくは内部のアミノ酸配列を得るのに十分な程度に、または（３）クーマシーブルー染色もしくは銀染色を用いて還元性もしくは非還元性の条件下でＳＤＳ−ｐａｇｅにより均一になるまで、精製される。単離された抗体は、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの成分は存在しないであろうから、組換え細胞内にｉｎ ｓｉｔｕで抗体を含む。しかしながら、通常、単離された抗体は、最も少ない１回の精製工程により調製されるであろう。
本明細書で用いられる場合、「治療」という用語は、治療処置および予防（prophylactic or preventative）手段の両方を意味する。治療を必要とするものは、すでに疾患を有するものさらには疾患が予防されるものを含む。
「症状が軽減される条件下で」という表現は、疾患からの回復率（たとえば、体重増加率）に及ぼす検出可能な影響（ただし、これに限定されるものではない）を含めてαβＴＣＲ抗体により治療可能な任意の疾患の検出可能な症状の定性的もしくは定量的な軽減、または特定の疾患に通常関連付けられる症状（たとえば、移植拒絶の症状）の少なくとも１つの軽減、の任意の程度を意味する。特定の実施形態では、本発明に係るαβＴＣＲ抗体は、（たとえば、αβＴＣＲ抗体で治療しない場合と比較して）移植拒絶またはＧＶＨＤの症状が軽減される条件下で被験体に投与される。
本明細書で用いられる見出し（「背景」や「概要」など）および副見出しは、本技術内のトピックを一般的に構成することを意図したものにすぎず、本技術またはその任意の側面の開示を限定することを意図したものではない。とくに、「背景」に開示された主題は、新規な技術を含むこともあれば、先行技術の記載を構成しないこともありうる。「概要」に開示された主題は、技術またはその任意の実施形態の全範囲の網羅的または完全な開示ではない。特定の有用性を有する本明細書の節内の材料の分類または考察は、便宜的に行われたものであり、所与の組成物のいずれで使用する場合でも、本明細書のその分類に従って材料が必ずまたは専ら機能しなければならないという推論を引き出すべきでない。
本明細書での参照文献の引用は、それらの参照文献が先行技術であることまたは本明細書に開示された技術の特許性となんらかの関連性を有することを承認するものではない。本開示に引用された参照文献の内容の考察はいずれも、参照文献の著者らによりなされた主張の一般的概要を単に提供することを意図したものであり、そのような参照文献の内容の確かさに関して承認するものではない。本明細書の「説明」の節で引用された引用文献はすべて、その全体が参照により本明細書において援用される。
説明および特施例は、技術の実施形態の指標となるが、例示の目的を意図したものにすぎず、技術の範囲を限定することを意図したものではない。さらに、明記された特徴を有する複数の実施形態の記載は、追加の特徴を有する他の実施形態または明記された特徴の異なる組合せが組み込まれた他の実施形態を除外することを意図したものではない。特定例は、この技術の組成物および方法の実施および使用をいかに行うかを例示する目的で提供されたものであり、とくに明記されていないかぎり、この技術の所与の実施形態の作製または試験が行われたか行われていないかを表すことを意図したものではない。
本明細書で用いられる場合、「好ましい」および「好ましくは」という言葉は、特定の状況下で特定の利点を与える技術の実施形態を意味する。しかしながら、同一または他の状況下で、他の実施形態が好ましいこともありうる。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の記載は、他の実施形態が有用でないことを意味するものでもなければ、他の実施形態を技術の範囲から除外することを意図したものでもない。
本明細書で参照される場合、組成パーセントはすべて、とくに明記されていないかぎり、全組成物の重量を基準にする。本明細書で用いられる場合、「ｉｎｃｌｕｄｅ（〜を含む）」という言葉およびその変化形は、限定することを意図したものではないので、リスト中の項目の記載は、この技術の材料、組成物、装置、および方法で同様に有用でありうる他の類似の項目を除外するものではない。同様に、「ｃａｎ（〜可能である、〜しうる）」および「ｍａｙ（〜であってもよい、〜しうる）」という用語ならびにそれらの変化形は、限定することを意図したものではないので、実施形態が特定の要素または特徴を含みうるまたは含んでいてもよいという記載は、それらの要素または特徴を含有しない本技術の他の実施形態を除外するものではない。
「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を含む）」というオープンエンドの用語は、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（〜を含む）、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（〜を含有する）、ｈａｖｉｎｇ（〜を有する）などの同義語も同様に、本発明の説明または特許請求を行うべく本明細書で用いられるが、本技術またはその実施形態は、記載の成分「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（〜からなる）」や「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（〜から本質的になる）」などのより多くの限定用語を用いて代替的に記載されうる。
とくに定義されていないかぎり、本明細書で用いられる科学技術用語はすべて、当該技術が属する技術分野の当業者により一般に理解されているものと同一の意味を有する。本技術の実施または試験にあたり本明細書に記載のものと類似のもしくは等価な方法および材料を使用することが可能であるが、好適な方法および材料を以下に記載する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示的なものにすぎず、それらに限定しようとするものではない。本明細書に記載の刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献はすべて、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾を生じた場合、定義を含む本明細書が優先するものとする。
αβＴＣＲを指向する単離された抗体および抗体フラグメント
「抗体」という用語は、最広義で用いられ、特定的には、単一の抗αβＴＣＲ抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、および中和抗体または阻止抗体を含む）およびポリエピトープ特異性を有する抗αβＴＣＲ抗体組成物を包含する。本明細書で用いられる「抗体」は、本明細書に記載の所望の作動性もしくは拮抗性または機能性もしくは臨床性のいずれかを呈するかぎり、インタクト免疫グロブリンまたは抗体分子、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（すなわち、少なくとも２つのインタクト抗体から形成される二重特異性抗体）、および免疫グロブリンフラグメント（たとえば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦｖ）を含む。
抗体は、典型的には、特異的抗原に対する結合特異性を呈するタンパク質またはポリペプチドである。天然抗体は、通常、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖で構成されたヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、各軽鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合により重鎖に結合されるが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）および続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に（ＶＬ）可変ドメインおよびその他端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインにアライメントされ、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインでアライメントされる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖の可変ドメイン間に境界を形成すると考えられる［Chothia et al., J. Mol. Biol., 186:651-663 (1985)、Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-4596 (1985)］。いかなるの脊椎動物種の抗体の軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる２つの明確に異なるタイプの１つに帰属可能である。その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、異なるクラスに帰属可能である。
５つの主要クラスの免疫グロブリン、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、たとえば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、およびＩｇＧ−４、ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２にさらに分割されうる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
「抗体フラグメント」は、インタクト抗体の一部、一般的には、インタクト抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント、ダイアボディー、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異的抗体が含まれる。
「可変」という用語は、抗体間で配列が異なる可変ドメインの特定の部分を記載すべく本明細書で用いられ、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合性および特異性に使用される。しかしながら、可変性は、通常、抗体の可変ドメイン全体にわたり一様に分布してない。それは、典型的には、軽鎖および重鎖の可変ドメインの両方にある相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中する。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、３つのＣＤＲにより結合された主にβシート配置をとる４つのＦＲ領域を含み、これらのＣＤＲは、ループを形成して、βシート構造を結合し、いくつかの場合にはその一部を形成する。各鎖中のＣＤＲは、他の鎖のＣＤＲと共にＦＲ領域によりごく近接して一体的に保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する［Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)を参照されたい］。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与していないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与などの種々のエフェクター機能を呈する。
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個別の抗体は、副次量で存在しうる天然に存在する可能性のある突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は、きわめて特異的であり、単一の抗原性部位を指向する。さらに、典型的には異なる決定因子（エピトープ）を指向する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル抗体）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子を指向する。
本明細書中のモノクローナル抗体は、所望の生物学的活性または性質を呈するかぎり、起源の種または免疫グロブリンのクラス名もしくはサブクラス名さらには抗体フラグメント（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）にかかわらず、抗αβＴＣＲ抗体の可変（超可変を含む）ドメインと定常ドメインとの（たとえば、「ヒト化」抗体の場合）、または軽鎖と重鎖との、または一方の種の鎖と他方の種の鎖との接合により、または異種タンパク質との融合により、産生されたキメラ抗体、ハイブリッド抗体、および組換え抗体を含む。たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号およびMage et al., in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97 (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987)を参照されたい。
したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特性を意味し、いかなる特定の方法による抗体の産生も必要とみなすべきではない。たとえば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製しうるか、または米国特許第４，８１６，５６７号に記載の組換えＤＮＡ法により作製しうる。「モノクローナル抗体」はまた、たとえば、McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)に記載の技術を用いて生成されたファージライブラリーから単離しうる。
「ヒト化」形態の非ヒト（たとえば、ネズミ）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する特異的なキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント（たとえば、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または他の抗原結合サブ配列）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基により置き換えられた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも輸入されたＣＤＲやフレームワーク配列中にも見いだされない残基を含みうる。これらの修飾は、抗体性能のさらなる精密化および最適化のために行われる。一般的には、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応する、かつＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むであろう。最適には、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むであろう。
「ヒト抗体」は、ヒトにより産生された抗体および／または当技術分野で公知のもしくは本明細書に開示のヒト抗体作製技術のいずれかを用いて作製された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体、たとえば、ネズミ軽鎖ポリペプチドとヒト重鎖ポリペプチドとを含む抗体を含む。ヒト抗体は、当技術分野で公知の種々の技術を用いて産生可能である。一実施形態では、ヒト抗体は、ファージライブラリーがヒト抗体を発現するファージライブラリーから選択される（Vaughan et al. Nature Biotechnology, 14:309-314 (1996)、Sheets et al. PNAS, (USA) 95:6157-6162 (1998))、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)、Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)）。ヒト抗体はまた、トランスジェニック動物、たとえば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されたマウスにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することにより作製可能である。挑戦時、遺伝子再構成、集合、および抗体レパートリーを含めてあらゆる点でヒトに見られるものによく似たヒト抗体産生が観察される。この手法は、たとえば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、および次の科学出版物、すなわち、Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)、Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994)、Morrison, Nature, 368:812-13 (1994)、Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-51 (1996)、Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996)、Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)に記載されている。他の選択肢として、ヒト抗体は、標的抗原を指向する抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化を介して調製されうる（そのようなＢリンパ球は、個体から回収されうるか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫されたものでありうる）。たとえば、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)、Boerner et al., J. Immunol. , 147 (1):86-95 (1991)、および米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたい。
本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体または抗体フラグメントの可変領域および／またはＣＤＲならびにそれらの変異体は、任意のタイプの好適なヒト定常領域（たとえば、キメラ抗体の場合）またはヒトフレームワーク（たとえば、ヒト化抗体の場合）と共に利用しうる。特定の実施形態では、定常領域はＩｇＭクラスである。好ましくは、ＣＤＲは、完全ヒトフレームワーク領域またはフレームワークサブ領域と共に使用される。たとえば、ＮＣＢＩウェブサイトは、特定のヒトフレームワーク領域に対する配列を含有する。ヒトＶＨ配列の例としては、ヒト免疫グロブリン鎖可変領域遺伝子座の完全なヌクレオチド配列を含むMatsuda et al., J Exp. Med. 1998 Dec 7; 188(11):2151-62（参照により本明細書において援用される）に提供されるＶＨ１−１８、ＶＨ１−２、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−３、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−８、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−５、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ３−９、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−４、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１およびＶＨ７−８１が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトＶＫ配列の例としては、Kawasaki et al., Eur J Immunol 2001 Apr;31(4): 1017-28、Schable and Zachau, Biol Chem Hoppe Seyler 1993 Nov; 374(11):1001-22、およびＢrensing-Kuppers et al., Gene 1997 Jun 3;191(2):173-81（それらはすべて、参照により本明細書において援用される）に提供されるＡ１、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１４、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２、Ａ２０、Ａ２３、Ａ２６、Ａ２７、Ａ３、Ａ３０、Ａ５、Ａ７、Ｂ２、Ｂ３、Ｌ１、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１４、Ｌ
１５、Ｌ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｌ２、Ｌ２０、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２５、Ｌ４／１８ａ、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ８、Ｌ９、Ｏ１、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１４、Ｏ１８、Ｏ２、Ｏ４、およびＯ８が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトＶＬ配列の例としては、Kawasaki et al., Genome Res 1997 Mar; 7(3):250-61（参照により本明細書において援用される）に提供されるＶ１−１１、Ｖ１−１３、Ｖ１−１６、Ｖ１−１７、Ｖ１−１８、Ｖ１−１９、Ｖ１−２、Ｖ１−２０、Ｖ１−２２、Ｖ１−３、Ｖ１−４、Ｖ１−５、Ｖ１−７、Ｖ１−９、Ｖ２−１、Ｖ２−１１、Ｖ２−１３、Ｖ２−１４、Ｖ２−１５、Ｖ２−１７、Ｖ２−１９、Ｖ２−６、Ｖ２−７、Ｖ２−８、Ｖ３−２、Ｖ３−３、Ｖ３−４、Ｖ４−１、Ｖ４−２、Ｖ４−３、Ｖ４−４、Ｖ４−６、Ｖ５−１、Ｖ５−２、Ｖ５−４、およびＶ５−６が含まれるが、これらに限定されるものではない。完全ヒトフレームワークは、これらの機能性生殖系列遺伝子のいずれかから選択可能である。一般的には、これらのフレームワークは、限られた数のアミノ酸変化だけ互いに異なる。これらのフレームワークは、ＴＯＬ１０１のＣＤＲまたはその変異体と共に使用しうる。本発明に係るＣＤＲと共に使用しうるヒトフレームワークの追加の例としては、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ、およびＰＯＭが含まれるが、これらに限定されるものではない（たとえば、Kabat et al., 1987 Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA、およびWu et al., 1970, J. Exp. Med. 132, 211-250（両方とも参照により本明細書において援用される）を参照されたい）。
「Ｆｃ領域」という用語は、インタクト抗体のパパイン消化により生成されうる免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義すべく使用される。Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または変異Ｆｃ領域でありうる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界はさまざまでありうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６近傍のアミノ酸残基からまたは位置Ｐｒｏ２３０近傍からＦｃ領域のカルボキシル末端まで伸長するように定義される（本明細書ではKabat et al., supraによる番号付け体系を使用する）。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般的には、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの２つの定常ドメインを含み、任意選択で、ＣＨ４ドメインを含む。
「Ｆｃ領域鎖」とは、本明細書では、Ｆｃ領域の２本のポリペプチド鎖の１つを意味する。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃγ２」ドメインとしても参照される）は、通常、位置２３１近傍のアミノ酸残基から位置３４０近傍のアミノ酸残基まで延在する。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと強く対合しないという点でユニークである。もっと正確に言えば、インタクト天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に２本のＮ結合分岐状炭水化物鎖が介在する。炭水化物は、ドメイン間対合の代わりを提供してＣＨ２ドメインの安定化を支援しうると推測されてきた。Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)。本明細書中のＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメインまたは変異ＣＨ２ドメインでありうる。
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣ末端からＣＨ２ドメインまでの一続きの残基（すなわち、ＩｇＧの位置３４１近傍のアミノ酸残基から位置４４７近傍のアミノ酸残基まで）を含む。本明細書中のＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメインまたは変異ＣＨ３ドメインでありうる（たとえば、一方の鎖中に導入された「隆起」と他方の鎖中に対応して導入された「空隙」とを有するＣＨ３ドメイン、米国特許第５，８２１，３３３号参照）。そのような変異体ＣＨ３ドメインは、本明細書に記載の多重特異的（たとえば、二重特異的）抗体を作製するために使用しうる。
「ヒンジ領域」は、一般的には、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６近傍またはＣｙｓ２２６近傍からＰｒｏ２３０近傍までの伸長として定義される（Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)）。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、同一の位置に重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する最初および最後のシステイン残基を配置することによりＩｇＧ１配列とアライメントされうる。本明細書中のヒンジ領域は、天然配列ヒンジ領域または変異ヒンジ領域でありうる。変異ヒンジ領域の２本のポリペプチド鎖は、一般的には、変異ヒンジ領域の２本のポリペプチド鎖が２本の鎖間でジスルフィド結合を形成できるように、ポリペプチド鎖１本あたり少なくとも１個のシステイン残基を保持する。本明細書中の好ましいヒンジ領域は、天然配列ヒトヒンジ領域、たとえば、天然配列ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
「機能性Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つの「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面レセプター（たとえば、Ｂ細胞レセプターＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが含まれる。そのようなエフェクター機能は、一般的には、Ｆｃ領域を結合ドメイン（たとえば、抗体可変ドメイン）と組み合わせることを必要とし、そのような抗体エフェクター機能を評価するための当技術分野で公知の種々のアッセイを用いて評価可能である。
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見いだされるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「変異Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾により天然配列Ｆｃ領域のものと異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも１つのアミノ酸置換、たとえば、約１〜約１０のアミノ酸置換、好ましくは約１〜約５のアミノ酸置換を有する。本明細書の変異Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域に対して少なくとも約８０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するであろう。
「抗体依存性Ｔ細胞媒介細胞傷害性」および「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（たとえば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が、標的Ｔ細胞上に結合された抗体を認識し、続いて標的Ｔ細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を意味する。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞のＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)の４６４頁の表３にまとめられている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを行いうる。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。他の選択肢としてまたは追加として、対象分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、たとえば、Clynes et al. PNAS (USA), 95:652-656 (1998)に開示されるような動物モデルで評価しうる。
「ヒトエフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現する白血球であり、エフェクター機能を発揮する。好ましくは、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を発揮する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、および好中球が含まれ、好ましいのは、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞である。エフェクター細胞は、その天然源から、たとえば、本明細書に記載の血液またはＰＢＭＣから、単離しうる。
「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載すべく用いられる。好ましいＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（γレセプター）であり、これには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターが含まれ、これらのレセプターの対立遺伝子変異体および選択的にスプライシングされた形態も含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターとしては、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性レセプター」）が含まれ、これらは、主にその細胞質内ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質内ドメインに免疫レセプターチロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質内ドメインに免疫レセプターチロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)にレビューされている）。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)、Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994)、およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995)にレビューされている。他のＦｃＲは、将来同定されるものを含めて、本明細書中の「ＦｃＲ」という用語に包含される。この用語はまた、胎児への母性ＩｇＧの移動に関与する新生児レセプター（ＦｃＲｎ）を含む（Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976)、およびKim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)）。
「補体依存性細胞傷害」および「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的の溶解を意味する。補体活性化経路は、コグネイト抗原と複合体化された分子（たとえば、抗体）への補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）の結合により開始される。補体活性化を評価するために、たとえば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)に記載のＣＤＣアッセイを行いうる。
「親和性成熟」抗体は、改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改良をもたらす１つ以上の改変をその１つ以上のＣＤＲ中に有するものである。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対するナノモル親和性さらにはピコモル親和性を有するであろう。親和性成熟抗体は、当技術分野で公知の手順により産生される。Marks et al. Bio/Technology, 10:779-783 (1992)には、ＶＨおよびＶＬドメインシャフリングによる親和性成熟が記載されている。ＣＤＲおよび／またはフレームワークの残基のランダム突然変異誘発は、Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91 :3809-3813 (1994)、Schier et al. Gene, 169:147-155 (1995)、Yelton et al. J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)、Jackson et al., J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)、およびHawkins et al, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に記載されている。
たとえば「抗体の免疫特異的結合」で使用される「免疫特異的」という用語は、抗体の抗原結合部位とその抗体により認識される特異的抗原との間で起こる抗原特異的結合相互作用を意味する。
