CN103906766B - 抗cd83激动剂抗体用于治疗自身免疫疾病的用途 - Google Patents

抗cd83激动剂抗体用于治疗自身免疫疾病的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN103906766B
CN103906766B CN201280042210.6A CN201280042210A CN103906766B CN 103906766 B CN103906766 B CN 103906766B CN 201280042210 A CN201280042210 A CN 201280042210A CN 103906766 B CN103906766 B CN 103906766B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
cell
seq
hvr
aminoacid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201280042210.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103906766A (zh
Inventor
L·迪尔
J·贝茨
T·赛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Huffman Lara Cutting Co Ltd
Original Assignee
F Huffman Lara Cutting Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Huffman Lara Cutting Co Ltd filed Critical F Huffman Lara Cutting Co Ltd
Publication of CN103906766A publication Critical patent/CN103906766A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103906766B publication Critical patent/CN103906766B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及包含抗CD83激动剂抗体的组合物和利用抗CD83激动剂抗体治疗自身免疫性病症（如炎性肠病）的方法，以及包含抗CD83激动剂抗体的制成品。

Description

抗CD83激动剂抗体用于治疗自身免疫疾病的用途
相关申请的交叉参考
该申请要求2011年7月1日提交的美国临时专利申请系列号61/504,127和2011年12月27日提交的日本专利申请号2011-285585和2011年12月27日提交的2011-285595的权益，各自以其整体引入作为参考。
技术领域
本发明涉及抗CD83激动剂抗体和用于使用抗CD83激动剂抗体治疗自身免疫疾病，如炎性肠病的方法。
发明背景
炎性肠病(IBD)，如溃疡性结肠炎和克隆病的特征在于肠道的慢性和复发性炎症。近期证据表明，IBD是由于丧失了对共生肠道菌群的耐受性，其中粘膜免疫系统不能区分病原体和共生生物。因而，IBD患者发生了对正常菌群的免疫识别，其产生胃肠道炎症反应。对正常菌群发生血清反应性的程度与疾病持续时间和疾病严重性大致相关(Lodes等,J ClinInvest.,113:1296-1306,2004)。已经鉴定了超过25个在溃疡性结肠炎与克隆病遗传学之间重叠的等位基因(Umeno等,Inflamm Bowel Dis.In press,2011)。这些IBD遗传等位基因在几条常见途径中汇集，其导致1）上皮完整性缺陷，2）骨髓微生物应答和促炎细胞因子的产生中的缺陷，和3）T辅助17细胞和T辅助1细胞响应增加。研究显示，大多数IBD患者具有自发的复发和缓解周期，其中他们以合理的频率实现临床缓解，但不能长期维持缓解。该观察结果表明，存在尚未明确的粘膜稳态机制，其可以驱动IBD缓解期(Schirbel等,Expert RevGastroenterol Hepatol.,5(1):33-41,2011)。鉴定参与维持粘膜稳态的分子和机制因而对驱动以及维持IBD缓解有益。
CD83是高度保守的45千道尔顿的跨膜糖蛋白，其主要在树突细胞和胸腺上皮细胞的表面上表达。此外，CD83在免疫系统的其他激活细胞的表面上瞬时表达并还发现存在可溶形式。CD83的预测氨基酸序列的结构分析显示，其为免疫球蛋白超家族的成员，指示在免疫系统中的作用。参考文献报道提示，可溶性的CD83(sCD83)起免疫调节作用，这是由于这样的观察结果，即HCMV感染的成熟树突细胞所释放的sCD83抑制T细胞增殖(Senechal等,Blood.,103(11):4207-4215,2004)，并且sCD83对树突细胞的细胞骨架具有形态学影响(Kotzor等,Immunobiology.,209(1-2):129-140,2004)。然而，没有鉴定到CD83的配体并且对CD83的功能了解的仍然很少。有意思的是，CD83基因表达在人克隆病的粘膜表面上下调(Silva等,Dig.Dis.Sci.,53(7):1917-1928,2008)，提示CD83可能参与维持粘膜稳态并因而是调节IBD中的免疫系统的治疗靶标。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请和公开均以其整体引入作为参考。
发明概述
本文提供了用于在个体中治疗或预防自身免疫疾病的方法，其包括向个体施用有效量的抗CD83激动剂抗体。在一些实施方案中，所述个体是人。
在一些实施方案中，自身免疫疾病选自类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮（SLE）、狼疮性肾炎、溃疡性结肠炎、韦格纳病、炎性肠病、特发性血小板减少性紫癜（ITP）、血栓性血小板减少性紫癜（TTP）、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化症、牛皮癣、IgA肾病、IgM多发性神经病、重症肌无力、血管炎、糖尿病、雷诺氏综合征、舍格伦综合征和肾小球肾炎。在一些实施方案中，所述自身免疫疾病与髓样细胞激活（树突细胞和巨噬细胞）相关，如多发性硬化症和炎性肠病。
在一些实施方案中，所述个体患有或诊断患有自身免疫疾病。在一些实施方案中，所述个体患有或诊断患有炎性肠病（如克隆病、溃疡性结肠炎和不确定性结肠炎）。
在一些实施方案中，抗CD83激动剂抗体抑制促炎细胞因子从成熟树突细胞中的释放（例如，抑制促炎细胞因子MCP-1和/或IL-12p40的释放）。在一些实施方案中，抗CD83激动剂抗体诱导抗炎细胞因子从成熟树突细胞中的释放（例如，诱导抗炎细胞因子IL-1ra的释放）。在一些实施方案中，抗CD83激动剂抗体诱导成熟树突细胞上CD83和/或HLA-DR的细胞表面表达降低。在一些实施方案中，抗CD83激动剂抗体抑制成熟树突细胞中MAPK和/或TOR信号传导的激活。在一些实施方案中，通过成熟树突细胞中p38和/或CREB蛋白质磷酸化的降低来测定对MAPK信号传导激活的抑制。在一些实施方案中，通过成熟树突细胞中mTOR蛋白质磷酸化的降低来测定对mTOR信号传导激活的抑制。在一些实施方案中，抗CD83激动剂抗体上调成熟树突细胞中创伤愈合基因（例如，vcan、spock2和fbn2）的表达。
在一些实施方案中，抗CD83激动剂抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗CD83激动剂抗体是抗原结合片段，例如选自Fab、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)2片段的片段。在一些实施方案中，抗CD83激动剂抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，抗CD83激动剂抗体是人抗体。在一些实施方案中，抗CD83激动剂抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗CD83激动剂抗体包含重链可变域，其包含含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ IDNO:32的氨基酸序列的HVR-H2，和含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；和/或轻链可变域，其包含含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2，和含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，抗CD83激动剂抗体包含含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链可变域，和/或含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链可变域。
在一些实施方案中，通过静脉内、肌内、皮下、局部、经口、经皮，腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用抗CD83激动剂抗体。
本文还提供的是包含抗CD83激动剂抗体的制成品或药盒。在一些实施方案中，所述制成品或药盒还可以包含包装插页，其包含在个体中使用抗CD83激动剂抗体治疗或预防自身免疫疾病的说明书。
本文还提供的是包含可变域的分离的抗CD83抗体，所述可变域包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列：(a)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2；(f)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3。本文还提供的是包含重链可变域和轻链可变域的分离的抗CD83抗体，所述可变域包含以下六个HVR序列：(a)包含SEQ IDNO:31的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2；(f)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗体包含(a)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方案中，抗体还包含(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗体包含(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，其中抗体是嵌合抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链可变域，和/或含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链可变域。
本文还提供的是包含本文所述的抗CD83抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
本文还提供的是分离的核酸，其包含编码本文所述的抗CD83抗体的核苷酸序列。本文提供的是包含核酸的载体。在一些实施方案中，所述载体是表达载体。本文还提供的是包含载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是原核的或真核的。
本文还提供的是用于制备抗CD83抗体的方法，所述方法包括在适合表达编码本文所述抗CD83抗体的核酸的条件下培养本文所述的宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括回收所述宿主细胞产生的抗CD83抗体。
应理解，可以组合本文所述的多个实施方案的一个、一些或全部性质，以形成本发明的其他实施方案。本发明的这些方面以及其他方面对本领域技术人员会变得显而易见。
附图简述
图1显示了在表达CD83的细胞表面上参与同型结合的CD83。(a)通过流式细胞术定量在稳定转染的CHO-hCD83细胞表面上表达的CD83。(b)通过流式细胞术定量在MUTZ-3来源的成熟DC上表达的CD83的表达。(c和d)结合CHO-hCD83和成熟DC的CD83.fc。
图2显示CD83为结合CD83.fc所必需。(a)如流式细胞术所定量，CD83.fc结合CHO-hCD83细胞，但结合被抗CD83抗体所阻断。(b)如针对18S归一化的总RNA的taqman分析所示，MUTZ-3成熟DCs中对CD83特异的siRNA(siCD83)的功效。(c)CD83在利用非靶向对照(siNTC)siRNA处理的成熟DC表面上表达，但不在利用siCD83处理的成熟DCs上表达。(d)CD83.fc结合mDC，但结合被siCD83处理消除。(e)CD83的敲倒降低了成熟DCs中MHCII的表面表达。(f)CD83的敲倒不改变成熟DCs中CD86的表面表达。
图3提供了10X下的显微镜图像，显示CD83表达导致细胞在悬浮培养中聚集。（a）对照CHO细胞不聚集。（b）表达CD83的细胞在悬浮培养中时形成聚集体。（c）CD83.fc蛋白质预处理CHO-hCD83细胞阻断了聚集。（d）Ig对照蛋白质预处理CHO-hCD83细胞不阻断聚集。
图4显示，CD83.fc或HB15e抗体处理成熟DCs中的CD83降低了表面激活标志物CD83和HLA-DR的表达。
图5 ELISA数据显示，CD83处理的人单核细胞来源的DCs中改变的细胞因子释放。(a和c)CD83.fc或HB15e抗体处理后，促炎细胞因子IL12-p40和MCP-1减少。(b)抗炎细胞因子IL-1ra在CD83处理的DCs中显著增加。(d)IL-8在CD83处理的或对照处理的DCs中没有差别。*表示值具有显著差异；*p<0.01,**p<0.001。图代表至少四个不同的供体。
图6 ELISA数据显示，CD83处理的MUTZ-3来源的DCs中改变的细胞因子释放。(a和c)CD83.fc或HB15e抗体处理后，促炎细胞因子IL12-p40和MCP-1减少。(b)抗炎细胞因子IL-1ra在CD83处理的DCs中显著增加。(d)IL-8在CD83处理的或对照处理的DCs中没有差别。一式三份运行来自每个孔的上清液。
图7显示，如通过针对gapdh归一化的vcan、spock2和fbn2的TaqmanqPCR分析所提供，在DCs中利用CD83.fc或HB15e抗体处理CD83导致参与创伤愈合的基因上调。平均相对表达(2^△CT)+SEM。
图8显示，CD83同型相互作用可以反向发生，以在DCs中介导抗炎应答。(a和b)细胞因子产生的ELISA测定显示，过表达CD83的CHO细胞与mDCs的共培养抑制了促炎细胞因子IL12-p40和MCP-1的释放。(c)从CD83敲除(CD83KO)和野生型(WT)同窝出生仔畜产生的成熟小鼠骨髓来源的DCs(BMDCs)（灰色条）在24h LPS刺激后产生相似水平的IL-12p40。(d)利用WT成熟的BMDCs培养的未成熟的BMDCs产生比利用CD83缺陷的成熟BMDCs培养的那些显著更少的IL-12p40，p=0.0372。
图9显示，CD83同型相互作用在DCs中介导抗炎应答。(a)如MCP-1的ELISA显示，CD83的siRNA敲倒消除了对CD83.fc或HB15e抗体的应答。(b)全长CD83和胞质截短的CD83的CD83慢病毒表达构建体的示意图。(c)MCP-1产生的ELISA显示，胞质截短的CD83的表达阻断了CD83.fc蛋白质的抑制效果。
图10显示，抗体交联通过DCs中的CD83胞质结构域足以驱动抗炎应答。(a)CD83嵌合慢病毒表达构建体的示意图，所述构建体描绘了与CD83跨膜融合的CD79a胞外结构域和全长或截短的胞质结构域。(b)IL12-p40产生的ELISA显示，过表达截短的嵌合体抑制DC对抗CD79a抗体的应答。
图11显示，CD83在C末端含有一类III PDZ配体基序，其介导抗炎应答。(a)CD83胞质结构域的最后15个氨基酸的氨基酸比对示意图显示了保守类型的III PDZ配体基序。(b)C末端PDZ配体基序V205A突变体的CD83慢病毒表达构建体的示意图。(c)MCP-1产生的ELISA显示，V205APDZ配体基序突变体的表达阻断了CD83.fc蛋白质的抑制效果。
图12显示，CD83同型相互作用的免疫抑制效应由p38MAPK和mTOR信号传导途径介导。(a-c)显示，HB15e抗体处理导致mTOR、p38和CREB的磷酸化显著降低。(d)HB15e抗体处理不抑制STAT3的磷酸化，其由TNF途径激活。(e)Western印迹分析验证了HB15e抗体处理后p38磷酸化的降低。(f)HB15e抗体处理后，没有看到STAT3的磷酸化的显著差异。总的p38和STAT3用作上样对照。
图13显示，结肠中CD83过表达导致固有层中DCs上的表面激活标志物下调。(a)用于产生CD83转基因小鼠的转基因构建体的示意图。(b)免疫组织化学染色显示结肠上皮细胞中转基因的表达。(c和e)通过FACS定量从CD83转基因小鼠的结肠和脾中分离的DCs上表面标志物的表达并测量为平均荧光强度(MFI)。(d和f)在CD83转基因小鼠的结肠或脾中没有发现T细胞表面激活标志物的任何显著差异。(g)Taqman qPCR分析显示了从CD83转基因小鼠分离的DCs中增加的创伤愈合基因表达。
图14描述了用于分析从CD83转基因小鼠分离的DC亚组的FACS门控策略，其显示CD83转基因对DC亚组的产生没有影响。(a和b)MHCII+和CD11c hi表达门控的DCs。(c)T细胞的门控。(d和e)从结肠和脾分离的DC亚组的流式细胞术分析。
图15显示，CD83过表达保护小鼠免于葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎。(a)描述了当利用DSS处理时，与野生型小鼠相比，CD83转基因小鼠体重减轻的少。(b)患有DSS诱导结肠炎的小鼠的结肠切片的苏木精-伊红染色。(c)野生型和CD83转基因小鼠的组织学得分。(d)与野生型同窝出生仔畜相比，利用DSS处理的CD83转基因小鼠中血清细胞因子水平的ELISA。(e)与野生型同窝出生仔畜相比，来自利用DSS处理的CD83Tg小鼠的结肠固有层DCs中的IL-12p40基因表达的qPCR。
