MX2014005358A

MX2014005358A - Anticuerpo y metodos para la inhibicion selectiva de respuestas mediadas por celulas t.

Info

Publication number: MX2014005358A
Application number: MX2014005358A
Authority: MX
Inventors: Richardt Getts Daniel; Joseph Hermann James; James Puisis John; J Fokta Frank
Original assignee: Tolera Therapeutics Inc
Priority date: 2011-11-03
Filing date: 2012-11-05
Publication date: 2014-09-12
Also published as: IL232269A0; US20150252109A1; US8524234B2; EP2773670A4; WO2013067517A3; US20130122015A1; EP2773670A2; US8968739B2; KR20140091038A; BR112014010532A2; JP2015504419A; AU2012332193A1; CA2853687A1; CN104870011A; HK1201279A1; US20130330351A1; WO2013067517A2

Abstract

Composiciones, métodos y ensayos para tratar una enfermedad inflamatoria y/o enfermedad autoinmune, y/o rechazo de tejido trasplantado usando anticuerpos y fragmentos de anticuerpos anti-aß TCR. Los anticuerpos anti-aß TCR son anticuerpos que se unen a un aß TCR. También se proveen anticuerpos anti-aß TCR producidos por el hibridoma MCB TOL101. También se proveen métodos para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune y para el rechazo de trasplante de tejido usando régimen de dosificación terapéutica de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos anti-aß TCR y para el aumento de los números de células T Treg.

Description

ANTICUERPO Y MÉTODOS PARA LA INHIBICIÓN SELECTIVA DE RESPUESTAS MEDIADAS POR CÉLULAS T REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud invoca prioridad a las Solicitudes de Patente provisional de los EE.UU. N° 61/555.335 (presentada el 3 de noviembre de 2011); 61/555.344 (presentada el 3 de noviembre de 2011); 61/589.715 (presentada el 23 de enero de 2012); 61/610.348 (presentada el 13 de marzo de 2012); y 61/654.631 (presentada el Io de junio de 2012), cuyos contenidos se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad.

DESCRIPCIÓN DEL ARCHIVO DE TEXTO PRESENTADO ELECTRÓNICAMENTE Los contenidos del archivo de texto presentado electrónicamente junto con la presente se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad: una copia en formato que puede leerse en computadora del Listado de Secuencias (nombre del archivo: TLRA_001_01WO_SeqList_ST25.txt, grabado con fecha: 5 de noviembre de 2012, tamaño del archivo 20 kilobytes) .

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con anticuerpos y métodos para inhibir selectivamente las respuestas inmunes por células T (TCR+) . En particular, la presente invención se relaciona con el tratamiento del rechazo de trasplantes, enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias con el uso de anticuerpos anti-aß TCR y fragmentos de anticuerpos. También se describen métodos y ensayos para identificar moduladores de respuestas inmunes por células T (TCR+) . En algunas formas de realización, los anticuerpos anti- ß TCR son anticuerpos TOLIOI monoclonales, anticuerpos TOLIOI quiméricos, anticuerpos TOLIOI humanizados o variantes de los mismos .

ANTECEDENTES Lo descrito en esta sección meramente provee información de antecedentes relacionados con la presente divulgación y puede no constituir arte previo.

El receptor de célula T (TCR) está compuesto por al menos 7 proteínas integrales de membrana. En la mayoría de las células T periféricas el TCR contiene un heterodímero unido por disulfuro clonalmente distribuido que consiste de una cadena a de TCR y cadena ß de TCR. Estas cadenas clonotípicas se subdividen en segmentos variables (V) , de unión (J) y constantes (C) para la cadena a y segmento de diversidad (D) para la cadena ß. En asociación con el ß TCR hay tres cadenas invariantes que forman el complejo CD3. El aß TCR es crítico para el reconocimiento antígeno/MHC mientras que las proteínas CD3 tienen un papel importante en la transducción de la señal.

La estructura de las cadenas ß TCR es similar a la de anticuerpos, con las regiones variables que resultan de la recombinación genética, generando la gran diversidad del repertorio de TCR. Por otra parte, las regiones constantes y transmembrana del aß TCR son conservadas. Estas regiones conservadas son muy importantes, ya que tienen un papel en la unión de las cadenas a y ß, interaccionan con las proteínas CD3 y tienen un papel en el transporte de componentes TCR desde el retículo endoplasmático hacia la superficie celular. Los pacientes que tienen mutaciones dentro de la región constante pueden tener un funcionamiento deteriorado del aß TCR, pero más comúnmente no pueden expresar completamente un TCR. Fisiológicamente, los pacientes con estas mutaciones sufren de inmunodeficiencia severa. Un estudio reciente en el Journal of Clinical Investigation mostró en muchos pacientes que un deterioro genético en la última base del exón 3 inmediatamente después del codón de terminación de la traducción en el gen constante de la subunidad de TCR da como resultado la inmunodeficiencia severa en niños, requiriendo una profilaxis con antibióticos y antivirales de por vida (Morgan, y col., "Mutation in the TCR subunidad constant gene (TRAC) leads to a human immunodeficiency disorder characterized by a lack of TCRa + T cells". J. Clin. Invest . , Feb 2011) .

En ausencia de intervención inmunosupresora luego del trasplante alogénico de órganos sólidos, las células presentadoras de antigeno del donante y del receptor presentan antigenos de injerto para las células T alfa-beta (aß) aloreactivas, las cuales, cuando se activan, dan como resultado una respuesta inflamatoria y un rápido rechazo del aloinjerto. Estas células T, las cuales incluyen células T colaboradoras (CD4) y citotóxicas (CD8), son criticas en la respuesta de rechazo agudo de trasplante de órganos ya que reconocen antigenos alogénicos, incluyendo antigenos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) , como extraños. Las células T gamma-delta (?d) expresan el receptor de células T ?d (TCR) y generalmente no reconocen antigenos proteicos en el contexto de MHC pero en su lugar reconocen antigenos no proteicos no convencionales. Las células T ?d pueden ser beneficiosas en los pacientes con trasplante renal desde varios puntos de vista, que incluyen proveer protección contra una variedad de infecciones microbianas contra las cuales los pacientes con trasplante inmunosuprimidos son particularmente vulnerables. Dichas infecciones incluyen citomegalovirus (CMV) , una infección viral común en pacientes con trasplante que, por sus propiedades inmunosupresoras , puede llevar a otras infecciones oportunistas asi como a trastornos linfoproliferativos posteriores al trasplante.

En ratones y humanos, la presencia de células T ?d del donante está asociada con mejores resultados en modelos de trasplante de médula ósea, en parte por la prevención de la enfermedad injerto versus huésped (GVHD) , por medio de mecanismos que no se entienden completamente. Un subconjunto de células T ?d es una población rara en la sangre periférica de humanos normales y la mayoría de los pacientes con trasplante de hígado, pero se expande a una mayor frecuencia en comparación a otros subconjuntos de células T ?d en la sangre periférica de pacientes con trasplante de hígado "tolerantes a operación".. Estos pacientes son considerados "tolerantes a operación" porque han alcanzado un nivel de tolerancia al aloinjerto que permite la eliminación total de la inmunosupresión . Este subconjunto expandido de células T ?d es el mismo que está asociado con la tolerancia de antígenos semialogénicos en individuos embarazados, indicando que estas células pueden tener un papel importante en la generación y/o mantenimiento de tolerancia contra antígenos alogénicos. Adicionalmente, una reducción en las células T ?d periféricas está asociado con el rechazo por aloinjerto renal agudo y crónico, mientras que los pacientes con trasplante de riñon sin rechazo, estables, tienen un mayor porcentaje de células T ?d, en promedio. En conjunto, estos estudios indican que un agente inmunosupresor que evita la disminución en número o inactivación de células T ?d puede estar asociado con mejores resultados.

Existe una necesidad no satisfecha por un agente con capacidad de inactivar selectivamente células T aß especificas de un modo no mitógeno, sin exponer innecesariamente al paciente a inmunosupresión no especifica, a largo plazo, o de final indefinido, que puede exacerbar los riesgos de infecciones y malignidades. Las células T gamma-delta son importantes mediadores en la protección contra agentes infecciosos y comparten varias características en común con las células T aß, que incluyen la expresión de CD25, CD52 y CD3. En sí, las terapias de inducción actualmente usadas, que incluyen globulina anti-timocitos (ATG) , alemtuzumab, basiliximab y daclizumab, hacen blanco no solo en células T aloreactivas sino también en células T ?d y células NK. Una estrategia más específica para la prevención del rechazo agudo de órganos o para tratar enfermedades inflamatorias o autoinmunes haciendo blanco solo en aß TCR, reservando células T ?d, puede proveer una eficacia similar o mejor que los anticuerpos dirigidos a células T actualmente usados a la vez que implican menos riesgos en términos de desarrollo de infecciones oportunistas y malignidades. A pesar de que se ha intentado el desarrollo de algunos anticuerpos específicos por ß TCR, ninguno ha mostrado suficiente eficacia clínica y un perfil de seguridad aceptable. Por lo tanto hay una necesidad de anticuerpos específicos por ß TCR que exhiben eficacia en enfermedades y condiciones que incluyen enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes y rechazo por aloinjerto, a la vez que exhiben mínimos efectos adversos.

SÍNTESIS A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por una persona con experiencia ordinaria en el arte al cual pertenece esta presente tecnología. A pesar de que los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden usarse en la práctica o ensayo de la presente tecnología, los métodos y materiales adecuados se describen más adelante. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no tienen como intención ser limitantes. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan a modo de referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones, será la que predomina.

La presente invención provee composiciones, métodos y ensayos para tratar una enfermedad inflamatoria y/o enfermedad autoinmune, y/o rechazo de tejido trasplantado usando anticuerpos anti- ß TCR y fragmentos de anticuerpos. En ciertas formas de realización, la presente invención provee métodos para tratar una enfermedad autoinmune, con solo una dosis de un anticuerpo anti-aß TCR por día. En algunas formas de realización, los anticuerpos anti- ß TCR de la presente invención son anticuerpos TOL101 monoclonales, anticuerpos TOL101 quiméricos, anticuerpos TOL101 humanizados, o variantes de los mismos. Los anticuerpos TOL101 monoclonales son anticuerpos IgM monoclonales de ratón que se unen a un ß TCR humano y son producidos por un hibridoma que se designa Banco de Células Maestras (MCB) TOL101. El hibridoma MCB TOL101, que produce TOL101, se depositó el 2 de noviembre de 2012 en la Colección de Cultivos Tipo Americano (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, bajo las cláusulas del tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para el Propósito de Procedimientos de Patentes y número de acceso de ATCC asignado .

En un aspecto, la presente invención provee una linea celular de hibridoma aislada que produce un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une a aß TCR.

En una forma de realización, la linea celular de hibridoma es MCB TOL101. En otros aspectos, la presente invención provee un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antigeno del mismo, que se une al ß TCR y está glicosilado en residuos de aminoácidos equivalentes o correspondientes como el anticuerpo producido por el hibridoma MCB TOL101. En otra forma de realización de la invención, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo es TOL101 o un fragmento del mismo, el cual es producido por el hibridoma MCB TOL101.

En una forma de realización, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo de la invención no induce producción de una citoquina con unión al ß TCR en una célula T. En otra forma de realización, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo de la invención no induce la producción del Factor de Necrosis Tumoral-alfa (TNF-a) , Interferón-gamma (IFN-?), Interleuquina-2 y/o Interleuquina-6 con unión al ß TCR en una célula T. En otra forma de realización, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo de la invención no produce niveles de citoquinas asociadas con el síndrome de liberación de citoquinas con la unión al aß TCR en una célula T. En otra forma de realización, las citoquinas asociadas con el síndrome de liberación de citoquinas son TNF-a, IFN-?, interleuquina-2 y/o interleuquina-6. En otra forma de realización, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo de la invención induce la producción de menos de 500 pg/mL de TNF-a con la unión a aß TCR en una célula T. En otra forma de realización, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo de la invención induce la producción de menos de 500 pg/mL de IFN-? con la unión a ß TCR en una célula T. En otra forma de realización, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo de la invención induce la producción de menos de 500 pg/mL de interleuquina-2 con la unión a aß TCR en una célula T. En otra forma de realización, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo de la invención induce la producción de menos de 500 pg/mL de Interleuquina-6 con la unión a aß TCR en una célula T. En otra forma de realización, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo de la invención se une a ß TCR en una célula T, en donde el anticuerpo se une a ß TCR y reduce la expresión en superficie de aß TCR y CD3 en la célula T y en donde el anticuerpo no reduce el número de células T. En otra forma de realización, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo de la invención induce la fosforilación de AKT o ERK con la unión a ß TCR. En otra forma de realización, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo de la invención induce el flujo de calcio en menos del 60% de células T aß TCR+. En otra forma de realización, el anticuerpo o fragmento del mismo induce el flujo de calcio en menos del 50% de células T aß TCR+. En otra forma de realización, el anticuerpo o fragmento del mismo induce el flujo de calcio en menos del 40% de células T aß TCR+. En otra forma de realización, el anticuerpo o fragmento del mismo induce el flujo de calcio en menos del 30% de células T aß TCR+. En otra forma de realización, el anticuerpo o fragmento del mismo induce el flujo de calcio en menos del 20% de células T aß TCR+. En otra forma de realización, el anticuerpo o fragmento del mismo induce el flujo de calcio en menos del 15% de células T aß TCR+. En aún otra forma de realización, el anticuerpo o fragmento del mismo induce el flujo de calcio en menos del 10% de células T aß TCR+ . En otra forma de realización, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo de la invención reduce la unión de otros anticuerpos específicos por el aß TCR, que incluyen IP26, 3a8 y T10B9. En una forma de realización, el anticuerpo o fragmento del mismo reduce la unión del anticuerpo monoclonal T10B9, 3a8, o IP26 al aß TCR entre aproximadamente 10% y aproximadamente 100%. En otra forma de realización, el anticuerpo o fragmento del mismo reduce la unión de anticuerpo monoclonal T10B9, 3a8, o IP26 al aß TCR entre aproximadamente 40% y aproximadamente 90%. En aún otra forma de realización, el anticuerpo o fragmento del mismo reduce la unión de anticuerpo monoclonal T10B9, 3a8, o IP26 al aß TCR entre aproximadamente 60% y aproximadamente 80%. En aún otra forma de realización, el anticuerpo o fragmento del mismo reduce la unión de anticuerpo monoclonal T10B9, 3a8, o IP26 al aß TCR en al menos 80%. En otra forma de realización, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo se une a ß TCR en una célula T, en donde entrecruzamiento del anticuerpo o fragmento del mismo no induce la proliferación de la célula T. Como se usa en la presente, el término "entrecruzamiento" se refiere a inmovilizar el anticuerpo, por ejemplo, sobre una superficie plástica en fase sólida.

En una forma de realización, la presente invención provee un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo en donde las tres regiones determinantes de complementariedad de la cadena liviana (CDRLl, CDRL2 y CDRL3) y las tres regiones determinantes de complementariedad de la cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3) son las regiones determinantes de complementariedad de las cadenas liviana y pesada del anticuerpo producido por el hibridoma MCB TOLIOI. En otra forma de realización, el anticuerpo o fragmento del mismo está codificado por una secuencia de polinucleótidos que comprende SEQ ID NOs: 3, 4 y 5. En otra forma de realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NOs: 6, 7 y 8.

En algunas formas de realización, la presente invención provee un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une a aß TCR, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo es un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un scFv, un fragmento Fab, un fragmento Fab' y un fragmento F(ab) ' .

En una forma de realización, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo se une a aß TCR y está acoplado a una marca que se puede detectar, que incluye, a titulo enunciativo no taxativo, un radioisótopo, una enzima, una marca fluorescente, una marca luminiscente, una biomarca luminiscente, biotina o toxina.

En una forma de realización, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo de la invención se une a aß TCR en una célula T y, luego del entrecruzamiento del anticuerpo o fragmento de unión a antigeno no induce la proliferación de la célula T.

En un aspecto, la presente invención provee un método para tratar, prevenir el inicio de, mejorar o reducir los síntomas de una enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune, o rechazo de tejido trasplantado que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo a un paciente humano que lo necesita, en donde el anticuerpo o fragmento se une a aß TCR. En otro aspecto, la presente invención provee un método para inhibir una respuesta inmune por células T con el objetivo de tratar, prevenir el inicio de, mejorar, o reduce los síntomas de una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune, o una respuesta contra un tejido trasplantado, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti- ß TCR o fragmento de unión a antígeno del mismo a un paciente humano que lo necesita. Las enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, o rechazo de tejido trasplantado que puede detectarse, diagnosticarse, tratarse, pronosticarse, mejorarse o monitorearse por los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención incluyen, a título enunciativo no taxativo: asma, alergia, inflamación alérgica de las vías aéreas, encefalomielitis alérgica, artritis autoinmune, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reactiva, artritis psoriática, sacroilitis, uveitis anterior aguda aislada, espondiloartropatía no diferenciada, Diabetes Mellitus tipo 1, Esclerosis Múltiple, Lupus Eritematoso Sistémico, glomerulonefritis , tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, Escleroderma, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria de los intestinos, colitis ulcerativa, espondilitis anquilosante, síndrome de Sjogren, psoriasis, dermatitis por contacto, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Addison, granulomatosis de egener, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante, hepatitis autoinmune, polimialgia reumática, enfermedad de Bechet, síndrome de Guillain-Barre, diferentes vasculitis, uveoretinitis, tiroditis, miastenia gravis, nefropatías por inmunoglobulinas, miocarditis, esclerosis sistémica progresiva, rechazo de injerto de órgano, rechazo de tejido conectivo mezclado y enfermedad injerto versus huésped.

En una forma de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención se une a aß TCR e induce una respuesta de anticuerpo anti-ratón de humano (HAMA) en menos del 20% de los pacientes humanos administrados con el anticuerpo o fragmento del mismo medido por Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima (ELISA) . En otra forma de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a ß TCR e induce una respuesta HAMA en menos del 10% o 5% de los pacientes humanos administrados con el anticuerpo o fragmento del mismo medido por ELISA.

En una forma de realización, la presente invención también provee un método para producir un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que comprende transfectar una célula huésped mamífera con una secuencia de polinucleótidos que codifica para un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende las seis regiones determinantes de complementariedad (CDRl, CDR2 y CDR3) de la cadena liviana y pesada del anticuerpo producido por el hibridoma MCB TOLlOl; cultivar la célula huésped; y aislar el anticuerpo o fragmento del mismo producido por la célula huésped que se une a aß TCR. En una forma de realización, el anticuerpo o fragmento del mismo producido por este método reduce la expresión en superficie de aß TCR y CD3 en la célula T y no reduce el número de células T. En otra forma de realización, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo producido por este método está codificado por una secuencia de polinucleótidos que comprende SEQ ID NOs : 3 y 4. En otra forma de realización, la secuencia de polinucleótidos además comprende SEQ ID NO: 5. En aún otra forma de realización, el anticuerpo aislado producido por este método es TOLlOl.

En otro aspecto, la presente invención provee un método para identificar un compuesto terapéutico que reprime la activación de las células T TCR+. En otra forma de realización, el método incluye los pasos de: (a) poner en contacto el receptor de células ß T ( ß TCR) o fragmento del mismo con un anticuerpo anti- ß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo bajo condiciones operables para formar un complejo TCR-anti-aß TCR; (b) poner en contacto el complejo TCR-anti-aß TCR; con un compuesto candidato; (c) determinar la capacidad del compuesto candidato para modular la unión del anticuerpo anti- ß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo al TCR o fragmento del mismo y (d) determinar si dicho compuesto candidato activa una célula T en reposo de un anticuerpo anti-CD3, en donde la modulación de la unión de dicho anticuerpo anti- ß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo a dicho TCR o fragmento del mismo y falla en la activación de una célula T en reposo indica que dicho compuesto candidato es un compuesto terapéutico. En otro aspecto adicional, la presente invención incluye un método para tratar una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune, o un rechazo de tejido trasplantado, el método incluyen el paso: administrar un anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo en una cantidad entre aproximadamente 14 mg/dia y aproximadamente 52 mg/dia a un sujeto que lo necesita en donde el anticuerpo es producido por el hibridoma MCB TOL101.

En una forma de realización, la presente invención provee un método para tratar una enfermedad autoinmune, enfermedad inflamatoria, o rechazo de tejido trasplantado, que comprende administrar un anticuerpo contra ß TCR o fragmento de unión a antigeno del mismo en una cantidad entre aproximadamente 7 mg/dia y aproximadamente 58 mg/dia a un sujeto que lo necesita. En otra forma de realización, el anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de unión a antigeno del mismo es producido por el hibridoma MCB TOLlOl. En otra forma de realización, the anti-aß TCR anticuerpo o fragmento del mismo se administra en una cantidad de 7 mg/dia, 14 mg/dia, 21 mg/dia, 28 mg/dia, 30 mg/dia, 32 mg/dia, 34 mg/dia, 35 mg/dia, 36 mg/dia, 38 mg/dia, 40 mg/dia, 42 mg/día, 44 mg/dia, 46 mg/dia, 48 mg/dia, 50 mg/dia, 52 mg/dia, 54 mg/dia, 56 mg/dia o 58 mg/dia, o combinaciones de los mismos.

En una forma de realización, la presente invención provee un método para tratar una enfermedad autoinmune, enfermedad inflamatoria, o rechazo de tejido trasplantado, que comprende administrar un anticuerpo dirigido contra aß TCR o fragmento de unión a antigeno del mismo en un esquema de dosificación que comprende 14 mg en el dia 1, 21 mg en el dia 2, 28 mg en el dia 3, 42 mg en el dia 4 y 42 mg en el dia 5. En otra forma de realización, el anticuerpo o fragmento del mismo se administra en un esquema de dosificación que comprende 14 mg en el dia 1, 21 mg en el dia 2, 28 mg en el dia 3, 42 mg en el dia 4, 42 mg en el dia 5 y 42 mg en el dia 6. En una forma de realización, el anticuerpo dirigido contra ß TCR o fragmento de unión a antigeno del mismo se administra una vez por dia.

En un aspecto, la presente invención provee un método para inducir las células T regulatorias (Tregs) en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar un anticuerpo dirigido contra ß TCR o fragmento de unión a antigeno del mismo en un esquema de dosificación que comprende 14 mg en el día 1, 21 mg en el día 2, 28 mg en el día 3, 42 mg en el día 4 y 42 mg en el dia 5. En otra forma de realización, el anticuerpo o fragmento del mismo se administra en un esquema de dosificación que comprende 14 mg en el dia 1, 21 mg en el dia 2, 28 mg en el dia 3, 42 mg en el dia 4, 42 mg en el dia 5 y 42 mg en el dia 6. En una forma de realización, la concentración de Tregs por mililitro de sangre entera presente en el sujeto se determina antes de comenzar el esquema de dosificación para obtener un nivel basal de Tregs por mililitro de sangre entera en el sujeto. En algunas formas de realización, la Tregs son fenotipicamente Tregs CD2+ CD4+ CD25+ F0XP3+ CD1271o. En algunas formas de realización, el número de Tregs se determina usando marcadores de superficie celular y citometria de flujo. En algunas formas de realización, un método para inducir Tregs se provee en donde el sujeto necesita que le inhiban las células T aloreactivas , o inhiban la actividad de las células T citotóxicas (CTL) , o inmunosuprimirle una alorespuesta, o inhiban una respuesta inmune, o inhiban, prevengan o bloqueen una alorespuesta o una respuesta autoinmune antes de, durante o posteriormente a un trasplante de tejido, o inhibir, suprimir o bloquear la enfermedad de injerto vs . huésped, o prevenir, tratar o suprimir una respuesta autoinmune en una enfermedad inflamatoria, o enfermedad autoinmune.

Los detalles de una o más formas de realización de la presente invención se indican en las figuras acompañantes y en la descripción más adelante. Otras áreas de aplicabilidad resultarán evidentes a partir de la descripción provista en la presente. Se debe entender que la descripción y los ejemplos específicos tienen como intención solo propósitos de ilustración y no tienen como intención limitar el alcance de la presente divulgación.

FIGURAS Las figuras descritas en la presente tienen solo el propósito de ilustración y no tienen como intención limitar el alcance de la presente divulgación en ningún sentido.

La Figura 1 describe un gráfico de barras que ilustra que TOL101 suprime la proliferación en una reacción de linfocitos mezclados (MLR) de una vía.

La Figura 2 describe un gráfico de líneas del curso en el tiempo de la proliferación de células T en un MLR de una vía en presencia de TOL101 a diferentes concentraciones.

La Figura 3 describe un gráfico de barras de proliferación de células T en presencia de TOL101 en una forma libre versus entrecruzado con diferentes concentraciones .

La Figura 4 describe un gráfico de barras que describe la supresión mediada por TOL101 de la proliferación de células T mediada por anti-CD3.

La Figura 5 describe pictogramas de citometria de flujo que ilustran la especificidad de TOL101 a células T aß TCR+ con un fenotipo activado y sin activación previa.

La Figura 6 describe pictogramas de citometria de flujo que ilustran la especificidad de TOL101 por subconjuntos de células T aß TCR+ activadas en una reacción de linfocitos mezclados de una vía.

La Figura 7 describe pictogramas de citometria de flujo que ilustran la especificidad de TOL101 por subconjuntos de memoria de células T aß TCR+ de células mononucleares de sangre periférica aislados frescas.

La Figura 8 describe pictogramas de citometria de flujo que ilustran la especificidad o fTOLlOl del subconjunto de memoria de células T ß TCR+ de células mononucleares de sangre periférica aislados frescas después de la estimulación en una reacción de linfocitos mezclados de una via.

La Figura 9 describe pictogramas de citometria de flujo que ilustran la unión disminuida de TOL101 después de la activación con anti-CD3 de células mononucleares de sangre periférica aislados.

La Figura 10 describe un histograma de fosforilación de ZAP70 en células T y la capacidad de TOL101 para reducir la fosforilación de ZAP70 mediada por anti-CD3.

La Figura 11A describe un histograma de la fosforilación de ERK/p38 en células T bajo diferentes condiciones y la capacidad de TOL101 para inducir ERK fosforilado en células T tratadas con anti-CD3. La Figura 11B muestra los valores en crudo de la fosforilación de ERK/p38 bajo cada condición.

La Figura 12A describe un histograma de fosforilación de STAT1 en células T en presencia y ausencia de anti-CD3 y/o TOL101. La Figura 12B muestra los valores en crudo de la fosforilación de ERK/p38 bajo cada condición.

La Figura 13A describe un histograma de fosforilación de STAT3 en células T en presencia y ausencia de anti-CD3 y/o TOL101. La Figura 13B muestra los valores en crudo de la fosforilación de ERK/p38 bajo cada condición.

La Figura 14A describe un histograma de fosforilación de STAT5 en células T en presencia y ausencia de anti-CD3 y/o TOL101. La Figura 14B muestra los valores en crudo de la fosforilación de ERK/p38 bajo cada condición.

La Figura 15A describe un histograma de fosforilación de STAT6 en células T en presencia y ausencia de anti-CD3 y/o TOL101. La Figura 15B muestra los valores en crudo de la fosforilación de ERK/p38 bajo cada condición.

La Figura 16 describe un protocolo para el tratamiento de receptores de trasplante renal usando TOL101 y correspondientes puntos de valoración clínicos.

La Figura 17 describe una representación esquemática de esquemas de dosificación para el protocolo de tratamiento de la Figura 16.

La Figura 18 describe un gráfico de líneas de un curso en el tiempo de recuento de CD3 en pacientes humanos en presencia de TOL101 a diferentes concentraciones.

La Figura 19 describe un gráfico de líneas que representa la respuesta de células T con terapia de TOL101 28mg durante un período de dos semanas, que muestra la presencia de células T carentes de un complejo TCR durante el período de dosificación.

La Figura 20 describe un gráfico de barras de supresión de la respuesta antialogénica in vitro en presencia de TOL101.

La Figura 21 describe un gráfico de líneas del ensayo de liberación de citoquinas usando muestras obtenidas de pacientes con TOL101 en comparación con datos de rATG históricos a múltiples puntos en el tiempo.

La Figura 22 describe un gráfico de líneas de un curso en el tiempo de biodisponibilidad de TOLIOI a dosificaciones de 0,28 y 1,4 mg durante un período de tiempo; los resultados se presentan como niveles en plasma de TOLIOI.

La Figura 23 describe un gráfico de líneas de un curso en el tiempo de biodisponibilidad de TOLIOI a dosificaciones de 7 y 14 mg durante un período de tiempo; los resultados se presentan como niveles en plasma de TOLIOI.

La Figura 24 describe un gráfico de líneas de un curso en el tiempo de biodisponibilidad de TOLIOI a una dosificación de 28 mg durante un período de tiempo; los resultados se presentan como niveles en plasma de TOLIOI.

La Figura 25 describe resultados de citometría de flujo de recuentos de células T obtenidas de sangre entera usando el procedimiento con fluoroesferas de recuento en flujo Beckman Coulter. Los resultados obtenidos son indicativos de expresión de CD2, CD3 y CD45 luego de la incubación con TOLIOI.

La Figura 26 describe un gráfico de líneas que ilustra los cambios en los marcadores de expresión de fenotipo de células T CD3, CD4 y CD8 durante un período de tiempo después de la exposición a TOLIOI.

La Figura 27 es una representación esquemática del mecanismo de acción de TOLIOI respecto a células T ß TCR+ . El esquema muestra que TOLIOI provoca la eliminación del complejo TCR de la superficie celular sin agotar las células.

La Figura 28 es un gráfico de lineas gue demuestra la inducción de Treg en pacientes en un estudio clínico gue recibieron un régimen de escalado de dosis de TOL101.

La Figura 29 es un esguema de los pasos iniciales de la unión de TOL101 unión e inducción de Tregs.

La Figura 30 es un esguema continuado de la Figura 29, gue muestra una vía potencial por la cual TOL101 induce las Tregs cuando se da en un régimen de escalado de dosis.

Las Figuras 31 A-E son gráficos de líneas gue demuestran los niveles de TNF (panel A), IFN-? (panel B) , IL6 (panel C) , ILi (panel D) y IL2 (panel E) en sujetos humanos tratados con TOL101 en ensayo clínico. La Figura 31 F es un gráfico de barras que demuestra el nivel de inducción de anticuerpo anti-ratón de humano (HAMA) en un ensayo clínico de Fase 2 de TOL101.

La Figura 32 es un listado de recuento de CD3 de pacientes enrolados en el estudio clínico de Fase 2 de TOL101.

La Figura 33 A-C describe las medidas de eficacia del estudio clínico de Fase 2 de TOL101. El Panel A es un gráfico de líneas que describe las tasas de rechazos agudos probados por biopsia así como la supervivencia de pacientes e injertos (comúnmente referido como el punto de valoración triple del trasplante) . El Panel B es un gráfico de lineas que muestra la tasa de filtración glomerular estimada. El Panel C es un gráfico en grupos que muestra la tasa de filtración glomerular medida de pacientes en el estudio de Fase 2 de TOLIOI.

La Figura 34 describe un subconjunto de gráficos de puntos e histogramas de citometria de flujo que muestran la especificidad de TOLIOI por aß TCR, indicando que el anticuerpo se une a la cadena alfa.

La Figura 35 describe un conjunto de gráficos de barras que ilustran la supresión de IFN-gamma por TOLIOI en un MLR de una via.

La Figura 36 muestra que TOLIOI no modula la proliferación inducida por CD28.

La Figura 37 describe el flujo de calcio en células T CD4 estimuladas con ionomicina, anti-CD3, o TOLIOI.

La Figura 38 describe la fosforilación proteínas de la proteína de choque térmico 27, quinasa activada por la proteína MAPK p38a y AKT2 luego del tratamiento con TOLIOI en comparación con el tratamiento con anti-CD3 y medios control. ND = no detectado.

La Figura 39 describe la estrategia de gatilleo y la inducción de FoxP3 por TOLIOI en un MLR de dos vías.

La Figura 40 muestra la estructura esquemática y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) de un scFV derivado de la secuencia de aminoácidos de TOL101 (panel A) ; una electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS de scFV bajo condiciones reductoras y no reductoras (panel B) ; y citometria de flujo mostrando la capacidad del scFV para unirse a las célul¾s T CD8 y CD4 (panel C) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA La siguiente descripción de tecnología es meramente ej emplificativa en la naturaleza del tema sujeto, fabricación y uso de una o más de las presentes invenciones y no tiene como intención limitar el alcance, aplicación, o usos de cualquiera de las presentes tecnologías invocadas en esta solicitud o en otras aplicaciones que pueden presentarse invocando prioridad a esta solicitud, o patentes que surgen de ella. Las siguientes definiciones y guías no limitantes deben considerarse como revisión de la descripción de la tecnología descrita en la presente.

El término "anticuerpo", como se usa en la presente, tiene como intención referirse a moléculas de inmunoglobulina comprendidas por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas livianas (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está comprendida de una región variable de cadena pesada (abreviado en la presente como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está comprendida por tres dominios, CHl, CH2 y CH3. Cada cadena liviana está comprendida por una región variable de la cadena liviana (abreviado en la presente como LCVR o VL) y una región constante de cadena liviana. La región constante de cadena liviana está comprendida por un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR) , intercaladas con regiones que son más conservadas, llamadas regiones esqueleto (FR) . Cada región variable (VH o VL) contiene 3 CDR, designadas CDR1, CDR2 y CDR3. Cada región variable también contiene 4 subregiones esqueleto, designadas FR1, FR2, FR3 y FR . El término anticuerpo incluye todos los tipos de anticuerpos, que incluyen, por ejemplo, IgG e IgM. En algunas formas de realización, los anticuerpos son IgM y en algunas formas de realización, la IgM forma pentámeros polimerizados .

Como se usa en la presente, el término "fragmentos de anticuerpos" y "fragmento de unión a antigeno", en referencia a un anticuerpo, se refiere a una porción de un anticuerpo intacto que tiene la capacidad de unirse al mismo antigeno que el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, a titulo enunciativo no taxativo, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena simple (scFv) , fragmentos Fv, Fab y F(ab')2 y anticuerpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos preferentemente retienen al menos parte de la región variable de la cadena pesada y/o liviana.

El término "anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo" se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a la cadena alfa del receptor de células T de humano, la cadena beta del receptor de células T de humano, o las cadenas alfa y beta del receptor de células T de humano.

Como se usa en la presente, la frase "anticuerpo TOL101" se refiere a un anticuerpo IgM monoclonal murino anti- ß TCR que se une a un aß TCR humano y es producido por el hibridoma TOL101 del Banco de Células Maestras (MCB) . Como se usa en la presente, el término "banco de células maestras" se refiere a un cultivo de células completamente caracterizadas procesadas juntas para asegurar uniformidad y estabilidad. Típicamente, una MCB es una línea celular de hibridoma que es ensayada y determinada para proveer una fuente estable y uniforme de un anticuerpo monoclonal particular. El MCB TOL101 se depositó el 2 de noviembre de 2012 en la ATCC y se le asignó el número de acceso de ATCC .

El TOL101 tiene una cadena liviana codificada por la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 3: ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAAT A CCAGAGGACAAA TTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACC ATGACCTGCAGTGC CAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCA AAAGATGGATTTAT GACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGG GACCTCTTACTCTC TCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGG AGTAGTAACCCATT CACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTG TATCCATCTTCCCA CCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAA CTTCTACCCCAAAG ACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAAC AGTTGGACTGATCA GGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACG AGTATGAACGACAT AACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAG CTTCAACAGGAATG AGTGTTAG .