「サイトカイン」という用語は、細胞間メディエーターとして他の細胞に作用する１つの細胞集団により放出されるタンパク質に対する総称語である。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、たとえば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン、上皮小体ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、糖タンパク質ホルモン、たとえば、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）、肝臓増殖因子、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、腫瘍壊死因子−αおよび−β、ミュラー管抑制物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、神経成長因子、たとえば、ＮＧＦ−α、血小板増殖因子、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、たとえば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β、インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン、たとえば、インターフェロン−α、−β、および−γ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、たとえば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、腫瘍壊死因子、たとえば、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β、ならびにＬＩＦやｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。本明細書で用いられる場合、サイトカインという用語は、天然源からのまたは組換えＴ細胞培養物からのタンパク質、および天然配列サイトカインの生物学的活性等価体を包含する。
本明細書で用いられる「治療する」、「治療」、および「療法」という用語は、治癒的療法、疾患または病態の症状を軽減または改善する療法、予防的療法（prophylactic therapy; and preventative therapy）を意味する。
「治療上有効量」という用語は、哺乳動物において疾患または障害を治療するのに効果的な量の活性剤（たとえば、抗体もしくは抗体フラグメント）または薬剤を意味する。自己免疫性疾患または炎症性疾患の場合、治療上有効量の活性剤または薬剤は、活性化免疫細胞（たとえば、αβＴＣＲ＋Ｔ細胞）の数の低減、Ｔｒｅｇ細胞の数および／もしくは活性の増加、炎症性サイトカインもしくは免疫誘発性サイトカイン、たとえば、ＩＬ−２、インターフェロン−γ、または活性化Ｔ細胞からのＴＮＦ−αの産生の低減、活性化Ｔ細胞の増殖の阻害（すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止）、αβＴＣＲ＋Ｔ細胞の表面上のＣＤ３の発現を５０個／ｍｍ３未満、好ましくは２５個／ｍｍ３未満に低減、ならびに／または自己免疫性および／もしくは炎症性の障害に関連付けられる症状の１つ以上のある程度の軽減を行いうる。抗体または抗体活性剤または薬剤がαβＴＣＲ＋Ｔ細胞の活性化および増殖を予防しうる程度まで、抗炎症性および／または自己抗原寛容誘発性でありうる。自己免疫療法または炎症療法では、ｉｎ ｖｉｖｏ有効性は、たとえば、炎症性サイトカインまたは免疫誘発性サイトカイン、たとえば、ＩＬ−２、インターフェロン−γ、もしくは活性化Ｔ細胞からのＴＮＦ−αの量、およびαβＴＣＲ＋Ｔ細胞の表面上の機能性ＣＤ３分子の枯渇を評価することにより、測定可能である。移植組織拒絶の治療では、「治療上有効量」とは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、移植組織の細胞壊死、アロ反応性抗体の産生、または移植組織に反応するアロ反応性Ｔ細胞の産生の抑止、低減、休止、または予防により測定したときに、移植組織拒絶の抑止、低減、休止、または予防に効果的な量の活性剤（たとえば、抗αβＴＣＲ抗体または抗体フラグメント）、たとえば、ＴＯＬ１０１または二次的補助薬剤を意味する。
「ヒト抗マウス抗体反応」または「ＨＡＭＡ」という用語は、ヒト被験体へのネズミ抗体の投与後のネズミ抗体に対する免疫反応を意味する。典型的には、マウス抗体は、ヒト免疫系により異種として認識されるので、ヒト抗マウス抗体反応またはＨＡＭＡ反応を誘発する。ＨＡＭＡ反応は、マウス抗体の有効性を妨害し、レシピエントにおいて重篤有害症状を引き起こしうる。ＨＡＭＡ反応はまた、後続的に患者に投与されうる他のネズミベースの治療剤または診断剤の使用を妨害しうる。患者におけるＨＡＭＡの測定方法および／またはＨＡＭＡの診断方法は、当技術分野で周知である。たとえば、ImmuSTRIP（登録商標）HAMA IgG ELISA Test System（カタログ番号１００１６；IMMUNOMEDICS（登録商標）INC. 300 American Road, Morris Plains, NJ 07950）、またはＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）ＥＬＩＳＡ（ＩｇＧおよびＩｇＭ ＨＡＭＡ、カタログ番号４３−ＨＡＭＨＵ−Ｅ０１；ALPCO DIAGNOSTICS, 26-G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079）、またはGruber et. al., Cancer Res., 60: 1921-1926 (2000)を参照されたい。
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原および補助剤の複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により動物で産生される。他の選択肢として、抗原を動物のリンパ節に直接注射しうる（Kilpatrick et al., Hybridoma, 16:381-389, 1997参照）。改善された抗体反応は、二官能性剤または誘導体化剤、たとえば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、または当技術分野で公知の他の作用剤を用いて、関連抗原を免疫される種において免疫原性であるタンパク質、たとえば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイモグロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤にコンジュゲートすることにより取得しうる。
動物は、たとえば、１００μｇのタンパク質またはコンジュゲート（マウスの場合）と３体積のフロイント完全アジュバントとを組み合わせて、複数の部位に溶液を皮内注射することにより、αβＴＣＲタンパク質、そのフラグメント、それらの免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して免疫される。１ヶ月後、動物は、フロイント完全アジュバント中の元の量の１／５〜１／１０のペプチドまたはコンジュゲートを用いて、複数の部位に皮下注射することにより、ブースター免疫される。ブースター注射の７〜１４日後、動物から採血して、抗体価に関して血清をアッセイする。力価プラトーまで動物をブースター免疫する。好ましくは、動物は、同一の抗原のコンジュゲートを用いて、ただし、異なる架橋試薬によりコンジュゲートして、ブースター免疫される。コンジュゲートはまた、タンパク質融合として組換え細胞培養で作製可能である。また、免疫反応を促進するために、ミョウバンなどの凝集剤が好適に使用される。
モノクローナル抗体
本発明に係る抗体は、モノクローナル抗体でありうる。モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)により記載されるようなハイブリドーマ法を用いて調製しうる。ハイブリドーマ法では、典型的には、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を免疫剤で免疫して、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するまたは産生可能であるリンパ球を誘導する。他の選択肢として、リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化しうる。
免疫剤は、典型的には、αβＴＣＲまたはそのサブユニットを含むであろう。限定されるものではないが、例として、αβＴＣＲサブユニットとしては、α鎖、β鎖、または結合されたα−β鎖が含まれうる。いくつかの実施形態では、αβＴＣＲは、哺乳動物βＴＣＲでありうる。いくつかの実施形態では、動物を免疫するために使用されるαβＴＣＲは、配列番号１のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むヒトαβＴＣＲを含む。他の選択肢として、免疫剤は、配列番号１のフラグメントまたは一部を含みうる。一実施形態では、免疫剤は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。一実施形態では、免疫剤は、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２の一部のフラグメントを含むタンパク質を含む。一実施形態では、免疫剤は、配列番号１および２のアミノ酸配列により提供される２つのサブユニットのタンパク質を含む。他の選択肢として、免疫原は、所望の種のαβＴＣＲヘテロ二量体、たとえば、ヒトαβＴＣＲヘテロ二量体を含みうる。一実施形態では、免疫剤は、末梢血単核細胞を含有するヒトバフィーコート細胞の集団を含む。
一般的には、ヒト起源の細胞が望まれるのであれば、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、または非ヒト哺乳動物源が望まれるのであれば、脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が使用される。次いで、リンパ球は、ハイブリドーマ細胞を形成するために、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を用いて不死化細胞系と融合される（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103に開示されるモノクローナル抗体の例示的な産生方法を参照されたい）。不死化細胞系は、通常、トランスフォームされた哺乳動物細胞、特定的には、齧歯動物起源、ウシ起源、およびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞系が利用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは非融合不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する好適な培養培地中で培養しうる。たとえば、親細胞に酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）が欠如しているのであれば、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むであろう（「ＨＡＴ培地」）。これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損Ｔ細胞の増殖を予防する。いくつかの実施形態では、好ましい不死化細胞系は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル発現を支援し、かつＨＡＴ培地など培地に対して感受性があるものである。より好ましい不死化細胞系は、ネズミ骨髄腫系であり、たとえば、ソーク研究所細胞頒布センター（Salk Institute Cell Distribution Center）、San Diego, Calif.および米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）、Manassas, Va.から取得可能である。そのようなネズミ骨髄腫細胞系の例は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）である。また、ヒト骨髄腫細胞系およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系は、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている（たとえば、Kozbor, J. Immunol., 133 :3001 (1984)、Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63を参照されたい）。
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、αβＴＣＲを指向するモノクローナル抗体の存在に関してアッセイしうる。好ましくは、免疫沈降によりまたは放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）や酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにより、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を決定するか、他の選択肢として、モノクローナル抗体と共にＴ細胞の集団をインキュベートして、抗ＣＤ３抗体を用いて共染色することにより、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を決定することが可能である。そのような技術およびアッセイは、当技術分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、たとえば、Munson and Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980)のスキャチャード解析により決定可能である。
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、限界希釈手順によりクローンをサブクローニングし、標準的方法により増殖させうる（たとえば、Goding, supraを参照されたい）。この目的に合った好適な培養培地としては、たとえば、ダルベッコ改変イーグル培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。他の選択肢として、当技術分野で一般に使用されるかつ慣例的に作製される哺乳動物において、ｉｎ ｖｉｖｏで腹水としてハイブリドーマ細胞を増殖させうる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、たとえば、などプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーにより、培養培地または腹水から単離または精製しうる。
抗体の組換え産生
対象の免疫グロブリンのアミノ酸配列は、一般的には、直接的タンパク質配列決定により決定可能であり、好適なコードヌクレオチド配列は、ユニバーサルコドン表に従って設計可能である。しかしながら、ＩｇＭ抗体の場合、抗体タンパク質からの直接的タンパク質配列決定は、非常に困難である。ＴＯＬ１０１（ＩｇＭ抗体）のアミノ酸配列は、標準的タンパク質配列決定プロトコルではとくに取扱いが困難である。他の選択肢として、従来の手順を用いて（たとえば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いて）抗体のアミノ酸配列を確認するために、ＴＯＬ１０１を含めてモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、ハイブリドーマＴＯＬ１０１ＭＣＢを含めてハイブリドーマ細胞から単離および配列決定を行うことが可能である。配列決定は、一般的には、対象の遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部の単離を必要とするであろう。通常、これは、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡのクローニングを必要とする。クローニングは、標準的技術を用いて行われる（たとえば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press（参照により本明細書において援用される）を参照されたい）。たとえば、ｃＤＮＡライブラリーは、ポリＡ＋ｍＲＮＡ、好ましくは膜関連ｍＲＮＡの逆転写により、構築可能であり、ライブラリーは、ヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを用いてスクリーニング可能である。好ましい実施形態では、対象の免疫グロブリン遺伝子セグメント（たとえば、軽鎖可変セグメント）をコードするｃＤＮＡ（または全長ｃＤＮＡの一部）を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が使用される。増幅された配列は、任意の好適なベクター、たとえば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクター、またはファージディスプレイベクター中に容易にクローニング可能である。対象の免疫グロブリンポリペプチドの一部分の配列を決定可能であるかぎり、使用される特定のクローニング方法がそれほど重要でないことは、わかるであろう。
クローニングおよび配列決定に使用されるＲＮＡ源の１つは、トランスジェニックマウスからＢ細胞を取得してＢ細胞を不死細胞に融合することにより産生されたハイブリドーマである。ハイブリドーマを使用する利点は、容易にスクリーニング可能であることおよび対象のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択可能であることである。他の選択肢として、免疫化動物のＢ細胞（または全脾臓）からＲＮＡを単離することが可能である。ハイブリドーマ以外の供給源を使用する場合、特異的結合特性を有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列をスクリーニングすることが望ましいこともある。そのようなスクリーニング方法の１つは、ファージディスプレイ技術の使用である。ファージディスプレイは、たとえば、Dowerらの国際公開第９１／１７２７１号、McCaffertyらの国際公開第９２／０１０４７号、およびCaton and Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-6454 (1990)（それぞれ参照により本明細書において援用される）に記載されている。ファージディスプレイ技術を使用する一実施形態では、免疫化トランスジェニックマウスのｃＤＮＡ（たとえば、全脾臓ｃＤＮＡ）を単離し、ＰＣＲを用いて免疫グロブリンポリペプチド一部、たとえば、ＣＤＲ領域をコードするｃＤＮＡ配列を増幅し、そして増幅された配列をファージベクターに挿入する。対象のペプチド、たとえば、所望の結合特性を有する可変領域ペプチドをコードするｃＤＮＡは、パニングなどの標準的技術により同定される。次いで、増幅またはクローニングされた核酸の配列を決定する。典型的には、免疫グロブリンポリペプチドの全可変領域をコードする配列を決定するが、ときには、可変領域の一部のみ、たとえば、ＣＤＲコード部分の配列を決定することが必要なこともある。典型的には、配列決定部分は、少なくとも３０塩基長であろう。また、より多くの場合、可変領域の長さの少なくとも約１／３または少なくとも約１／２をコードする塩基の配列が決定されるであろう。配列決定は、ｃＤＮＡライブラリーから単離されたクローンで行いうるか、またはＰＣＲを使用する場合、増幅された配列をサブクローニングした後に行いうるか、または増幅されたセグメントの直接的ＰＣＲ配列決定により行いうる。配列決定は、標準的技術を用いて行われる（たとえば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press、およびSanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467（参照により本明細書において援用される）を参照されたい）。クローニングされた核酸の配列とヒト免疫グロブリン遺伝子およびｃＤＮＡの発表された配列とを比較することにより、当業者であれば、配列決定された領域に依存して、（ｉ）ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド（重鎖のアイソタイプを含む）の生殖系列セグメントの使用頻度、および（ｉｉ）Ｎ領域付加および体細胞突然変異プロセスから生じる配列を含めて重鎖および軽鎖の可変領域の配列を容易に決定することが可能である。免疫グロブリン遺伝子配列情報源の１つは、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）、国立医学図書館（National Library of Medicine）、国立衛生研究所（National Institutes of Health）、Bethesda, Mdである。
単離後、ＤＮＡを発現制御配列に機能可能に結合しうるか、または発現ベクター中に配置しうる。次いで、そうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない細菌宿主細胞、真核宿主細胞、および／または哺乳動物宿主細胞、たとえば、Ｅ．コリ（E.coli）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成を誘導する。
発現制御配列とは、特定の宿主生物において機能可能に結合されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に好適な制御配列としては、たとえば、プロモーター、任意選択でオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。原核宿主細胞、真核宿主細胞、および／または哺乳動物宿主細胞で抗体を発現するのに好適な発現制御配列は、当技術分野で周知である。
他の核酸配列と機能的関係に配置された場合、核酸は、機能可能に結合されている。たとえば、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現するのであれば、プレ配列もしくは分泌リーダーのＤＮＡがポリペプチドのＤＮＡに機能可能に結合され、配列の転写に影響を及ぼすのであれば、プロモーターもしくはエンハンサーがコード配列に機能可能に結合され、または翻訳を促進するように配置するのであれば、リボソーム結合部位がコード配列に機能可能に結合される。一般的には、機能可能に結合されるとは、結合されるＤＮＡ配列が隣接していること、分泌リーダーの場合、隣接しかつリーディングフェーズ内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接していなくてもよい。結合は、都合のよい制限部位でライゲーションにより達成可能である。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを慣例に従って使用することが可能である。
「細胞系」および「細胞培養物」は、多くの場合、同義的に使用され、そのような表記はすべて、後代を含む。トランスフォーマントおよびトランスフォーム細胞としては、移入回数に関係なく、一次対象細胞およびそれ由来の培養物が含まれる。また、意図的または偶発的な突然変異に起因して、後代はすべて、ＤＮＡ含有率が正確に同一であるとはかぎらないことを理解されたい。最初にトランスフォームされた細胞でスクリーニングしたときと同一の機能または生物学的活性を有する突然変異後代が含まれる。
また、任意選択で宿主細胞により認識される制御配列に機能可能に結合された、特異的抗体をコードする単離された核酸、この核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにこの核酸が発現されるように宿主細胞を培養することと、任意選択で、宿主細胞培養物または培養培地から抗体を回収していることと、を含む、抗体を産生するための組換え技術が提供される。
さまざまなベクターが当技術分野で公知である。ベクター成分は、次のもの、すなわち、シグナル配列（たとえば、抗体の分泌の誘導が可能なもの）、複製起点、１つ以上の選択マーカー遺伝子（たとえば、抗生物質耐性または他の薬剤耐性の付与、栄養要求性欠損の補完、または培地から取得できない重要栄養素の供給が可能なもの）、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終止配列（それらはすべて、当技術分野で周知である）の１つ以上を含みうる。
好適な宿主細胞としては、原核生物細胞、酵母細胞、または高等真核生物細胞が含まれる。好適な原核生物としては、真性細菌、たとえば、グラム陰性またはグラム陽性の生物、たとえば、腸内細菌科（Enterohacteriaceae）、たとえば、エシェリキア属（Escherichia）、たとえば、Ｅ．コリ（E. coli）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、プロテウス属（Proteus）、サルモネラ属（Salmonella）、たとえば、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、セラチア属（Serratia）、たとえば、セラチア・マルセッサンス（Serratia marcescans）、およびシゲラ属（Shigella）、さらには桿菌、たとえば、Ｂ．サブチリス（B.subtilis）およびＢ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、シュードモナス属（Pseudomonas）、およびストレプトマイセス属（Streptomyces）が含まれる。原核生物に加えて、真核微生物、たとえば、糸状菌または酵母は、抗体コードベクターに好適なクローニング宿主または発現宿主である。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）または通常のパン酵母は、下等真核宿主微生物のなかで最も一般的に使用される。しかしながら、いくつかの他の属、種、および株、たとえば、ピキア属（Pichia）、たとえば、Ｐ．パストリス（P. pastoris）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）、ヤロウイア属（Yarrowia）、カンジダ属（Candida）、トリコデルマ・リーシア（Trichoderma reesia）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、シュワンニオマイセス属（Schwanniomyces）、たとえば、シュワンニオマイセス・オシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）、ならびに糸状菌、たとえば、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペニシリウム属（Penicillium）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）、およびアスペルギルス属（Aspergillus）宿主、たとえば、Ａ．ニデュランス（A. nidulans）およびＡ．ニガー（A. niger）は、一般に利用可能である。
グリコシル化抗体を発現させるのに好適な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株および変異体、ならびにスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（イモムシ・ケムシ）、アエデス・アエギプティ（Aedes aegypti）（カ）、アエデス・アルボピクタス（Aedes albopictus）（カ）、ドロソフィラ・メラノガステル（Drosophila melanogaster）（ミバエ）、ボンビクス・モリ（Bombyx mori）などの宿主の対応する許容昆虫宿主細胞が、同定されてきた。そのような細胞をトランスフェクトするためのさまざまなウイルス株、たとえば、アウトグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）ＮＰＶのＬ−Ｉ変異体およびボンビクス・モリ（Bombyx mori）ＮＰＶのＢｍ−５株が、公的に利用可能である。
しかしながら、関心は、脊椎動物細胞で最も大きくなってきており、培養（組織培養）下の脊椎動物細胞の増殖は、慣例になってきた。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯＫＩ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）およびチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)）を含む）、ＳＶ４０によりトランスフォームされたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胚性腎臓系（２９３または懸濁培養増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞）［Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)］、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)）、サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（ＷＩ３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）、ヒト肝癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、トリ細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)）、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞である。
宿主細胞は、さまざまな培地中で培養可能である。市販の培地、たとえば、ハムＦ１０（Sigma）、最少必須培地（（ＭＥＭ）、（Sigma）、ＲＰＭＩ−１６４０（Sigma）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Sigma）は、宿主細胞の培養に好適である。それに加えて、Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979)、Ｂarnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980)、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、または同第５，１２２，４６９号、国際公開第９０１０３４３０号、国際公開第８７／００１９５号、または米国再発行特許第３０，９８５号に記載の培地のいずれかを、宿主細胞用の培養培地として使用することが可能である。好ましくは、培地は動物産物を含まない。より好ましくは、培地はタンパク質を含まない。例示的な培地としては、Gibco CDハイブリドーマ、SAFC EX CELL SP/20、SAFC EX CELL 620-HSF、Cell Grow TurboDoma、およびHyclone HyQ CDM4Mabが含まれる。これらの培地はいずれも、所要により、ホルモンおよび／または他の増殖因子（たとえば、インスリン、トランスフェリン、または表皮増殖因子）、塩（たとえば、塩化ナトリウム、カルシウム塩、マグネシウム塩、およびリン酸塩）、緩衝液（たとえば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（たとえば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（たとえば、Gentamycin（商標）薬剤）、微量元素（マイクロモル領域の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは等価エネルギー源を追加可能である。好ましくは、培地は、ＬグルタミンまたはＬアラニル−Ｌグルタミンを追加しうる。また、任意の他の必要なサプリメントを当業者に公知の適切な濃度で組み込みうる。培養条件、たとえば、温度、ｐＨなどは、発現のために選択される宿主細胞ですでに使用されているものであり、当業者には明らかであろう。
いくつかの実施形態では、細胞培養および採取プロセスは、以下の５工程、すなわち、
１． 解凍および増殖
２． 振盪フラスコ増殖
３． ＷＡＶＥ増殖
４． ３００Ｌバイオリアクター産生
５． 採取／清澄化
を含む。
抗体組成物は、たとえば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、陽イオン交換もしくは陰イオン交換クロマトグラフィー、または好ましくはアフィニティークロマトグラフィー（対象の抗原または親和性リガンドとしてプロテインＡもしくはプロテインＧを使用）を用いて、精製可能である。ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために、プロテインＡを使用することが可能である（Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)）。すべてのマウスアイソタイプに対しておよびヒトγ３に対して、プロテインＧが推奨される（Guss et al., 20 EMBO J. 5: 15671575 (1986)）。親和性リガンドが装着されるマトリックスは、多くの場合ほとんどがアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御細孔ガラスやポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成可能なよりも高流量かつ短時間処理を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABX.TM．樹脂（J. T. Baker, Phillipsburg, 25 NJ.）は、精製に有用である。また、タンパク質精製のための他の技術、たとえば、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫安沈殿は、特異的結合剤または回収抗体に依存して、利用可能である。
いくつかの実施形態では、精製プロセスは、以下の６工程、すなわち、
１． ｐＨ調整およびToypearl SP-650Mクロマトグラフィー
２． Toyopearl Super Q-650Mクロマトグラフィー
３． Toyopearl CM-650Mクロマトグラフィー
４． Pianova 35Nナノ濾過
５． Toypearl phenyl-650Mクロマトグラフィー
６． 最終接線流濾過（ＴＦＦ）
を含む。
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、本明細書では同義的に用いられ、特定の抗体により認識可能であるかつ特異的に結合される抗原の部分を意味する。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、連続アミノ酸およびタンパク質の三次フォールディングにより並置された非連続アミノ酸の両方から形成可能である。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、タンパク質変性の際に保持されるが、三次フォールディングにより形成されるエピトープは、典型的には、タンパク質変性の際に失われる。エピトープは、ユニークな空間コンフォメーションで、典型的には少なくとも３〜５個、通常は少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含む。
また、キメラ抗体またはハイブリッド抗体は、架橋剤が関与するものを含めて、合成タンパク質化学の公知の方法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製しうる。たとえば、ジスルフィド交換反応を用いてまたはチオエーテル結合を形成することにより、イムノトキシンを構築しうる。この目的に好適な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチリミデートが含まれる。
ヒト化抗体
一般的には、ヒト化抗体は、非ヒト源から導入された１個以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「輸入」残基と参照され、典型的には、「輸入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、本質的には、ヒト抗体の対応する配列を齧歯動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置き換えることにより、Winterらの方法［Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986)、Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)］に従って、実施可能である。
