JP7366374B2 - 免疫チェックポイント阻害剤の効果予測方法 - Google Patents
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Description
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願2018-187856号(2018年10月3日出願)の明細書に記載された内容を包含する。
技術分野:
本発明は、免疫チェックポイント阻害剤によるがん免疫療法の適否を判定する方法、及び前記方法のためのキットに関する。
[1]免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスクを予測する方法であって、
(a)被験者から単離された末梢血単核球におけるVδ2+γδT細胞の細胞数又は割合、
(b)被験者から単離された末梢血単核球におけるVδ2+γδT細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合、
(c)被験者から単離された末梢血T細胞におけるVδ2+γδT細胞の細胞数又は割合、及び
(d)被験者から単離された末梢血T細胞におけるVδ2+γδT細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合、から選ばれるいずれか1又は2以上を測定すること、及び
前記細胞数又は割合に基づいて重症間質性肺炎の発症リスクを判断すること、を含む方法。
前記方法では、比較的急性でびまん性肺胞傷害(diffuse alveolar damage:DAD)を伴う間質性肺炎(重症間質性肺炎)をそれ以外の(例えば器質化肺炎(organizing pneumonia:OP)を伴う)間質性肺炎と鑑別して、その発症を予測することができる。
[2]前記細胞数又は割合がカットオフ値以上である場合に、当該被験者は重症間質性肺炎の発症リスクが高いと予測することを特徴とする、[1]に記載の方法。
[3]抗原刺激後の細胞数又は割合が高く、抗原刺激後の細胞が凝集を生じる場合に、当該被験者は重症間質性肺炎の発症リスクが高いと予測することを特徴とする、[1]に記載の方法。
[4]免疫チェックポイント阻害剤による治療の適否を判定する方法であって、請求項1~3に記載の方法にしたがい重症間質性肺炎の発症リスクを予測し、前記予測に基づき免疫チェックポイント阻害剤による治療の適否を判定する方法。
[5]前記γδT細胞の抗原刺激が、IL-2、リン酸モノエステル化合物、ピロリン酸モノエステル化合物、トリリン酸モノエステル化合物、テトラリン酸モノエステル化合物、トリリン酸ジエステル化合物、テトラリン酸ジエステル化合物、窒素含有型ビスホスホン酸化合物、アルキルアミン、アルキルアルコール、アルケニルアルコール、イソプレニルアルコール、及びヒト由来腫瘍細胞から選ばれるいずれか1又は2以上の抗原を用いて行われる、[1]~[4]のいずれかに記載の方法。
[6]前記抗原刺激に加えて、IL-18、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IL-23、インターフェロンγ、及び末梢血コンディション培地から選ばれるいずれか1又は2以上を用いてγδT細胞を刺激する、[5]に記載の方法。
[7]細胞数又は割合が、フローサイトメトリー又はイメージサイトメトリーを用いて測定される、[1]~[6]のいずれかに記載の方法。
[8](i)抗CD3抗体、及び(ii)抗Vδ2抗体を含む、免疫チェックポイント阻害剤による治療の適否を判定するためのキット。
[9]さらに、
(iii)ピロリン酸モノエステル誘導体、又は窒素含有ビスホスホン酸誘導体、及び
(iv)IL-18、
から選ばれる1又は2以上を含む、[8]に記載のキット。
[10]免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスクの診断を補助するための方法であって、
(a)被験者から単離された末梢血単核球におけるVδ2+γδT細胞の細胞数又は割合、
(b)被験者から単離された末梢血単核球におけるVδ2+γδT細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合、
(c)被験者から単離された末梢血T細胞におけるVδ2+γδT細胞の細胞数又は割合、及び
(d)被験者から単離された末梢血T細胞におけるVδ2+γδT細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合、から選ばれるいずれか1又は2以上を測定することを含み、
ここで、重症間質性肺炎の発症リスクは前記細胞数又は割合に基づいて決定される、方法。
[11]免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスクを予測し、免疫チェックポイント阻害剤により治療するための方法であって、
(a)被験者から単離された末梢血単核球におけるVδ2+γδT細胞の細胞数又は割合、
(b)被験者から単離された末梢血単核球におけるVδ2+γδT細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合、
(c)被験者から単離された末梢血T細胞におけるVδ2+γδT細胞の細胞数又は割合、及び
(d)被験者から単離された末梢血T細胞におけるVδ2+γδT細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合、から選ばれるいずれか1又は2以上を測定すること、
前記細胞数又は割合に基づいて重症間質性肺炎の発症リスクを予測すること、及び
前記予測にしたがい免疫チェックポイント阻害剤による治療を行う(例えば、発症リスクが高い被験者を除外して免疫チェックポイント阻害剤の投与を行う、あるいは発症リスクが高い患者には所定の措置を講じて免疫チェックポイント阻害剤の投与を行う)ことを含む、方法。
[12]被験者が、肺がん患者である、[1]~[7]、[10]、及び[11]のいずれかに記載の方法。
[13]免疫チェックポイント阻害剤を含有する医薬組成物であって、重症間質性肺炎の発症を抑制し、腫瘍を治療または予防するために使用され、[1]~[7]のいずれかに記載の方法により重症間質性肺炎の発症リスクが少ないと判断される被験者に用いることを特徴とする医薬組成物。