图16显示了DCs加剧的结肠炎中CD83的敲除。(a)CD83条件性敲除策略的示意图。(b)脾中TCRb+淋巴细胞上门控的FACS曲线。在脾中，CD83fl/fl CD11c-Cre小鼠具有48.6%CD4阳性T细胞，CD83wt/wtCD11c-Cre小鼠具有48.1%CD4阳性T细胞。(c)柱状图，其显示CD83wt/ wtCD11c-Cre(黑线)和CD83fl/fl CD11c-Cre(灰线)小鼠的脾DCs上CD83的相对表达。(d)CD83fl/fl CD11c-Cre和CD83wt/wt CD11c-Cre小鼠中的DSS结肠炎存活。条件性敲除动物具有显著更少的存活（Log秩检验，p=0.0186）。(e)与CD83wt/wt CD11c-Cre同窝出生仔畜相比，第8天CD83fl/fl CD11c-Cre小鼠的体重显著更低。(f)动物肛门周围的明血的发生率。100%的CD83fl/flCD11c-Cre小鼠到第7天时具有明显的隐血。在CD83wt/wt CD11c-Cre同窝出生仔畜中没有观察到明血。
图17显示结合表达CD83的细胞的抗人CD83抗体。通过流式细胞术进行的定量显示，抗CD83抗体(a)35G10、(b)40A11、(c)54AD1、(d)59G10、(e)75A1和(f)7C7与表达人CD83的CHO细胞（黑线）特异性结合，但不与表达小鼠CD83的细胞（阴影线）特异性结合。(g)抗CD83抗体60B10结合表达人CD83的CHO细胞，但还显示与表达小鼠CD83的CHO细胞的交叉反应性。在亲本CHO细胞系中没有看到结合（实心灰色柱状图）。
图18显示结合表达小鼠CD83的CHO细胞的抗小鼠CD83抗体。通过流式细胞术进行的定量显示，抗CD83抗体(a)42C6和(b)39A2与表达小鼠CD83的CHO细胞（阴影线）特异性结合，但不与表达人CD83的CHO细胞（黑线）或亲本CHO细胞系（实心灰色柱状图）特异性结合。
图19显示抗CD83抗体显著减少了促炎细胞因子的产生。(a)ELISA数据分析显示，与使用同种型对照抗体(ISO)相比，抗CD83抗体60B10、35G10、40A11或7C7显著减少了MCP-1从mDCs的产生；*表明显著不同于所处理的同种型对照的值，分别为p=0.0303、p=0.0309、p=0.0369、p=0.0247。在给予54D1、59G10或75A1抗体的细胞中没有看到显著差异。(b)小鼠骨髓来源的DCs(BMDCs)中对IL-12p40表达的定量PCR分析显示，与使用同种型对照抗体相比，抗CD83抗体39A2或42C6显著减少了LPS-诱导的CD83表达。将IL-12p40表达针对β肌动蛋白进行归一化。每个符号代表来自独立小鼠的细胞。*,p=0.0372;，p=0.0438。
图20显示，抗CD83抗体保护小鼠免于DSS诱导的结肠炎。给予抗CD83抗体的小鼠与给予抗gD对照抗体或仅DSS的那些小鼠相比具有显著减少的组织学得分：39A2,均值=5.3,**表示p=0.0011;42C6,均值=5.5,表示p=0.0015;60B10,均值=5.4,*表示p=0.0059。
发明详述
I.通用技术
本文描述或参考的技术和方法一般为本领域技术人员所充分理解并通常使用常规方法，例如在以下描述的广泛采用的方法：Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual第3版(2001)Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.;Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel,等编辑,(2003));the series Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.):PCR2:A PracticalApproach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995)),Harlow和Lane,编辑(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Animal Cell Culture(R.I.Freshney,编辑(1987));Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,编辑,1984);Methods in MolecularBiology,Humana Press;Cell Biology:ALaboratory Notebook(J.E.Cellis,编辑,1998)Academic Press;AnimalCell Culture(R.I.Freshney),编辑,1987);Introduction toCell and TissueCulture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press;Cell andTissueCulture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,和D.G.Newell,编辑,1993-8)J.Wiley和Sons;Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir andC.C.Blackwell,编辑);Gene Transfer Vectors forMammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos,编辑,1987);PCR:ThePolymerase Chain Reaction,(Mullis等,编辑,1994);Current Protocols inImmunology(J.E.Coligan等,编辑,1991);Short Protocols inMolecularBiology(Wiley和Sons,1999);Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997);Antibodies(P.Finch,1997);Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.,编辑,IRL Press,1988-1989);Monoclonal Antibodies:A PracticalApproach(P.Shepherd和C.Dean,编辑,Oxford University Press,2000);Using Antibodies:A LaboratoryManual(E.Harlow和D.Lane(ColdSpring Harbor Laboratory Press,1999);TheAntibodies(M.Zanetti和J.D.Capra,编辑,Harwood Academic Publishers,1995);andCancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等,编辑,J.B.LippincottCompany,1993)。
II.定义
术语“自身免疫”指这样的过程，免疫系统组分，如抗体或淋巴细胞通过所述过程攻击或损伤产生它们的生物的分子、细胞或组织。“自身免疫性病症”指这样的疾病，其中损伤，如组织损伤或发病机理至少部分起因于自身免疫过程。例如，“自身免疫疾病”包括类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮（SLE）、狼疮性肾炎、溃疡性结肠炎、韦格纳病、炎性肠病、特发性血小板减少性紫癜（ITP）、血栓性血小板减少性紫癜（TTP）、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化症、牛皮癣、IgA肾病、IgM多发性神经病、重症肌无力、血管炎、糖尿病、雷诺氏综合征、舍格伦综合征和肾小球肾炎。在一些实施方案中，自身免疫性病症与髓样细胞激活（树突细胞和巨噬细胞），如多发性硬化症和炎性肠病相关。
“炎性肠病”或“IBD”指引起肠道发炎的一组病症，其一般表现为以下症状，包括腹部绞痛和疼痛、腹泻、体重减轻和肠道出血。IBD包括溃疡性结肠炎(UC)、克隆病和不确定性结肠炎。
“溃疡性结肠炎”或“UC”是特征为血性腹泻的大肠和直肠不定期的慢性炎性疾病。溃疡性结肠炎的特征在于结肠粘膜中具有慢性炎症并且可以根据位置分类：“直肠炎”仅在直肠中发生；“直肠乙状结肠炎”影响直肠和乙状结肠；“左半结肠炎”包括大肠的整个左半边；和“全结肠炎”使整个结肠发炎。
“克隆病”，也称为“局限性肠炎”是慢性自身免疫疾病，其可以影响胃肠道的任何部分，但最经常发生在回肠（小肠和大肠相遇的区域）。与溃疡性结肠炎相反，克隆病的特征在于慢性炎症通过肠壁的所有层扩展并涉及到肠系膜以及区域淋巴结。无论涉及小肠还是结肠，基本的病理过程是相同的。
在超过90%的情况中，溃疡性结肠炎和克隆病在临床上、内窥镜检查上、病理学上和血清学上彼此区分得开；认为剩余情况是不确定性IBD(Harrison's Principles ofInternal medicine,第12版,第1271页(1991))。
“不确定性结肠炎”指具有溃疡性结肠炎和克隆病的重叠特征的炎性肠病状况。当历史显示急性和慢性炎症，并具有局限于结肠的结构改变，但不清楚地表明个体是患有克隆病还是溃疡性结肠炎时，给出诊断。
如本文所用，术语“治疗”指设计来改变临床病理学过程中治疗的个体或细胞的天然过程的临床干预。想要的治疗效果包括降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态，和缓解或改进预后。例如，如果与自身免疫疾病（如炎性肠病）相关的一个或多个症状减轻或消除，那么成功“治疗”了个体。
如本文所用，术语“预防”包括在个体中在疾病发生或复发方面提供预防。个体可以易感染、易感自身免疫疾病，或处于发生自身免疫疾病的危险中，但还未被诊断患有该疾病。
如本文所用，“处于发生自身免疫疾病危险”的个体可以具有或可以不具有可检测的疾病或疾病症状，并且在本文所述的治疗方法之前可以具有或可以不具有所显示的可检测疾病或疾病症状。“处于危险中”表示个体具有一个或多个危险因子，其为自身免疫疾病的发生相关的可测量参数，如本领域所知。具有一个或多个这些危险因子的个体比不具有一个或多个这些危险因子的个体发生疾病的可能性更高。
“有效量”指实现想要的治疗或预防结果必需的剂量和时间内至少有效的量。可以以一次或多次施用提供有效量。
“治疗有效量”是实现特定病症（例如，自身免疫疾病）可测量改进所需要的至少最小浓度。本文中治疗有效量根据以下因素可以变化，如患者的疾病状态、年龄、性别和体重，以及抗CD83激动剂抗体在个体中激发想要应答的能力。治疗有效量还是这样的一种量，其中有益的治疗效果超过抗CD83激动剂抗体的任何有毒效果或有害效果。“预防有效量”指实现想要的预防结果必需的剂量和时间内的有效量。通常但不一定，因为在疾病之前或疾病的较早阶段在受试者中使用预防剂量，所以预防有效量可以少于治疗有效量。
“长期”施用指与急性方式相反，以连续方式施用药物，以延长时间维持初始治疗效果（活性）。“间歇”施用指这样的治疗，其不是没有间隔的连续完成，而是自然周期性的。
如本文所用，与另一种化合物或组合物“结合”施用包括同时施用和/或在不同时间施用。结合施用还包括作为共同制剂施用或作为分开组合物施用，包括以不同给药频率或间隔，和使用相同的施用途径或不同的施用途径。
为治疗或预防目的，“个体”指任何动物，其分类为哺乳动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园动物、运动动物或宠物，如狗、马、兔子、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等。在一些实施方案中，所述个体是人。
如本文所用，术语“细胞因子”在属类上指一个细胞群体释放的蛋白质，所述细胞群体作为细胞间介体作用于另外的细胞或对产生该蛋白质的细胞具有自分泌作用。此类细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子；白细胞介素(“ILs”)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17A-F、IL-18至IL-29(如IL-23)、IL-31，包括rIL-2；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β、TGF-β1-3；和其他多肽因子，包括白血病抑制因子(“LIF”)、睫状节神经营养因子(“CNTF”)、CNTF-样细胞因子(“CLC”)、心脏营养素(“CT”)和kit配体(“KL”)。
如本文所用,术语“CD83”包括天然序列CD83和CD83的天然存在的变体。可以从多种来源，如哺乳动物（包括人）组织类型或另一来源分离CD83，或通过重组和/或合成方法制备CD83。
如本文所用,术语“抗CD83激动剂抗体”指结合在细胞表面上表达的CD83并在结合细胞表面上表达的CD83后激活CD83的信号转导的抗体。
术语“免疫球蛋白”(Ig)与本文中的“抗体”互换使用。本文中以最广泛意义使用术语“抗体”并且其特异地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、从至少两个完整抗体形成的多特异性抗体（例如双特异性抗体），和抗体片段，
只要它们显示想要的生物学活性。
基本的4链抗体单位是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。VH和VL的配对一起形成单一抗原结合位点。对于不同种类的抗体的结构和性质，参见例如Basic and Clinical Immunology,第8版,Daniel P.Stites,Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编辑),Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994，第71页和第6章。
来自任何脊椎动物物种的L链可以基于它们恒定域的氨基酸序列被分派为两个明显不同类型中的一种，称为kappa(“κ”)和lambda(“λ”)。根据它们的重链(CH)恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被分派为不同的种类或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有被命名为alpha(“α”)、delta(“δ”)、epsilon(“ε”)、gamma(“γ”)和mu(“μ”)的重链。基于CH序列和功能方面的相对小的差异，γ和α类被进一步分成亚类（同种型），例如，人类表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的并一般描述于例如Abbas等,Cellular and MolecularImmunology,第4版(W.B.Saunders Co.,2000)中。
“天然抗体”一般是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的约150,000道尔顿异四聚体糖蛋白。每条轻链与重链通过一个共价二硫键连接，而二硫键的数量在不同免疫球蛋白同种型的重链之间是变化的。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有可变域(VH)，随后是许多恒定域。每条轻链在一端具有可变域(VL)，在其另一端具有恒定域；所述轻链的恒定域与重链的第一个恒定域排列，轻链可变域与重链可变域排列。相信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变域之间形成界面。
“分离的”抗体是已经从其产生环境的组分中鉴定、分离和/或回收（例如天然地或重组地）的一种抗体。优选地，所述分离的多肽不与其产生环境的所有其他污染物组分结合。来自其产生环境的污染物组分，如源自重组转染细胞的那些污染物组分是这样的材料，其通常会干扰抗体的研究、诊断或治疗用途，并且可以包括酶、激素和其他蛋白性或非蛋白性溶质。在优选的实施方案中，多肽将被纯化为：（1）例如通过Lowry方法测定，超过抗体的95重量%，并且在一些实施方案中，超过99重量%；（2）用转杯式蛋白测序仪，达到足以获得N-末端或内部氨基酸序列至少15个残基的程度，或（3）使用考马斯蓝或优选银染色，达到在非-还原或还原条件下SDS-PAGE电泳同质性的程度。分离的抗体包括重组T细胞内的原位抗体，因为不会存在抗体天然环境的至少一种组分。然而通常，通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽或抗体。
抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变域可以分别称为“VH”和“VL”。这些结构域一般是抗体的最可变部分（相对于其他同类抗体）并含有抗原结合位点。
术语“可变的”指这样的事实，即可变域的某些区段在抗体序列上广泛不同。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对特定抗原的特异性。然而，可变性在可变域的全长范围内并不平均分布。的确，其富集于轻链和重链可变域中称为高变区(HVRs)的三个区段中。可变域更加高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，大多采取β-折叠构型，通过三个HVRs连接，所述HVRs形成环形连接，并且在一些情况下形成部分β-折叠结构。每条链中的HVRs通过FR区紧密邻近地结合在一起，并与来自另一条链的HVRs促进形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等,Sequences of ImmunologicalInterest,第5版,NationalInstitute of Health,Bethesda,MD(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但是显示出多种效应功能，如抗体参与对抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。
如本文所用，术语“单克隆抗体”指是从基本上均一的抗体群体中获得的抗体，即包含群体的单个抗体是相同的，除了少量存在的可能的天然存在突变和/或翻译后修饰（例如，异构化、酰胺化）。单克隆抗体对单一的抗原位点有高度的特异性。与通常包括针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性，单克隆抗体的优点还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不受其他免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本均一的抗体群体中获得的特性，并且不应该解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。例如，可以通过多种技术来制备待根据本发明使用的单克隆抗体，