したがって、そのような「ヒト化」抗体は、インタクトヒト可変ドメインよりも実質的に小さい部分が非ヒト種の対応する配列により置換されたキメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基が齧歯動物抗体中の類似部位の残基により置換されたヒト抗体である。
抗原に対する高親和性および他の有利な生物学的性質を保持しながら抗体がヒト化されることは、重要である。この目標を達成するために、好ましい方法によれば、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いて親配列および種々の概念上のヒト化産物の分析プロセスにより調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者の熟知するところである。選択された候補免疫グロブリン配列の予想三次元コンフォメーション構造を例示および表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析（すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を及ぼす残基の分析）が可能になる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大などの所望の抗体特性が達成されるように、コンセンサスからＦＲ残基を選択し組み合わせて、配列を輸入することが可能である。一般的には、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に直接的かつ最も実質的に関与する。
ヒト抗体
ヒトモノクローナル抗体はヒト抗体ハイブリドーマ法により作製可能である。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系は、たとえば、Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984)、およびBrodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)に記載されている。
いくつかの実施形態では、αβＴＣＲまたはそのフラグメントによる免疫化の際、内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体のレパートリーを産生可能なトランスジェニック動物（たとえば、マウス）を利用することが可能である。たとえば、キメラマウスおよび生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失は、内因性抗体産生の完全阻害をもたらすと記載されている。そのような生殖系列突然変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジによるヒト抗体の産生をもたらすであろう。たとえば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255 (1993)、Jakobovits et al., Nature 362, 255-258 (1993)を参照されたい。Mendezら（Nature Genetics 15 : 146-156 [1997)）は、技術をさらに改善し、抗原でチャレンジした時に高親和性完全ヒト抗体を産生する「Xenomouse II」と称されるトランスジェニックマウス系を作製した。これは、以上に記載の内因性（ＪＨ）セグメント中に欠失を有するマウスへのメガ塩基のヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の生殖系列組込みにより達成された。Xenomouse IIは、約６６個のＶＨ遺伝子、完全ＤＨおよびＪＨ領域、ならびに３個の異なる定常領域（μ、δ、χ）を含有する１，０２０ｋｂのヒト重鎖遺伝子座を保有し、さらには、３２個のＶκ遺伝子、Ｊκセグメント、およびＣκ遺伝子を含有する８００ｋｂのヒトκ遺伝子座を保有する。これらのマウスで産生された抗体は、遺伝子再構成、集合、およびレパートリーを含めて、あらゆる点でヒトに見られるものに非常によく類似している。ヒト抗体は、ネズミ遺伝子座での遺伝子再構成を予防する内因性ＪＨセグメントの欠失に起因して、内因性抗体よりも優先的に発現される。
他の選択肢として、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト抗体および抗体フラグメントを産生するために、ファージディスプレイ技術（McCafferty et al., Nature 348, 552-553 (1990]）を使用することが可能である。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれか、たとえば、Ｍ１３またはｆｄ中にインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能性抗体フラグメントとして提示される。糸状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能性に基づく選択はまた、それらの性質を呈する抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。したがって、ファージは、Ｂ細胞の性質のうちのいくつかを模倣する。ファージディスプレイは、さまざまな方式で実施可能である。それらのレビューに関しては、たとえば、Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993)を参照されたい。いくつかのＶ遺伝子セグメントの供給源は、ファージディスプレイに使用することが可能である。Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さいランダムコンビナトリアルライブラリーから多様な一連の抗オキサゾロン抗体を単離した。Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991)、またはGriffith et al., EMBO J. 12, 725-734 (1993)に記載の技術を本質的に従って、非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーを構築可することが可能であり、また多様な一連の抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を単離することが可能である。自然免疫反応では、抗体遺伝子は、高速度で突然変異を蓄積する（体細胞超突然変異）。導入された変化のいくつかは、より高い親和性を付与するであろう。また、高親和性表面免疫グロブリンを提示するＢ細胞は、後続の抗原のチャレンジの際に優先的に複製され分化される。この自然過程は、「鎖シャフリング」（Marks et al., Bio/Technol. 10, 779-783 [1992]）として知られる技術を利用することにより模倣可能である。この方法では、ファージディスプレイにより取得された「一次」ヒト抗体の親和性は、重鎖および軽鎖のＶ領域遺伝子を非免疫化ドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然に存在する変異体（レパートリー）のレパートリーで逐次置き換えることにより改善可能である。この技術は、ｎＭ領域の親和性を有する抗体および抗体フラグメントの産生を可能にする。非常に大きいファージ抗体レパートリーを作製する戦略は、Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993)に記載されている。また、齧歯動物抗体からヒト抗体を誘導するために、遺伝子シャフリングを使用することも可能である。この場合、ヒト抗体は、出発齧歯動物抗体と類似の親和性および特異性を有する。「エピトープインプリンティング」としても参照されるこの方法によれば、ファージディスプレイ技術により取得された齧歯動物抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子は、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置き換えられて、齧歯動物ヒトキメラを形成する。抗原の選択は、機能性抗原結合部位を回復可能なヒト可変部の単離をもたらす。すなわち、エピトープは、パートナーの選択を支配（インプリント）する。残りの齧歯動物Ｖドメインを置き換えるようにプロセスを繰り返した場合、ヒト抗体が取得される（１９９３年４月１日公開のＰＣＴ出願国際公開第９３／０６２１３号を参照されたい）。ＣＤＲ移植による齧歯動物抗体の伝統的ヒト化とは異なり、この技術は、齧歯動物起源のフレームワーク残基またはＣＤＲ残基を有していない完全ヒト抗体を提供する。
以下で詳細に考察されるように、本発明に係る抗体は、任意選択、単量体抗体、二量体抗体、さらには多価形態の抗体を含みうる。当業者であれば、当技術分野で公知の技術により、かつ本明細書に開示される抗αβＴＣＲ抗体を用いて、そのような二量体または多価形態を構築しうる。また、一価抗体の調製方法も、当技術分野で周知である。たとえば、一方法は、免疫グロブリンの軽鎖および修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は、一般的には、重鎖架橋を予防すべくＦｃ領域中の任意の点がトランケートされる。他の選択肢として、関連システイン残基は、他のアミノ酸残基で置換されるか、または架橋を予防すべく欠失される。
ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合で連結された抗体で構成される。そのような抗体は、たとえば、免疫系細胞が望ましくない細胞を標的とすべく（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染を治療すべく（ＰＣＴ出願公開番号国際公開第９１／００３６０号および国際公開第９２／２００３７３号、欧州特許第０３０８９号）、提案されてきた。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の都合のよい架橋方法を用いて作製しうる。好適な架橋剤は、当技術分野で周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号にはいくつかの架橋技術と共に開示されている。
抗体フラグメント
特定の実施形態では、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体（ネズミ抗体、ヒト抗体、およびヒト化抗体、ならびに抗体変異体を含む）は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントの産生のために、種々の技術が開発されてきた。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクト抗体のタンパク質分解消化を介して誘導されてきた（たとえば、Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992)およびBrennan et al., Science 229:81 (1985)を参照されたい）。しかしながら、これらのフラグメントは、現在、組換え宿主細胞により直接に産生することが可能である。たとえば、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、Ｅ．コリ（E.coli）から直接回収可能であり、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを形成すべく化学結合可能である（Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)）。一実施形態では、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、当技術分野で公知の技術を用いてＥ．コリ（E.coli）から産生される。他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆ（ａｂ’）２分子の集合を促進すべくロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。他の手法によれば、Ｆｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接単離可能である。抗体フラグメントを産生するためのさまざまな技術は、当業者には明らかであろう。たとえば、パパインを用いて消化を行うことが可能である。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日公開の国際公開第９４／２９３４８号および米国特許第４，３４２，５６６号に記載されている。抗体のパパイン消化は、典型的には、それぞれ一つの抗原結合部位と残りのＦｃフラグメントとを有するＦａｂフラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントを産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有するかつ依然として抗原の架橋が可能であるＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成する。
また、抗体消化で産生されたＦａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に少数の残基が追加されている点でＦａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’に対する表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、最初に、それらの間にヒンジシステインを有する対をなすＦａｂ’フラグメントとして産生された。また、抗体フラグメントの他の化学結合も知られている。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（たとえば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いて）、容易に単離および配列決定が行われる。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。単離後、ＤＮＡを発現ベクター中に配置しうる。次いで、そうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、たとえば、Ｅ．コリ（E.coli）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成を達成する。
いくつかの実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、たとえば、McCafferty et al., Nature, 348: 552554 (1990)に記載の技術を用いて作製された抗体ファージライブラリーから単離される。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)には、それぞれ、ファージライブラリーを用いたネズミ抗体およびヒト抗体の単離が記載されている。後続の出版物には、鎖シャフリング（Marks et al, BioTechnology, 10: 779-783 (1992)）さらには非常に大きいファージライブラリーを構築するための戦略としてコンビナトリアル感染およびｉｎ ｖｉｖｏ組換え（たとえば、Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21 : 2265-2266 (1993)）による高親和性（ｎＭ領域）ヒト抗体の産生が記載されている。したがって、これらの技術および類似の技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的モノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する利用可能な代替手段である。
また、たとえば、相同的ネズミ配列の代わりのヒト重質および軽鎖定常ドメインのコード配列を用いることにより（たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号、およびMorrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984)（両方とも参照により本明細書において援用される））、または非免疫グロブリンポリペプチドに対するコード配列の全部または一部分を免疫グロブリンコード配列に共有結合で連結することにより、ＤＮＡを修飾しうる。
典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに対して置換されるか、または抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有する他の抗原結合部位と、を含むキメラ二価抗体を形成すべく、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに対して置換される。
抗体のアミノ酸配列変異体
抗αβＴＣＲ抗体のアミノ酸配列変異体は、抗αβＴＣＲ抗体ＤＮＡ中に適切なヌクレオチド変化を導入することにより、またはペプチド合成により、調製される。そのような変異体は、たとえば、本明細書の実施例の抗αβＴＣＲ抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはその中への挿入、および／またはその置換を含む。最終構築物が所望の特性を有するかぎり、最終構築物に達するように、欠失、挿入、および置換の任意の組合せが行われる。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数や位置の変化などのヒト化抗αβＴＣＲ抗体または変異抗αβＴＣＲ抗体の翻訳後過程で改変しうる。
突然変異誘発に対する好ましい位置である抗αβＴＣＲ抗体の特定の残基または部分の同定に有用な方法は、Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989)に記載されるように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この場合、残基または一群の標的残基が同定され（たとえば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ｇｌｕなどの荷電残基）、アミノ酸とＤＲ４抗原との相互作用に影響を及ぼすように中性または負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）により置き換えられる。次いで、さらなるまたは他の変異体を置換部位にまたは置換のために導入することにより、置換に対する機能感受性を示すアミノ酸位置を精密化する。したがって、アミノ酸配列変化を導入する部位は、あらかじめ決定されるが、突然変異自体の性質は、あらかじめ決定する必要がない。たとえば、所与の部位での突然変異の性能を分析するためには、標的コドンまたは領域でａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発を行い、発現された抗αβＴＣＲ抗体変異体を所望の活性に関してスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００残基以上を含有するポリペプチドまでの長さ範囲にわたるアミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合さらには単一もしくは複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗αβＴＣＲ抗体またはエピトープタグに融合された抗体が含まれる。抗αβＴＣＲ抗体分子の他の挿入変異体としては、抗体の血清中半減期を増加させる酵素またはポリペプチドの抗αβＴＣＲ抗体のＮ末端またはＣ末端への融合が含まれる。
他のタイプの変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗αβＴＣＲ抗体分子中に除去された少なくとも１つのアミノ酸残基とその場所に挿入された異なる残基とを有する。置換突然変異誘発の最も興味深い部位としては、超可変領域が含まれるが、ＦＲ改変も考えられる。保存的置換は、以下に示される。そのような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、より実質的な置換変化を導入して産物をスクリーニングしうる。
抗体の生物学的性質の実質的修飾は、（ａ）置換領域内のポリペプチド骨格の構造、たとえば、シートもしくはヘリックスのコンフォメーション、（ｂ）標的部位の分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩の維持に及ぼす効果が有意に異なる置換を選択することにより達成される。天然に存在する残基は、共通する側鎖の性質に基づいてグループに分類される。
次の８つのグループは、それぞれ、互いに保存的置換とみなされるアミノ酸を含有する。１）アラニン（Ａ）およびグリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、およびバリン（ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）、ならびに８）システイン（Ｃ）およびメチオニン（Ｍ）（たとえば、Creighton, Proteins, W.H. Freeman and Co., New York (1984)を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。たとえば、保存的置換を選択する例示的ガイドラインの１つとしては、次のものが含まれる（元の残基およびそれに続く例示的置換）。ａｌａ／ｇｌｙまたはｓｅｒ、ａｒｇ／ｌｙｓ、ａｓｎ／ｇｌｎまたはｈｉｓ、ａｓｐ／ｇｌｕ、ｃｙｓ／ｓｅｒ、ｇｌｎ／ａｓｎ、ｇｌｙ／ａｓｐ、ｇｌｙ／ａｌａまたはｐｒｏ、ｈｉｓ／ａｓｎまたはｇｉｎ、ｉｌｅ／ｌｅｕまたはｖａｌ、ｌｅｕ／ｉｌｅまたはｖａｌ、ｌｙｓ／ａｒｇまたはｇｉｎまたはｇｌｕ、ｍｅｔ／ｌｅｕまたはｔｙｒまたはｉｌｅ、ｐｈｅ／ｍｅｔまたはｌｅｕまたはｔｙｒ、ｓｅｒ／ｔｈｒ、ｔｈｒ／ｓｅｒ、ｔｒｐ／ｔｙｒ、ｔｙｒ／ｔｒｐまたはｐｈｅ、ｖａｌ／ｉｌｅまたはｌｅｕ。他の選択肢の例示的ガイドラインでは、互いに保存的置換であるアミノ酸をそれぞれ含有する次の６つのグループが使用される。１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｉ）、ヒスチジン（ｈ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、ならびに６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、（また、たとえば、Creighton, Proteins, W.H. Freeman and Company (1984)、Schultz and Schimer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag (1979)も参照されたい）。当業者であれば、以上に規定した置換のみが可能な保存的置換ではないことは、わかるであろう。たとえば、いくつかの目的では、正または負であるかにかかわらず、すべての荷電アミノ酸を互いに保存的置換であると見なしうる。それに加えて、コード配列中の単一のアミノ酸または低パーセントのアミノ酸が改変、付加、または欠失された個別の置換、欠失、または付加もまた、「保存的修飾変異」であると見なしうる。
非保存的置換では、これらクラスの１つのメンバーを他のクラスのものと交換することが必要であろう。ヒト化抗αβＴＣＲ抗体または変異抗αβＴＣＲ抗体の適正コンフォメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基もまた、分子の酸化安定性の改善および異常架橋の予防のために、一般的にはセリンで置換しうる。反対に、その安定性を改善するために、システイン結合を抗体に付加しうる（とくに、抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）。
とくに好ましいタイプの置換変異体は、親抗体（たとえば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を含む。一般的には、さらなる改善のために選択された得られた変異体は、産生源の親抗体を基準にして改善された生物学的性質を有するであろう。そのような置換変異体を産生するための簡便法は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟である。簡潔に述べると、いくつかの超可変領域部位（たとえば、６〜７部位）は、各部位ですべての可能なアミノ置換を生成するように突然変異される。こうして産生された抗体変異体は、各粒子内にパッケージ化されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合体としての繊維状ファージ粒子から一価形態で提示される。次いで、ファージディスプレイ変異体は、本明細書に開示された生物学的活性（たとえば、結合親和性）に関してスクリーニングされる。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を行って、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定することが可能である。他の選択肢としてまたは追加として、抗体とヒトＤＲ４との間の接点を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有益なこともありうる。そのような接触残基および近接残基は、本明細書に詳述された技術による置換の候補である。そのような変異体を産生した後、一群の変異体を本明細書に記載のスクリーニングに付して、さらなる改善のために、１つ以上の関連アッセイにより優れた性質を有する抗体を選択しうる。
抗体のグリコシル化変異体
抗体は、その定常領域内の保存位置でグリコシル化される（Jefferis and Lund, Chem. Immunol. 65:111-128 [1997)、Wright and Morrison, TibTECH 15:26-32 [1997]）。免疫グロブリンのオリゴサッカリド側鎖は、タンパク質の機能（Boyd et al., Mol. Immunol. 32: 1311-1318 [1996)、Wittwe and Howard, Biochem. 29:4175-4180 [1990]）ならびに糖タンパク質のコンフォメーションおよび提示三次元表面に影響を及ぼしうる糖タンパク質の部分間の分子内相互作用（Hefferis and Lund, supra、Wyss and Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416 [1996]）に影響を及ぼす。オリゴサッカリドはまた、特異的認識構造に基づいて所与の糖タンパク質が特定の分子を標的とするように機能しうる。たとえば、アガラクトシル化ＩｇＧでは、ＣＨ２内空間および末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基からのオリゴサッカリド部分の「フリップ」は、マンノース結合性タンパク質に結合するように利用可能になると報告された（Malhotra et al., Nature Med. 1 :237-243 (1995]）。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で産生されるＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（ヒトリンパ球のＣＤｗ５２抗原を認識する組換えヒト化ネズミモノクローナルＩｇＧ１抗体）からのオリゴサッカリドのグリコペプチダーゼによる除去は、補体媒介性溶解の完全低減をもたらし（ＣＭＣＬ）（Boyd et al., Mol. Immunol. 32:1311-1318 [1996]）、一方、ノイラミニダーゼを用いたシアル酸残基の選択的除去は、ＤＭＣＬ低下をもたらさなかった。抗体のグリコシル化もまた、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼすと報告された。とくに、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）のテトラサイクリン調節発現を有するＣＨＯ細胞では、バイセクトＧｌｃＮＡｃのグリコシルトランスフェラーゼ触媒形成が改善されたＡＤＣＣ活性を有すると報告された（Umana et al., Mature Biotech. 17: 176-180 [1999]）。
抗体のグリコシル化変異体は、抗体のグリコシル化パターンが改変された変異体である。改変とは、抗体中に見いだされる１つ以上の炭水化物部分を欠失すること、１つ以上の炭水化物部分を抗体に付加すること、グリコシル化の組成（グリコシル化パターン）、グリコシル化の程度などを変化させることを意味する。グリコシル化変異体は、たとえば、抗体をコードする核酸配列中の１つ以上のグリコシル化部位の除去、変化、および／または付加、ならびに原核細胞発現系での核酸の発現および翻訳により調製されうる。
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合またはＯ結合である。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の装着を意味する。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素装着のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を形成する。Ｏ結合グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの糖Ｎ−アセイルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つの装着を意味するが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用しうる。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、以上に記載のトリペプチド配列の１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することにより、都合よく達成される（Ｎ結合グリコシル化部位に対して）。改変はまた、元の抗体の配列に対する１つ以上のセリン残基またはトレオニン残基の付加または置換により、行われうる（Ｏ結合グリコシル化部位に対して）。
抗αβＴＣＲ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知のさまざまな方法により調製される。これらの方法としては、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）またはすでに調製された変異型または非変異体型の抗αβＴＣＲ抗体のオリゴヌクレオチド媒介（または部位指向）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発による調製が含まれるが、これらに限定されるものではない。
抗体のグリコシル化（グリコシル化パターンを含む）はまた、下に位置するヌクレオチド配列を改変することなく改変しうる。グリコシル化は、主に、抗体を発現するために用いられる宿主細胞に依存する。治療剤としての組換え糖タンパク質、たとえば、抗体の発現に使用される細胞タイプが天然細胞であることは、ほとんどないので、抗体のグリコシル化パターンの有意な変化は予想可能である（たとえば、Hse et al., J. Biol. Chem. 272:9062-9070 [1997］を参照された）。オリゴサッカリド産生に関与する特定の酵素の導入または過剰発現を含む特定の宿主生物で達成されるグリコシル化パターンを改変するために、種々の方法が提案されてきた（米国特許第５，０４７，３３５号、同第５，５１０，２６１号、および同第５．２７８，２９９号）。グリコシル化または特定のタイプのグリコシル化は、たとえば、エンドグリコシダーゼＨ（エンドＨ）を用いて、糖タンパク質から酵素的に除去可能である。それに加えて、組換え宿主細胞は、遺伝子工学操作が可能である。たとえば、特定のタイプのポリサッカリドのプロセシングで欠損を生じさせることが可能である。これらのおよび類似の技術は、当技術分野で周知である。抗体のグリコシル化構造は、レクチンクロマトグラフィー、ＮＭＲ、質量分析、ＨＰＬＣ、ＧＰＣ、モノサッカリド組成分析、逐次酵素消化、およびＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて電荷に基づいてオリゴサッカリドを分離する）を含めて、従来の炭水化物分析技術により、容易に分析可能である。分析目的のオリゴサッカリドの放出方法も知られており、限定されるものではないが、酵素処理（一般的には、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ／エンド−α−ガラクトシダーゼを用いて行われる）、過酷なアルカリ性環境を用いた脱離による主にＯ結合構造の放出、無水ヒドラジンを用いてＮ結合およびＯ結合オリゴサッカリドの両方を放出する化学法が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体は、グリコシル化可能である。本発明のいくつかの実施形態では、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体は、非グリコシル化可能である。いくつかの実施形態では、本発明に係る抗体または抗原結合フラグメントは、ハイブリドーマＴＯＬ１０１ＭＣＢ（ＴＯＬ１０１）から産生される抗体と同一のグリコシル化パターンを有するまたは有するように工学操作された、ヒトαβＴＣＲに結合する抗体または抗体フラグメントを含む。「同一のグリコシル化パターン」または「等価なグリコシル化パターン」とは、本発明に係る抗体の全体的グリコシル化シグネチャーまたはＮ結合もしくはＯ結合オリゴサッカリド組成が、本明細書に開示される伝統技術を用いて測定したときに、ハイブリドーマＴＯＬ１０１ＭＣＢ（ＴＯＬ１０１）から産生される抗体のグリコシル化シグネチャーまたはＮ結合もしくはＯ結合オリゴサッカリド組成に類似して、本明細書に記載のＴＯＬ１０１の改善された機能性または臨床性の少なくともの１つを有する本発明に係る抗体をもたらすように、本発明に係る抗体が、ハイブリドーマＴＯＬ１０１ＭＣＢ（ＴＯＬ１０１）から産生される抗体と同一の数および／またはタイプのグリコシル化部位を有することが意図される。それに加えて、本発明に係る抗体または抗原結合フラグメントは、ハイブリドーマＴＯＬ１０１ＭＣＢ（ＴＯＬ１０１）により産生される抗体と等価なまたは対応する残基の位置でグリコシル化しうる。「等価なまたは対応する残基」とは、公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて２つの抗体配列をアライメントし、グリコシル化残基の残基番号をKabatに従って同定したときに、本発明に係る抗体または抗原結合フラグメントが、本明細書に記載の先行技術よりも改善されたＴＯＬ１０１の機能性または臨床性の少なくとも１つを有するように、本発明に係る抗体または抗原結合フラグメントが、ハイブリドーマＴＯＬ１０１ＭＣＢ（ＴＯＬ１０１）により産生される抗体中のグリコシル化残基のうち３５個以内、３０個以内、２５個以内、２０個以内、１５個以内、１０個以内、または５個以内のアミノ酸残基である残基位置でグリコシル化されるものと考えられる。好適なコンピューターソフトウェアの例としては、「Staden Package」、「DNA Star」、「MacVector」、GCG「Wisconsin Package」（Genetics Computer Group, Madison, Wis.）、および「NCBI toolbox」（国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information））を含むプログラムが含まれる。また、本明細書で考察されるように、抗体のグリコシル化の同定、比較、改変、および／または工学操作の方法は、当技術分野で周知である。