上記[1]~[13]において、免疫チェックポイント阻害剤は、好ましくはPD-1免疫チェックポイント阻害剤である。
「免疫チェックポイント阻害剤」
免疫チェックポイント阻害剤とは、CTLA-4/CD80/CD86シグナル伝達系や、PD-1/PD-L1/PD-L2シグナル伝達系などの免疫チェックポイントを阻害し、これにより抗腫瘍効果やウイルスなどの免疫逃避を抑制して抗感染症効果を示す物質を言う。
「PD-1免疫チェックポイント阻害剤」とは、PD-1が介在する免疫チェックポイント系を阻害する物質を意味する。これにより、「PD-1免疫チェックポイント阻害剤」は、腫瘍細胞による免疫逃避機構を抑制することで抗腫瘍効果を示し、またウイルスや病原微生物の免疫逃避を抑制することで抗感染症効果を示す。
間質性肺炎とは肺の間質を炎症や線維化病変の場とする疾患の総称であり、進行して肺が線維化を起こしたものは肺線維症と呼ばれる。間質性肺炎の原因は多岐にわたり、職業・環境性や薬剤などによるもの、膠原病・サルコイドーシスなどの全身性疾患に付随して発症するもの、原因が特定できないものがある。一般的傾向として、急性発症はびまん性肺胞傷害(diffuse alveolar damage:DAD)などの臨床像を取るのに対し、慢性発症では器質化肺炎(organizing pneumonia:OP)の臨床像を示す。OPなどは一般に良好で薬剤中止あるいは副腎皮質ステロイド(ステロイド)の使用で改善することが多いが、DADは治療反応性に乏しく予後不良で、回復しても線維化を残す。
本明細書において、重症間質性肺炎とは、比較的急性のDADを伴う間質性肺炎を意味し、急性憎悪を起こし、死に至る危険がある間質性肺炎の症状を意味する。本発明の方法によれば、DADを伴う間質性肺炎と、それ以外の(例えばOPを伴う)間質性肺炎を鑑別して、その発症を予測することができる。
単核球(Mononuclear Cells)とは全身の結合組織、血中、リンパ組織に広く分布する単核の間葉系細胞群の総称で、組織中のマクロファージ、その前駆細胞である単球、リンパ球が含まれる。本発明にかかる「末梢血単核球(Peripheral Blood Mononuclear Cells: PBMC)」とは、末梢血に存在する単核球であり、主として単球とリンパ球からなる。末梢血単核球は公知の方法により、あるいは市販のキット等を用いて、単離することができる。
「腫瘍細胞障害活性」とは、腫瘍細胞に対して、死、機能障害、増殖阻害を与える機能を意味する。NK細胞は、腫瘍細胞表面のリガンドとγδT細胞は、細胞内IPP濃度の高い腫瘍細胞に対して、高い細胞障害性を示し、IFN-γやTNF-αなどのサイトカインを産生し、抗腫瘍細胞活性を示す。腫瘍細胞傷害性を有する「エフェクターT細胞」としては、αβT細胞、γδT細胞、NK細胞が知られている。
「αβT細胞」は、α鎖とβ鎖の2つの糖タンパク質から構成されるT細胞受容体を有するT細胞で、末梢血リンパ球の大部分を占める。αβT細胞はTCR/CD3複合体により、抗原性ペプチド/MHC複合体を認識する。したがって、αβT細胞を解析するためには抗原性ペプチドに関する情報が必要になる。現在までにT細胞の認識する抗原性ペプチドが同定されているが、一つの腫瘍でもその種類は複数であることが推測され、その全体を把握し、解析するのは困難である。
「γδT細胞」は、細胞表面にγ鎖とδ鎖の2つの糖タンパク質から構成されるT細胞受容体を有するT細胞である。γδT細胞は、通常αβT細胞と比べると、はるかに少ない。末梢血単核球のCD3陽性T細胞中には約4%のγδT細胞が存在し、その50~75%が、TCR可変領域において、「Vγ2」(Vγ9と称されることもある)及び「Vδ2」を発現するVγ2Vδ2T細胞(Vδ2+γδT細胞)である。
本発明にかかる「NK細胞」は、T細胞にも、B細胞にも属さないリンパ球で、腫瘍細胞、ある種のウイルス感染細胞、移植骨髄細胞などに対して、主要組織適合性(MHC)抗原に拘束されずに障害活性を示す。NK細胞の表面には、標的細胞表面のリガンドと結合して細胞障害活性を誘導する活性化受容体と、自己MHCクラスI分子を認識して活性化受容体からのシグナルを抑制する抑制受容体が存在する。このように、NK細胞は、通常はMHCによる負のシグナルを受け、腫瘍細胞上のMHCが欠落した際、腫瘍細胞障害性を発揮する。しかし、ヒトのNK細胞でPD-1の発現を検討すると、その発現の確認が困難であり、解析することは難しい。
「キラーT細胞(CTL)」は、細胞障害性T細胞(CTL:Cytotoxic T Lymphocyte)と称され、宿主にとって異物である、アロ抗原やウイルス抗原を有する細胞を認識して障害する。CTLは、細胞表面にCD8抗原とα鎖、β鎖からなるT細胞受容体を有する。「CD8陽性T細胞」は、抗原提示細胞からMHC-クラスI抗原と抗原ペプチドの提示を受け、活性化されることで、細胞障害活性を有するようになる。活性化されたCTLは、パーフォリン、グランザイム、TNFを放出したり、標的細胞のFas抗原を刺激してアポトーシスを誘導することで、細胞を障害する。
免疫チェックポイント阻害剤は、腫瘍細胞によるエフェクターT細胞の機能抑制を解除することにより、その本来の機能を回復させる。しかし、エフェクターT細胞の数が極端に少ないがん患者に関しては、エフェクター細胞の機能を回復させても、その絶対数が足りないために効率的な抗腫瘍効果は期待できない。本発明は、エフェクター細胞であるγδT細胞の数(割合)と機能を測定することで、免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスクを予測することを特徴とする。
本発明で使用される検体(試料)は、被験者、すなわち免疫チェックポイント阻害剤の使用を検討している、あるいは既に使用している被験者から単離された末梢血単核球である。1回の測定に必要な末梢血は、少なくとも10ml、好ましくは10ml~20mlである。
(a)末梢血単核球におけるVδ2+γδT細胞の細胞数又は割合
「末梢血単核球におけるVδ2+γδT細胞の細胞数又は割合」は、特異的な表面マーカーを利用することで、測定することができる。
「末梢血単核球におけるVδ2+γδT細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合」は、Vδ2+γδT細胞の増殖能を示す。