El TOL101 tiene una cadena pesada codificada por el polinucleótido de la SEQ ID NO: 4: ATGGAAAGGCACTGGATCTTTCTACTCCTGTTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTC CCAGGTCCAGCTG CAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAA GGCTTCTGGCTAC ACCTTTACTAGCTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGA ATGGATTGGATAC ATTAATCCTAGCAGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCAC ATTGACTGCAGAC AAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGC AGTCTATTACTGT GCAAGATGGAGGGACGCGTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGT CACCGTCTCCTCA GAGAGTCAGTCCTTCCCAAATGTCTTCCCCCTCGTCTCCTGCGAGAGCCCCCTGTC TGATAAGAATCTG GTGGCCATGGGCTGCCTGGCCCGGGACTTCCTGCCCAGCACCATTTCCTTCACCTG GAACTACCAGAAC AACACTGAAGTCATCCAGGGTATCAGAACCTTCCCAACACTGAGGACAGGGGGCAA GTACCTAGCCACC TCGCAGGTGTTGCTGTCTCCCAAGAGCATCCTTGAAGGTTCAGATGAATACCTGGT ATGCAAAATCCAC TACGGAGGCAAAAACAGAGATCTGCATGTGCCCATTCCAGCTGTCGCAGAGATGAA CCCCAATGTAAAT GTGTTCGTCCCACCACGGGATGGCTTCTCTGGCCCTGCACCACGCAAGTCTAAACT CATCTGCGAGGCC ACGAACTTCACTCCAAAACCGATCACAGTATCCTGGCTAAAGGATGGGAAGCTCGT GGAATCTGGCTTC ACCACAGATCCGGTGACCATCGAGAACAAAGGATCCACACCCCAAACCTACAAGGT CATAAGCACACTT ACCATCTCTGAAATCGACTGGCTGAACCTGAATGTGTACACCTGCCGTGTGGATCA CAGGGGTCTCACC TTCTTGAAGAACGTGTCCTCCACATGTGCTGCCAGTCCCTCCACAGACATCCTAAC CTTCACCATCCCC CCCTCCTTTGCCGACATCTTCCTCAGCAAGTCCGCTAACCTGACCTGTCTGGTCTC AAACCTGGCAACC TATGAAACCCTGAATATCTCCTGGGCTTCTCAAAGTGGTGAACCACTGGAAACCAA AATTAAAATCATG GAAAGCCATCCCAATGGCACCTTCAGTGCTAAGGGTGTGGCTAGTGTTTGTGTGGA AGACTGGAATAAC AGGAAGGAATTTGTGTGTACTGTGACTCACAGGGATCTGCCTTCACCACAGAAGAA ATTCATCTCAAAA CCCAATGAGGTGCACAAACATCCACCTGCTGTGTACCTGCTGCCACCAGCTCGTGA GCAACTGAACCTG AGGGAGTCAGCCACAGTCACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTCTCCTGCAGACATCAG TGTGCAGTGGCTT CAGAGAGGGCAACTCTTGCCCCAAGAGAAGTATGTGACCAGTGCCCCGATGCCAGA GCCTGGGGCCCCA GGCTTCTACTTTACCCACAGCATCCTGACTGTGACAGAGGAGGAATGGAACTCCGG AGAGACCTATACC TGTGTTGTAGGCCACGAGGCCCTGCCACACCTGGTGACCGAGAGGACCGTGGACAA GTCCACTGGTAAA CCCACACTGTACAATGTCTCCCTGATCATGTCTGACACAGGCGGCACCTGCTATTG A.

El TOL101 tiene una cadena J codificada por la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 5: ATGAAGACCCACCTGCTTCTCTGGGGAGTCCTGGCCATTTTTGTTAAGGCTGTCCT TGTAACAGGTGACG ACGAAGCGACCATTCTTGCTGACAACAAATGCATGTGTACCCGAGTTACCTCTAGG ATCATCCCTTCCAC CGAGGATCCTAATGAGGACATTGTGGAGAGAAATATCCGAATTGTTGTCCCTTTGA ACAACAGGGAGAAT ATCTCTGATCCCACCTCCCCACTGAGAAGGAACTTTGTATACCATTTGTCAGACGT CTGTAAGAAATGCG ATCCTGTGGAAGTGGAGCTGGAAGATCAGGTTGTTACTGCCACCCAGAGCAACATC TGCAATGAAGACGA TGGTGTTCCTGAGACCTGCTACATGTATGACAGAAACAAGTGCTATACCACTATGG TCCCACTTAGGTAT CATGGTGAGACCAAAATGGTGCAAGCAGCCTTGACCCCCGATTCTTGCTACCCTGA CTAG.

La secuencia de aminoácidos de la cadena liviana de TOL101 tiene la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 6: MDFQVQIFSFLLISASVIISRGQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMH YQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQ SSNPF TFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQN GVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de TOL101 tiene la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 7: MERHWIFLLLLSVTAGVHSQVQLQQSGAELARPGASVK SCKASGYTFTSYT HWV KQRPGQGLE IGYINPSSGYTNYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAR WRDAYYAMDYWGQGTSVTVSSESQSFPNVFPLVSCESPLSDKNLVAMGCLARDFLPSTISF TWNYQNNTEVIQGIRTFPTLRTGGKYLATSQVLLSPKSILEGSDEYLVCKIHYGGKNRDLH VPIPAVAEMNPNVNVFVPPRDGFSGPAPRKSKLICEATNFTPKPITVS LKDGKLVESGFT TDPVTIENKGSTPQTYKVISTLTISEIDWLNLNVYTCRVDHRGLTFLKNVSSTCAASPSTD ILTFTIPPSFADIFLSKSANLTCLVSNLATYETLNIS ASQSGEPLETKIKIMESHPNGTF SAKGVASVCVEDWNNRKEFVCTVTHRDLPSPQ KFISKPNEVHKHPPAVYLLPPAREQLNL RESATVTCLVKGFSPADISVQ LQRGQLLPQEKYVTSAPMPEPGAPGFYFTHSILTVTEEE WNSGETYTCVVGHEALPHLVTERTVDKSTGKPTLYNVSLI SDTGGTCY La secuencia de aminoácidos de la cadena J de TOL101 tiene la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 8: MKTHLLL GVLAIFVKAVLVTGDDEATILADNKCMCTRVTSRIIPSTEDPNEDIVE RNIRIVVPLNNRENISDPTSPLRRNFVYHLSDVCKKCDPVEVELEDQVVTATQSNICNEDD GVPETCYMYDRNKCYTTMVPLRYHGETKMVQAALTPDSCYPD Como se usa en la presente un "aß TCR" puede incluir un heterodimero de una a-subunidad de mamífero y una ß-subunidad de mamífero de un TCR de mamífero. En algunas formas de realización, la -subunidad de mamífero puede comprender la secuencia de aminoácidos de una a-subunidad de humano, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l: MAKTTQPNSMESNEEEPVHLPCNHSTISGTDYIH YRQLPSQGPEYVIHGLTSNVNNRMAS LAIAEDRKSSTLILHRATLRDAAVYYCILPLAGGTSYGKLTFGQGTILTVHPNIQNPDPAV YQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSD FACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS.

En algunas formas de realización, la ß-subunidad de mamífero puede comprender la secuencia de aminoácidos de una ß-subunidad de humano, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2: MAGSHMGVSQSPRYKVAKRGQDVALRCDPISGHVSLFWYQQALGQGPEFLTYFQNEAQLDK SGLPSDRFFAERPEGSVSTLKIQRTQQEDSAVYLCASSLGQAYEQYFGPGTRLTVTEDLKN VFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQ PALNDSRYCLSSRLRVSA FWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWG RADCTSGD DDDK.

En algunas formas de realización, un aß TCR de humano ilustrativo puede ser un heterodímero que comprende las subunidades aß de las SEQ ID NOs: 1 & 2. En algunas formas de realización, un aß TCR humano o fragmento del mismo comprende al menos una porción de las SEQ ID NOs: 1 & 2. En algunas formas de realización, el aß TCR humano puede incluir una porción o fragmento que incluye al menos una porción de la SEQ ID NO: 1 o 2.

Como se usa en la presente, los términos "región determinante de complementariedad" y "CDR" se refieren a las regiones que son principalmente responsables de la unión a antígeno. Hay tres CDR en la región variable de la cadena liviana ( CDRL1 , CDRL2 y CDRL3) y tres CDR en una región variable de la cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3) . Los residuos que forman estas seis CDR han sido caracterizadas por Kabat y Chothia como a continuación: residuos 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) y 89-97 (CDRL3) en la región variable de la cadena liviana y 31-35 (CDRHl ) , 50-65 (CDRH2) y 95-102 (CDRH3) en la región variable de la cadena pesada; Kabat y col., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., que se incorpora a la presente a modo de referencia; y los residuos 26-32 (CDRL1), 50-52 (CDRL2) y 91-96 (CDRL3) en la región variable de la cadena liviana y 26-32 (CDRHl), 53-55 (CDRH2) y 96-101 (CDRH3) en la región variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917, que se incorpora a la presente a modo de referencia. En ciertas formas de realización, los términos "región determinante de complementariedad" y "CDR" como se usa en la presente, incluyen los residuos que abarcan las definiciones de Kabat y Chothia (es decir, los residuos 24-34 (CDRL1) , 50-56 (CDRL2) y 89-97 (CDRL3 ) en la región variable de la cadena liviana; y 26-35 (CDRHl), 50-65 (CDRH2) y 95-102 ( CDRH3 ) ) . También, a menos que se especifique, como se usa en la presente, la numeración de los residuos de la CDR es de acuerdo con Kabat. En ciertas formas de realización, la presente invención provee anticuerpos humanizados de las seis CDR de TOL101, dentro de un esqueleto humano (por ejemplo, los hibridomas depositados son secuenciados y los anticuerpos humanizados son ensamblados en forma recombinante de acuerdo con técnicas conocidas en el arte) .

Como se usa en la presente, el término "esqueleto" se refiere a los residuos de la región variable diferentes de los residuos de la CDR como se define en la presente. Hay cuatro subregiones de esqueleto separadas que forman el esqueleto: FRl, FR2 , FR3 y FR4. Con el objetivo de indicar si la subregión del esqueleto está en la región variable de la cadena liviana o pesada, se debe agregar una "L" o "H" a la abreviatura de la subregión (por ejemplo, "FRL1" indica subregión 1 del esqueleto de la región variable de la cadena liviana) . A menos que se especifique, la numeración de los residuos del esqueleto es de acuerdo con Kabat. Se indica que, en ciertas formas de realización, los anticuerpos anti-aß TCR o fragmentos de los mismos pueden tener menos de un esqueleto completo (por ejemplo pueden tener una porción de un esqueleto que solo contenga una o más de las cuatro subregiones) .

Como se usa en la presente, el término "esqueleto completamente humano" significa un esqueleto con una secuencia de aminoácidos que se encuentra naturalmente en humanos. Los ejemplos de esqueletos completamente humanos, incluyen, a titulo enunciativo no taxativo, KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI , LAY y POM (véase, por ejemplo, Kabat y col., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, NIH, EE.UU.; y Wu y col., (1970) J. Exp. Med. 132, 211-250, las cuales se incorporan a la presente a modo de referencia) . En ciertas formas de realización, los anticuerpos humanizados de la presente invención tienen esqueletos completamente humanizados, o esqueletos con uno o más aminoácidos cambiados para acomodar las CDR murinas de TOL101.

Como se usa en la presente, anticuerpos "humanizados" se refiere a una molécula quimérica, generalmente preparada usando técnicas recombinantes , que tienen un sitio de . unión a antigeno derivado de una inmunoglobulina de una especie no humana y la estructura de inmunoglobulina remanente de la molécula en base a la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión a antigeno puede comprender dominios variables completos fusionados sobre dominios constantes o solo las regiones determinantes de complementariedad (CDR) injertadas sobre regiones de esqueleto apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión a antigeno pueden ser de tipo salvaje o modificados por una o más sustituciones de aminoácidos. Esto generalmente elimina la región constante como inmunógeno en individuos humanos, pero la posibilidad de una respuesta inmune contra la región variable foránea generalmente permanece. Otra estrategia se enfoca en no solo proveer regiones constantes derivadas de humano, sino modificar las regiones variables de forma tal de remodelarlas tan cercano a la forma humana como sea posible. Se sabe que las regiones variables de las cadenas pesada y liviana contienen tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que pueden variar en respuesta a los antigenos en cuestión y determina la capacidad de unión, flanqueadas por cuatro regiones esqueleto (FR) que están relativamente conservadas en una dad especie y que putativamente proveen una estructura de andamiaje para las CDR. Cuando se preparan anticuerpos no humanos respecto a un antigeno particular, las regiones variables pueden ser "reformuladas" o "humanizadas" por injerto de CDR derivados de anticuerpos no humanos en los FR presentes en el anticuerpo humano a ser modificado. La aplicación de esta estrategia a diferentes anticuerpos ha sido informada por Sato, K. , y col., (1993) Cáncer Res 53:851-856. Riechmann, L., y col., (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen, M . , y col., (1988) Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A., y col., (1991) Protein Engineering 4: 773-3783; Maeda, H . , y col., (1991) Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. , y col., (1991) Proc Nati Acad Sci USA 88:4181-4185; Tempest, P. R., y col., (1991) Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S., y col., (1991) Proc Nati Acad Sci USA 88:2869-2873; Cárter, P., y col., (1992) Proc Nati Acad Sci USA 89:4285-4289; y Co, M. S. y col., (1992) J Immunol 148:1149-1154, las cuales se incorporan a la presente a modo de referencia. En algunas formas de realización, los anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que contiene las seis CDR del anticuerpo TOL101 depositado) . En otras formas de realización, los anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (una, dos, tres, cuatro, cinco, seis) que están alteradas respecto al anticuerpo original (por ejemplo, anticuerpo TOL101 original) , que también son llamadas una o más CDR "derivadas de" una o más CDR del anticuerpo original.

Como se usa en la presente, los términos "sujeto" y "paciente" se refieren a cualquier animal, tal como un mamífero. El término "mamífero" como se usa en la presente se refiere a cualquier mamífero clasificado como un mamífero, que incluye humanos, primates no humanos, simios, cerdos, vacas, cabras, ovejas, caballos, perros, gatos y aquellos mamíferos empleados en la investigación científica comúnmente conocidos en el arte, por ejemplo, ratones, ratas, hámsters, conejos, conejillos de Indias y hurones. En una forma de realización preferida de la invención, el mamífero es un humano .

Como se usa en la presente, el término "purificado" o "para purificar" se refiere la eliminación de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, los anticuerpos específicos por aß TCR pueden purificarse por eliminación de proteínas no inmunoglobulina contaminantes; también son purificados por la eliminación de inmunoglobulinas que no se unen al mismo antígeno. La eliminación de proteínas no inmunoglobulinas y/o la eliminación de inmunoglobulinas que no se unen al antígeno particular da como resultado un aumento en el porcentaje de inmunoglobulinas específicas por el antígeno en la muestra. En otro ejemplo, los polipéptidos específicos de antígeno recombinantes se expresan en células huéspedes bacterianas, eucarióticas o de mamífero y los polipéptidos son purificados por la eliminación de las proteínas de la célula huésped; de este modo el porcentaje de polipéptidos específicos de antígeno recombinantes aumenta en la muestra.

Como se usa en la presente, el término "región Fe" se refiere a una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina. La "región Fe" puede ser una región Fe de secuencia nativa o una región Fe variante (por ejemplo, con funciones efectoras aumentadas o disminuidas) .

Como se usa en la presente, una región Fe puede poseer "funciones efectoras" que son responsables de la activación o disminución de una actividad biológica (por ejemplo, en un sujeto) . Los ejemplos de funciones efectoras incluyen, a titulo enunciativo no taxativo: unión a Clq; citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) ; unión a receptor de Fe; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; disminución en la expresión de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B; BCR) , etc. Dichas funciones efectoras pueden requerir que se combine la región Fe con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y pueden ser evaluadas usando diferentes ensayos (por ejemplo ensayos de unión a Fe, ensayos de ADCC, ensayos de CDC, etc.).

Como se usa en la presente, un anticuerpo "aislado" o fragmento de anticuerpo es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podrían interferir con usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo o fragmento del mismo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En ciertas formas de realización, el anticuerpo aislado se purifica (1) a más del 95% en peso de polipéptidos determinado por el método de Lowry y preferentemente, más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N terminales o internos por el uso de un secuenciador de plato giratorio, o (3) hasta la homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie, o tinción de plata. Un anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del polipéptido no estará presente. Comúnmente, sin embargo, un anticuerpo aislado se preparará por al menos un paso de purificación.

Como se usa en la presente, el término "tratamiento" se refiere al tratamiento terapéutico y profiláctico o medidas preventivas. Aquellos con necesidad de tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el trastorno asi como aquellos en los cuales se puede prevenir el trastorno.

La frase "bajo condiciones tales que se reducen los síntomas" se refiere a cualquier grado de reducción de calidad o cantidad en los síntomas que pueden detectarse de cualquier enfermedad que se puede tratar con anticuerpos aß TCR, que incluyen a título enunciativo no taxativo, un impacto que puede detectarse en la tasa de recuperación de la enfermedad (por ejemplo, tasa de ganancia de peso), o la reducción de al menos uno de los síntomas normalmente asociados con la enfermedad particular (por ejemplo, síntomas de rechazo de injerto) . En ciertas formas de realización, los anticuerpos contra aß TCR de la presente invención se administran a un sujeto bajo condiciones tales que los síntomas del rechazo del injerto o GVHD son reducidos (por ejemplo, en . comparación a no tratar con los anticuerpos aß TCR) .

Los títulos (tales como "Antecedentes" y "Síntesis") y subtítulos usados en la presente tienen como única intención la organización general de los temas dentro de la presente tecnología y no tienen como intención limitar la divulgación de la presente tecnología o cualquier aspecto de la misma. En particular, el tema sujeto descrito en "Antecedentes" puede incluir tecnología novedosa y puede no constituir un relato del arte previo. El tema sujeto descrito en "Síntesis" no es una divulgación exhaustiva ni completa del alcance completo de la tecnología o cualquier forma de realización de la misma. La clasificación de un material dentro de una sección de esta memoria descriptiva que tiene una utilidad particular se hace por conveniencia y no se debe tomar inferencia de que el material debe funcionar necesaria o solamente de acuerdo a su clasificación en la presente cuando se usa en una dada composición .

La cita de referencias en la presente no constituye una aceptación de que aquellas referencias son arte previo o que tienen relevancia para la patentabilidad de la tecnología descrita en la presente. Cualquier exposición del contenido de referencias citadas en la presente divulgación tiene como intención meramente proveer un resumen general de afirmaciones hechas por los autores de las referencias y no constituye una aceptación de la exactitud de los contenidos de dichas referencias. Todas las referencias citadas en la sección "Descripción" de esta memoria descriptiva se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad.

La descripción y los ejemplos específicos, si bien indican formas de realización de la tecnología, tienen como intención el propósito de ilustración solamente y no tienen como intención limitar el alcance de la tecnología. Adicionalmente, la mención de múltiples formas de realización que tienen características descritas no tiene como intención excluir otras formas de realización que tienen características adicionales, u otras formas de realización que incorporan combinaciones de las características indicadas. Los ejemplos específicos se proveen con propósito ilustrativo de cómo hacer y usar las composiciones y métodos de esta tecnología y, a menos que se indique explícitamente de otra forma, no tienen como intención ser una representación de que las formas de realización de esta tecnología ha, o no ha, sido hecha o ensayada.

Como se usan en la presente, las palabras "preferido/a" y "preferentemente" se refieren a formas de realización de la tecnología que propician ciertos beneficios, bajo ciertas circunstancias. Sin embargo, también pueden preferirse otras formas de realización, bajo las mismas u otras circunstancias. Adicionalmente, la mención de una o más formas de realización preferidas no implica que las otras formas de realización no sean útiles y no tiene como intención excluir otras formas de realización del alcance de la tecnología.

Como se refiere en la presente, todos los porcentajes de composiciones son en peso de la composición total, a menos que se especifique de otro modo. Como se usa en la presente, la palabra "incluye", y sus variantes, tiene como intención no ser limitante, tal que la descripción de los ítems en una lista no excluye otros ítems similares que también pueden ser útiles en los materiales, composiciones, dispositivos y métodos de esta tecnología. Similarmente, los términos "que puede" y "puede" y sus variantes tienen como intención no ser limitantes, tal que la descripción de que una forma de realización que puede o puede comprender ciertos elementos o características no excluye otras formas de realización de la presente tecnología que no contengan aquellos elementos o características .

A pesar del término abierto "que comprende", como un sinónimo de términos tales como que incluye, que contiene, o que tiene, se usa en la presente para describir e invocar la invención, la presente tecnología, o formas de realización de la misma, puede como alternativa ser descrito usando términos más limitantes tales como "que consiste en" o "que consiste esencialmente de" los ingredientes mencionados.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por una persona con experiencia ordinaria en el arte al cual pertenece la presente tecnología. A pesar de que se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente en la práctica o ensayo de la presente tecnología, más adelante se describen métodos y materiales adecuados. Adicionalmente, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no tienen como intención ser limitantes. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan a modo de referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, que incluye definiciones, predominará.

Anticuerpos aislados y fragmentos de anticuerpos dirigidos contra ß TCR El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y específicamente cubre anticuerpos simples anti-aß TCR (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes o anticuerpos bloqueadores ) y composiciones de anticuerpo anti-aß TCR con especificidad poliepitópica . "Anticuerpo" como se usa en la presente inmunoglobulina intacta o moléculas de anticuerpo, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (es decir, anticuerpos biespecífieos formados de al menos dos anticuerpos intactos) y fragmentos de inmunoglobulina (tal como scFv, Fab, F(ab')2, o Fv) , con la condición que exhiban . cualquiera de las propiedades agonistas o antagonistas o funcionales o clínicas deseadas descritas en la presente.

Los anticuerpos típicamente son proteínas o polipéptidos que exhiben especificidad de unión por un antígeno específico. Los anticuerpos nativos usualmente son glicoproteínas heterotetraméricas, compuestas por dos cadenas livianas (L) y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Típicamente, cada cadena liviana está ligada a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, si bien el número de uniones disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas . Cada una de las cadenas pesada y liviana también tienen puentes disulfuro entre cadenas espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena liviana tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en el otro extremo; el dominio constante de la cadena liviana se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada y el variable dominio de la cadena liviana se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que unos residuos aminoácidos particulares forman una interfase entre los dominios variables de la cadena liviana y pesada [Chothia y col., J. Mol. Biol., 186:651-663 (1985); Novotny y Haber, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:4592-4596 (1985)]. Las cadenas livianas de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado puede ser asignada a uno o dos tipos claramente distintos, llamados kappa y lambda, en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases .

Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de estas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG-1, IgG-2, IgG-3 y IgG-4; IgA-1 e IgA-2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con diferentes clases de inmunoglobulinas son llamadas alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente.

Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, generalmente la región de unión a antigeno o variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, diabodies y anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

El término "variable" se usa en la presente para describir ciertas porciones de los dominios variables que difieren en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antigeno particular. Sin embargo, la variabilidad usualmente no está distribuida por igual entre los dominios variables de anticuerpos. Típicamente se concentra en tres segmentos llamados regiones determinantes de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables ambos en los dominios variables de la cadena liviana y de la cadena pesada. Las porciones muy conservadas de los dominios variables son llamadas el esqueleto (FR). Los dominios variables de cadenas nativas pesada y liviana comprenden cada uno cuatro regiones FR, adoptando en gran medida una configuración hoja ß, conectada por las tres CDR, que forma bucles que conectan y en algunos casos formando parte de la estructura hoja ß. Las CDR en cada cadena son mantenidas juntas en proximidad por regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antigeno de los anticuerpos [véase Kabat, E. A. y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)]. Los dominios constantes no están involucrados directamente en la unión a un anticuerpo de un antígeno, pero exhibe diferentes funciones efectoras, tal como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las mutaciones posibles de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un sitio antigénico simple. Adicionalmente , en contraste con las preparaciones de anticuerpo convencionales (policlonal) que típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epitopes), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un determinante único en el antígeno.

Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen anticuerpos quiméricos, híbridos y recombinantes producidos por el corte y empalme de un dominio variable (incluyendo hipervariable) de un anticuerpo anti-aß TCR con un dominio constante (por ejemplo anticuerpos "humanizados"), o una cadena liviana con una cadena pesada, o una cadena de una especie con una cadena de otra especie, o fusiones con proteínas heterólogas, sin importar la especie de origen o clase de inmunoglobulina o designación de subclase, así como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, F(ab')2 y Fv) , con la condición de que exhiban la actividad biológica deseada o propiedades. Véase, por ejemplo la Patente de los EE.UU. No. 4.816.567 y Mage y col., en Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97 (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987).

Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no se debe interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser usados de acuerdo con la presente invención pueden hacerse con el método del hibridoma descrito primero por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975), o pueden hacerse por métodos de ADN recombinante tales como los descritos en la Patente de los EE.UU. No. 4.816.567. Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de bibliotecas de fagos generadas usando las técnicas descritas en McCafferty y col., Nature, 348:552-554 (1990), por ejemplo.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo murino) son inmunoglobulinas quiméricas especificas, cadenas de inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos (tal como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a antigeno de anticuerpos) que contienen la secuencia mínima derivada de inmunoglobulinas de no humanos. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo del receptor) en donde los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se reemplaza por residuos de una CDR de una especie no humano (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región esqueleto (FR) Fv de la inmunoglobulina humana son reemplazados por los correspondientes residuos no humanos. Adicionalmente, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo del receptor ni en la CDR importada o secuencias de esqueleto. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente y optimizar el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos los al menos uno y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá óptimamente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina o dominio (Fe), típicamente la de una inmunoglobulina humana.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un humano y/o ha sido hecho usando cualquiera de las técnicas para hacer anticuerpos humanos conocidas en el arte o como se describe en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano incluye anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de cadena pesada humana o al menos un polipéptido de cadena liviana humana, por ejemplo un anticuerpo que comprende polipéptidos de cadena liviana murina y cadena pesada humana. Los anticuerpos humanos pueden producirse usando diferentes técnicas conocidas en el arte. En una forma de realización, el anticuerpo humano se selecciona de una biblioteca de fagos, en donde esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan y col. Nature Biotechnology, 14:309-314 (1996): Sheets y col.

PNAS, (USA) 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); arks y col., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Los anticuerpos humanos también pueden hacerse por introducción de loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los cuales los genes de inmunoglobulina endógena han sido parcialmente o completamente inactivados. Luego del enfrentamiento, se observa la producción de anticuerpo humano, que se parece mucho a la vista en humanos en todos los aspectos, incluyendo el reordenamiento de genes, ensamblaje y repertorio de anticuerpos. Esta estrategia se describe, por ejemplo, en las Patentes de los EE.UU. Nos. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016 y en las siguientes publicaciones científicas: Marks y col., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg y col., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-13 (1994); Fishwild y col., Nature Biotechnology, 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995). Como alternativa, el anticuerpo humano puede prepararse por medio de la inmortalización de linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno blanco (dichos linfocitos B pueden ser recuperados de un individual o pueden haber sido inmunizados in vitro) . Véase, por ejemplo, Colé y col., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner y col., J. Immunol., 147 (l):86-95 (1991); y la Patente de los EE.UU. No. 5.750.373.

Las regiones variables y/o las CDR del anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo de la presente invención y variantes de los mismos, pueden emplearse con cualquier tipo de regiones constantes humanas adecuadas (por ejemplo, para anticuerpos quiméricos) o de esqueleto humanas (por ejemplo, para anticuerpos humanizados) . En ciertas formas de realización, las regiones constantes son de la clase IgM. Preferentemente, las CDR se usan con esqueletos completamente humanizados o subregiones de esqueleto. Por ejemplo, el sitio de internet de NCBI contiene las secuencias para ciertas regiones de esqueleto humanas. Los ejemplos de secuencias de VH humanas incluyen, a titulo enunciativo no taxativo, VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VHl-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1 y VH7-81, que se proveen en Matsuda y col., J Exp. Med. 1998 Dic 7 ; 188 ( 11 ): 2151-62 , que incluye la secuencia de nucleotidos completa del locus región variable de la cadena de inmunoglobulina humana, incorporada a la presente a modo de referencia. Los ejemplos de secuencias VK humanas incluyen, a titulo enunciativo no taxativo, Al, A10, All, A14, A17, A18, A19, A2, A20, A23, A26, A27, A3, A30, A5, A7 , B2, B3, Ll, LIO, Lll, L12, L14, L15, L16, L18, L19, L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, 01, 011, 012, 014, 018, 02, 04 y 08, que se proveen en Ka asaki y col., Eur J Immunol 2001 Abr; 31 (4) : 1017-28; Schable y Zachau, Biol Chem Hoppe Seyler 1993 Nov;374 (11) : 1001-22; y Brensing-Kuppers y col., Gene 1997 Jun 3; 191 (2) : 173-81, las cuales se incorporan a la presente a modo de referencia. Los ejemplos de secuencias de VL humanas incluyen, a titulo enunciativo no taxativo, Vl-11, Vl-13, Vl-16, Vl-17, Vl-18, Vl-19, Vl-2, Vl-20, Vl-22, Vl-3, Vl-4, Vl-5, Vl-7, Vl-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4 y V5-6, que se proveen en Kawasaki y col., Genome Res 1997 Mar ; 7 ( 3 ) : 250-61 , incorporada a la presente a modo de referencia. Los esqueletos completamente humanizados pueden seleccionarse de cualquiera de estos genes de linea germinal funcionales. Generalmente, estos esqueletos difieren uno de otro por un número limitado de cambios de aminoácidos. Estos esqueletos pueden usarse con las CDR de TOL101 o variantes del mismo. Los ejemplos adicionales de esqueletos humanos que pueden usarse con las CDR de la presente invención incluyen, a titulo enunciativo no taxativo, KOL, NEWM, REI, EÜ, TUR, TEI, LAY y POM (véase, por ejemplo, Kabat y col., 1987 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, NIH, EE.UU.; y Wu y col., 1970, J. Exp. Med. 132, 211-250, las cuales se incorporan a la presente a modo de referencia) .

El término "región Fe" se usa para definir la región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que puede generarse por digestión con papaina de un anticuerpo intacto. La región Fe puede ser una región Fe de secuencia nativa o una región Fe variante. A pesar de que los bordes de la región Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fe de la cadena pesada de la IgG humana usualmente se define para expandir desde un residuo de aminoácido en aproximadamente la posición Cys226, o desde aproximadamente la posición Pro230, hasta el carboxilo terminal de la región Fe (usando en la presente el sistema de numeración de acuerdo con Kabat y col., anterior). La región Fe de una inmunoglobulina generalmente comprende dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3 y opcionalmente comprende un dominio CH .

Por "cadena de región Fe" en la presente se entiende una de las dos cadenas de polipéptido de una región Fe. El "dominio CH2" de una región Fe de IgG humana (también referida como dominio "??2") usualmente se extiende desde un residuo aminoácido en aproximadamente la posición 231 hasta un residuo aminoácido en aproximadamente la posición 340. El dominio CH2 es único en que no está apareado cercano con otro dominio. En su lugar, dos cadenas de hidrato de carbono ramificado unidas por N se interponen entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG nativa intacta. Se ha especulado que el hidrato de carbono puede proveer un sustituto para el apareamiento dominio-dominio y ayude a estabilizar el dominio CH2. Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985). El dominio CH2 en la presente puede ser un dominio CH2 de secuencia nativa o dominio CH2 variante.

El "dominio CH3" comprende la expansión de los residuos C terminales hasta el dominio CH2 en una región Fe (es decir desde un residuo de aminoácido hasta aproximadamente la posición 341 hasta un residuo aminoácido en aproximadamente la posición 447 de una IgG) . La región CH3 en la presente puede ser un dominio CH3 de secuencia nativa o un dominio CH3 variante (por ejemplo un dominio CH3 con una "protruberancia" introducida en una cadena del mismo y una correspondiente "cavidad" introducida en la otra cadena del mismo; véase la Patente de los EE.UU. No. 5.821.333). Dichos dominios CH3 variantes pueden usarse para hacer anticuerpos multiespecificos (por ejemplo biespecificos ) como se describen en la presente.

La "región bisagra" generalmente se define como la expansión desde aproximadamente Glu216, o aproximadamente Cys226, y aproximadamente Pro230 de IgGl humana (Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)). Las regiones bisagra de otros isotipos de IgG pueden alinearse con la secuencia IgGl colocando los primeros y últimos residuos de cisteina formando enlaces S—S dentro de la cadena pesada en las mismas posiciones. La región bisagra en la presente puede ser una región bisagra de secuencia nativa o una región bisagra variante. Las dos cadenas polipeptidicas de una región bisagra variante generalmente retienen al menos un residuo cisteina por cadena de polipéptido, de modo que las dos cadenas polipeptidicas de la región bisagra variante pueden formar un enlace disulfuro entre las dos cadenas. La región bisagra preferida en la presente es una región bisagra humana de secuencia nativa, por ejemplo una región bisagra de IgGl humana de secuencia nativa.

Una "región Fe funcional" posee al menos una "función efectora" de una región Fe de secuencia nativa. Las "funciones efectoras" ej emplificativas incluyen la unión a Clq; citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) ; unión al receptor Fe; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; disminución de la expresión de los receptores de superficie celular (por ejemplo receptor de células B; BCR) , etc. Dichas funciones efectoras generalmente requieren que la región Fe se combine con un dominio de unión (por ejemplo un dominio variable de anticuerpo) y puede evaluarse usando diferentes ensayos conocidos en el arte para evaluar dichas funciones efectoras del anticuerpo.

Una "región Fe de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fe encontrada en la naturaleza. Una "región Fe variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de la región Fe de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácido. Preferentemente, la región Fe variante tiene al menos una sustitución de aminoácido comparado con una región Fe de secuencia nativa o la región Fe de un polipéptido parental, por ejemplo entre aproximadamente una y aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos y preferentemente entre aproximadamente una y aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fe de secuencia nativa o en la región Fe del polipéptido parental. La región Fe variante en la presente preferentemente poseerá al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con una región Fe de secuencia nativa y/o con una región an Fe de un polipéptido parental y más preferentemente al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia con la misma, más preferentemente al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con la misma.

La "citotoxicidad mediada por células T dependiente de anticuerpo" y "ADCC" se refiere a una reacción mediada por células en la cual las células citotóxicas no especificas que expresan los receptores Fe (FcR) (por ejemplo células asesinas naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula T blanco y posteriormente provoca la lisis de la célula T blanco. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan solo FCYRIII, mientras los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resumen en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en la Patente de los EE.UU. No. 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK) . Como alternativa, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes y col. PNAS (USA), 95:652-656 (1998) .

Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan al menos FCYRIII y realizan una función efectora ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; prefiriendo a PBMC y células NK. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa de las mismas, por ejemplo de sangre o PBMC como se describe en la presente.

Los términos "receptor Fe" y "FcR" se usan para describir un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Adicionalmente, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FCYRIII, que incluyen variantes alélicas y como alternativa formas de corte y empalme de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activador") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias similares de aminoácidos que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de los mismos. El receptor activador FcyRIIA contiene un motivo de activación en base a tirosina inmunoreceptor (ITAM) en su dominio citoplasmático . El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo de inhibición en base a tirosina inmunoreceptor (ITIM) en su dominio citoplasmático (revisado en Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). Los FcR son revisados en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel y col., Immunomethods , 4:25-34 (1994); y de Haas y col., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Otros FcR, que incluyen aquellos a ser identificados en el futuro, están abarcados por el término "FcR" en la presente. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer y col., J. Immunol., 117:587 (1976); y Kim y col., J. Immunol., 24:249 (1994)).

"Citotoxicidad dependiente de complemento" y "CDC" se refieren al lisado de un blanco en presencia de complemento. La vía de activación del complemento es iniciada por la unión del primer componente del sistema de complemento (Clq) a una molécula (por ejemplo un anticuerpo) formando complejo con un antigeno cognado. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo de CDC, por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996) .

Un anticuerpo "madurado en afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más CDR del mismo que resulta en una mejora en la afinidad del anticuerpo por un antígeno, en comparación con un anticuerpo parental que no posee aquellas alteraciones. Los anticuerpos madurados en afinidad preferidos tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antigeno blanco. Los anticuerpos madurados en afinidad son producidos por procedimientos conocidos en el arte. Marks y col. Bio/Biotechnology, 10:779-783 (1992) describe la maduración de afinidad por el intercambio de dominios VH y VL . La mutagénesis al azar de CDR y/o residuos del esqueleto se describe en: Barbas y col. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier y col. Gene, 169:147-155 (1995); Yelton y col. J. Immunol . , 155: 1994-2004 (1995); Jackson y col., J. Immunol., 154 (7) : 3310-9 (1995); y Hawkins y col, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992).

El término "inmunoespecifico" como se usa en "unión inmunoespecifica de anticuerpos" por ejemplo, se refiere a la interacción de unión especifica por antigeno que se produce entre el sitio de combinación a antigeno de un anticuerpo y el antigeno especifico reconocido por ese anticuerpo.

El término "citoquina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúa sobre otra célula como mediadores intercelulares. Los ejemplos de dichas citoquinas son linfoquinas, monoquinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citoquinas se encuentran incluidas hormonas de crecimiento tales como hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento humana N-metionilo y hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormones glicoproteicas tales como hormona folículo estimulante (FSH) , hormona estimulante de tiroides (TSH) y hormona luteinizante (LH) ; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; Factor de Necrosis Tumoral-alfa y -beta; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotrofina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO) ; factores de crecimiento nervioso tal como NGF-alfa; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformante (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-beta; factor de crecimiento similar a insulina I y II; eritropoyetina (EPO) ; factores inductores de hueso; Interferones tales como Interferón-alfa, -beta y -gamma, factores estimulantes de colonias (CSF) tales como CSF de macrófagos ( -CSF) ; CSF de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) ; y CSF de granulocitos (G-CSF) ; interleuquinas (ILs) tales como IL-1, IL-lalfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; un Factor de Necrosis Tumoral tal como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y ligando kit (KL) . Como se usa en la presente, el término citoquina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos de células T recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citoquinas de secuencia nativa.