例示的な抗体
本明細書に開示された本発明は、いくつかの例示的実施形態を有する。本発明のさまざまな典型的実施形態は、以下に記載される。以下の実施形態は、単に例示を目的として提供したものにすぎず、本発明の範囲をなんら限定しようとするものではない。本発明に係る方法、アッセイ、および組成物の特定の実施形態では、抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントは、αβＴＣＲに結合するかつハイブリドーマＴＯＬ１０１ＭＣＢにより産生される単離されたマウスＩｇＭモノクローナル抗体であるＴＯＬ１０１抗体または抗体フラグメントを含む。
抗αβＴＣＲモノクローナル抗体の性質
種々の実施形態では、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体は、哺乳動物αβＴＣＲ（たとえばヒトαβＴＣＲ）に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体は、γδＴＣＲを含まないＣＤ３＋Ｔ細胞に結合する。さらに、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体は、ＣＤ１４、ＣＤ１６、Ｂ２２０、ＣＤ１９などのマーカーを発現する細胞に結合しないことから、αβＴ細胞に対する特異性がさらに強調される。たとえば、ＴＯＬ１０１の均一でロバストで再現性のある抗αβＴＣＲ抗体結合は、１３０名の臨床患者および２０名の健常志願者さらには通常の不死化Ｔ細胞系で観察された。本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体は、αβＴ細胞の全集団に均一に結合するので、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体は、αβＴＣＲの定常領域に結合すると考えられる。
Ｔ１０Ｂ９．１Ａ−３１（Ｔ１０Ｂ９）やＭＥＤＩ−５００などの当技術分野で公知の他の抗αβＴＣＲ抗体は、Ｔリンパ球レセプター複合体のアルファベータ（αβ）ヘテロ二量体を指向する免疫グロブリンＭκネズミモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。Ｔ１０Ｂ９は、カタログ番号５６１６７４、５５５５４８、５５５５５４７、５６１６７３としてBD Pharminigen（商標）（San Diego, CA, USA）から市販されている。Ｔ１０Ｂ９は、サイモグロブリンおよびＣａｍｐａｔｈ−１Ｈで見られる長期間枯渇と異なり、比較的短い作用持続期間を有し、Ｔ細胞を１０〜１４日間枯渇させる。Ｔ１０Ｂ９やＭＥＤＩ−５００などの抗αβＴＣＲ抗体は、低濃度で可溶形態で非マイトジェンである（すなわち、細胞増殖を引き起こさない）。しかしながら、高濃度の可溶形態の抗体または低濃度もしくは高濃度のプレート結合抗体（すなわち、架橋抗体）は、細胞増殖を引き起こす（Brown et al. Clinical Transplantation 10; 607-613 [1996]）。これとは対照的に、本発明に係る抗αβＴＣＲモノクローナル抗体またはその抗体フラグメント（ＭＥＤＩ−５００もしくはＴ１０Ｂ９またはそれらのフラグメントを含まない）は、高濃度および低濃度でならびに可溶性形態およびプレート結合形態の両方で非マイトジェンである。Ｔ１０Ｂ９およびＭＥＤＩ−５００は、文献では同義的に使用されることがあり、それぞれ、アロ移植拒絶および血液学的悪性疾患に対する治療など、適応症に対する治療用抗体としてすでに試験されてきた。しかしながら、これら抗体の臨床的使用は、有害なイベントおよび有意なヒト抗マウス抗体反応（ＨＡＭＡ）に関連付けられた（Waid et al. Transplantation 64; 274-281 [1997]）。したがって、有害イベントを最小限に抑えつつ有効性を提供する抗αβＴＣＲ抗体の必要性が、当技術分野に存在する。驚くべきことに、ネズミ抗体であるかつαβＴＣＲに特異的であるＴＯＬ１０１は、有害イベントを最小限に抑えてかつＨＡＭＡ反応を最小限に抑えて、ロバストなＴ細胞抑制を呈した。理論により拘束することを望むものではないが、たとえば、抗体のグリコシル化および／またはコンフォメーションを含めて、ＴＯＬ１０１の翻訳後修飾が、少なくとも部分的に、先行技術の抗体よりも優れた本発明に係る抗体の臨床的有効性および安全性に関与すると考えられる。それに加えて、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体（ＴＯＬ１０１を含む）は、０〜４２ｍｇ／ｍＬ／日の範囲内の用量で１〜５日間全身投与したとき、循環ＣＤ３＋Ｔ細胞の数を有意に（たとえば、媒体対照と比較して１０％超の量）枯渇しない。理論により拘束することを望むものではないが、その代わりに、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体（ＴＯＬ１０１を含む）は、αβＴＣＲ自体を含めて、αβＴＣＲ＋Ｔ細胞上のＣＤ３複合体をダウンレギュレートすることにより、Ｔ細胞が抗原に反応しないようにすると考えられる。本明細書で用いられる場合、「Ｔ細胞枯渇」および「Ｔ細胞欠失」という用語は、Ｔ細胞数（たとえば、被験体における循環Ｔ細胞数）の低減を意味する。Ｔ細胞の枯渇または欠失は、Ｔ細胞で細胞死を引き起こすことにより達成しうる。
抗αβＴＣＲ抗体およびその抗体フラグメントの使用
本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントは、とくにαβＴＣＲ＋Ｔ細胞の負のモジュレーションに関連付けられる種々の有用性を有する。たとえば、抗αβＴＣＲ抗体は、哺乳動物、たとえば、ヒト、霊長動物、および実験動物において、病態の治療方法で利用しうる。本明細書では、抗αβＴＣＲ抗体は、自己免疫性疾患、炎症性疾患、および移植片対宿主反応または移植組織拒絶反応に関連する病態および疾患の治療および／または予防に利用しうると考えられる。本発明に係る方法では、抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントは、単独でまたはさらに他の二次的補助療法剤または技術との組合せで、哺乳動物（たとえば、必要とされるヒト被験体）に投与可能である。
単なる例示にすぎないが、抗αβＴＣＲ抗体または抗体フラグメントによる治療が有効性を提供可能である自己免疫性および炎症性疾患としては、喘息（たとえば、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息、運動起因性喘息、職業性喘息、および夜間性喘息）、アレルギー、アレルギー性気道炎症、アレルギー性脳脊髄炎、自己免疫性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、反応性関節炎、乾癬性関節炎、仙腸骨炎、孤立性急性前部ブドウ膜炎、未分化脊椎関節症、１型糖尿病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、糸球体腎炎、橋本甲状腺炎、グレーブス病、強皮症、セリアック病、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、乾癬、接触性皮膚炎、グッドパスチャー症候群、アジソン病、ウェゲナー肉芽腫症、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、リウマチ性多発性筋痛症、ベーチェット病、ギラン・バレー症候群、種々の血管炎、ブドウ膜網膜炎、甲状腺炎、重症筋無力症、免疫グロブリン腎症、心筋炎、および進行性全身性硬化症が含まれうる。いくつかの実施形態では、炎症性疾患としては、炎症性の病態または疾患、たとえば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支炎、肺気腫、または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）が含まれうる。他の態様では、炎症性の病態または疾患としては、炎症性サイトカインレベルの上昇に関連付けられる疾患、病態、または障害が含まれうる。種々の態様で、炎症性サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、またはＩＬ−５であるか、または炎症性サイトカインは、ＩＦＮ−γであるか、または炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−αである。特定の実施形態では、自己免疫性疾患は、Ｉ型糖尿病または多発性硬化症である。
本発明の実施形態は、移植を行っているまたは移植を必要とする被験体を治療する方法を提供する。これらの実施形態によれば、被験体は、被験体における移植拒絶または移植拒絶の副作用のリスクを低減させるために組成物で治療しうる。この方法によれば、Ｔ細胞活性化を低減可能な抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを含む組成物を被験体に投与することが可能である。組成物は、移植前、移植中、移植後、またはそれらの組合せで投与しうる。いくつかの実施形態では、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントは、移植拒絶の予防またはその重症度の低減のために投与される。他の実施形態では、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントは、起こっているまたはすでに起こった移植拒絶を治療するために投与される。それに加えて、組成物は、１つ以上の抗移植拒絶剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、免疫変調剤、抗微生物剤、またはそれらの組合せをさらに含みうる。
本発明の特定の実施形態では、抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを含む組成物は、Ｔ細胞活性化に関連付けられるサイトカイン活性化を有意に低減可能である。本発明に係る組織移植は、臓器移植および／または非臓器移植を含みうる。たとえば、肺、腎臓、心臓、肝臓、角膜、皮膚、幹細胞、軟組織（たとえば、顔要素移植）、腸管移植、骨髄、膵島、膵臓の移植、またはそれらの組合せが考えられる。
本発明の実施形態は、移植を行っているまたは移植を必要とする被験体が遭遇する症状または徴候を改善する方法を提供する。これらの実施形態によれば、症状または徴候としては、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）または移植拒絶に関連付けられる病態が含まれうる。一例では、本明細書に開示される方法は、腎臓移植を受けている被験体を治療するために使用しうる。他の実施形態では、症状または徴候としては、次のもの、すなわち、腎機能不全、肺不全、心不全、倦怠感、発熱、乾性咳、拒食症、重量損失、筋肉痛および胸痛を限定されるものではないが含む、換気障害、発汗する、悪心、嘔吐、発熱、腹痛、血性下痢、粘膜潰瘍、腎機能低下（クレアチニン増加、尿量減少）、肺機能低下（息切れ増加、発熱する、咳、痰、低酸素血症）、心機能低下（息切れ、胸痛、疲労、肺浮腫または末梢性浮腫、弁膜症）、ランゲルハンス島機能低下（グルコース増加、糖尿病）、移植片対宿主病（胃腸（ＧＩ）潰瘍化、肺不全、皮膚潰瘍、凝固障害、ＣＮＳ機能不全（精神状態変化、昏睡）、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス感染、ウイルス菌類寄生生物感染））のうち１つ以上が含まれうる。
本発明の実施形態は、抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを含む治療上有効量の組成物を必要とされる被験体に投与することを含む、被験体における長期間移植片生着および機能を促進する方法を提供する。本発明の実施形態は、免疫寛容療法を必要とする被験体を治療する方法を提供する。これらの実施形態によれば、被験体は、被験体における機能不全移植拒絶または機能不全移植拒絶の副作用のリスクを低減させるために組成物で治療しうる。他の実施形態では、本明細書中の方法は、移植に特異的な免疫寛容の誘導および／または免疫抑制療法の必要性の低減を提供する。この実施形態によれば、移植レシピエントの免疫系は、移植片を攻撃する特異的能力を低減または消失すると同時に任意の他のタイプの免疫攻撃を開始する能力を維持しうる。この方法によれば、抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメント、たとえば、ＴＯＬ１１０１を含む組成物を移植レシピエントに投与することが可能である。これらの実施形態によれば、免疫寛容療法は、抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを用いてサイトカイン産生を阻害することを含みうる。
本発明の実施形態は、被験体においてＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）レベルを低下させる方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要とする被験体に抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを含む組成物を投与することを含む。本発明の実施形態は、免疫寛容療法を必要とする被験体を治療する方法を提供する。これらの実施形態によれば、抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを含む組成物を投与することを含む、ＮＯ産生の低減および／またはアポトーシスの低減および／またはサイトメガロウイルス（感染および再活性化）の阻害を行う方法が提供される。本発明の特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞活性化を有意に低減可能な組成物である。
本発明の特定の実施形態では、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントと組み合わせて、二次活性剤を使用することが可能である。例示的実施形態では、抗炎症性化合物または免疫モジュレート薬剤としては、単独または組合せのいずれかで摂取される、インターフェロン、インターフェロン誘導体（betaseron、βインターフェロンを含む）、プロスタン誘導体（イロプロスト、シカプロストを含む）、グルココルチコイド（コルチゾール、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾンを含む）、免疫抑制剤（シクロスポリンＡ、ＦＫ−５０６、メトキサレン、サリドマイド、スルファサラジン、アザチオプリン、メトトレキセートを含む）、リポキシゲナーゼ阻害剤（zileutone、ＭＫ−８８６、ＷＹ−５０２９５、ＳＣ−４５６６２、ＳＣ−４１６６１Ａ、ＢＩ−Ｌ−３５７を含む）、ロイコトリエンアンタゴニスト、ペプチド誘導体（ＡＣＴＨおよびそのアナログを含む）、可溶性ＴＮＦ受容体、ＴＮＦ抗体、インターロイキン、他のサイトカイン、Ｔ細胞タンパク質の可溶性レセプターインターロイキン、他のサイトカイン、Ｔ細胞タンパク質に対する抗体レセプター、およびカルシポトリオール、Celcept（登録商標）ミコフェノール酸モフェチル、ならびにそれらの類似体の１つ以上が含まれうるが、これらに限定されるものではない。
本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントはさらに、Ｎ末端またはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え融合もしくはカップリングされうるか、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的にコンジュゲートされうる（共有結合もしくは非共有結合によるコンジュゲーションを含む）。たとえば、本発明に係る抗体は、検出アッセイで標識として有用な分子（放射性核種、放射性同位体、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、またはビオチン）およびエフェクター分子、たとえば、異種ポリペプチド、薬剤、酵素、または毒素に組換え融合またはコンジュゲートされうる。たとえば、ＰＣＴ出版物国際公開第９２／０８４９５号、国際公開第９１／１４４３８号を参照されたい。
本発明の実施形態は、被験体において移植拒絶を低減する方法を提供する。これらの実施形態によれば、被験体において移植拒絶反応または移植拒絶反応の副作用のリスクを低減させるために、治療上有効量の抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントで被験体を治療しうる。この方法によれば、抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを含む組成物を被験体に投与することが可能である。一例では、移植拒絶の低減としては、臓器移植、たとえば、腎臓移植または腸移植、非臓器移植、たとえば、骨髄移植軟組織移植を有する被験体において移植拒絶に関連付けられる症状の低減が含まれうる。
種々の実施形態では、本明細書に記載の種々の病態の哺乳動物において診断が熟練者により行われうる。たとえば、哺乳動物において自己免疫性疾患および炎症関連疾患の診断または検出を可能する診断技術は、当技術分野で利用可能である。たとえば、自己免疫性疾患および炎症関連疾患は、特定のリンパ球のタイプおよび集団、自己抗体の存在、疾患特異的サイトカインの存在および量の同定を含む技術（ただし、これらに限定されるものではない）により、発熱の存在などにより、同定しうる。たとえば、全身性紅斑性狼瘡では、疾患の中心的メディエーターは、自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体の産生および後続の免疫媒介性炎症の発生である。腎臓、肺、筋骨格系、粘膜皮膚、眼、中枢神経系、心血管系、胃腸管、骨髄、および血液を含めて、複数の臓器および系が臨床的に影響を受ける。ＳＬＥは、さまざまなリウマチ学的および血液学的試験、たとえば、特定の自己抗体の存在および量、たとえば、陽性抗核抗体（ＡＮＡ）試験、抗ｎＲＮＰＡ、抗ｎＲＮＰＣ、抗Ｓｍ、抗Ｒｏ、抗Ｌａ、および抗ｄｓＤＮＡ抗体の存在を用いて、診断可能である。
関節リウマチ（ＲＡ）は、主に関節軟骨に傷害を生じた複数の関節の滑膜が関与する慢性全身性自己免疫性炎症性疾患である。病理発生は、Ｔリンパ球依存性であり、結果的に滑液中および血液中で高レベルに達する免疫複合体の形成を伴うリウマチ因子、自己ＩｇＧを指向する自己抗体の産生に関連付けられる。関節中のこれらの複合体は、滑膜中へのリンパ球および単球の顕著な浸潤および後続の顕著な滑膜変化を引き起こしうる。多数の好中球が加わって類似の細胞により浸潤される場合、関節腔／流体中。罹患組織は、主に関節であり、多くの場合、対称パターンである。しかしながら、関節外疾患もまた、２つの主要形態で生じる。一形態は、持続進行性関節疾患を伴う関節外病変、ならびに肺線維症、血管炎、および皮膚潰瘍の典型的な病変の発生である。関節外疾患の第２の形態は、ＲＡ疾患経過の後期に、ときには関節疾患が非活動性になった後に起こるいわゆるフェルティー症候群であり、好中球減少症、血小板減少症、および巨脾の存在を含む。これは、梗塞、皮膚潰瘍、および壊疽の形成と共に複数の臓器で血管炎を伴いうる。また、患者は、多くの場合、罹患関節を覆う皮下組織中にリウマトイド結節を発生し、結節は、後期、混合炎症細胞浸潤物に取り囲まれたネクローシス中心を有する。ＲＡで生じうる他の所見は、心膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、およびリウマトイド結節を含む。
若年性慢性関節炎は、多くの場合、１６歳未満の年齢で始まる慢性特発性炎症性疾患である。その表現型は、ＲＡとのいくつかの類似性を有し、リウマチ性因子陽性である一部の患者は、若年性関節リウマチとして分類される。疾患は、３つの主要なカテゴリー、すなわち、小関節性、多関節性、および全身性に細分類される。関節炎は、重篤になることもあり、典型的には、破壊的であり、関節硬直および遅延成長をもたらす。他の所見は、慢性前部ブドウ膜炎および全身性アミロイドーシスを含みうる。
脊椎関節症は、いくつかの共通した臨床徴候およびＨＬＡ−Ｂ２７遺伝子産物の発現を伴う共通した関連症状を有する一群の疾患である。障害としては、強直性脊椎炎、ライター症候群（反応性関節炎）、炎症性腸疾患関連関節炎、乾癬関連脊椎炎、若年発症脊椎関節症、および未分化脊椎関節症が含まれる。際立った特徴としては、脊椎炎を伴うまたは伴わない仙腸骨炎、炎症性非対称性関節炎、ＨＬＡ−Ｂ２７関連症（クラスＩ ＭＨＣのＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の血清学的に規定される対立遺伝子）、眼炎症、および他のリウマチ性疾患に関連付けられる自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導の鍵として最も関与する細胞は、クラスＩ ＭＨＣ分子により提示された抗原を標的とする細胞ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。ＭＨＣクラスＩ分子により発現された外来ペプチドであるがごとく、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、クラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ−Ｂ２７に対して反応しうる。ＨＬＡ−Ｂ２７のエピトープは、細菌または他の微生物の抗原エピトープを模倣しうるので、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を引き起こすという仮説が立てられてきた。
全身性硬化症（強皮症）は、未知の病因を有する。疾患の特徴は、皮膚の硬結であり、これは、おそらく活性炎症過程により引き起こされる。強皮症は、局所性であることもあれば全身性であることもあり、血管病変は、共通しており、微小血管系の内皮細胞傷害は、全身性硬化症の発生における初期の重要なイベントである。血管損傷は、免疫媒介性でありうる。免疫学的基礎は、皮膚病変中の単核細胞浸潤物の存在および多くの患者における抗核抗体の存在により示唆される。ＩＣＡＭ−１は、多くの場合、皮膚病変の線維芽細胞の細胞表面上でアップレギュレートされることから、ことが示唆される、これらの細胞とＴ細胞との相互作用は、疾患の病理発生の役割を有する。関与する他の臓器としては、胃腸管：異常蠕動運動／運動性をもたらす平滑筋萎縮および線維症；腎臓：弓状小動脈および小葉間動脈に影響を及ぼして腎臓皮質血流の減少を生じる同心性内皮下内膜増殖は、タンパク尿、高窒素血症、および高血圧をもたらす；骨格筋：萎縮、間質性線維症、炎症；肺：間質性肺炎および間質性線維症；ならびに心臓：収縮帯壊死（瘢痕化／線維症）が含まれる。
皮膚筋炎、多発性筋炎などを含む特発性炎症性筋症は、筋力低下をもたらす未知の病因の慢性筋肉炎症の障害である。筋損傷／炎症は、多くの場合、対称性かつ進行性である。自己抗体は、ほとんどの形態と関連する。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に関与する成分、タンパク質、およびＲＮＡを指向し、それらの機能を阻害する。
シェーグレン症候群は、免疫媒介性炎症ならびにそれに続く涙腺および唾液腺の機能破壊に起因する。疾患は、炎症性結合組織疾患に関連付けられうるか、または結合組織疾患を伴いうる。疾患は、ＲｏおよびＬａ抗原（両方とも小さいＲＮＡ−タンパク質複合体である）に対する自己抗体産生に関連付けられる。病変は、乾性角結膜炎、口腔乾燥症をもたらし、胆汁性肝硬変、末梢性または感覚性神経症、および触知可能紫斑病を含む他の所見または関連症を伴う。
全身性血管炎は、一次病変が炎症およびそれに続く血管の損傷であり、罹患した血管により供給される組織に虚血／壊死／変性を生じ、いくつかの場合には、最終的な終末臓器機能不全をもたらす疾患である。血管炎はまた、免疫炎症媒介疾患、たとえば、関節リウマチ、全身性硬化症などに対する二次病変または後遺症として、とくに、免疫複合体の形成にも関連付けられる疾患で、起こりうる。原発性全身性血管炎グループの疾患としては、全身性壊死性血管炎、結節性多発性動脈炎、アレルギー性血管炎、および肉芽腫症、多発性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、リンパ腫様肉芽腫症、ならびに巨細胞性動脈炎が含まれる。他の血管炎としては、皮膚粘膜リンパ節症候群（ＭＬＮＳまたは川崎病）、孤立性ＣＮＳ血管炎、ベーチェット病、閉塞性血栓性血管炎（バージャー病）、および皮膚壊死性細静脈炎が含まれる。列挙された血管炎のタイプのほとんどの病原機序は、主に血管壁中への免疫グロブリン複合体の堆積およびそれに続くＡＤＣＣ、補体活性化、またはその両方を介する炎症反応の誘導に起因すると考えられる。
サルコイドーシスは、体内のほぼ任意の組織において類上皮肉芽腫の存在により特徴付けられる未知の病因の病態であり、肺の合併症は、最も一般的である。病理発生は、疾患部位における活性化マクロファージおよびリンパ系細胞の存続を含み、これらの細胞タイプにより放出される局所的および全身的に活性な産物の放出から生じる後続の慢性後遺症を伴う。
自己免疫性溶血性貧血、免疫性汎血球減少症、および発作性夜間血色素尿症を含む自己免疫性溶血性貧血は、赤血球（いくつかの場合には、血小板をも含めた他の血液細胞）の表面上に発現された抗原と反応する抗体の産生の結果であり、補体媒介性溶解および／またはＡＤＣＣ／Ｆｃレセプター媒介性機序を介する抗体被覆細胞の除去の現れである。
血小板減少性紫斑病および他の臨床状況で免疫媒介性血小板減少症を含む自己免疫性血小板減少症では、血小板に装着する抗体または補体、およびそれに続く補体溶解、ＡＤＣＣ、またはＦＣレセプター媒介機序による除去のいずれかの結果として、血小板破壊／除去が起こる。
グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、および萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果であり、甲状腺に存在するおよび多くの場合それに特異的であるタンパク質と反応する抗体の産生を伴う。自然モデル：ラット（ＢＵＦおよびＢＢラット）およびニワトリ（肥満ニワトリ株）；誘導モデル：サイログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原（甲状腺ペルオキシダーゼ）のいずれかによる動物の免疫化を含む実験モデルが存在する。
Ｉ型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病は、膵島β細胞の自己免疫性破壊である。この破壊は、自己抗体および自己反応性Ｔ細胞により媒介される。また、インスリンまたはインスリンレセプターに対する抗体は、インスリン非反応性の表現型を生成可能である。
糸球体腎炎および尿細管間質性腎炎を含む免疫媒介性腎疾患は、直接的には、腎臓抗原に対する自己反応性抗体またはＴ細胞の産生の結果としての、または間接的には、他の非腎臓抗原に対して反応性である抗体および／または免疫複合体の腎臓中への堆積の結果としての、腎臓組織の抗体媒介またはＴリンパ球媒介の傷害の結果である。したがって、免疫複合体の形成をもたらす他の免疫媒介性疾患はまた、間接的後遺症として免疫媒介性腎疾患を引き起こしうる。直接的および間接的の両方の免疫機序は、腎臓組織中に病変発生を生成／誘導する炎症性反応をもたらし、臓器機能障害およびいくつかの場合には腎不全への進行を伴う。体液性および細胞性の両方の免疫機序は、病変の病理発生に関与しうる。
多発性硬化症、特発性脱髄性多発性神経症またはギラン・バレー症候群、ならびに慢性炎症性脱髄性多発性神経症を含む中枢神経系および末梢神経系の脱髄疾患は、自己免疫性基礎を有し、乏突起膠細胞または直接ミエリンに損傷を引き起こした結果として神経脱髄をもたらすと考えられる。多発性硬化症では、疾患の誘導および進行は、Ｔリンパ球に依存することを示唆する証拠が存在する。多発性硬化症は、典型的には、再発性寛解性経過または慢性進行性経過のいずれかを有する。病因は、不明であるが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境、および自己免疫はすべて、疾患の病因および／または病理発生に寄与しうる。病変は、主にＴリンパ球媒介のミクログリア細胞および浸潤性マクロファージの浸潤物を含有し、ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、病変部位の主な細胞タイプである。乏突起膠細胞の細胞死および後続の脱髄の機序は、知られていないが、おそらくＴリンパ球駆動であろう。本発明の種々の態様では、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体の投与は、さらなるミエリン破壊および患者罹患を予防するうえで合理的な第一段階と見られる。ＭＳの動物モデル（実験的自己免疫性脳脊髄炎）では、Ｔ細胞アンタゴニズムは、疾患を完全に抑止可能である。特定の理論になんら拘束されるものではないが、多発性硬化症（実験的自己免疫性脳脊髄炎）の動物モデルでは、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体の投与は、疾患を完全に抑止可能であるＴ細胞アンタゴニズムをもたらすと考えられる。疾患の症状および病理発生を軽減、抑止、または逆転する際の特異的作用機序は、本発明の理解に必要ではないが、最近発症した多発性硬化症患者への本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体の投与は、自己反応性免疫反応を鎮静化するだけでなく、他のミエリンエピトープへのエピトープの広がりを予防し、疾患の進行を阻害すると考えられる。
多発性硬化症疾患の病期を決定する基準は、周知である。たとえば、最近の発症に関連付けられる症状としては、次のもの、すなわち、疲労、視覚障害、無感覚眩暈（dizziness/vertigo）、膀胱および腸管の機能不全、虚弱、振戦、運動障害、性機能不全、不明瞭言語、痙縮（脚硬直）、嚥下障害、慢性うずく痛み、抑鬱症、軽度の認知障害および記憶障害のうち１つ以上が含まれうる。これらの症状のすべてが最近発症した多発性硬化症に存在するとは限らないが、通常、これらのいくつかの組合せが検出される。多発性硬化症の他の病期またはタイプとしては、次のもの、すなわち、良性多発性硬化症、再発性／寛解性多発性硬化症、二次／進行性多発性硬化症、一次／進行性多発性硬化症、および進行性／再発性多発性硬化症が含まれうる。多発性硬化症のこれらの病期は、当技術分野で周知であり、当技術分野で公知の神経学的に許容可能な試験方法および診断方法を用いて検証可能である。たとえば、コントラスト増強病巣（ＣＥＬ）の数は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）試験から決定可能である。そのほかに、多発性硬化症患者の機能評価は、当技術分野で公知であり、たとえば、平均スクリプス神経症状評価尺度（ＳＮＲＳ）、平均総合障害度評価尺度（ＥＤＳＳ）、および平均多発性硬化症複合機能（ＭＳＦＣ）を含む。
本明細書で用いられる場合、多発性硬化症を有すると診断されたまたはその疑いのある哺乳動物、たとえば、ヒトの治療は、治療上有効な用量の本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体またはそのフラグメントを、最近発症した多発性硬化症、良性多発性硬化症、再発性／寛解性多発性硬化症、二次／進行性多発性硬化症、一次／進行性多発性硬化症、および進行性／再発性多発性硬化症、のいずれか１つ以上を有すると診断されたまたはその疑いのある哺乳動物被験体に投与することを含みうる。いくつかの実施形態では、多発性硬化症の哺乳動物を治療する方法はさらに、本明細書に開示されるように、漸増用量レジメン、漸減用量レジメン、またはそれらの組合せ中で治療上有効な用量の本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体またはそのフラグメントを投与することを含みうる。
臨床的には、アレムツズマブおよびダクリズマブを含む作用剤がＭＳで試験されている。しかしながら、これらの療法は、疑わしい有効性および安全性プロファイルを有する。動物研究では、αβＴ細胞レセプターを標的とすると、疾患の臨床的および病理学的徴候に対する劇的な治療有効性を有することが示された。自己反応性免疫反応を鎮静化するだけでなく、他のミエリンエピトープへのエピトープの広がりを予防して、疾患の進行を阻害する。いくつかの実施形態では、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体またはそのフラグメントは、毎月のコントラスト増強病巣の平均数を５０％以上低減するであろう。いくつかの実施形態では、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体またはそのフラグメントは、ベースラインＭＲＩ時のＣＥＬの全平均（たとえば、治療の２ヶ月前に得られた３つのＭＲＩのＣＥＬの全平均）と比較して、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体またはそのフラグメントによる治療の３〜６ヶ月後、コントラスト増強病巣（ＣＥＬ）の平均数を低減するであろう。他の実施形態では、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体またはそのフラグメントによる治療は、ＳＮＲＳ、総合障害度評価尺度（ＥＤＳＳ）、および／または多発性硬化症複合機能（ＭＳＦＣ）と比較して、平均スクリプス神経症状評価尺度（ＳＮＲＳ）により測定したとき、多発性硬化症の症状の悪化を改善または予防する。
いくつかの実施形態では、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体またはそのフラグメントは、ミエリン特異的Ｔ細胞の数を低減するであろう。いくつかの実施形態では、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体またはそのフラグメントは、ミエリン特異的Ｔ細胞の表現型を炎症誘発性ＴＨ１／１７細胞から抗炎症性ＴＨ２様Ｔ細胞に変化させたり、かつ／または疾患誘発性Ｔ細胞を非反応性にしたりするであろう。
本明細書で用いられる場合、最近発症した多発性硬化症は、最初の脱髄イベント（臨床孤立症候群（ＣＩＤ））を有する被験体を含みうる。最近発症した多発性硬化症を検出および／または診断する方法は、神経学的分野で周知である。いくつかの例示的な例としては、病変検出のための、たとえば、ガドリニウム増強病変およびＴ２病変（すなわち、Ｔ２強調画像上に見られた病変）、Ｔ１強調低信号病変（ブラックホール）の病変体積およびカウント数の使用のための、磁気共鳴イメージングが含まれ、中枢神経系（ＣＮＳ）萎縮測定は、炎症、脱髄、軸索損失、また神経変性により引き起こされる一連の組織改変のよりグローバルな写真を取り込むことが可能である。いくつかの実施形態では、最近発症した多発性硬化症患者の１つの病変（臨床孤立症候群）の客観的な臨床的証拠は、発性硬化症に合致する２つ以上のＭＲＩ病変により示される空間内の広がり、陽性ＣＳＦ、およびＭＲＩまたは第２の臨床的発作により示される時間内の広がりにより決定可能である。陽性ＣＳＦは、一般的には、血清中のものとは異なるオリゴクローナルバンドまたは免疫グロブリンＧ指標の増加として定義される。一例では、次の基準、すなわち、１）脳または脊椎中の１つのガドリニウム増強病変または９つのＴ２高信号病変、２）少なくとも１つテント下病変または脊椎病変、３）少なくとも１つの傍骨性病変、または４）少なくとも３つの室周囲病変の少なくとも３つが満たされれば、空間内および時間内の広がりにより決定される脳の異常ならびに空間内に広がるＭＲＩ病変に対するＭＲＩ基準を決定することが可能である。時間内に広がるＭＲＩ病変の存在を決定するために、次の少なくとも１つの基準を満たさなければならない。すなわち、１）初期出現の３ヶ月以上後のガドリニウム増強病変であるが、初期イベントとは異なる位置、および２）初期イベントの発症の３０日以上後に行われた参照ＭＲＩと比較して、新しいＴ２病変。Polman CH, Reingold SC, Edan G, et al: Diagnostic Criteria for Multiple Sclerosis: 2005 Revisions to the “McDonald Criteria.” Ann Neurol 2005;58:840-846（その開示はその全体が本明細書において援用される）。