「末梢血T細胞におけるVδ2+γδT細胞の細胞数又は割合」は、T細胞に特異的な抗CD3抗体と抗Vδ2抗体を用いることにより求めることができる。測定は、後述するフローサイトメトリーあるいはイメージアナライザーを使用することで求めることができる。
「末梢血T細胞における抗原刺激後のVδ2+γδT細胞の細胞数又は割合」は、Vδ2+γδT細胞の増殖能を示す。抗原刺激及び抗原刺激後のVδ2+γδT細胞の細胞数又は割合の測定方法は、(b)に記載した方法に準じて実施することができる。
本発明においては、上記(a)~(d)のいずれを指標とすることも可能であるが、後述するように、CD3-Vδ2-細胞が多い被験者においては末梢血T細胞を試料とするほうが好ましい。
また、通常健常人ではγδT細胞の大部分はVδ2+細胞であるが、がん患者では、Vδ1が多い場合がある。そのような患者由来の試料でも、抗原刺激をするとVδ2+細胞が増殖し、Vδ1は検出感度以下になるため、Vδ2+γδT細胞を、γδT細胞の数や割合を示すものとして評価することができる。したがって、Vδ1+γδT細胞が多い被験者においては抗原刺激後の試料中のVδ2+γδT細胞の細胞数や割合を指標とすることが好ましい。
・フローサイトメトリー
末梢血単核球あるいは末梢血T細胞中におけるVδ2+γδT細胞の細胞数又は割合の測定方法は、各細胞の表面抗原に特異的な抗体を使用して、フローサイトメトリーにより測定することができる。フローサイトメトリーは、流体に懸濁させた細胞を1個ずつセンシングゾーンに導き、その単一の流れにおいて、蛍光や散乱光を測定することで、多量の細胞を短時間に1個ずつ定量解析できる細胞測定法である。
末梢血単核球におけるVδ2+γδT細胞の細胞数又は割合の測定方法は、各細胞の表面抗原に特異的な抗体を使用して、イメージサイトメトリーにより測定することもできる。イメージサイトメトリーは、マルチウェルプレートやスライドグラス上の細胞を、レーザー走査して、その蛍光イメージや散乱光・透過光イメージを取得し、画像処理することにより、多量の細胞を短時間に1個ずつ定量解析できる細胞測定法である。
(1)末梢血単核球におけるVδ2+γδT細胞の数・割合に基づく予測
(a)末梢血単核球におけるVδ2+γδT細胞の細胞数又は割合、及び/又は(b)末梢血単核球におけるVδ2+γδT細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合が、所定のカットオフ値以上の場合、免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスクは高いと予測できる。そして、その発症リスクに基づき免疫チェックポイント阻害剤による治療の適否を判定することができる。
細胞割合のカットオフ値は、通常0.5~15%の範囲、好ましくは0.5~14%、0.5~13%、0.5~12%、0.5~11%、0.5~10%、0.5~9%、0.5~8%、0.5~7%、0.5~6%、0.5~5%、0.6~5%、0.7~5%、0.8~5%、0.9~5%、1.0~5%、0.6~4%、0.7~4%、0.8~4%、0.9~4%、1.0~4%の範囲、より好ましくは0.6~3%、0.7~3%、0.8~3%の範囲、0.9~3%、とくに好ましくは1~3%の範囲である。
(b)抗原刺激を与える場合の細胞数のカットオフ値は、与える抗原刺激によって異なるが、上記した値の数十倍超、好ましくは100倍~2000倍になる。例えば、PTAとIL-2を用いた抗原刺激では、細胞数は200倍~3000倍に増加し、細胞割合は98%超となる。重症間質性肺炎の発症リスクが高い被験者では、Vδ2+γδT細胞の反応性が高く、ピロリン酸誘導体やビスホスホン酸化合物による抗原刺激を与えると細胞が凝集を生じるため、目視判定することも可能である。例えば、末梢血単核球に1μMのPTAを作用させて、1日目の細胞凝集を目視判定する。
(c)末梢血T細胞におけるVδ2+γδT細胞の細胞数又は割合、及び/又は(d)末梢血T細胞におけるVδ2+γδT細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合が、所定のカットオフ値以上の場合、免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスクは高いと予測できる。そして、その発症リスクに基づき免疫チェックポイント阻害剤による治療の適否を判定することができる。
一般的には、前述した末梢血単核球におけるVδ2+γδT細胞の細胞数又は割合によって被験者の応答を予測できるが、CD3-Vδ2-の細胞(G3)が多い被験者の場合には、これを除いた末梢血T細胞におけるVδ2+γδT細胞の細胞数や割合を対象に診断するほうが好ましい。
細胞割合のカットオフ値は、通常1~20%の範囲、好ましくは1~19%、1~18%、1~17%、1~16%、1~15%、1~14%、1~13%、1~12%、1~11%、1~10%、1~9%、1~8%、1~7%、1~6%、1~5%、1~4%、1~3%の範囲、より好ましくは2~5%、2~4%の範囲、とくに好ましくは2~3%の範囲である。
(b)抗原刺激を与える場合の細胞数のカットオフ値は、与える抗原刺激によって異なるが、上記した値の数十倍超、好ましくは100倍~2000倍になる。例えば、PTAとIL-2を用いた抗原刺激では、細胞数は200倍~3000倍に増加し、細胞割合は98%超となる。
重症間質性肺炎の発症リスクが高い被験者では、Vδ2+γδT細胞の反応性が高く、ピロリン酸誘導体やビスホスホン酸化合物による抗原刺激を与えると細胞が凝集を生じるため、目視判定することも可能である。例えば、末梢血単核球に1μMのPTAを作用させて、1日目の細胞凝集を目視判定する。
上記した方法に加えて、使用する免疫チェックポイント阻害剤や治療目的に応じて、下記(e)~(i)の指標を適宜組み合わせて、治療の適否を判定してもよい。
(e)抗原刺激後のγδT細胞のPD-1発現量、
(f)抗原刺激後のγδT細胞の腫瘍細胞障害活性、
(g)被験者から単離された末梢血単核球におけるNK細胞の細胞数又は割合、
(h)被験者から単離された末梢血単核球におけるNK細胞の増殖刺激後の細胞数又は割合、
(i)前記増殖刺激後のNK細胞の腫瘍細胞障害活性。