Los términos "tratar", "tratamiento" y "terapia" como se usan en la presente se refieren a terapia curativa; terapia que reduce o mejora los síntomas de una enfermedad o condición; terapia profiláctica; y terapia preventiva.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente activo (por ejemplo un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) o droga eficaz para tratar una enfermedad o un trastorno en un mamífero. En el caso de una enfermedad autoinmune o una enfermedad inflamatoria, la cantidad terapéuticamente eficaz del agente activo o fármaco puede reducir el número de células inmunes activas, (por ejemplo células T aß TCR+) ; aumentar el número y/o actividad de células Treg, reducir la producción de citoquinas inflamatorias, o citoquinas proinmunes, tales como IL-2, Interferón-?, o TNF- de células T activadas; inhibir (es decir, enlentecer en cierta medida y preferentemente detener) la proliferación de células T activadas; reducir la expresión de CD3 en la superficie de células T aß TCR+ por debajo de 50/mm3, preferentemente debajo de 25/mm3; y/o aliviar en cierta medida, uno o más de los síntomas asociados con el trastorno autoinmune y/o inflamatorio. La medida en la cual el anticuerpo o agente activo del anticuerpo o fármaco pueda prevenir la activación y expansión de células T aß TCR+, puede ser inductor de antiinflamatorio y/o tolerancia de autoantigeno. Para la terapia autoinmune o de inflamación, la eficacia in vivo puede, por ejemplo, ser medida por evaluación de la cantidad de citoquinas inflamatorias, o citoquinas proinmunes, tales como IL-2, Interferón-?, o TNF-a de células T activadas y el agotamiento de moléculas CD3 funcionales en la superficie de células T ß TCR+ . Para el tratamiento del rechazo de tejido trasplantado, una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente activo (por ejemplo un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti ß TCR) por ejemplo TOL101, o un fármaco adyuvante secundario eficaz para anular, reducir, cesar o prevenir el rechazo de un tejido trasplantado medido por la anulación, reducción, cesación o prevención de la necrosis celular de tejido trasplantado, producción de anticuerpos aloreactivos, o producción de células T aloreactivas reactivas contra el tejido trasplantado in vivo o in vitro.

El término "respuesta de anticuerpo humano anti-ratón" o "HAMA" se refiere a una respuesta inmunogénica contra un anticuerpo murino luego de la administración de un anticuerpo murino a un sujeto humano. Típicamente, los anticuerpos de ratón son reconocidos como extraños por el sistema inmune humano y por lo tanto provocan la respuesta de anticuerpo humano anti-ratón o HAMA. La respuesta HAMA interfiere con la eficacia del anticuerpo de ratón y puede provocar síntomas adversos severos en el receptor. La respuesta HAMA también puede interferir con el uso de medicamentos en base a murinos o diagnósticos que posteriormente pueden administrarse al paciente. Los métodos para medir HAMA y/o diagnosticar HAMA en pacientes son bien conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, el sistema de ensayo de ELISA ImmuSTRIP® HAMA IgG (Número de catálogo 10016; IMMUNOMEDICS®, INC. 300 American Road, Morris Plains, NJ 07950) o HAMA (anticuerpos humanos anti-ratón) ELISA (IgG e IgM HAMA, Número de catálogo 43-HAMHU-E01 ; ALPCO DIAGNOSTICS, 26-G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079) o Gruber et . al, Cáncer Res., 60: 1921-1926 (2000).

Anticuerpos policlonales Los anticuerpos policlonales se generan en animales preferentemente mediante múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Como alternativa, el antígeno se puede inyectar directamente en el nodulo linfático del animal (véase Kilpatrick et al., Hibridoma, 16: 381-389, 1997). Se puede obtener una respuesta de anticuerpo mejorado por conjugación del antígeno relevante con una proteína que es inmunogénica en la especie a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa, albúmina de suero, timoglobulina bovina o un inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncíonal o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoilsulfosuccinimida (conjugación por residuos de cisteína) , N-hidroxisuccinimida (por residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico u otros agentes conocidos en la técnica. aß Los animales son inmunizados contra la proteína ß TCR, contra fragmentos de la misma, conjugados inmunogénicos o sus derivados, por combinación, por ejemplo, de 100 µg de la proteína o del conjugado (para ratones) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyección de la solución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después, los animales reciben un refuerzo con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. A los 7-14 días después de la inyección de refuezo, los animales son sacrificados por desangrado y se evalúa el título de anticuerpos en suero. Los animales reciben refuerzos hasta que el título alcanza un plateau o valor constante. Preferiblemente, el animal recibe un refuerzo con el conjugado del mismo antígeno, pero que fue conjugado con un reactivo de entrecruzamiento diferente. Los conjugados también se pueden elaborar en cultivos de células recombinantes como fusiones de proteínas. Además, se pueden usar convenientemente agentes agregantes, tal como alúmina, para mejorar la respuesta inmune.

Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando métodos de hibridoma, tales como que que describieron Kohler y ilstein, Nature, 256: 495 (1975) . En un método con hibridomas, típicamente se inmuniza un ratón, un hámster u otro animal huésped apropiado, con un agente de inmunización para generar linfocitos que producen o que pueden producir anticuerpos que se unirán específicamente con el agente de inmunización. Como alternativa, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.

El agente de inmunización típicamente incluirá a la aß TCR o una subunidad de la misma. En ejemplos no taxativos, la subunidad aß TCR puede incluir una cadena alfa, una cadena beta o una cadena alfa-beta unida. En algunas formas de realización, la aß TCR puede ser una á TCR de mamífero. En algunas formas de realización, la aß TCR usada para inmunizar un animal incluye una aß TCR humana que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N° : 1 o un fragmento de la misma. Como alternative, el agente de inmunización puede comprender un fragmento o una porción de la SEQ ID N° : 1. En una forma de realización, el agente de inmunización comprende una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 1. En una forma de realización, el agente de inmunización comprende una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N° : 2 o un fragmento o porción de la SEQ ID N°: 2. En una forma de realización, el agente de inmunización comprende una proteína de dos subunidades provista en la secuencia de aminoácidoss de las SEQ ID N": 1 y 2. Como alternativa, el inmunógeno puede comprender un heterodímero de aß TCR, de la especie deseada, por ejemplo un heterodímero de la aß TCR humana. En una forma de realización, el agente de inmunización comprende una población de células de la capa leuco-plaquetaria humana que contiene células mononucleares de sangre periférica.

En general, se usan linfocitos de sangre periférica ("PBLs") si se desean células de origen humano o se usan células de bazo o células de nodulo linfático si se desean fuentes de mamíferos no humanos. Los linfocitos se fusionan luego con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (véase los métodos ilustrativos para elaborar anticuerpos monoclonales divulgados en Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, Academic Press, (1986) páginas 59-103) . Las lineas celulares inmortalizadas habitualmente son células transformadas de mamífero, en particular células de mieloma de roedores, bovinos y humanos. Habitualmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o de ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la sobrevida de las células inmortalizadas, no fusionadas. Por ejemplo, si las células progenitoras no contienen la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), donde dichas sustancias impedirán el crecimiento de células T deficientes en HGPRT. En algunas formas de realización, las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan de manera eficiente, soportan un nivel de expresión de anticuerpos estable alto por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio, tal como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma de murinos, que se pueden obtener, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. y de American Type Culture Collection, Manassas, Va. Un ejemplo de dicha línea celular de mieloma de murino es P3X63Ag8U.l, (ATCC CRL 1580) . También se han descrito lineas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (véase, por ejemplo, Kozbor, J. Inmunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) páginas 51-63] .

El medio de cultivo en el cual se cultivan las células de hibridoma puede evaluarse luego por la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra una aß TCR. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) , como alternativa, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se puede determinar por incubación de una población de células T con los anticuerpos monoclonales y co-tinción usando un anticuerpo anti-CD3. Dichas técnicas y ensayos son conocidos en el arte. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem. 107: 220 (1980) .

Una vez identificadas las células de hibridoma deseadas, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitante o clasificación FACS y se cultivan mediante métodos estándar (véase por ejemplo, Goding, supra) . Los medios de cultivo adecuados para tal fin incluyen, por ejemplo, el medio de Eagle modificado por Dulbecco o el medio RPMI-1640. Como alternativa, las células de hibridoma se pueden cultivar in vivo como ascites en un mamífero usado comúnmente y producido de manera rutinaria en el arte.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden aislar o purificar a partir del medio de cultivo o líquido ascites mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tal como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis sobre gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Producción de anticuerpos recombinantes La secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina de interés generalmente puede determinarse por secuenciación directa de proteínas, y se pueden diseñar secuencias de nucleótidos codificantes adecuadas de acuerdo con una tabla universal de codones. Sin embargo, en el caso de los anticuerpos IgM, la secuenciación directa de proteínas de la proteína de anticuerpo es muy difícil. La secuencia de aminoácidos de TOL101, un anticuerpo de IgM, es particularmente reticente a los protocolos estándar de secuenciación de proteínas. Como alternativa, el ADN que codifica los anticuerpos monoclonales, incluyendo TOL101, se puede aislar y secuenciar a partir de las células de hibridoma, incluyendo el hibridoma TOL101 MCB, para obtener la secuencia de aminoácidos del anticuerpo usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que se pueden unir específicamente con los qenes que codifican las cadenas pesada y liviana de los anticuerpos monoclonales) . La determinación de la secuencia requiere en general del aislamiento de por lo menos una porción del gen o ADNc de interés. Habitualmente esto requiere clonación del ADN o ARNm que codifica los anticuerpos monoclonales. La clonación se lleva a cabo usando técnicas estándar (véase, por ejemplo, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning:A Laboratorio Guide, Volúmenes 1-3, Cold Spring Harbor Press, que se incorpora en la presente a modo de referencia) . Por ejemplo, se puede construir una biblioteca de ADNc por transcripción inversa de poliA+ ARNm, preferentemente el ARNm asociado a membrana, y luego se puede examinar la biblioteca usando sondas específicas para las secuencias de genes de polipéptidos de inmunoglobulinas humanas. En una realización preferida, se usa la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar los ADNcs (o porciones de ADNc de longitud completa) que codifican un segmento de un gen de inmunoglobulina de interés (por ejemplo, un segmento de la cadena liviana variable) . Las secuencias amplificadas se pueden clonar fácilmente en cualquier vector adecuado, por ejemplo, vectores de expresión, vectores de minigenes o vectores de expresión en fagos. Se podrá apreciar que el método particular de clonación usado no es critico, siempre que sea posible determinar la secuencia de alguna porción del polipéptido de inmunoglobulina de interés.

Una fuente de ARN usada para la clonación y secuenciación es un hibridoma producido por obtención de una célula B a partir del ratón transgénico y fusión de la célula B con una célula inmortal. Una ventaja del uso de hibridomas es que se pueden examianr fácilmente, y se selecciona un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal humano de interés. Como alternativa, se puede aislar ARN a partir de células B (o bazo completo) del animal inmunizado. Cuando se usan fuentes distintas de hibridomas, puede ser deseable examinar secuencias que codifican inmunoglobulinas o polipéptidos de inmunoglobulina con características de unión especifica. Un método para dicho examen es el uso de tecnología de expresión en fagos. La expresión en fagos se describe, por ejemplo, en Dower et al., WO 91/17271, McCafferty et al., WO 92/01047, y Catón y Koprowski, Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU., 87:6450-6454 (1990), cada una de las cuales se incorpora en la presente a modo de referencia. En una realización usando tecnología de expresión en fagos, se aisla el ADNc de un ratón inmunizado transgénico (por ejemplo, ADNc total de bazo), se usa PCR para amplificar secuencias de ADNc que codifican una porción de un polipéptido de inmunoglobulina, por ejemplo, las regiones CDR, y las secuencias amplificadas se insertan en un vector fago. Los ADNc que codifican los péptidos de interés, por ejemplo, péptidos de la región variable con las características de unión deseadas, se identifican mediante técnicas estándar, tal como paneo. Luego se determina la secuencia del ácido nucleico amplificado o clonado. Típicamente, se determina la secuencia que codifica una región variable completa del polipéptido de inmunoglobulina, sin embargo, a veces solamente es necesario secuenciar una porción de una región variable, por ejemplo, la porción que codifica a la CDR. Típicamente, la porción secuenciada será de por lo menos 30 bases de longitud y más a menudo se secuenciarán las bases que codifican por lo menos un tercio aproximadamente o por lo menos la mitad aproximadamente de la longitud de la región variable. La secuenciación se puede efectuar con clones aislados de una biblioteca de ADNc o, cuando se usa PCR, después de subclonación de la secuencia amplificada o por secuenciación directa con PCR del segmento amplificado. La clonación se lleva a cabo usando técnicas estándar (véase, por ejemplo, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning:A Laboratorio Gulde, Volúmenes 1-3, Cold Spring Harbor Press, y Sanger, F. et al., (1977) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, que se incorporan en la presente a modo de referencia) . La comparación de la secuencia del ácido nucleico clonado con las secuencias publicadas de genes y ADNc de inmunoglobulina humana, permitirá que un especialista determine fácilmente, según la región secuenciada, (i) la utilización de segmentos de la linea germinal del polipéptido de la inmunoglobulina del hibridoma (incluyendo el isotipo de la cadena pesada) y (ii) la secuencia de las regiones variables de la cadena liviana o pesada, incluyendo las secuencias resultantes de la adición de la región N y de los procesos de mutación somática. Una fuente de información sobre secuencias de genes de inmunoglobulina es la National Center for Biotechnology Información, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Md.

Una vez aislado, el ADN se puede ligar operativamente a secuencias de control de la expresión o se puede incluir en vectores de expresión, que luego son transfectados en células huésped bacterianas, eucariotas y/o de mamífero, tales como células de E. coli, células COS de simios, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otra manera proteínas de inmunoglobulinas , para lograr la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes .

Las secuencias de control de la expresión indican las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante ligada operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias control que son adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de un operador y un sitio de unión a ribosomas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores . Las secuencias de control de la expresión adecuadas para la expresión de anticuerpos en células huésped procariotas, eucariotas y/o de mamífero son bien conocidas en el arte.

Un ácido nucleico está ligado operativamente cuando se encuentra en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o directriz de secreción está ligado operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está ligado operativamente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está ligado operativamente a una secuencia codificante si está ubicado como para facilitar la traducción. En general, el término ligado operativamente significa que las secuencias de ADN ligadas son contiguas y, en el caso de una directriz de secreción, son contiguas y están en fase de lectura. Sin embargo, no es necesario que los potenciadores sean contiguos. La unión se puede lograr mediante enlaces en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se pueden usar adaptadores o ligadores de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

A menudo, los términos "línea celular" y "cultivo celular" se usan indistintamente y todas dichas denominaciones en la presente incluyen la progenie. Los transformantes y las células transformadas incluyen a la célula sujeto primaria y a los cultivos derivados de la misma independientemente del número de transferencias. Se comprenderá también que toda la progenie no debe ser exactamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la buscada en la célula transformada originalmente.

También se proveen ácidos nucleicos aislados que codifican anticuerpos específicos, opcionalmente ligados operativamente a secuencias control reconocidas por una célula huésped, vectores y células huésped que comprenden a los ácidos nucleicos y las técnicas recombinantes para la producción de los anticuerpos, que pueden comprender el cultivo de la célula huésped de modo que se expresa el ácido nucleico y, opcionalmente, se recupera el anticuerpo del cultivo de células huésped o del medio de cultivo.

Se conoce una variedad de vectores en el arte. Los componentes de vectores pueden incluir uno o más de los siguientes componentes: una secuencia señal (por ejemplo, que puede dirigir la secreción del anticuerpo) , un origen de replicación, uno o más genes marcadores selectivos (por ejemplo, que pueden conferir resistencia a antibióticos o a otras drogas, deficiencias auxotróficas del complemento o suministrar nutrientes críticos que no se encuentran disponible en el medio) , un elemento mejorador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción, todas las cuales son bien conocidas en el arte.

Las células huésped adecuadas incluyen células procariotas, de levadura o de eucariotas superiores. Los procariotas adecuados incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia , por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella , Proteus , Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia , por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella , asi como Bacilli tal como B. subtilis y B. licheniformis, Pseudomonas y Streptomyces . Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para los vectores que codifican anticuerpos. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común de panadería, es el más comunmente usado entre los microorganismos huésped de eucariotas inferiores. Sin embargo, comúnmente hay numerosos géneros, especies y cepas adicionales disponibles, tales como Pichia, por ejemplo P. pastoris , Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces , Yarrowia ; Candida; Trichoderma reesia; Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, huéspedes de Neurospora , Penicillium, Tolypocladium y Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpos glicosilados derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insectos y vegetales. Se han identificado numerosas cepas baculovirales y variantes y las correspondientes células huésped de insecto permisivas de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx morí. Hay una variedad de cepas virales para la transfección de dichas células disponibles al público, por ejemplo, la variante L-I del NPV de Autographa californica y la cepa Bm-5 del NPV de Bombyx morí .

Sin embargo, el mayor interés ha sido en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha vuelto una tarea de rutina. Los ejemplos de useful de lineas de células huésped de mamífero son células de ovario de hámster chino, incluyendo células CHOKI (ATCC CCL61) y células de ovario de hámster chino/-DHFR (DXB-11, DG-44; Urlaub et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); la línea CVl de riñon de mono transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); una línea de riñon embrionario humano (células 293 ó 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión, [Graham et al., J. Gen Virol., 36: 59 (1977)]; células de riñon de hámster recién nacido (BHK, ATCC CCL 10); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de riñon de mono (CVl ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células de pulmón humano (WI38, ATCC CCL 75) ; células de hepatoma humano (Hep G2, HB 8065) ; tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5 y células FS4.

Las células huésped se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente, tales como FIO de Ham (Sigma) , Medio Mínimo Esencial ( (MEM) (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) y el medio de Eagle modificado por Dulbecco ( (DMEM) Sigma) son adecuados para el cultivo de las células huésped. Además, se puede usar cualquiera de los medios que se describen en Ham et al., Meth. Enz . 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), las Patentes de los EE.UU. N°: 4,767,704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; WO 90103430; WO 87/00195; o la Patente de los EE.UU. Re. N° . 30,985 como medio de cultivo para las células huésped. Preferiblemente, los medios están libres de productos animales. Más preferiblemente, los medios están libres de proteínas. Los ejemplos de medios incluyen Gibco CD Hybridoma; SAFC EX CELL SP/20; SAFC EX CELL 620-HSF; Cell Grow TurboDoma; y Hyclone HyQ CDM4Mab. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según necesidad con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tal como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tal como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , soluciones amortiguadoras (tal como HEPES), nucleótidos (tal como adenosina y timidina) , antibióticos (tal como la droga Gentamicina™) , elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes a concentraciones finales en el rango micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Preferiblemente, el medio se puede suplementar con L glutamina o L-alanil-L-glutamina . También se puede incluir cualquier otro suplemento necesario a concentraciones apropiadas, que será conocido por los especialistas en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y semejantes, son las que se utilizaron anteriormente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y resultarán evidentes para el especialista.

En algunas formas de realización, el cultivo de células y el proceso de cosecha comprende los siguientes cinco pasos: 1. Descongelamiento y expansión 2. Expansión en frascos de agitación 3. Expansión WAVE 4. Producción en biorreactor de 300 1 5. Cosecha/clarificación La composición de anticuerpos se puede purificar usando, por ejemplo, cromatografía con hidroxilapatita, cromatografía por intercambio catiónico o aniónico o preferiblemente cromatografía de afinidad, usando el antígeno de interés o la proteína A o la proteína G como ligando de afinidad. La Proteína A se puede usar para purificar los anticuerpos basados en las cadenas pesadas al, 32 o 34 humanas (Lindmark et al., J. Inmuno1. Meth. 62: 1-13 (1983)). La Proteína G es recomendada para todos los isotipos de ratón y para la 33 humana (Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). La matriz a la cual se une el ligando es muy a menudo agarosa, pero existen otras matrices adecuadas. Las matrices mecánicamente estables, tal como de vidrio de poro controlado o poli (estirendivinil) enceno permiten velocidades de flujo mayores y tiempos de procesamiento más cortos de los que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) es de utilidad para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas que también son posibles comprenden precipitación con etanol, HPLC de fase reversa, cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación por sulfato de amonio, dependiendo del agente de unión o anticuerpo específico a recuperar.

En algunas formas de realización, el proceso de purificación comprende los siguientes 6 pasos: 1. Ajuste del pH y cromatografía con Toypearl SP-650M 2. Cromatografía con Toyopearl Super Q-650 3. Cromatografía con Toyopearl CM-650M 4. Nanofiltración con Planova 35N 5. Cromatografía con Toypearl fenil-650M 6. Filtración con flujo tangencial final (TFF) Los términos "epitope" o "determinante antigénico" se usan indistintamente en la presente y se refieren a aquella porción de un antígeno que puede ser reconocida y que se puede unir específicamente a un anticuerpo particular. Cuando el antígeno es un polipéptido, los epitopes pueden estar formados por aminoácidos contiguos o por aminoácidos no contiguos yuxtapuestos debido a un pliegue terciario en la proteína. Los epitopes que están formados por aminoácidos contiguos típicamente se conservan al desnaturalizarse la proteína, mientras que los epitopes que se forman debido a pliegues terciarios típicamente se pierden cuando se desnaturaliza la proteína. Un epitope típicamente incluye por lo menos 3-5, y más habitualmente por lo menos 5 u 8-10 aminoácidos, que presentan una conformación espacial única.

Los anticuerpos quiméricos o híbridos también se pueden preparar in vitro usando métodos conocidos en la química de síntesis de proteínas, incluyendo aquellos que emplean agentes de entrecruzamiento . Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro o por formación de un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este fin incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato .

Anticuerpos humanizados En general, un anticuerpo humanizado contiene uno o más residuos de aminoácido que fueron introducidos en el mismo a partir de una fuente no humana. Estos residuos de aminoácido no humanos a menudo se conocen como residuos "importados", que típicamente se toman de un dominio variable de "importación". La humanización se puede efectuar esencialmente según el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), por sustitución de las CDR o las secuencias de CDR de las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano.

Por lo tanto, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos en donde sustancialmente menos que un dominio variable intacto humano ha sido sustituido por la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de la CDR y posiblemente algunos residuos del FR están sustituidos por los residuos de sitios análogos en los anticuerpos de roedores .

Es importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de una gran afinidad por el antigeno y otras propiedades biológicas favorables. Para alcanzar esta meta, de acuerdo con un método preferido, los anticuerpos humanizados se pueden preparar mediante un proceso de análisis de las secuencias progenitoras y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias progenitoras y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina se encuentran disponibles y son familiares para los especialistas en la técnica. Hay programas para computadora que ilustran y muestran las probables estructuras de conformación tridimensionales de las secuencias de inmunoglobulina candidato seleccionadas. La inspección de estas representaciones permite un análisis del probable rol de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, es decir, un análisis de los residuos que afectan la capacidad de la inmunoglobulina candidato para unirse a su antigeno. De este modo, se pueden aislar y combinar residuos FR de secuencias consenso e importadas con el fin de obtener una característica deseada en el anticuerpo, tal como la afinidad de unión por uno o más antigenos blanco. En general, los residuos de las CDR tienen una influencia directa y más sustancial sobre la unión al antigeno.

Anticuerpos humanos Se pueden elaborar anticuerpos monoclonales humanos utilizando el método del hibridoma. Se han descrito lineas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (véase, por ejemplo, Kozbor, J. Inmuno1., 133: 3001 (1984) y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) .

En algunas formas de realización, se pueden emplear animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, luego de una inmunización con aß TCR, o fragmentos de la misma, de producir un repertorio de anticuerpos humanos en la ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas . Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigota del gen de la región de unión de la cadena pesada (JH) del anticuerpo en ratones mutantes quiméricos y de linea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulina de linea germinal humanos en dichos ratones mutantes de linea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos frente a desafios con antigenos. Véase, por ejemplo Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90, 2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255-258 (1993). Méndez et al., (Nature Genetics 15: 146-156 [1997)) han mejorado aún más la tecnología y han generado una línea de ratones transgénicos denominada "Xenomouse II" que, cuando es sometida a un desafío con un antígeno, genera anticuerpos humanos completes de gran afinidad. Esto se logró integrando la línea germinal de loci de la cadena pesada y cadena liviana humanos de megabases en ratones con supresión en el segmento (JH) endógeno según se describió previamente. El Xenomouse II comprende 1.020 kb del locus de la cadena pesada humana que contiene aproximadamente 66 genes VH, las regiones DH y JH completas y tres regiones constantes diferentes (µ, d, ?) , y también comprende 800 kb del locus humano que contiene 32 genes VK, segmentos JK y genes CK. Los anticuerpos producidos en estos ratones son muy semejantes a los observados en humanos en todo sentido, incluyendo reordenamiento, ensamblaje y repertorio de genes. Los anticuerpos humanos se expresan preferencialmente antes que los anticuerpos endógenos debido a la supresión en un segmento endógeno JH que impide el reordenamiento de genes en el locus murino.

Como alternativa, se puede usar la tecnología de expresión en fagos (McCafferty et al., Nature 348, 552-553 (1990]) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de repertorios de genes del dominio variable (V) de inmunoglobulina proveniente de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, se clonan los genes del dominio V del anticuerpo en-marco en el gen de una proteina de recubrimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como MI3 o fd, y se expresan como fragmentos de anticuerpo funcionales sobre la superficie de la partícula de fago. Debidoa que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de cadena simple del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en la selección del gen que codifica al anticuerpo que presenta dichas propiedades. Por consiguiente, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La expresión en fagos se puede realizar en una variedad de formatos; por una revisión de la misma véase, por ejemplo Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J. , Current Opinión in Structural Biology 3, 564-571 (1993) . Se pueden usar varias fuentes de segmentos del gen V para la expresión en fagos. Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) aislaron un conjunto diverso de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V a partir de donantes humanos no inmunizados y se pueden aislar anticuerpos contra un conjunto diverso de antigenos (incluyendo autoantigenos ) esencialmente según las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12, 725-734 (1993). En una respuesta inmune natural, los genes de anticuerpo acumulan mutaciones a una gran índice (hipermutación somática) . Algunos de los cambios introducidos van a conferir una mayor afinidad, y las células B que expresan inmunoglobulina de superficie de gran afinidad se replican preferencialmente y luego se diferencian durante el subsiguiente desafío con antígenos. Es posible imitar este proceso natural empleando la técnica conocida como "entremezclado de cadenas" (Marks et al., Bio/Technol. 10, 779-783

[1992]). En este método, es posible mejorar la afinidad de los anticuerpos humanos "primarios" obtenidos por expresión en fagos por reemplazo sucesivo de genes de la región V de la cadena pesada y liviana con repertorios de variantes naturales (repertorios) de genes del dominio V obtenidos de donantes no inmunizados. Estas técnicas permiten la producción de anticuerpos y de fragmentos de anticuerpo con afinidades en el rango nM. Waterhouse et al., Nucí. Acids Res., 21, 2265-2266 (1993) han descrito una estrategia para elaborar repertorios de fato anticuerpo muy grandes. El entremezclado de genes también se puede usar para derivar anticuerpos humanos a partir de anticuerpos de roedores, donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo de roedor de partida. De acuerdo con este método, que también se conoce como "impronta de epitopes", el gen del dominio V de la cadena pesada o liviana de anticuerpos de roedores obtenidos con la técnica de expresión en fagos se reemplaza con un repertorio de genes del dominio V humano, creando quimeras de roedores-humanas. La selección sobre el antigeno da como resultado el aislamiento de la variable humana capaz de restablecer un sitio de unión al antígeno funcional, es decir el epitope gobierna (imprime) la elección del otro miembro. Cuando el proceso se repite con el fin de reemplazar el dominio V de roedor remanente, se obtiene un anticuerpo humano (véase la Solicitud de Patente PCT O 93/06213, publicada el 1 de abril, 1993) . A diferencia de la humanización tradicional de anticuerpos de roedores por injertos de CDR, esta técnica provee anticuerpos completamente humanos, que no tienen residuos del marco de trabajo o de CDR de roedores.

Como se describirá con detalle más adelante, los anticuerpos de la invención pueden comprender opcionalmente anticuerpos monoméricos, anticuerpos diméricos, asi como formas de anticuerpos multivalentes . Los especialistas en el arte pueden construir dichos dimeros o formas multivalentes mediante técnicas conocidas en el arte y usando los anticuerpos anti-aß TCR divulgados en la presente. Los métodos para preparar anticuerpos monovalentes también son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, un método comprende la expresión recombinante de la cadena liviana y de la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina . La cadena pesada está truncada, en general en cualquier punto en la región Fe para asi prevenir el entrecruzamiento de la cadena pesada. Como alternativa, se sustituyen los residuos relevantes de cisteina por otro residuo de aminoácido o se suprimen para asi prevenir el entrecruzamiento.

Anticuerpos heteroconjugados Los anticuerpos heteroconjugado también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heterocon ugados están compuestos por dos anticuerpos unidos de manera covalente. Se ha propuesto, por ejemplo, que tales anticuerpos puedan dirigir células del sistema inmune hacia células indeseadas (Patente de los EE.UU. N°: 4.676.980) y para el tratamiento de una infección por VIH (publicaciones de las Solicitudes de Patente PCT N°: WO 91/00360 y WO 92/200373; EP 03089). Los anticuerpos heteroconj ugados pueden elaborarse usando cualquier método de entrecruzamiento conveniente. Los agentes de entrecruzamiento adecuados son bien conocidos en la técnica y se divulgan en la Patente de los EE.UU. N°: 4.676.980, junto con diversas técnicas de entrecruzamiento .

Fragmentos de anticuerpo En determinadas formas de realización, el anticuerpo anti- ß TCR de la presente invención (incluyendo anticuerpos de murino, humanos y humanizados, y variantes de anticuerpo) es un fragmento de anticuerpo. Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos fueron derivados mediante digestión proteolitica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., J. Bíochem. Biophys. Methods 24: 107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir ahora directamente en células huésped recombinantes . Por ejemplo, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplar químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al. Bio/'Technology 10:163-167 (1992)). En una forma de realización, los fragmentos de cadena simple variables (scFv) se producen a partir de E. coli usando técnicas conocidas en el arte. En otra forma de realización, los F(ab')2 se forman usando el cierre de leucina GCN4 para promover el ensamblaje de la molécula de F(ab')2. De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos Fv, Fab o F(ab')2 se pueden aislar directamente del cultivo de células huésped recombinantes . Una variedad de técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo resultarán evidentes para el especialista. Por ejemplo, la digestión se puede conducir usando papaina. Los ejemplos de digestión con papaina se describen en WO 94/29348, publicada el 22 de diciembre, 1994 y en la Patente de los EE.UU. N°: 4.342.566. La digestión con papaina de los anticuerpos produce típicamente dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, denominados fragmentos Fab, cada uno con un solo sitio de un unión al antígeno, y un fragmento Fe residual. El tratamiento con pepsina da como resultado un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígenos y aún tiene capacidad para entrecruzar antígenos.

Los fragmentos · Fab producidos con la digestión del anticuerpo también contienen a los dominios constantes de la cadena liviana y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' en la adición de unos pocos residuos por el extremo carboxilo-terminal del dominio CHl de la cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación en la presente para un Fab' en el cual el o los residuos cisteína de los dominios constantes contienen un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que contienen una bisagra de cisteina entre los mismos. Se conocen otras uniones químicas que pueden ocurrir entre los fragmentos de anticuerpos.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y liviana de los anticuerpos monoclonales) . Las células de hibridoma sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede incluir en vectores de expresión, que luego son transíectados en células huésped tales como células de E. coli, células COS de simios, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otra manera proteínas de inmunoglobulinas, para lograr la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes .

En algunas formas de realización, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo se pueden aislar a partir de bibliotecas de fagos de anticuerpos generadas usando las técnicas que se describe, por ejemplo, en McCaffer.ty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos de murino y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. En subsiguientes publicaciones se describe la producción de anticuerpos humanos de gran afinidad (rango nM) por entremezclado de cadenas (Marks et al, BioTechnology, 10: 779-783 (1992)), asi como por infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (por ejemplo, Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). Por consiguiente, estas técnicas, y técnicas similares, constituyen alternativas viables de las técnicas tradicionales con hibridomas de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

También se puede modificar el ADN, por ejemplo, por sustitución de la secuencia codificante para los dominios constantes de las cadenas pesadas y livianas humanas en lugar de las secuencias homologas de murinos (por ejemplo, la Patente de los EE.UU. N°: 4.816.567 y Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984), ambas incorporadas en la presente a modo de referencia) o por unión covalente de la secuencia codificante de la inmunoglobulina a todo o parte de la secuencia codificante de un polipéptido que no es de una inmunoglobulina.

Típicamente, dichos polipéptidos que no son de una inmuno-globulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación con el antigeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación con el antigeno que presenta especificidad por un antigeno y otro sitio de combinación con el antigeno que presenta especificidad por un antigeno diferente .

Variantes de secuencias de aminoácidos de anticuerpos Las variantes de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos anti-aß TCR se preparan por introducción de cambios de nucleótidos apropiados en el ADN del anticuerpo anti-aß TCR o mediante síntesis de péptidos. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, supresiones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos anti-aß TCR. Se puede utilizar cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución para obtener la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos de post-traducción del anticuerpo anti-aß TCR humanizado o de variantes del mismo, tal como cambiar el número o la posición de los sitios de glicosilación.

Un método de utilidad para la identificación de determinados residuos o regiones del anticuerpo anti-aß TCR que son ubicaciones preferidas para mutagénesis se denomina "mutagénesis por barrido de alanina" se describe en Cunningham y Wells en Science, 244: 1081-1085 (1989). Aquí, se identifica un residuo o grupo de residuos blanco (por ejemplo, residuos con carga tal como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplaza con un aminoácido de carga neutra o negativa (con mayor preferencia alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el antigeno DR4. Aquellas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones son refinadas luego por introducción de variantes adicionales en o para los sitios de sustitución. Por consiguiente, en tanto el sitio para la introducción de una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, no es necesario que la naturaleza de la mutación per se esté predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se conduce un barrido con ala o mutagénesis aleatoria en el codón o región blanco y luego se examinan las variantes de anticuerpo anti-aß TCR expresadas por la actividad deseada.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminales cuya longitud varia en un rango desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, asi como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo anti-aß TCR con un residuo metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a una marca de epitope. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo anti-aß TCR incluyen la fusión al extremo N- o C-terminal del anticuerpo anti-aß TCR a una enzima o un polipéptido que incrementa la vida media en suero del anticuerpo.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. En estas variantes se ha eliminado por lo menos un residuo de aminoácido en la molécula del anticuerpo anti-aß TCR y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de la FR. A continuación, se indican la sustituciones conservadoras. Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir cambios más sustanciales y seleccionar los productos.

Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se logran seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una lámina o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio blanco o (c) el volumen de la cadena lateral. Los aminoácidos naturales se pueden dividir en grupos basado en las propiedades comunes de la cadena lateral: Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son considerados como sustituciones conservadoras entre si: 1) Alanina (A), Glicina (G) ; 2) Ácido aspártico (D) , Ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V); 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y), Triptofano ( ) ; 7) Serina (S) , Treonina (T) ; y 8) Cisteina (C) , Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins, W.H. Freeman and Co., Nueva York (1984) ) .

En algunas formas de realización, se utilizan las tablas de sustituciones conservadoras de aminoácidos de funcionalidad similar bien conocidas en la técnica. Asi, un ejemplo de lineamiento para seleccionar sustituciones conservadoras incluye (residuo original seguido por el ejemplo de sustitución) : ala/gly o ser; arg/lys; asn/gln o his; asp/glu; cys/ser; gln/asn; gly/asp; gly/ala o pro; his/asn o gln; ile/leu o val; leu/ile o val; lys/arg o gln o glu; met/leu o tyr o ile; phe/met o leu o tyr; ser/thr; thr/ser; trp/tyr; tyr/trp o phe; val/ile o leu. Un ejemplo alternativo de lineamiento emplea los siguientes seis grupos, cada uno de los cuales contiene aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre si: 1) Alanine (A), Serina (S) , Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D) , Ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisina (I), Histidina (H) ; 5) Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V); y 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptofano (W) ; (véase también, por ejemplo, Creighton, Proteins, W.H. Freeman y Company (1984); Schultz y Schimer, Principies of Protein Structure, Springer-Verlag (1979) ) . Un especialista en el arte podrá apreciar que las sustituciones identificadas precedentemente no son las únicas sustituciones conservadoras posibles. Por ejemplo, para algunos propósitos, se puede considerar a todos los aminoácidos cargados como sustituciones conservadoras entre si, ya sea si son positivas o negativas. Además, las sustituciones, supresiones o adiciones individuales que alteran, agregan o suprimn un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada también pueden considerarse como "variaciones modificadas conservadoramente" .