所述技术包括例如杂交瘤方法(例如，Kohler和Milstein.,Nature,256:495-97(1975);Hongo等,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow等,Antibodies:A LaboratoryManual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988);Hammerling等,Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如，Clackson等,Nature,352:624-628(1991);Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA101(34):12467-472(2004);和Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004),和用于在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人或人样抗体的技术(参见例如，WO1998/24893;WO1996/34096;WO1996/33735;WO1991/10741;Jakobovits等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA90:2551(1993);Jakobovits等,Nature362:255-258(1993);Bruggemann等,Year in Immunol.7:33(1993);美国专利号5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;和5,661,016;Marks等,Bio/Technology10:779-783(1992);Lonberg等,Nature368:856-859(1994);Morrison,Nature368:812-813(1994);Fishwild等,NatureBiotechnol.14:845-851(1996);Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996);和Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995).
术语“裸抗体”指不与细胞毒性部分或放射性标记缀合的抗体。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“整个抗体”互换使用，指基本完整形式的抗体，与抗体片段相反。特异性的整个抗体包括具有重链和轻链，包括Fc区的那些抗体。恒定域可以是天然序列恒定域（例如，人天然序列恒定域）或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可以具有一种或多种效应功能。
“抗体片段”包含完整抗体的部分，优选完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体（参见美国专利5,641,870,实施例2;Zapata等,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995)）；单链抗体分子和从抗体片段形成的多特异性抗体。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，和剩余的“Fc”片段，该命名反映了容易结晶的能力。所述Fab片段由完整L链与H链的可变区结构域(VH)以及一条重链的第一个恒定域(CH1)一起组成。每个Fab片段在抗原结合方面是单价的，即其具有单一的抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生单一的大F(ab')2片段，其大致对应于具有不同抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段并且仍然能够交联抗原。Fab'片段通过在CH1结构域的羧基末端具有一些额外的残基（包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸）而不同于Fab片段。Fab'-SH在本文中是对Fab'的命名，其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离的巯基。F(ab')2抗体片段开始产生为Fab'片段对，其在它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
Fc片段包含通过二硫键连接在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应功能由Fc区中的序列决定，所述区域还被在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密非共价结合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠发射出六个高变环（从H和L链各自发射出3个环），其贡献了用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗原对抗体的结合特异性。然而，即使单个可变域（或仅包含对抗原特异的三个HVRs的Fv的一半）也具有识别并结合抗原的能力，尽管比完整结合位点的亲和力低。
“单链Fv”还缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接单条多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，所述sFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得sFv能够形成用于抗原结合的想要的结构。对于sFv的综述，参见Pluckthun，The Pharmacology ofMonoclonalAntibodies,第114卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,NewYork,第269-315页(1994)。
本发明抗体的“功能片段”包含完整抗体的部分，一般包括完整抗体的抗原结合或可变区或抗体的F区，其保留或具有改变的FcR结合能力。抗体片段的实例包括线性抗体、单链抗体分子和从抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“双抗体”指通过这样的过程制备的小抗体片段，其中在VH和VL结构域之间构建具有短接头（约5-10个）残基的sFv片段（参见上文段落），以便实现V结构域的链间配对，而非链内配对，由此产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。例如在EP404,097;WO93/11161;Hollinger等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA90:6444-48(1993)中更详细地描述了双抗体。
本文的单克隆抗体特异地包括“嵌合”抗体（免疫球蛋白），其中重链和/或轻链的部分与来自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列同一或同源，同时链的剩余部分与来自另外物种或属于另外抗体种类或亚类的抗体中的相应序列以及此类抗体的片段同一或同源，只要它们显示想要的生物学活性(美国专利号4,816,567;Morrison等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA,81:6851-55(1984))。本文的目的嵌合抗体包括抗体，其中抗体的抗原结合区来自通过例如用目的抗原免疫猕猴而产生的抗体。如本文所用，“人源化抗体”用作“嵌合抗体”的亚组。
非人（例如，鼠类）抗体的“人源化”形式是含有来自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白（受体抗体），其中来自受体的HVR的残基被来自非人物种（供体抗体），如小鼠、大鼠、兔子或非人灵长类的HVR的残基所替换，具有想要的特异性、亲和力和/或能力。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基所替换。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。可以进行这些修饰，以进一步限定抗体性能，如结合亲和力。一般而言，人源化抗体会包含基本上所有至少一个，通常两个可变域，其中所有的或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白序列的那些，并且所有的或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的那些，尽管FR区可以包括一个或多个单个FR残基取代，其改进抗体性能，如结合亲和力、异构化、免疫原性等。FR中这些氨基酸取代的数量在H链中通常不超过6个，在L链中不超过3个。人源化抗体任选地还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。对于其他细节，参见例如Jones等,Nature321:522-525(1986);Riechmann等,Nature332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见例如，Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998);Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995);Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994);和美国专利号6,982,321和7,087,409。
“人抗体”是具有对应于人产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的和/或已经使用制备本文公开的人抗体的任何技术制备的一种抗体。人抗体的这种定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的多种技术，包括噬菌体展示文库产生人抗体。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991);Marks等,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。还可用于制备人单克隆抗体的是在Cole等,Monoclonal AntibodiesandCancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985);Boerner等,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)中描述的方法。还参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)。可以通过向转基因动物施用抗原制备人抗体，已经修饰了所述转基因动物以产生应答抗原攻击的此类抗体，但是其内源基因座已经失效，例如经免疫的xenomice(对于XENOMOUSETM技术，参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584)。对于通过人B细胞杂交瘤技术产生人抗体，还参见例如Li等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
当用于本文时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”指在序列上高变的和/或形成结构上限定的环的抗体可变域的区域。一般地，抗体包含六个HVRs；三个在VH(H1、H2、H3)中，三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展示了六个HVRs的最大多样性，并且尤其认为H3在赋予抗体精细特异性上具有独特作用。参见例如Xu等,Immunity13:37-45(2000);Johnson和Wu，Methods in Molecular Biology248:1-25(Lo,编辑,Human Press,Totowa,NJ,2003))。的确，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在缺少轻链时是有功能且稳定的。参见例如Hamers-Casterman等,Nature363:446-448(1993)和Sheriff等,NatureStruct.Biol.3:733-736(1996)。
在本文中使用并包括许多HVR的划定。HVRs（其为Kabat互补决定区(CDRs)）基于序列变异性并且是最常用的(Kabat等,上文)。Chothia改为指结构环的位置(Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVRs代表Kabat CDRs和Chothia结构环之间的折衷，并且为Oxford Molecular's AbM抗体建模软件所用。“接触的”HVRs基于可用复杂晶体结构的分析。在下文中指出了来自每一个这些HVRs的残基。
HVRs可包含如下“延伸的HVRs”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)，和89-97或89-96(L3)以及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65（优选实施方案）(H2)，和93-102、94-102或95-102(H3)。对于每个这些延伸的HVR定义，根据Kabat等（上文）对可变域残基进行编号。
“构架”或“FR”残基为除本文定义的HVR残基以外的可变域残基。
短语“如Kabat的可变域残基编号”或“如Kabat的氨基酸位点编号”及其变型指Kabat等（上文）中用于抗体编译的重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用该编号系统，事实上线性的氨基酸序列相应于对可变域的FR或HVR的截短或插入可含有更少的或额外的氨基酸。例如，重链可变域可包括H2的残基52后的单个氨基酸插入(根据Kabat为残基52a)以及重链FR残基82后插入的残基(例如根据Kabat为残基82a,82b和82c等)。对于给定的抗体，可通过将该抗体序列的同源性区域与“标准的”Kabat编号序列进行比对来确定残基的Kabat编号。
Kabat编号系统一般在提及可变域中的残基(轻链的大约残基1-107以及重链的残基1-113)时使用(例如，Kabat等，Sequences ofImmunological Interest，第五版，PublicHealth Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。“EU编号系统”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如，Kabat等，上文中报道的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号。除非本文另有说明，抗体可变域中的残基编号的参考指通过Kabat编号系统的残基编号。除非本文另有说明，抗体恒定域中的残基编号的参考指通过EU编号系统的残基编号（例如，参见美国临时申请号60/640,323,EU编号的图）。
如本文所用，“受者人构架”是这样的构架，其包含来自人免疫球蛋白构架或人共有构架的VL或VH构架的氨基酸序列。“来自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的受者人构架可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以含有预先存在的氨基酸序列改变。在一些实施方案中，预先存在的氨基酸改变的数量是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少或2个或更少。在VH中存在预先存在的氨基酸改变时，优选那些改变仅在位置71H、73H和78H中的三个、两个或一个上发生；例如，那些位置上的氨基酸残基可以是71A、73T和/或78A。在一个实施方案中，VL受者人构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。
“人共有构架”为代表一组人免疫球蛋白VL或VH构架序列中最常出现的氨基酸残基的构架。一般地，所述组的人免疫球蛋白VL或VH序列来自可变域序列的亚组。一般地，序列亚组为如Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中的亚组。对于VL，实例包括亚组可以是如Kabat等（上文）中的kappa I、kappa II、kappa III或kappa IV亚组。此外，对于VH，亚组可以是如Kabat等（上文）中的亚组I、亚组II或亚组III。
“VH亚组III共有构架”包含从Kabat等（上文）的可变重链亚组III中的氨基酸序列获得的共有序列。
“VL亚组I共有构架”包含从Kabat等（上文）的可变轻链kappa亚组I中的氨基酸序列获得的共有序列。
例如Fc区指定位置上的“氨基酸修饰”指指定残基的取代或缺失，或在指定残基邻近至少一个氨基酸残基的插入。指定残基“邻近的”插入表示插入其一个或两个残基内。所述插入可以是指定残基的N末端或C末端。本文中的优选氨基酸修饰是取代。