なお、前述のとおり、γδT細胞はVδ2+γδT細胞として上記指標を求めても良い。
「抗原刺激後のγδT細胞のPD-1発現量」は、免疫チェックポイント阻害剤に対する応答性の指標である。したがって、重症間質性肺炎の発症リスクと併せて、免疫チェックポイント阻害剤に対する応答性を評価することで、より精密な治療が可能になる。
「抗原刺激後のγδT細胞の腫瘍細胞障害活性」は、免疫チェックポイント阻害剤に応答して、現実にγδT細胞が腫瘍細胞障害活性を発揮するかどうかの指標である。したがって、重症間質性肺炎の発症リスクと併せて、免疫チェックポイント阻害剤に応答したγδT細胞の腫瘍細胞障害活性を評価することで、より精密な治療が可能になる。
標的細胞(腫瘍細胞)を3H-Prolineで標識し、エフェクター細胞(γδT細胞又はNK細胞)と混合培養し、エフェクター細胞による細胞障害によって標的細胞から放出される3H-Proline量(β放射線)を測定する。標的細胞とエフェクター細胞の混合比(E/T比)や培養時間は使用する細胞に応じて適宜設定され、例えばE/T比=0.5~2程度で調整する。
次式で示される細胞障害活性(%)を計算し、細胞障害活性を評価する。
細胞障害活性(%)=(E/T比)-標的細胞のみの放出量 / 標的細胞を全て障害したときの放出量-標的細胞のみの放出量
標的細胞(腫瘍細胞)を51Crで標識し、エフェクター細胞(γδT細胞又はNK細胞)と混合培養し、エフェクター細胞による細胞障害によって標的細胞から放出される3H-Proline量(β放射線)を測定する。β放射線放射活性測定法と同様に、標的細胞とエフェクター細胞の混合比(E/T比)や培養時間は使用する細胞に応じて適宜設定され、細胞障害活性(%)を計算することで細胞障害活性を評価する。
標的細胞(腫瘍細胞)をユーロピウム(Eu)で標識し、エフェクター細胞(γδT細胞又はNK細胞)と混合培養し、エフェクター細胞による細胞障害によって標的細胞から放出される3Eu量(蛍光)を測定する。β放射線放射活性測定法やγ放射線放射活性測定法と同様に、標的細胞とエフェクター細胞の混合比(E/T比)や培養時間は使用する細胞に応じて適宜設定され、細胞障害活性(%)を計算することで細胞障害活性を評価する。
乳酸脱水素酵素(LDH)は細胞質に存在する酵素で、細胞が障害を受けると培地中に放出される。この放出されたLDHを、LDHによって触媒される乳酸脱水素反応で生じるNADHをITN(テトラゾリウム塩)と反応させて生じるホルマザン色素(490nmの吸光度量)を通して定量する。RIを使用しないため、安全性が高い。他の方法と同様に、標的細胞とエフェクター細胞の混合比(E/T比)や培養時間は使用する細胞に応じて適宜設定され、細胞障害活性(%)を計算することで細胞障害活性を評価する。
発明者らが開発した非RI系による細胞障害能迅速測定法では、キレート剤前駆体で腫瘍細胞を処理する。具体的には、まず、ブタノイルオキシメチル基で保護したテルピリジン誘導体で腫瘍細胞を処理する。すると、その脂溶性のために細胞に取り込まれ、エステラーゼで加水分解を受け、細胞内にネガティブチャージを有するキレート剤が蓄積する。ここで、免疫エフェクター細胞を作用させると、腫瘍細胞が障害され、膜構造が少し破壊される。すると、キレート剤は速やかに培養上清に漏出する。ここで、培養上清を少し回収し、ランタノイド系金属であるユーロピウムを添加するとキレートが形成され、励起光を当てると時間分解蛍光が発せられる。この時間分解蛍光を測定すれば、細胞障害性が非RIで定量できる。
「末梢血単核球におけるNK細胞の細胞数又は割合」は、末梢血単核球とNK細胞にそれぞれ特異的な表面マーカーを利用することで、測定することができる。前述のとおり、NK細胞は、腫瘍細胞障害活性を有する。したがって、重症間質性肺炎の発症リスクと併せて、NK細胞の数や割合を評価することで、より精密な治療が可能になる。
「末梢血単核球におけるNK細胞の増殖刺激後の細胞数又は割合」は、NK細胞の増殖能を示す。したがって、重症間質性肺炎の発症リスクと併せて、腫瘍細胞障害活性を有するNK細胞の増殖能を評価することで、より精密な治療が可能になる。
「増殖刺激後のNK細胞の腫瘍細胞障害活性」は、免疫チェックポイント阻害剤に応答して、現実にNK細胞が腫瘍細胞障害活性を発揮するかどうかの指標である。したがって、重症間質性肺炎の発症リスクと併せて、NK細胞の腫瘍細胞障害活性を評価することで、より精密な治療が可能になる。
本発明は、上記した免疫チェックポイント阻害剤の効果予測用試薬及びキットも提供する。
本発明の免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症のリスクを予測する方法、前記方法にしたがい免疫チェックポイント阻害剤による治療の適否を判定する方法(診断方法)、試薬(診断薬)、及びキット(診断用キット)は、免疫チェックポイント阻害剤の効果や副作用を投薬前に予測する臨床検査、いわゆるコンパニオン診断に利用することができる。
本発明によれば、免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスクを予測し、当該リスクが少ないと判断される被験者を対象とした、免疫チェックポイント阻害剤の新たな用途を提供する。本発明は、そのような免疫チェックポイント阻害剤を含有する医薬組成物であって、重症間質性肺炎の発症を抑制し、腫瘍を治療または予防するために使用され、前述した方法により重症間質性肺炎の発症リスクが少ないと判断される被験者に用いることを特徴とする医薬組成物も提供する。
本発明の方法及び試薬・キットは、免疫チェックポイント阻害剤の使用前段階での投薬の適否の診断に加えて、治療開始後のリスク予測、さらには、HIV感染症などのウイルス感染症や、原虫感染症、細菌感染症などにおける免疫チェックポイント阻害剤治療における投薬の適否の診断にも利用することができる。
免疫チェックポイント阻害剤を用いたがん免疫療法において、重要なことはエフェクター細胞であるT細胞の数とPD-1発現を含む免疫状態である。極論を言えば、がん患者で免疫系が疲弊し、腫瘍細胞障害性T細胞のほとんどない、あるいは、極端に少ない症例に対して免疫チェックポイント阻害剤を投与しても、腫瘍細胞障害性は期待できない。
(1)Vγ2Vδ2T細胞及びNK細胞の数又は割合