炎症性および線維性の肺疾患（好酸球性肺炎を含む）、特発性肺線維症、および過敏性肺炎は、脱調節された免疫炎症性反応を含みうる。その反応の阻害は、治療上有益であろう。
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑、および接触性皮膚炎を含む自己免疫性または免疫媒介性の皮膚疾患は、自己抗体により媒介され、その起源はＴリンパ球依存性である。
乾癬は、Ｔリンパ球媒介性炎症性疾患である。病変は、Ｔリンパ球、マクロファージ、および抗原プロセシング細胞ならびにいくらかの好中球の浸潤物を含有する。
炎症性疾患としては、ＩｇＥ媒介性および非ＩｇＥ媒介性のものを含むアレルギー型疾患を含みうる。たとえば、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症、および蕁麻疹は、Ｔリンパ球依存性である。これらの疾患は、主に、Ｔリンパ球誘発性炎症、ＩｇＥ媒介性炎症、または両者の組合せにより媒介される。いくつかの実施形態では、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体は、アレルギー疾患、神経過敏関連疾患、または気道炎症関連呼吸器疾患、たとえば、喘息を治療するのに有用でありうる。いくつかの実施形態では、本発明に係る組成物は、過敏症、皮膚アレルギー、湿疹、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、眼乾燥疾患、アレルギー、接触アレルギー、食物過敏症、アレルギー性結膜炎、昆虫毒アレルギー、気管支喘息、アレルギー性喘息、内因性喘息、職業性喘息、アトピー性喘息、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に関連付けられる１つ以上の症状を予防、治療、または軽減するのに効果的である。
本発明に係る方法により治療しうる過敏性関連疾患または障害としては、過敏症、薬剤反応、皮膚アレルギー、湿疹、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、眼乾燥疾患（または乾性角結膜炎（ＫＣＳ）としても参照される、乾性角膜炎、眼球乾燥症とも呼ばれる、アレルギー性接触アレルギー、食物アレルギー、アレルギー性結膜炎、昆虫毒アレルギー、および気道炎症関連呼吸器疾患、たとえば、ＩｇＥ媒介性喘息および非ＩｇＥ媒介性喘息が含まれるが、これらに限定されるものではない。
気道炎症関連呼吸器疾患としては、鼻炎、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アレルギー（外因性）喘息、非アレルギー性（内因性）喘息、職業性喘息、アトピー性喘息、運動起因性喘息、咳誘発性喘息、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
移植拒絶および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む移植関連疾患は、Ｔリンパ球依存性であり、Ｔリンパ球機能の阻害は、改善性である。以上に記載の抗αβＴＣＲ抗体および抗体フラグメントは、アロ移植拒絶を治療、予防、または遅延するに有用である。
本発明は、利用されるアロ移植片のタイプにより制限されない。たとえば、特定の実施形態では、アロ移植片は、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、腸、胃、精巣、手、角膜、顔を含む皮膚再移植片、ランゲルハンス島（ランゲルハンス島細胞）、骨髄／成体幹細胞、輸血／部分輸血、血管、心臓弁、骨、および細胞、または組織移植レシピエント（たとえば、幹細胞または骨髄細胞レシピエント）からなる群から選択される固形臓器または組織である。
投与
好ましくは、抗体は、担体、好ましくは薬学的に許容可能な担体に入れて哺乳動物に投与される。好適な担体およびその処方は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co., edited by Oslo et al.に記載されている。典型的には、製剤を等張性にするために、適切な量の薬学的に許容可能な塩が製剤で使用される。担体の例としては、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が含まれる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。さらなる担体としては、持続放出性製剤、たとえば、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性のマトリックスが含まれる。このマトリックスは、造形品、たとえば、膜、リポソーム、またはマイクロ粒子の形態である。たとえば、投与経路および投与される抗体の濃度に依存して、特定の担体がより好ましいこともありうることは、当業者には明らかであろう。
抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントは、注射により（たとえば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、門脈内）、または他の方法により、たとえば、効果的形態で血流への送達が確保される注入により、被験体に投与可能である。抗体はまた、局所治療効果を発揮するように、分離組織灌流などの分離灌流技術により投与しうる。局所注射または静脈内注射が好ましい。
抗体の適切な用量を選択する際の指針は、抗体の治療的使用に関する文献、たとえば、Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 and pp. 303-357、Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389に見いだされる。単独使用される抗体の典型的な一日投与量は、以上に述べた因子に依存して、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日またはそれ以上、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約０．７ｍｇ／ｋｇ体重／日またはそれ以上の範囲内でありうる。
いくつかの実施形態では、自己免疫性疾患、炎症性疾患、または移植組織拒絶（たとえば、腎臓移植拒絶反応）を治療する方法は、抗αβＴＣＲ抗体もしくはその抗体フラグメントまたは抗αβＴＣＲＩｇＭ抗体もしくはその抗体フラグメントを、約１ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日、もしくは約７ｍｇ／日〜約５８ｍｇ／日、もしくは約１４ｍｇ／日〜約４５ｍｇ／日、もしくは約２８ｍｇ／日〜約４２ｍｇ／日の量で、または７ｍｇ／日、１４ｍｇ／日、２１ｍｇ／日、２８ｍｇ／日、３０ｍｇ／日、３２ｍｇ／日、３４ｍｇ／日、３５ｍｇ／日、３６ｍｇ／日、３８ｍｇ／日、４０ｍｇ／日、４２ｍｇ／日、４４ｍｇ／日、４６ｍｇ／日、４８ｍｇ／日、５０ｍｇ／日、５２ｍｇ／日、５４ｍｇ／日、５６ｍｇ／日、もしくは５８ｍｇ／日またはそれ以上の量で、あるいはそれらの組合せで、必要とする被験体に投与することを含みうる。本明細書で用いられる場合、整数１〜２００は、整数１と２００との間の任意の整数またはその分割値を包含または含む。たとえば、約７ｍｇ／日〜約５８ｍｇ／日の一日用量は、当然ながら、この範囲間のすべての整数、たとえば、８、１０、１３、２７、２８、２９、３０、４５、５３、および５７ｍｇ／日、ならびにその任意の分割量、たとえば、整数７と５８との間にあるとみなされる分割量の単なる例として、３．５、４．７、５．２５、１１．６、２２．１、４６．３、および５１．１２５ｍｇ／日を含む。いくつかの実施形態では、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間の投与スケジュールは、同一であってもよいかつ／または異なっていてもよい逐次一日用量とみなされる漸増および／または漸減投与スケジュールを含みうる。本発明に係る方法、アッセイ、および組成物の特定の実施形態では、抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントは、αβＴＣＲに結合するＴＯＬ１０１抗体またはその抗体フラグメントを含む。本発明に係る方法の特定の実施形態では、自己免疫性疾患、炎症性疾患、または移植片組織拒絶は、腎臓移植組織拒絶／移植片対宿主病または多発性硬化症である。
いくつかの実施形態では、本発明に係る方法、たとえば、自己免疫性疾患、炎症性疾患、または移植組織拒絶の治療方法は、抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを、約１ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日もしくは約７ｍｇ〜約５８ｍｇ／一日用量の範囲内の量または合計すると一日用量になる分割単位用量（たとえば、２８ｍｇの一日用量は、２４時間以内の異なる時間、たとえば１日２回または１２時間おき、の２回の１４ｍｇ投与用量を含みうる）で、必要とする被験体に投与することを含みうる。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、必要とされる患者または被験体に、組成物、たとえば、医薬組成物を、本質的に日によって変わらない一日用量で投与することを含みうる。いくつかの実施形態では、被験体は、０日目に最高一日用量、たとえば、５８ｍｇ／日または５６ｍｇ／日または４２ｍｇ／日から始めて、３日間〜５日間〜６日間にわたり最低一日用量、たとえば、７ｍｇ／日または１４ｍｇ／日に調整される調整一日用量で治療される。例示的な投与スケジュールは、以下の表１〜４に示される。
Figure 2015504419
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いくつかの実施形態では、投与レジメンは、０日目に一日用量が最低一日用量で被験体に投与される漸増投与スケジュールを含みうる。治療期間内の最終日または他日に、一日用量は、最高一日用量に漸増される。一実施形態では、被験体のタクロリムスレベルが目標レベルに達するまで抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを被験体に投与する。一実施形態では、最低３日間にわたりまたは被験体のタクロリムスレベルが目標レベルに達するまで抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを被験体に毎日投与する。一実施形態では、最低４日間にわたりまたは被験体のタクロリムスレベルが目標レベルに達するまで抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを被験体に毎日投与する。一実施形態では、最低５日間にわたりまたは被験体のタクロリムスレベルが目標レベルに達するまで抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを被験体に毎日投与する。一実施形態では、最低６日間にわたりまたは被験体のタクロリムスレベルが目標レベルに達するまで抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを被験体に毎日投与する。一実施形態では、最大１０日間にわたり抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを被験体に毎日投与する。いくつかの実施形態では、タクロリムスの目標レベルは、８〜１５ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、漸増投与レジメンは、表５および６に例示された以下の投与スケジュールを含みうる。
Figure 2015504419
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いくつかの実施形態では、一日用量は、全一日用量であり、一単位用量または複数回用量で、たとえば、合計すると指定の全一日用量に達する２、３、または４単位用量で投与される。
いくつかの実施形態では、自己免疫性疾患、炎症性疾患、または移植組織拒絶の治療方法は、少なくとも３回分の個別用量の抗αβＴＣＲ抗体（たとえば、ＩｇＧまたはＩｇＭ）またはその抗αβＴＣＲ抗体フラグメントを、自己免疫性疾患、炎症性疾患、臓器アロ移植片移植レシピエントの被験体に、投与することを含みうる。ただし、少なくとも３回分の個別用量は、連続して３日間にわたり投与され、２回分の用量は、同一日に投与される。他の実施形態では、少なくとも３回分の個別用量は、４回分の個別用量を含むかまたはそれからなる。ただし、少なくとも４回分の個別用量は、連続して４日間にわたりに投与され、同一日に２回分の用量は投与されない。特定の実施形態では、少なくとも３回分の個別用量は、５回分の個別用量を含むかまたはそれからなる。ただし、少なくとも５回分の個別用量は、連続して５日間にわたりに投与され、同一日に２回分の用量は投与されない。他の実施形態では、少なくとも３回分の個別用量は、６〜１４回分の個別用量を含むかまたはそれからなる。ただし、少なくとも６〜１４回分の個別用量は、連続して６〜１４日間にわたりに投与され、同一日に２回分の用量は投与されない。
いくつかの実施形態では、自己免疫性疾患、炎症性疾患、または移植組織拒絶を有する被験体の治療は、少なくとも初回用量の抗αβＴＣＲ抗体（たとえば、ＩｇＧまたはＩｇＭ）または抗αβＴＣＲ抗体フラグメントを被験体に投与することを含む。ただし、初回用量は、少なくとも５０分間または少なくとも７０分間（たとえば、５０〜１００分間、７０〜２００分間、７０〜１８０分間、７０〜１４０分間、または７０…１４０…１８０…２００分間）にわたり静脈内投与される。特定の実施形態では、本発明は、少なくとも初回用量の抗αβＴＣＲ抗体（たとえば、ＩｇＧまたはＩｇＭ）または抗αβＴＣＲ抗体フラグメントをアロ移植片移植レシピエントに投与することを含む、アロ移植拒絶を遅延または予防する方法を提供する。ただし、初回用量は、０．０５ｍｇ／分〜０．３５ｍｇ／分間（たとえば、０．０５…０．１…０．２…０．３…０．３５ｍｇ／分）の速度で静脈内投与される。
他の実施形態では、少なくとも初回用量は、少なくとも３回分の個別用量を含み、３回分の個別用量は、連続して３日間にわたり投与され、３回分の個別用量のそれぞれは、少なくとも５０分間…６０分間…または少なくとも７０分間にわたり静脈内投与される。さらなる実施形態では、初回用量は、実質的に一定の速度（たとえば、０．０５ｍｇ／分〜０．３５ｍｇ／分の速度）で静脈内投与される。特定の実施形態では、初回用量は、高流量静脈内に投与される。
抗αβＴＣＲ抗体および抗体フラグメントは、非経口、非侵襲的、皮下、局所、腹腔内、肺内、鼻腔内、および病変内の投与を含めて、任意の好適な手段により投与されうる（たとえば、局所免疫抑制治療のために）。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下の投与が含まれるが、これらに限定されるものではない。それに加えて、抗αβＴＣＲ抗体および抗体フラグメントは、とくに漸減用量で、パルス注入により投与されうる。
抗αβＴＣＲ抗体および抗体フラグメントは、被験体への投与に好適な医薬組成物中に組込み可能である。たとえば、医薬組成物は、抗αβＴＣＲ抗体および抗体フラグメントと、薬学的に許容可能な担体と、を含みうる。本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容可能な担体」としては、生理学的に適合性のある、溶媒、分散媒、被覆剤、抗細菌剤および抗菌類剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容可能な担体の例としては、次のもの、すなわち、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうち１つ以上、さらにはそれらの組合せが含まれる。多くの場合、組成物中に等張化剤、たとえば、糖、ポリアルコール、たとえば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。薬学的に許容可能な担体は、抗αβＴＣＲ抗体および抗体フラグメントの貯蔵寿命または有効性を向上させる副次量の補助物質、たとえば、湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝液をさらに含みうる。
本発明に係る組成物は、さまざまな形態をとりうる。こうしたものとしては、たとえば、液体溶液剤（たとえば、注射用および注入用の溶液剤）、ディスパージョン剤またはサスペンジョン剤、錠剤、丸剤、粉末剤、リポソーム剤、坐剤などの液体、半固体、および固体の剤形が含まれる。好ましい形態は、意図される投与形態および治療用途に依存する。典型的な好ましい組成物は、注射用または注入用の溶液剤、たとえば、他の抗体によるヒトの受動免疫に使用されるものに類似した組成物の形態をとる。
治療用組成物は、典型的には、製造条件下および貯蔵条件下で無菌かつ安定である。組成物は、溶液剤、マイクロエマルジョン剤、ディスパージョン剤、リポソーム剤、または高薬剤濃度に好適な他の秩序化構造剤として製剤化可能である。無菌注射用溶液剤は、活性化合物（すなわち、抗体または抗体フラグメント）を必要量で適切な溶媒中に、必要に応じて、以上に列挙した成分の１つまたは組合せと共に、組み込んでから無菌濾過を行うことにより、調製可能である。一般的には、ディスパージョン剤は、ベース分散媒と以上に列挙したものから選ばれる所要の他の成分とを含有する無菌媒体中に活性化合物を組み込むことにより調製される。無菌注射用溶液剤を調製するための無菌粉末剤の場合、好ましい調製方法は、活性成分と任意の追加の所望の成分とからなる粉末を事前に無菌濾過されたその溶液から生成する真空乾燥および凍結乾燥である。溶液剤の適正な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティング剤を用いることにより、ディスパージョン剤の場合には所要の粒子サイズを維持することにより、および界面活性剤を用いることにより、維持可能である。吸収を遅らせる作用剤、たとえば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に組み込むことにより、注射用組成物を長期間にわたり吸収させるようにすることが可能である。
特定の実施形態では、活性化合物は、化合物の急速放出を防止する担体を用いて調製しうる。たとえば、インプラント、経真皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムをはじめとする制御放出性製剤である。生分解性生体適合性ポリマー、たとえば、エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用することが可能である。そのような製剤の多くの調製方法は、特許化されており、当業者に周知である（たとえば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい）。
本発明に係る医薬組成物は「治療上有効量」または「予防上有効量」の本発明に係る抗体または抗体フラグメントを含みうる。「治療上有効量」とは、所望の治療結果（たとえば、アロ移植拒絶の予防または低減、自己免疫性および炎症性の症状および病態の治療、軽減、再発または発症の予防）を達成するのに必要な投与および期間で効果的な量を意味する。治療上有効量の抗体または抗体フラグメントは、疾患状態、個体の年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の反応を誘発する抗体または抗体フラグメントが能力などの因子によって異なりうる。また、治療上有効量は、治療上有益な効果が抗αβＴＣＲ抗体または抗体フラグメントのいかなる毒性または有害作用をも凌ぐ量である。「予防上有効量」とは、所望の予防結果を達成するのに必要な投与および期間で効果的な量を意味する。典型的には、予防用量は、疾患の前またはより早い段階の被験体で使用されるので、予防上有効量は、治療上有効量よりも少ないであろう。
特定の実施形態では、本発明は、配列番号３、４、および５のポリヌクレオチド配列を含む単離された抗体を含む組成物を提供する。ただし、単離された抗体は、αβＴＣＲに結合する。特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の自己免疫性の疾患および障害、炎症性の疾患または障害、ならびに移植組織拒絶またはＧＶＨＤの治療のための、αβＴＣＲに結合するかつαβＴＣＲへのモノクローナル抗体Ｔ１０Ｂ９．１Ａ−３１の結合を競合的に阻害する抗体を含む組成物を提供する。
特定の実施形態では、本発明は、ｉ）ＴＯＬ１０１抗体の軽鎖可変領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つと、ｉｉ）ＴＯＬ１０１抗体の重鎖可変領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つと、ｉｉｉ）ヒト抗体の定常領域と、を含む単離されたヒト化モノクロナール抗体またはそのフラグメントを含む組成物を提供する。さらなる実施形態では、単離されたヒト化モノクロナール抗体またはそのフラグメントは、ｉ）ＴＯＬ１０１抗体の軽鎖可変領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてと、ｉｉ）ＴＯＬ１０１抗体の重鎖可変領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてと、を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、ｉ）ＴＯＬ１０１抗体の軽鎖可変領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ｉｉ）ＴＯＬ１０１抗体の重鎖可変領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ｉｉｉ）ヒト抗体の定常領域と、を含む単離されたヒト化モノクロナール抗体またはそのフラグメントを含む組成物を提供する。さらなる実施形態では、ヒト化モノクロナール抗体またはそのフラグメントは、凍結乾燥される。他の実施形態では、組成物はさらに、生理学的耐容性緩衝液を含む。特定の実施形態では、組成物はさらに、次のもの、すなわち、ｉ）無菌水、ｉｉ）Ｌ−アルギニン（たとえば、約１００ｍＭ Ｌ−アルギニンまたは１０〜９００ｍＭ）、ｉｉｉ）シトレート（たとえば、約５ｍＭシトレート、または約１〜２５ｍＭシトレート）、ｉｖ）マンニトール（たとえば、４％マンニトール（ｗ／ｖ）または１〜３０％ｗ／ｖマンニトール約）、およびｖ）ＴＷＥＥＮまたは他の非イオン性界面活性剤（たとえば、約０．０１％ＴＷＥＥＮ８０、ｐＨ７．０）の少なくとも１つ、２つ、または３つを含むかまたはそれからなる。さらなる実施形態では、ヒト化モノクローナルＴＯＬ１０１抗体またはそのフラグメントは、組成物中に１４ｍｇ〜５２ｍｇ、好ましくは２８ｍｇ〜５２ｍｇで存在し、または組成物中に２８ｍｇ、３０ｍｇ、３２ｍｇ、３４ｍｇ、３５ｍｇ、３６ｍｇ、３８ｍｇ、４０ｍｇ、４２ｍｇ、４４ｍｇ、４６ｍｇ、４８ｍｇ、もしくは５０ｍｇで存在する。
抗αβＴＣＲ抗体の他の使用
本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体の治療効果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによりおよびｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルを用いて調べることが可能である。たとえば免疫関連疾患または癌の発症および病理発生における本明細書に明記される抗αβＴＣＲ抗体の役割をさらに理解するためにおよび候補治療剤の有効性を試験するために、さまざまな周知の動物モデルを使用することが可能である。そのようなモデルのｉｎ ｖｉｖｏでの性質により、とくに、ヒト患者における反応が予測されるようになる。免疫関連疾患の動物モデルは、非組換えおよび組換え（トランスジェニック）動物の両方を含む。非組換え動物モデルとしては、たとえば、齧歯動物、たとえば、ネズミモデルが含まれる。そのようなモデルは、標準的技術により、たとえば、皮下注射、尾静脈注射、脾臓留置術、腹腔内留置術、および腎臓カプセル下留置術を用いて、細胞を同種同系マウス中に導入することにより作製可能である。
動物モデル（たとえば、移植片対宿主病）は、公知である。移植片対宿主病は、免疫担当細胞を免疫抑制または免疫寛容の患者に移植した時に起こる。ドナー細胞は、宿主抗原を認識して反応する。反応は、命にかかわる重篤な炎症から下痢や体重減少の軽度の症例までさまざまでありうる。移植片対宿主病モデルは、ＭＨＣ抗原および副次的移植抗原に対するＴ細胞反応性を評価する手段を提供する。好適な手順は、Current Protocols in Immunology, Unit 4.3に詳述されており、前記手順は、その全体が参照により本明細書において援用される。
皮膚アロ移植拒絶の動物モデルは、ｉｎ ｖｉｖｏで組織破壊を媒介するＴ細胞の能力を試験する手段であり、抗ウイルス免疫および抗腫瘍免疫におけるその役割の指標および尺度となる。最も一般的な許容されたモデルでは、ネズミ尾皮膚移植片が使用される。皮膚アロ移植拒絶は、抗体ではなく、Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、およびキラーエフェクターＴ細胞により媒介されることが、反復実験により示された。（Auchincloss, H. Jr. and Sachs, D. H., Fundamental Immunology, 2nd ed., W. E. Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992）。好適な手順は、Current Protocols in Immunology, Unit 4.4に詳述されている。本発明に係る組成物の試験に使用可能な他の移植拒絶モデルは、Tanabe, M. et al., Transplantation, (1994) 58:23およびTinubu, S. A. et al., J. Immunol., (1994) 4330-4338に記載されている同種異系心臓移植モデルである。
遅延型過敏症の動物モデルでは、さらに細胞媒介性免疫機能のアッセイも提供される。遅延型過敏反応は、炎症がピークに達するのが抗原チャレンジ後一定期間を経過した後であることにより特徴付けられるＴ細胞媒介ｉｎ ｖｉｖｏ免疫反応である。これらの反応はまた、多発性硬化症（ＭＳ）や実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ、ＭＳ用モデル）などの組織特異的自己免疫性疾患でも起こる。好適な手順は、Current Protocols in Immunology, Unit 4.5に詳述されている。
関節炎の動物モデルは、コラーゲン誘発関節炎である。このモデルは、ヒト自己免疫性関節リウマチの臨床的、組織学的、および免疫学的な特性を共有し、ヒト自己免疫性関節炎に対する許容可能なモデルである。マウスおよびラットモデルは、滑膜炎、軟骨および軟骨下骨の糜爛により特徴付けられる。本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体は、Current Protocols in Immunology, above, units 15.5に記載のプロトコルを用いて自己免疫性関節炎に対する活性に関して試験可能である。Issekutz, A. C. et al., Immunology, (1996) 88:569に記載のＣＤ１８およびＶＬＡ−４インテグリンに対するモノクローナル抗体を用いたモデルも参照されたい。
オボアルブミンで動物を感作してから、エアロゾルにより送達される同一のタンパク質で動物をチャレンジすることにより、抗原誘発性気道過反応性肺好酸球増加症および炎症が引き起こされる喘息モデルが記載されている。いくつかの動物モデル（モルモット、ラット、非ヒト霊長動物）は、エアロゾル抗原でチャレンジするとヒトにおいてアトピー性喘息に類似した症状を示す。ネズミモデルは、ヒト喘息の特徴の多くを有する。喘息の治療における活性および有効性に関して本発明に係る組成物を試験する好適な手順は、Wolyniec, W. W. et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., (1998) 18:777およびそこに引用されている参照文献に記載されている。
そのほかに、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体は、乾癬様疾患の動物モデルで試験可能である。本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体は、Schon, M. P. et al., Nat. Med., (1997) 3:183に記載のｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスモデルで試験可能である。このモデルでは、マウスは、乾癬に類似した病理組織学的皮膚病変を示す。他の好適なモデルは、Nickoloff, B. J. et al., Am. J. Path., (1995) 146:580に記載されるように作製されたヒト皮膚／ｓｃｉｄマウスキメラである。
（ＴＣＲ＋）Ｔ細胞免疫反応の選択的阻害方法
いくつかの実施形態では、本発明は、（αβＴＣＲ＋）Ｔ細胞免疫反応を阻害または選択的に阻害する方法を提供する。本明細書で用いられる場合、「選択的に阻害する」または「阻害する」という用語は、一般的には、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントへのαβＴＣＲ＋Ｔ細胞の暴露後にαβＴＣＲ＋Ｔ細胞の少なくとも１つの活性化経路が阻害されることを意味する。また、「選択的に阻害する」または「阻害する」とは、増殖やサイトカイン産生などのＴ細胞活性化の下流効果が阻害されることも意味しうる。
以上に記載したように、（ＴＣＲ＋）Ｔ細胞免疫反応の選択的阻害は、炎症誘発性サイトカイン、たとえば、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、またはＳＴＡＴ活性化に関連付けられるインターロイキン（たとえば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、および／またはＩＬ−１３）の増殖および／または産生の低減または完全休止をもたらしうる、αβＴＣＲ＋Ｔ細胞（たとえばヒトＣＤ４＋Ｔｈｅｌｐｅｒ ｏｒ ｍｅｍｏｒｙ細胞またはＣＤ８＋Ｔｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞）中のシグナル伝達成分の低減または抑制を含む。本明細書で利用される種々の治療方法では、治療上有効量の抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを投与すると、ＭＨＣとの関連でかつ抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントの不在下でコグネイト抗原に暴露されたＴＣＲ＋Ｔ細胞の活性化と比較して前記ＴＣＲ＋Ｔ細胞からの炎症誘発性サイトカインの発現または放出が低減される。さらに、選択的に阻害すると、枯渇するのではなく単にＣＤ３の発現を消失するにすぎず、引き続きＣＤ２を発現するαβＴＣＲ＋Ｔ細胞を生じる（たとえば、アロ移植片移植レシピエントのＣＤ３＋カウント数を２５細胞／ｍｍ３未満にするには、抗αβＴＣＲ抗体または抗αβＴＣＲ抗体フラグメントの少なくとも３回の投与で十分である）。したがって、本発明に係る抗αβＴＣＲ抗体またはそのフラグメントは、血流からＴ細胞を枯渇させて重度免疫無防備被験者をもたらしうるＯＫＴ３などの他の抗Ｔ細胞抗体とは異なり、Ｔ細胞枯渇を引き起こすことなく炎症誘発性サイトカインの増殖および産生をはじめとするＴ細胞活性化を抑制する。
アッセイ
いくつかの実施形態では、抗αβＴＣＲ抗体およびその抗体フラグメントは、抗αβＴＣＲ抗体を模倣して抗αβＴＣＲに結合しＴＣＲの機能不活性化を引き起こす治療用化合物を同定するスクリーニングアッセイに使用可能である。
一実施形態では、本方法は、ＴＣＲ＋Ｔ細胞活性化を抑制、抑圧、不活性化／脱活性化する治療用化合物を同定するアッセイ工程を含む。本方法は、ＴＣＲ−抗αβＴＣＲ複合体を形成するように操作可能な条件下でαβＴ細胞レセプター（αβＴＣＲ）またはそのフラグメントと抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントとを接触させる工程を含む。アッセイは、アッセイ条件がＴＣＲ−抗αβＴＣＲ抗体複合体の形成を助長するかぎり、任意のアッセイ反応容器内、ウェル内、チューブ内、または固体基材上で行うことが可能である。いくつかの実施形態では、試薬は、適切な緩衝液中に懸濁された液体形態で添加される。αβＴ細胞レセプターは、フローサイトメトリー細胞分取器を利用して選別されたヒトαβＴ細胞から、単離または精製することが可能である。
一般的には、第２の工程は、ＴＣＲ−抗αβＴＣＲ複合体と候補化合物とを接触させることを含む。候補化合物としては、核酸、ペプチド、タンパク質（本明細書に記載の抗体を含む）、糖、ポリサッカリド、糖タンパク質、脂質、および小有機分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。「候補化合物」は、スクリーニングアッセイで試験可能な化合物である。一実施形態では、候補化合物は、抗体またはその抗体フラグメントを含みうる。候補化合物または陰性対照のタンパク質もしくは抗体（たとえば、ウシ血清アルブミンもしくは抗ＢＳＡ抗体）の不在下と比較して、候補化合物がαβＴ細胞レセプターに特異的に結合した場合、その候補化合物は、同定された化合物のサイトカイン産生の低減または休止をはじめとするαβＴ細胞レセプター脱活性化を実証可能なアッセイを用いて検証されうる「リード化合物」であると言えるか、あるいは自己免疫性、炎症性、または組織拒絶性の疾患または病態、たとえば、Ｉ型糖尿病および自己免疫性または炎症性の神経変性疾患、たとえば、多発性硬化症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症の治療に好適なαβＴ細胞レセプター脱活性化活性を有する潜在的または実際的な治療剤または活性剤として使用可能である。「小有機分子」という用語は、典型的には、医薬で一般に使用される有機分子に匹敵するサイズの分子を意味する。小有機分子としては、一般的には、生体高分子（たとえば、タンパク質、核酸など）は除外される。好ましい小有機分子は、約５，０００Ｄａまで、より好ましくは２，０００Ｄａまで、最も好ましくは約１、０００Ｄａまでの範囲内のサイズである。
従来方式では、有用な性質を有する新しい化学物質は、いくつかの望ましい性質または活性を有する候補化合物を同定することと、候補化合物の変異体を形成することと、それらの変異体化合物の性質および活性を評価することと、創製される。しかしながら、創薬のすべての側面で時間スケールを短縮することが、現在の傾向である。迅速かつ効率的に多くを試験する能力があることから、高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）方法が従来のリード化合物同定法と置き換わりつつある。
いくつかの実施形態では、高スループットスクリーニング方法は、多数の潜在的治療用化合物（候補化合物）を含有するライブラリーを提供することを含む。次に、そのような「コンビナトリアル化学ライブラリー」を本明細書に記載されているような１種以上のアッセイでスクリーニングして、所望の特性活性を呈するライブラリーメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定する。
コンビナトリアル化学ライブラリーまたは化学ライブラリーとは、化学的合成または生物学的合成のいずれかにより、試薬などのいくつかの化学的「ビルディングブロック」を組み合わせることにより、生成されたさまざまな化学化合物のコレクションのことである。たとえば、ポリペプチド（たとえば、ムテイン）ライブラリーなどのリニアコンビナトリアル化学ライブラリーは、所与の化合物長さ（すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）に対してできるかぎりの方法で一群の化学的ビルディングブロックと呼ばれるアミノ酸を組み合わせることにより形成される。化学的ビルディングブロックのそのようなコンビナトリアル混合を介して、何百万もの化学化合物を合成することが可能である。たとえば、１００個の交換可能な化学的ビルディングブロックの系統的コンビナトリアル混合により、１００００万個の四量体化合物または１００億個の五量体化合物の理論的合成か可能になる。