“亲和力成熟的”抗体是这样的一种抗体，在其一个或多个HVRs中具有一个或多个改变，导致与不具有这些改变的亲本抗体相比，所述抗体对抗原的亲和力改善。在一个实施方案中，亲和力成熟的抗体对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。可通过本领域已知的方法产生亲和力成熟的抗体。例如，Marks等,Bio/Technology10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。例如Barbas等Proc Nat.Acad.Sci.USA91:3809-3813(1994);Schier等Gene169:147-155(1995);Yelton等J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson等,J.Immunol.154(7):3310-9(1995);和Hawkins et al,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)描述了HVR和/或构架残基的随机诱变。
如本文所用，术语“特异性结合”或“特异的”指可测量的和可重复的相互作用，如靶标与抗体之间的结合，其决定在存在分子（包括生物分子）的异质群体时靶标的存在。例如，特异性结合靶标（其可以是表位）的抗体是以比其结合其他靶标更高亲和力、亲合力、更稳定和/或更长持续时间结合该靶标。在一个实施方案中，例如通过放射性免疫测定(RIA)所测定，抗体与不相关靶标的结合程度低于抗体与靶标结合程度的约10%。在某些实施方案中，特异性结合靶标的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗体特异性结合在来自不同物种的蛋白质之间保守的蛋白质上的表位。在另一实施方案中，特异性结合可以包括，但不需要排除性结合。
本文中术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，包括天然序列的Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区边界可能变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为从位置Cys226，或从Pro230上的氨基酸残基向其羧基末端的延伸。例如在抗体产生或纯化过程中，或通过重组改造编码抗体重链的核酸来去除Fc区的C末端赖氨酸（对应于EU编号系统的残基447）。因此，完整抗体的组成可以包含去除了所有K447残基的抗体群体、没有去除K447残基的抗体群体，和具有和没有K447残基的抗体混合物的抗体群体。用于本发明抗体的合适的天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
“天然序列Fc区”包含与天然发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区（非A和A同种异型）；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；和天然序列人IgG4Fc区及其天然存在的变体。
“变体Fc区”包含这样的氨基酸序列，其通过至少一个氨基酸修饰，优选一个或多个氨基酸取代而不同于天然序列Fc区。优选地，变体Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中约1个-约10个氨基酸取代，并优选约1个-约5个氨基酸取代。本文中变体Fc区优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约80%同源性，并且最优选与其具有至少约90%同源性，更优选与其具有至少约95%同源性。
“结合亲和力”一般指分子（例如，抗体）的单一结合位点与其结合配偶体（例如，抗原）之间非共价相互作用的总强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”指反映结合配对成员（例如抗体与抗原）之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力一般由解离常数（“Kd,”参见下文）表示。可以通过本领域已知的常见方法，包括本文描述的那些方法测定亲和力。低亲和力抗体一般缓慢结合抗原并倾向于容易地解离，然而高亲和力抗体一般更快地结合抗原并倾向于保持更久的结合。测定结合亲和力的多种方法为本领域所知，任何所述方法可以用于本发明目的。在下文中描述了用于测定结合亲和力的特定说明性和示例性实施方案。
在一个实施方案中，通过放射标记的抗原结合测定(RIA)来测定本发明的“Kd”或“Kd值”，所述放射标记的抗原结合测定利用如下文测定描述的目的抗体的Fab版本及其抗原进行。通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况下利用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后利用抗Fab抗体包被的平板捕获结合的抗原来测定Fabs对抗原的溶液结合亲和力（参见例如，Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)）。为了建立用于测定的条件，用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕获性抗Fab抗体(Cappel Labs,Cochranville,PA)过夜包被微量滴定板(DYNEX Technologies,Inc.,Chantilly,VA)，随后用PBS中的2%(w/v)牛血清白蛋白在室温（大约23℃）下封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc#269620,NalgeNuncInternational,Rochester,NY)中，100pM或26pM[125I]抗原与目的Fab的连续稀释液混合（例如，与抗VEGF抗体、Fab-12的评价一致，Prestaet al.,Cancer Res.57:4593-4599(1997)）。目的Fab然后温育过夜；然而，温育可以持续更长时间（例如，约65小时），以保证达到平衡。然后，将混合物转移到捕获平板中，用于在室温下温育（例如，1小时）。然后去除溶液，并利用PBS中的0.1%TWEEN-20TM表面活性剂洗涤平板8次。当平板已经干燥时，加入150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20TM;Packard)，并在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上对平板进行计数10分钟。选择产生少于或等于20%最大结合的每一Fab的浓度用于竞争结合测定。
根据另一实施方案，通过使用表面等离振子共振测定用-2000或-3000仪器(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃下用～10应答单位(RU)的固定化抗原CM5芯片测定Kd。简言之，根据供应商说明书用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIAcore Inc.)。在以5μl/分钟的流速注射之前，用10mM乙酸钠,pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，以实现偶联蛋白的大约10个应答单位(RU)。注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测定，将在含有0.05%TWEEN20TM表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)在25℃下以大约25μl/分钟的流速注射。使用简单的一对一Langmuir结合模型(Evaluation Software3.2版)通过同时拟合结合和解离感应图来计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon的比值。参见例如，Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上文的表面等离振子共振测定的结合速率超过106M-1s-1，那么通过使用荧光淬灭技术确定所述结合速率，所述荧光淬灭技术在存在增加浓度的抗原的情况下测定PBS,pH7.2中20nM抗-抗原抗体(Fab形式)在25℃下荧光发射强度（激发=295nm；发射=340nm,16nm带通）的增加或降低，在分光计，如断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic,Madison,WI)中利用搅拌杯测定所述抗原的增加浓度。
还可以如上所述使用-2000或-3000系统(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)测定本发明的“结合速率”、“结合的速率”、“结合速率”或“kon”。
编码本文的抗体的“分离的”核酸分子是从至少一种污染性核酸分子中鉴定并分离的核酸分子，其在产生它的环境中通常与所述污染性核酸分子结合。优选地，所述分离的核酸不与结合产生环境的所有组分结合。编码本文的多肽和抗体的分离的核酸分子是除在自然界中发现它们的形式或环境以外的形式。分离的核酸分子因而与编码细胞中天然存在的本文的多肽和抗体的核酸区分开。
如本文所用，术语“载体”旨在表示能够转运其已经连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，指环形双链DNA，其中可以连接额外的DNA区段。另一类型的载体是噬菌体载体。另一类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在导入它们的宿主细胞中自主复制（例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体）。其他载体（例如非附加体哺乳动物载体）可以在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起进行复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。本文中此类载体称为“重组表达载体”，或简单地“表达载体”。一般而言，在重组DNA技术中利用的表达载体经常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。
如在本文中互换使用的“多核苷酸，”或“核酸”指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸及其类似物。若存在，可以在聚合物组装之前或之后给予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以由非核苷酸组分所隔断。多核苷酸可以包含合成后进行的一种或多种修饰，如缀合标记。其他类型的修饰包括：例如“帽”，用类似物取代一种或多种天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰，如例如具有不带电荷的键的那些（例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等）和带电荷的键的那些（例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）、含有侧基的那些，如例如蛋白质（例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等），具有嵌合剂（例如吖啶、补骨脂素（psoralen）等）的那些，含有螯合剂（例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等）的那些、含有烷化剂的那些、具有修饰的键（例如α异头核酸，等）的那些，以及多核苷酸的未修饰形式。此外，通常存在于糖中的任何羟基例如可以由膦酸基、磷酸基替换，受标准保护基团保护，或者被活化以制备与额外核苷酸的额外连接，或者可以与固态或半固态支持物缀合。5’和3’末端OH可以被磷酸化或被胺或1-20个碳原子的有机帽化基团部分取代。其他羟基还可以衍生为标准保护基团。多核苷酸还可以包含本领域一般已知的核糖或脱氧核糖糖类的类似形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基-、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖，如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、非环类似物和碱性核苷酸类似物，如甲基核苷。一种或多种磷酸二酯键可以被备选连接基团替换。这些备选连接基团包括但不限于这样的实施方案，其中磷酸酯被P(O)S
(“硫代酯（thioate）”)、P(S)S(“二硫代酯（dithioate）”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“formacetal”)替换，其中每一R或R’独立地为H或任选含有醚(-O-)键的取代的或未取代的烃基(1-20C)、芳基、链烯基、环烷基、环烯基或芳烷基（araldyl）。多核苷酸中的所有键不需要完全相同。前面的描述应用于本文所指的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
如本文所用，“寡核苷酸”一般指短的、一般为单链的、一般为合成的多核苷酸，其长度一般但并不必少于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。上文对多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。
如本文所用，“载体”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，其在所应用的剂量和浓度下对暴露其中的细胞或哺乳动物是无毒的。通常生理学上可接受的载体是pH缓冲的水溶液。生理学上可接受的载体的实例包括缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量（小于约10个残基）多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖、和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨醇；形成盐的抗衡例子如钠；和/或非离子型表面活性剂如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
“包装插页”指通常包括在药物的商业包装中的说明书，其含有关于通常包括在药物的商业包装中的指示信息，其含有关于此类药物的适应征、用法、剂量、施用、禁忌症、与该包装产品组合的其它药物和/或警告等的信息。
“药学上可接受的酸”包括无机酸和有机酸，其在配制它们的浓度和方式下是无毒的。例如，合适的无机酸包括盐酸、高氯酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸、磺酸、亚磺酸、对氨基苯磺酸、磷酸、碳酸等。合适的有机酸包括直链和支链烷基、芳族、环状、环脂族、芳基脂族、杂环、饱和、不饱和、单、二-和三-羧酸，包括例如甲酸、乙酸、2-羟基乙酸、三氟乙酸、苯乙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、邻氨基苯甲酸、丙酸、2-羟基丙酸、2-氧丙酸、丙二酸、环戊烷丙酸（cyclopentanepropionic）、环戊烷丙酸（cyclopentane propionic）、3-苯基丙酸、丁酸、丁二酸（butandioic）、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、抗坏血酸、肉桂酸、月桂基硫酸、硬脂酸、粘康酸、扁桃酸、琥珀酸、双羟萘酸、富马酸、苹果酸、马来酸、羟基马来酸、丙二酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、乙醇酸、葡糖酸（glyconic）、葡糖酸（gluconic）、丙酮酸、乙醛酸、草酸、甲磺酸、琥珀酸、水杨酸、邻苯二甲酸、棕榈酸（palmoic）、棕榈酸（palmeic）、硫氰酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸（4-chorobenzenesulfonic）、萘-2-磺酸（napthalene-2-sulphonic）、对甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基二环[2.2.2]-辛-2-烯-1-甲酸、葡庚糖酸、4,4'-亚甲基双-3-(羟基-2-烯-1-甲酸)、羟基萘酸。
“药学上可接受的碱”包括无机碱和有机碱，其在配制它们的浓度和方式下是无毒的。例如，合适的碱包括从形成无机碱的金属形成的那些，如锂、钠、钾、镁、钙、铵、铁、锌、铜、锰、铝、N-甲基葡萄糖胺、吗啉、哌啶，和有机无毒碱，包括伯胺、仲胺、叔胺、取代胺、环胺，和碱性离子交换树脂，[例如,N(R’)4 +(其中R’独立地为H或C1-4烷基,例如，铵、Tris)]例如，异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙氨基乙醇、三甲胺（trimethamine）、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明（hydrabamine）、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。特别优选的有机无毒碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。
可用于本发明的额外的药学上可接受的酸和碱包括来自氨基酸例如组氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和天冬酰胺的那些。
“药学上可接受的”缓冲剂和盐包括来自上述说明的酸和碱的酸和碱加成盐的那些。具体的缓冲剂和/或盐包括组氨酸、琥珀酸盐和乙酸盐。