末梢血単核球(PBMC:Peripheral Blood Mononuclear Cell)中のγδT細胞の数又は割合は、以下の手順にしたがい、2色フローサイトメトリーで解析する。
肺がん患者より、末梢血(10ml)を採取し、常法にしたがいPBMC画分を調製し、50μlのPBS/2% FCSに懸濁させる。各3μlの抗体をウェルに加え、氷上で30分放置後、2% FCS/PBSで3回洗浄し、フローサイトメトリー(FACSCaliburTM、BDバイオサイエンス)で解析する。
PMBC中のγδT細胞(Vδ2陽性細胞)の数及び割合は、抗CD3抗体と抗Vδ2抗体を用いた2色フローサイトメトリーにより求めることができる。
PMBC中のNK細胞(CD56陽性細胞)の数及び割合は、抗CD3抗体と抗CD56抗体を用いた2色フローサイトメトリーにより求めることができる。
CD3はT細胞の表面マーカーであり、CD56はNK細胞の表面マーカーである。Vδ2は、ここではγδT細胞を検出するために使用される。健常人のγδT細胞の大部分はVδ2陽性細胞であり、Vδ1陽性細胞が多い試料でも、後述する抗原刺激後にはVδ2陽性細胞が増殖し、Vδ1陽性細胞は検出感度以下になるため、Vδ2陽性細胞をγδT細胞として評価することができるからである。
1mMのPTAストック溶液(DMSO中)3μlをPMBC(3ml)に加え、終濃度1μMにする。Vδ2陽性細胞懸濁液を24ウェルプレートの2ウェル(1.5 ml/ウェル, 2ウェル)に移す。IL-2、IL-18を2ウェルに加え、それぞれ終濃度100U/ml、100ng/mlになるように添加し、37℃、5%CO2でインキュベートする。Day 1からPBMCに、毎日IL-2又はIL-2/IL-18を培地に加える。
*PTAは、下記構造を有する窒素含有型ビスホスホン酸(WO2016/125757、及びMedicinal Chemistry, 2007, 85-99)で、FPPS合成を阻害することでγδT細胞を活性化する。
Day11に細胞を回収し、(1)にしたがい、2色フローサイトメトリーでγδT細胞の数又は割合を解析する。
PMBCから、常法にしたがい、MACS(r)Beads標識抗CD3抗体を用いて、NK細胞を精製する。具体的には、PMBC(3ml)を15mlのコニカルチューブに移し、1700rpm、4℃で5分遠心する。次いで、上清を吸引除去し、細胞ペレットを分散させ、80μlのPBS/0.5%BSA/2mM EDTA に再懸濁させる。20μlのMACS(r)Beads標識抗CD3抗体(Mylteny Biotec)を細胞懸濁液に加え、4℃で15分間インキュベートする。15分後、2mlのPBS/0.5%BSA/2mM EDTAを加えて細胞を再懸濁させる。次いで、300xg、4℃で10分遠心して上清を吸引除去する。細胞ペレットを分散させ、1mlのPBS/0.5%BSA/2mM EDTA に再懸濁させる。細胞懸濁液を、PBS/0.5%BSA/2mM EDTAで平衡化したLDカラム(磁性球体で構成される)にかける。CD3陰性細胞を1mlのPBS/0.5%BSA/2mM EDTAで2回溶出する。1700rpm、4℃、5分間遠心し、上清を捨て、アスピレーターで吸引除去する。次いで、細胞ペレットを分散させ、CD3陰性細胞を1.5mlのYM-AB培地に再懸濁させる。
NK細胞懸濁液を24ウェルプレート(1.5 ml/ウェル, 1ウェル)に移し、IL-2及びIL-18をウェルに加え、それぞれ終濃度100IU/ml及び100ng/mlにし、37℃、5%CO2でインキュベートする。Day 0から10日間、毎日IL-2/IL-18を培地に加える。
Day11に細胞を回収し、(1)にしたがい、2色フローサイトメトリーでNK細胞の数又は割合を解析する。
(1)健常人のγδT細胞の割合
12人の健常人のγδT細胞の割合をフローサイトメトリーで解析すると、これまで報告されてきたとおり、平均すると末梢血単核球中の3%から4%程度であり、10%を超えているドナーも存在した。一方、2%を切るようなドナーは2例と少なく、1%を切るようなドナーはいなかった(図1)。
次に、健常人のγδT細胞の反応性に関して検討を行った。Vδ2γδT細胞の割合が5.57%だった健常人の末梢血単核球にPTAを作用させ、IL-2とともに11日間培養すると、γδT細胞の割合は98.39%まで上昇した。また、この際、細胞数は1000倍以上になった(図2(A))。
肺がん患者のγδ型T細胞の割合を表1に示す。γδT細胞の少ない症例(LC02,LC05,LC09,LC10)と多い症例(LC03,LC04,LC07,LC08)にはっきりと分かれているのが分かる。
次に、肺がん患者のうち、γδT細胞の割合が、健常人と同程度の症例を選択し、γδT細胞の増殖誘導能を検討した。Vδ2γδT細胞の割合が4.14%だった肺がん患者の末梢血単核球にPTAを作用させ、IL-2とともに11日間培養すると、γδT細胞の割合は98.59%まで上昇した。また、この際、細胞数は1000倍以上になった。すなわち、健常人に近い数値の肺がん患者は、健常人と同程度のγδT細胞増殖誘導能があることが明らかとなった(図4(A))。
γδT細胞とNK細胞との関係について検討を行った。まず、健常人の末梢血単核球を精製し、既報(Sigie T. et al., Cancer Immunol Immunother. 2013 Apr; 62(4):677-87. Epub 2012 Nov 15.)にしたがい、窒素含有ビスホスホン酸(N-BP)の1種であるZol(Zoledronic acid:ゾメタ)/IL-2あるいはZol/IL-2/IL-18で刺激し、γδT細胞の増殖誘導を検討した。
次に、NK細胞とIL-18との関係について検討を行った。NK細胞はIL-2刺激により増殖誘導を受けるが、ここにIL-18を添加するとどうなるのか検討した。まず、ヒト末梢血単核球からCD3陽性細胞を除去し、CD3-細胞画分をIL-2あるいはIL-2/IL-18で刺激した。