Ninguna de las sustituciones conservadoras implicará intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. También se puede sustituir cualquier residuo de cisteina que no está relacionado con el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo anti-aß TCR humanizado o una variante del mismo, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y para prevenir un entrecruzamiento aberrante. A la inversa, se pueden agregar uno o más enlaces cisteina al anticuerpo para mejorar su estabilidad (en particular cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv) .

Un tipo particularmente preferido de variante de sustitución comprende sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo progenitor (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la o las variantes resultantes seleccionadas para un desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas con relación al anticuerpo progenitor a partir del cual fueron generadas. Una manera conveniente para generar dichas variantes de sustitución comprende maduración por afinidad usando expresión en fagos. Brevemente, se mutan varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las sustituciones posibles de amino en cada sitio. Las variantes de anticuerpo asi generadas se expresan de manera monovalente a partir de partículas de fago filamentosas como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. Las variantes expresadas en fagos son examinadas luego por su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se divulga en la presente. Con el fin de identificar los sitios de la región hipervariable que son candidatos para la modificación, se puede conducir una mutagénesis por barrido de alanina para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente en la unión al antígeno. Como alternativa, o además, puede ser beneficioso analizar la estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el DR4 humano. Dichos residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente. Una vez que se han generado dichas variantes, el panel de variantes es sometido a un examen como se describe en la presente y se pueden seleccionar los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para su desarrollo posterior.

Variantes de glicosilacion de los anticuerpos Los anticuerpos son glicosilados en posiciones conservadas de sus regiones constantes (Jefferis y Lund, Chem. Inmunol. 65: 111-128 [1997); Wright y Morrison, TíbTECH 15: 26-32

[1997]). Las cadenas laterales de oligosacáridos de las inmunoglobulinas afectan la función de la proteína (Boyd et al., Mol. Inmunol. 32: 1311-1318 [1996); Wittwe y Howard, Biochem., 29: 4175-4180

[1990]), y la interacción intramolecular entre porciones de la glicoproteina que pueden afectar la conformación y presentar la superficie tridimensional de la glicoproteina (Hefferis y Lund, supra Wyss y Wagner, Current Opin. Biotech. 7: 409-416

[1996]). Los oligosacáridos también pueden servir para dirigir una glicoproteina dada hacia determinadas moléculas basado en estructuras de reconocimiento especificas. Por ejemplo, se ha informado que en la IgG agalactosilada, la porción de oligosacárido " salta s fuera del espacio inter-CH2 y los residuos terminales de N-acetilglucosamina se vuelven disponibles para unirse a la proteina de unión a mañosa (Malhotra et al., Nature Med. 1: 237-243 (1995]). La eliminación por la glicopeptidasa de los oligosacáridos de CAMPATH-1H (un anticuerpo monoclonal IgGl recombinante de murino . humanizado que reconoce al antigeno CDw52 de linfocitos humanos) producidos en células de ovario de hámster chino (CHO) dio como resultado una reducción completa en la lisis mediada por el complemento (CMCL) (Boyd et al., Mol. Inmunol. 32: 1311-1318

[1996]), en tanto la eliminación selectiva de residuos de ácido siálico usando neuraminidasa no resultó en una pérdida de DMCL . También se ha informado que la glicosilación de anticuerpos afecta la citotoxicidad por células T dependiente de anticuerpos (ADCC) . En particular, se informó que las células CHO que expresan de manera regulada por tetraciclina la ß-(1,4)-?-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII) , una glicosiltransferasa que cataliza la formación de GlcNAc bifurcada, presentan una actividad ADCC mejorada (Umana et al., Mature Biotech. 17: 176-180

[1999]).

Las variantes de glicosilación de los anticuerpos son variantes en las cuales se ha alterado el patrón de glicosilación de un anticuerpo. El término alterado significa que se ha suprimido uno o más de los grupos carbohidrato presentes en el anticuerpo, se ha agregado uno o más grupos carbohidrato al anticuerpo, se ha cambiado la composición de la glicosilación (patrón de glicosilación) , el grando de glicosilación, etc. Las variantes de glicosilación se pueden preparar, por ejemplo, por eliminación, cambio y/o adición de uno o más sitios de glicosilación en la secuencia de ácidos nucleicos que codifica al anticuerpo, y expresión y traducción del ácido nucleico en un sistema de expresión en células procariotas.

La glicosilación de los anticuerpos típicamente está N-ligada u O-ligada. N-ligado se refiere a la unión de la porción carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias de los tripéptidos asparagina-X- serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por consiguiente, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un potencial sitio de glicosilación. Una glicosilación O-ligada se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina .

La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se efectúa convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo tal que contiene una o más de las secuencias de tripéptidos descritas previamente (para sitios de glicosilación N-ligados) . La alteración también se puede efectuar por adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de glicosilación O-ligados).

Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican las variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti- ß TCR se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero en un sentido no limitativo, aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos naturales) o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio) , mutagénesis de PCR y mutagénesis de casetes de una variante preparada con anterioridad o una versión que no es una variante del anticuerpo anti-aß TCR.

La glicosilacion (incluyendo el patrón de glicosilacion) de los anticuerpos también se puede alterar sin alterar la secuencia de nucleótidos subyacente. La glicosilacion depende en gran medida de la célula huésped usada para expresar el anticuerpo. Dado que el tipo de célula usado para la expresión de glicoproteinas recombinantes, por ejemplo anticuerpos, como fármacos potenciales, raramente es la célula nativa, cabe esperar variaciones significativas en el patrón de glicosilacion de los anticuerpos (véase, por ejemplo Hse et al., J. Biol. Chem. 272: 9062-9070

[1997]). Se han propuesto diversos métodos para alterar el patrón de glicosilacion logrado en un organismo huésped particular incluyendo la introducción o sobreexpresión de determinadas enzimas relacionadas con la producción de oligosacáridos (Patentes de los EE.UU. N° : 5.047.335; 5.510.261 y 5.278.299). La glicosilacion, o determinados tipos de glicosilacion, pueden eliminarse enzimáticamente de la glicoproteina, por ejemplo usando endoglicosidasa H (Endo H) . Además, la célula huésped recombinante se puede manipular genéticamente, por ejemplo se puede volver defectuosa en el procesamiento de determinados tipos de polisacáridos . Estas técnicas y otras similares son bien conocidas en el arte. La estructura de glicosilación de los anticuerpos se puede analizar fácilmente mediante técnicas convencionales de análisis de carbohidratos, incluyendo cromatografía con lectina, NMR, espectrometría de masa, HPLC, GPC, análisis de composición de monosacáridos, digestión enzimática secuencial y HPAEC-PAD, que emplea cromatografía de intercambio aniónico a pH alto para separar los oligosacáridos basado en la carga. También se conocen métodos para liberar oligosacáridos con fines analíticos, e incluyen, sin limitaciones, tratamiento enzimático (comúnmente realizado utilizando péptido-N-glicosidasa F/endo-A-galactosidasa) , eliminación utilizando un ambiente alcalino severo para liberar principalmente estructuras O-ligadas, y métodos químicos usando hidrazina anhidra para liberar ambos oligosacáridos N-y O-ligados. En algunas formas de realización, se pueden glicosilar los anticuerpos anti- ß TCR de la presente invención. En algunas formas de realización de la presente invención, los anticuerpos anti-aß TCR de la presente invención no están glicosilados . En algunas formas de realización, el anticuerpo o fragmentos de unión al antígeno de la invención incluyen anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se unen a la aß TCR humana que tienen o que fueron manipulados para tener el mismo patrón de glicosilación que el anticuerpo producido a partir del hibridoma TOL101 MCB (TOL101) . El "mismo patrón de glicosilación" o un "patrón de glicosilación equivalente" significa que los anticuerpos de la invención tienen el mismo número y/o tipo de sitios de glicosilación que el anticuerpo producido a partir del hibridoma TOL101 MCB (TOL101) de manera tal que la signatura global de glicosilación o la composición de oligosacáridos N- y O-ligados de los anticuerpos de la invención es similar a la signatura de glicosilación o a la composición de oligosacáridos N- y Coligados del anticuerpo producido a partir del hibridoma TOL101 MCB (TOL101), medido usando las técnicas tradicionales divulgadas en la presente, dando como resultando los anticuerpos de la invención con por lo menos una de las propiedades funcionales o clínicas de TOL101 descritas en la presente. Además, el anticuerpo o fragmentos de unión al antígeno de la invención se pueden glicosilar en residuos equivalentes o correspondientes que el anticuerpo producido por el hibridoma TOL101 MCB (TOL101) . Los "residuos equivalentes o correspondientes" significan que el anticuerpo o fragmentos de unión al antigeno de la invención están glicosilados en los residuos que se encuentran dentro de los 35, dentro de los 30, dentro de los 25, dentro de los 20, dentro de los 15, dentro de los 10 o dentro de los 5 residuos de aminoácidos con respecto al residuo glicosilado en el anticuerpo producido por el hibridoma TOL101 MCB (TOL101) cuando las dos secuencias de anticuerpo se alinean usando un software para computadora disponible al público y el número de residuo de los residuos glicosilados se identifican de acuerdo con Kabat de modo tal que los anticuerpos o fragmentos de unión al antigeno de la invención tienen por lo menos una de las propiedades funcionales o clínicas mejoradas de TOL101 ante el arte anterior como se describe en la presente. Los ejemplos de software para computadora adecuados comprenden programas que incluyen "Staden Package", "ADN Star", "MacVector", GCG "Wisconsin Package" (Genetics Computer Grupo, Madison, Wis.) y "NCBI toolbox" (Nacional Center for Biotechnology Information) . Según se describe en la presente, los métodos para identificar, comparar, alterar y/o manipular la glicosilación de un anticuerpo también son bien conocidos en el arte.

Ejemplos de anticuerpos La invención divulgada en la presente tiene numerosos ejemplos de formas de realización. A continuación se describe una variedad de las formas de realización típicas de la invención. Las siguientes formas de realización se ofrecen a efectos ilustrativos solamente y no pretenden limitar en modo alguno el alcance de la presente invención. En determinadas formas de realización de los métodos, ensayos y composiciones de la presente invención, el anticuerpo anti-aß TCR o un fragmento de anticuerpo del mismo comprende al anticuerpo TOLIOI o un fragmento de anticuerpo del mismo que es un anticuerpo monoclonal IgM aislado de ratón que se une a aß TCR y es producido por el hibridoma TOLIOI MCB.

Propiedades de los anticuerpos monoclonales anti- ß TCR En diversas formas de realización, los anticuerpos anti-aß TCR de la presente invención se unen específicamente a una aß TCR de mamífero, por ejemplo, una aß TCR humana. En algunas formas de realización, los anticuerpos anti- ß TCR de la presente invención se unen a células T CD3 + sin una áá TCR. Aún más, los anticuerpos anti-aß TCR de la presente invención no se unen a células que expresan marcadores tales como CD14, CD16, B220 y CD19, resaltando aún más su especificidad por la célula T ß. Por ejemplo, se ha observado una unión homogénea, robusta y reproducible del anticuerpo anti-aß TCR a TOLIOI en más de 130 pacientes clínicos y 20 voluntarios saludables, así como a líneas celulares T inmortalizadas comunes. Dado que los anticuerpos anti- ß TCR de la presente invención se unen a toda la población de células T aß de una manera homogénea, se cree que los anticuerpos anti-aß TCR de la presente invención se unen a una región constante de la aß TCR.

Otros anticuerpos anti-aß TCR conocidos en el arte, tal como T10B9.1A-31 (T10B9) y MEDI-500, son anticuerpos monoclonales M kappa de inmunoglobulina de murino (mAb) dirigidos contra el heterodimero alfa-beta ( ß) del complejo receptor de linfocitos T. T10B9 se encuentra disponible comercialmente en BD Pharminigen™ (San Diego, CA, EE.UU.) con los números de catálogo 561674, 555548, 5555547, 561673. T10B9 tiene una duración de acción relativamente corta, con depleción de células T durante entre 10 y 14 días, a diferencia de la depleción prolongada observada con la timoglobulina y Campath-1H. Los anticuerpos anti-aß TCR, tal como T10B9 y MEDI-500, son no mitogénicos (es decir, no inducen una proliferación celular) en una forma soluble a concentraciones bajas; sin embargo, las concentraciones altas de anticuerpos en una forma soluble, o concentraciones ya sea bajas o altas de anticuerpo unido a placa (es decir, anticuerpos entrecruzados) inducen proliferación celular (Brown et al., Clinical Transplantation 10; 607-613

[1996]). Por el contrario, los anticuerpos monoclonales anti-aß TCR o fragmentos de anticuerpo de los mismos de la presente invención, que no incluyen MEDI-500 o T10B9 o fragmentos de los mismos, son no mitogénicos a concentraciones altas y bajas y en ambas formas soluble y unida a placa. A veces T10B9 y MEDI-500 se usan indistintamente en la literatura, y cada uno ha sido evaluado previamente como anticuerpos terapéuticos en indicaciones tales como el tratamiento de rechazo a aloinjertos y formas malignas hematológicas . Sin embargo, el uso clínico de estos anticuerpos se asoció con eventos adversos y respuestas de anticuerpo anti-ratón humano significativas ( HAMA) (Waid et al., Transplantation 64; 274-281

[1997]). Por consiguiente, persiste la necesidad en el arte de anticuerpos anti- ß TCR que propocionen eficacia al tiempo que minimizan los eventos adversos. Sorprendentemente, TOL101 que es un anticuerpo de murino y es específico de aß TCR, presentó una suppression robusta de células T con un mínimo de eventos adversos y de respuestas HAMA. Sin considerar la teoría, se cree que las modificaciones de postraducción de TOL101, incluyendo, por ejemplo, la glicosilación y/o la conformación del anticuerpo, son por lo menos en parte responsables de la eficacia clínica y seguridad superiores del anticuerpo de la presente invención ante los anticuerpos del arte anterior. Además, los anticuerpos anti- ß TCR de la presente invención (incluyendo TOL101) no deplecionan significativamente los números de células T CD3+ en circulación (por ejemplo, en una cantidad mayor que un 10% cuando se comparan con un control de vehículo) cuando se administran por vía sistémica a dosis que varían en un rango entre 0 y 42 mg/ml por día durante 1 a 5 días. En su lugar, sin considerar la teoría, se cree que los anticuerpos anti- aß TCR de la presente invención (incluyendo TOL101) subregulan el complejo CD3 sobre las células T ß TCR+, incluyendo la propia aß TCR, por lo cual las células T se vuelven incapaces de responder al antígeno. Según se usa en la presente, los términos "depleción de células T" y "supresión células T" se refieren a la reducción de los números de células T (por ejemplo, las células T en la circulación en un sujeto). La depleción o suppression de células T se puede lograr por inducción de muerte celular de la célula T.

Usos de los anticuerpos anti-aß TCR y fragmentos de anticuerpo de los mismos Los anticuerpos anti-aß TCR o fragmentos de anticuerpo de los mismos de la invención tienen diversas utilidades, en particular relacionadas con la modulación negativa de las células T ß TCR+. Por ejemplo, los anticuerpos anti-aß TCR se pueden emplear en métodos de tratamiento de condiciones patológicas en mamíferos, por ejemplo, seres humanos, primates y animales de laboratorio. En la presente se contempla que los anticuerpos anti-aß TCR se pueden emplear en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias y condiciones y enfermedades relacionadas con rechazo de injerto contra huésped o de tejidos trasplantados. En los métodos de la presente invención , los anticuerpos anti- ß TCR o fragmentos de anticuerpos de los mismos, se pueden administrar a un mamífero , por ejemplo a un sujeto humano que lo necesita, solos o en combinación con otras o técnicas o agentes terapéuticos adyuvantes secundarios adicionales.

A modo ilustrativo solamente, las enfermedades autoinmunes y de inflamación para las cuales el tratamiento con los anticuerpos anti- ß TCR o fragmentos de anticuerpos puede resultar eficaz pueden incluir: asma (por ejemplo, asma alérgica, asma no alérgica, asma inducida por el ejercicio, asma ocupacional y asma nocturna) , alergia, inflamación alérgica de las vías respiratorias, encefalomielitis alérgica, artritis autoinmune, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reactiva, artritis psoriásica, sacroilitis, uveítis anterior aguda aislada, espondiloartropatía no diferenciada, diabetes mellitus tipo 1, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, glomerulonef itis, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, esclerodermia, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, espondilitis anquilosante, síndrome de Sjogren, psoriasis, dermatitis de contacto, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Addison , granulomatosis de Wegener , cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante, hepatitis autoinmune, polimialgia reumática, enfermedad de Bechet, síndrome de Guillain-Barre, diversas vasculitis, uveorretinitis, tiroiditis, miastenia grave, nefropatías por inmunoglobulina, miocarditis y esclerosis sistémica progresiva. En algunas formas de realización, una enfermedad inflamatoria puede incluir una condición o enfermedad inflamatorias, por ejemplo, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) , bronquitis, enfisema o síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) . En otro aspecto, el trastorno o enfermedad inflamatoria puede incluir una enfermedad, trastorno o trastorno que está asociado con niveles elevados de citoquinas inflamatorias. En diversos aspectos, la citoquina inflamatoria es IL-2, IL-4 o IL-5; o la citoquina inflamatoria es IFN-a; o la citoquina inflamatoria es TNF-áEn formas de realización particulares, la enfermedad autoinmune es diabetes tipo I o esclerosis múltiple .

Las formas de realización de la presente invención proveen métodos para tratar a un sujeto que tiene o que necesita un transplante. De acuerdo con estas formas de realización, el sujeto puede ser tratado con una composición para reducir el riesgo de un rechazo de trasplante o un efecto secundario por el rechazo de trasplante en dicho sujeto. De acuerdo con este método, al sujeto se le puede administrar una composición que comprende anticuerpos anti-aß TCR o fragmentos de anticuerpo de los mismos que tienen la capacidad para reducir la activación de células T. La composición puede ser administrada antes del trasplante, durante el trasplante, después del trasplante o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, los anticuerpos anti-TCR aß o fragmentos de anticuerpo de los mismos de la presente invención se administran con el fin de prevenir o reducir la gravedad del rechazo del trasplante. En otras formas de realización, los anticuerpos anti-TCR aß o fragmentos de anticuerpo de los mismos de la presente invención se administran con el fin de tratar un rechazo de trasplante que se está produciendo o que ya se ha producido. Además, la composición puede incluir además uno o más entre un agente anti-rechazo de trasplantes, un agente antiinflamatorio, un agente inmunosupresor, un agente inmunomodulador, un agente anti-microbiano o una combinación de los mismos.

En determinadas formas de realización de la invención, la composición que comprende a los anticuerpos anti-TCR aß o fragmentos de anticuerpos de los mismos pueden reducir significativamente la activación de citoquinas asociada con la activación de células T. Un trasplante de tejido de la presente invención puede incluir un trasplante de órganos y/o un trasplante que no es de órganos. Por ejemplo, se contemplan transplantes de pulmón, de riñon, de corazón, de hígado, de córnea, de piel, de células madre, de tejido blando (por ejemplo, un trasplante del componente facial), trasplantes intestinales, de médula ósea, de los islotes pancreáticos, un trasplante de páncreas o una combinación de los mismos.

Las formas de realización de la presente invención proveen métodos para aliviar los síntomas o signos experimentados por un sujeto que tiene o que necesita de un transplante. De acuerdo con estas formas de realización, los síntomas o signos pueden incluir las condiciones asociadas con la enfermedad de injerto versus huésped (GVHD) o con el rechazo de injertos. En un ejemplo, los métodos descritos en la presente se pueden usar para tratar a un sujeto sometido a un trasplante renal. En otra forma de realización, los síntomas o signos pueden incluir, pero en un sentido no taxativo, uno o más de los siguientes, insuficiencia renal, insuficiencia pulmonar, insuficiencia cardíaca, malestar general, fiebre, tos seca, anorexia, pérdida de peso, mialgias y dolor de pecho, compromiso de ventilación, sudoración, náuseas, vómitos, fiebre, dolor abdominal, diarrea con sangre, ulceraciones de la mucosa, una función renal reducida (aumento de creatinina, disminución de la producción de orina) , función pulmonar reducida (aumento de la dificultad para respirar, fiebre, tos, expectoración, hipoxemia) , reducción de la función cardiaca (falta de aire, dolor de pecho, fatiga, edema pulmonar o periférico, valvulopatia) , función reducida de los islotes (aumento de glucosa, diabetes mellitus) , enfermedad de injerto versus huésped (ulceración gastrointestinal (GI), insuficiencia pulmonar, ulceración de la piel, coagulopatia, disfunción del SNC (cambios en el estado mental, coma) , infección por citomegalovirus (CMV) , viral, parasitaria, fúngica) .

Las formas de realización de la presente invención proporcionan métodos para promover una supervivencia y la función prolongada de injertos en un sujeto incluyendo la administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que incluye anticuerpos anti-TCR aß o fragmentos de anticuerpos de los mismos. Las formas de realización de la presente invención proporcionan métodos para tratar a un sujeto que necesita de una terapia de inmunotolerancia . De acuerdo con estas formas de realización, el sujeto puede ' ser tratado con una composición para reducir el riesgo de una respuesta inmune disfuncional o un efecto secundario de una respuesta inmune se proporcionan métodos para reducir la producción de NO y/o para reducir la apoptosis y/o para inhibir al citomegalovirus (de infección y de reactivación) , que incluyen la administración de una composición que incluye anticuerpos anti-TCR aß o fragmentos de anticuerpos de los mismos. En determinadas formas de realización de la invención, se provee una composición capaz de reducir significativamente la activación de células T in vivo e in vitro.

En determinadas formas de realización de la presente invención, se pueden usar agentes activos secundarios en combinación con los anticuerpos anti-TCR ß o fragmentos de anticuerpo de los mismos de la presente invención. En ejemplos de formas de realización, las drogas o los compuestos inmunomoduladores antiinflamatorios pueden incluir, pero en un sentido no taxativo, uno o más entre interferón, derivados de interferón incluyendo betaseron, beta-interferón, derivados de prostano incluyendo iloprost, cicaprost; glucocorticoides tal como cortisol, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona; inmunosupresores incluyendo ciclosporina A, FK -506, metoxsaleno, talidomida, sulfasalazina, azatioprina, metotrexato; inhibidores de lipoxigenasa que comprenden zileutón, MK-886, WY-50295, SC-45662, SC-41661A, BI-L-357; antagonistas de leucotrienos ; derivados de péptidos incluyendo ACTH y análogos de los mismos; receptores solubles de TNF; anticuerpos de TNF; receptores solubles de interleuquinas, otras citoquinas, proteínas de células T; anticuerpos contra los receptores de interleuquinas, otras citoquinas, proteínas de células T; y calcipotrioles; Celcept® micofenolato de mofetilo y análogos de los mismos, ya sea solos o combinados.

Los anticuerpos anti-TCR aß o fragmentos de anticuerpo de los mismos de la presente invención también se pueden fusionar o acoplar de manera recombinante a un polipéptido heterólogo por el extremo N - o C-terminal o se pueden conjugar químicamente (incluyendo con ugaciones covalentes y no covalentes) a un polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención se pueden fusionar o conjugar de manera recombinante a moléculas que son útiles como marcadores en ensayos de detección (tales como radionúclidos , radioisótopos, marcadores fluorescentes, marcadores luminiscentes, marcas bioluminiscentes o biotina) y moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, drogas, enzimas o toxinas. Véase, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 92/08495; WO 91/14438.

Las formas de realización de la presente invención proporcionan métodos para reducir el rechazo del injerto en un sujeto. De acuerdo con estas formas de realización, el sujeto puede ser tratado con una cantidad terapéuticamente presencia y cantidad de citoquinas especificas de la enfermedad, la presencia de fiebre y semejantes. Por ejemplo, en el lupus eritematoso sistémico, el mediador central de la enfermedad es la producción de anticuerpos autorreactivos contra autoproteinas/tej idos y la posterior generación de una inflamación mediada por el sistema inmune. Hay múltiples órganos y sistemas afectados clínicamente, incluyendo riñon, pulmón, el sistema musculoesquelético, mucocutáneo, ojos, sistema nervioso central, sistema cardiovascular, tracto gastrointestinal, médula ósea y sangre. El SLE se puede diagnosticar usando una variedad de pruebas reumatológicas y hematológicas , por ejemplo, la presencia y la cantidad de determinados autoanticuerpos, por ejemplo, una prueba positiva para un anticuerpo anti-nuclear (ANA) , la presencia de anticuerpos anti-nRNP A, anti-nRNP C, anti-Sm, anti-Ro y anti-La y anticuerpos anti-ADNcd.

La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad inflamatoria autoinmune sistémica crónica que afecta principalmente a la membrana sinovial de múltiples articulaciones, con lesiones resultantes del cartílago articular. La patogénesis es dependiente de linfocitos T y está asociada con la producción de factores reumatoides, autoanticuerpos dirigidos contra la IgG propia, con la formación resultante de complejos inmunes que alcanzan niveles elevados en el liquido articular y la sangre. Estos complejos en la articulación pueden inducir el infiltrado marcado de linfocitos y monocitos en la membrana sinovial y los marcados cambios sinoviales . subsiguientes; el espacio/fluido articular es infiltrado por células similares con la adición de numerosos neutrófilos. Los tejidos afectados son primariamente las articulaciones, a menudo según un patrón simétrico. Sin embargo, también existe la enfermedad extraarticular en dos formas principales. Una forma es el desarrollo de lesiones extra-articulares con una enfermedad articular progresiva en curso y lesiones típicas de fibrosis pulmonar, vasculitis y úlceras cutáneas. La segunda forma de enfermedad extra-articular es el denominado síndrome de Felty que tiene lugar tarde en el transcurso de la enfermedad de RA, a veces después que la enfermedad articular haya pasado a estar quiescente, e implica la presencia de neutropenia, trombocitopenia y esplenomegalia . Esto puede estar acompañado por vasculitis en múltiples órganos con formaciones de infartos, úlceras de la piel y gangrena. Los pacientes a menudo también desarrollan nodulos reumatoides en el tejido subcutáneo que recubre las articulaciones afectadas; los nodulos de etapa tardía tienen centros necróticos rodeados por un infiltrado celular inflamatorio mixto. Otras manifestaciones que pueden aparecer en la RA incluyen: pericarditis, pleuritis, arteritis coronaria, neumonitis intersticial con fibrosis pulmonar, queratoconj untivitis seca y nodulos reumatoides .

La artritis crónica juvenil es una enfermedad inflamatoria idiopática crónica que empieza a menudo antes de los 16 años de edad. Su fenotipo tiene algunas similitudes con la RA; algunos pacientes de factor reumatoide positivo se clasifican como artritis reumatoide juvenil. La enfermedad s subclasifica en tres grandes categorías: pauciarticular, poliarticular y sistémica. La artritis puede ser grave y típicamente es destructiva y conduce a la anquilosis de la articulación y un crecimiento retardado. Otras manifestaciones pueden incluir uveitis anterior crónica y amiloidosis sistémica.

Las espondiloartropatías son un grupo de trastornos con algunas características clínicas comunes y la asociación común con la expresión del producto del gen HLA-B27. Los trastornos incluyen: espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter (artritis reactiva) , artritis asociada con una enfermedad inflamatoria del intestino, espondilitis asociada con psoriasis, espondiloartropatía de inicio juvenil y espondiloartropatía indiferenciada . Las características distintivas incluyen sacroileítis con o sin espondilitis; artritis asimétrica inflamatoria; asociación con HLA-B27 (un alelo definido serológicamente del locus HLA-B de MHC de clase I) ; inflamación ocular y ausencia de autoanticuerpos asociados con otra enfermedad reumatoide. La célula más implicada como clave para la inducción de la enfermedad es el linfocito T CD8 +, una célula que dirigida a los antigenos presentados por moléculas MHC de clase I . Las células T CD8 + pueden reaccionar contra el alelo HLA-B27 MHC de clase I como si fuera un péptido extraño expresado por las moléculas MHC de clase I. Se ha planteado la hipótesis de que un epitopo de HLA- B27 puede imitar un epitopo antigénico bacteriano u otro microbiano y por lo tanto inducir una respuesta de células T CD8 +.

La esclerosis sistémica (esclerodermia) es de etiología desconocida. Un sello distintivo de la enfermedad es la induración de la piel; probablemente esta es inducida por un proceso inflamatorio activo. La esclerodermia puede ser localizada o sistémica; las lesiones vasculares son comunes y la lesión de las células endoteliales en la microvasculatura es un evento temprano e importante en el desarrollo de la esclerosis sistémica; la lesión vascular puede ser mediada por el sistema inmune. Hay una base inmunológica implicada por la presencia de infiltrados de células mononucleares en las lesiones cutáneas y la presencia de anticuerpos antinucleares en muchos pacientes. ICAM -1 a menudo está sobreregulado sobre la superficie celular de los fibroblastos en las lesiones de la piel lo cual sugiere que la interacción de células T con estas células puede cumplir un papel en la patogénesis de la enfermedad. Otros órganos implicados incluyen: el tracto gastrointestinal: atrofia del músculo liso y la fibrosis que resulta en una peristalsia/motilidad anormal; renal: proliferación de la intima subendotelial concéntrica que afecta las pequeñas arterias interlobulares arqueadas y la consiguiente reducción del flujo sanguíneo cortical renal, que resulta en proteinuria, azotemia e hipertensión; músculo esquelético: atrofia, fibrosis intersticial; inflamación; pulmón: neumonitis intersticial y fibrosis intersticial ; y corazón: necrosis en bandas de contracción, cicatrización/fibrosis .

Las miopatías inflamatorias idiopáticas incluyendo dermatomiositis, polimiositis y otras son trastornos de la inflamación muscular crónica de etiología desconocida que resulta en debilidad muscular. La lesión muscular/inflamación a menudo es simétrica y progresiva. Los autoanticuerpos están asociados con la mayoría de las formas. Estos autoanticuerpos específicos de la miositis están dirigidos contra e inhiben la función de los componentes, las proteínas y los ARN que participan en la síntesis de proteínas.

El síndrome de Sjogren se debe a la inflamación mediada por el sistema inmune y la subsiguiente destrucción funcional de las glándulas lagrimales y las glándulas salivales. La enfermedad puede estar asociada con o acompañada por enfermedades inflamatorias del tejido conectivo. La enfermedad está asociada con la producción de autoanticuerpos contra los antigenos Ro y La, ambos siendos pequeños complejos de ARN-proteina . Las lesiones resultan en queratoconjuntivitis seca, xerostomia, y otras manifestaciones o asociaciones, que incluyen cirrosis biliar, neuropatía periférica o sensorial y púrpura palpable.

Las vasculitis sistémicas son enfermedades en las cuales la lesión primaria es una inflamación y subsiguiente daño en los vasos sanguíneos que da como resultado isquemia/necrosis/degeneración de los tejidos suministrados por los vasos afectados y en algunos casos la eventual disfunción del órgano final. Las vasculitis también pueden aparecer como una lesión secundaria o como una secuela de otras enfermedades mediadas por el sistema inmune e inflamatorio tales como artritis reumatoide, esclerosis sistémica, etc, particularmente en las enfermedades que también están asociadas con la formación de complejos inmunes. Las enfermedades del grupo de la vasculitis sistémica primaria incluyen: vasculitis sistémica necrotizante : poliarteritis nodosa, vasculitis alérgica y granulomatosis, poliangeitis ; granulomatosis de Wegener; granulomatosis linfomatoide; y arteritis de células gigantes. Varias vasculitis incluyen: síndrome de ganglio linfático mucocutáneo ( LNS o enfermedad de Kawasaki) , vasculitis aislada del SNC, enfermedad de Behet, tromboangeítis obliterante (enfermedad de Buerger) y venulitis cutánea necrotizante . Se cree que el mecanismo patogénico de la mayoría de los tipos de vasculitis enumerados se debe principalmente a la deposición de complejos de inmunoglobulina en la pared del vaso y la subsiguiente inducción de una respuesta inflamatoria ya sea vía ADCC, activación del complemento o ambos.

La sarcoidosis es una condición de etiología desconocida que se caracteriza por la presencia de granulomas epitelioides en casi cualquier tejido del cuerpo; el compromiso de pulmones es la característica más común. La patogénesis implica la persistencia de macrofagos activados y células linfoides en los sitios de la enfermedad, con las subsiguientes secuelas crónicas debidas a la liberación de productos activos local y sistémicamente que son liberados por estos tipos de células.

La anemia hemolítica autoinmune que incluye la anemia autoinmune hemolítica, pancitopenia inmune y la hemoglobinuria paroxística nocturna, es el resultado de la producción de anticuerpos que reaccionan contra antigenos expresados sobre en la superficie de los glóbulos rojos de la sangre (y en algunos casos otras células sanguíneas que también incluyen plaquetas) y es un reflejo de la eliminación de dichas células recubiertas con anticuerpos a través de una lisis mediada por complemento y/o mecanismos mediados por ADCC/receptor Fe.

En la trombocitopenia autoinmune, que incluye púrpura trombocitopénica y la trombocitopenia mediada por el sistema inmun en otras situaciones clínicas, la destrucción/eliminación de plaquetas se produce como resultado de la unión de anticuerpos o de complementos a las plaquetas y la posterior eliminación mediante lisis del complemento, mecanismos mediados por ADCC o el receptor Fe.

La tiroiditis, que incluye la enfermedad de Grave, la tiroiditis de Hashimoto, la tiroiditis linfocítica juvenil y la tiroiditis atrófica, son el resultado de una respuesta autoinmune contra antígenos de la tiroides con producción de anticuerpos que reaccionan con las proteínas presentes en la glándula tiroides y con frecuencia específicas de la misma. Existen modelos experimentales que incluyen modelos espontáneos: ratas (ratas BUF y BB) y pollos (cepa de pollos obesos) ; modelos inducibles : inmunización de animales con tiroglobulina, antígeno microsómico tiroideo (peroxidasa tiroidea) .

La diabetes mellitus tipo I o la diabetes insulino-dependiente es la destrucción autoinmune de las células ß de los islotes pancreáticos. Esta destrucción está mediada por autoanticuerpos y células T autorreactivas . Los anticuerpos contra la insulina o el receptor de insulina también pueden producir el fenotipo de falta de respuesta a insulina .

Las enfermedades renales mediadas por el sistema inmune, incluyendo glomerulonefritis y nefritis tubulointersticial, son el resultado de anticuerpos o lesiones mediadas por linfocitos T en el tejido renal, ya sea directamente como resultado de la producción de anticuerpos autorreactivos o células T contra antigenos renales o indirectamente como resultado de la deposición de anticuerpos y/o de complejos inmunes en el riñon que son reactivos contra otros antigenos no renales. Por lo tanto, otras enfermedades mediadas por el sistema inmune que dan como resultado la formación de complejos inmunes también pueden inducir una enfermedad renal mediada por el sistema inmun como una secuela indirecta. Ambos mecanismos inmunes directos e indirectos dan como resultado una respuesta inflamatoria que produce/induce el desarrollo de lesiones en los tejidos renales con la consiguiente insuficiencia de la función del órgano y, en algunos casos, la progresión a una insuficiencia renal.

Ambos mecanismos inmunes humorales y celulares pueden estar implicados en la patogénesis de las lesiones.

Se cree que las enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico, incluyendo esclerosis múltiple; polineuropatia desmielinizante idiopática o el síndrome de Guillain-Barr ; y la polineuropatia desmielinizante inflamatoria crónica, tienen una base autoinmune y dar lugar a la desmielinización del nervio como resultado del daño causado en los oligodendrocitos o directamente en la mielina. En la esclerosis múltiple hay pruebas que sugieren que la inducción de la enfermedad y la progresión dependen de los linfocitos T. La esclerosis múltiple suele tener un curso ya sea recurrente-remitente o un curso progresivo-crónico . La etiología es desconocida; sin embargo, las infecciones virales, la predisposición genética, el medio ambiente y la autoinmunidad pueden contribuir todos en la etiología y/o la patogénesis de la enfermedad. Las lesiones contienen infiltrados de células microgliales y macrofagos infiltrantes mediados predominantemente por linfocitos T; los linfocitos T CD4 + son el tipo celular predominante en los sitios de las lesiones. El mecanismo de la muerte celular de oligodendrocitos y la posterior desmielinización no es conocida pero es probable que sea dirigido por linfocitos T.