コンビナトリアル化学ライブラリーの作製は、当業者に周知である。そのようなコンビナトリアル化学ライブラリーとしては、ペプチドライブラリー（たとえば、米国特許第５，０１０，１７５号を参照されたい）が含まれるが、これに限定されるものではない。ペプチド合成は、なんら想定される唯一の手法というわけではないが、本発明で使用することが意図される。化学的多様性ライブラリーを作製するための他の化学を使用することも可能である。そのような化学としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ペプトイド（ＰＣＴ国際公開第９１／１９７３５号、１９９１年１２月２６日）、コードペプチド（ＰＣＴ国際公開第９３／２０２４２号、１９９３年１０月１４日）、ランダムバイオオリゴマー（ＰＣＴ国際公開第９２／０００９１号、１９９２年１月９日）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）、ダイバーソマー、たとえば、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチド、ビニロガスポリペプチド、β−Ｄ−グルコース足場を有する非ペプチド性ペプチド模倣体、低分子化合物ライブラリーの類似の有機合成、オリゴカルバメート、および／またはペプチジルホスホネート。一般的には、核酸ライブラリー（たとえば、Strategene, Corp.）、ペプチド核酸ライブラリー（たとえば、米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、抗体ライブラリー（たとえば、ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７号を参照されたい）、炭水化物ライブラリー（たとえば、米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、および小有機分子ライブラリー（たとえば、ベンゾジアゼピン、イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号、チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号、ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号、および同第５，５１９，１３４号、ならびにモルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号、およびベンゾジアゼピン、同第５，２８８，５１４号などを参照されたい）を参照されたい。
コンビナトリアルライブラリーの作製装置は、市販されている（たとえば、357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville Ky.、Symphony, Rainin, Woburn, Mass.、433A Applied Biosystems, Foster City, Calif、9050 Plus, Millipore, Bedford, Mass.を参照されたい）。また、いくつかの周知のロボットシステムも溶相化学用に開発されてきた。これらのシステムとしては、武田薬品工業株式会社（日本国大阪）により開発された自動合成装置のような自動ワークステーション、および化学者により行われる手動合成操作を模倣するロボットアームを利用した多くのロボットシステム（Zymate II, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.、Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.）、および開始から終了まで５７６〜９，６００の同時反応を行うことが可能な超ハイスループット合成装置Ｖｅｎｔｕｒｅ（商標）プラットフォーム（Advanced ChemTech, Inc. Louisville, KY, USAを参照されたい）が含まれるが、これらに限定されるものではない。以上の装置はいずれも、本発明に使用するのに好適である。本明細書で考察されるように操作可能になるようなこれらの装置に対する変更（もしあれば）の特質および実現は、関連技術分野の当業者には明らかであろう。そのほかに、多くのコンビナトリアルライブラリーが市販されている（たとえば、ComGenex, Princeton, N.J.、Asinex, Moscow, Ru、Tripos, Inc., St. Louis, Mo.、ChemStar, Ltd, Moscow, RU、3D Pharmaceuticals, Exton, Pa.、Martek Biosciences, Columbia, Md.などを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、アッセイ方法の第３の工程は、前記ＴＣＲまたはそのフラグメントへの抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントの結合をモジュレートする前記候補化合物能力を決定することを含む。この場合、前記ＴＣＲまたはそのフラグメントへの前記抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントの結合をモジュレートすることおよび休止Ｔ細胞を活性化できないことは、前記候補化合物が治療用化合物であることの指標となる。候補化合物がＴＣＲまたはそのフラグメントへの抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントの結合をモジュレート可能であるかの決定は、多くの方法で達成可能である。抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントとＴＣＲまたはそのフラグメントとの結合のモジュレーションは、競合結合アッセイにより達成可能である。そのようなアッセイでは、ＴＣＲは、固体基材、たとえば、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの表面上に接着可能である。さまざまな量の抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを対照サンプル中のウェルに添加可能である。試験サンプルでは、さまざまな量の候補化合物が抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントの添加と同時にまたそれに続いて添加される例外は、対照反応と等価な条件で行われる。次いで、試験および対照のウェルを洗浄して結合されていない抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを除去する。次いで、結合された抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントの量は測定し、対応する対照サンプルと比較することが可能である。候補化合物がＴＣＲへの抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントの結合を競合的に阻害した場合、候補化合物が抗ＣＤ３抗体の存在下で休止αβＴ細胞を活性化可能であるかを調べるために、候補化合物をさらに試験する。これは、１つ以上のαβＴＣＲ＋Ｔ細胞と、１つ以上のαβＴＣＲ＋Ｔ細胞上のＣＤ３に結合するように機能可能な抗ＣＤ３抗体またはスーパー抗原と、を接触させることと、αβＴＣＲまたはそのフラグメントへの抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントの結合をモジュレートする候補化合物を添加することと、試験候補化合物の存在または不在で生じるαβＴＣＲ Ｔ細胞活性化の程度または速度を比較することと、により実施可能である。候補化合物が、候補化合物の不在下で生じるαβＴＣＲ＋Ｔ細胞活性化の程度または速度と比較して、抗ＣＤ３抗体の存在下でαβＴＣＲ＋Ｔ細胞活性化の程度または速度を増加させない場合、候補化合物は治療用化合物である。
実施例
以下の実施例は、本発明の特定の例示的実施形態を提供するために示されたものであり、その範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１．ＴＯＬ１０１またはキメラＴＯＬ１０１による治療およびそれらにより治療されたヒトの評価
ＴＯＬ１０１は、ハイブリドーマＴＯＬ１０１ＭＣＢにより産生され、ヒトαβＴＣＲに結合するネズミＩｇＭモノクローナル抗体（特定的にはＩｇＭκ）である。
例示的なＴＯＬ１０１およびＴＯＬ１０１キメラ抗体の製剤
ＴＯＬ１０１およびキメラＴＯＬ１０１は、ＩＶ投与前に注射用無菌水（ＳＷＦＩ）中に再構成してから生理食塩水中に希釈すべく製剤化される凍結乾燥生成物として作製可能である。バイアル入り生成物は、５０〜１５０ｍＭのＬ−アルギニン（たとえば、５０ｍＭ…７５ｍＭ…１００ｍＭ…１２５ｍＭ…１５０ｍＭ）、１〜１０ｍＭのシトレート（たとえば、１．０ｍＭ…２．０ｍＭ…３．０ｍＭ…４．０ｍＭ…５．０ｍＭ…６．０ｍＭ…７．０ｍＭ…８．０ｍＭ…９．０ｍＭ…１０ｍＭ）、２〜８％のマンニトール（ｗ／ｖ）（たとえば、２％…３％…４％…５％…６％…７％…または８％）、０．００５〜０．０５％のＴｗｅｅｎ ８０、ｐＨ７．０（たとえば、０．００５％…０．０１％…０．０２％…０．０３％…または０．０５％）からなる最終製剤を提供するように３ｍＬのＳＷＦＩ中に再構成可能である。
ＴＯＬ１０１およびキメラＴＯＬ１０１の作製
ＴＯＬ１０１およびキメラＴＯＬ１０１は、静脈内（ＩＶ）投与に供すべく再構成および希釈が可能である。ＴＯＬ１０１／キメラＴＯＬ１０１バイアル（たとえば、１４ｍｇの凍結乾燥抗体を有する）は、真空下で密閉可能である。ＴＯＬ１０１およびキメラＴＯＬ１０１は、以下の工程に従って再構成可能である。
１． 必要とされるバイアルの数を計算する（たとえば、０．２８ｍｇ、１．４ｍｇ、７ｍｇ、または１４ｍｇの用量ではバイアル１つ、２８ｍｇの用量ではバイアル２つなど）。
２． 再構成前に各バイアルを室温に達するようにする。
３． 無菌でキャップを除去してゴム栓を露出させる。
４． 殺菌剤またはアルコールスワブで栓を清浄化する。
５． 皮下注射針をバイアルに挿入してバイアルの内圧を解放する。
６． 無菌で第２の針を用いて３ｍＬのＳＷＦＩで各バイアルを再構成してから両方の針を除去する。
７． バイアルを手で４５度の角度で穏やかに６０秒間転動させる。バイアルの上端が材料に接触しない状態を確保する。好ましくは、再構成中、バイアルを振盪したり逆転させたりしない。材料が起泡しないようにする。
８． 気泡が排除されるまで、擾乱させずにバイアルを３分間静置する。そして、
９． 内容物が均一になるまで、２回目としてバイアルを手で６０秒間転動させる。
微粒子状物質がないか再構成溶液を検査すべきである。微粒子状物質が完全に消失しない場合、バイアルは、偏析しているので使用すべきでない。再構成されたＴＯＬ１０１またはキメラＴＯＬ１０１は、正常生理食塩水（ＮＳ）を用いてＩＶ注入バッグ（ポリビニルクロリド、ＰＶＣバッグ）中に１バイアルあたり５０ｍＬに希釈可能である（以下の表７を参照されたい）。バイアルの一部を使用する場合（すなわち、０．２８ｍｇ、１．４ｍｇ、または７ｍｇ）、以上に記載したように全バイアルを３ｍＬのＳＷＦＩで再構成すべきであり、そして適切な体積（すなわち、それぞれ、０．０６ｍＬ（６０μＬ）、０．３ｍＬ、または１．５ｍＬ）の再構成されたＴＯＬ１０１／キメラＴＯＬ１０１をＩＶ注入バッグに移すべきである。注入前、ＩＶバッグを穏やかに逆転させて校正された注入ポンプを介して溶液を混合すべきである。
例示的な注入速度
０．２８ｍｇ用量に対しては０．００４ｍｇ／分、１．４ｍｇ用量に対しては０．０２ｍｇ／分、７および１４ｍｇ用量に対しては０．１ｍｇ／分、および２８ｍｇ用量に対しては０．２ｍｇ／分、および４２ｍｇ以上の用量に対しては０．３ｍｇ／分の一定速度で、特定の用量のＴＯＬ１０１またはキメラＴＯＬ１０１を低速静脈内注入により投与することが可能である（下記表７参照）。したがって、この実施例では、ＴＯＬ１０１またはキメラＴＯＬ１０１は、いずれの用量でも７０分間未満で投与されることはない。任意の中間用量を試験する場合、より低速度を使用することが可能である（たとえば、２８ｍｇ用量に対して０．２ｍｇ／分の速度を使用し、かつ４２ｍｇ用量に対して０．３ｍｇ／分の速度を使用し、かつ中間用量を試験する場合、０．２ｍｇ／分の速度で３５ｍｇ用量を投与することが可能である）。ＴＯＬ１０１またはキメラＴＯＬ１０１は、好ましくは高流量静脈中に投与される。注入の終了時、約２５ｍＬのＮＳでＩＶ系を徐々にフラッシングすべきである。
Figure 2015504419
実施例２．ヒト移植患者の治療
この実施例では、ＴＯＬ１０１モノクローナル抗体によるヒト腎臓移植患者の治療および種々の時間点でのＣＤ３カウント数に関するこれらの患者が試験について説明する。Ｔ細胞の枯渇および／またはモジュレーション（ＣＤ３バイオマーカーにより決定される）は、急性拒絶を予防するので、臓器移植の初期段階で重要である。それに加えて、とくに腎臓移植の場合、移植臓器に対して毒性を有することが知られている維持免疫抑制剤の遅延適用もまた可能である。医者の経験により、５０（ＣＤ３＋カウント数／ｍｍ３）は、最良の長期転帰を提供するようにＴ細胞を低減する必要な上側閾値に対応することが決定された。この実施例では、以下の表８のスケジュールに従って少なくとも６日間にわたり腎臓移植患者に注入を行った。各コホート２名の患者で３つの異なるコホートを試験した。試験投与量は、０．２８ｍｇ、１．４ｍｇ、７．０ｍｇのＴＯＬ１０１抗体であった。これらの用量を７０分間にわたり静脈内に与えた。初回用量を移植手術時に与えて、合計５日間にわたり各患者に毎日１回投与を行った。被験体を麻酔した後かつクランプを解除する前から開始して、初回用量を手術室で与えた（アロ移植片の再灌流）。
ＴＯＬ１０１の最初の２回の投与前にジフェンヒドラミン（５０ｍｇＩＶ）を投与し、ＴＯＬ１０１の最初の３回の投与前に静脈内ステロイドを投与した。後続投与のＴＯＬ１０１は、経口ステロイド投与の後に注入した。また、移植後の最初６日以内に開始して試験の持続期間にわたりタクロリムスを投与した。タクロリムスは、移植後の最初の１ヶ月間にわたり８〜１５ｎｇ／ｍＬの治療域に達してそれを維持するようにかつその後は６〜１２ｎｇ／ｍＬの治療域を維持するように設計された用量で投与された。移植日または翌日かつ試験の持続期間にわたり、１０００ｍｇＢＩＤの最大用量でミコフェノール酸モフェチルを投与した。
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試験の結果から、ＴＯＬ１０１の投与は、腎臓移植患者においてＣＤ３＋Ｔ細胞のカウント数を用量依存的に低減することが示された。
実施例３．ＴＯＬ１０１はＴ細胞を選択的に阻害する
抗αβＴＣＲ抗体ＴＯＬ１０１がｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞の増殖を抑制するかを調べるために、一方向ＭＲＬ反応でＴＯＬ１０１の増殖効果を調べる実験を行った。３名の健常ドナーのバフィーコートからＰＢＭＣを単離した。リンパ球を富化すべく、バフィーコートをＦｉｃｏｌグラジエント上に層状化した。次いで、３０００ｒａｄｓでスティミュレーター細胞に照射した。スティミュレーター細胞およびレスポンダー細胞を２：１の比（（４×１０５）スティミュレーター細胞対２×１０５レスポンダー細胞）で６日間共培養した。細胞の組合せは次のとおりであった。被験体Ｎｏ．１からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．２からの１単位の照射された血液、被験体Ｎｏ．１からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．３からの１単位の照射された血液、被験体Ｎｏ．２からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．１からの１単位の照射された血液、被験体Ｎｏ．２からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．３からの１単位の照射された血液、被験体Ｎｏ．３からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．１からの１単位の照射された血液、被験体Ｎｏ．３からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．２からの１単位の照射された血液。培養時、ＴＯＬ１０１を９μｇ／ｍＬの濃度で添加した。トリチウム化チミジンＨ３を培養物に５日間添加し、６日目にプレートから採取してカウントした。図１は、２つの独立した実験の代表的データを示している。＊＊＊＝ｐ＞．００１。図１に示されるように、ＴＯＬ１０１は、対照と比較して、Ｔ細胞の増殖を有意に抑制することから、アロ免疫反応の阻害が直接示唆される。
他の実験では、ＴＯＬ１０１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏＭＬＲ反応の最初の２４時間の間とくに効果的であることが示された。３名の健常ドナーのバフィーコートからＰＢＭＣを単離した。リンパ球を富化すべく、バフィーコートをＦｉｃｏｌグラジエント上に層状化した。次いで、３０００ｒａｄｓでスティミュレーター細胞に照射した。スティミュレーター細胞およびレスポンダー細胞を２：１の比（４×１０５スティミュレーター細胞対２×１０５レスポンダー細胞）で６日間共培養した。細胞の組合せは次のとおりであった。被験体Ｎｏ．１からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．２からの１単位の照射された血液、被験体Ｎｏ．１からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．３からの１単位の照射された血液、被験体Ｎｏ．２からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．１からの１単位の照射された血液、被験体Ｎｏ．２からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．３からの１単位の照射された血液、被験体Ｎｏ．３からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．１からの１単位の照射された血液、被験体Ｎｏ．３からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．２からの１単位の照射された血液。０時間、２４時間、４８時間、および７２時間の時間でＴＯＬ１０１を添加した。添加されたＴＯＬ１０１の濃度は、０．９μｇ／ｍＬ、９μｇ／ｍＬ、および９０μｇ／ｍＬであった。トリチウム化チミジンＨ３を培養物に５日間添加し、６日目にプレートから採取してカウントした。図２に示されるように、実線は、９μｇ／ｍＬで添加されたＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）を含む培養物の陽性対照増殖に対応する。破線は、ＴＯＬ１０１無添加の培養物からの増殖に対応する。＊＊＝ｐ＞．０５。図２からわかるように、増殖の抑制は、０時間〜２４時間の間で最大が観察された。
他の実験では、ＴＯＬ１０１を液体溶液に添加するかまたは表面上にプレーティングして、Ｔ細胞増殖に及ぼすＴＯＬ１０１の架橋の影響を対照活性化抗体抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）と比較して測定した。３名の健常ドナーのバフィーコートからＰＢＭＣを単離した。リンパ球を富化すべく、バフィーコートをＦｉｃｏｌグラジエント上に層状化した。リンパ球を２×１０５細胞／ウェルの密度で培養した。可溶性ＴＯＬ１０１（９、０．９μｇ／ｍＬ）またはプレート結合ＴＯＬ１０１（９０、９、０．９μｇ／ｍＬ）のいずれかと共に細胞を培養し、一方、陽性対照としてＣＤ３抗体（ＯＫＴ３ ９μｇ／ｍＬ）またはＰＭＡ／イオノマイシンと共に他の細胞を培養した。トリチウム化チミジンＨ３を培養物に５日間添加し、６日目にプレートから採取してカウントした。図３に示されるように、実線は、バックグラウンド増殖に対応する。＊＊＝ｐ＞．０５、＊＊＊＝ｐ＞．００１。抗ＣＤ３、Ｔ１０Ｂ９、および他の抗ＴＣＲ抗体（Brown et al. Clinical Transplantation 10; 607-613 [1996]）と異なり、ＴＯＬ１０１の架橋は、９０μｇ／ｍＬの最高濃度でさえも、マイトジェン性状態（すなわち、Ｔ細胞の増殖の誘発）を引き起こさない。これは、驚くべきことであり、臨床被験体におけるＴＯＬ１０１の安全な利用の可能性を反映するので、臨床適合性である。
他の実験では、抗ＣＤ３で刺激されたＴ細胞に対するＴＯＬ１０１の抑制的活性は調べた。Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）の認識機序は、ペプチドとＭＨＣとの複合体に関与するα鎖およびβ鎖である。関与する遺伝的および細胞的機序は、何百万もの異なるα鎖およびβ鎖の形成をもたらして、広範な病原体範囲を提供する。ＴＣＲの非多型成分、すなわち、ＣＤ３、γ、δ、ε、およびＴＣＲζ鎖二量体は、α鎖およびβ鎖の認識成分をと相互作用する。ＴＣＲのα鎖およびβ鎖に対する公知の細胞内シグナル伝達成分は、存在しない。もっと正確に言えば、ＣＤ３は、Ｔ細胞を活性化するためにＴＣＲによるシグナル伝達機構の使用を含有すると考えられる。たとえば、ＣＤ３分子は、適切なＴＣＲ発現に必要とされるだけでなく、さらには、これらの非多型分子のそれらの細胞内／サイトゾル成分中にユニークなモチーフＩＴＡＭ（免疫レセプターベースチロシン活性化モチーフ）を含有する、不可欠なＴＣＲ成分である。ＣＤ３内に含有されるこれらのＩＴＡＭＳは、Ｔ細胞を活性化するためにＴＣＲにより使用されるシグナル伝達機構である。αβＴＣＲの活性化がＣＤ３媒介シグナル伝達をもたらすプロセスは、不明である。しかしながら、αβＴＣＲシグナルはＣＤ３を介して起こるに違いないと、これまで考えられていた。したがって、抗ＣＤ３抗体の使用により、αβＴＣＲ活性化シグナルの必要性が回避される。この実施例では、３名の健常ドナーのバフィーコートからＰＢＭＣを単離した。リンパ球を富化すべく、バフィーコートをＦｉｃｏｌグラジエント上に層状化した。リンパ球を２ｅ５細胞／ウェルの密度で培養した。可溶性ＴＯＬ１０１（９、０．９μｇ／ｍＬ）と共にまたは陽性対照として抗ＣＤ３（ＯＫＴ３ ９、０．９、０．０９μｇ／ｍＬ）またはＰＭＡ／イオノマイシンと共に、細胞を培養した。２４時間で、ＴＯＬ１０１（９μｇ／ｍＬ）を一群のＯＫＴ３刺激細胞に添加した。トリチウム化チミジンＨ３を培養物に５日間添加し、６日目にプレートから採取してカウントした。図４に示されるように、驚くべきことに、ＴＯＬ１０１は、増殖を引き起こさないだけではなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞の抗ＣＤ３誘発増殖を改善または逆転させた。＊＝ｐ＞．０１、＊＊＝ｐ ＞．０５、＊＊＊＝ｐ＞．００１。
他の実験では、混合リンパ球の集団中でＴＯＬ１０１の結合の特異性を測定した。３名の健常ドナーのバフィーコートからＰＢＭＣを単離した。リンパ球を富化すべく、バフィーコートをＦｉｃｏｌグラジエント上に層状化した。細胞をヒトＡＢ血清により４℃で３０分間ブロックした。次いで、細胞を４℃で次の抗体で３０分間染色した。ＴＯＬ１０１＋抗マウスＩｇＭ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２、ＣＤ６９、およびＣＤ４４。細胞を洗浄し、そしてBD FACS Canto IIで試験した。Flow Joによるデータ解析。図５に示されるデータは、６名の患者に対応する。図５に示されるように、染色プロファイルは、Ｔ細胞に対するＴＯＬ１０１の特異性を示すだけではなく、ＴＯＬ１０１が活性化状態に関係なくＴ細胞に結合することをも例示する（たとえば、活性化およびナイーブＴ細胞の指標となるそれぞれＣＤ６２Ｌ高および低のエクスプレッサーに結合する）。
他の実験では、ＴＯＬ１０１は、図６に示されるように活性化Ｔ細胞に結合することが示された。簡潔に述べると、３名の健常ドナーのバフィーコートからＰＢＭＣを単離した。リンパ球を富化すべく、バフィーコートをＦｉｃｏｌグラジエント上に層状化した。次いで、３０００ｒａｄｓでスティミュレーター細胞に照射した。スティミュレーター細胞およびレスポンダー細胞を２：１の比（４×１０５スティミュレーター細胞対２×１０５レスポンダー細胞）で６日間共培養した。細胞の組合せは、次のとおりであった。被験体Ｎｏ．１からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．２からの１単位の照射された血液、被験体Ｎｏ．１からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．３からの１単位の照射された血液、被験体Ｎｏ．２からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．１からの１単位の照射された血液、被験体Ｎｏ．２からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．３からの１単位の照射された血液、被験体Ｎｏ．３からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．１からの１単位の照射された血液、および被験体Ｎｏ．３からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．２からの１単位の照射された血液。細胞を培養の６日目に分析した。細胞をヒトＡＢ血清と共に４℃で３０分間３０分間ブロックし、次いで、次の抗体で４℃で染色した。ＴＯＬ１０１＋抗マウスＩｇＭ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２、ＣＤ６９、およびＣＤ４４。細胞を洗浄し、そしてBD FACS Canto IIで試験した。データをFlow Joにより解析した。試験の結果から、Ｔ細胞に対するＴＯＬ１０１の特異性がさらに確認される。驚くべきことに、Ｔ細胞活性化後、ＴＣＲがダウンレギュレートされると考えられる事実にもかかわらず、ＴＯＬ１０１は、活性化Ｔ細胞に結合した。したがって、他のＴ細胞抗体と異なり、ＴＯＬ１０１は、活性化状態のいかんを問わずＴ細胞に結合する能力を有する。
ＴＯＬ１０１が活性化Ｔ細胞に結合することを示すことに加えて、ＴＯＬ１０１がＴ細胞の特定のメモリーサブセットに結合可能であるかを調べるために、さらなる実験を行った。３名の健常ドナーのバフィーコートからＰＢＭＣを単離した。リンパ球を富化すべく、バフィーコートをＦｉｃｏｌグラジエント上に層状化した。細胞をヒトＡＢ血清により４℃で３０分間ブロックした。次いで、細胞を４℃で次の抗体で３０分間染色した。ＴＯＬ１０１＋抗マウスＩｇＭ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ。細胞を洗浄し、そしてBD FACS Canto IIで試験した。データをFlow Joにより解析した。このデータは、２つの独立した実験の６名の患者に対応する。図７に示されるように、抗αβＴＣＲ抗体ＴＯＬ１０１は、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞メモリーサブセットの両方に結合する。
メモリーサブセットへのＴＯＬ１０１の結合をさらに調べるために、他の実験では、ＰＢＭＣを３名の健常ドナーのバフィーコートから単離した。リンパ球を富化すべく、バフィーコートをＦｉｃｏｌグラジエント上に層状化した。次いで、３０００ｒａｄｓでスティミュレーター細胞に照射した。スティミュレーター細胞およびレスポンダー細胞を２：１の比（４×１０５スティミュレーター細胞対２×１０５レスポンダー細胞）で６日間共培養した。細胞の組合せは、次のとおりであった。被験体Ｎｏ．１からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．２からの１単位の照射された血液、被験体Ｎｏ．１からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．３からの１単位の照射された血液、被験体Ｎｏ．２からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．１からの１単位の照射された血液、被験体Ｎｏ．２からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．３からの１単位の照射された血液、被験体Ｎｏ．３からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．１からの１単位の照射された血液、および被験体Ｎｏ．３からの１単位の血液＋被験体Ｎｏ．２からの１単位の照射された血液。細胞を培養の６日目に分析した。細胞をヒトＡＢ血清により４℃で３０分間ブロックした。次いで、細胞を４℃で次の抗体で３０分間染色した。ＴＯＬ１０１＋抗マウスＩｇＭ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ。細胞を洗浄し、そしてBD FACS Canto IIで試験した。Flow Joによるデータ解析。図８に示されるように、ＴＯＬ１０１は、一方向ＭＬＲ反応後、ＰＢＭＣのメモリーＴ細胞サブセットおよび活性化Ｔ細胞サブセットに結合する。
他の実験では、抗ＣＤ３抗体を用いてすでに活性化された細胞でＴＯＬ１０１の結合特性を測定した。３名の健常ドナーのバフィーコートからＰＢＭＣを単離した。リンパ球を富化すべく、バフィーコートをＦｉｃｏｌグラジエント上に層状化した。抗ＣＤ３（９μｇ／ｍＬ）または、ＰＭＩ／イオノマイシンを培養時に各ドナーの細胞に添加した。細胞を培養の６日目に分析した。細胞をヒトＡＢ血清で４℃で３０分間ブロック化し、ＴＯＬ１０１で染色した。細胞を洗浄し、BD FACS Canto IIで試験し、Flow Joによりデータを解析した。図９に示されるように、ＴＯＬ１０１は、ＣＤ３活性化細胞およびＰＭＡ／イオノマイシン活性化細胞の両方により高度に結合した。
他の実験では、主要な活性化およびシグナル伝達成分ＺＡＰ７０のリン酸化に及ぼす影響を調べるために、ＴＯＬ１０１を試験した。次の条件に従って、３名の健常ドナーから採取した新鮮血を刺激して活性化後のリン酸化を分析した。無刺激：３７℃で１５分、抗ＣＤ３→ＴＯＬ１０１：抗ＣＤ３ ４℃で１５分、ａＩＧ ３７℃で１５分、ＴＯＬ１０１ ４℃で１５分、ａＩｇＭ ３７℃で１５分、架橋抗ＣＤ３：抗ＣＤ３ ４℃で１５分、ａＩＧ ３７℃で１５分、抗ＣＤ３：抗ＣＤ３ ３７℃で１５分、架橋ＴＯＬ１０１：ＴＯＬ１０１ ４℃で１５分、ａＩｇＭ ３７℃での１５分、およびＴＯＬ１０１：ＴＯＬ１０１ ３７℃で１５分。抗体を９μｇ／ｍＬの濃度で添加した。刺激後、細胞を固定し、透過化し、Ｔ細胞抗体カクテルおよび抗ｐＺａｐ７０（BD Phosflow T cell Activation Kit-Human）で染色した。染色の４時間以内で細胞をBD FACS Canto IIで解析した。Ｚａｐ７０リン酸化および生の蛍光強度値のヒストグラムを図１０に示す。抗ＣＤ３に暴露された２４時間後にＴＯＬ１０１に暴露されたＴ細胞ではＺＡＰ７０リン酸化は低減される。また、ＺＡＰ７０のリン酸化の生の値を図１０に示す。以上に記載したように、ＴＣＲ媒介Ｔ細胞活性化は、ＩＴＡＭ媒介下流シグナル伝達の結果である。ＺＡＰ−７０（タンパク質チロシンキナーゼ）は、ＣＤ３ＩＴＡＭドメインに結合するＳＲＣ相同性２ドメイン（ＳＨ２）を含有する。ＺＡＰ７０の初期活性化に続いて、アダプタータンパク質および酵素のリン酸化が起こり、最終的には、転写因子、たとえば、活性化細胞の核因子（ＮＦＡＴ）、ＦＯＳ、ＪＵＮ、および核転写因子ｋＢ（ＮＦＫＢ）の活性化が起こる。理論により拘束することを望むものではないが、ＴＯＬ１０１が抗ＣＤ３誘発リン酸化ＺＡＰ−７０を低減できることから、ＴＯＬ１０１がそのエピトープに特異的に結合することにより、おそらく、プロテインチロシンホスファターゼ、たとえば、ＰＴＰＮ２２、ＣＤ４５、ＣＤ１４８、ＳＨＰ−１、およびＳＩＴを介して、またはＣＤ３を必要とすることなくαβＴＣＲを細胞シグナリングカスケードにリンクする未知アダプタータンパク質を介して、Ｔ細胞ダウンレギュレーションがもたらされることが示唆される。なんら特定の理論により拘束することを望むものではないが、このタンパク質は、Ｂ細胞レセプターシグナル伝達におけるＣＤ８１およびＣＤ１９と同様に作用しうる。
他の実験では、主要なシグナル伝達成分ＥＲＫのリン酸化に及ぼす影響を調べるために、ＴＯＬ１０１を試験した。次の条件下で、健常ドナーから採取した新鮮血を刺激して活性化後のリン酸化を分析した。無刺激：３７℃で１５分、抗ＣＤ３→ＴＯＬ１０１：抗ＣＤ３ ４℃で１５分、ａＩＧ ３７℃で１５分、ＴＯＬ１０１ ４℃で１５分、ａＩｇＭ ３７℃で１５分、架橋抗ＣＤ３：抗ＣＤ３ ４℃で１５分、ａＩＧ ３７℃で１５分、抗ＣＤ３：抗ＣＤ３ ３７℃で１５分、架橋ＴＯＬ１０１：ＴＯＬ１０１ ４℃で１５分、ａＩｇＭ ３７℃での１５分、およびＴＯＬ１０１：ＴＯＬ１０１ ３７℃で１５分。抗体を９μｇ／ｍＬの濃度で添加した。刺激後、細胞を固定し、透過化し、Ｔ細胞抗体カクテルおよび抗ｐＥＲＫ／ｐ３８（BD Phosflow T cell Activation Kit-Human）で染色した。染色の４時間以内で細胞をBD FACS Canto IIで解析した。ｐＥＲＫ／ｐ３８リン酸化のヒストグラム（図１１Ａ）および平均蛍光強度値（図１１Ｂ）を示す。図１１からわかるように、ＥＲＫ／ｐ３８リン酸化は、抗ＣＤ３刺激の２４時間後にＴＯＬ１０１に暴露された抗ＣＤ３処理Ｔ細胞で増大される。ｐＥＲＫ／ｐ３８のリン酸化の生の値を図１１Ｂに示す。ＥＲＫをはじめとするマイトジェン活性化プロテインキナーゼは、細胞増殖、分化、運動性、および生存を協調的に調節する。共刺激（たとえば、ＣＤ２８刺激の形態で）を含まないＴＣＲ刺激は、通常、Ｔ細胞アネルギーおよびアポトーシスをもたらす。したがって、ＴＯＬ１０１誘発シグナル伝達が生存経路を開始するという知見は、驚くべきことである。理論により拘束することを望むものではないが、これらのデータから、ヒトαβＴＣＲへのＴＯＬ１０１の結合により誘発された新規なシグナル伝達経路の存在が裏付けられる。
他の実験では、主要なシグナル伝達成分ＳＴＡＴ１のリン酸化に及ぼす影響を調べるために、ＴＯＬ１０１に試験した。次の条件下で、健常ドナーから採取した新鮮血を刺激して活性化後のリン酸化を分析した。無刺激：３７℃で１５分、抗ＣＤ３→ＴＯＬ１０１：抗ＣＤ３ ４℃で１５分、ａＩＧ ３７℃で１５分、ＴＯＬ１０１ ４℃で１５分、ａＩｇＭ ３７℃で１５分、架橋抗ＣＤ３：抗ＣＤ３ ４℃で１５分、ａＩＧ ３７℃で１５分、抗ＣＤ３：抗ＣＤ３ ３７℃で１５分、架橋ＴＯＬ１０１：ＴＯＬ１０１ ４℃で１５分、ａＩｇＭ ３７℃での１５分、およびＴＯＬ１０１：ＴＯＬ１０１ ３７℃で１５分。抗体を９μｇ／ｍＬの濃度で添加した。刺激後、細胞を固定し、透過化し、Ｔ細胞抗体カクテルおよび抗ＳＴＡＴ１（BD Phosflow T cell Activation Kit-Human）で染色した。染色の４時間以内にBD FACS Canto IIで細胞を分析した。ＳＴＡＴ１リン酸化のヒストグラム（図１２Ａ）および平均蛍光強度値（図１２Ｂ）を示す。図１２からわかるように、Ｔ細胞をＴＯＬ１０１に暴露した場合、ＳＴＡＴ１リン酸化は増大される。ＳＴＡＴ１結合性サイトカイン（たとえば、ＩＩ型インターフェロン）は、Ｔ細胞増殖および活性化に関連付けられるので、ＴＯＬ１０１の結合によるリン酸化ＳＴＡＴ１の増大は、予想外であった。理論により拘束することを望むものではないが、これまでに記載されたＴ細胞活性化におけるＳＴＡＴ１の役割を超えたＳＴＡＴ１の役割がデータから示唆される。ＳＴＡＴ１のリン酸化の生の値を図１２Ｂに示す。
他の実験では、主要なシグナル伝達成分ＳＴＡＴ３のリン酸化に及ぼす影響を調べるために、ＴＯＬ１０１を試験した。次の条件下で、健常ドナーから採取した新鮮血を刺激して活性化後のリン酸化を分析した。無刺激：３７℃で１５分、抗ＣＤ３→ＴＯＬ１０１：抗ＣＤ３ ４℃で１５分、ａＩＧ ３７℃で１５分、ＴＯＬ１０１ ４℃で１５分、ａＩｇＭ ３７℃で１５分、架橋抗ＣＤ３：抗ＣＤ３ ４℃で１５分、ａＩＧ ３７℃で１５分、抗ＣＤ３：抗ＣＤ３ ３７℃で１５分、架橋ＴＯＬ１０１：ＴＯＬ１０１ ４℃で１５分、ａＩｇＭ ３７℃での１５分、およびＴＯＬ１０１：ＴＯＬ１０１ ３７℃で１５分。抗体を９μｇ／ｍＬの濃度で添加した。刺激後、細胞を固定し、透過化し、Ｔ細胞抗体カクテルおよび抗ＳＴＡＴ３（BD Phosflow T cell Activation Kit-Human）で染色した。染色の４時間以内で細胞をBD FACS Canto IIで解析した。ＳＴＡＴ３リン酸化のヒストグラム（図１３Ａ）および平均蛍光強度（図１３Ｂ）値を示す。図１３からわかるように、ＳＴＡＴ３リン酸化は、抗ＣＤ３処理およびＴＯＬ１０１処理のＴ細胞で同等に増大した。ＳＴＡＴ３のリン酸化の生の値を図１３Ｂに示す。