上記の結果から、ゾメタやPTAのようなN-BPによるγδT細胞の増殖誘導メカニズムはは、γδT細胞とNK細胞の相互作用に基づくものと予想された(図8)。すなわち、N-BPがCD14陽性であるマクロファージに取り込まれると、ブチロフィリン3A1(BTN3A1)の細胞外領域に変化が起こり、それをγδT細胞がγδT細胞受容体依存的に認識する。すると、γδT細胞受容体からγδT細胞内にシグナルが誘導され、IL-2のプロモーター領域に転写因子が動員されることにより、若干量のIL-2の産生がみられる。一方、N-BPストレスを受けたマクロファージではインフラマソーム依存的にカスパーゼIが活性化され、IL-18前駆体を加水分解し、成熟型IL-18を産生し、細胞外へ放出する。ここで、IL-2/IL-18によりNK細胞が増殖誘導を受ける。他方、γδT細胞にもIL-18が作用するとLFA-1やICAM-1が発現誘導される。これらの接着分子を介してNK細胞とγδT細胞との強い相互作用がおこり、γδT細胞の爆発的な増殖誘導がおこる。以上のことから、一次的にはγδT細胞の数(割合)と増殖誘導性を、二次的にはNK細胞の数(割合)と増殖誘導性を検討すれば、免疫チェックポイント阻害剤の感受性予測が可能であることが予想される。
実施例1の結果、PD-1免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果を予測する際、免疫エフェクターT細胞の機能と増殖性、そして、NK細胞の増殖性が鍵となる可能性が高いことが確認された。つまり、免疫エフェクターT細胞として、αβT細胞とγδT細胞があるが、これらの免疫寛容誘導システムが同一であるとすると、γδT細胞の状態を明らかにすれば、αβT細胞の免疫寛容状態も予想できることになる。
[施設数]多施設共同試験(長崎大学病院、長崎原爆病院)
[対象]肺がん患者
[選択基準]
コンピュータ断層撮影で組織学的に肺がんと確認された患者(any T, any N, and M1, stage IV)、
パーフォーマンスステータス(PS)0、年齢20~75歳、主要組織は機能を維持しており、当機関の試験基準に合致し、試験の性質について説明を受けた後、本試験への参加に対する同意書面を自発的に提出したものを採用する。
以下のうち一つでも該当する患者は、対象として除外する。
1)本剤の成分に対し過敏症の既往歴のある患者
2)妊婦および妊娠している可能性のある患者、または授乳中の患者
3)その他、研究責任者が研究対象者として不適当と判断した患者
第1のプライマリーエンドポイントは、ニボルマブを投与された肺がん患者における、奏効率(ORR)と末梢血リンパ球ゲート中及びCD3陽性細胞中のVδ2T細胞の割合との相関関係である。
第2のプライマリーエンドポイントは、肺がん患者における奏効率(ORR)と抗原刺激後のPD-1発現Vδ2T細胞の割合との相関関係である。
第1のセカンダリーエンドポイントは、ニボルマブを投与された肺がん患者における、奏効率(ORR)と末梢血単核球中のNK細胞の割合との相関関係である。
第2のプライマリーエンドポイントは、肺がん患者における奏効率(ORR)とIL-2/IL-18刺激後のNK細胞の増殖との割合の相関関係である。
同意の得られた抗PD-1抗体ニボルマブを投与予定の症例より、投与前および投与3ヶ月後に、末梢血10mlのヘパリン採血を行う。この際、入院中の通常採血に付随して採血を行い、この採血のための新たな穿刺は行わない。
(A)腫瘍容積の測定及び奏効率(RECIST)
腫瘍容積はMRIを用いて測定する。測定はガイドラインにしたがって実施し、奏効率(ORR:Objective Response Rate)は超音波検査と臨床評価を使用してRECISTガイドラインにしたがい個別に評価する。
フィコール濃度勾配遠心法により、末梢血単核球(PBMC)を精製し(実施例1参照)、7 mlのYM-AB培地に懸濁する。YM-AB培地に懸濁したPBMCのうち1mlに関してフローサイトメトリー解析を行う。具体的には、細胞懸濁液0.1mlずつを96ウェル丸底プレート9ウェルに播種し、1700rpm、4℃、2分間遠心する。上清を除去し、細胞ペレットをボルテックス攪拌する。そこに46μlの2% FCS/PBSと、それぞれ以下を添加する。
(i)2% FCS/PBS(4μl)
(ii)PE標識抗CD3抗体(2μl)+2% FCS/PBS(2μl)
(iii)2% FCS/PBS(2μl)+FITC標識抗Vδ2抗体(2μl)
(iv)PE標識抗CD3抗体(2μl)+FITC標識抗CD4抗体(2μl)
(v)PE標識抗CD3抗体(2μl)+FITC標識抗CD8抗体(2μl)
(vi)PE標識抗CD3抗体(2μl)+FITC標識抗Vδ1抗体(2μl)
(vii)PE標識抗CD3抗体(2μl)+FITC標識抗Vδ2抗体(2μl)
(viii)PE標識抗CD25抗体(2μl)+FITC標識抗CD4抗体(2μl)
(ix)PE標識抗CD56抗体(2μl)+FITC標識抗CD3抗体(2μl)
抗体添加後、プレートを氷上で15分インキュベートし、100μlの2% FCS/PBSを添加する。その後、プレートを1700 rpm、4℃、2分間遠心し、上清を除去する。この操作を計3回行い、最後に、200μlの2% FCS/PBSを添加し、70μmのフィルター膜に通し、フローサイトメトリーで解析を行う。この解析結果を基に、Vγ2Vδ2T細胞の割合と数、および、細胞表面マーカーの検討を行う。
YM-AB培地に懸濁したPBMCのうち3mlに関してγδT細胞の増殖試験を行う。3mlのPBMC懸濁液に1mMのPTAを加え、24ウェルプレートの2ウェル(1.5 ml/ウェル, 2ウェル)に播種し、37℃、5%CO2でインキュベートする(Day 0)。
一方のウェルにIL-2(100 U/ml)、他方のウェルにIL-2(100U/ml)+IL-18(100ng/ml)の最終濃度で添加する(Day 1)。IL-2あるいはIL-2+IL-18をさらに添加する(Day 2-Day 9)。Day 10において細胞数を測定し、Vγ2Vδ2T細胞の増殖誘導性を検討する。