“药学上可接受的糖”是这样的分子，其当与目的蛋白质组合时，明显防止或降低在储存时蛋白质的化学和/或物理不稳定性。当制剂旨在冻干并随后重构时，“药学上可接受的糖”还可以称为“冻干保护剂”。示例性的糖及其对应的糖醇包括：氨基酸如谷氨酸单钠或组氨酸；甲胺如甜菜碱；易溶的盐如硫酸镁；多元醇如三羟的或更高分子量的糖醇，例如甘油（glycerin）、葡聚糖、赤藓醇、甘油（glycerol）、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇、甘露糖醇；丙二醇；聚乙二醇；；及其组合。额外的示例性冻干保护剂包括甘油和明胶，以及糖蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水苏糖。还原糖的实例包括葡萄糖、麦芽糖、乳糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖和乳果糖。非还原糖的实例包括选自糖醇和其他直链多元醇的多羟基化合物的非还原糖苷。优选的糖醇是单糖苷，尤其是通过还原二糖如乳糖、麦芽糖、乳果糖和麦芽酮糖获得的那些化合物。糖苷侧基可以是糖苷或半乳糖苷。糖醇的额外实例是葡糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇和异麦芽酮糖。优选的药学上可接受的糖是非还原糖海藻糖或蔗糖。将药学上可接受的糖以“保护性量”（例如冻干前）加入制剂中，其表示蛋白质在储存过程中（例如在重构和储存后）基本上保持它的物理和化学稳定性和完整性。
本文的目的“稀释剂”是这样的稀释剂，其是药学上可接受的（对于向人施用是安全且无毒的），并且用于制备液体制剂，如冻干后重构的制剂。示例性的稀释剂包括无菌水、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液（例如，磷酸缓冲盐溶液）、无菌盐溶液、林格溶液或葡萄糖溶液。在备选实施方案中，稀释剂可以包括盐的水溶液和/或缓冲液。
“防腐剂”是这样的化合物，可以将其加入本文的制剂中以降低细菌活性。加入防腐剂例如可以促进产生多用途（多剂量）制剂。可能的防腐剂的实例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲二铵、苯扎氯铵（氯化烷基苄基二甲基铵的混合物，其中烷基基团为长链化合物）和苄索氯铵。其他类型的防腐剂包括芳香醇如苯酚、丁醇和苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚。本文最优选的防腐剂是苯甲醇。
术语“药物制剂”指这样的制剂，其形式允许活性成分的生物学活性有效且不含有对施用该制剂的受试者产生不可接受的毒性的额外成分。此类制剂是无菌的。
“无菌”制剂是无菌的或不含所有活的微生物及其孢子。
如本文所用，术语“约”指本技术领域的技术人员容易已知的各个值的通常误差范围。本文中“约”值或参数的参考包括（并且描述了）针对值或参数本身的实施方案。
如本文所用并且在所附权利要求书中，单数形式“a,”“an,”和“the”包括复数参考，除非上下文另有明确指出。例如，“抗体”的参考是参考来自一个至许多抗体，如摩尔量的抗体，并包括本领域技术人员已知的其等同物等。
应理解，本文描述的本发明的方法和实施方案包括“包含”、“由……组成”和“基本上由……组成”的方面和实施方案。
III.本发明的组合物和方法
本发明提供了用于在个体中治疗或预防自身免疫疾病（如炎性肠病）的方法，其包括向个体施用有效量的本文所述的抗CD83激动剂抗体。在一些实施方案中，向个体施用有效量的抗CD83激动剂抗体用于在所述个体中治疗或预防溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，向个体施用有效量的抗CD83激动剂抗体用于在所述个体中治疗或预防克隆病。在一些实施方案中，向个体施用有效量的抗CD83激动剂抗体用于在所述个体中治疗或预防不确定性结肠炎。
关于本文描述的所有方法，抗CD83激动剂抗体的参考还包括包含一种或多种那些试剂的组合物。此类组合物还包含合适的赋形剂，如药学上可接受的赋形剂（载体），包括缓冲剂、酸、碱、糖、稀释剂、防腐剂等，其为本领域所熟知并且在本文中有描述。本发明的方法可单独使用或与其他常规治疗方法组合使用。
A.抗CD83激动剂抗体
本发明的方法使用抗CD83激动剂抗体，所述术语指结合细胞表面上表达的CD83并在结合细胞表面上表达的CD83（如成熟树突细胞的细胞表面上表达的CD83）后激活CD83介导的信号转导的抗CD83抗体。本文描述的抗CD83激动剂抗体具有一种或多种以下特性：（a）抑制成熟树突细胞中的MAPK信号传导的激活（如引起成熟树突细胞中p38和CREB蛋白质的磷酸化的降低）；（b）抑制成熟树突细胞中的mTOR信号转导的激活（如引起成熟树突细胞中mTOR蛋白质的磷酸化的降低）；（c）抑制一种或多种促炎细胞因子（如MCP-1、IL-12p40）从成熟树突细胞中的释放；（d）诱导一种或多种抗炎细胞因子（如IL-1ra）从成熟树突细胞中的释放；（e）诱导成熟树突细胞激活标志物（如CD83、HLA-DR）的细胞表面表达的降低；（f）上调成熟树突细胞中一个或多个创伤愈合基因（如vcan、spock2和fbn2）的表达；和（g）治疗和/或预防自身免疫疾病（如IBD）。可在体外和/或体内测定抗CD83激动剂抗体的活性。
可以使用本领域已知的方法产生抗CD83抗体，并筛选本文描述的一种或多种激动剂活性。参见例如，实施例9中描述的方法。
在一些实施方案中，抗CD83抗体特异性结合人CD83的细胞外区域。
在一些实施方案中，人CD83包含来自
MSRGLQLLLLSCAYSLAPATPEVKVACSEDVDLPCTAPWDPQVPYTVSWVKLLEGGEERMETPQEDHLRGQHYHQKGQNGSFDAPNERPYSLKIRNTTSCNSGTYRCTLQDPDGQRNLSGKVILRVTGCPAQRKEETFKKYRAEIVLLLALVIFYLTLIIFTCKFARLQSIFPDFSKAGMERAFLPVTSPNKHLGLVTPHKTELV(SEQ ID NO:1)的成熟氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD83抗体特异性结合包含
TPEVKVACSEDVDLPCTAPWDPQVPYTVSWVKLLEGGEERMETPQEDHLRGQHYHQKGQNGSFDAPNERPYSLKIRNTTSCNSGTYRCTLQDPDGQRNLSGKVILRVTGCPAQRKEETFKK(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是分离的抗体。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，抗体是抗体片段，如Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或(Fab’)2。
在一些实施方案中，抗CD83抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVRs，其选自(a)含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的
HVR-H1；(b)含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗CD83抗体包含六个HVRs，其包含(a)含有SEQID NO:31的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQ IDNO:38的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗CD83抗体包含至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列，其选自(a)含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体包含含有SEQ IDNO:33的氨基酸序列的HVR-H3。在另一实施方案中，所述抗体包含含有SEQID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3和含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3。在其他实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3、含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H2。在其他实施方案中，所述抗体包含(a)含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQID NO:32的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，抗CD83抗体包含至少一个、至少两个、或全部三个VL HVR序列，其选自(a)含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗CD83抗体包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个VHHVR序列的VH结构域和(b)包含至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列的VL结构域，所述VH HVR序列选自(i)含有SEQ IDNO:31的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)含有选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3，所述VL HVR序列选自(i)含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗CD83抗体包含(a)含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗CD83抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗CD83抗体包含如上述实施方案任何项中的HVRs，并进一步包含受者人构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。
在一些实施方案中，提供抗CD83抗体，其中所述抗体包含与SEQ IDNO:30的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH序列相对于参照序列含有取代（例如，保守取代）、插入或缺失，但包含所述序列的抗CD83抗体保留结合CD83的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:30中已经取代、插入和/或缺失总共1-10个氨基酸。在某些实施方案中，在HVRs外的区域（即FRs）中发生取代、插入或缺失。任选地，抗CD83抗体包含SEQ ID NO:30中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个HVRs，其选自：(a)含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，提供抗CD83抗体，其中所述抗体包含与SEQ IDNO:36的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列相对于参照序列含有取代（例如，保守取代）、插入或缺失，但包含所述序列的抗CD83抗体保留结合CD83的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:36中已经取代、插入和/或缺失总共1-10个氨基酸。在某些实施方案中，在HVRs外的区域（即FRs）中发生取代、插入或缺失。任选地，抗CD83抗体包含SEQ ID NO:36中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个HVRs，其选自：(a)含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，提供抗CD83抗体，其中所述抗体包含如上文提供的实施方案任何项中的VH和如上文提供的实施方案任何项中的VL。在一个实施方案中，所述抗体分别包含SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:36中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:29中显示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:35中显示的轻链氨基酸序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，本文提供的是与本文描述的任一抗体竞争性结合人CD83的抗CD83抗体。在某些实施方案中，可以使用ELISA测定确定竞争性结合。例如，在某些实施方案中，提供与抗CD83抗体竞争性结合人CD83的抗体，所述抗CD83抗体包含SEQ ID NO:30的VH序列和SEQID NO:36的VL序列。在某些实施方案中，提供与抗CD83抗体竞争性结合人CD83的抗体，所述抗CD83抗体包含SEQ ID NO:29中显示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:35中显示的轻链氨基酸序列。
抗体对靶抗原CD83可以具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。在某些实施方案中，抗体的Kd是约0.05-约100nM。例如，抗体的Kd是约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM或约50pM的任何一个至约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM或约40pM的任何一个。
B.重组制备抗CD83激动剂抗体
本发明还提供使用重组技术产生抗CD83激动剂抗体的方法。例如，可以使用编码此类抗体或其片段的分离的核酸、包含此类核酸的载体和宿主细胞制备多肽。尽管在B部分描述的方法一般涉及产生抗体，但这些方法也可以用于产生本文描述的任何多肽。
为了重组产生抗体或其片段，分离编码想要的抗体或抗体片段的核酸并将其插入到可复制载体中用于进一步的克隆（DNA的扩增）或用于表达。使用常规方法可以容易地分离（例如，利用特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针）和测序编码多克隆或单克隆抗体的DNA。许多克隆和/或表达载体是可以通过商业途径获得的。载体组分一般包括，但不限于以下中的一个或多个：信号序列、复制起始区、一个或多个标志物基因、含有用作许多限制性内切核酸酶的识别序列的多克隆位点、增强子元件、启动子和转录终止序列。
(1)信号序列组分
不仅可以直接重组产生抗体或其片段，还可以产生为融合蛋白质，其中所述抗体与异源多肽，优选信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N末端具有特异性切割位点的其他多肽融合。所选的异源信号序列优选是真核宿主细胞识别并加工（即，被信号肽酶切割）的一种信号序列。对于不识别和加工天然的哺乳动物信号序列的原核宿主细胞，真核（即哺乳动物）信号序列被选自碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II基因的前导序列的原核信号序列替换。对于酵母分泌，天然的信号序列可以被例如酵母转化酶前导序列、因子前导序列（包括酵母（Saccharomyces）和克鲁维酵母（Kluyveromyces）因子前导序列）、或酸性磷酸酶前导序列、白色念珠菌（C.albicans）葡萄糖淀粉酶前导序列、或在WO90/13646中描述的信号序列替换。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯性疱疹病毒gD信号序列是可用的。
该前体区的DNA框内连接编码抗体或其片段的DNA。
(2)复制起点
表达载体和克隆载体均含有使得载体能够在一个或多个所选宿主细胞中复制的核酸序列。一般地，在克隆载体中该序列是这样的一种序列，其使得载体能够不依赖宿主染色体DNA而复制，并且包括复制起点或自主复制序列。此类序列对于多种细菌、酵母和病毒而言是众所周知的。质粒pBR322的复制起点适合于革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而多种病毒起点（SV40、多瘤、腺病毒、水泡性口炎病毒(“VSV”)或牛乳头状瘤病毒(“BPV”)）用作哺乳动物细胞中的克隆载体。一般地，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分（通常仅使用SV40起点，因为其含有早期启动子）。
(3)选择基因组分
表达载体和克隆载体还可以含有选择基因，称为选择标志物。典型的选择基因编码这样的蛋白质，其(a)赋予针对抗生素或其他毒素，例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素的抗性，(b)补足营养缺陷，或(c)提供不能从复合培养基中得到的重要营养素，例如编码芽孢杆菌（Bacilli）的D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个实例利用药物来阻止宿主细胞的生长。成功转化有异源基因的那些细胞产生赋予药物抗性的蛋白质并因此在选择方案中存活。此类优势选择策略的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
用于哺乳动物细胞的合适选择标志物的另一实例是使得能够鉴定细胞的那些标志物，所述细胞为感受态以吸收抗体或抗体片段编码核酸，如二氢叶酸还原酶(“DHFR”)、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II，优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，首先通过在含有氨甲喋呤(Mtx)（DHFR的竞争性拮抗剂）的培养基中培养所有转化体来鉴定转化有DHFR选择基因的细胞。野生型DHFR使用的示例性宿主细胞菌株是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞系（例如，ATCC CRL-9096）。
用于哺乳动物细胞的合适的选择标志物的另一实例是使得能够鉴定细胞的那些标志物，所述细胞为感受态以吸收抗体或抗体片段编码核酸，如二氢叶酸还原酶(“DHFR”)、谷氨酰胺合成酶(GS)、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II，优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