他の実験では、主要なシグナル伝達成分ＳＴＡＴ５のリン酸化に及ぼす影響を調べるために、ＴＯＬ１０１を試験した。次の条件下で、健常ドナーから採取した新鮮血を刺激して活性化後のリン酸化を分析した。無刺激：３７℃で１５分、抗ＣＤ３→ＴＯＬ１０１：抗ＣＤ３ ４℃で１５分、ａＩＧ ３７℃で１５分、ＴＯＬ１０１ ４℃で１５分、ａＩｇＭ ３７℃で１５分、架橋抗ＣＤ３：抗ＣＤ３ ４℃で１５分、ａＩＧ ３７℃で１５分、抗ＣＤ３：抗ＣＤ３ ３７℃で１５分、架橋ＴＯＬ１０１：ＴＯＬ１０１ ４℃で１５分、ａＩｇＭ ３７℃での１５分、およびＴＯＬ１０１：ＴＯＬ１０１ ３７℃で１５分。抗体を９μｇ／ｍＬの濃度で添加した。刺激後、細胞を固定し、透過化し、Ｔ細胞抗体カクテルおよび抗ＳＴＡＴ５（BD Phosflow T cell Activation Kit-Human）で染色した。染色の４時間以内で細胞をBD FACS Canto IIで解析した。ＳＴＡＴ５リン酸化のヒストグラム（図１４Ａ）および平均蛍光強度値（図１４Ｂ）を示す。図１４からわかるように、ＳＴＡＴ５リン酸化は、Ｔ細胞がＴＯＬ１０１および／または抗ＣＤ３に暴露された時に増大される。ＳＴＡＴ５のリン酸化の生の値を図１４Ｂに示す。
他の実験では、主要なシグナル伝達成分ＳＴＡＴ６のリン酸化に及ぼす影響を調べるために、ＴＯＬ１０１を試験した。次の条件下で、健常ドナーから採取した新鮮血を刺激して活性化後のリン酸化を分析した。無刺激：３７℃で１５分、抗ＣＤ３→ＴＯＬ１０１：抗ＣＤ３ ４℃で１５分、ａＩＧ ３７℃で１５分、ＴＯＬ１０１ ４℃で１５分、ａＩｇＭ ３７℃で１５分、架橋抗ＣＤ３：抗ＣＤ３ ４℃で１５分、ａＩＧ ３７℃で１５分、抗ＣＤ３：抗ＣＤ３ ３７℃で１５分、架橋ＴＯＬ１０１：ＴＯＬ１０１ ４℃で１５分、ａＩｇＭ ３７℃での１５分、およびＴＯＬ１０１：ＴＯＬ１０１ ３７℃で１５分。抗体を９μｇ／ｍＬの濃度で添加した。刺激後、細胞を固定し、透過化し、Ｔ細胞抗体カクテルおよび抗ＳＴＡＴ６（BD Phosflow T cell Activation Kit-Human）で染色した。染色の４時間以内で細胞をBD FACS Canto IIで解析した。ＳＴＡＴ６リン酸化のヒストグラム（図１５Ａ）および平均蛍光強度値（図１５Ｂ）を示す。図１５からわかるように、ＳＴＡＴ６リン酸化は、後続的にＴＯＬ１０１に暴露した場合、抗ＣＤ３処理Ｔ細胞で低減される。ＳＴＡＴ６のリン酸化の生の値を図１５Ｂに示す。
実施例４．腎臓移植患者におけるＴＯＬ１０１漸増試験
初回腎臓移植レシピエントに投与されたＴＯＬ１０１の第２の試験では、安全性および投与の標準尺度を測定した。第２の試験は、初回投与漸増成分に続いてランダム化実対照成分を含む修飾適応設計を有する。試験の最初の部分（パートＡ）は、２つの可能性のある治療用量レベル（ＰＴＤ−ＡおよびＰＴＤ−Ｂ）の同定を目標として、逐次高用量レベルで４〜１４コホート（２〜６被験体／コホート）を登録するように計画する。パートＢは、所要により、標準治療対照としてサイモグロブリンを含むランダム化並行群間設計を用いて、かつ目標集団の腎臓移植患者で安全性およびいくつかの有効性データを集めて、より多くの腎臓移植被験体でＴＯＬ１０１を評価するよう設計する。米国では急性腎臓アロ移植拒絶の予防に最も一般的に使用される誘発剤でありかつこの試験に関与する多くのセンターで標準治療であることから、サイモグロブリンを実対照として選択した。ＴＯＬ１０１投与をトラフタクロリムスレベルに連動させた。試験の概要を図１６に提供する。
Figure 2015504419
０．２８、１．４、７、１４、２８、３２、および４２ｍｇ／日で５〜８日間、さらには１日あたり１４または２１ｍｇから開始して２８および４２ｍｇまでの漸増戦略のＴＯＬ１０１の試験を評価した。最初のコホートを図１７にまとめる。安全の点では、ＴＯＬ１０１は、耐容性が良好あった。これまでに報告された注入反応は、軽度であり、容易に対処された（表９）。重要なこととして、Ｔ細胞モジュレーションが治療レベルまたはその近傍に現われる用量レベルで、急性拒絶は報告されていない。また、血液学的パラメーターは、ＴＯＬ１０１の高安全性プロファイルを裏付ける（表９）。これらの患者におけるＴＯＬ１０１の薬力学的効果の検討から、ＴＯＬ１０１用量に伴って増大する強いＣＤ３モジュレーションが示される（図１８）。＜５０ Ｔ細胞／ｍｍ３の薬力学的目標が２８ｍｇコホートで達成された。アレムツズマブおよびThymoglobulinとは異なり、ＴＯＬ１０１で治療された患者は、メモリーＴ細胞およびナイーブＴ細胞のモジュレーションを示すことから、現在使用されている作用剤と対比してＴＯＬ１０１の有効性が増大しうる。さらに、他のＴＣＲ標的化薬剤とは異なり、ＴＯＬ１０１は、全白血球カウント数を低減することもなければ（非枯渇機序を介するＴＯＬ１０１機能が示唆される）、サイモグロブリンの通常の副作用である血小板レベルに影響を及ぼすこともない。広範なＴ細胞不活性化に加えて、２８ｍｇコホートデータから、ＴＯＬ１０１は、ＣＤ３−ＣＤ２＋Ｔ細胞の存在により決定したときに、Ｔ細胞を枯渇させることなくＣＤ３発現を低減することが示された（図１９）。ＴＯＬ１０１は非枯渇性でありうるが、混合リンパ球反応でアロ反応性を強力に阻害しうる。この作用機序により、ｉｎ−ｖｉｔｒｏで抗アロ抗原反応が強力に予防される（図２０参照）。ＴＯＬ１０１の注入は、いかなる有意なサイトカイン放出症候群の症状もＴＮＦ−αやＩＬ−６の強力な産生も引き起こさなかったことから、以上の表９に概説した臨床安全性プロファイルが裏付けられる。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６（図２１に示される）さらにはＩＬ−Ιβ、ＩＦＮγ、およびＩＬ−２（図示せず）のレベルは、注入後の複数の時間点で決定されつつある。ＴＯＬ１０１治療被験体で、最小量のこれらサイトカインが検出された。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６は、とくに過去のｒＡＴＧデータと比較して、非常に低レベルで検出された。サイトカイン放出症候群は、報告されていない。それに加えて、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０は、ＴＯＬ１０１の注入により増大する。
本明細書に提示されたデータは、ＴＯＬ１０１の安全性および有効性を裏付ける。以上で提示されたｉｎ ｖｉｔｒｏデータと一緒にすると、試験の結果から、ものＴＯＬ１０１は、Ｔ細胞枯渇を引き起こすことなく、炎症性サイトカインの増殖および産生をはじめとするＴ細胞の活性化を阻害することが示される。さらに、メモリー表現型のものを含めてαβＴＣＲ＋Ｔ細胞のすべてのサブセットをモジュレートするＴＯＬ１０１の能力や非枯渇作用機序などの重要な要素は、おそらく、一緒になって、より良好な抗拒絶療法を提供するとともに、移植後リンパ球増殖性障害（ＰＴＬＤ、悪性腫瘍の形態）のリスクを低減する。結論として、ＴＯＬ１０１による被験体の治療は、ＣＤ３＋細胞カウント数が２５ｍｍ３未満に低減され、ＣＤ２＋Ｔ細胞が無αβＴＣＲ／ＣＤ３で現れることにより決定される治療有効性をもたらすので、これらの細胞を枯渇させることがなくαβＴＣＲ＋Ｔ細胞を不活性化させる。ＴＣＲの欠如は、非機能的Ｔ細胞に等しい。
図２２〜２４に示されるように、ＴＯＬ１０１の用量漸増は、治療された被験体において、生物学的利用能の増大（ＡＵＣの付随的増加を含む）、血清中半減期の増大を示し、認知可能な抗マウス抗体反応を示さない。ＴＯＬ１０１用量漸増は、有望な安全性プロファイルを有して行われた。ＴＯＬ１０１は、有意なサイトカイン放出や他の重篤有害イベント（ＳＡＥ）を引き起こすことなく、用量依存性Ｔ細胞モジュレーションを引き起こした。免疫モニタリングにより、枯渇を伴わない特異的標的化機能的不活性化の作用機序が示される。現在使用されている誘発剤よりも増大された特異性および長期にわたる安全性指標を提供するＴＯＬ１０１の可能性が、データから裏付けられる。
図１７に示される投与スケジュールを用いてＴＯＬ１０１を投与した後、フローサイトメトリーを用いてBeckman Coulter Flow-Count Flourospheres手順により全血のＴ細胞カウント数を調べた。Ｆｉｃｏｌｌ分離サンプルでＴ細胞表現型分析を行う。現在の試験では、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ４５ＲＯの発現プロファイルは、図２５〜２７に示されるように本実施例で提供される。手順はすべて、中央研究所で行われる。これらのタンパク質に加えて、次のパラメーターも測定した。ＣＤ３カウント数および免疫表現型解析、サイトカイン産生（ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γ）分析、ＨＡＭＡ分析、および標準的血液学的分析。
図２５に示されるように、ＴＯＬ１０１療法後、フローサイトメトリー分析を行った。図２５Ａ〜２５Ｃに示される。ＣＤ３カウント数のゲート処理戦略を選択した。ビーズ標準（２５Ａ）、リンパ球ゲート処理（２５Ｂ）、およびＣＤ２対ＣＤ３ゲート処理（２５Ｃ）を示す。ＣＤ３カウント数がソリッドボックスにより与えられていることに留意されたい。ＴＯＬ１０１は、用量依存的にＣＤ３カウント数を低減することが示された。ここに提示されたデータから、図２６に示されるように、細胞を枯渇させることがなく細胞表面からＴＣＲ複合体が除去されることが裏付けられる。図１９に示されたＣＤ２＋データに類似して、ＣＤ３を発現する細胞のパーセントは、ＴＯＬ１０１による治療後、劇的に低減され、ＣＤ４＋およびＣＤの８＋細胞の数は、図２６に示されるように依然として正常レベルであった。ＴＯＬ１０１の投与後のＣＤ３枯渇の機序を図２７に模式的に示す。
実施例５．ＴＯＬ１０１漸増試験
漸増投与プロトコルの有効性を試験すべく臨床実験を設計した。ＴＯＬ１０１抗体などのＴＣＲダウンモジュレーション剤が投与された患者における可能性のある副作用、たとえば、皮疹を予防または改善するために、漸増投与を使用した。たとえば、皮疹は、αβＴＣＲ刺激およびそれに続いてすでに形成された貯蔵物、たとえば、とくにグランザイムまたはパーフォリンの放出の結果である。理論的根拠は、本発明を理解するうえで必ずしも必要というわけではないが、低用量のＴＯＬ１０１抗体の使用により、明らか臨床症状をなんら引き起こさない閾値未満のレベルで、すでに形成された貯蔵物のＴ細胞放出が起こり、続いて、より高用量のＴＯＬ１０１抗体により、すでに形成された貯蔵物が使い果たされた後、ＴＣＲダウンモジュレーションが完結し、それにより、臨床症状が予防される。この仮説を試験するために、以下の投与戦略を用いてＴＯＬ１０１抗体を投与した。
Figure 2015504419
２名の患者がこの投与戦略に最初に登録された。両患者は、優れたＴ細胞モジュレーションを呈したが、投与された患者は、いかなる形態の皮疹も他の可能な重篤有害イベントも発症しなかった。まとめると、これらのデータから、皮疹発症および他の重篤有害イベントの低減を試行して生物学的物質を投与する新規な方法が示される。それに加えて、表１０に示される投与戦略は、限定されるものではないが、自己免疫性疾患、炎症性疾患、または移植組織拒絶（たとえば、腎臓移植拒絶反応）をはじめとする広範にわたる疾患に罹患した患者において生物学的物質または抗体（ＴＯＬ１０１のような抗αβＴＣＲ抗体を含む）を投与するうえで有用でありうる。
実施例６．漸増ＴＯＬ１０１投与によるＴｒｅｇ細胞の誘導および／またはアップレギュレーション
ＴＯＬ１０１の組織移植および投与を行った後の臨床血液学的転帰を調べる実験では、一定投与レジメン（すなわち、同一投与量のＴＯＬ１０１ｍＡｂを患者に投与した。たとえば、投与レジメンのそれぞれの日に、０．２８ｍｇ／日、１．４ｍｇ／日、７ｍｇ／日、１４ｍｇ／日、２８ｍｇ／日、または３２ｍｇ／日で）、または１日目に１４ｍｇ、２日目に２１ｍｇ、３日目に２８ｍｇ、４日目に４２ｍｇ、５日目に４２ｍｇ、および６日目に４２ｍｇを含む漸増投与レジメンのいずれかを用いて、ＴＯＬ１０１を患者に投与した。Ｔ細胞、生命徴候、および他の生化学的パラメーターを分析した。ＴＯＬ１０１抗体に加えて、同様に行ったバックグラウンド療法は、以下のものを含んでいた。
１． 静脈内メチルプレドニゾロン、１回目のＴＯＬ１０１投与の前に５００ｍｇ、ならびに２および３回目の投与の前に２５〜２５０ｍｇ
２． 経口プレドニゾン、４回目の投与の前に１００ｍｇ、その後、ステロイド、２０〜３０ｍｇまで漸減させて１４日目まで
３． 静脈内Ｂｅｎａｄｒｙｌ、最初の２回の投与の前に（５０ｍｇ）
４． タクロリムスの毎日の投与を移植の６時間後すぐから開始して、遅くとも移植の６日後まで続ける
５． ミコフェノール酸モフェチルの毎日の投与を移植日または翌日に開始する
被験体を麻酔した後かつクランプを解除する前から開始して、初回用量のＴＯＬ１０１を手術室で与えた（アロ移植片の再灌流）。
この試験では、薬力学的目標は、２５細胞／ｍｍ３未満でＴ細胞カウント数であった。この薬力学的目標は、移植拒絶を予防する所要のＴ細胞モジュレーションを提供するのに十分であると考えられる。漸増投与レジメンは、ベースラインからのＣＤ３カウント数を有意に低減した（表１１）。
Figure 2015504419
各患者のＴｒｅｇＴ細胞（ＣＤ２＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ１２７ｌｏ）の測定を移植の１４日後まで毎日行った。結果を図２８に示す。驚くべきことに、漸増投与レジメンの投与を受ける患者では、Ｔｒｅｇが誘導されたが、３２ｍｇ／日程度の高用量の投与を受けた患者でさえも、治療のそれぞれの日に同一の用量の投与を受けた患者では誘導されなかった。
適応免疫反応中、一般的には、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣ／ペプチド複合体とＴエフェクター細胞のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）との間での相互作用および情報伝達は、ＩＬ−４やＩＦＮ−γなどの炎症誘発性サイトカインの活性化および分泌をもたらす。一方、天然のＴ調節性Ｔ細胞（ＴｒｅｇＴ細胞）の活性化は、とくに、免疫抑制的なサイトカインＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの発現をもたらす。これらのサイトカインは、近傍のエフェクターＴ細胞に直接作用して、いくつかの場合には、アネルギーまたはアポトーシスをもたらす。他の場合には、調節性のサイトカインおよびケモカインは、エフェクターＴ細胞をＴ調節性表現型に変換する。このプロセスは、本明細書では、「誘発」寛容または「適応」寛容として参照される。ＭＨＣ分子に結合可能であるしかも活性化循環ＴｒｅｇＴ細胞に会合可能かつそれを活性化可能であるＴ細胞エピトープは、Ｔｒｅｇエピトープと参照される。本明細書で用いられる場合、ＴｒｅｇＴ細胞の治療のためのおよびＴｒｅｇＴ細胞の細胞数のアップレギュレーションのための種々の方法は、一般的には、機能性ＴｒｅｇＴ細胞、たとえば、表面マーカーＣＤ２＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋およびＣＤ１２７ｌｏを発現するＴｒｅｇＴ細胞を意味する。
髄様上皮細胞が未成熟Ｔ細胞に特異的な自己タンパク質エピトープを発現する初期自己／非自己識別は、新生児発症の際に胸腺で生じる。高親和性を有する自己抗原を認識するＴ細胞は、欠失されているが、中程度の親和性を有する自己反応性Ｔ細胞は、ときには、欠失を回避して、いわゆる天然ＴｒｅｇＴ細胞に変換されうる。これらの天然ＴｒｅｇＴ細胞は、末梢に輸出され、自己免疫の定常的抑制を提供する。天然ＴｒｅｇＴ細胞は、免疫制御および自己寛容の重要な成分である。
自己寛容は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、サイトカイン、および表面レセプターの間の複雑な相互関係により調節される。Ｔ調節性免疫反応は、タンパク質抗原（自己も異種も）に対するＴエフェクター免疫反応を相殺する。自己反応性Ｔエフェクター細胞の数もしくは機能の増大またはＴｒｅｇＴ細胞の数または機能の減少のいずれかにより自己反応性側に向かうバランス傾向は、自己免疫として顕在化される。
第２の寛容形態は、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの存在下で、通常、バイスタンダーＴｒｅｇＴ細胞により供給されて、Ｔ細胞レセプターを介して、活性化時に成熟Ｔ細胞が「適応」ＴｒｅｇＴ細胞表現型に変換される末梢で生じる。これらの「適応」ＴｒｅｇＴ細胞に対する可能な役割としては、アレルギー反応または低レベル慢性感染症により引き起こされうる過剰の炎症の制御手段として浸潤性病原体の奏功的クリアランスの後で免疫反応を弱めること、またはおそらく、有益な共生細菌およびウイルスとの共存を促進することが含まれる。「適応」Ｔｒｅｇ Ｔ細胞はまた、体細胞超突然変異を受けたヒト抗体の生活環の管理にも関与しうる。
また、ＴｒｅｇＴ細胞は、Ｂ細胞寛容の助けになる。Ｂ細胞は、その細胞表面上に単一の低親和性ＦｃレセプターＦｃγＲＩＩＢを発現する。このレセプターは、その細胞質内ドメインに免疫レセプターチロシンベース阻害モチーフ配列（ＩＴＩＭ）を含有する。免疫複合体によるＦＣｙＲＩＩＢとＢＣＲとの共ライゲーションは、ＩＴＩＭのチロシンリン酸化を引き起こすように作用し、イノシトールホスファターゼＳＨＩＰの動員をもたらして、ＭＡＰキナーゼの活性化を妨害することによりＢＣＲ誘発増殖を阻害し、細胞膜からのバートンチロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）の解離により食作用をブロックして、細胞中へのカルシウム流入を阻害する。ＦｃγＲＩＩＢはまた、ＩＴＩＭに依存しないアポトーシスを引き起こしうる。ＩＣによるＦｃＲＩＩＢのホモ凝集の際、Ｂｔｋと細胞膜との会合が促進されて、アポトーシス性反応を引き起こす。ＦｃγＲＩＩＢの発現は、きわめて変動性であり、サイトカイン依存する。活性化Ｔｈ２およびＴｒｅｇＴ細胞により発現されるＩＬ−４およびＩＬ−１０は、相乗的に作用して、ＦｃγＲＩＩＢ発現を促進することにより、体液性応答の抑制を支援することが示されている。
本発明は、患者において特異的漸増用量レジメンを用いて抗αβＴＣＲ抗体ＴＯＬ１０１が投与された患者でＴｒｅｇＴ細胞の予想外の驚くべき治療的アップレギュレーションを提供する。なんら特定の理論により拘束することを望むものではないが、いくつかのアロ反応性または自己反応性の反応に遭遇しているまたは遭遇するであろう患者において、低用量ＴＯＬ１０１抗体を用いると、新規なシグナリングイベント（ＺＡＰ７０ダウンレギュレーション、ＡＫＴおよびＥＲＫモジュレーション、さらには潜在的カルシウムフラックス）のカスケード、さらには低レベルのＩＬ２の産生が誘発されると考えられる。この考えは、低減レベルのＴｒｅｇＴ細胞（Saadoun, D. et al. N. Engl. J. Med, 365(22) 2067-2077）を有するＣ型肝炎ウイルスにより引き起こされた血管炎の患者での試験で裏付けられる。Saadoun et al.に示されるように、低レベルＩＬ２は、ＴｒｅｇＴ細胞誘導を刺激する。数日間にわたり、Ｔｒｅｇ遺伝子は、所定の位置にＴｒｅｇ表現型を有して機能性である。理論により拘束することを望むものではないが、本開示に例示されるように、ＴＯＬ１０１ｍＡｂ用量を増大させるにつれて、ＩＬ２の局所的増加だけでなく、ｉｎ ｖｉｖｏでＴｒｅｇＴ細胞の増殖を支援する一群のユニークな転写因子が開始されると考えられる。ＴＯＬ１０１ｍＡｂの投与に反応して産生されるＩＬ２のレベルは、古典的Ｔ細胞活性化および増殖に必要と通常考えられるよりも低いことは、注目に値する。したがって、ＩＬ２が産生されて、ＴｒｅｇＴ細胞増殖を支援するが、ＩＬ−２のレベルは、サイトカイン放出症候群を引き起こすのに必要なレベル未満である。この点に関して、特異的Ｔｒｅｇ細胞を活用することにより、望ましくない免疫反応を抑制したり、適応ＴｒｅｇＴ細胞を誘導して、アロ反応性反応および自己抗原でチャレンジされた自己免疫性反応を抑制したりすることが可能である。概略図を図２９および３０に示す。この発見は、移植、タンパク質療法、アレルギー、慢性感染、自己免疫、およびワクチン設計に対する治療レジメンおよび抗原特異的療法の設計と密接な関係がある。本明細書に記載の特異的漸増投与レジメンでＴＯＬ１０１ｍＡｂの投与を用いれば、ＴｒｅｇＴ細胞の細胞数の拡張および増大するが可能になり、次に、これを用いて、エフェクター免疫反応を抑制することが可能である。いくつかの実施形態では、ＴＯＬ１０１ｍＡｂは、自己免疫性疾患の症状の発生前、発生時、もしくは発生後、または組織の移植前、移植時、もしくは移植後に、患者に投与される。いくつかの実施形態では、移植手順によるＴＯＬ１０１ｍＡｂの投与は、移植時に開始される。すなわち、同一日、したがって、投与スケジュールの１日目は、移植日である。他の実施形態では、ＴＯＬ１０１は、すでに組織移植を受けた被験体に投与されうる。いくつかの実施形態では、漸増投与レジメンは、１日目に１４ｍｇ、２日目に２１ｍｇ、３日目に２８ｍｇ、４日目に４２ｍｇ、および５日目に４２ｍｇでＴＯＬ１０１を被験体に投与することを含む。他の実施形態では、漸増投与レジメンは、１日目に１４ｍｇ、２日目に２１ｍｇ、３日目に２８ｍｇ、４日目に４２ｍｇ、５日目に４２ｍｇ、および６日目に４２ｍｇでＴＯＬ１０１を被験体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＴＯＬ１０１ｍＡｂの一度の漸増投与が誘導投与のためであることが例証されるので、本明細書に記載のＴＯＬ１０１の漸増投与は、５または６日時間にわたり１回のみ行われると考えられる。
本明細書に記載の漸増投与レジメンを用いた抗αβＴＣＲ抗体ＴＯＬ１０１の投与は、ＴｒｅｇＴ細胞の選択的会合および活性化に役立つ。本明細書では、全身的状況および局限的疾患特異的状況の両方で、望ましくない免疫反応の抑制のために、ＴｒｅｇＴ細胞の既存集団の会合、活性化、および適用が可能であることが実証される。本明細書に記載の漸増レジームを用いて症状発現前投与、症状発現時投与、または症状発現後投与が奏効しうる特異的疾患としては、喘息、アレルギー、アレルギー性気道炎症、アレルギー性脳脊髄炎、自己免疫性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、反応性関節炎、乾癬性関節炎、仙腸骨炎、孤立性急性前部ブドウ膜炎、未分化脊椎関節症、１型糖尿病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、糸球体腎炎、橋本甲状腺炎、グレーブス病、強皮症、免疫調節不全多腺性内分泌症腸疾患Ｘ連鎖症候群（ＩＰＥＸ症候群）、セリアック病、クームス陽性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、乾癬、接触性皮膚炎、グッドパスチャー症候群、アジソン病、ウェゲナー肉芽腫症、尿細管性腎症、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、リウマチ性多発性筋痛症、ベーチェット病、ギラン・バレー症候群、種々の血管炎、ブドウ膜網膜炎、甲状腺炎、重症筋無力症、免疫グロブリン腎症、心筋炎、および進行性全身性硬化症が含まれうるが、これらに限定されるものではない。
いくつかの実施形態では、ＴｒｅｇＴ細胞レベルをアップレギュレートのために本明細書に提供される治療方法は、必要とされる被験体に治療効果を提供する。いくつかの実施形態では、ＴｒｅｇＴ細胞の方法および／またはアップレギュレーションは、前記ＴｒｅｇＴ細胞の被験体ベースラインレベル超でＴｒｅｇＴ細胞のアップレギュレーションを提供する。ベースラインレベルは、治療用ｍＡｂＴＯＬ１０１の投与前に決定可能である。いくつかの実施形態では、ＴｒｅｇＴ細胞のアップレギュレーションとは、一般的には、特定の被験体に対して、ＣＤ２＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ１２７ｌｏである局所または全身循環のＴｒｅｇ細胞の数の増加を意味し、この増加は、ＴＯＬ１０１の漸増投与前のＣＤ２＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ１２７ｌｏのＴｒｅｇＴ細胞のベースライン濃度を基準にして、ベースラインレベルから５％増、または１０％増、または１５％増、または２０％増、または２５％増、または３０％＞増、または５０％＞増である。それにもかかわらず、ＴｒｅｇＴ細胞のアップレギュレーションは、アロ反応性Ｔ細胞に関連付けられる任意の１つ以上の症状または病態のブロック、予防、治療、または抑制、または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性の阻害、またはアロ反応の免疫抑制、または自己免疫反応の阻害、または組織の移植前、移植中、もしくは移植後のアロ反応もしくは自己免疫反応の阻害、予防、もしくはブロック、または移植片対宿主疾患の阻害、抑制、もしくはブロック、または炎症性疾患もしくは自己免疫性疾患で自己免疫反応の予防、治療、もしくは抑制に、治療上有効である。いくつかの実施形態では、被験体、たとえば、ヒトまたは他の哺乳動物被験体は、全身健康状態を調べて、なんらかの既存の自己免疫性疾患または自己組織拒絶もしくはアロ−組織拒絶の好発を確認すべく、治療前に評価可能である。この実施形態では、被験体の血液を採血し、Ｔ細胞また他の白血球計数を行う。また、これらは、行われる予後予測または医学的治療に関連するアロ反応または組織拒絶および自己免疫性疾患の治療前ＴｒｅｇＴ細胞および他のマーカーの濃度をも含みうる。いくつかの実施形態では、被験体に存在する全血１ミリリットルあたりのＴｒｅｇ細胞の濃度は、被験体において全血１ミリリットルあたりＣＤ２＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ１２７ｌｏのＴｒｅｇＴ細胞のベースラインレベルが得られるように投与スケジュールの開始前に決定される。ＴＯＬ１０１ｍＡＢの漸増投与中および終了時、慣例的採血を行って、被験体において全血１ミリリットルあたりのＣＤ２＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ１２７ｌｏのＴｒｅｇＴ細胞の数を調べ、標準的免疫学的方法を用いて、たとえば、ＣＤ２＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞表面マーカーを表現型発現するＴｒｅｇＴ細胞の細胞表面マーカーに特異的な１、２、または３つのカラー免疫蛍光染色を用いたフローサイトメトリーにより、ＴｒｅｇＴ細胞のアップレギュレーションを確認することが可能である。
実施例７．ＴＯＬ１０１の安全性および有効性
腎臓移植患者においてＴＯＬ１０１臨床試験を以上の実施例６で説明したように行った。
安全性パラメーター。一般的な臨床安全性測定、たとえば、異常生命徴候、身体的徴候、および症状、ならびに血清化学または血液学をはじめとする複数の安全性パラメーターをモニターした。適正臨床試験規範ガイドラインを用いて、臓器系に基づいてイベントを有害イベント（ＡＥ）または重篤有害イベント（ＳＡＥ）に分類した。Ｍｅｄｒａ辞書を用いて有害イベントコード化を行った。同一のイベントを２回以上起こした被験体を１つのイベントを起こしたと記録した。システム臓器クラス内で２回以上の有害イベントを起こした被験体をそのシステム臓器クラスで１回のみカウントした。サイトカイン放出症候群を示唆しうる症状を含む免疫安全パラメーターをモニターした。それに加えて、ＴＮＦ、インターフェロン−γ、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキンＩＢ（ＩＬ１）、およびインターロイキン２（ＩＬ２）の血清中レベルを、初回投与の０、２、８、および２４時間後に決定した。ルミネックス技術を用いてサイトカインを測定した。初回投与の０、２、８、および２４時間後さらには４日目、熱量測定アッセイを用いて一酸化窒素レベルも決定した。１４日目および２８日目、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いてヒト抗マウス抗体をベースラインで決定した。ＴＯＬ１０１を一次抗体として使用した。
リンパ球増殖性障害を含む悪性腫瘍の発生を収集した。それに加えて、ＣＭＶ（２８、９０、および１８０日目）、ＢＫＶ（９０および１８０日目）、およびＥＢＶ（２８、９０、および１８０日目）に対してＰＣＲ検出を用いてウイルス血症を調べた。他の重篤感染または日和見感染の発生も収集した。
有効性パラメーター。ＣＤ３＋Ｔリンパ球カウント数に及ぼすＴＯＬ１０１の薬力学的効果により、臨床的有効性を決定した。ＣＤ３＋カウント数が２５／ｍｍ３未満に保持された患者をＴ細胞モジュレーションに成功したとみなしたが、連続投与間隔では、ベースラインから９０％のＣＤ３カウント数の減少で十分であると考えられる。それに加えて、６ヶ月で患者生存、移植片生着、および生検確認急性拒絶（ＢＰＡＲ）を含む伝統的トリプルエンドポイントを決定した。臓器移植後臓器機能障害は、移植後の最初の１週間以内に透析が必要性として定義された。各試験訪問時に推定糸球体濾過率（ＧＦＲ）により腎機能を決定した。１８０日目にイオタラメートクリアランスにより測定ＧＦＲを決定した。９０日目および１８０日目に尿中タンパク対クレアチニン比さらにはドナー特異的抗体（ＤＳＡ）を測定した。
維持免疫抑制。経口またはＩＶミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ、少なくとも７５０ｍｇ毎日２回）からなる維持免疫抑制を移植日に開始した。被験体の病態に依存して試験１日目と試験６日目との間でタクロリムスを開始した。タクロリムスの出発用量は、０．１〜０．２ｍｇ／ｋｇであった。移植後の最初の１ヶ月間、全血中Ｃ０レベルを８〜１５ｎｇ／ｍＬの範囲内に維持するようにタクロリムスの後続用量を個別化した。ＴＯＬ１０１投与中は毎日、１ヶ月目は毎週、ならびに９０および１８０日目、最小タクロリムスＣ０レベル測定を行った。
コルチコステロイドの初回投与は、移植時に５００ｍｇ、２日目に２５０ｍｇ、３日目に１２５ｍｇ、および４日目から０．５ｍｇ／ｋｇ、１ヶ月目まで５〜１０ｍｇ／日に漸減、そして４５日目に５ｍｇ以上／日まで低減し、６ヶ月目まで行った。
抗感染予防。ＣＭＶ＋レシピエントまたはＣＭＶ＋ドナーからの腎臓のレシピエントでは、経口バルガンシクロビル（Valcyte（登録商標））が推奨された。ニューモシスティスカリニ肺炎（ＰＣＰ）の予防のために、経口トリメトプリム／スルファメトキサゾール（ＴＭＰ／ＳＭＸ、Septra SS（登録商標）／バクトリム（Bactrim）（登録商標））が６ヶ月に必要とされた。
ＴＯＬ１０１の投与。ＴＯＬ１０１は、１４ｍｇ凍結乾燥バイアル（Tolera Therapeutics, Inc Kalamazoo, Michigan, USA）中に提供された。被験体は、中心静脈カテーテルを介して、０日目に手術室で開始して少なくとも６回のＴＯＬ１０１投与を受けた。この試験は、表１２にまとめられているように、有効性の一次マーカーとしてのＣＤ３Ｔ細胞カウント数を用いて、ＴＯＬ１０１の漸増用量を試験するように設計された。ＴＣＲ標的化抗体の潜在的免疫刺激能に起因して、使用した初期ＴＯＬ１０１用量は、０．２８ｍｇの計算最小有害生物学的作用レベル（ＭＡＢＥＬ）の１／１０であった。さらなる安全上の要件は、患者間２４時間保持および患者データの定期的安全性データモニタリング委員会審査を含んでいた。Beckman Coulter CD3フローサイトメトリーキットを用いて、センター施設（Neogenomics; Orange County, CA）でＣＤ３カウント数を測定した。投与期間を通じてＣＤ３カウント数が＜２５ Ｔ細胞／ｍｍ３であれば、投与が有効であるとみなした。タクロリムスＣ０レベルが治療的であれば（８〜１５ｎｇ／ｍＬ）、最小６回の投与後にＴＯＬ１０１投与を停止した。
薬動学。１回目の投与後のいくつかの時間点で毎日（０日目）、４回目投与で、最終投与で、および１４日目に、ＴＯＬ１０１の血清中濃度を測定した。マウスＩｇＭに対してＡサンドイッチＥＬＩＳＡを利用した（ABS laboratories, Colombia MI）。コンパートメントモデルを、すべての被験体のすべての観測および用量のデータを含むプールデータセットにあてはめることにより、ＴＯＬ１０１に対する集団薬動学的モデルを開発した。モデリングでは、投与内または投与間で量または注入速度の変化を考慮に入れる。適切なクリアランス値（ＣＬ）および分布容積（ｖ）に関してモデルをパラメーター化する。あてはめられたパラメーターから排出半減期（ｔ１／２）を推定する。ＮＯＮＭＥＭバージョン７．０以降を用いて集団モデリングを行う。目的関数および／またははめあい等級のグラフの改良に基づいて、共変量（年齢、身体サイズ、性別、人種など）をモデル中に組み込む。Ｒバージョン２．１０以降を用いて、観察されたおよびモデルから予測された血清中濃度のグラフを作成する。
統計。１つのコホートあたりの被験体の数は、統計的要件に基づくものではなく、その次の用量レベルに漸増するのに十分な安全性およびＰＤのデータを提供するように意図されたものである。すべての感染、ＡＥ、最大重症度のすべてのＡＥ、薬剤関連ＡＥ、ＳＡＥ、および試験薬剤停止をもたらすＡＥに対して、度数分布表を提示する。定量臨床検査に対しては、各時点で統計のまとめを提示する。サイトカイン放出症候群を呈する被験体のカウント数をまとめて、度数分布表を提示する。測定ＧＦＲおよび推定ＧＦＲの両方を記述統計でまとめる。臓器移植後臓器機能障害およびＢＰＡＲのエピソードを度数分布表にまとめる。尿中タンパク対クレアチニン比およびＤＳＡ評価に対しては、９０日目および１８０日目／ＥＯＳに取得された値で、まとめの統計値を提示する。カプラン・マイヤー積極限手順およびログランク検定を用いて生存曲線を比較し、患者生存および移植片生着を分析する。
結果
患者の特徴。２０１０年２月に患者登録を開始し、米国で６つのセンターで登録を行って、２０１２年４月に終了した。合計２８名の患者は、この第２ａ相試験に登録し、被験体は、表１２に示される漸増ＴＯＬ１０１用量のコホートに入った。登録は、広範な範囲の患者に対応した（表１３）。平均ドナー年齢は、４０歳であった。２４名の被験体は、生体ドナーから腎臓を受け、４名の被験体は、死体ドナーから腎臓を受けた。平均レシピエント年齢は、４４歳であり、これら患者の７９％が男性であった。被験体は、低度〜中度の拒絶のリスクを有する初回腎臓移植レシピエントであった。重要なこととして、登録患者のリスクプロファイルは、用量と共に増加した。最初の４のコホートの患者は、一般に、より低い免疫学的リスクであった。最後の用量漸増コホートは、４つの死体ドナー移植片および３つのアフリカ系アメリカ人レシピエントを含んでいた。末期腎疾患（ＥＲＳＤ）の最も一般的な原因は、多嚢胞性腎疾患（３３％）および糸球体腎炎（３３％）であった。
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重篤有害イベント。３５例の重篤有害イベント（ＳＡＥ）が１１名の被験体で報告されている（表１４）。死亡は、観察されなかった。１名のＳＡＥ以外は全員、試験薬剤と「無関係」とみなされた。おそらく関連するＳＡＥは、院内肺炎であった。他のＳＡＥは、手術および他の非ＴＯＬ１０１関連問題に関連付けられた。
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有害イベント（ＡＥ）。「もしかすると」、「おそらく」、または「明らかに」ＴＯＬ１０１に関連付けられると報告された１８名の被験体の２９例のＡＥを含めて、合計５２１例のＡＥが２８の被験体で報告されている。患者の１５％以上に生じたＡＥを表１５に示す。ＡＥの大多数は、２８、３２、および４２ｍｇ用量コホートで報告された。３名の被験体は、ＡＥ（蕁麻疹様皮疹および掻痒）に起因して薬剤の継続を中断した。これらの各人は、４２ｍｇ用量グループであった。最も一般的に報告された関連ＡＥは、表１５に示されるように、皮疹であった。観察された皮疹は、蕁麻疹様、赤色、隆起、蕁麻疹、および／またはみみずばれ様のようにさまざまに記載された。いかなる場合も、ネクローシスや長期持続性と判定された皮疹はなく、よりの重篤な所見に進行することはなかった。