YM-AB培地に懸濁したPBMCのうち残り3mlに関してNK細胞の増殖試験を行う。細胞懸濁の入った15mlのコニカルチューブを1700rpm、4℃で5分遠心する。次いで、上清を吸引除去し、細胞ペレットを分散させ、80μlのPBS/0.5%BSA/2mM EDTA に再懸濁させる。そこに20μlのMACS(登録商標)Beads(Mylteny Biotec)標識抗CD3抗体を20μl加え、4℃で15分間インキュベートする。ここに2mlのPBS/0.5%BSA/2mM EDTAを加えて細胞を軽く懸濁させる。次いで、この細胞懸濁液を300xg、4℃で10分遠心して上清を除去する。細胞ペレットを分散させ、1mlのPBS/0.5%BSA/2mM EDTAを添加し、細胞をよく懸濁させる。細胞懸濁液を、PBS/0.5%BSA/2mM EDTAで平衡化したLDカラム(磁性球体で構成される)にかける。CD3陰性細胞を1mlのPBS/0.5%BSA/2mM EDTAで2回溶出する。1700rpm、4℃、5分間遠心し、上清を捨て、アスピレーターで吸引除去する。次いで、細胞ペレットを分散させ、CD3-細胞を1.5mlのYM-AB培地に懸濁させる。 これを24ウェルプレートに播種し、IL-2及びIL-18をそれぞれ終濃度100U/ml及び100ng/mlとなるように添加し、37℃、5%CO2でインキュベートする(Day 0)。IL-2及びIL-18を毎日培地に加える(Day 2-Day 9)。Day 10において細胞数を測定し、NK細胞の増殖誘導性を検討する。
PTAにより増殖誘導したVγ2Vδ2T細胞をDay 10において回収し、細胞表面マーカーのフローサイトメトリーによる検討を行う。具体的には、細胞懸濁液0.1mlずつを96ウェル丸底プレート7ウェルに播種し、1700rpm、4℃、2分間遠心する。上清を除去し、細胞ペレットをボルテックス攪拌する。そこに46μlの2% FCS/PBSと、それぞれ以下を添加する。
(i)2% FCS/PBS(4μl)
(ii)PE標識抗CD3抗体(2μl)+2% FCS/PBS(2μl)
(iii) 2% FCS/PBS(2μl)+FITC標識抗Vδ2抗体(2μl)
(iv)PE標識抗CD3抗体(2μl)+FITC標識抗Vδ2抗体(2μl)
(v)PE標識抗CD3抗体(2μl)+FITC標識抗CD4抗体(2μl)
(vi)PE標識抗CD3抗体(2μl)+FITC標識抗CD8抗体(2μl)
(vii)PE標識抗CD56抗体(2μl)+FITC標識抗Vδ2抗体(2μl)
(viii)2% PE標識抗NKG2D抗体(2μl)+FITC標識抗Vδ2抗体(2μl)
(ix)PE標識抗DNAM-1抗体(2μl)+FITC標識抗Vδ2抗体(2μl)
(x)PE標識抗FasL(2μl)+FITC標識抗Vδ2抗体(2μl)
(xi)PE標識抗TRAIL抗体(2μl)+FITC標識抗Vδ2抗体(2μl)
(xii)PE標識抗CD16抗体(2μl)+FITC標識抗Vδ2抗体(2μl)
(xiii)無標識抗PD-1抗体(2μl)+RPE標識抗マウスIgG抗体(2μl)+FITC標識抗Vδ2抗体(2μl)
抗体添加後、プレートを氷上で15分インキュベートし、100μlの2% FCS/PBSを添加する。その後、プレートを1700 rpm、4℃、2分間遠心し、上清を除去する。この操作を計3回行い、最後に、200μlの2% FCS/PBSを添加し、70μmのフィルター膜に通し、フローサイトメトリーで解析を行う。この解析結果を基に、Vγ2Vδ2T細胞の割合と個数、および、細胞表面マーカーの検討を行う。
Day 10において細胞を回収し、細胞表面マーカーのフローサイトメトリーによる検討を行う。具体的には、細胞懸濁液0.1mlずつを96ウェル丸底プレート7ウェルに播種し、1700 rpm、4℃、2分間遠心する。上清を除去し、細胞ペレットをボルテックス攪拌する。そこに46μlの2% FCS/PBSと、それぞれ以下を添加する。
(i)2% FCS/PBS(4μl)
(ii)PE標識抗CD56抗体(2μl)+FITC標識抗CD3抗体(2μl)
(iii)PE標識抗NKG2D抗体(2μl)+FITC標識抗CD56抗体(2μl)
(iv)PE標識抗DNAM-1抗体(2μl)+FITC標識抗CD56抗体(2μl)
(v)PE標識抗FasL(2μl)+FITC標識抗CD56抗体(2μl)
(vi)PE標識抗TRAIL抗体(2μl)+FITC標識抗CD56抗体(2μl)
(vii)PE標識抗CD16抗体(2μl)+FITC標識抗CD56抗体(2μl)
抗体添加後、プレートを氷上で15分インキュベートし、100μlの2% FCS/PBSを添加する。その後、プレートを1700 rpm、4℃、2分間遠心し、上清を除去する。この操作を計3回行い、最後に、200μlの2% FCS/PBSを添加し、70μmのフィルター膜に通し、Vγ2Vδ2T細胞の細胞表面マーカーに関するフローサイトメトリーで解析する。この解析結果を基に、NK細胞の割合と個数、および、細胞表面マーカーの検討を行う。
増殖誘導したVγ2Vδ2T細胞の細胞障害性アッセイを行う。標的細胞としてはヒトPD-L1を強制発現させたヒトDaudiバーキットリンパ腫由来細胞株Daudi/hPD-L1を用い、PD-1免疫チェックポイント阻害剤としてはマウス抗ヒトPD-L1抗体27A2を用いる。
まずDaudi/hPD-L1を30mlのRPMI1640培地に懸濁し、75cm2フラスコで37℃、5%CO2で培養する。細胞数を測定し、1x106個の細胞を4本の15mlコニカルチューブに移す。細胞懸濁液を1700rpm、4℃で5分遠心し、上清を吸引除去し、細胞ペレットを分散させる。チューブ1及び2には、細胞を1mlのRPMI1640培地に懸濁し、1x106個の/mlの細胞懸濁液を調製する。チューブ3及び4には、100nMのPTA溶液を1ml添加し、よく懸濁する。37℃、5% CO2雰囲気下で1時間45分インキュベートする。チューブ4に、1mg/mlのマウス抗ヒトPD-L1モノクローナル抗体27A2を2μl添加し、最終濃度が0.5μg/mlになるようにする。さらに、これらのチューブを37℃、5% CO2雰囲気下で15分間インキュベートする。次に、チューブ1に、2.5μlのDMSO、チューブ2~4にテルピリジン誘導体Ch46(ビス(ブチリロキシメチル)4’-(ヒドロキシメチル)-2,2’:6’,2’’-テルピリジン-6,6’-ジカルボキシラート:WO2015/152111 実施例8参照)を2.5μl添加し、37℃、5% CO2雰囲気下で15分インキュベートする。次にこれらのチューブを1700 rpm、4℃、5分間遠心し、上清を除去する。細胞ペレットをタッピングし、2mlのRPMI1640培地を添加し、細胞をよく懸濁後、この操作を3回繰り返し、細胞を洗浄する。5mlのRPMI1640培地で細胞を懸濁し、この細胞懸濁液2mlを新しい15mlコニカルチューブに移し、6mlのRPMI1640培地を添加し、細胞の最終濃度を5x104個/m = 5x103個/100μlとする。RPMI1640培地中1 x 107のVγ2Vδ2T細胞を15mlのコニカルチューブに移す。1700rpm、4℃で5分遠心し、上清を吸引除去し、5mlのRPMI1640培地に添加し、細胞をよく懸濁後、以下のように系列希釈を行い、細胞懸濁液を調製する。