或者，通过在含有L-甲硫氨酸亚砜亚胺(Msx)（GS的抑制剂）的培养基中培养转化体来鉴定转化有GS（谷氨酰胺合成酶）基因的细胞。在这些条件下，GS基因与任何其他共转化的核酸一起进行扩增。GS选择/扩增系统可以与上文描述的DHFR选择/扩增系统组合使用。
或者，可以在含有用于适当选择标志物的选择剂，如氨基糖苷抗生素（例如卡那霉素、新霉素、G418）的培养基中通过细胞生长来选择利用编码抗CD83激动剂抗体或其片段、野生型DHFR蛋白质和另一选择标志物，如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(“APH”)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞（特别是含有内源DHFR的野生型宿主）。参见美国专利号4,965,199。
用于酵母的合适的选择基因是存在于酵母质粒YRp7上的trp1基因(Stinchcomb等,Nature,282:39(1979))。所述trp1基因提供了用于酵母突变体菌株的选择标志物，所述酵母突变体菌株(例如，ATCC No.44076或PEP4-1)在含有色氨酸的培养基中缺乏生长能力.Jones,Genetics,85:12(1977)。酵母宿主细胞基因组中trp1损伤的存在然后为检测在缺失色氨酸的情况下的生长转化提供了有效环境。类似地，Leu2-缺失酵母菌株(例如,ATCC20,622或38,626)可以被携带Leu2基因的已知质粒互补。
此外，来自1.6μm环形质粒pKD1的载体可用于转化克鲁维酵母属酵母。或者，为K.lactis报道了用于大规模产生重组牛凝乳酶的表达系统。Van den Berg,Bio/Technology,8:135(1990)。还已经公开了用于通过克鲁维酵母属的工业菌株分泌成熟重组人血清白蛋白的稳定的多拷贝表达载体。Fleer等,Bio/Technology,9:968-975(1991)。
(4)启动子组分
表达载体和克隆载体一般含有被宿主生物识别并有效连接编码抗CD83激动剂抗体或其片段的核酸的启动子。适合用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸启动子系统，和杂合启动子，如tac启动子，尽管其他已知细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还会含有有效连接编码抗体和抗体片段的DNA的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
对于真核生物，启动子序列是已知的。事实上所有的真核基因具有定位在转录起始位点上游大约25-30碱基的AT富含区。在许多基因的转录起始上游70-80碱基处发现的另一序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。大多数真核基因的3'末端是AATAAA序列，其可以是向编码序列的3'末端添加聚A尾巴的信号。所有这些序列可以插入到真核表达载体中。
酵母宿主使用的合适启动子序列的实例包括用于3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖酵解酶，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸酯变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶的启动子。
酵母中的诱导型启动子具有允许转录受生长条件控制的额外优势。示例性的诱导型启动子包括用于醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶，和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。在EP73,657中进一步描述了用于酵母表达的合适的载体和启动子。酵母增强子还有利地与酵母启动子一起使用。
哺乳动物宿主细胞中编码抗体或其片段的核酸从载体的转录可以受以下启动子的控制：例如从病毒，如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒（如腺病毒2）、牛乳头状瘤病毒、鸟类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒，和最优选猿猴病毒40(SV40)的基因组获得的启动子，异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，和热激基因启动子，只要此类启动子与想要的宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期和晚期启动子方便地获得为SV40限制性片段，其还含有SV40病毒复制起点。人巨细胞病毒的立即早期启动子方便地获得为HindIII E限制性片段。使用牛乳头状瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统公开于美国专利号4,419,446中。该系统的修改描述于美国专利号4,601,978中。关于在来自单纯性疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下在小鼠细胞中表达人干扰素cDNA的方法，还参见Reyes等,Nature297:598-601(1982)。或者，劳氏肉瘤病毒长末端重复可以用作启动子。
(5)增强子元件组分
经常通过将增强子序列插入到载体中来增强高等真核生物编码抗体或其片段的DNA的转录。许多增强子序列目前已知来自哺乳动物基因（珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素）。然而，本领域技术人员通常会使用来自真核病毒的增强子。实例包括复制起点迟侧上的SV40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点迟侧上的多瘤增强子，和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件，还参见Yaniv,Nature297:17-18(1982)。增强子可以在抗体或抗体片段编码序列的5'或3'位置处剪接至载体中，但优选定位在启动子的5'位点处。
(6)转录终止组分
在真核宿主细胞（酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞有机体的有核细胞）使用的表达载体还含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNAs的5'，偶尔3'未翻译区得到。这些区域含有转录为编码抗体或其片段的mRNA未翻译部分中的多腺苷酸化片段的核苷酸区段。一个有用的转录终止组分是牛生长激素多腺苷酸化区。参见WO94/11026和本文公开的表达载体。
(7)宿主细胞的选择和转化
用于在本文描述的载体中克隆或表达编码抗CD83激动剂抗体或其片段的DNA的合适宿主细胞包括如上所述的原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞。用于该目的的合适的原核生物包括真菌，如革兰氏阴性生物或革兰氏阳性生物，例如，肠杆菌科（Enterobacteriaceae），如埃希氏菌属（Escherichia），例如大肠杆菌（E.coli），肠杆菌属（Enterobacter）、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）、沙雷氏菌属(Serratia)，例如Serratia marcescans和志贺氏菌(Shigella)，以及芽孢杆菌属如枯草芽孢杆菌（B.subtilis）和地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）（例如，在1989年4月12日出版的DD266,710中的地衣芽孢杆菌41P），假单胞菌属（Pseudomonas），如铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）和链霉菌属（Streptomyces）。一个优选的大肠杆菌克隆宿主为大肠杆菌294(ATCC31,446)，尽管其他菌株例如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)也是适合的。这些实例具有例示性而不具有限制性。
可以在细菌中产生全长抗体、抗体片段和抗体融合蛋白质，特别是当不需要糖基化和Fc效应功能时，如当治疗抗体缀合到细胞毒性剂（例如毒素）上时。全长抗体在循环中具有更长的半衰期。大肠杆菌中的产生更快并且更有效地节省成本。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如U.S.5,648,237(Carter等)、U.S.5,789,199(Joly等)和U.S.5,840,523(Simmons等)，其描述了用于优化表达和分泌的翻译启动区(TIR)和信号序列。表达后，从大肠杆菌细胞沉淀中分离可溶级分的抗体或抗体片段并根据同种型通过例如A蛋白或G蛋白柱进行纯化。可通过用于纯化例如在CHO细胞中所表达的抗体或抗体片段的相同方法进行最终的纯化。
除原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是用于抗体或抗体编码载体的合适的克隆或表达宿主。在低等真核宿主微生物中最常使用的是酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）或常见的面包酵母。然而，多种其他属、种和菌株也是通常可得到并可用于本文中，如，栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属种（Kluyveromycesspp.）如乳酸克鲁维酵母（K.lactis）、脆壁克鲁维酵母（K.fragilis）(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母（K.bulgaricus）(ATCC16,045)、成克曼氏克鲁维酵母（K.wickeramii）(ATCC24,178)、K.waltii(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母（K.drosophilarum）(ATCC36,906)、耐热克鲁维酵母（K.thermotolerans）和马克斯克鲁维酵母（K.marxianus）；子囊菌酵母属（yarrowia）(EP402,226)；巴斯德毕赤氏酵母（Pichia pastoris)(EP183,070)；假丝酵母属（Candida）；里氏木霉（Trichoderma reesia）(EP244,234)；粗糙链孢霉（Neurosporacrassa)；许旺氏酵母属（Schwanniomyces)如西方许旺氏酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌如链孢霉属（Neurospora)、青霉菌属(penicillium)、弯颈霉属（Tolypocladium）和曲霉属(Aspergillus)如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉（A.niger)。关于讨论酵母和丝状真菌用于生产治疗性蛋白质的用途的综述，见例如Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)。
可以选择某些真菌和酵母菌株，其中已经将糖基化途径“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。例如参见Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)(描述巴斯德毕赤酵母中糖基化途径的人源化);和Gerngross等，上文。
用于表达糖基化抗体或抗体片段的合适的宿主细胞来自多细胞有机体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒菌株和变体，以及来自宿主，如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)（蚊子）、白纹伊蚊(Aedes albopictus)（蚊子）、果蝇(Drosophila melanogaster)（果蝇）和家蚕（Bombyxmori)（蛾）的相应的允许性昆虫宿主细胞。用于转染的多种病毒株是公众可以获得的，例如Autographa californica NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株。此类病毒可根据本发明在本文中用作病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。
棉花、玉米、土豆、大豆、牵牛花、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以被用作宿主。
然而，脊椎动物细胞是最感兴趣的，而在培养中繁殖脊椎动物细胞（组织培养）已经成为一种常规的程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是，被SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾细胞系（293细胞或亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞，Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞（BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA77:4216(1980))；小鼠Sertoli细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CVIATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞（VERO-76，ATCCCRL-1587)；人宫颈癌细胞（HELA，ATCC CCL2)；犬肾细胞（MDCK，ATCCCCL34)；水牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A,ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138,ATCCCCL75)；人肝细胞(Hep G2,HB8065)；小鼠乳房肿瘤（MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，如NS0和Sp2/0。对于适合于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods inMolecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo,编辑,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第255-268页。
利用用于产生抗体或抗体片段的上述表达或克隆载体转化宿主细胞，并在适当时被改良用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码想要序列的基因的常规营养培养基中进行培养。
(8)培养宿主细胞
可在多种培养基中培养用于产生本文所述抗CD83激动剂抗体或抗体片段的宿主细胞。市售的培养基如Ham's F10(Sigma)、最小必需培养基((MEM),Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改良的Eagle培养基((DMEM),Sigma)均适合用于培养所述宿主细胞。此外，在例如下列文献中描述的任何培养基也可用作宿主细胞的培养基：Ham等,Meth.Enz.58:44(1979)、Barnes等,Anal.Biochem.102:255(1980)、美国专利号4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5,122,469;WIPO公开号WO90/03430;WO87/00195;或美国专利Re.30,985。必要时，用以下补充任何这些培养基：激素和/或其他生长因子（如胰岛素、运铁蛋白、或表皮生长因子)、盐类（如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物）、痕量元素（定义为一般以微摩尔级的终浓度存在的无机化合物）、和葡萄糖或等价的能源。还可以包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其他必要补充物。培养条件，如温度、pH等是所选用于表达的宿主细胞先前使用的那些条件，这是对普通技术人员而言显而易见的。
(9)纯化抗体
当使用重组技术时，抗CD83激动剂抗体或抗体片段可以在细胞内、周质间隙内产生或直接分泌在培养基中。如果在细胞内产生抗体，第一步是通过例如离心或超滤去除来自宿主细胞或裂解片段的颗粒状碎片。Carter等,Bio/Technology10:163-167(1992)描述了分离分泌在大肠杆菌周质间隙内的抗体的方法。简言之，在乙酸钠（pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟（PMSF）存在下融解细胞沉淀约30分钟。可以通过离心去除细胞碎片。抗体分泌在培养基中时，一般首先用市售的蛋白质浓缩滤膜（例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元）将来自此类表达系统的上清液浓缩。可以在任何前述步骤中包括蛋白酶抑制剂，如PMSF以抑制蛋白水解，并包括抗生素以阻止外来污染物的生长。