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必ずしも全部というわけではないが、皮疹を生じた患者のほとんどは、ＴＯＬ１０１の初回投与後に皮疹を生じた（表１６）。すべての場合で、皮疹は、自然に消失したか、またはジフェンヒドラミンによる治療後に典型的には数時間以内に消失した。皮疹は、４２ｍｇコホート以外のいずれの用量レベルでも再発しなかった。再発した時、典型的には、それほど強くはなかったが、連続したＴＯＬ１０１投与を行わなかった。理論により拘束することを望むものではないが、観察された皮疹の１つの潜在的原因は、血管拡張能を有するあらかじめ形成された非古典的可溶性メディエーターのＴ細胞から放出であると考えられる。これらは、あらかじめ形成されたと考えられるので、これらのＴ細胞貯蔵物を使い果たして皮疹発生を低減することを目標として、用量漸増戦略を利用した。表１６に示されるように、用量漸増プロトコルの利用は、皮疹発生を低減した４２ｍｇ投与を可能にした。全体的に、試験の結果から、ＴＯＬ１０１は、安全に投与しうることが示唆された。とくに、漸増投与戦略は、最小限の有害作用に関連付けられた。
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感染および悪性疾患。悪性疾患は、ＴＯＬ１０１の投与を受けた被験体でこれまで報告されていない。表１７は、試験で観測された感染をすべてまとめる。ただ１つの有意な感染は、以上に記載したように、おそらくＴＯＬ１０１に関連付けられると考えられた（院内肺炎）。しかしながら、この患者から培養を行っていないので、確定的な診断および原因物質を同定することはできなかった。皮膚関連感染は、主に、切開創傷細菌感染であり、濾胞炎の症例は、報告されていない。ＢＫウイルス血症の３つの症例が検出され、そのうち２つは、サイモグロブリンレスキューの直後に急性拒絶エピソードに罹患している患者で現れた。ＣＭＶ、ＥＢＶ、日和見性ニューモシスティス性肺炎などの他の重要な感染は、観察されなかった。
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免疫学的安全性パラメーター。ＡＥ表に記載したように、サイトカイン放出症候群に関連付けられる症状は、一般に観察されなかった。症状の欠如は、低レベルのＴＮＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ６、ＩＬ１β、およびＩＬ２（図３１Ａ〜３１Ｅ）により裏付けられた。これらは、検出されなかったか、またはｒＡＴＧが与えられた患者での記載のレベルと対比して低レベルで検出された。さらに、注入反応の指標となる他のおそらく炎症性マーカーは、一酸化窒素（ＮＯ）の産生を含む。ＮＯは、いずれのＴＯＬ１０１治療患者でも検出されなかった。ＴＯＬ１０１はネズミ抗体であるので、ＨＡＭＡの検出は、試験の重要な部分であった。移植の０、１４、および２８日後、ＨＡＭＡ発症に関して、サンプルを評価した。１名の患者以外ではすべて、ＨＡＭＡは検出されなかった（図３１Ｆ）。陽性ＨＡＭＡサンプルを有する１名の患者の力価は、１／１００であった。Ｔ１０Ｂ９、ＯＫＴ３、およびＢＭＡ−０３１およびを含めて、他の抗ＴＣＲ抗体またはＣＤ３抗体は、患者の３０％超でＨＡＭＡを誘発し、いくつかの試験では、ＨＡＭＡの発生率が８０％と報告されているので、ＨＡＭＡの低い発生率は、驚くべき結果であった（Waid et al. Transplantation 64; 274-281 [1997]）。理論により拘束することを望むものではないが、ＨＡＭＡの低い発生率は、抗体の新規な作用機序および／または抗体の翻訳後修飾（グリコシル化など）を反映すると考えられる。
薬力学的ＣＤ３モジュレーション。末梢血ＣＤ３Ｔ細胞カウント数を投与中に毎日測定した。５日間１日１回（６回投与）、または治療的タクロリムスレベル（８−１５ｎｇ／ｍｌ）が達されるまで、ＴＯＬ１０１の投与を行った。６名の患者では、ＴＯＬ１０１の６回超の投与が必要であった。しかしながら、これらはどれも、ＴＯＬ１０１がＣＤ３抑制目標を満たしたコホートではなかった。すべての患者で、ＣＤ３発現細胞を含めて、白血球カウント数の初期低減が移植直後に観察された。これは、静脈内ステロイド注入を受けた患者では一般に観察される。０．２８、１．４、７、および１４ｍｇのＴＯＬ１０１の投与を受けた患者では、４８〜７２時間以内に、循環ＣＤ３カウント数は、２５／ｍｍ３目標によりも増加した（図３２）。２８ｍｇコホートでは、３日目にＣＤ３数のスパイクに遭遇した１名の患者を除いて、ＣＤ３カウント数は、依然として２５／ｍｍ３を下回った状態を維持した。２８ｍｇは有望な用量レジメンであるように思われたが、１つの潜在的異常値があったので、３２ｍｇおよび４２ｍｇへのＴＯＬ１０１の増量を行うきっかけとなった。これらの投与レジメンの両方では、ロバストなＣＤ３抑制が達成された。しかしながら、３２ｍｇおよび４２ｍｇコホートの患者のそれぞれ５０％および１００％で、皮疹が観察された。理論により拘束することを望むものではないが、皮疹は、あらかじめ形成されたＴ細胞可溶性メディエーター放出の結果であろうことが確認された。したがって、発症レベル以下でこれらの貯蔵物を使い果たすことに重点を置いた用量漸増戦略を行った。この投与レジメンでは、投与は、１４ｍｇで開始され、４回目の投与による４２ｍｇまで、急速に増加させた。この投与レジメン、皮疹発症の傾向を低減しただけでなく、さらには薬力学的目標を満たして、ロバストなＣＤ３抑制をもたらした。
ＴＯＬ１０１投与後、ＣＤ３発現の回復は、１４日目までにすべての患者で生じることが観察された（図３２）。この回復は、非枯渇作用機序の証拠となり、投与中に白色白血球カウント数の減少が見られなかった観測からも裏付けられる。
薬動学。ＯＫＴ３および他の抗ＴＣＲ療法に類似して、ＴＯＬ１０１の排出は、その標的タンパク質への結合を介して主に媒介されると考えられる。薬動学的観測から、ロバストなＣＤ３抑制が達成された（すなわち、２８、３２、４２ｍｇおよび用量漸増コホート；３２）コホートでは、ＴＯＬ１０１の半減期は、２３〜２９時間の範囲内であった（表１８）。ＴＯＬ１０１のピーク濃度は、投与の３日後に達成されたことから、おそらく、この時点で標的飽和であることが示唆される。
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有効性複合トリプルエンドポイント。試験で報告された移植片機能損失の患者は、存在しなかった（図３３Ａ）。３名の被験体は、もしかすると試験薬剤に関連付けられると記載された生検確認急性拒絶エピソードに遭遇した。すべての拒絶エピソードは、ステロイドまたはサイモグロブリンで治療されて、移植片機能損失を伴うことなく臨床的に消散された。ドナー特異的抗体は、試験に登録されたいずれの患者でも検出されていない。
腎機能。臓器移植後臓器機能障害は、試験で観察されなかった。試験全体にわたり腎機能は、改善し、すべての患者で観測された推定ＧＦＲの増加が見られた（図３３Ｂ）。それに加えて、移植片後１８０日目のイオタラメートクリアランスを用いて計算されちＧＦＲは、急性拒絶イベントを受けたものを含めて、すべての患者にわたって優れたクレアチニンクリアランスを示した（図３３Ｃ）。
実施例８．ＴＯＬ１０１の特異性
６名の独立したドナーの末梢血単球（ＰＢＭＣ）を用いて、ＴＯＬ１０１が結合する精密Ｔ細胞サブセットを決定した。ＴＯＬ１０１は、ＣＤ３＋Ｔ細胞をのみ標識し、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方に結合した（図３４）。重要なこととして、ＴＯＬ１０１は、ＣＤ１４（単球系列／ＮＫ細胞）を発現する細胞であるγδＴ細胞にもＢ細胞にも結合しなかった（図３４）。したがって、ＴＯＬ１０１は、αβＴ細胞に特異的である。さらに、ＴＯＬ１０１と共にプレインキュベートしたところ、他のαβＴＣＲ抗体ＩＰ２６の結合をブロックしたことから、αβＴ細胞に対するＴＯＬ１０１の特異性をさらに実証された。ＴＣＲのα鎖に特異的な抗体は、ＴＯＬ１０１結合を阻害したが、β鎖抗体は、ＴＯＬ１０１結合の阻害をそれほど示さなかった。したがって、ＴＯＬ１０１は、優先的にＴＣＲのα鎖に結合するように思われる。
実施例９．ＴＯＬ１０１のシグナル伝達およびｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒｅｇ誘導
１方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を用いて、ＴＯＬ１０１媒介Ｔ細胞阻害をさらに調べた。この実験では、３名の健常ドナーのバフィーコートからＰＢＭＣを単離した。リンパ球を富化すべく、バフィーコートをＦｉｃｏｌグラジエント上に層状化した。次いで、３０００ｒａｄｓでスティミュレーター細胞に照射した。スティミュレーター細胞およびレスポンダー細胞を２：１の比（４ｅ５スティミュレーター細胞対２ｅ５レスポンダー細胞）で７日間共培養した。細胞の組合せは、次のとおりでにあった。ユニット１＋ユニット２ｉｒｒ（Ａｂ）、ユニット１＋ユニット３ｉｒｒ（Ａｃ）、ユニット２＋ユニット１ｉｒｒ（Ｂａ）、ユニット２＋ユニット３ｉｒｒ、ユニット３＋ユニット１ｉｒｒ（Ｃａ）、ユニット３＋単位２ｉｒｒ（Ｃｂ）。培養時、ＴＯＬ１０１を９μｇ／ｍＬの濃度で添加した。培養の最後の２４時間、ブレフェルジンを添加した。細胞を採取し、細胞外抗原に対して染色し、固定で、透過化し、細胞内サイトカインに対して染色した。図３５でのグラフは、ＩＦＮ−γを発現するＣＤ４Ｔ細胞のパーセントを示している。得られた臨床データを裏づけるものとして、ＴＯＬ１０１は、多くの個別患者の一方向ＭＬＲでＴ細胞の２型インターフェロンを阻害した。
実施例３に記載されるように、ＴＯＬ１０１は、リン酸化ＥＲＫのレベルを増加し（図１１）、リン酸化ＺＡＰ７０のレベルを低下させる（図１０）ことが示された。Ｔ細胞のＥＲＫリン酸化は、一般に、ＣＤ２８経路を含めて、Ｔ細胞共刺激経路に関連付けられる。ＴＯＬ１０１が共刺激誘発Ｔ細胞増殖を阻害するかを調べる実験を行った。３名の健常ドナーのバフィーコートからＰＢＭＣを単離した。リンパ球を富化すべく、バフィーコートをＦｉｃｏｌグラジエント上に層状化した。リンパ球を２ｅ５細胞／ウェルの密度で培養した。ＴＯＬ１０１（９μｇ／ｍＬ）、プレート結合ＣＤ２８（１μｇ／ｍＬ）、ならびにプレート結合ＣＤ２８（１μｇ／ｍＬ）およびＴＯＬ１０１（９μｇ／ｍＬ）と共に細胞を培養した。Ｈ３を培養物に４日間添加し、５日目にプレートから採取してカウントした。図３６からわかるように、ＴＯＬ１０１は、ＣＤ２８媒介増殖を阻害できなかった。
ＺＡＰ７０およびＥＲＫに加えて、Ｔ細胞活性化の他の指示は、カルシウムフラックスである。カルシウムの持続増加は、ホスファターゼカルシニューリンの活性化をもたらす。カルシニューリンは、ＮＦ−ＡＴを含むいくつかの転写因子を調節する。ＴＯＬ１０１がカルシウム放出を引き起こすかを調べるために、４名の健常ドナー（０、Ｐ、Ｑ、およびＲ）のバフィーコートからＰＢＭＣを単離した。図３７では、リンパ球を富化すべく、バフィーコートをＦｉｃｏｌグラジエント上に層状化した。各ドナーの５ｅ５細胞を３７℃で１時間にわたり抗ＣＤ４で染色した。細胞を洗浄し、Ｆｌｕｏ−４直接カルシウムアッセイ試薬溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ｆ１０４７１）で処理し、３７℃で３０分間そして室温で３０分間インキュベートした。細胞をＬＳＲで６００秒間試験した。Ｔ＝９０秒、２０μＬの培地単独、または各２０μＬの９μｇ／ｍＬ ＴＯＬ１０１および９μｇ／ｍＬ抗マウスＩｇＭ、または２０μＬの９μｇ／ｍＬ ＣＤ３および９μｇ／ｍＬ抗マウスＩｇＧ、または２０μＬの１μｇ／ｍＬイオノマイシンをチューブに添加し、ピペットで穏やかに上下させてから、取得を継続した。驚くべきことに、ＴＯＬ１０１は、抗ＣＤ３とは異なり、ＣＤ４Ｔ細胞のわずか約１５％でカルシウムフラックスを引き起こし、結果として、本質的にすべてのＣＤ４Ｔ細胞でカルシウムフラックスを生じた（図３７）。理論により拘束することを望むものではないが、ＴＯＬ１０１の結合によりカルシウムフラックスを引き起こす小数のＣＤ４Ｔ細胞は、ＴｒｅｇになるＴ細胞に対応すると考えられる。
カルシウムフラックスに加えて、リン酸化熱ショックタンパク質２７（ＨＳＰ２７）、ＡＫＴ−２、およびＭＡＰＫ活性化プロテインキナーゼを、ＴＯＬ１０１処理Ｔ細胞で調べた（図３８）。この実験では、健常ドナーのバフィーコートからＰＢＭＣを単離した。リンパ球を富化すべく、バフィーコートをＦｉｃｏｌグラジエント上に層状化した。細胞は、次の条件、すなわち、無処理、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）９μｇ／ｍＬ＋抗マウスＩｇ１０μｇ／ｍＬ、ＴＯＬ１０１ ９μｇ／ｍＬ＋抗マウスＩｇＭ１０μｇ／ｍＬの１つの下に３７度で１時間維持された。１時間後、細胞を洗浄し、そして溶解させた。ＲＤヒトホスホＭＡＰＫアレイを用いて、２００μｇのタンパク質／サンプルを処理した。ストレプトアビジン−ＨＲＰおよび化学発光検出を用いて、タンパク質のリン酸化を検出した。露出および発色させた膜の写真およびＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いたピクセル強度の定量を図３８に示す。図３８に示されるように、ＨＳＰ２７は、処理グループ間で異ならなかった。Ｐ３８ａに対する潜在的傾向が観察されてきたが、それは有意ではなかった。最も顕著なのは、リン酸化ＡＫＴ２のレベルが、ＴＯＬ１０１処理ＰＢＭＣでは有意量で見いだされたが、抗ＣＤ３ＰＢＭＣまたは対照ＰＢＭＣでは発見されなかったという観測であった。まとめると、これらのデータは、ＴＣＲに結合した時にＴＯＬ１０１により開始されるユニークなモジュレーション経路をさらに際立たせる。
以上に記載したように、ＴＯＬ１０１の漸増用量で治療された臨床患者でのＴｒｅｇの誘導は、予想外であった（図２８）。さらに、ＥＲＫの増大を含めて、ＴＯＬ１０１により引き起こされるシグナル伝達イベントは、Ｔｒｅｇの増殖を阻害すると記載されてきた。さらにこれらの結果を調べるために、Ｔｒｅｇを誘導するＴＯＬ１０１の能力をｉｎ−ｖｉｔｒｏでさらに調べられた。３名の健常ドナーのバフィーコートからＰＢＭＣを単離した。リンパ球を富化すべく、バフィーコートをＦｉｃｏｌグラジエント上に層状化した。ｉｎ ｖｉｖｏアロ移植片移植患者に対応する二方向ＭＬＲ培養を１：１の比の４ｅ５細胞／ドナーで構成した。臨床実験投与を反映するように漸増濃度でＴＯＬ１０１と共に細胞を培養した。漸増濃度のＴＯＬ１０１（９、１８、３６、７２、および１２０μｇ／ｍＬ）、一定濃度のＴＯＬ１０１（９μｇ／ｍＬ）、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）、または培地単独を培養物に添加した。培養下で５日後、細胞を採取し、洗浄し、ブロックし、細胞外抗原で染色し、固定し、透過化し、細胞内Ｆｏｘｐ３を染色した。細胞をフローサイトメトリーにより捕集し、 Flow Joで分析した。ドットプロットは、３つの反応（Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ）を表す。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ１２７ｌｏ表現型を有するＴｒｅｇは、ｉｎ ｖｉｖｏで抑制活性を有することがすでに示されており、図３９に示されるようにゲート処理した。注目すべき点として、漸増用量のＴＯＬ１０１で処理された培養物は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ１２７ｌｏＴｒｅｇが富化された。抗ＣＤ３処理培養物は、数的にはより多くのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ１２７ｌｏを有しているが、有意なＣＤ１２７ｈｉ集団もまた存在したことから、それはエフェクターＴ細胞であると考えられる。これらのエフェクターＴ細胞は、アロ移植拒絶および自己免疫を引き起こすうえではできわめて効果的である。まとめると、試験の結果から、予想外なことに、シグナル２（共刺激）を伴わないシグナル１（ＴＣＲ刺激）を示唆する定説とは対照的に、Ｔ細胞アネルギーおよび死亡をもたらし、ＴＯＬ１０１により提供されたユニークなシグナル１は、Ｔ細胞枯渇や死亡をもたらさない。理論により拘束することを望むものではないが、αβＴＣＲへのＴＯＬ１０１は、Ｔ細胞生存に重要であることが知られているＡＫＴおよびＥＲＫを含めて、タンパク質のリン酸化を引き起こし、生存シグナルが、カルシウム誘発シグナル伝達と組み合わされて、Ｔｒｅｇの誘導をもたらすと考えられる。
実施例１０．ＴＯＬ１０１ＳｃＦＶ
この実験では、ＴＯＬ１０１の一連の１０個の異なる小鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を発現する修飾ＣＤＲをＥ．コリ（E.coli）中で発現させた。１０個のｓｃＦｖの１つは、高発現プロファイル（図４０）を呈した。また、概略図およびこのｓｃＦｖのアミノ酸配列（配列番号９）を図４０に示す。ｓｃＦｖは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方にｉｎ ｖｉｔｒｏ結合したことから（図４０）、Ｔ細胞結合能と高発現レベルとを兼備したＴＯＬ１０１ｓｃＦｖを産生可能であるが示唆される。
本出願に挙げた出版物および特許はすべて、参照により本明細書において援用される。本発明に係る記載の方法および組成物の種々の修正形態および変更形態は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者に自明なものであろう。特定の好ましい実施形態に関連させて本発明を説明してきたが、特許請求された本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるものではないことを理解すべきである。実際上、本発明を実施するための記載の形態の種々の修正形態のうち関連分野の当業者に自明なものは、次の特許請求の範囲内に含まれるものとみなされる。

Claims (49)

  1. αβＴＣＲに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ハイブリドーマＴＯＬ１０１ＭＣＢにより産生される抗体と等価なアミノ酸残基でグリコシル化される、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. Ｔ細胞上に発現されたαβＴＣＲに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、αβＴＣＲへの前記抗体またはその抗原結合フラグメントの結合が、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−２、およびインターロイキン−６からなる群から選択されるサイトカインの産生を前記Ｔ細胞で誘導しない、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  3. Ｔ細胞上のαβＴＣＲに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、αβＴＣＲへの前記抗体またはそのフラグメントの結合が、前記Ｔ細胞上のαβＴＣＲおよびＣＤ３の表面発現を低減し、かつ前記Ｔ細胞を枯渇させない、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  4. Ｔ細胞上のαβＴＣＲに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、αβＴＣＲへの前記抗体またはその抗原結合フラグメントの結合が、前記Ｔ細胞のＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化を誘導する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  5. Ｔ細胞上のαβＴＣＲに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、αβＴＣＲへの前記抗体またはその抗原結合フラグメントの結合が、フローサイトメトリーにより測定したとき、αβＴＣＲ＋Ｔ細胞の２０％未満でカルシウムフラックスを引き起こす、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  6. 前記カルシウムフラックスがαβＴＣＲ＋Ｔ細胞の１５％未満で引き起こされる、請求項５に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  7. Ｔ細胞上のαβＴＣＲに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体または抗原結合フラグメントの架橋が、前記Ｔ細胞の増殖を引き起こさない、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  8. ハイブリドーマＴＯＬ１０１ＭＣＢにより産生された抗体の、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  9. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号３、４、および５を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  10. 前記抗体のアミノ酸配列またはそのフラグメントが、配列番号６、７、および８を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  11. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ネズミ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、およびＦ（ａｂ）’フラグメントからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  12. ハイブリドーマＴＯＬ１０１ＭＣＢにより産生された単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  13. 前記抗体またはフラグメントが、放射性同位体、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、ビオチン、または毒素からなる群から選択される検出可能標識にカップリングされる、請求項１〜７および１２のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  14. 炎症性疾患、自己免疫性疾患、または移植組織拒絶を治療する方法であって、請求項１〜７または１２のいずれか一項に記載の治療上有効量の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを必要とされるヒト患者に投与することを含む、方法。
  15. 前記炎症性疾患、自己免疫性疾患、または移植組織拒絶が、喘息、アレルギー、アレルギー性気道炎症、アレルギー性脳脊髄炎、自己免疫性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、反応性関節炎、乾癬性関節炎、仙腸骨炎、孤立性急性前部ブドウ膜炎、未分化脊椎関節症、１型糖尿病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、糸球体腎炎、橋本甲状腺炎、グレーブス病、強皮症、セリアック病、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、乾癬、接触性皮膚炎、グッドパスチャー症候群、アジソン病、ウェゲナー肉芽腫症、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、リウマチ性多発性筋痛症、ベーチェット病、ギラン・バレー症候群、種々の血管炎、ブドウ膜網膜炎、甲状腺炎、重症筋無力症、免疫グロブリン腎症、心筋炎、進行性全身性硬化症、臓器移植拒絶、混合性結合組織拒絶、および移植片対宿主病からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記自己免疫性疾患が１型糖尿病または多発性硬化症である、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記移植組織拒絶が臓器移植拒絶または移植片対宿主病を含む、請求項１４に記載の方法。
  18. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＥＬＩＳＡにより測定したとき、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが投与された前記ヒト患者の２０％未満でＨＡＭＡ反応を引き起こす、請求項１４に記載の方法。
  19. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＥＬＩＳＡにより測定したとき、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが投与された前記ヒト患者の１０％未満でＨＡＭＡ反応を引き起こす、請求項１４に記載の方法。
  20. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＥＬＩＳＡにより測定したとき、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが投与された前記ヒト患者の５％未満でＨＡＭＡ反応を引き起こす、請求項１４に記載の方法。
  21. 炎症性疾患、自己免疫性疾患、または移植組織拒絶でＴ細胞免疫反応を阻害する方法であって、請求項１〜７または１２のいずれか一項に記載の治療上有効量の抗体またはその抗原結合フラグメントを必要とされるヒト患者に投与することを含む方法。
  22. 前記炎症性疾患、自己免疫性疾患、または移植組織拒絶が、喘息、アレルギー、アレルギー性気道炎症、アレルギー性脳脊髄炎、自己免疫性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、反応性関節炎、乾癬性関節炎、仙腸骨炎、孤立性急性前部ブドウ膜炎、未分化脊椎関節症、１型糖尿病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、糸球体腎炎、橋本甲状腺炎、グレーブス病、強皮症、セリアック病、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、乾癬、接触性皮膚炎、グッドパスチャー症候群、アジソン病、ウェゲナー肉芽腫症、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、リウマチ性多発性筋痛症、ベーチェット病、ギラン・バレー症候群、種々の血管炎、ブドウ膜網膜炎、甲状腺炎、重症筋無力症、免疫グロブリン腎症、心筋炎、進行性全身性硬化症、臓器移植拒絶、混合性結合組織拒絶、および移植片対宿主病からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記自己免疫性疾患が１型糖尿病または多発性硬化症である、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記移植組織拒絶が臓器移植拒絶または移植片対宿主病を含む、請求項２１に記載の方法。
  25. 単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する方法であって、
    ｉ．ハイブリドーマＴＯＬ１０１ＭＣＢにより産生された抗体の、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列で哺乳動物宿主細胞をトランスフェクトすることと、
    ｉｉ．前記宿主細胞を培養することと、
    ｉｉｉ．前記抗体またはその抗原結合フラグメントを単離することと、
    を含み、
    前記抗体またはその抗原結合フラグメントがＴ細胞上に発現されたαβＴＣＲに結合し、かつαβＴＣＲへの前記抗体またはその抗原結合フラグメントの結合が、前記Ｔ細胞上のαβＴＣＲおよびＣＤ３の表面発現を低減し、かつＴ細胞を枯渇させない、方法。
  26. 前記ポリヌクレオチド配列が配列番号３および４を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記ポリヌクレオチド配列が配列番号５をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 請求項２５に記載の方法により産生された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  29. 前記抗体がＴＯＬ１０１である、請求項２７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  30. αβＴＣＲに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する単離されたハイブリドーマ細胞系であって、前記ハイブリドーマ細胞系がＴＯＬ１０１ＭＣＢである、単離されたハイブリドーマ細胞系。
  31. 自己免疫性疾患、炎症性疾患、または移植組織拒絶を治療する方法であって、前記方法が、抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを約７ｍｇ／日〜約５８ｍｇ／日の量で必要とされる被験体に投与することを含み、前記抗体がハイブリドーマＴＯＬ１０１ＭＣＢから産生される、方法。
  32. 自己免疫性疾患、炎症性疾患、または移植組織拒絶を治療する方法であって、前記方法が、抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを約７ｍｇ／日〜約５８ｍｇ／日の量で必要とされる被験体に投与することを含み、前記抗体がαβＴＣＲに結合する、方法。
  33. 前記抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントが、７ｍｇ／日、１４ｍｇ／日、２１ｍｇ／日、２８ｍｇ／日、３０ｍｇ／日、３２ｍｇ／日、３４ｍｇ／日、３５ｍｇ／日、３６ｍｇ／日、３８ｍｇ／日、４０ｍｇ／日、４２ｍｇ／日、４４ｍｇ／日、４６ｍｇ／日、４８ｍｇ／日、５０ｍｇ／日、５２ｍｇ／日、５４ｍｇ／日、５６ｍｇ／日、もしくは５８ｍｇ／日、またはそれらの組合せの量で投与される、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントが１４ｍｇ／日の量で投与される、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントが２８ｍｇ／日の量で投与される、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントが３２ｍｇ／日の量で投与される、請求項３３に記載の方法。
  37. 前記抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントが３５ｍｇ／日の量で投与される、請求項３３に記載の方法。
  38. 前記抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントが４２ｍｇ／日の量で投与される、請求項３３に記載の方法。
  39. 必要とされる被験体において炎症性疾患、自己免疫性疾患、または移植組織拒絶を治療する方法であって、前記方法が、１日目に１４ｍｇ、２日目に２１ｍｇ、３日目に２８ｍｇ、４日目に４２ｍｇ、５日目に４２ｍｇ、および６日目に４２ｍｇを含む投与スケジュールで抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを投与することを含む、方法。
  40. 必要とされる被験体において炎症性疾患、自己免疫性疾患、または移植組織拒絶を治療する方法であって、前記方法が、１日目に１４ｍｇ、２日目に２１ｍｇ、３日目に２８ｍｇ、４日目に４２ｍｇ、および５日目に４２ｍｇを含む投与スケジュールで抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを投与することを含む、方法。
  41. 前記抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントが１日１回投与される、請求項３９または４０に記載の方法。
  42. 前記炎症性疾患、自己免疫性疾患、または移植組織拒絶が、喘息、アレルギー、アレルギー性気道炎症、アレルギー性脳脊髄炎、自己免疫性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、反応性関節炎、乾癬性関節炎、仙腸骨炎、孤立性急性前部ブドウ膜炎、未分化脊椎関節症、１型糖尿病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、糸球体腎炎、橋本甲状腺炎グレーブス病、強皮症、セリアック病、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、乾癬、接触性皮膚炎、グッドパスチャー症候群、アジソン病、ウェゲナー肉芽腫症、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、リウマチ性多発性筋痛症、ベーチェット病、ギラン・バレー症候群、種々の血管炎、ブドウ膜網膜炎、甲状腺炎、重症筋無力症、免疫グロブリン腎症、心筋炎、進行性全身性硬化症、臓器移植拒絶、混合性結合組織拒絶、および移植片対宿主病からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記炎症性疾患、自己免疫性疾患、または移植組織拒絶が１型糖尿病または多発性硬化症である、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記移植組織拒絶が、臓器移植拒絶、混合性結合組織拒絶、または移植片対宿主病を含む、請求項４１に記載の方法。
  45. 必要とされる被験体においてＴｒｅｇＴ細胞をアップレギュレートする方法であって、前記方法が、１日目に１４ｍｇ、２日目に２１ｍｇ、３日目に２８ｍｇ、４日目に４２ｍｇ、５日目に４２ｍｇ、および６日目に４２ｍｇを含む投与スケジュールで、抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを投与するを含む、方法。
  46. 必要とされる被験体においてＴｒｅｇＴ細胞を誘導する方法であって、前記方法が、１日目に１４ｍｇ、２日目に２１ｍｇ、３日目に２８ｍｇ、４日目に４２ｍｇ、および５日目に４２ｍｇを含む投与スケジュールで、抗αβＴＣＲ抗体またはその抗体フラグメントを投与するを含む、方法。
  47. 前記ＴｒｅｇＴ細胞の表現型が、ＣＤ２＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ１２７ｌｏである、請求項４５または４６に記載の方法。
  48. 前記被験体が、アロ反応性Ｔ細胞の阻害、または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性の阻害、またはアロ反応の免疫抑制、または自己免疫反応の阻害、または組織の移植前、移植中、もしくは移植後のアロ反応もしくは自己免疫反応の阻害、予防、もしくはブロック、または移植片対宿主疾患の阻害、抑制、もしくはブロック、または炎症性疾患、自己免疫性疾患、もしくは移植組織拒絶での自己免疫反応の予防、治療、もしくは抑制が必要な状態である、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記炎症性疾患、自己免疫性疾患、または移植組織拒絶が、喘息、アレルギー、アレルギー性気道炎症、アレルギー性脳脊髄炎、自己免疫性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、反応性関節炎、乾癬性関節炎、仙腸骨炎、孤立性急性前部ブドウ膜炎、未分化脊椎関節症、１型糖尿病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、糸球体腎炎、橋本甲状腺炎グレーブス病、強皮症、セリアック病、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、乾癬、接触性皮膚炎、グッドパスチャー症候群、アジソン病、ウェゲナー肉芽腫症、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、リウマチ性多発性筋痛症、ベーチェット病、ギラン・バレー症候群、種々の血管炎、ブドウ膜網膜炎、甲状腺炎、重症筋無力症、免疫グロブリン腎症、心筋炎、進行性全身性硬化症、臓器移植拒絶、混合性結合組織拒絶、および移植片対宿主病からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
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