5 ml (Vγ2Vδ2T細胞) : 2 x 106/ml: 40 : 1 (E/T ratio)
2 ml (2 x 106/ml) + 2 ml (RPMI) : 1 x 106/ml: 20 : 1 (E/T ratio)
2 ml (1 x 106/ml) + 2 ml (RPMI) : 5 x 105/ml : 10 : 1 (E/T ratio)
2 ml (5 x 105/ml) + 2 ml (RPMI) : 2.5 x 105/ml : 5 : 1 (E/T ratio)
2 ml (2.5 x 105/ml) + 2 ml (RPMI) : 1.25 x 105/ml: 2.5 : 1 (E/T ratio)
2 ml (1.25 x 105/ml) + 2 ml (RPMI) : 6.25 x 104/ml: 1.25 : 1 (E/T ratio)
2 ml (6.25 x 105/ml) +2 ml (RPMI) : 3.125 x 104/ml: 0.625 : 1 (E/T ratio)
2 ml (RPMI) : 0/ml: 0 : 1 (E/T ratio)
増殖誘導したNK細胞の細胞障害性アッセイを行う。標的細胞としてヒト骨髄腫由来細胞株K562細胞株を、Vγ2Vδ2T細胞の代わりにNK細胞用いる以外は、上記(G)と同じ手順で時間分解蛍光を測定し、その結果を基に増殖培養したNK細胞の示すK562細胞株への抗腫瘍効果を検討する。
ニボルマブ投与前および投与後について、上記評価項目記載のバイオマーカーについて要約統計量(例数、平均、標準偏差、最小値、四分位範囲、中央値、最大値等)を求める。ニボルマブ奏功の有無で2群に分け、各バイオマーカーの要約統計量を求める。これらの結果から、末梢血単核球中のγδT細胞の割合、γδT細胞の抗原刺激による増殖誘導性、増殖誘導後のPD-1を発現量と奏功性との相関関係について検討を行う。さらに、γNK細胞の割合及び増殖誘導能と奏功性との相関関係について検討を行う。次にニボルマブ奏功に対するカットオフ値を推定するために、各バイオマーカーによるROC曲線を作成する。また、ニボルマブ奏功に対して多因子による関与が考えられた場合には、各バイオマーカーによるLogisticモデルより多因子ROC曲線を求め、多因子でのカットオフ値を推定する。
下表に結果を示す。
Claims (10)
- 免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスクを予測するための方法であって、
(a)被験者から単離された末梢血単核球におけるVδ2+γδT細胞の細胞数又は割合
、
(b)被験者から単離された末梢血単核球におけるVδ2+γδT細胞の抗原刺激後の細
胞数又は割合、
(c)被験者から単離された末梢血T細胞におけるVδ2+γδT細胞の細胞数又は割合
、及び
(d)被験者から単離された末梢血T細胞におけるVδ2+γδT細胞の抗原刺激後の細
胞数又は割合、から選ばれるいずれか1又は2以上を測定すること、を含む方法。 - 前記細胞数又は割合がカットオフ値以上であることが、当該被験者は重症間質性肺炎の発症リスクが高いことを示す、請求項1に記載の方法。
- 抗原刺激後の細胞が凝集を生じることが、当該被験者は重症間質性肺炎の発症リスクが高いことを示す、請求項1に記載の方法。
- 免疫チェックポイント阻害剤による治療の適否の判定を補助するための方法であって、
(a)被験者から単離された末梢血単核球におけるVδ2 + γδT細胞の細胞数又は割合
、
(b)被験者から単離された末梢血単核球におけるVδ2 + γδT細胞の抗原刺激後の細
胞数又は割合、
(c)被験者から単離された末梢血T細胞におけるVδ2 + γδT細胞の細胞数又は割合
、及び
(d)被験者から単離された末梢血T細胞におけるVδ2 + γδT細胞の抗原刺激後の細
胞数又は割合、
から選ばれるいずれか1又は2以上を測定することを含み、
(1)前記細胞数又は割合がカットオフ値以上であること、及び/又は
(2)抗原刺激後の細胞が凝集を生じることが、
当該被験者は重症間質性肺炎の発症リスクが高いことを示し、
前記発症リスクが高いことが、免疫チェックポイント阻害剤による治療が不適であることを示す、方法。 - 前記γδT細胞の抗原刺激が、IL-2、リン酸モノエステル化合物、ピロリン酸モノエステル化合物、トリリン酸モノエステル化合物、テトラリン酸モノエステル化合物、トリリン酸ジエステル化合物、テトラリン酸ジエステル化合物、窒素含有型ビスホスホン酸化合物、アルキルアミン、アルキルアルコール、アルケニルアルコール、イソプレニルアルコール、及びヒト由来腫瘍細胞から選ばれるいずれか1又は2以上の抗原を用いて行われる、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗原刺激に加えて、IL-18、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IL-23、インターフェロンγ、及び末梢血コンディション培地から選ばれるいずれか1又は2以上を用いてγδT細胞を刺激する、請求項5に記載の方法。
- 細胞数又は割合が、フローサイトメトリー又はイメージサイトメトリーを用いて測定される、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- (i)抗CD3抗体、及び(ii)抗Vδ2抗体を含む、免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスクを判定するためのキット。
- さらに、
(iii)ピロリン酸モノエステル誘導体、又は窒素含有ビスホスホン酸誘導体、及び
(iv)IL-18、
から選ばれる1又は2以上を含む、請求項8に記載のキット。 - 免疫チェックポイント阻害剤による治療の適否を判定するために使用される、請求項8又は9に記載のキット。
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