En diversos aspectos de la presente invención, la administración de los anticuerpos anti-aß TCR de la presente invención es considerada como un primer paso racional en la prevención de una mayor destrucción de la mielina y la morbilidad del paciente. En el modelo animal de la esclerosis múltiple, encefalomielitis autoinmune experimental, el antagonismo de las células T puede anular la enfermedad por completo. Sin considerar ninguna teoría particular, se cree que la administración de los anticuerpos anti- ß TCR de la presente invención en el modelo animal de esclerosis múltiple, encefalomielitis autoinmune experimental, conduce a un antagonismo de las células T que puede anular la enfermedad por completo. Si bien el o los mecanismos específicos que funcionan en la reducción, anulación o reversión de los síntomas y la patogénesis de la enfermedad no serían necesarios para comprender la presente invención, se cree que la administración de los anticuerpos anti-aß TCR de la presente invención a un pacientes con inicio reciente de esclerosis múltiple no sólo podría silenciar la respuesta inmune autorreactiva, sino que también podría impedir la difusión de epitopes a otros epítopos de mielina, inhibiendo así la progresión de la enfermedad.

Los criterios para determinar las etapas de la enfermedad de esclerosis múltiple son bien conocidos. Por ejemplo, los síntomas asociados con un inicio reciente pueden incluir uno o más de los siguientes: fatiga, trastornos visuales, mareos, entumecimiento/vértigo, disfunción vesical e intestinal, debilidad, temblores, problemas de movilidad, disfunción sexual, trastornos del habla, espasticidad (rigidez de piernas), trastornos de deglución, dolor crónico, depresión, dificultades cognitivas y de memoria leves. Si bien no todos estos síntomas estarán presentes en la esclerosis múltiple de inicio reciente, generalmente se detecta alguna combinación de los mismos. Otras etapas o tipos de esclerosis múltiple pueden incluir: esclerosis múltiple benigna, recaída/remisión de esclerosis múltiple, esclerosis múltiple secundaria/progresiva, esclerosis múltiple primaria/progresiva y esclerosis múltiple progresiva/recidivante. Estas etapas de la esclerosis múltiple son bien conocidas en la técnica y se pueden verificar usando ensayos neurológicamente aceptables y métodos de diagnóstico conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede determinar el número de lesiones de mejora del contraste (CEL) a partir de estudios de imágenes de resonancia magnética (MRI). Además, las evaluaciones funcionales de los pacientes con esclerosis múltiple con conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, la media de la Escala de Calificación Neurológica de Scripps (SNRS) ; la media de la Escala del Estado de Discapacidad Ampliada (EDSS) ; y la media de la Escala Funcional Compuesto de Esclerosis Múltiple (MSFC) .

Según se usa en la presente, el tratamiento de un mamífero, por ejemplo un ser humano, diagnosticado con esclerosis múltiple o sospechado de sufrir esclerosis múltiple, puede incluir la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-aß TCR o un fragmento del mismo de la presente invención a un sujeto mamífero diagnosticado con o sospechado de presentar uno o más de: esclerosis múltiple de inicio reciente, esclerosis múltiple benigna, esclerosis múltiple recidivante/en remisión, esclerosis múltiple secundaria/progresiva, esclerosis múltiple primaria/progresiva y esclerosis múltiple progresiva/recidivante. En algunas formas de realización, el método de tratamiento de un mamífero con esclerosis múltiple puede comprender además la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-aß TCR o un fragmento del mismo de la presente invención en un régimen de dosis de escala creciente, un régimen de dosis decreciente o combinaciones de los mismos, como se divulga en la presente.

Clínicamente, se están probando agentes que incluyen alemtuzumab y daclizumab para la MS. Sin embargo, estas terapias tienen perfiles de eficacia y seguridad cuestionables. En estudios con animales, el direccionamiento al receptor de células T aß ha demostrado una eficacia terapéutica dramática para los signos clínicos y patológicos de la enfermedad. No sólo permiten silenciar la respuesta inmune autorreactiva, sino que también impiden la difusión de epitopes a otros epitopes de mielina, inhibiendo así la progresión de la enfermedad. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-aß TCR o un fragmento del mismo de la presente invención disminuirán el número promedio de lesiones de mejora del contraste mensuales en un 50 % o más. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-aß TCR o un fragmento del mismo de la presente invención disminuirá el número promedio de lesiones de mejora de contraste (CEL) durante los meses 3-6 después del tratamiento con el anticuerpo anti- aß TCR o un fragmento del mismo de la presente invención, en comparación con la media total del CEL de las MRI básales (por ejemplo, la media total de CEL durante 3 resonancias magnéticas tomadas durante los dos meses previos al tratamiento) . En otras formas de realización, el tratamiento con el anticuerpo anti-aß TCR o un fragmento del mismo de la presente invención mejora o previene el empeoramiento de los síntomas de la esclerosis múltiple medido con la media de la Escala de Calificación Neurológica de Scripps (SNRS) en comparación con las SNR, la Escala Ampliada del Estado de Discapacidad (EDSS) y/o la Escala Funcional Compuesta de Esclerosis Múltiple (MSFC) En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-aß TCR o un fragmento del mismo de la presente invención reduce el número de células T especificas de mielina En algunas formas de realización, el anticuerpo anti- ß TCR o un fragmento del mismo de la presente invención cambiará el fenotipo de las células T especificas de mielina de una célula T proinflamatoria-THl/17 a una célula T TH2 - y/o hará que las células T causantes de la enfermedad no respondan.

Según se usa en la presente, la esclerosis múltiple de inicio reciente puede incluir sujetos que tienen un primer evento desmielinizante (síndrome clínicamente aislado (CID) ) . Los métodos para detectar y/o diagnosticar la esclerosis múltiple de inicio reciente son bien conocidos en el campo neurológico. Algunos ejemplos ilustrativos pueden incluir, imágenes por resonancia magnética, para la detección de lesiones, tal como el uso del volumen de la lesión y el recuento de lesiones realzadas con gadolinio y T2 (es decir, las lesiones observadas en las imágenes ponderadas para T2), lesiones hipointensas ponderadas para TI (Agujeros Negros) y las mediciones de atrofia del sistema nervioso central (CNS) , permiten capturar una imagen más global del rango de alteraciones de tejidos causadas por la inflamación, desmielinización, pérdida axonal y la neurodegeneración . En algunas formas de realización, la evidencia clínica objetiva de una lesión (síndrome clínicamente aislado) en un paciente con esclerosis múltiple de inicio reciente se puede determinar con la diseminación en el espacio demostrada por: dos o más lesiones por MRI coherentes con una esclerosis múltiple además de un CSF positivo y la diseminación en el tiempo demostrado por MRI o un segundo ataque clínico. Un valor CSF positivo se define en general como bandas oligoclonales diferentes de las del suero o generadas por el índice de inmunoglobulina G. En un ejemplo, se pueden determinar los criterios de MRI para anomalía cerebral según lo determinado por diseminación en espacio y tiempo y las lesiones de MRI diseminadas en el espacio si se cumplen por lo menos tres de los siguientes criterios: 1) Una lesión realzada con gadolinio o nueve lesiones hiperintensas T2 en cerebro o médula espinal; 2) por lo menos una lesión infratentorial o de la médula espinal; 3) por lo menos una lesión yuxtacortical ; o 4) por lo menos tres lesiones periventriculares . Para determinar la presencia de lesiones diseminadas por MRI en el tiempo, se debe cumplir por lo menos uno de los siguientes criterios: 1) lesión realzada con gadolinio = 3 meses después de la presentación inicial, pero en un lugar diferente del evento inicial, y 2) una nueva lesión T2, en comparación con una RI de referencia = 30 días después del inicio del evento inicial. Adaptado de Polman CH, Reingold SC, Edan G, et al., Diagnostic Criteria for Múltiple Sclerosis: 2005 Revisions to the "McDonald Criteria." Ann Neurol 2005; 58:840-846, cuya divulgación se incorpora por completo en la presente..

Una enfermedad inflamatoria y fibrosis pulmonar, incluyendo neumonías eosinofílicas ; fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis por hipersensibilidad, puede comprender la desregulación de una respuesta inmune inflamatoria. La inhibición de esta respuesta tendría un beneficio terapéutico.

Una enfermedad autoinmune o de la piel mediada por el sistema inmune incluyendo enfermedades cutáneas ampollosas , eritema multiforme y dermatitis de contacto, están mediadas por auto-anticuerpos, cuya génesis depende de linfocitos T.

La psoriasis es una enfermedad inflamatoria mediada por linfocitos T. Las lesiones contienen infiltrados de linfocitos T, macrófagos y células de procesamiento de antígenos y algunos neutrófilos.

Las enfermedades inflamatorias pueden incluir enfermedades de tipo alérgicas, que incluyen aquellas que están mediadas por IgE y no mediadas por IgE. Por ejemplo, la rinitis alérgica; la dermatitis atópica; la hipersensibilidad a los alimentos; y la urticaria son dependientes de linfocitos T. Estas enfermedades están mediadas predominantemente por una inflamación inducida por linfocitos T, una inflamación mediada por IgE o una combinación de ambas. En algunas formas de realización , los anticuerpos anti- ß TCR de la presente invención pueden ser de utilidad en el tratamiento de una enfermedad alérgica, una enfermedad hipersensible asociada o una enfermedad respiratoria asociada con la inflamación de las vias respiratorias, tal como asma. En algunas formas de realización, las composiciones de la presente invención son eficaces en la prevención, el tratamiento o el alivio de uno o más de los síntomas relacionados con anafilaxia, alergia de la piel, eccema, rinitis alérgica, urticaria, dermatitis atópica, enfermedad de ojo seco, alergia de contacto alergénica, hipersensibilidad alimentaria , conjuntivitis alérgica, alergia al veneno de insectos, asma bronquial, asma alérgica, asma intrínseca, asma ocupacional, asma atópica, síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) .

Las enfermedades o los trastornos asociados con hipersensibilidad que pueden ser tratados con los métodos de la invención incluyen, pero en un sentido no taxativo, anafilaxia, reacciones a fármacos, alergias en la piel, eccema, rinitis alérgica, urticaria, dermatitis atópica, enfermedad de ojo seco (o también conocida como queratoconjuntivitis seca ( CS) , también denominada queratitis seca, xeroftalmia, alergia de contacto alergénica, alergia alimentaria, conjuntivitis alérgica, alergia al veneno de insectos y enfermedades respiratorias asociadas con una inflamación de las vías respiratorias, como por ejemplo el asma y asma mediada por IgE y asma no mediada por IgE.

Las enfermedades respiratorias asociadas con la inflamación de las vias respiratorias pueden incluir, pero en un sentido no taxativo, rinitis, rinitis alérgica, asma bronquial, asma alérgica (extrínseca) , asma no alérgica (intrínseca), asma ocupacional, asma atópica, asma inducida po'r el ejercicio, asma inducida por tos, síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) .

Las enfermedades asociadas con trasplantes, incluyendo el rechazo de injertos y la enfermedad de injerto versus huésped (GVHD) , son dependientes de linfocitos T; y la inhibición de la función de los linfocitos T es paliativa.

Los anticuerpos anti-aß TCR y los fragmentos de anticuerpos descritos anteriormente son útiles para tratar, prevenir o demorar el rechazo de aloinj ertos ..

La presente invención no está limitada por el tipo de aloinj erto empleado. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, el aloinjerto es un órgano sólido o un tejido seleccionado del grupo que consiste en: corazón, pulmón, riñon , hígado, páncreas , intestino, estómago, testículos, manos, córnea, piel incluyendo un reimplante facial, islotes de Langerhans (células de los islotes del páncreas) , células madre de médula ósea/adultas, transfusión de sangre/transfusión de partes de sangre, vasos sanguíneos, válvulas cardíacas, huesos y receptor de trasplante de células o tejidos (por ejemplo, receptor de células madre o de células de la médula ósea) ..

Administración El anticuerpo preferentemente se administra al mamífero en un transportador; preferentemente un transportador farmacéuticamente aceptable. Los transportadores adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ta ed., 1980, Mack Publishing Co., editado por Oslo y col. Típicamente, se usa una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable en la formulación para obtener la formulación isotónica. Los ejemplos del transportador incluyen solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. El pH de la solución preferentemente está entre aproximadamente 5 y aproximadamente 8 y más preferentemente entre aproximadamente 7 y aproximadamente 7,5. Otros transportadores incluyen preparaciones de liberación sostenida tales como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, en donde dichas matrices están en la forma de artículos con forma, por ejemplo, películas, liposomas o micropartículas . Resultará evidente para aquellas personas con experiencia en el arte que ciertos transportadores pueden ser más preferibles dependiendo de, por ejemplo, la ruta de administración y concentración del anticuerpo que se está administrando .

Los anticuerpos anti-aß TCR o fragmentos de anticuerpos de los mismos pueden administrarse al sujeto por inyección (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intraportal) , o por otros métodos tales como infusión que aseguren la llegada al torrente sanguíneo de una forma eficaz. El anticuerpo también puede administrarse por técnicas de perfusión aislada, tales como perfusión de tejido aislado, para ejercer efectos terapéuticos locales. Se prefiere la inyección local o intravenosa.

Las guias en la selección de dosis apropiadas de anticuerpo se encuentran en la literatura sobre usos terapéuticos de anticuerpos, por ejemplo, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone y col., eds . , Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) cap. 22 y pp. 303-357; Smith y col., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber y col., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389. Una dosificación diaria típica del anticuerpo usados solo podría variar en un rango entre aproximadamente 0,01mg/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal o más por día, más preferentemente, entre aproximadamente 0,1 mg/kg hasta y aproximadamente 10mg/kg e incluso más preferentemente entre aproximadamente 0,2 mg/kg y aproximadamente 0,7 mg/kg de peso corporal o más por día dependiendo de los factores mencionados anteriormente.

En algunas formas de realización, los métodos para tratar una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria o un rechazo de tejido injertado (por ejemplo, una reacción de rechazo de trasplante renal) puede incluir administrar un anticuerpo anti- ß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo o un anticuerpo IgM anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo a un sujeto con necesidad, en una cantidad entre aproximadamente 1 mg/día y aproximadamente 200 mg/día, o entre aproximadamente 7 mg/día y aproximadamente 58 mg/día o entre aproximadamente 14 mg/día y aproximadamente 45 mg/día, o entre aproximadamente 28 mg/dia y aproximadamente 42 mg/dia, o una cantidad de 7 mg/dia, 14 mg/dia, 21 mg/dia, 28 mg/dia, 30 mg/dia, 32 mg/dia, 34 mg/dia, 35 mg/dia, 36 mg/dia, 38 mg/dia, 40 mg/dia, 42 mg/dia, 44 mg/dia, 46 mg/dia, 48 mg/dia, 50 mg/dia, 52 mg/dia, 54 mg/dia, 56 mg/dia 0 58 mg/dia o más, o combinaciones de los mismos. Como se usa en la presente, los enteros entre 1 y 200 abarcan o incluyen, cualquier entero o fracción de los mismos entres los enteros 1 y 200. Por ejemplo, una dosis diaria de entre aproximadamente 7 mg/dia y aproximadamente 58 mg/dia podría incluir naturalmente todos los enteros entre este rango, por ejemplo: 8, 10, 13, 27, 28, 29, 30, 45, 53 y 57 mg/día y cualquier cantidad fraccionaria de los mismos, por ejemplo, 3,5, 4,7, 5,25, 11,6, 22,1, 46,3 y 51,125 mg/día como ejemplo meramente de cantidades fraccionarias como se contempla entre los enteros 7 y 58. En algunas formas de realización, un esquema de dosificación de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, orl4 días, puede incluir un escalado y/o una disminución en el esquema de dosificación que contempla dosis diarias secuenciales que pueden ser las mismas y/o pueden ser diferentes. En ciertas formas de realización de los métodos, ensayos y composiciones de la presente invención, el anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo comprende el anticuerpo TOL101 o fragmento de anticuerpo del mismo el cual se une a un ß TCR. En ciertas formas de realización de los métodos de la presente invención, la enfermedad autoinmune, TOL101 o rechazo de tejido injertado es rechazo renal de tejido trasplantado/enfermedad de injerto versus huésped o esclerosis múltiple.

En algunas formas de realización, los métodos de la presente invención, por ejemplo, métodos para tratar una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria o un rechazo de tejido injertado puede incluir la administración de un anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo a un sujeto con necesidad, en una cantidad que varia en un rango entre aproximadamente 1 mg/dia y aproximadamente 200 mg/dia, o entre aproximadamente 7 mg y aproximadamente 58 mg por dosis diaria, o una dosis unitaria fraccionaria que agregada en conjunto comprende una dosis diaria, por ejemplo una dosis diaria de 28 mg puede comprender dos dosis de 14 mg administradas a tiempos diferentes dentro de un periodo de 24 horas, por ejemplo dos veces por día, o cada 12 horas. En algunas formas de realización, el régimen de dosificación puede comprender la dosificación a un paciente o sujeto que lo necesita, con una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, con una dosis diaria que esencialmente no varia entre un día y otro. En algunas formas de realización, el sujeto es tratado con una dosis diaria titulada que comienza en el dia 0 con la mayor dosis diaria, por ejemplo, 58 mg por dia, o 56 mg/dia o 42 mg/dia y se titula con la menor de las dosis diarias, por ejemplo, 7 mg por dia, o 14 mg/dia durante un periodo de entre tres y cinco o seis dias. Los esquemas de dosificación ej emplificativos se muestran en las Tablas 1- .

Tabla 1. Esquema ej emplificativo de dosificación con disminución en 3 dias Tabla 4. Esquema ej emplificativo de dosificación con disminución en 5 días En algunas formas de realización, el régimen de dosificación puede comprender un esquema de dosificación en escalado, en donde en el día 0, la dosis diaria es la menor de las dosis diarias a ser administrada al sujeto. En el último dia o algún día dentro del intervalo de tratamiento, la dosis diaria se escala hasta la mayor de las dosis diarias. En una forma de realización, se administra al sujeto un anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo hasta que los niveles de tacrólimo del sujeto han alcanzado un nivel blanco. En una forma de realización, se administra al sujeto un anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo diariamente durante un mínimo de 3 días o hasta que los niveles de tacrólimo del sujeto han alcanzado un nivel blanco. En una forma de realización, se administra al sujeto un anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo diariamente durante un mínimo de 4 días o hasta que los niveles de tacrólimo del sujeto han alcanzado un nivel blanco. En una forma de realización, se administra al sujeto un anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo diariamente durante un mínimo de 5 días o hasta que los niveles de tacrólimo del sujeto han alcanzado un nivel blanco. En una forma de realización, se administra al sujeto un anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo diariamente durante un mínimo de 6 días o hasta que los niveles de tacrólimo del sujeto han alcanzado un nivel blanco. En una forma de realización, se administra al sujeto un anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo diariamente durante un máximo de 10 días. En algunas formas de realización, el nivel blanco de tacrólimo está entre 8 y 15 ng/ml. En una forma de realización, el régimen de escalado de dosificación puede comprender los siguientes esquemas de dosificación ejemplificados en las Tablas 5 y 6: Tabla 5. Esquema e emplificativo de dosificación con escalado en 6 días Tabla 6. Esquema e emplificativo de dosificación con ado en 5 días En algunas formas de realización, la dosis diaria es dosis diaria total, administrada en una dosis unitaria o múltiples dosis, por ejemplo, 2, 3 o 4 dosis unitarias combinadas para llegar a la dosis diaria total establecida En algunas formas de realización, los métodos para tratar una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria o un rechazo de tejido injertado puede incluir administrar al menos tres dosis separadas de anticuerpos anti-aß TCR (por ejemplo, IgG o IgM) , o anticuerpo anti- ß TCR o fragmentos del mismo, a un sujeto con una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, un receptor de trasplante de aloinjerto de órgano, en donde las al menos tres dosis separadas se administran durante tres días consecutivos y en donde no se administran dos dosis el mismo día. En otras formas de realización, las al menos tres dosis separadas comprenden o consisten en cuatro dosis separadas, en donde las al menos cuatro dosis separadas se administran durante cuatro dias consecutivos y en donde no se administran dos dosis el mismo dia. En formas de realización particulares, las al menos tres dosis separadas comprende o consiste en cinco dosis separadas, en donde las al menos cinco dosis separadas se administran durante cinco dias consecutivos y en donde no se administran dos dosis el mismo dia. En otras formas de realización, las al menos tres dosis separadas comprenden o consisten entre seis y catorce dosis separadas, en donde las al menos seis a catorce dosis separadas se administran durante entre seis y catorce dias consecutivos y en donde se administran dos dosis el mismo dia.

En algunas formas de realización, el tratamiento de un sujeto con una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria o un rechazo de tejido injertado puede comprender la administración de al menos una primera dosis de anticuerpos anti-aß TCR (por ejemplo, IgG o IgM) , o fragmentos de anticuerpo anti-aß TCR, a un sujeto, en donde la primera dosis se administra en forma intravenosa durante al menos 50 minutos o al menos 70 minutos (por ejemplo, entre 50 y 100 minutos; entre 70 y 200 minutos; entre 70 y 180 minutos; entre 70 y 140 minutos; o 70 ... 140 ... 180 ... 200 minutos) . En ciertas formas de realización, la presente invención provee métodos para retrasar o prevenir el rechazo de aloinjerto que comprende: administrar al menos una primera dosis de anticuerpos anti-aß TCR (por ejemplo, IgG o IgM) , o fragmentos de anticuerpo anti-aß TCR, a un receptor de trasplante de aloinjerto, en donde la primera dosis se administra en forma intravenosa a una tasa de entre 0,05 mg/minuto y 0,35 mg/minuto (por ejemplo, 0,05 ... 0,1 ... 0,2 ... 0,3 ... 0,35 mg/minuto).

En otras formas de realización, la al menos una primera dosis comprende al menos tres dosis separadas, en donde las tres dosis separadas se administran durante tres días consecutivos y en donde cada una de las tres dosis separadas se administran en forma intravenosa durante al menos 50 minutos ... 60 minutos ... o al menos 70 minutos. En otras formas de realización, la primera dosis se administra en forma intravenosa a una tasa sustancialmente constante (por ejemplo, una tasa entre 0,05 mg/minuto y 0,35 mg/minuto) . En ciertas formas de realización, la primera dosis se administra en una vena de alto flujo.

Los anticuerpos anti-aß TCR y fragmentos de anticuerpos pueden administrarse por cualquier medio adecuado, que incluye administración parenteral, no parenteral, subcutáneo, tópico, intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal e intralesión (por ejemplo, para el tratamiento de inmunosupresores locales) . Las infusiones parenterales incluyen, a titulo enunciativo no taxativo, administración intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, o subcutánea. Adicionalmente, los anticuerpos anti- ß TCR y fragmentos de anticuerpos pueden administrarse por infusión en pulso, particularmente con dosis en disminución.

Los anticuerpos anti-aß TCR y fragmentos de anticuerpos pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un sujeto. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede comprender anticuerpos anti-aß TCR y fragmentos de anticuerpos y un transportador farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente, "transportador farmacéuticamente aceptable" incluye solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes de retraso isotónicos y de absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de transportadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de los siguientes: agua, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, asi como combinaciones de los mismos. En muchos casos, se preferirá incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. Los transportadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender además cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes de humectación o emulsificantes, conservantes o soluciones amortiguadoras, que potenciarán la vida útil o eficacia de los anticuerpos anti-aß TCR y fragmentos de anticuerpos.

Las composiciones de esta invención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación liquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones liquidas (por ejemplo, soluciones que pueden inyectarse e infundir) , dispersiones o suspensiones, comprimidos, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo pretendido de administración y aplicación terapéutica. Las composiciones preferidas típicas se encuentran en la forma de soluciones que se pueden inyectar o infundir, tales como composiciones similares a aquellas usadas para la inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos.

Las composiciones terapéuticas típicamente son estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para alta concentración de fármaco. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse por incorporación del compuesto activo (es decir, anticuerpo o fragmento de anticuerpo) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por filtración estéril. Generalmente, las dispersiones se preparan por incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contienen un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado por vacío y secado por congelamiento que generan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente filtrada en esterilidad del mismo. La fluidez apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos . La absorción prolongada de composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

En ciertas formas de realización, el compuesto activo puede ser preparado con un transportador que protegerá el compuesto contra una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados . Pueden usarse polímeros biodegradables , biocompatibles, tales como etilenvinilacetato, polianhídridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentadas o son generalmente conocidas por aquellos con experiencia en el arte (véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J. R. Robinson. ed. , Marcel Dekker, Inc. , New York, 1978) .

Las composiciones farmacéuticas de la invención puede incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente eficaz" de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado terapéutico deseado (por ejemplo, prevenir o reducir el rechazo de aloinjerto, tratar, aliviar o prevenir la recurrencia u ocurrencia de síntomas y condiciones autoinmunes e inflamatorios) . Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y la capacidad del anticuerpo o fragmento de anticuerpo para generar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de los anticuerpos anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo es sobrepasado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado profiláctico deseado. Típicamente, dado que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes de o en un estadio más temprano de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

En ciertas formas de realización, la presente invención provee composiciones que comprende un anticuerpo aislado que comprende una secuencia de polinucleotidos de la SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 y en donde el anticuerpo aislado se une a aß TCR. En ciertas formas de realización, la presente invención provee composiciones que comprende un anticuerpo el cual se une a un ß TCR e inhibe competitivamente la unión del anticuerpo monoclonal T10B9.1A-31 al aß TCR para el tratamiento de enfermedades y trastornos autoinmunes, enfermedades o trastornos inflamatorios y rechazo de tejido trasplantado o GVHD como se describe en la presente.

En ciertas formas de realización, la presente invención provee composiciones que comprenden: anticuerpos monoclonal humanizados aislados o fragmentos de los mismos que comprenden: i) al menos una de las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la región variable de la cadena liviana del anticuerpo TOL101, ii) al menos una de las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo TOL101 y iii) las regiones constantes de un anticuerpo humano. En otras formas de realización, los anticuerpos monoclonal humanizados aislados o fragmentos de los mismos comprenden: i) al menos una, o al menos dos, o las tres, de las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la región variable de la cadena liviana del anticuerpo TOL101 y ii) al menos una, o al menos dos, o las tres, de las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo TOLIOI.

En algunas formas de realización, la presente invención provee composiciones que comprenden: anticuerpos monoclonales humanizados aislados o fragmentos de los mismos que comprenden: i) las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la región variable de la cadena liviana del anticuerpo TOLIOI, ii) las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo TOLIOI y iii) las regiones constantes de un anticuerpo humano. En otras formas de realización, los anticuerpos monoclonales humanizados o fragmentos de los mismos, se liofilizan. En otras formas de realización, las composiciones además comprenden una solución amortiguadora fisiológicamente tolerable. En formas de realización particulares, las composiciones además comprenden o consisten de al menos uno, dos, o tres de los siguientes: i) agua estéril; ii) L-arginina (por ejemplo, aproximadamente L-arginina 100 mM o entre 10 y 900 mM) ; iii) citrato (por ejemplo, aproximadamente citrato 5 mM, o citrato aproximadamente entre 1 y 25 mM) ; iv) manitol (por ejemplo, aproximadamente 4% de manitol (peso en volumen) o aproximadamente entre 1 y 30% de peso en volumen de manitol) ; y v) TWEEN u otro detergente no iónico (por ejemplo, aproximadamente 0,01% de TWEEN 80, pH 7,0). En otras formas de realización, un anticuerpo TOL101 monoclonal humanizado o fragmentos de los mismos, está presente en la composición a entre 14 mg y 52 mg, preferentemente entre 28 mg y 52 mg, o presente en la composición a 28 mg, 30mg, 32mg, 34mg, 35mg, 36mg, 38mg, 40mg, 42mg, 44mg, 46mg, 48mg, o 50mg.

Otros usos de los anticuerpos anti- ß TCR Los efectos terapéuticos de los anticuerpos anti- ß TCR de la invención pueden examinarse en ensayos in vitro y usando modelos animales in vivo. Una variedad de modelos animales bien conocidos pueden usarse para entender mejor el rol de los anticuerpos anti-aß TCR identificados en la presente en el desarrollo y patogénesis de, por ejemplo, enfermedades inmunorelacionadas o cáncer y para estudiar la eficacia de los agentes terapéuticos candidatos. La naturaleza in vivo de dichos modelos los hace particularmente predictivos de respuestas en pacientes humanos. Los modelos animales de enfermedades inmunorelacionadas incluyen animales no recombinantes y recombinantes (transgénicos) . Los modelos animales no recombinantes incluyen, por ejemplo, roedores, por ejemplo, modelos murinos . Dichos modelos pueden generarse por introducción de células en ratones singénicos usando técnicas estándares, por ejemplo inyección subcutánea, inyección en la vena de la cola, implantación en bazo, implantación intraperitoneal e implantación bajo la cápsula renal .

Se conocen modelos animales, por ejemplo, enfermedad de injerto versus huésped. La enfermedad de injerto versus huésped ocurre cuando las células inmunocompetentes son trasplantadas a pacientes inmunosuprimidos o tolerantes. Las células del donante reconocen y responden a los antigenos del huésped. La respuesta puede variar desde inflamación severa que amenaza la vida hasta casos más leves de diarrea y pérdida de peso. Los modelos de enfermedad de injerto versus huésped proveen un medio para evaluar la reactividad de células T contra los antigenos de MHC y antigenos de trasplantes menores. Un procedimiento adecuado se describe con detalle en Current Protocols in Immunology, Unidad 4.3; dicho procedimiento se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad.

Un modelo animal para el rechazo de aloinjerto de piel es un medio para evaluar la capacidad de las células T para mediar la destrucción de tejido in vivo que es indicativo de y una medida de su rol en la inmunidad anti-viral y tumor. Los modelos más comunes y aceptados usan injertos de piel de la cola murina. Los experimentos repetidos han mostrado que el rechazo de aloinjerto de piel es mediado por células T, células T colaboradoras y células T efectoras asesinas y no anticuerpos. (Auchincloss, H. Jr. Y Sachs, D. H., Fundamental Immunology, 2da ed., W. E. Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992) . Un procedimiento adecuado se describe con detalle en Current Protocols in Immunology, Unidad 4.4. Otros modelos de rechazo de trasplantes que pueden usarse para evaluar las composiciones de la invención son los modelos de trasplante de corazón alogénico descrito por Tanabe, M. y col., Transplantation, (1994) 58:23 y Tinubu, S. A. y col., J. Immunol., (1994) 4330-4338.

Los modelos animales para la hipersensibilidad de tipo retrasada proveen un ensayo de función inmune mediada por células también. Las reacciones de hipersensibilidad de tipo retrasada son una respuesta inmune mediada por células T in vivo caracterizada por inflamación que no alcanza un pico hasta luego que pase un periodo de tiempo luego del enfrentamiento con un antigeno. Estas reacciones también se producen en enfermedades autoinmunes especificas de tejido tales como esclerosis múltiple (MS) y encefalomielitis autoinmune experimental (EAE, un modelo de MS) . Un procedimiento adecuado se describe con detalle en Current Protocols in Immunology, unidad 4.5.

Un modelo animal para artritis es la artritis inducida por colágeno. Este modelo comparte características clínicas, histológicas e inmunológicas de la artritis reumatoide autoinmune humana y es un modelo aceptable de la artritis autoinmune humana. Los modelos de ratón y rata se caracterizan por sinovitis, erosión del cartílago y hueso subcondral. Los anticuerpos anti-aß TCR de la invención pueden ensayarse para la actividad contra la artritis autoinmune usando los protocolos descritos en Current Protocols in Immunology, anteriormente, unidades 15.5. También véase el modelo que usa un anticuerpo monoclonal contra las integrinas CD18 y VLA-4 descritas en Issekutz, A. C. y col., Immunology, (1996) 88:569.

Se ha descrito un modelo de asma en el cual se induce hiperreactividad de las vías aéreas inducidas por antígeno, eosinofilia pulmonar e inflamación por sensibilización de un animal con ovoalbúmina y luego enfrentando el animal con la misma proteína administrada por aerosol. Varios modelos animales (conejillo de Indias, rata, primate no humano) muestran síntomas similares a asma atópica en humanos con el enfrentamiento con antígenos en aerosol. Los modelos murinos tienen muchas de las características del asma humano. Los procedimientos adecuados para ensayar las composiciones de la invención para la actividad y eficacia en el tratamiento de asma están descritos por Wolyniec, W. W. y col., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., (1998) 18:777 y todas las referencias citadas allí.

Adicionalmente, los anticuerpos anti-aß TCR de la invención pueden ser ensayados en modelos animales para enfermedades similares a psoriasis. Los anticuerpos anti-aß TCR de la invención pueden ser ensayados en el modelo de ratón scid/scid descrito por Schon, M. P. y col., Nat. Med., (1997) 3:183, en el cual los ratones demuestran lesiones histopatológicas de piel que se parecen a psoriasis. Otro modelo adecuado es la quimera de piel de humano/ratón scid preparada como lo describe Nickoloff, B. J. y col., Am. J. Path., (1995) 146:580.

Métodos para inhibir selectivamente una respuesta inmune de células T (TCR+) En algunas formas de realización, la presente invención provee un método para inhibir o inhibir selectivamente una respuesta inmune de células T (aß TCR+) . Como se usa en la presente, el término "inhibir selectivamente" o "inhibiendo" generalmente se refiere a la inhibición de al menos una vía de activación de la célula T aß TCR+ después de la exposición de una célula T aß TCR+ a un anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo de la presente invención, "inhibiendo selectivamente" o "inhibiendo" también puede referirse a la inhibición de efectos corriente abajo de la activación de las células T tales como proliferación y producción de citoquinas.

Como se describió anteriormente, la inhibición selectiva de una respuesta inmune de células T (TCR+) involucra la reducción o supresión de componentes de señalización en las células T aß TCR+, (por ejemplo, células Tcolaboradoras o de memoria CD4+ humanas o células Tefectoras CD8+) , que pueden llevar a la reducción o cesación completa de la proliferación y/o producción de citoquinas proinflamatorias tales como el Factor de Necrosis Tumoral-alfa (TNF-a) ; Interferón-gamma (IFN-?); o interleuquinas asociadas con la activación de STAT, por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9 y/o IL-13. En diferentes métodos de tratamiento empleados en la presente, la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo da como resultado una expresión disminuida o liberación de citoquinas proinflamatorias de dichas células T TCR+ cuando se compara con la activación de las células T TCR+ expuestas a un antigeno cognado en el contexto de MHC y en ausencia del anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo. Adicionalmente, la inhibición selectiva da como resultado una célula T aß TCR+ que no está agotada, pero meramente pierde la expresión de CD3, (por ejemplo, al menos 3 dosis de anticuerpos anti-aß TCR, o fragmentos de anticuerpo anti-aß TCR, son suficientes para reducir el recuento de CD3+ en el receptor de trasplante de aloinjerto a menos de 25 células por mm3) y continúa expresando CD2. Por lo tanto, los anticuerpos anti-aß TCR o fragmentos de los mismos de la presente invención suprimen la activación de las células T, incluyendo la proliferación y producción de citoquinas proinflamatorias, sin inducir el agotamiento de células T, a diferencia de otros anticuerpos anti-célula T, tal como 0KT3, que agota las células T de la circulación y puede llevar a sujetos severamente inmunocomprometidos .

Ensayos En algunas formas de realización, los anticuerpos anti-? TCR y fragmentos de anticuerpos de los mismos pueden usarse en un ensayo de tamizaje para identificar compuestos terapéuticos que mimetizan anticuerpos anti- ß TCR y se unen a anti-aß TCR y provocan desactivación funcional del TCR.

En una forma de realización, el método incluye pasos de ensayos para identificar un compuesto terapéutico que suprime, reprime o inactiva/desactiva la activación de células T TCR+. El método incluye el paso de: poner en contacto un receptor de células T aß ( ß TCR) o fragmento del mismo con un anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo bajo condiciones operables para formar un complejo TCR-anti-aß TCR. El ensayo puede realizarse en cualquier recipiente de reacción de ensayo, pocilios, en tubos, o sobre sustratos sólidos, con la condición que las condiciones de ensayo sean conducentes para la formación de un complejo TCR-anticuerpo anti- ß TCR. En algunas formas de realización, los reactivos son agregados en forma liquida suspendidos en una solución apropiada. El receptor de célula T aß puede ser aislado o purificado de células T aß humanas clasificadas con la ayuda de un clasificador celular por citometria de flujo.