可使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化从此类细胞制备的抗体或抗体片段组合物，其中亲和层析是优选的纯化技术。A蛋白用作亲和配体的适用性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。A蛋白可用于纯化基于人1、2或4重链的抗体或抗体片段(Lindmark等,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。为所有小鼠同种型和人3重链抗体或抗体片段推荐G蛋白(Guss等,EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体附着的基质最经常是琼脂糖，但也可用其它基质。机械性能稳定的基质如可控孔径的玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯基)苯允许比琼脂糖实现的流速更快，并且处理时间更短。抗体或抗体片段包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)可用于纯化。根据待回收的抗体或抗体片段，也可采用其它蛋白质纯化技术，如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶层析、肝素、SEPHAROSETM、或阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)层析，以及层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何前述纯化步骤或多个步骤之后，包含目的抗体或抗体片段和污染物的混合物可以进行低pH疏水相互作用层析，其使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度（例如约0-0.25M盐）下进行。
一般而言，制备用于研究、测试和临床应用的抗体的多种方法学在本领域中是成熟的，与上述方法学一致和/或被本领域技术人员认为适合于特定目的抗体。
C.抗体制备
本发明中有用的抗体可以包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段（例如，Fab、Fab’-SH、Fv、scFv和F(ab’)2）、嵌合抗体、双特异性抗体、多价抗体、异源缀合抗体、包含抗体部分的融合蛋白质、人源化抗体，和包含具有所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白的任何其他修饰构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体，和共价修饰的抗体。抗体可以是鼠类、大鼠、人或任何其他来源（包括嵌合或人源化抗体）。
(1)多克隆抗体
一般通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来产生多克隆抗体。其可以用于将相关抗原（例如，纯化的或重组的CD83）缀合到在待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质上，例如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂，使用双功能试剂或衍生试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酰酐、SOCl2或R1N=C=NR，其中R和R1独立地是低级烷基。可以使用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂（单磷酰脂质A、合成的海藻糖二霉菌酸酯（trehalose dicorynomycolate）。可以由本领域技术人员不用过度实验选择免疫方案。
通过将例如100μg(对于兔)或5μg(对于小鼠)蛋白质或具有3倍体积的弗氏完全佐剂的缀合物组合，并在多个位点上皮下注射该溶液来针对想要的抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫动物。1个月后，通过在多个位点上皮下注射1/5-1/10起始量的肽或弗氏完全佐剂中的缀合物来加强免疫动物。7-14天后，对动物采血，并测定血清的抗体效价。对动物加强免疫直到效价达到平台期为止。缀合物还可以在重组细胞培养中产生为融合蛋白质。同样，聚集剂，如明矾适合于增强免疫应答。
(2)单克隆抗体
单克隆抗体从基本均一的抗体群体获得，即包含该群体的单个抗体是相同的，除了少量存在的可能的天然存在的突变和/或翻译后修饰（例如异构化、酰胺化）。因此，修饰词“单克隆”指所述抗体并非不同抗体混合物的特性。
例如，可以使用首次由Kohler等,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或通过重组DNA方法（美国专利号4,816,567）制备单克隆抗体。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其他适当的宿主动物如仓鼠，以引发产生或能够产生与用于免疫的蛋白质（例如纯化的或重组的CD83）特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，可体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂，如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(Academic Press,1986))。
免疫剂通常包括抗原蛋白质（例如，纯化的或重组的CD83）或其融合变体。一般地，如果想要人来源的细胞，那么使用外周血淋巴细胞(“PBLs”)，而如果想要非人哺乳动物来源，那么使用脾或淋巴结。然后使用合适的融合剂，如聚乙二醇将淋巴细胞与无限增殖的细胞系融合，以形成杂交瘤细胞。Goding,Monoclonal Antibodies:Principles andPractice,Academic Press(1986),第59-103页。
无限增殖的细胞系一般是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类、牛或人来源的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。将因此制备的杂交瘤细胞接种并在合适的培养基中培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，用于杂交瘤的培养基通常会包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，其为阻止HGPRT缺陷型细胞生长的物质。
优选的无限增殖的骨髓瘤细胞是有效融合、支持所选抗体生成细胞以稳定的高水平产生抗体，并对培养基，如HAT培养基敏感的那些细胞。其中，优选的是鼠骨髓瘤系，如来自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤（可从Salk Institute Cell Distribution Center,SanDiego,California USA获得），以及SP-2细胞及其衍生物（例如X63-Ag8-653）（可从American TypeCulture Collection,Manassas,Virginia USA获得）的那些。对于产生人单克隆抗体，还已经为其描述了人骨髓瘤和小鼠-人异质骨髓瘤细胞系(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等,Monoclonal AntibodyProduction Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
测定其中生长杂交瘤细胞的培养基中针对抗原（例如，CD83）的单克隆抗体产生。优选地，通过免疫沉淀或通过体外结合测定，如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定((ELISA)来确定杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性。
可以测定其中培养杂交瘤细胞的培养基中针对想要的抗原（例如，CD83）的单克隆抗体的存在。优选地，通过免疫沉淀或通过体外结合测定，如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定((ELISA)来确单克隆抗体的结合亲和力和特异性。此类技术和测定为本领域所知。例如，可以通过Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析确定结合亲和力。
在鉴定了产生具有想要的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释方法亚克隆所述克隆并通过标准方法进行培养(Goding,上文)。用于该目的的合适的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞在哺乳动物中可以作为肿瘤在体内生长。
可通过常规免疫球蛋白纯化方法如，例如A蛋白-Sepharose层析、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、亲和层析和上述其他方法从培养基、腹水或血清中分离由亚克隆分泌的单克隆抗体。
还可以通过重组DNA方法，如在美国专利号4,816,567中公开的和如上所述的那些来制备单克隆抗体。使用常规方法（例如通过使用特异性结合编码鼠类抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针）容易地分离并测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞是此类DNA的优选来源。一旦分离，可以将DNA置于表达载体中，然后将所述表达载体转染到宿主细胞，如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中，以在此类重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra等,Curr.Opin.Immunol.,5:256-262(1993)和Plückthun,Immunol.Rev.130:151-188(1992)。
在某些实施方案中，可使用在McCafferty等,Nature,348:552-554(1990)中描述的技术从所产生的抗体噬菌体文库分离抗体。Clackson等,Nature,352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)分别描述了从噬菌体文库中分离鼠类和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组(Marks等,Bio/Technology,10:779-783(1992))，以及组合转染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等,Nucl.AcidsRes.,21:2265-2266(1993))产生高亲和力(纳摩尔(“nM”)级别)的人抗体。因此，这些技术是用于分离具有想要的特异性（例如结合CD83的那些特异性）的单克隆抗体的常规单克隆抗体杂交瘤技术的可行性备选。
例如还可以通过用同源鼠类序列取代人重链和轻链恒定域的编码序列(美国专利号4,816,567;Morrison,等,Proc.Natl Acad.Sci.USA,81:6851(1984))，或通过共价连接免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列来修饰编码抗体或其片段的DNA。通常，此类非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定域，或者它们取代抗体的一个抗原组合位点的可变域，以产生嵌合二价抗体，该二价抗体包含对抗原具有特异性的一个抗原组合位点和对不同的抗原具有特异性的另一抗原组合位点。
本文描述的单克隆抗体（例如，抗CD83激动剂抗体或其片段）可以是单价的，其制备为本领域所熟知。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和经修饰的重链的重组表达。所述重链一般在Fc区的任何位点上被截短，以防止重链交联。或者，相关的半胱氨酸残基可以取代为另一氨基酸残基或缺失，以防止交联。体外方法也适合于制备单价抗体。可以使用本领域已知的常规技术完成抗体的消化，以产生其片段，特别是Fab片段。
还可以使用合成蛋白质化学中已知的方法，包括涉及交联剂的那些方法在体外制备嵌合或杂合抗体。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键构建免疫毒素。用于该目的的合适的试剂的实例包括亚氨基硫醇化物（iminothiolate）和甲基-4-巯基丁亚氨酸酯（methyl-4-mercaptobutyrimidate）。
(3)人源化抗体
本发明的抗体（如抗CD83激动剂抗体）或抗体片段还包含人源化或人抗体。非人（例如，鼠类）抗体的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段（如，Fab、Fab’-SH、Fv、scFv、F(ab’)2或抗体的其他抗原结合子序列），其含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白（受体抗体），其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种（供体抗体），如小鼠、大鼠、仓鼠或兔的CDR的残基（具有想要的特异性、亲和力和能力）替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架残基被相应的非人残基替换。人源化抗体还可以包含既不在受体抗体也不在引进的CDR或构架序列中发现的残基。一般而言，人源化抗体包含至少一个，通常两个可变域中的基本上全部，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些并且全部或基本上全部FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最优地还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区（Fc），通常是人免疫球蛋白的恒定区。Jones等,Nature321:522-525(1986);Riechmann等,Nature332:323-329(1988)和Presta,Curr.Opin.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
用于人源化非人抗体的方法为本领域所熟知。一般地，人源化抗体具有从非人来源中引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常称为“引进的”残基，其通常来自“引进的”可变域。基本上根据Winter及其同事Jones等,Nature321:522-525(1986);Riechmann等,Nature332:323-327(1988);Verhoeyen等,Science239:1534-1536(1988)的方法，或用啮齿类CDRs或CDR序列取代人抗体的相应序列来进行人源化。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整人类可变域被非人类物种的相应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基且可能一些FR残基被啮齿类抗体中类似位点的残基取代。
用于制备人源化抗体的人类可变域（重链和轻链）的选择对降低抗原性非常重要。根据所谓“最适应”方法，针对已知人类可变域序列的整个文库筛选啮齿类抗体的可变域序列。然后将与啮齿类的序列最相似的人序列接受为人源化抗体的人构架(FR)。Sims等,J.Immunol.,151:2296(1993);Chothia等,J.Mol.Biol.,196:901(1987)。另一种方法使用来自具有轻链或重链特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定构架。相同的构架可以用于几种不同的人源化抗体。Carter等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA89:4285(1992);Presta等,J.Immunol.151:2623(1993)。
此外，重要的是将抗体人源化，其保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物学性质。为了实现该目标，根据优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和多种概念上的人源化产物的方法制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可以获得的并为本领域技术人员所熟知。可以获得计算机程序，其阐明并展示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构型结构。检查这些展示允许分析残基在行使候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原能力的残基。由此，可以从受体和引入序列中选择FR残基并进行组合，以便实现想要的抗体特性，如对靶抗原或多个抗原（例如，CD83）增加的亲和力。一般而言，CDR残基直接并最实际参与影响抗原结合。
考虑多种形式的人源化抗体。例如，人源化抗体可以是抗体片段，如Fab，其任选地与一种或多种细胞毒性剂缀合，以产生免疫缀合物。或者，人源化抗体可以是完整的抗体，如完整的IgG1抗体。
(4)人抗体
或者，可以产生人抗体。例如，现在可以产生转基因动物（例如，小鼠），其在免疫后能够在没有内源免疫球蛋白产生的情况下产生所有种类的人抗体。在嵌合的和种系突变小鼠中抗体重链连接区（JH）基因的纯合缺失导致完全抑制内源抗体的产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到此类种系突变小鼠中会导致在抗原攻击后产生人抗体。参见例如，Jakobovits等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,90:2551(1993);Jakobovits等,Nature,362:255-258(1993);Bruggermann等,Year in Immunol.,7:33(1993);美国专利号5,591,669和WO97/17852。