En términos generales, el segundo paso incluye poner en contacto el complejo TCR-anti-aß TCR con un compuesto candidato. Un compuesto candidato puede incluir, pero no se limita a: ácidos nucleicos, péptidos, proteínas, (que incluyen anticuerpos como se describe en la presente) , azúcares, polisacáridos, glicoproteínas, lípidos y pequeñas moléculas orgánicas. Un "compuesto candidato" es un compuesto que puede ser ensayado en un ensayo de tamizaje. En una forma de realización, un compuesto candidato puede incluir anticuerpos o fragmentos de anticuerpos del mismo. Si el compuesto candidato se une a un receptor de células T aß específicamente, en comparación a la ausencia del compuesto candidato o una proteína o anticuerpo control negativo (por ejemplo, albúmina sérica bovina, o anticuerpos anti-BSA) , ese compuesto candidato puede decirse que es un "compuesto líder" que puede ser validado usando ensayos con capacidad de demostrar la desactivación del receptor de células T aß, que incluye la reducción o cesación de la producción de citoquinas del compuesto identificado, o puede usarse como potencial o real terapéutico o agente activo que posee actividad de desactivación de células T ß adecuada para el tratamiento de una enfermedad o condición autoinmune, inflamatoria, o rechazo de tejido, tal como diabetes mellitus tipo I y enfermedades neurodegenerativas autoinmunes o inflamatorias, por ejemplo, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, o esclerosis lateral amiotrófica . El término "moléculas orgánicas pequeñas" típicamente se refiere a moléculas de un tamaño comparable a aquellas moléculas orgánicas generalmente usadas en los fármacos. Las moléculas orgánicas pequeñas generalmente excluyen macromoléculas biológicas (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, etc.). las moléculas orgánicas pequeñas preferidas varían en un rango hasta aproximadamente 5.000 Da, más preferentemente hasta 2.000 Da, y aún más preferentemente hasta aproximadamente 1.000 Da.

Convencionalmente, se generan nuevas entidades químicas con propiedades útiles por identificación de un compuesto candidato que tiene algo de propiedad o actividad deseable, creando variantes del compuesto candidato y evaluando la propiedad y actividad de aquellos compuestos variantes. Sin embargo, la actual tendencia es acortar la escala de tiempo para todos los aspectos del descubrimiento de los fármacos. Debido a la capacidad de ensayar grandes números rápida y eficazmente, los métodos de tamizaje de alto rendimiento (HTS) reemplazan a los métodos de identificación de compuesto líder .

En algunas formas de realización, los métodos de tamizaje de alto rendimiento involucran proveer una biblioteca que contiene un gran número de compuestos potenciales terapéuticos (compuestos candidatos). Dichas "bibliotecas químicas combinatorias" son luego tamizadas en uno o más ensayos, como se describe en la presente para identificar aquellos miembros de la biblioteca (particularmente especies químicas o subclases) que presentan una actividad característica deseada.

Una biblioteca química combinatoria, o biblioteca de química, es una colección de diversos compuestos químicos generados por síntesis química o síntesis biológica por combinación de un gran número de "bloques de construcción" químicos tales como reactivos. Por ejemplo, una biblioteca química combinatoria lineal tal como una biblioteca de polipéptidos (por ejemplo, muteina) se forma por combinación de un conjunto de bloques de construcción química llamados aminoácidos en cada forma posible para una dada longitud de compuesto (es decir, el número de aminoácidos en un polipéptido compuesto) . Millones de compuestos químicos podrían ser sintetizados por medio de mezclado combinatorio de los bloques de construcción química. Por ejemplo, el mezclado sistemático, combinatorio de 100 bloques de construcción química que pueden cambiarse da como resultado la síntesis teórica de 100 millones de compuestos tetraméricos o 10 mil millones de compuestos pentaméricos .

La preparación de bibliotecas químicas combinatorias son bien conocidas por aquellos con experiencia en el arte. Dichas bibliotecas químicas combinatorias incluyen, a título enunciativo no taxativo, bibliotecas de péptidos (véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. No. 5.010.175. La síntesis de péptidos no es de ningún la única estrategia pensada y pretendida para el uso con la presente invención. También pueden usarse otros químicos para generar bibliotecas de diversidad química. Dichos químicos incluyen, a título enunciativo no taxativo: peptoides (Publicación PCT No O 91/19735, 26 Dic. 1991), péptidos codificados (Publicación PCT WO 93/20242, 14 Oct. 1993), biooligómeros al azar (Publicación PCT WO 92/00091, 9 Ene. 1992), benzodiazepinas (Patente de los EE.UU. No. 5.288.514), diversómeros tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos, polipéptidos vinilogos, peptidomiméticos no peptídicos con un esqueleto Beta-D-Glucosa, síntesis análoga de bibliotecas de compuestos pequeños, oligocarbamatos, y/o peptidil fosfonatos. Véase, generalmente, las bibliotecas de ácidos nucleicos (véase, por ejemplo, Strategene, Corp.), bibliotecas de ácidos nucleicos peptidicos (véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. No. 5.539.083) bibliotecas de anticuerpos (véase, por ejemplo, PCT/US96/10287 ) , bibliotecas de hidratos de carbono (véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. No. 5.593.853) y bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas (véase, por ejemplo, benzodiazepinas, isoprenoides en la Patente de los EE.UU. No. 5.569.588, tiazolidinonas y metatiazanonas en la Patente de los EE.UU. No. 5.549.974, pirrolidinas en la Patente de los EE.UU. Nos. 5.525.735 y 5.519.134, compuestos de morfolino en la Patente de los EE.UU. Nos. 5.506.337, benzodiazepinas 5.288.514 y similares).

Los dispositivos para la preparación de bibliotecas combinatorias se encuentran disponibles comercialmente (véase, por ejemplo, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville Ky., Symphony, Rainin, Woburn, Mass., 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif., 9050 Plus, Millipore, Bedford, Mass.) . Se han desarrollado también un número de sistemas robóticos bien reconocido para los químicos en fase de solución. Estos sistemas incluyen, a título enunciativo no taxativo, estaciones de trabajo automatizadas como el aparato de síntesis automatizada desarrollado por Takeda Chemical Industries, LTD. (Osaka, Japón) y muchos sistemas robóticos que utilizan brazos robóticos (Zymate II, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.; Orea, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.) que mimetizan las operaciones de síntesis manuales realizadas por un químico y la plataforma Venture™, un sintetizador de ultra alto rendimiento que puede correr entre 576 y 9.600 reacciones simultáneas desde el inicio hasta el final (véase Advanced ChemTech, Inc. Louisville, KY, EE.UU.). Cualquiera de los dispositivos anteriores son adecuados para usar con la presente invención. La naturaleza e implementación de modificaciones a estos dispositivos (si hay alguno) de forma que pueden operar como se describe en la presente resultará evidente para personas con experiencia en el arte relevante. Adicionalmente, se encuentran comercialmente disponibles numerosas bibliotecas combinatorias (véase, por ejemplo, ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, Mo., ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals , Exton, Pa., Martek Biosciences, Columbra, Md. , etc. ) .

En algunas formas de realización, el tercer paso del método del ensayo incluye determinar la capacidad de dicho compuesto candidato para modular la unión del anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo a dicho TCR o fragmento del mismo y en donde la modulación de la unión de dicho anticuerpo anti- ß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo a dicho TCR o fragmento del mismo y la falla para activar una célula T en reposo indica que dicho compuesto candidato es un compuesto terapéutico. La determinación de si el compuesto candidato puede modular la unión del anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo al TCR o fragmento del mismo puede liograrse por muchas maneras. La modulación de la unión entre el anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo al TCR o fragmento del mismo puede lograrse por un ensayo de unión competitiva. En dicho ensayo, el TCR puede adherirse a un sustrato sólido, por ejemplo, sobre la superficie de una placa de 96 pocilios para ELISA. Pueden agregarse cantidades variadas del anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo al pocilio en una muestra control. En una muestra de ensayo, se colocan condiciones equivalentes a la reacción de control excepto que se agregan cantidades variables de un compuesto candidato en forma contemporánea con o posteriormente al agregado del anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo. Los pocilios de ensayo y control se lavan luego para eliminar el anticuerpo anti- ß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo no unido. Luego la cantidad de anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo unido puede medirse y compararse con la correspondiente muestra control. Si el compuesto candidato inhibe competitivamente la unión del anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo al TCR, el compuesto candidato es luego ensayado adicionalmente para determinar si el compuesto candidato puede activar una célula T aß en reposo en presencia de un anticuerpo anti-CD3. Eso puede ser hecho poniendo en contacto una o más células T aß TCR+; con anticuerpo anti-CD3 operable para unirse a CD3 en una o más células T ß TCR+, o un superantigeno; y agregar un compuesto candidato que module la unión de un anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo a un aß TCR o fragmento del mismo; y comparar la extensión o tasa de activación de la célula T ß TCR+ que se produce en presencia o ausencia del compuesto candidato ensayado. El compuesto candidato es un compuesto terapéutico si el compuesto candidato no aumenta la extensión o tasa de activación de las células T aß TCR+ en presencia del anticuerpo anti-CD3 en comparación a la extensión o tasa de activación de T aß TCR+ que se produce en ausencia del compuesto candidato.

EJEMPLOS Los siguientes Ejemplos se presentan para proveer ciertas formas de realización indicativas de la presente invención y no se dan con la intención de limitar el alcance de la misma.

Ejemplo 1. Tratamiento y evaluación de seres humanos tratados con TOLIOI o TOLIOI quimérico TOLIOI es producido por el hibridoma MCB TOLIOI y es un anticuerpo IgM monoclonal murino (específicamente, IgM ) que se une al ß de TCR humano.

Formulación indicativa de anticuerpos TOLIOI y TOLIOI quimérico El TOLIOI y el TOLIOI quimérico se pueden hacer como un producto liofilizado que se formula para su reconstitución en agua estéril para inyección (SWFI por las iniciales en inglés de Sterile Water For Injection) seguido de dilución en solución salina antes de la administración IV. El producto en ampolletas se puede reconstituir en 3 ml de SWFI para proveer una formulación final de L-arginina 50-150 mM (por ejemplo, 50 mM; 75 mM; 100 mM; 125 mM; 150 mM) , citrato 1-10 mM (por ejemplo, 1,0 mM; 2,0 mM; 3,0 mM; 4,0 mM; 5,0 mM; 6,0 mM; 7,0mM; 8,0 mM; 9,0 mM; 10 mM) , 2-8% manitol (peso en volumen) (por ejemplo, 2%; 3%; 4%; 5%; 6%; 7%; o 8%), Tween 80 al 0,005-0,05%, pH 7,0 (por ejemplo, 0,005%; 0,01%; 0,02%; 0, 03%; o 0, 05%) .

Preparación de TOLIOI y TOLIOI quimérico El TOLIOI y el TOLIOI quimérico se pueden reconstituir y diluir para la administración intravenosa (IV) . Las ampolletas de TOL101/ TOLIOI quimérico (por ejemplo, con 14 mg de liofilizado anticuerpo) se pueden sellar al vacio. El TOL101 y el TOL101 quimérico se pueden reconstituir de acuerdo con los siguientes pasos: 1. Calcular el número de ampolletas que son necesarias (por ejemplo, 1 ampolleta para una dosis de 0,28mg, l,4mg, 7mg o 14mg, 2 ampolletas para una dosis de 28mg, etc . ) ; 2. Dejar que cada ampolleta alcance la temperatura ambiente antes de la reconstitución; 3. Retirar asépticamente las tapas, exponiendo los tapones de caucho; 4. Limpiar los tapones con germicida o alcohol usando hisopos; 5. Insertar una aguja hipodérmica en la ampolleta para aliviar la presión interna de la ampolleta; 6. Reconstituir asépticamente cada ampolleta con 3 mi de S FI usando una segunda aguja, luego retirar ambas aguj as; 7. Hacer rodar suavemente la ampolleta entre las manos con un ángulo de 45 grados durante 60 segundos. Asegurarse de que la parte superior de la ampolleta no esté en contacto con el material. Preferiblemente, no sacudir ni invertir la ampolleta durante la reconstitución. Evitar la formación de espuma con el material. 8. Dejar la ampolleta en reposo durante 3 minutos hasta que se eliminan todas las burbujas; y 9. Hacer rodar suavemente la ampolleta entre las manos una segunda vez durante 60 segundos, o hasta que los contenidos sean homogéneos.

La solución reconstituida se debería inspeccionar para verificar la presencia de materia particulada. Si la materia particulada no desaparece por completo, la ampolleta se debería apartar y no se la debería utilizar. El TOL101 o el TOL101 quimérico reconstituido se puede diluir hasta 50 mi por ampolleta con solución salina normal (NS por las iniciales en inglés de Normal Saline) (véase la tabla 7, a continuación) en una bolsa para infusión IV (bolsa de poli (cloruro de vinilo) , PVC) . Si una ampolleta se va a utilizar parcialmente (es decir, 0,28 mg, 1,4 mg, o 7 mg) , la ampolleta completa se debería reconstituir con 3 mi de SWFI como se describió anteriormente y se debería transferir el volumen apropiado (es decir, 0,06 mi (60 µ?) , 0,3 mi, o 1,5 mi respectivamente) del TOL101/ TOL101 quimérico reconstituido a la bolsa para infusión IV. La bolsa para infusión IV se debe invertir suavemente para mezclar la solución antes de la infusión usando una bomba de infusión calibrada .

Velocidad de infusión indicativa La dosis particular de TOLlOl o TOLlOl quimérico se puede administrar por infusión intravenosa lenta a una velocidad constante de 0,004 mg/min para las dosis de 0,28 mg, 0,02 mg/min para las dosis de 1,4 mg, 0,lmg/min para las dosis de 7 y 14 mg y, 0,2mg/min para las dosis de 28 mg y 0,3 mg/min para las dosis de 42 mg o mayores (véase la tabla 7, a continuación) . Por lo tanto, en este Ejemplo, no se administrará TOLlOl o TOLlOl quimérico durante menos de 70 minutos con ninguna dosis. Si se prueba cualquier dosis intermedia, se puede utilizar la más lenta de las velocidades (por ejemplo, si se utilizó una velocidad de 0,2 mg/min para las dosis de 28 mg y se utilizó una velocidad de 0 , 3mg/min para una dosis de 42 mg y se va a probar una dosis intermedia, entonces se puede administrar una dosis de 35 mg con una velocidad de 0,2 mg/min). Preferentemente, TOLlOl o TOLlOl quimérico se administran en una vena de alto flujo. La linea IV se debe enjuagar lentamente con aproximadamente 25 mi de NS al final de la infusión.

Tabla 7. Velocidad y Duración Total de la Infusión de TOLlOl y TOLlOl quimérico para cada nivel de dosis Ejemplo 2. Tratamiento de pacientes de trasplante humanos Este Ejemplo describe el tratamiento de pacientes humanos de trasplante de riñon con anticuerpo TOL101 monoclonal y las pruebas de dichos pacientes para las cuentas de CD3 para diversos puntos de tiempo. La merma y/o modulación de las células T (según se determinó por el biomarcador de CD3) es importante en las etapas iniciales de trasplantes de órganos porque previene el rechazo agudo. Adicionalmente, también permite la aplicación con retraso de agentes inmunosupresores de mantenimiento, que se sabe que son tóxicos para los órganos trasplantados, especialmente en el caso de los trasplantes de riñon. En base a la experiencia de los doctores, se ha determinado que 50 (CD3+ cuentas/mm3) representa un umbral superior por debajo del que es necesario reducir las células T para proveer el mejor resultado a largo plazo. En este Ejemplo, los pacientes de trasplante de riñon se infundieron durante el transcurso de al menos 6 días de manera acorde con el calendario de la tabla 8, que se da a continuación. Se probaron tres cohortes diferentes con dos pacientes en cada cohorte. Las dosificaciones que se probaron fueron 0,28 mg, 1,4 mg, 7,0 mg de anticuerpo TOL101. Las dosis se suministraron en forma intravenosa durante el transcurso de 70 minutos. A cada paciente se le dio una dosis cada dia durante un total de 5 días, donde la primera dosis se suministró en el momento de la cirugía de trasplante. La primera dosis se suministró en el quirófano, comenzando luego de que anestesiar el sujeto y antes de quitar el dispositivo de cierre (reperfusión del aloinjerto) .

Se administró difenhidramina (50mg IV) antes de las dos primeras dosis de TOLIOI y se administraron esteroides por vía intravenosa antes de las tres primeras dosis de TOLIOI. Las dosis subsiguientes de TOLIOI se infundieron luego de la administración oral de esteroides. También se administró tacrólimo comenzando dentro de los primeros 6 días posteriores al trasplante y durante toda la duración del estudio. Se administró tacrólimo en dosis diseñadas para alcanzar y mantener un rango terapéutico de 8-15 ng/ml durante el primer mes posterior al trasplante y para mantener un rango terapéutico de 6-12 ng/ml de allí en adelante. Se administró micofenolato de mofetilo el dia del trasplante, o el dia siguiente, y durante toda la duración del estudio con una dosis máxima de 1000 mg BID.

Tabla 8. Cuentas de CD3 en pacientes de trasplante de riñon tratados con TOLIOI Los resultados del estudio mostraron que la administración de TOL101 reduce cuentas de células T CD3+ en pacientes de trasplante de riñon de manera dependiente de la dosis .

Ejemplo 3. TOL101 inhibe selectivamente las células Para determinar si el anticuerpo anti-aß TCR TOL101 suprime in vitro la proliferación de las células T, se llevó a cabo un experimento para determinar los efectos sobre la proliferación del TOLIOI mediante una reacción de MRL de una vía. Se aislaron PBMCs de las capas leucocitarias de tres donantes saludables. Las capas leucocitarias se separaron en capas sobre un gradiente de Ficol para enriquecerlas en linfocitos. Luego se irradiaron las células estimulantes con 3000 rads . Se cultivaron en conjunto células estimulantes y respondedoras durante 6 días en una proporción de 2:1 ((4 x 105) células estimulantes a 2 x 105 células respondedoras) . Las combinaciones para las células fueron las siguientes: una unidad de sangre del sujeto No. 1 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 2, una unidad de sangre del sujeto No. 1 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 3, una unidad de sangre del sujeto No. 2 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 1, una unidad de sangre del sujeto No. 2+ una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 3, una unidad de sangre del sujeto No. 3 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 1, una unidad de sangre del sujeto No. 3 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 2. Se agregó TOLIOI en el momento del cultivo en una concentración de 9 pg/ml. Se agregó timidina tritiada H3 5 dias en el cultivo y las placas se cosecharon y se contaron el dia 6. La Figura 1 muestra los datos representativos de 2 experimentos independientes. *** = p > 0,001. Como se muestra en la Figura 1, TOL101 suprime significativamente la proliferación de las células T, lo que indica directamente la inhibición de la respuesta aloinmune, en comparación con el control.

En otro experimento, se mostró que TOL101 es particularmente eficaz durante las primeras 24 horas de la reacción de MLR in vitro. Se aislaron PBMCs de las capas leucocitarias de tres donantes saludables. Las capas leucocitarias se separaron en capas sobre un gradiente de Ficol para enriquecerlas en linfocitos. Luego se irradiaron las células estimulantes con 3000 rads . Se cultivaron en conjunto células estimulantes y respondedoras durante 6 días en una proporción de 2 : 1 (4 x 105 células estimulantes a 2 x 105 células respondedoras) . Las combinaciones para células fueron las siguientes: una unidad de sangre del sujeto No. 1 + unidad de sangre irradiada del sujeto No. 2, una unidad de sangre del sujeto No. 1 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 3, una unidad de sangre del sujeto No. 2 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 1, una unidad de sangre del sujeto No. 2 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 3, una unidad de sangre del sujeto No. 3 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 1, una unidad de sangre del sujeto No. 3 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 2. Se agregó TOL101 en los puntos de tiempo correspondientes a: 0 horas, 24 horas, 48 horas y 72 horas. Las concentraciones de TOL101 que se agregaron fueron 0,9 µq/ l, 9 pg/ml y 90 µg ml. Se agregó timidina tritiada H3 5 días en el cultivo y las placas se cosecharon y se contaron el día 6. Como se ilustra en la Figura 2, la linea continua representa un control positivo de proliferación de los cultivos con un anticuerpo CD3 (OKT3) agregado en 9 µg/ml·. La linea cortada representa la proliferación desde los cultivos sin agregado de TOL101. ** = p > 0,05. Como se puede ver en la Figura 2, se observó que la supresión de la proliferación fue mayor entre el periodo de tiempo de entre 0 horas y 24 horas .

En otro experimento, se agregó TOL101 a una solución liquida o se puso en placas sobre una superficie para medir el efecto del entrecruzamiento de TOL101 sobre la proliferación de las células T en comparación con un anticuerpo de control de activación anti-CD3 (OKT3) . Se aislaron PBMCs de las capas leucocitarias de tres donantes saludables. Las capas leucocitarias se separaron en capas sobre un gradiente de Ficol para enriquecerlas en linfocitos. Los linfocitos se cultivaron con una densidad de 2 x 105 células/pocilio. Las células se cultivaron ya sea con TOL101 soluble (9,9 ug/ml) o TOL101 unido a las placas (90, 9,9 g/ml) , mientras que se cultivaron otras células con un anticuerpo CD3 (0KT3 9 ug/ml) o P A/ionomicina como controles positivos. Se agregó timidina tritiada H3 5 días en el cultivo y las placas se cosecharon y se contaron el dia 6. Como se muestra en la Figura 3, la linea continua representa la proliferación de fondo. ** = p > 0,05, *** = p > 0,001. Al contrario que anti-CD3, T10B9 y otros anticuerpos anti-TCR (Bro n y col. Clinic Transplantation 10; 607-613

[1996]), el entrecruzamiento de TOLIOI, aún a la mayor concentración de 90 µg/ml, no hace que se vuelva mitogénico (es decir que no hace que se induzca la proliferación de las células T) . Esto es sorprendente y clínicamente relevante porque refleja el potencial de un uso seguro de TOLIOI en sujetos clínicos.

En otro experimento, se determinó la actividad supresora de TOLIOI contra las células T estimuladas con anti-CD3. El (los) mecanismo (s) de reconocimiento del receptor de células T (TCR) son las cadenas y ß, que se unen con el complejo de péptido y MHC. Los mecanismos genético y celular relacionados dan como resultado la creación de millones de cadenas a y ß diferentes, proveyendo una cobertura amplia contra los patógenos. Los componentes no polimórficos de TCR, es decir, CD3, ?, d y e y el dímero TCR con la cadena ?, interactúa con los componentes de reconocimiento de la cadena a y ß. No hay componentes de señalización intracelular conocidos para las cadenas a y ß del TCR. En vez de eso se cree que CD3 contiene la maquinaria de señalización que utiliza el TCR para activar las células T. Por ejemplo, las moléculas de CD3 son componentes integral es del TCR, no son necesarias solo para una expresión apropiada del TCR, sino que también contienen un motivo único, el ITA (motivo de activación de tirosina basado en inmunorreceptores ) en sus componentes intracelulares/citosólicos de dichas moléculas no polimórficas . Dichos ITAMS, contenidos dentro del CD3, son la maquinaria de señalización que utiliza el TCR para activar las células T. El proceso por el cual la activación de la aß de TCR da como resultado la señalización mediada por CD3 es desconocido. Sin embargo, anteriormente se creía que debía ocurrir una señal de aß de TCR a través de CD3. Por lo tanto, el uso de anticuerpo anti-CD3 elude la necesidad de a señal de activación de aß de TCR. En este Ejemplo se aislaron PBMCs de capas leucocitarias de tres donantes saludables. Las capas leucocitarias se separaron en capas sobre un gradiente de Ficol para enriquecerlas en linfocitos. Los linfocitos se cultivaron con una densidad de 2x105 células/pocilio. Las células se cultivaron con TOL101 soluble (9,9 µ9 ??1), o con anti-CD3 (OKT3 9, 0,9; 0,09 µq/ml) o PMA/ionomicina como controles positivos. A las 24 horas, se agregó TOL101 (9 pg/ml) a un conjunto de las células estimuladas con OKT3. Se agregó timidina tritiada H3 5 días en el cultivo y las placas se cosecharon y se contaron el día 6. Como se muestra en la Figura 4, sorprendentemente, el TOL101 no solo no induce la proliferación, sino que también mejora o revierte in vitro la proliferación de las células T inducida por anti-CD3. * = p> 0,01, ** = p > 0,05, *** = p > 0,001.

En otro experimento, se midió la especificidad de la unión de TOL101 en a población de linfocitos mixtos. Se aislaron PB Cs de capas leucocitarias de tres donantes saludables. Las capas leucocitarias se separaron en capas sobre un gradiente de Ficol para enriquecerlas en linfocitos. Las células se bloquearon durante 30 minutos a 4°C con suero AB humano. Luego se tiñeron las células con los siguientes anticuerpos durante 30 minutos a 4°C: TOL101 + Ig anti ratón, CD3, CD4 , CD8, CD2, CD69 y CD44. Las células se lavaron y corrieron en un aparato BD FACS Canto II. Los datos se analizaron usando Flow Jo. Los datos que se muestran en la Figura 5 son representativos de 6 pacientes. Como se muestra en la Figura 5, el perfil de tinción no solo muestra la especificidad de TOL101 por las células T, sino que también ilustra que TOL101 se une a las células T independientemente de su estado de activación (por ejemplo, unión a CD62L con alta y baja expresión, indicativos de células T activadas y sin activación previa, respectivamente) .

En otro experimento, se mostró que TOL101 se une a las células T activadas, como se muestra en la Figura 6. En resumen, se aislaron PB Cs de capas leucocitarias de tres donantes saludables. Las capas leucocitarias se separaron en capas sobre un gradiente de Ficol para enriquecerlas en linfocitos. Luego se irradiaron las células estimulantes con 3000 rads . Las células estimulantes y respondedoras se cultivaron en conjunto durante 6 días en una proporción de 2:1 (4 x 105 células estimulantes a 2 x 105 células respondedoras) . Las combinaciones para las células fueron las siguientes: una unidad de sangre del sujeto No. 1 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 2; una unidad de sangre del sujeto No. 1 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 3; una unidad de sangre del sujeto No. 2 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 1; una unidad de sangre del sujeto No. 2 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 3; una unidad de sangre del sujeto No. 3 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 1; y una unidad de sangre del sujeto No. 3 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 2. Las células se analizaron el día 6 del cultivo. Las células se bloquearon durante 30 minutos a 4°C con suero AB humano, luego se tiñeron con los siguientes anticuerpos durante 30 minutos a 4°C: TOL101 + Ig anti ratón, CD3, CD4, CD8, CD2, CD69 y CD44. Las células se lavaron y corrieron en un aparato BD FACS Canto II. Los datos se analizaron usando Flow Jo. Los resultados del estudio confirman adicionalmente la especificidad de TOL101 por las células T. Sorprendentemente, TOL101 se unió a las células T activadas, a pesar de que cree que el TCR tiene su expresión reducida luego de la activación de la célula T. Por lo tanto, al contrario que otros anticuerpos contra células T, TOL101 tiene la capacidad de unirse a las células T independientemente de estado de activación.

Además de mostrar que TOL101 se une a las células T activadas, se realizaron otros experimentos adicionales para determinar si TOL101 puede unirse a los subconjuntos de memoria especializados de las células T. Se aislaron PBMCs de capas leucocitarias de tres donantes saludables. Las capas leucocitarias se separaron en capas sobre un gradiente de Ficol para enriquecerlas en linfocitos. Las células se bloquearon durante 30 minutos a 4°C con suero AB humano. Luego se tiñeron las células con los siguientes anticuerpos durante 30 minutos a 4°C: TOL101 + IgM anti ratón, CD3, CD4, CD8, CD2, CD62L, CD45RA, CD45RO. Las células se lavaron y corrieron en un aparato BD FACS Canto II. Los datos se analizaron usando Flow Jo y son representativos de 6 pacientes de 2 experimentos independientes . Como se muestra en la Figura 7, el anticuerpo anti-aß TCR TOL101 se une tanto a subconjuntos de memoria de las células T CD4 y CD8.

Para analizar adicionalmente la unión de TOL101 a los subconjuntos de memoria, en otro experimento, se aislaron PBMCs de capas leucocitarias de tres donantes saludables. Las capas leucocitarias se separaron en capas sobre un gradiente de Ficol para enriquecerlas en linfocitos. Luego se irradiaron las células estimulantes con 3000 rads . Las células estimulantes y respondedoras se cultivaron en conjunto durante 6 días en una proporción de 2 : 1 (4 x 105 células estimulantes a 2 x 105 células respondedoras) . Las combinaciones para las células fueron las siguientes: una unidad de sangre del sujeto No. 1 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 2; una unidad de sangre del sujeto No. 1 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 3; una unidad de sangre del sujeto No. 2 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 1; una unidad de sangre del sujeto No. 2 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 3; una unidad de sangre del sujeto No. 3 + una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 1; y una unidad de sangre del sujeto No. 3+ una unidad de sangre irradiada del sujeto No. 2. Las células se analizaron el dia 6 del cultivo. Las células se bloquearon durante 30 minutos a 4°C con suero AB humano. Luego se tiñeron las células con los siguientes anticuerpos durante 30 minutos a 4°C: TOL101 + IgM anti ratón, CD3, CD4, CD8, CD2, CD62L, CD45RA, CD45RO. Las células se lavaron y corrieron en un aparato BD FACS Canto II. Los datos se analizaron usando Flow Jo. Como se muestra en la Figura 8, TOL101 se une a subconjuntos de PBMCs con memoria y células T activadas luego de reacciones de MLR de una vía.

En otro experimento, se midieron las características de unión de TOL101 en células que anteriormente se habían activado usando anticuerpo anti-CD3. Se aislaron PBMCs de capas leucocitarias de tres donantes saludables. Las capas leucocitarias se separaron en capas sobre un gradiente de Ficol para enriquecerlas en linfocitos. Se agregó Anti-CD3 (9 ug/ml) o PMI/ionomicina en el momento de cultivo a las células provenientes de cada donante. Las células se analizaron el día 6 del cultivo. Las células se bloquearon durante 30 minutos a 4°C con suero AB humano y se tiñeron con TOL101. Las células se lavaron y corrieron en un aparato BD FACS Canto II y los datos se analizaron usando Flow Jo. Como se muestra en la Figura 9, TOL101 se unió tanto a células activadas con CD3 y, en mayor grado, células activadas con PMA/ionomicina .

En otro experimento, se probó TOL101 para determinar su efecto sobre la fosforilación de un componente ZAP70 de activación y señalización clave. Se estimuló sangre recién extraída de tres donantes saludables para analizar la fosforilación luego de la activación, de acuerdo con las siguientes condiciones. Sin estimular: 15 min a 37 °C; anti-CD3 ? TOL101: anti- CD3 15 min a 4°C, alG 15 min a 37°C, TOL101 15 min a 4°C, algM 15 min a 37°C; anti-CD3 reticulada: anti-CD3 15 min a 4°C, alG 15 min a 37 °C; anti-CD3: anti-CD3 15 min a 37°C; TOL101 reticulada: TOL101 15 min a 4°C, algM 15 min a 37°C; y TOL101: TOL101 15 min a 37°C. Se agregaron anticuerpos en una concentración de 9 yg/ml. Luego de la estimulación, se fijaron las células, se permeabilizaron y se tiñeron con un cóctel de anticuerpo para células T y anti-pZap70 (BD Phosflow T cell Activation Kit-Human) . Las células se analizaron con un aparato BD FACS Canto II dentro de las 4 horas de la tinción. Los histogramas de la fosforilación de Zap70 y los valores en bruto de intensidad de la fluorescencia se muestran en la Figura 10. La fosforilación de Zap70 disminuye en las células T expuestas a anti-CD3 seguido de TOL101 24 horas más tarde. Los valores en bruto para la fosforilación de ZAP70 también se muestran en la Figura 10. Como se describió anteriormente, la activación de la célula T mediada por TCR es el resultado de señalización posterior mediada por ITAM corriente abajo. ZAP-70, una proteina tirosina quinasa, contiene dominios SRC con homología 2 (SH2) que se unen a los dominios ITAM de CD3. La activación inicial de ZAP70 es seguida de una fosforilación de adaptador de proteínas y enzimas, culminando en última instancia en la activación de factores de transcripción tales como el factor nuclear de células activadas (NFAT) , FOS, JUN y factor nuclear de transcripción kB (NFKB) . Sin deseos de ser limitados por una teoría, la capacidad de TOL101 de reducir fosforilación de ZAP-70 inducida por anti-CD3 sugiere que la unión de TOL101 a su epitope da como resultado específicamente la reducción de la expresión de células T, potencialmente a través de proteína tirosina fosfatasas tales como, por ejemplo, PTPN22, CD45, CD148, SHP-1 y SIT, o a través de una proteína adaptador desconocida que conecta al ß de TCR con las cascadas de señalización celular sin necesidad de CD3. Sin deseos de ser limitados por ninguna teoría en particular, esta proteína puede actuar de manera similar a CD81 y CD19 en señalización de receptores de células B.

En otro experimento, se probó a TOL101 para determinar su efecto sobre la fosforilación de un componente clave de la señalización ERK. Se estimuló sangre recién extraída de donante saludable para analizar la fosforilación luego de la activación en las siguientes condiciones. Sin estimular: 15 min a 37 °C; anti-CD3 ? TOL101: anti- CD3 15 min a 4°C, alG 15 min a 37°C, TOL101 15 min a 4°C, algM 15 min a 37°C; anti-CD3 reticulada: anti-CD3 15 min a 4°C, alG 15 min a 37 °C; anti-CD3: anti-CD3 15 min a 37°C; TOL101 reticulada: TOL101 15 min a 4°C, alg 15 min a 37°C; y TOL101: TOL101 15 min a 37°C. Se agregaron anticuerpos en concentraciones de 9 µg/ml. Luego de la estimulación, se fijaron las células, se permeabilizaron y se tiñeron con un cóctel de anticuerpo para células T y anti-pERK/p38 (BD Phosflow T cell Activation Kit-Human) . Las células se analizaron con un aparato BD FACS Canto II dentro de las 4 horas de la tinción. Se muestra un histograma de fosforilación de pERK/p38 (Figura 11A) y valores medios de intensidad de la fluorescencia (Figura 11B) . Como se puede ver en la Figura 11, la fosforilación de ERK/p38 aumenta en células T tratadas con anti-CD3 que se expusieron a TOL101, 24 horas luego de la estimulación con anti-CD3. Los valores en bruto para la fosforilación de pERK/p38 se muestran en la Figura 11B. Las proteina quinasas activadas con mitógeno, incluyendo ERK, regulan de manera coordinada la proliferación, diferenciación, motilidad y supervivencia celular. La estimulación con TCR sin co-estimulación (en la forma de estimulación con CD28, por ejemplo), usualmente da como resultado una anergia y apoptosis de las células T. Por lo tanto, el descubrimiento de que la señalización inducida por TOL101 dispara una vía de supervivencia es sorprendente. Sin deseos de ser limitados por una teoría, dichos datos presentan un sustento adicional a la existencia de una novedosa vía de señalización inducida por la unión de TOL101 a aß de TCR humano.

En otro experimento, se probó TOL101 para determinar su efecto sobre la fosforilación de un componente clave de la señalización STAT1. Se estimuló sangre recién extraída de un donante saludable para analizar la fosforilación luego de la activación en las siguientes condiciones. Sin estimular: 15 min a 37°C; anti-CD3 ? TOL101: anti- CD3 15 min a 4°C, alG 15 min a 37°C, TOL101 15 min a 4°C, algM 15 min a 37°C; anti-CD3 reticulada: anti-CD3 15 min a 4°C, alG 15 min a 37 °C; anti-CD3: anti-CD3 15 min a 37°C; TOL101 reticulada: TOL101 15 min a 4°C, algM 15 min a 37°C; y TOL101: TOL101 15 min a 37°C. Se agregaron anticuerpos en concentraciones de 9 µg/ml. Luego de la estimulación, se fijaron las células, se permeabilizaron y se tiñeron con un cóctel de anticuerpo para células T y anti-STAT1 (BD Phosflow T cell Activation Kit-Human) . Las células se analizaron con un aparato BD FACS Canto II dentro de las 4 horas de la tinción. Se muestran un histograma de fosforilación de STAT1 (Figura 12A) y los valores medios de intensidad de la fluorescencia (Figura 12B) . Como se puede ver en la Figura 12, la fosforilación de STAT1 aumenta cuando las células T se exponen a TOL101. Como las citoquinas que se unen a STAT1 (tales como el interferón de tipo II) están asociadas con proliferación y activación de las células T, la elevación del STAT1 fosforilado por unión de TOL101 fue inesperada. Sin deseos de ser limitados por una teoría, los datos sugieren un papel de STATl que va más allá del papel de STATl descrito anteriormente en la activación de la célula T. En la Figura 12B se muestran los valores en bruto para la fosforilación de STATl.

En otro experimento, se probó TOLIOI para determinar su efecto sobre la fosforilación de un componente clave de la señalización STAT3. Se estimuló sangre recién extraída de donante saludable para analizar la fosforilación luego de la activación en las siguientes condiciones. Sin estimular: 15 min a 37°C; anti-CD3 ? TOLIOI: anti- CD3 15 min a 4°C, alG 15 min a 37°C, TOLIOI 15 min a 4°C, algM 15 min a 37°C; anti-CD3 reticulada: anti-CD3 15 min a 4°C, alG 15 min a 37 °C; anti-CD3: anti-CD3 15 min a 37°C; TOLIOI reticulada: TOLIOI 15 min a 4°C, algM 15 min a 37°C; y TOLIOI: TOLIOI 15 min a 37°C. Se agregaron anticuerpos en concentraciones de 9 µ?/p??. Luego de la estimulación, se fijaron las células, se permeabilizaron y se tiñeron con cóctel de anticuerpo para células T y anti-STAT3 (BD Phosflow T cell Activation Kit-Human) . Las células se analizaron con un aparato BD FACS Canto II dentro de las 4 horas de la tinción. Se muestran un histograma de la fosforilación de STAT3 (Figura 13A) y los valores de medios de intensidad de la fluorescencia (Figura 13B) . Como se puede ver en la Figura 13, la fosforilación de STAT3 aumentó de manera comparable en las células T tratadas con anti-CD3 y TOLIOI. En la Figura 13B se muestran los valores en bruto para la fosforilación de STAT3.

En otro experimento, se probó TOLIOI para determinar su efecto sobre la fosforilación de un componente clave de la señalización STAT5. Se estimuló sangre recién extraída de donante saludable para analizar la fosforilación luego de la activación en las siguientes condiciones. Sin estimular: 15 min a 37°C; anti-CD3 ? TOLIOI: anti- CD3 15 min a 4°C, alG 15 min a 37°C, TOLIOI 15 min a 4°C, alg 15 min a 37°C; anti-CD3 reticulada: anti-CD3 15 min a 4°C, alG 15 min a 37 °C; anti-CD3: anti-CD3 15 min a 37°C; TOLIOI reticulada: TOLIOI 15 min a 4°C, algM 15 min a 37°C; y TOLIOI: TOLIOI 15 min a 37°C. Se agregaron anticuerpos en concentraciones de 9 µg/ml. Luego de la estimulación, se fijaron las células, se permeabilizaron y se tiñeron con cóctel de anticuerpo para células T y anti-STAT5 (BD Phosflow T cell Activation Kit-Human) . Las células se analizaron con un aparato BD FACS Canto II dentro de las 4 horas de la tinción. Se muestran un histograma de fosforilación de STAT5 (Figura 14A) y valores medios de intensidad de la fluorescencia (Figura 14B) . Como se puede ver en la Figura 14, la fosforilación de STAT5 aumenta cuando las células T se exponen a TOLIOI y/o anti-CD3. En la Figura 14B se muestran valores en bruto para la fosforilación de STAT5.

En otro experimento, se probó TOLIOI para determinar su efecto sobre la fosforilación de un componente clave de la señalización STAT6. Se estimuló sangre recién extraída de un donante saludable para analizar la fosforilación luego de la activación en las siguientes condiciones. Sin estimular: 15 min a 37°C; anti-CD3 ? TOLIOI: anti- CD3 15 min a 4°C, alG 15 min a 37°C, TOLIOI 15 min a 4°C, algM 15 min a 37°C; anti-CD3 reticulada: anti-CD3 15 min a 4°C, alG 15 min a 37 °C; anti-CD3: anti-CD3 15 min a 37°C; TOLIOI reticulada: TOLIOI 15 min a 4°C, algM 15 min a 37°C; y TOLIOI: TOLIOI 15 min a 37°C. Se agregaron anticuerpos en concentraciones de 9 µg/ml. Luego de la estimulación, se fijaron las células, se permeabilizaron y se tiñeron con cóctel de anticuerpo para células T y anti-STAT6 (BD Phosflow T cell Activation Kit-Human) . Las células se analizaron con un aparato BD FACS Canto II dentro de las 4 horas de la tinción. Se muestran un histograma de fosforilación de STAT6 (Figura 15A) y valores medios de intensidad de la fluorescencia (Figura 15B) . Como se puede ver en la Figura 15, la fosforilación de STAT6 se reduce en las células T tratadas con anti-CD3, cuando las mismas se exponen subsiguientemente a TOLIOI. En la Figura 15B se muestran valores en bruto para la fosforilación de STAT6.

Ejemplo 4. Prueba de escalado de dosis de TOLIOI en pacientes de trasplante renal En un segundo estudio de TOLIOI administrado una primera vez a receptores de trasplante de riñon, se realizaron mediciones estándar de seguridad y dosificación. El segundo estudio tiene un diseño adaptativo modificado que incluye un componente inicial de escalado de la dosis seguido de un componente de control activo aleatorizado . La primera parte del estudio (Parte A) se planificó para enrolar entre 4-14 cohortes (2-6 sujetos por cohorte) en niveles de dosis sucesivamente mayores con el objetivo de identificar dos niveles de dosis con potencial terapéutico (PTD-A y PTD-B) . de ser necesario, la parte B, se diseña para evaluar TOLIOI en un mayor número de sujetos de trasplante renal, usando un diseño aleatorizado, de brazos paralelos con timoglobulina como el comparador estándar de asistencia sanitaria y seguridad acumulativa y algunos datos de eficacia en la población objetivo de pacientes de trasplante renal. La timoglobulina se seleccionó como el comparador activo porque es el agente de inducción que se utiliza más comúnmente para la prevención del rechazo agudo de aloinjerto renal en los EE.UU. y es el estándar de la asistencia sanitaria en muchos centros que participaron en este estudio. La dosificación de TOLIOI se fijó para reducir a un mínimo los niveles de tacrólimo. El resumen de la prueba se provee en la Figura 16.

Tabla 9. Seguridad y efectos secundarios luego de la dosificación con TOL101 Se evaluaron las pruebas de TOLIOI para 0,28, 1,4, 7, 14, 28, 32 y 42mg por día durante 5-8 días asi como un estrategia de escalada comenzando ya sea a 14 o 21mg hasta 28 y 42mg por día. Las primeras cohortes se resumen en la Figura 17. Desde una perspectiva de la seguridad, TOLIOI se toleraron bien. Las reacciones de infusión informadas hasta la fecha han sido leves y se gestionaron fácilmente (Tabla 9) . Es importante que, no se informaron rechazos agudos para los niveles de dosis con los que la modulación de las células T pareció encontrarse en los niveles terapéuticos o cerca. Los parámetros hematologicos también dan sustento a un fuerte perfil de seguridad para TOLIOI (Tabla 9) . El examen del efecto farmacodinámico de TOLIOI en dichos pacientes muestran una fuerte modulación de CD3 que se incrementa con la dosis de TOLIOI (Figura 18). El objetivo farmacodinámico de <50 células T/mm3 se consiguió en la cohorte de 28mg. Al contrario que para el alemtuzumab y la timoglobulina, los pacientes tratados con TOL101 muestran modulación de las células T con memoria y células T sin activación previa, que puede incrementar la eficacia de TOL101 con relación a los agentes que se utilizan actualmente. Además, al contrario que otras drogas que se dirigen hacia TCR, TOL101 no reduce las cuentas totales de glóbulos blancos (lo que indica que TOL101 funciona a través de un mecanismo sin reducción) , ni tampoco influye sobre los niveles de trombocitos, un efecto secundario común de la timoglobulina. Además de una amplia desactivación de las células T, los datos de la cohorte de 28mg mostraron que TOL101 redujo la expresión de CD3 sin agotar las células T, según se determinó por la presencia de células T CD3-CD2+. (Figura 19) . Aunque TOL101 puede funcionar sin agotamiento, es muy capaz de inhibir la respuesta alorreactiva en reacciones de linfocitos mixtos. Este mecanismo de acción da como resultado una fuerte prevención de la respuesta anti-aloantigeno in-vitro (Véase la Figura 20) . La infusión de TOL101 no disparó ningún síntoma significativo de síndrome de liberación de citoquinas, ni producción fuerte de TNF- o IL-ß, presentan un sustento adicional al perfil de seguridad clínica que se resumió antes en la tabla 9. Los niveles de TNF-a e IL-6 (que se muestran en la Figura 21), así como de IL-?ß, IFNy e IL-2 (no se muestran) están siendo determinados en múltiples puntos de tiempo luego de la infusión. En los sujetos tratados con TOL101 se detectaron mínimas cantidades de dichas citoquinas. TNF-OÍ e IL-6 se detectaron en muy bajos niveles, especialmente en comparación con los datos históricos de rATG. No se informaron síndromes de liberación de citoquinas. Adicionalmente, la citoquina antiinflamatoria IL-10 se incrementa por infusión con TOL101.

Los datos que se presentan en la presente apoyan la seguridad y la eficacia de TOL101. Tomados en conjunto con los datos in vítro que se presentaron antes, los resultados del estudio muestran que TOL101 inhibe la activación de las células T, incluyendo la proliferación y producción de citoquinas inflamatorias, sin inducir la merma de células T. Además, es probable que algunos elementos importantes, como por ejemplo la capacidad de TOL101 de modular todos los subconjuntos de células T aß de TCR+ incluyendo a aquellas con un fenotipo de memoria y su mecanismo sin reducción de acción, se combinen para proveer una mejor terapia antirechazo así como para reducir el riesgo de trastornos linfoproliferativos posteriores al trasplante (PTLD, una forma de malignidad) . Finalmente, el tratamiento de los sujetos con TOL101 da como resultado una eficacia terapéutica según se determinó por cuentas de células CD3+ se redujo a un valor menor de 25 mm3, donde las células T CD2+ surgen sin aß de TCR/CD3, para dar como resultado la desactivación de células T ß -TCR+ sin agotar dichas células. La falta de TCR equivale a una célula T no funcional.

Como se muestra en las Figuras 22-24, el escalado de las dosis de TOLIOI muestra un aumento de la biodisponibilidad (con un incremento concomitante de AUC) , aumentó la vida media del suero y no hubo reacciones apreciables de anticuerpo anti-ratón en el sujeto tratado. El escalado de las dosis de TOLIOI ocurrió con un perfil de seguridad prometedor. La modulación de las células T produjo una inducción de TOLIOI dependiente de la dosis sin inducir una significativa liberación de citoquina ni otros eventos adversos graves (SAEs). El monitoreo inmune muestra que el direccionamiento y el mecanismo de acción especifico se desactivan funcionalmente sin agotamiento. Los datos apoyan el potencial de TOLIOI para proveer una mayor especificidad y un índice de seguridad a largo plazo mayores que los de los agentes de inducción que se utilizan actualmente.

Luego de la administración de TOLIOI usando el calendario de dosificación que se muestra en la Figura 17, se utilizó una citometría de flujo para determinar las cuentas de células T en sangre entera usando el procedimiento Beckman Coulter Flow-Count Flourospheres . El análisis del fenotipo de las células T se realiza en muestras separadas con Ficol. En este estudio, los perfiles de expresión de CD3, CD4, CD8, CD45RA y CD45RO se proveen en el presente ejemplo como se muestra en las Figuras 25-27. Todos los procedimientos se llevan a cabo en un laboratorio central. Además de dichas proteínas, también se midieron los siguientes parámetros: cuentas de CD3 y establecimiento de fenotipos por medios inmunológicos, análisis de la producción de citoquinas (IL-2, IL-10,IL-1 , IL-6, TNF-OÍ e IFN-?) , análisis de HAMA y análisis hematológico estándar.

Como se muestra en la Figura 25, se llevó a cabo un análisis por citometría de flujo luego de la terapia con TOL101 y se muestra en las Figuras 25A-25C. Se seleccionaron estrategias de portales [gating] para las cuentas de CD3, que muestran estándares de microesferas (25A) , gating de linfocitos (25B) y CD2 contra gating de CD3 (25C) . Nótese que las cuentas de CD3 se dan en la caja llena. Se mostró que TOL101 reduce las cuentas de CD3 de una manera dependiente de la dosis. Los datos que se presentan en la presente dan sustento a la eliminación del complejo TCR de la superficie de la célula sin agotar las células, como se muestra en la Figura 26. De manera similar a los datos para CD2+ que se muestran en la Figura 19, mientras que el porcentaje de células que expresan CD3 se redujo dramáticamente luego del tratamiento con TOL101, los números de células CD4+ y CD8+ se mantuvieron en niveles normales, como se muestra en la Figura 26. En la Figura 27 se representa esquemáticamente un mecanismo propuesto para la merma de CD3 posterior a la administración de TOL101.

Ejemplo 5. Estudio de escalado de la dosis de TOL101 Se diseñó un experimento clínico para probar la eficacia de un protocolo de escalado de la dosificación. El escalado de la dosificación se puede utilizar para prevenir o mejorar efectos secundarios potenciales, como por ejemplo sarpullidos en pacientes dosificados con un agente de modulación a niveles inferiores de TCR tales como el anticuerpo TOL101. Por ejemplo, un sarpullido puede ser un resultado de la estimulación con TCR ß y la subsiguiente liberación de almacenamientos preformados, como por ejemplo granzima o perforina, entre muchas otras. Se cree que el razonamiento, aunque no es necesario para comprender la presente invención, incluye el uso de dosis bajas de anticuerpo TOL101 para disparar la liberación de células T de almacenamientos preformados hasta un nivel inferior al umbral que podría disparar cualquiera de los síntomas clínicos obvios, seguido de mayores dosis de anticuerpo TOL101 para completar la modulación de TCR hasta niveles inferiores luego de agotar los almacenamientos formados anteriormente, previniendo de esa manera la aparición de síntomas clínic tales como el sarpullido. Para probar esta hipótesis, se administró anticuerpo TOL101 usando la siguiente estrategia de dosificación: Tabla 10. Estrategia de dosificación En esta estrategia de dosificación inicialmente se enrolaron dos pacientes. Ambos pacientes mostraron una excelente modulación de las células T, sin embargo, ninguno de los pacientes dosificados desarrolló ninguna forma de sarpullido ni otro evento adverso potencialmente grave. EN conjunto, dichos datos muestran una forma novedosa de dosificar un compuesto biológico en un intento de reducir el desarrollo de sarpullido y otros eventos adversos graves. Adicionalmente, la estrategia de dosificación que se muestran en la tabla 10 puede ser útil para administrar una sustancia biológica o anticuerpo (incluyendo a los anticuerpos anti-aß TCR como TOLlOl) en pacientes que padecen un amplio rango de enfermedades que incluyen, a titulo enunciativo no taxativo, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, o un rechazo de tejido injertado (por ejemplo, reacciones de rechazo a trasplantes renales) .

Ejemplo 6. Inducción y/o Incremento de la expresión de células Treg con el escalado de la dosificación de TOLlOl En un experimento para determinar resultados clínicos hematológicos luego del trasplante de tejido y la administración de TOLlOl, los pacientes se dosificaron con TOLlOl ya sea en un régimen de dosificación constante (es decir, pacientes a quienes se les administró la misma dosificación de TOLlOl mAb, por ejemplo, 0,28 mg/día, 1,4 mg/día, 7 mg/día, 14 mg/día, 28 mg/día, o 32 mg/día en cada día del régimen de dosificación) o un régimen de escalado de la dosificación que comprende: 14 mg en el día 1, 21 mg en el día 2, 28 mg en el día 3, 42 mg en el día 4, 42 mg en el día 5 y 42 mg en el día 6. Se analizaron las células T, los signos vitales y otros parámetros bioquímicos. Además del anticuerpo TOLlOl, las terapias antecedentes que también se administraron incluyeron: 1. Metilprednisolona intravenosa, 500mg antes de la dosis de TOLIOI 1 y 125-250mg antes de las dosis 2 y 3. 2. Prednisona oral, lOOmg antes de la dosis 4, luego de lo cual se redujeron los esteroides a 20-30mg el día 14 3. Benadryl intravenoso antes de las 2 primeras dosis (50mg) 4. La dosis diaria de tacrólimo no comenzó antes de las 6 horas luego del trasplante y no después de los 6 días luego del trasplante 5. La dosis diaria de micofenolato de mofetilo comenzó antes de transcurrido el dia del trasplante o el dia siguiente La primera dosis de TOLIOI se suministró en el quirófano comenzando luego de haber anestesiado al sujeto y antes de quitar el dispositivo de cierre (reperfusión del aloinjerto).

En este estudio, el objetivo farmacodinámico fue reducir las cuentas de células T a un valor menor de 25 células/mm3. Este objetivo farmacodinámico se considera suficiente para proveer la modulación necesaria de las células T para prevenir el rechazo de los trasplantes. El régimen de escalado de la dosificación redujo significativamente las cuentas de CD3 desde el nivel basal (Tabla 11) .

Tabla 11. Ejemplo de cuentas de células T en el paciente 7-006 & 07-007) Las mediciones de células T Treg (CD2+ CD4+ CD25+ FOXP3+ CD1271o) de cada paciente se llevaron a cabo cada dia hasta el dia 14 después del trasplante. Los resultados se muestran en la Figura 28. Sorprendentemente, los Tregs se indujeron en los pacientes que recibieron el régimen de escalado de la dosificación, pero no se indujeron en los pacientes que recibieron la misma dosis cada dia de tratamiento, aún en aquellas pacientes que recibieron a dosis tan alta como de 32 mg/dia . Durante la respuesta inmunitaria adaptativa, en general, la interacción y comunicación entre el complejo MHC/péptido sobre las células presentadoras de antigeno (APC, por las iniciales en inglés de Antigen Presenting Cells) y el receptor de células T (TCR, por las iniciales en inglés de T cell receptor) de las células efectoras T lleva a la activación y la secreción de citoquinas proinflamatorias tales como IL-4 e IFN-?. Por otro lado la activación de células T regulatorias naturales (Células T Treg) lleva a la expresión de las citoquinas supresoras de la inmunidad IL-10 y TGF-ß, entre otras. Dichas citoquinas actúan directamente sobre las células T efectoras cercanas llevando en algunos casos a la anergia o apoptosis. En otros casos las citoquinas regulatorias y las quimioquinas convierten a las células T efectoras en Fenotipos T regulatorios, este proceso se denomina aqui una tolerancia "inducida" o "adaptativa" . Los epitopes de células T que son capaces de unirse a moléculas de MHC y se unen y activan a las células T Treg en circulación se denominan epitopes Treg. Como se los usa en la presente, los diversos métodos para el tratamiento y para el aumento de la expresión celular de los números de células T Treg se refiere generalmente a las células T Treg funcionales, por ejemplo, aquellas células T Treg que expresan marcadores superficiales CD2+ CD4+ CD25+ F0XP3+ y CD1271o.

La discriminación inicial entre propio y extraño ocurre en el timo durante el desarrollo neonatal donde las células del epitelio medular expresan epitopes propios de las proteínas específicos de las células T inmaduras. Las células T que reconocen autoantígenos con alta afinidad se suprimen, pero las células T autorreactivas con afinidad moderada a veces evitan la supresión y se pueden convertir en las denominadas células T naturales Treg. Dichas células T naturales Treg se exportan a la periferia y proveen una constante supresión de la autoinmunidad. Las células T naturales Treg con un componente critico de la regulación inmune y la autotolerancia .

La autotolerancia es regulada por una interacción compleja entre células T, células B, citoquinas y receptores superficiales. Las respuestas inmunes T regulatorias contrarrestan la respuesta inmunitaria de los efectores T a los antigenos de la proteina (ya sea propia o extraña) . Un desplazamiento del equilibrio hacia el lado autorreactivo, ya sea por incremento del número o la función de células efectoras T autorreactivas o por disminución del número o la función de las células T Treg, se manifiesta como autoinmunidad.

Una segunda forma de tolerancia ocurre en la periferia donde las células T maduras se convierten a un fenotipo "adaptativo" de célula T Treg ante la activación a través de sus receptores de células T en presencia de IL-10 y TGF-ß, usualmente provistas por células T Treg vecinas. Los posibles papeles para dichas células T Treg "adaptativas" incluyen la amortiguación de la respuesta inmunitaria luego de la eliminación exitosa de un patógeno invasor como un medio de control de una inflamación excesiva, como la que podría ser causada por una reacción alérgica o una infección crónica de bajo nivel, o posiblemente para facilitar la coexistencia con las bacterias simbióticas y virus beneficiosos. Las células T Treg "adaptativas" también pueden desempeñar un papel en la gestión del ciclo de vida de los anticuerpos humanos que han sufrido hipermutación somática.

Las células T Treg también son instrumentales en la tolerancia a células B. Las células B expresan un único receptor de Fe de baja afinidad, FcyRIIB sobre la superficie de la célula. Este receptor contiene la secuencia del motivo de inhibición del inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM, por las iniciales en inglés de Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibltion Motif) en su dominio citoplasmático . La co-ligación de FCyRIIB y BCR por complejos inmunes actúa disparando la fosforilación de la tirosina del ITIM llevando al reclutamiento de la inositol fosfatasa, SHIP, que inhibe la proliferación disparada por BCR por interferencia con la activación de MAP quinasas y bloquea la fagocitosis por disociación de la tirosina quinasa de Burton (Btk) de la membrana celular, que inhibe el influjo calcio hacia el interior de la célula. FcyRIIB también puede inducir la apoptosis independiente del ITIM. Ante la homo-agregación de FcRIIB por ICs, se intensifica la asociación de Btk con la membrana celular, disparando una respuesta apoptótica. Se ha demostrado que la expresión de FcyRIIB es altamente variable y dependiente de citoquinas. IL-4 e IL-10, que son expresadas por las células T activadas Th2 y Treg, actúa de manera sinérgica para intensificar la expresión de FcyRIIB contribuyendo asi a la supresión de una respuesta humoral.

La presente invención provee un incremento terapéutico inesperado y sorprendente de la expresión de células T Treg en pacientes a quienes se les administra anticuerpo anti-aß TCR TOL101, usando un régimen especifico de escalado de la dosis en los pacientes. Sin deseos de ser limitados por ninguna teoría en particular, se cree que el uso de bajas dosis de anticuerpos TOL101 en un paciente que está experimentando o experimentará cierta respuesta alo- o auto-reactiva suscitará una cascada de eventos de señalización novedosos (que incluyen reducción de la expresión de ZAP70, modulación de AKT y ERK, así como el potencial flujo de calcio), así como la producción de un bajo nivel de IL2. Esta creencia se sustenta en los estudios en pacientes con vasculitis inducida por el virus de hepatitis C que redujo los niveles de células T Treg (Saadoun, D. y col. N. Engl. J. Med, 365(22) 2067-2077). Como se muestra en Saadoun y col., el bajo nivel de IL2 estimula la inducción de células T Treg. Durante unos pocos días, los genes Treg son funcionales con el fenotipo Treg correcto. Sin deseos de ser limitados por una teoría, se cree que a medida que aumenta la dosis de TOLIOI mAb, según se ejemplifica en la presente invención, no solo existe un incremento localizado de la IL2, sino que se inicia un conjunto de factores de transcripción únicos que sustentan la expansión de las células T Treg in vivo. Es digno de mención el que los niveles de IL2 que se producen en respuesta a la administración de TOLIOI mAb son menores a los que normalmente se consideran necesarios para la activación y proliferación clásica de las células T. Por lo tanto, aunque IL2 está siendo producido y apoya la expansión de las células T Treg, los niveles de IL-2 son menores que aquellos necesarios para inducir el síndrome de liberación de citoquinas. En este punto es posible aprovechar las células Treg específicas para suprimir las respuestas inmunes no deseadas y para inducir a las células T Treg adaptativas a suprimir las respuestas alorreactivas y autoinmunes al ser expuestas a un autoantígeno . En las Figuras 29 y 30 se muestra una representación esquemática. Este descubrimiento tiene implicaciones en el diseño de regímenes terapéuticos y terapias específicas para un antígeno para trasplantes, terapéuticas con proteínas, alergia, infección crónica, autoinmunidad y diseño de vacunas. La administración de TOLIOI mAb en el régimen específico de escalado de la dosificación descrito en la presente se puede utilizar para aumentar e incrementar el número de células T Treg, lo que a su vez se puede utilizar para suprimir la respuesta inmunitaria al efector. En algunas formas de realización, se administra TOL101 mAb al paciente antes de surgir los síntomas de enfermedad autoinmune, durante los mismos o después o antes del trasplante de tejido durante el mismo o después. En algunas formas de realización, la administración de TOL101 mAb en un procedimiento de trasplante comienza en el momento del trasplante. Es decir el mismo día, por consiguiente el día 1 del calendario de dosificación es el día del trasplante. En otras formas de realización, se puede administrar TOL101 a un sujeto que anteriormente ha recibido un trasplante de un tejido. En algunas formas de realización el régimen de escalado de la dosificación comprende la administración de TOL101 al sujeto en 14 mg en el día 1, 21 mg en el día 2, 28 mg en el día 3, 42 mg en el día 4 y 42 mg en el día 5. En otras formas de realización, el régimen de escalado de la dosificación comprende la administración de TOL101 al sujeto en 14 mg en el día 1, 21 mg en el día 2, 28 mg en el día 3, 42 mg en el día 4, 42 mg en el día 5 y 42 mg en el día 6. En algunas formas de realización, el escalado de la dosificación de TOL101 que se describe en la presente durante período de 5 ó 6 días se lleva a cabo solo una vez, ya que se cree que una escalada en una vez de la dosificación de TOL101 mAb es un ejemplo de una dosificación de inducción.

La administración de anticuerpo anti- ß TCR TOL101 usando un régimen de escalado de la dosificación descrito en la presente es útil en la unión selectiva y la activación de las células T Treg. En la presente se demuestra que ciertas poblaciones preexistentes de células T Treg pueden interactuar, activar y aplicar a la supresión de respuestas inmunes no deseadas en contextos tanto sistémicos como limitados, específicos de la enfermedad. Las enfermedades específicas que pueden beneficiarse con la dosificación presintomática, dosificación contemporánea o la dosificación post-sintomática usando un régimen de escalado de la dosis descrito en la presente puede incluir, a título enunciativo no taxativo: asma, alergia, inflamación alérgica de las vías aéreas, encefalomielitis alérgica, artritis autoinmune, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reactiva, artritis psoriásica, sacroileitis , uveitis anterior aguda aislada, espondiloartropatía no diferenciada, Diabetes Mellitus tipo 1, Esclerosis Múltiple, Lupus Eritematoso Sistémico, glomerulonefritis, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, Escleroderma, síndrome de desregulación inmune, poliendocrinopatía y enteropatia ligada al cromosoma X (Síndrome IPEX) , enfermedad celíaca, anemia hemolítica Coombs-positiva, trombocitopenia autoinmune, neutropenia autoinmune, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria de los intestinos, colitis ulcerativa, espondilitis anquilosante, síndrome de Sjogren, psoriasis, dermatitis por contacto, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Addison, granulomatosis de Wegener, nefropatía tubular, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante, hepatitis autoinmune, polimialgia reumática, enfermedad de Behcet, síndrome de Guillain-Barré, diferentes vasculitis, uveoretinitis, tiroiditis, miastenia gravis, nefropatías por inmunoglobulinas , miocarditis y esclerosis sistémica progresiva .

En algunas formas de realización, los métodos terapéuticos que se proveen en la presente para el aumento de la expresión de los niveles de células T Treg provee un beneficio terapéutico a un sujeto que lo necesita. En algunas formas de realización, los métodos y/o el incremento de la expresión de células T Treg provee un incremento de la expresión de células T Treg sobre el nivel de referencia del sujeto de dichas células T Treg. Los niveles de referencia se pueden determinar antes de la administración del mAb TOL101 terapéutico. En algunas formas de realización, el incremento de la expresión de células T Treg generalmente se refiere al incremento del número de células Treg en circulación local o sistémica que sean CD2+ CD4+ CD25+ FOXP3+ CD1271o para el sujeto en particular que se encuentren en más del 5% del nivel de referencia, o más del 10%, o más del %, o más del 20%, o más del 25 %, o más del 30%, o más del 50% del nivel basal de la concentración de células T Treg CD2+ CD4+ CD25+ FOXP3+ CDl271o antes del escalado de la dosificación de TOL101. Sin embargo, el incremento de la expresión de células T Treg, es terapéuticamente eficaz para bloquear, prevenir, tratar o suprimir uno o más cualesquiera de los síntomas o condiciones asociados con las células T alorreactivas, o para inhibir la actividad de las células T citotóxicas (CTL) , o para inmunosuprimir una alorrespuesta, o inhibir una respuesta inmunitaria, o inhibir, prevenir o bloquear una alorrespuesta o una respuesta autoinmune antes de un trasplante de tejido, durante el mismo o después, o inhibir, suprimir o bloquear la enfermedad de injerto contra huésped, o prevenir, tratar o suprimir una respuesta autoinmune en una enfermedad inflamatoria, o enfermedad autoinmune. En algunas formas de realización, el sujeto, por ejemplo, un ser humano u otro sujeto mamífero se puede avaluar antes del tratamiento para determinar su condición médica general para establecer cualquier enfermedad autoinmune preexistente o predilección por el autorrechazo o el alorrechazo de tejidos. En esta forma de realización, se extrae sangre del sujeto y se realizan las cuentas de células T y otros glóbulos blancos. Lo mismo también puede incluir la concentración de células T Treg previas al tratamiento y otros marcadores de alorreacción o rechazo de tejidos y enfermedad autoinmune relevante para llevar a cabo el pronóstico o el tratamiento médico. En algunas formas de realización, se determina la concentración de células T Treg por mililitro de sangre entera presente en el sujeto antes de comenzar el calendario de dosificación para obtener un nivel de referencia de células T Treg CD2+ CD4+ CD25+ F0XP3+ CD1271o por mililitro de sangre entera en el sujeto. Durante el escalado de la dosificación de TOL101 mAB y al completarlo, se pueden realizar extracciones de sangre de rutina para determinar los números de células T Treg CD2+ CD4+ CD25+ F0XP3+ CD1271o por mililitro de sangre entera en el sujeto para confirmar el incremento de la expresión de células T Treg usando técnicas inmunológicas estándar, por ejemplo, citometria de flujo usando inmunofluorescencia con tinción de 1, 2 o 3 colores específicos para marcadores de células T Treg de la superficie celular que expresan fenotipicamente marcadores de la superficie celular CD2+ CD4+ CD25+ F0XP3+ CD1271o.

Ejemplo 7. Seguridad y Eficacia de TOL101 El estudio clínico de TOL101 en pacientes de trasplante de riñon se realizó como se describió anteriormente en el Ejemplo 6.

Parámetros de seguridad. Se monitorearon múltiples parámetros de seguridad incluyendo mediciones de seguridad clínica general tales como signos vitales aberrantes, señales físicas y síntomas y química del suero o hematología. Los eventos se clasificaron como eventos adversos (AE por las iniciales en inglés de Adverse Events) o eventos adversos graves (SAE por las iniciales en inglés de Serious Adverse Events) de acuerdo con el sistema de órganos usando normativas de Buena Práctica Clínica. La codificación de los eventos adversos se realizó usando el diccionario Medra. Se registró que los sujetos que padecieron el mismo evento más de una vez padecieron un solo evento. Los sujetos que padecieron más de un evento adverso dentro de una clase del sistema de órganos se contaron solo una vez en dicha clase de sistema de órganos. Se monitorearon los parámetros de seguridad inmune, incluyendo a los síntomas que pueden sugerir un síndrome de liberación de citoquinas. Adicionalmente, se determinaron los niveles en suero de TNF, Interferón-?, Interleuquina 6 (IL6), Interleuquina IB (ILl) e Interleuquina 2 (IL2) a las 0, 2, 8 y 24 horas luego de la primera dosis. Las citoquinas se midieron usando la tecnología Luminex. También se determinaron los niveles de óxido nítrico usando un ensayo calorimétrico a las 0, 2, 8 y 24 horas luego de la primera dosis asi como el dia 4. Se determinó el anticuerpo humano anti-ratón en el nivel basal, el dia 14 y el dia 28, usando un sándwich ELISA. Como anticuerpo primario se utilizó TOL101.

Se recolectó la incidencia de malignidades, incluyendo trastornos linfoproliferativos . Además se llevó a cabo la viremia para CMV (los días 28, 90 y 180), BKV (los días 90 y 180) y EBV (los días 28, 90 y 180) usando detección por PCR. También se recolectó la incidencia de otras infecciones graves u oportunistas.

Parámetros de eficacia. Se determinó la eficacia clínica, por el efecto farmacodinámico de TOL101 sobre las cuentas de linfocitos T CD3+. Se consideró que hubo una exitosa modulación de las células T en los pacientes con números sostenidos de células T CD3+, con cuentas menores de 25 CD3+ por mm3, aunque se cree que es suficiente una reducción de las cuentas de CD3 del 90% desde el nivel basal, para el intervalo de dosificación continua. Adicionalmente, se determinó el punto final triple tradicional incluyendo supervivencia del paciente, supervivencia del injerto y rechazo agudo probado por biopsia (BPAR por las iniciales en inglés de Biopsia-Proven Acute Rejection) a los 6 meses. La función del injerto con retraso se definió como la necesidad de diálisis dentro de la primera semana luego del trasplante.

La función renal se determinó por la velocidad de filtración glomerular (GFR por las iniciales en inglés de Glomerular Filtration Rate) estimada en cada visita del estudio (método MDRD) , midiendo la GFR determinada por eliminación de iotalamato el dia 180. La proporción de proteina en orina a creatinina asi como el anticuerpo especifico contra el donante (DSA por las iniciales en inglés de Donor-Specific Antibody) se midió el dia 90 y el dia 180.

Mantenimiento de la supresión inmunitaria. El mantenimiento de la inmunosupresión consistió en micofenolato de mofetilo oral o IV (MMF; un mínimo 750 mg dos veces al día) se inició el día del trasplante. El tacrólimo se inició entre el Día 1 del estudio y el Día 6 del estudio, dependiendo de la condición del sujeto. La dosis inicial de tacrólimo fue de 0,1-0,2 mg/kg. Las subsiguientes dosis de tacrólimo se individualizaron para mantener los niveles C0 en sangre entera dentro del rango de 8-15 ng/ml durante el primer mes posterior al trasplante. Se realizaron mediciones del mínimo nivel diario de tacrólimo C0 durante la administración del TOL101, semanalmente el mes uno y los días 90 y 180.

La dosis inicial de corticoesteroides fue de 500 mg en los trasplantes, 250 mg el día 2, 125 mg el día 3 y 0,5 mg/kg a partir del día 4, se llevó a 5-10 mg/día el mes 1 y a =5- mg/día el día 45 hasta el mes 6.

Profilaxis antiinfecclosa . El valganciclovir oral (Valcito®) estaba recomendado en receptores de CMV+ o en receptores de riñon de donantes de CMV+. El trimetoprim/sulfametoxazol oral (TMP/SMX; Septra SS®/Bactrim®) fue necesario durante 6 meses para la profilaxis de neumonía por Neumocistis carinii (PCP) .

Administración de TOL101. Se suministró TOL101 liofilizado en ampolletas de 14mg (Tolera Therapeutics, Inc alamazoo, Michigan, EE.UU.). Los sujetos recibieron al menos seis dosis diarias de TOL101, comenzando en el quirófano el día 0, a través de un catéter venoso central. Este estudio se diseñó para probar dosis crecientes de TOL101, usando las cuentas de células T CD3 como marcador primario de eficacia, como se resume en la tabla 12. Debido a la potencial capacidad estimulante de la inmunidad de los anticuerpos dirigidos hacia TCR, la dosis inicial de TOL101 que se utilizó fue de 1/10 del nivel del mínimo efecto biológico adverso (MABEL por las iniciales en inglés de Mínimum Adverse Biological Effect Level) calculado, que fue de 0,28mg. Otras consideraciones adicionales sobre la seguridad incluyeron un intervalo de 24 horas entre pacientes y datos normales del panel de revisión del monitoreo de seguridad de datos del paciente. Las cuentas de CD3 se midieron en unas instalaciones centrales (Neogenomics; Orange County, CA) usando el conjunto de elementos para citometria de flujo Beckman Coulter CD3. Se consideró que una dosis era eficaz si las cuentas de CD3 eran < 25 células T por mm3 a través de todo el periodo de dosificación. La dosificación de TOLIOI se cesó luego de un mínimo de 6 dosis, si los niveles de tacrólimo CO fueron terapéutico (8-15 ng/ml) .

Farmacocinética . Se midieron diariamente las concentraciones en suero de TOLIOI en varios puntos de tiempo luego de la administración de la dosis #1 (Día 0) , la dosis #4, la última dosis y el día 14. Se utilizó un sándwich ELISA para IgM de ratón (ABS Laboratories, Colombia MI). Se desarrolló un modelo farmacocinético de la población para TOLIOI ajusfando un modelo compartimentado con un conjunto de datos combinados que incluye datos de todas las observaciones y dosis de todos los sujetos. El modelado tomará en consideración todos los cambios en la dosis o la velocidad de infusión dentro de una dosis o entre dosis. A los modelos se les asignarán parámetros en términos de los números de eliminación (CL) apropiados y los volúmenes de distribución (V) ; la vida media de eliminación (t½) se estimará a partir de los parámetros ajustados. El modelado de la población se llevará a cabo usando NONMEM Versión 7.0 o una versión posterior. Las covariantes (edad, tamaño del cuerpo, género, raza, etc.) se incorporarán al modelo en base a la mejora de la función objetivo y/o gráficos de la calidad del ajuste. Los gráficos de concentraciones en suero observadas y predichas por el modelo se prepararán usando R Versión 2.10 o posterior .

Estadística . El número de sujetos por cohorte no se basa en consideraciones estadísticas sino que se usa con la intención de proveer datos de seguridad y PD suficientes para escalar al próximo nivel de dosis. Se han presentado tablas de frecuencia para todas las infecciones, AEs, todos los AEs por máxima gravedad, AEs relacionados con la droga, SAEs y AEs que dan como resultado la interrupción del estudio con la droga. Para las pruebas de laboratorio cuantitativas, se presenta un resumen de la estadística en cada punto de tiempo. Las tablas de frecuencia se presentarán resumiendo las cuentas de sujetos que muestran un síndrome de liberación de citoquinas. Tanto los GFR medidos como los estimados se resumirán con una estadística descriptiva. En las tablas de frecuencia se resumirán la función retrasada del injerto y los episodios de BPAR. Para la proporción de proteína en orina a creatinina y las evaluaciones de DSA, se presentarán el resumen de la estadística para los valores que se obtuvieron el día 90 y el día 180/EOS. La supervivencia del paciente y del injerto se analizará usando el procedimiento del límite de producto de Kaplan-Meier y la prueba de log-rango para comparar las curvas de supervivencia.

Resultados Características del Paciente. El enrolamiento de los pacientes comenzó en febrero de 2010 y finalizó en abril de 2012 con un enrolamiento en 6 centros de los EE.UU. Se enroló un total de 28 pacientes en este estudio de Fase 2a, donde los sujetos entraron en cohortes de escalado de dosis de TOL101 como se muestra en la tabla 12. El enrolamiento representó una amplia sección transversal de pacientes (Tabla 13) . La edad media de los donantes era de 40 años de edad; 24 sujetos recibieron ríñones de donantes vivos y 4 sujetos recibieron ríñones de donantes cadavéricos. La edad media de los receptores fue de 44 años, donde el 79% de dichos pacientes eran masculinos. Los sujetos eran receptores de trasplante renal primario con un riesgo de rechazo moderado. Es importante que el perfil de riesgo de los pacientes que se enrolaron aumentó con la dosis. Los pacientes de las primeras 4 cohortes generalmente tenían el menor riesgo inmunológico . La cohorte del escalado final de las dosis incluyó 4 trasplantes de donantes muertos y 3 receptores afroamericanos. Las causas más comunes de enfermedad renal en etapa terminal (ERSD por las iniciales en inglés de End Stage Renal Disease) fueron enfermedad de riñon poliquístico (33%) y glomerulonefritis (33%).

Tabla 12. Cohortes de dosificación de TOLlOl Tabla 13. Demografía de pacientes y características del nivel basal Eventos adversos graves. Se informaron 35 eventos adversos graves (SAEs) en 11 sujetos (Tabla 14). No se observaron muertes. Se consideró que todos los SAE excepto 1 "no estuvieron relacionados" con la droga en estudio. El SAE posiblemente relacionado fue una neumonía hospitalaria. Otros SAEs estuvieron asociados con cirugía y otros problemas no relacionados con TOL101.

Tabla 14. Eventos adversos graves (SAEs) Eventos adversos (AEs) . Se informaron un total de 521 AEs en 28 sujetos, incluyendo 29 AEs en 18 sujetos que se informaron como "posiblemente", "probablemente", o "definitivamente" relacionados con TOL101. En la tabla 15 se muestran los AEs que ocurrieron en =15% de los pacientes. La mayoría de AEs se informaron en las cohortes de dosis de 28, 32 y 42 mg. Tres sujetos interrumpieron la droga debido a un AE (sarpullido de urticaria y prurito) ; cada uno de los cuales se encontraba en el grupo de dosis de 42mg. El AE relacionado que se informó más comúnmente fue un sarpullido, como se muestra en la tabla 15. Los sarpullidos que se observaron se describieron de manera variable como urticaria, enro ecimiento, con elevación, ronchas, y/o bienestar. En ningún caso se determinó que el sarpullido fuese necrótico ni de larga duración y nunca progresó a manifestaciones más graves .

Tabla 15. Eventos adversos que ocurrieron comúnmente En la mayoría de los pacientes que experimentaron un sarpullido pero no en todos, el sarpullido ocurrió luego de la primera dosis de TOL101 (Tabla 16) . En todos los casos, el sarpullido desapareció por sí mismo o luego del tratamiento con difenhidramina, típicamente dentro de unas pocas horas. El sarpullido no se repitió con ningún nivel de dosis excepto en la cohorte de 42mg. Cuando se repitió, típicamente fue menos intenso y no excluyó la continuación de la dosificación de TOL101. Sin deseos de ser limitados por una teoría, se consideró que una causa potencial del sarpullido observado fue la liberación de mediadores solubles preformados de células T no clásicos con potencial vasodilación. Como se consideró que los mismos se habían formado de antemano, se empleó una estrategia de escalado de las dosis con el objetivo de agotar a dichos almacenamientos de células T y reducir la incidencia del sarpullido. Como se muestra en la tabla 16, el uso de un protocolo de escalado de las dosis permitió usar una dosificación de 42mg con menor incidencia de sarpullido. En total, los resultados del estudio indicaron que TOL101 se puede administrar de manera segura. En particular, la estrategia de escalado de la dosificación estuvo asociada con un mínimo de efectos adversos.

Tabla 16. Incidencia de Sarpullido. Los cuadrados de color gris claro indican que no se observó sarpullido luego de la dosificación; los cuadrados negros indican que se observó un sarpullido luego de la dosificación; los cuadrados abiertos indican que el día que se indica no se administró dosis .

Gru Dosis po de tratamie P nto (mg acient osis OSIS de 7 TOL101) 261 Infecciones y Malignidades. En los sujetos que recibieron TOL101 no se informaron malignidades hasta la fecha. En la tabla 17 se resumen todas las infecciones que se observaron en el estudio. Se consideró que solo una infección significativa estuvo potencialmente asociada con TOL101, una neumonía hospitalaria, según se describió anteriormente. Sin embargo, no se tomaron cultivos de dicho paciente y por lo tanto, no hubo un diagnóstico definitivo y no se pudo identificar un agente causal. Las infecciones asociadas con la piel fueron predominantemente infecciones bacterianas en las heridas debidas a las incisiones, con un caso informado de foliculitis. Se detectaron tres casos de viremia por virus BK, dos de los cuales emergieron poco después de un rescate con timoglobulina en pacientes que padecieron episodios de rechazo agudo. No se observaron otras infecciones importantes tales como CMV, EBV ni neumonía por Pneumocistis oportunistas .

Tabla 17. Infecciones y malignidades Parámetros de seguridad inmunológicos . Como se hace notar en las tablas de AE, comúnmente no se observaron síntomas asociados con síndrome de liberación de citoquinas. La falta de síntomas fue soportada por los bajos niveles de TNF, IFN-?, IL6, ILip e IL2 (Figura 31 A-E), que o bien no se detectaron o se detectaron en bajos niveles con relación a aquellos descritos en pacientes a los que se les dio rATG. Además, otro marcador potencialmente inflamatorio, indicativo de reacciones de infusión, incluye la producción de óxido nítrico (NO) . No se detectó NO en ninguno de los pacientes tratados con TOL101. Como el TOL101 es un anticuerpo murino, la detección de HAMA fue una parte importante del estudio. En las muestras se evaluó el desarrollo de HAMA los días 0, 14 y 28 luego del trasplante. En todos los pacientes excepto uno, no se detectpo HAMA (Figura 31F) . El título para el paciente con una muestra HAMA positivo fue de 1/100. La baja incidencia de HAMA fue un resultado sorprendente, ya que otros anticuerpos anti-TCR o anticuerpos.- contra CD3, incluyendo a T10B9, 0KT3 y BMA-031, indujeron HAMA en más del 30% de los pacientes, donde algunos estudios informan una incidencia de HA A del 80% (Waid y col. Transplantation 64; 274-281

[1997]). Sin deseos de ser limitados por una teoría, se cree que la baja incidencia de HAMA refleja el mecanismo de acción novedoso del anticuerpo y/o las modificaciones del anticuerpo posteriores a la traducción (tales como la glicosilación) .

Modulación farmacodinámica de CD3. Durante la dosificación se midieron diariamente las cuentas de células T CD3 en sangre periférica. La dosificación de TOL101 se administró una vez por día durante un mínimo de 5 días (seis dosis) , o hasta que se alcanzaron los niveles terapéuticos de tacrólimo (8-15ng/ml). En 6 pacientes, fueron necesarias más de 6 dosis de TOL101; sin embargo, ninguna de las mismas pertenecieron a las cohortes en las que TOL101 alcanzó el objetivo de la supresión de CD3. En todos los pacientes, se observó una reducción primaria de las cuentas de leucocitos, incluyendo a las células que expresan CD3, inmediatamente después del trasplante. Esto se observó comúnmente en pacientes que recibieron infusión intravenosa de esferoide. Dentro de las 48-72 horas, las cuentas de CD3 en circulación aumentaron hasta superar el objetivo de 25/mm3 en pacientes que recibieron 0,28, 1,4, 7 y 14mg de TOL101 (Figura 32). En la cohorte de 28mg, las cuentas de CD3 permanecieron por debajo de 25/mm3, con la excepción de un paciente que experimentó un pico en el número de CD3 el día 3. Mientras que 28mg pareció ser un régimen de dosis prometedor, el único potencial valor discrepante disparó el escalado de TOL101 a 32mg y 42mg. Para ambos regímenes de dosificación se consiguió una robusta supresión de CD3, sin embargo, se observó un sarpullido en el 50% y el 100% de los pacientes de las cohortes de 32mg y 42mg, respectivamente. Sin deseos de ser limitados por una teoría, se determinó que el sarpullido puede ser el resultado de la liberación de mediadores solubles de células T preformados. Por lo tanto, se implemento una estrategia de escalado de las dosis enfocada en el agotamiento dichos almacenamientos a niveles sub-sintomáticos . En este régimen de dosificación, se inició la dosificación a 14mg y se escaló rápidamente a 42mg en la cuarta dosis. Este régimen de dosificación no solo redujo la propensión a desarrollar sarpullidos sino que también dio como resultado una robusta supresión de CD3, satisfaciendo el objetivo farmacodinámico .

Se observó que ocurrió una recuperación de la expresión de CD3 luego de la osificación de TOL101 en todos los pacientes el día 14 (Figura 32) . Esta recuperación apunta a un mecanismo sin reducción de la acción, lo que también es apoyado por la observación de que no hubo reducción de las cuentas de glóbulos blancos durante la dosificación.

Farmacocinética . De manera similar a 0KT3 y otras terapias anti-TCR, se piensa que la eliminación de TOL101 está mediada predominantemente por la unión a su proteina objetivo. El examen de la farmacocinética muestra que en aquellas cohortes donde se consiguió una robusta supresión de CD3 (es decir, las cohortes de 28, 32, 42 mg y de escalado de las dosis; 32), la vida media de TOL101 varió dentro del rango entre 23 y 29 horas (Tabla 18). Las concentraciones pico de TOL101 se obtuvieron luego de 3 dias de dosificación, lo que indica potencialmente una saturación objetivo en este punto de tiempo.

Tabla 18. Resumen de farmacocin ica Punto final triple de eficacia compuesta. En el estudio no se informaron pérdidas de pacientes ni de injertos (Figura 33A) . Tres sujetos experimentaron episodios de rechazo agudo probados por biopsia que se describieron como posiblemente relacionados con la droga en estudio. Todos los episodios de rechazo se trataron con esferoides o timoglobulina y se resolvieron clínicamente sin pérdida del injerto. No se detectaron anticuerpos específicos contra el donante en ninguno de los pacientes que se enrolaron en el estudio.

Función renal. En el estudio no se observó retraso de la función del injerto. Función renal mejoró durante el transcurso del estudio, observándose un incrementos de la GFR estimada en todos pacientes (Figura 33B) . Adicionalmente, la GFR calculada, usando la eliminación de iotalamato el día 180 luego del trasplante mostró una excelente eliminación de creatinina en todos los pacientes (Figura 33C) , incluyendo a aquellos que habían padecido eventos de rechazo agudo.

Ejemplo 8. Especificidad de TOL101 Se utilizaron monocitos de sangre periférica (PBMC) de 6 donantes independientes para determinar el subconjunto preciso de células T al que se une TOL101. TOL101 marcó solo las células T CD3+ y se unió a células T tanto CD4+ como CD8+ (Figura 34) . Es importante que TOL101 no se unió a células T ?d, a células que expresan CD14 (linaje de monocitos/ células NK) , ni células B (Figura 34). Por lo tanto, TOL101 es específico para células T aß. Además, la preincubación con TOL101 bloqueó la unión de otro anticuerpo TCR aß, IP26, demostró adicionalmente la especificidad de TOL101 por las células T aß. Los anticuerpos específicos para la cadena a del TCR inhibió la unión a TOL101, mientras que los anticuerpos para la cadena ß mostraron una inhibición de la unión a TOL101 mucho menor. Por lo tanto, TOL101 parece unirse preferentemente a la cadena alfa del TCR.

Ejemplo 9 Señalización de TOL101 e inducción in vitro de Treg Se analizó en mayor profundidad la inhibición de células T mediada por TOL101 usando una reacción en cultivo mixto de linfocitos (MLR) de 1 vía. En este experimento, se aislaron PBMCs de capas leucocitarias de tres donantes saludables. Las capas leucocitarias se separaron en capas sobre un gradiente de Ficol para enriquecerlas en linfocitos. Luego se irradiaron las células estimulantes con 3000 rads. Las células estimulantes y respondedoras se cultivaron en conjunto durante 7 días en una proporción de 2:1 (4x105 células estimulantes a 2x105 células respondedoras) . Las combinaciones para las células fueron las siguientes: unidad 1 + unidad 2 irr (Ab) , unidad 1 + unidad 3 irr (Ac) , unidad 2 + unidad 1 irr (Ba) , unidad 2 + unidad 3irr (Be) , unidad 3 + unidad 1 irr (Ca) , unidad 3 + unidad 2irr (Cb) . Se agregó TOL101 en el momento del cultivo en una concentración de 9ug/ml. Se agregó Brefeldina A durante las últimas 24 horas de cultivo. Las células se cosecharon y se tiñeron para antigenos extracelulares, se fijaron y se permeabilizaron y se tiñeron para citoquinas intracelulares . Los gráficos de la Figura 35 muestran el porcentaje de células T CD4 que expresan lFN-?. Esto sustenta de los datos clínicos que se obtuvieron, donde TOL101 inhibió al Interferón de tipo 2 de células T en la MLR de una vía de numerosos pacientes individuales .

Según se describe en el Ejemplo 3, se ha demostrado que TOL101 incrementa los niveles de ERK fosforilada (Figura 11) y reduce el nivel de ZAP70 fosforilada (Figura 10) . La fosforilación de ERK en células T comúnmente está asociada con las vías co-estimulatorias de las célula T, incluyendo a la vía CD28. Se llevó a cabo un experimento para determinar si TOL101 puede inhibir la proliferación de células T inducida por co-estimulación. Se aislaron PBMCs de capas leucocitarias de tres donantes saludables. Las capas leucocitarias se separaron en capas sobre un gradiente de Ficol para enriquecerlas en linfocitos. Los linfocitos se cultivaron con una densidad de 2x105 células/pocilio. Las células se cultivaron con TOL101 (9 µ?/p??), CD28 unidas a la placa (1 ug/ml) y CD28 unidas a la placa (1 ug/ml) y TOL101 (9 µ?/p??) . Se agregó H3 4 días en el cultivo y las placas se cosecharon y se contaron el día 5. Como se puede ver en la Figura 36, el TOL101 no fue capaz de inhibir la proliferación mediada por CD28.

Además de ZAP70 y ERK, otra indicación de la activación de las células T es el flujo de calcio. El incremento sostenido del calcio lleva a una activación de la fosfatasa Calcineurina . La calcineurina regula varios factores de transcripción que incluyen a NF-AT. Para estudiar si TOL101 dispara la liberación de calcio, se aislaron PBMCs de capas leucocitarias de cuatro donantes saludables (O, P, Q y R) . En la Figura 37, las capas leucocitarias se separaron en capas sobre un gradiente de Ficol para enriquecerlas en linfocitos. Se tiñeron 5x105 células provenientes de cada donante con anti-CD4 durante 1 hora a 37°C. Las células se lavaron y criaron en solución reactiva de ensayo de calcio Fluo-4 direct (Invitrogen #F10471) y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C y 30 minutos a la temperatura ambiente. Las células se corrieron en LSR durante 600 segundos. Al T= 90 segundos, se agregaron a los tubos 20 µ?, de medio solo, o 20 µL de cada uno de 9 g/ml de TOLIOI y 9 g ml de IgM anti-ratón, o 20µ?? de cada uno de 9µg/ml de CD3 y 9µg/ml de IgG anti-ratón, o 20µL de l g/ml de ionomicina y se pipetearon suavemente hacia arriba y abajo antes de continuar con la adquisición. Sorprendentemente, el TOLIOI indujo el flujo de calcio en solo aproximadamente 15% de las células T CD4, al contrario que el anti-CD3, que dio como resultado el que esencialmente todas las células T CD4 tuviesen flujos de calcio (Figura 37) . Sin deseos de ser limitados por una teoría, se cree que el pequeño número de células T CD4 con flujo de calcio por unión de TOLIOI representa las células T que se transformaron en Tregs.

Además del flujo de calcio, se estudiaron la proteína 27 de choque térmico fosforilada (HSP27), AKT-2 y la proteína quinasa activada MAPK en células T tratadas con TOLIOI (Figura 38) . En este experimento, se aislaron PBMCs de la capa leucocitaria de donantes saludables. Las capas leucocitarias se separaron en capas sobre un gradiente de Ficol para enriquecerlas en linfocitos. Las células se mantuvieron a 37 grados durante una hora en ona de las siguientes condiciones: sin tratamiento, anti-CD3 (0KT3) 9 Ug/ml + Ig anti-ratón 10 ug/ml, TOLIOI 9 ug/ml + anti-IgM de ratón 10 ug/ml. Luego de una hora, las células se lavaron y Usaron. Se procesaron 200 ug de proteina/muestra usando la matriz RD Human Phospho-MAPK Array. La fosforilación de las proteínas se detectó usando estreptavidina-HRP y detección por quimioluminiscencia . En la Figura 38 se muestra una imagen de las membranas expuestas y reveladas y una cuantificación de la intensidad de los pixeles usando el software ImageJ. Como se muestra en la Figura 38, HSP27 no fue diferente entre los grupos de tratamiento. Aunque puede haberse observado una potencial tendencia para P38a, esta no fue significativa. Lo más sorprendente fue la observación de que se encontró un nivel de AKT2 fosforilada en cantidades significativas en PB C tratadas con TOLIOI pero no se detectó en anti-CD3 ni en las PBMCs de control. Juntos, dichos datos resaltan adicionalmente la única vía de modulación iniciada por TOLIOI cuando se une al TCR.

Como se describió anteriormente, la inducción de Tregs en pacientes clínicos tratados con el escalado de dosis de TOLIOI fue inesperada (Figura 28). Además, se ha descrito que los eventos de señalización inducida por TOLIOI, incluyendo el aumento de ERK, inhiben la expansión de Tregs. Para explorar adicionalmente dichos resultados, se analizó en mayor profundidad la capacidad de TOLIOI de inducir Tregs in-vitro. Se aislaron PBMCs de capas leucocitarias de tres donantes saludables. Las capas leucocitarias se separaron en capas sobre un gradiente de Ficol para enriquecerlas en linfocitos. Se prepararon cultivos de MLR de dos vías, representativos de un paciente de trasplante de aloinjerto in vivo, en una proporción 1:1 de 4x105 células/donante. Las células se cultivaron con TOLIOI en escalado de concentraciones de manera que reflejasen la dosificación del experimento clínico. A los cultivos se les agregaron concentraciones crecientes de TOLIOI (9, 18, 36, 72 y 120 µ?/t?) , una concentración constante de TOLIOI (9 µ?/p??) , anti-CD3 (1 µg/ml) o medio solo. Las células se recolectaron luego de 5 días de cultivo, se lavaron, se bloquearon, se tiñeron para antígenos extracelulares, se fijaron y se permeabilizaron y se tiñeron para Foxp3 intracelular . Las células se recolectaron por citometría de flujo y se analizaron con Flow Jo. Los gráficos de puntos son representativos de 3 reacciones (A+B, A+C, B+C) . Anteriormente se había mostrado que los Tregs con un CD4+CD25+FOXP3+CD1271o fenotipo tienen una actividad de supresión in vivo y se realizó un gating como se muestra en la Figura 39. Sorprendentemente, los cultivos tratados con escalado de dosis de TOLIOI se enriquecieron en Tregs CD4+CD25+FOXP3+CD1271o. Los cultivos tratados con anti-CD3 tuvieron numéricamente más CD4+CD25+FOXP3+CD1271o, pero también hubo una significativa población de CD127hi, que se piensa que consistía en las células T efectoras. Dichas células T efectoras son altamente eficaces para causar el rechazo de aloinjerto y autoinmunidad. Tomados en conjunto, los resultados del estudio indican que inesperadamente y al contrario del dogma, que indica que la señal 1 (estimulación por TCR) sin señal 2 (co-estimulación) da como resultado la anergia y muerte de las células T, una única señal-1 provista por TOLIOI no da como resultado la merma ni la muerte de las células T. Sin deseos de ser limitados por una teoría, se piensa que la unión de TOLIOI a la aß de TCR induce la fosforilación de proteínas, incluyendo a AKT y ERK, que se sabe que son importantes para la supervivencia de las células T y que la señal de supervivencia, combinada con la señalización inducida por calcio, da como resultado la inducción de Tregs.

Ejemplo 10. ScFV de TOLIOI En este experimento, se expresaron en E. coli una serie de 10 diferentes fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) que expresaban CDRs modificadas de TOLIOI. Uno de los 10 scFv mostró un perfil de alta expresión (Figura 40) . En la Figura 40 también se muestran un diagrama esquemático y la secuencia de aminoácidos de esta scFv (SEQ ID NO: 9) . La scFv se unió in vitro a las células T tanto CD4+ como CD8+ (Figura 40), lo que indica que se puede generar un scFv de TOL101 tanto con capacidad de unión a células T como alto nivel de expresión .

Todas las publicaciones y patentes que se mencionan en la presente solicitud se incorporan a la presente a modo de referencia. Diversos modificaciones y variaciones de los métodos y composiciones de la invención descrita serán evidentes para aquellos con experiencia en el arte sin apartarse del alcance ni del espíritu de la invención. Aunque la invención se ha descrito con relación a formas de realización preferidas específicas, se debería comprender que la invención, tal como se la reivindica, no debería ser limitada indebidamente por dichas formas de realización específicas. Por cierto, hay diversas modificaciones a las modalidades descritas para llevar a cabo la invención que serán obvias para aquellos con experiencia en los campos relevantes, que se encuentran dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes. REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une a aß TCR; en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo está glicosilado en residuos de aminoácidos equivalentes al anticuerpo producido por el hibridoma MCB TOLIOI.

2. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une a aß TCR expresado en una célula T; en donde la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo a aß TCR no induce producción de una citoquina seleccionada del grupo que consiste en Factor de Necrosis Tumoral-alfa (TNF-OÍ) , Interferón-gamma (IFN-?), Interleuquina-2 e Interleuquina-6 en la célula T.

3. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo, que se une a aß TCR en una célula T; en donde la unión del anticuerpo o fragmento del mismo a ß TCR reduce la expresión en superficie de aß TCR y CD3 en la célula T, y no reduce el número de las células T.

4. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une a aß TCR en una célula T; en donde la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo a aß TCR induce fosforilación de AKT y ERK en la célula T.

5. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une a aß TCR en una célula T; en donde la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo a aß TCR induce el flujo de calcio en menos del 20% de las células T ß TCR+ medido por citometria de flujo.

6. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo de acuerdo a la reivindicación 5, en donde el flujo de calcio es inducido en menos del 15% de las células T aß TCR+.

7. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une a aß TCR en una célula T; en donde entrecruzamiento del anticuerpo o fragmento de unión a antigeno no induce proliferación de la célula T.

8. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende las CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena liviana y las CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo producido por el hibridoma MCB TOL101.

9. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo está codificado por una secuencia de polinucleótidos que comprenden las SEQ ID NOs : 3, 4 y 5.

10. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento del mismo comprende SEQ ID NOs: 6, 7 y 8.

11. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo.se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un scFv, un fragmento Fab, un fragmento Fab' , y un fragmento F(ab)' .

12. Un anticuerpo aislado producido por el hibridoma MCB TOL101, o un fragmento de unión a antigeno del mismo.

13. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7 y 12, en donde el anticuerpo o fragmento está acoplado a una marca que puede detectarse seleccionada del grupo que consiste en un radioisótopo, enzima, marca fluorescente, marca luminiscente, biomarca luminiscente, biotina o toxina.

14. Un método para tratar una enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune, o rechazo de tejido trasplantado que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7 o 12 a un paciente humano que lo necesita.

15. El método de acuerdo a la reivindicación 14, en donde la enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune o rechazo de tejido trasplantado se selecciona del grupo que consiste en: asma, alergia, inflamación alérgica de las vías aéreas, encefalomielitis alérgica, artritis autoinmune, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reactiva, artritis psoriática, sacroiliitis, uveitis anterior aguda aislada, espondiloartropatia no diferenciada, Diabetes Mellitus tipo 1, Esclerosis Múltiple, Lupus Eritematoso Sistémico, glomerulonefritis, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, Escleroderma, enfermedad celiaca, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria de los intestinos, colitis ulcerativa, espondilitis anquilosante, síndrome de Sjogren, psoriasis, dermatitis por contacto, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Addison, granulomatosis de Wegener, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante, hepatitis autoinmune, polimialgia reumática, enfermedad de Bechet, síndrome de Guillain-Barre, diferentes vasculitis, uveoretinitis , tiroditis, miastenia gravis, nefropatías por inmunoglobulinas , miocarditis, esclerosis sistémica progresiva, rechazo de injerto de órgano, rechazo de tejido conectivo mezclado y enfermedad de injerto versus huésped.

16. El método de acuerdo a la reivindicación 14, en donde la enfermedad autoinmune es Diabetes Mellitus tipo 1 o Esclerosis Múltiple.

17. El método de acuerdo a la reivindicación 14, en donde el rechazo de tejido trasplantado comprende rechazo de injerto de órgano o enfermedad de injerto versus huésped.

18. El método de acuerdo a la reivindicación 14, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo induce una respuesta HAMA en menos del 20% de los pacientes humanos administrados con el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo medido por ELISA.

19. El método de acuerdo a la reivindicación 14, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo induce una respuesta HAMA en menos del 10% de los pacientes humanos administrados con el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo medido por ELISA.

20. El método de acuerdo a la reivindicación 14, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo induce una respuesta HAMA en menos del 5% de los pacientes humanos administrados con el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del. mismo medido por ELISA.

21. Un método para inhibir una respuesta inmune de células T en una enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune o rechazo de tejido trasplantado, en donde el método que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7 o 12 a un paciente humano que lo necesita.

22. El método de acuerdo a la reivindicación 21, en donde la enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune o rechazo de tejido trasplantado se selecciona del grupo que consiste en: asma, alergia, inflamación alérgica de las vías aéreas, encefalomielitis alérgica, artritis autoinmune, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reactiva, artritis psoriática, sacroiliitis, uveitis anterior aguda aislada, espondiloartropatia no diferenciada, Diabetes Mellitus tipo 1, Esclerosis Múltiple, Lupus Eritematoso Sistémico, glomerulonefritis, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, Escleroderma, enfermedad celiaca, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria de los intestinos, colitis ulcerativa, espondilitis anquilosante, síndrome de Sjogren, psoriasis, dermatitis por contacto, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Addison, granulomatosis de Wegener, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante, hepatitis autoinmune, polimialgia reumática, enfermedad de Bechet, síndrome de Guillain-Barre, diferentes vasculitis, uveoretinitis, tiroditis, miastenia gravis, nefropatias por inmunoglobulinas, miocarditis, esclerosis sistémica progresiva, rechazo de injerto de órgano, rechazo de tejido conectivo mezclado y enfermedad injerto versus huésped.

23. El método de acuerdo a la reivindicación 21, en donde la enfermedad autoinmune es Diabetes Mellitus tipo 1 o Esclerosis Múltiple.

24. El método de acuerdo a la reivindicación 21, en donde el rechazo de tejido trasplantado comprende rechazo de injerto de órgano o enfermedad injerto versus huésped.

25. Un método para producir un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende: i. transfectar una célula huésped mamifera con una secuencia de polinucleótidos que codifica para un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende las CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena liviana y las CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo producido por el hibridoma MCB TOL101; ii. cultivar la célula huésped; y iii. aislar el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo; en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo se une a aß TCR expresado en una célula T; y en donde la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo a aß TCR reduce la expresión en superficie de aß TCR y CD3 en la célula T y no reduce el número de las células T.

26. El método de la reivindicación 25 en donde la secuencia de polinucleótidos comprende SEQ ID NOs: 3 y 4.

27. El método de la reivindicación 26, en donde la secuencia de polinucleótidos además comprende SEQ ID NO: 5.

28. El anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo producido por el método de la reivindicación 25.

29. El anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo de acuerdo a la reivindicación 27, en donde el anticuerpo es TOL101.

30. Una linea celular de hibridoma aislada que produce un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une a aß TCR, en donde la linea celular de hibridoma es MCB TOL101.

31. Un método para tratar una enfermedad autoinmune, enfermedad inflamatoria, o rechazo de tejido trasplantado, en donde el método comprende: administrar un anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo en una cantidad entre aproximadamente 7 mg/dia y aproximadamente 58 mg/dia a un sujeto que lo necesita, en donde el anticuerpo es producido por el hibridoma MCB TOL101.

32. Un método para tratar una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, o un rechazo de tejido trasplantado, en donde el método comprende: administrar un anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo en una cantidad entre aproximadamente 7 mg/dia y aproximadamente 58 mg/dia a un sujeto que lo necesita, en donde el anticuerpo se une a ß TCR.

33. El método de acuerdo a la reivindicación 32, en donde el anticuerpo anti- ß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo se administra en una cantidad de 7 mg/dia, 14 mg/dia, 21 mg/dia, 28 mg/dia, 30 mg/dia, 32 mg/dia, 34 mg/dia, 35 mg/dia, 36 mg/dia, 38 mg/dia, 40 mg/dia, 42 mg/dia, 44 mg/dia, 46 mg/dia, 48 mg/dia, 50 mg/dia, 52 mg/dia, 54 mg/dia, 56 mg/dia o 58 mg/dia, o combinaciones de los mismos.

34. El método de acuerdo a la reivindicación 33, en donde el anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo se administra en una cantidad de 14 mg/dia.

35. El método de acuerdo a la reivindicación 33, en donde el anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo se administra en una cantidad de 28 mg/dia.

36. El método de acuerdo a la reivindicación 33, en donde el anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo se administra en una cantidad de 32 mg/dia.

37. El método de acuerdo a la reivindicación 33, en donde el anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo se administra en una cantidad de 35 mg/dia.

38. El método de acuerdo a la reivindicación 33, en donde el anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo se administra en una cantidad de 42 mg/dia.

39. Un método para tratar una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune, o un rechazo de tejido trasplantado en un sujeto que lo necesita, en donde el método comprende: administrar un anticuerpo anti- ß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo en un esquema de dosificación que comprende: 14 mg en el dia 1, 21 mg en el dia 2, 28 mg en el día 3, 42 mg en el dia 4, 42 mg en el dia 5 y 42 mg en el dia 6.

40. Un método para tratar una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune, o un rechazo de tejido trasplantado en un sujeto que lo necesita, en donde el método comprende: administrar un anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo en un esquema de dosificación que comprende: 14 mg en el dia 1, 21 mg en el dia 2, 28 mg en el dia 3, 42 mg en el dia 4 y 42 mg en el dia 5.

41. El método de acuerdo a la reivindicación 39 o 40, en donde el anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo se administra una vez por dia.

42. El método de acuerdo a la reivindicación 41, en donde la enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune o rechazo de tejido trasplantado se selecciona del grupo que consiste en: asma, alergia, inflamación alérgica de las vías aéreas, encefalomielitis alérgica, artritis autoinmune, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reactiva, artritis psoriática, sacroiliitis , uveitis anterior aguda aislada, espondiloartropatia no diferenciada, Diabetes Mellitus tipo 1, Esclerosis Múltiple, Lupus Eritematoso Sistémico, glomerulonefritis, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, Escleroderma, enfermedad celiaca, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria de los intestinos, colitis ulcerativa, espondilitis anquilosante, síndrome de Sjogren, psoriasis, dermatitis por contacto, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Addison, granulomatosis de egene'r, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante, hepatitis autoinmune, polimialgia reumática, enfermedad de Bechet, síndrome de Guillain-Barre, diferentes vasculitis, uveoretinitis , tiroditis, miastenia gravis, nefropatías por inmunoglobulinas , miocarditis, esclerosis sistémica progresiva, rechazo de injerto de órgano, rechazo de tejido conectivo mezclado y enfermedad injerto versus huésped.

43. El método de acuerdo a la reivindicación 41, en donde la enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune o rechazo de tejido trasplantado, es Diabetes Mellitus tipo 1 o Esclerosis Múltiple.

44. El método de acuerdo a la reivindicación 41, en donde el rechazo de tejido trasplantado comprende rechazo de injerto de órgano, rechazo de tejido conectivo mezclado o enfermedad injerto versus huésped.

45. Un método para aumentar las células T Treg en un sujeto que lo necesita, en donde el método comprende administrar un anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo en un esquema de dosificación que comprende: 14 mg en el dia 1, 21 mg en el dia 2, 28 mg en el día 3, 42 mg en el dia 4, 42 mg en el dia 5 y 42 mg en el dia 6.

46. Un método para inducir células T Treg en un sujeto que lo necesita, en donde el método comprende: administrar un anticuerpo anti-aß TCR o fragmento de anticuerpo del mismo en un esquema de dosificación que comprende: 14 mg en el dia 1, 21 mg en el dia 2, 28 mg en el dia 3, 42 mg en el dia 4 y 42 mg en el dia 5.

47. El método de acuerdo a la reivindicación 45 o 46, en donde las células T Treg son fenotipicamente CD2+ CD4+ CD25+ FOXP3+' CD1271o.

48. El método de acuerdo a la reivindicación 47, en donde el sujeto necesita que le inhiban las células T aloreactivas, o inhiban la actividad de las células T citotóxicas (CTL) , o inmunosuprimirle una alorespuesta, o inhiban una respuesta inmune, o inhiban, prevengan o bloqueen una alorespuesta o una respuesta autoinmune antes de, durante o posteriormente a trasplante de tejido, o inhibir, suprimir o bloquear la enfermedad de injerto vs . huésped, o prevenir, tratar o suprimir una respuesta autoinmune en una enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune o durante el rechazo de tejido trasplantado.

49. El método de acuerdo a la reivindicación 48, en donde la enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune o rechazo de tejido trasplantado se selecciona del grupo que consiste en: asma, alergia, inflamación alérgica de las vias aéreas, encefalomielitis alérgica, artritis autoinmune, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reactiva, artritis psoriática, sacroiliitis , uveitis anterior aguda aislada, espondiloartropatia no diferenciada, Diabetes Mellitus tipo 1, Esclerosis Múltiple, Lupus Eritematoso Sistémico, glomerulonefritis, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, Escleroderma, enfermedad celiaca, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria de los intestinos, colitis ulcerativa, espondilitis anquilosante, síndrome de Sjogren, psoriasis, dermatitis por contacto, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Addison, granulomatosis de Wegener, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante, hepatitis autoinmune, polimialgia reumática, enfermedad de Bechet, síndrome de Guillain-Barre, diferentes vasculitis, uveoretinitis, tiroditis, miastenia gravis, nefropatías por inmunoglobulinas, miocarditis, esclerosis sistémica progresiva, rechazo de injerto de órgano, rechazo de tejido conectivo mezclado y enfermedad injerto versus huésped.