或者，可使用噬菌体展示技术从未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因的所有组成成分中体外产生人抗体和抗体片段。McCafferty等,Nature348:552-553(1990);Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991)。根据此技术，将抗体V结构域基因框内克隆在丝状噬菌体(如M13或fd)的主要或次要衣壳蛋白质基因内，并在噬菌体颗粒的表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体的功能性质进行的选择也导致对编码显示这些性质的抗体的基因进行选择。因此，噬菌体模仿了B细胞的一些性质。噬菌体展示可以以多种形式进行，综述见例如Johnson,Kevin S.和Chiswell,David J.,Curr.OpinStruct.Biol.3:564-571(1993)。V基因区段的几个来源可用于噬菌体展示。Clackson等,Nature352:624-628(1991)从来自经免疫小鼠脾的V基因的小的随机组合文库中分离了抗-唑酮抗体的多样性阵列。可基本上根据Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991),或Griffith等,EMBO J.12:725-734(1993)描述的技术构建来自未免疫人类供体的V基因所有组成成分，并分离针对多种抗原(包括自身抗原)的抗体。还参见美国专利号5,565,332和5,573,905。
还可以获得Cole等和Boerner等的技术用于制备人单克隆抗体(Cole等,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)和Boerner等,J.Immunol.147(1):86-95(1991)。类似地，可以通过向转基因动物，例如小鼠中导入人免疫球蛋白位点制备人抗体，在所述转基因动物中内源免疫球蛋白基因已经被部分或完全失活。攻击后，观察人抗体的产生，其在所有方面很接近于在人中看到的，包括基因重排、装配和抗体所有组成成分。例如在美国专利号5,545,807；5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016和以下科学出版物：Marks等,
Bio/Technology10:779-783(1992);Lonberg等,Nature368:856-859(1994);Morrison,Nature368:812-13(1994),Fishwild等,NatureBiotechnology14:845-51(1996),Neuberger,Nature Biotechnology14:826(1996)以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)中描述了该方法。
最后，还可以通过激活的B细胞在体外产生人抗体（参见美国专利号5,567,610和5,229,275）。
(5)抗体片段
在某些环境下，使用抗体片段比使用整个抗体有优势。更小的片段大小允许快速清除，并可以导致进入固体肿瘤得到改进。
已开发了产生抗体片段的多种技术。传统上，通过对完整抗体进行蛋白水解性消化获得这些片段(参见例如Morimoto等,J.Biochem.Biophys.Method.24:107-117(1992);和Brennan等,Science229:81(1985))。然而，现在可直接通过重组宿主细胞，例如使用编码上文讨论的CD83的抗体的核酸产生这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段均可以在大肠杆菌中表达并从中分泌，因此允许直接产生大量这些片段。还可以从如上讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，可从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段并经化学偶联形成F(ab’)2片段(Carter等,Bio/Technology10:163-167(1992))。根据另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养中分离F(ab’)2片段。在美国专利号5,869,046中描述了具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)2抗体片段的产生。在其他实施方案中，所选抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185;美国专利号5,571,894和美国专利号5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如在美国专利号5,641,870中所述。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
(6)双特异性和多特异性抗体
双特异性抗体(BsAbs)是对至少两个不同表位，包括相同或另一种蛋白质（例如，CD83）上那些表位具有结合特异性的抗体。此类抗体可来自全长抗体或抗体片段（例如，F(ab’)2双特异性抗体）。
制备双特异性抗体的方法为本领域所知。全长双特异性抗体的传统制备方法是基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中这两条链具有不同的特异性。Millstein等,Nature,305:537-539(1983)。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(细胞杂交瘤)产生10种不同抗体分子的可能混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化(一般通过亲和层析步骤来进行)非常麻烦，且产物产量低。在WO93/08829和Traunecker等,EMBO J.,10:3655-3659(1991)中公开了类似的方法。
根据不同的方法，可将具有想要的结合特异性的抗体可变域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定域序列融合。该融合优选与包含铰链区的至少一部分、CH2及CH3区的免疫球蛋白重链恒定域融合。优选使含有轻链结合所需位点的第一个重链恒定区(CH1)存在于至少在一个融合体中。可将编码免疫球蛋白重链融合体的DNAs，必要时编码免疫球蛋白轻链的DNAs插入分开的表达载体中，并共转染至合适的宿主生物。当构建中使用的非等比的三条多肽链提供最佳产量时，这在实施方案中调整三个多肽片段的相互比例中提供大的灵活性。然而，当等比例的至少两条多肽链的表达导致高产量或当比例没有特定显著性时，可以将两条或所有三条多肽链的编码序列插入一个表达载体中。
在该方法的优选实施方案中，双特异性抗体由一条臂中具有第一种结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二种结合特异性)构成。据发现，这种不对称结构有利于从不想要的免疫球蛋白链组合中分离出想要的双特异性化合物，因为仅该双特异性分子的一半中免疫球蛋白轻链的存在提供了便利的分离方式。此方法公开于WO94/04690中。对于产生双特异性抗体的更多细节，参见例如，Suresh等,Methods in Enzymology121:210(1986)。
根据WO96/27011或美国专利号5,731,168中描述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，以使得从重组细胞培养中回收的异源二聚体的百分比最大。优选的界面包含抗体恒定域CH3区的至少一部分。在该方法中，来自第一个抗体分子界面上的一条或多条氨基酸小侧链被较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换。与所述大侧链大小相同或相似的互补“腔”可通过将大氨基酸侧链用较小侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换而在第二个抗体分子的界面上形成。这为增加异二聚体的产量超过不想要的终产物如同型二聚体提供了机制。
已经在文献中描述了从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接制备双特异性抗体。Brennan等,Science229:81(1985)描述了其中将完整抗体经蛋白水解切割以产生F(ab’)2片段的方法。这些片段在二硫醇络合剂亚砷酸钠存在下被还原，以稳定相邻的二硫醇，并阻止分子间二硫键的形成。然后将所产生的Fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸(TNB)衍生物。然后将Fab’-TNB衍生物中的一种重新转化成Fab’-TNB衍生物，以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化中的试剂。
可从大肠杆菌直接回收Fab’片段并进行化学偶联，以形成双特异性抗体。Shalaby等,J.Exp.Med.175:217-225(1992)描述了完全人源化双特异性抗体F(ab’)2分子的产生。每个Fab'片段分别从大肠杆菌中分泌出来，并在体外直接化学偶联形成双特异性抗体。因此形成的双特异性抗体能够与过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞结合，还能引发人类细胞毒性淋巴细胞对人乳腺肿瘤细胞的裂解活性。
也已经描述了直接从重组细胞培养物中制备并分离二价抗体片段的多种技术。例如，可使用亮氨酸拉链产生二价异二聚体。Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白质的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab’部分通过基因融合而连接。使抗体同型二聚体在铰链区被还原，以形成单体，然后被再氧化，以形成抗体异二聚体。由Hollinger等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术提供了制备双特异性/二价抗体片段的备选机理。所述片段包含通过接头与轻链可变域(VL)相连的重链可变域(VH)，所述接头太短，以至于无法允许同一条链的两个结构域之间配对。因此，一个片段上的VH和VL结构域被迫与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性/二价抗体的另一种策略。参见Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994)。
还考虑了二价以上的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)。示例性的双特异性抗体可以结合给定分子（例如CD83）上的两个不同表位。
(7)多价抗体
多价抗体通过表达抗体结合的抗原的细胞而比二价抗体内化（和/或代谢）地更快。本发明的抗CD83抗体或抗体片段可以是具有三个或多个抗原结合位点的多价抗体（例如，四价抗体）（其为除IgM种类以外的种类），其可以通过重组表达编码抗体的多肽链的核酸容易地产生。多价抗体可以包含二聚化结构域和三个或多个抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含Fc区或铰链区。在该方案中，抗体将包含Fc区和Fc区氨基酸末端的三个或多个抗原结合位点。本文中的优选多价抗体包含三个至约8个，但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链（并优选两条多肽链），其中所述多肽链或多条链包含两个或多个可变域。例如，一条或多条多肽链可以包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一个可变域，VD2是第二个可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，并且n是0或1。类似地，一条或多条多肽链可以包含VH-CH1-柔韧接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选还包含至少两个（并优选四个）轻链可变域多肽。本文中的多价抗体例如可以包含约两个至约8个轻链可变域多肽。本文考虑的轻链可变域多肽包含轻链可变域和任选地还包含CL结构域。
(8)异偶联抗体
异偶联抗体（Heteroconjugate antibodies）也在本发明范围内。异偶联抗体由两个共价连接的抗体构成。例如，异偶联物中的一个抗体可以与抗生物素蛋白偶联，另外一个与生物素偶联。例如已经提出，此类抗体将免疫系统细胞靶向不想要的细胞，美国专利号4,676,980，并且已经用于治疗HIV感染。国际公开号WO91/00360、WO92/200373和EP0308936。应考虑，可以使用合成蛋白质化学中已知的方法，包括涉及交联剂的那些方法在体外制备抗体。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于该目的的合适的实例包括亚氨基硫醇化物（iminothiolate）和甲基-4-巯基丁亚氨酸酯（methyl-4-mercaptobutyrimidate），以及例如在美国专利号4,676,980中公开的那些试剂。可以使用任何便利的交联方法制备异偶联抗体。合适的交联剂为本领域所熟知，并与许多交联技术一起公开于美国专利号4,676,980。
(9)效应功能改造
可以期望修饰本发明的抗体，以修饰效应功能和/或增加抗体的血清半衰期。例如，可以修饰或突变恒定区上的Fc受体结合位点，以去除或降低对某些Fc受体，如FcγRI、FcγRII和/或FcγRIII的结合亲和力。在一些实施方案中，通过去除抗体Fc区（例如，在IgG的CH2结构域中）的N糖基化损害效应功能。在一些实施方案中，通过修饰区域，如PCT WO99/58572和Armour等,Molecular Immunology40:585-593(2003);Reddy等,J.Immunology164:1925-1933(2000)中描述的人IgG的233-236、297和/或327-331损害效应功能。
为了增加抗体的血清半衰期，可以将挽救受体结合表位掺入例如美国专利5,739,277描述的抗体（尤其是抗体片段）中。如本文所用，术语“挽救受体结合表位”指IgG分子（例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4）的Fc区的表位，其负责增加IgG分子的体内血清半衰期。
(10)其他氨基酸序列修饰
考虑本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，期望改进抗体或抗体片段的结合亲和力和/或其他生物学性质。通过将适当的核苷酸改变引入编码抗体或抗体片段的核酸中，或通过肽合成制备抗体或抗体片段的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如，抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。进行缺失、插入和取代的任何组合，以获得最终的构建体，条件是最终的构建体具有想要的特征（例如，结合或物理上与CD83相互作用的能力）。氨基酸改变还可以改变抗体的翻译后过程，如改变糖基化位点的数量或位置。
用于鉴定抗体的某些残基或区域（其为用于诱变的优选位置）的有用的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells在Science,
244:1081-1085(1989)中所述。本文中，鉴定残基或靶残基组（例如，带电残基，如arg、asp、his、lys和glu）并利用中性或带负电的氨基酸（最优选丙氨酸或聚丙氨酸）进行替换，以影响氨基酸与靶抗原的相互作用。然后通过在取代位点上或为取代位点引入进一步的或其他变体来改善证明对取代具有功能灵敏性的那些氨基酸位置。因此，尽管引入氨基酸序列变异的位点是预定的，但突变本身的性质不需要预定。例如，为了分析给定位点上突变的性能，在靶密码子或区域中进行丙氨酸扫描或随机诱变，并筛选所表达的抗体变体的想要的活性。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有数百个或更多残基的多肽范围内的氨基-(“N”)和/或羧基-(“C”)末端融合，以及单个或多个氨基残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒素多肽融合的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体N-或C-末端与酶或增加抗体血清半衰期的多肽的融合。
另一类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体在抗体分子中具有被不同残基替换的至少一个氨基酸残基。最感兴趣的取代诱变位点包括高变区，但也考虑FR改变。在下文表A中以“优选取代”标题显示了保守取代。如果此类取代导致生物学活性改变，那么可以引入更多的实质性改变（在表A中命名为“示例性取代”或在下文中参考氨基酸种类进一步进行描述）并筛选产物。
表A
氨基酸取代
原始残基 示例性取代 优选取代
Ala(A) val;leu;ile Val
Arg(R) lys;gln;asn Lys
Asn(N) gln;his;asp,lys;arg Gln
Asp(D) glu;asn Glu
Cys(C) ser;ala Ser
Gln(Q) asn;glu Asn
Glu(E) asp;gln Asp
Gly(G) ala Ala
His(H) asn;gln;lys;arg Arg
Ile(I) leu;val;met;ala;phe;正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸;ile;val;met;ala;phe Ile
Lys(K) arg;gln;asn Arg
Met(M) leu;phe;ile Leu
Phe(F) leu;val;ile;ala;tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
原始残基 示例性取代 优选取代
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) tyr;phe Tyr
Tyr(Y) trp;phe;thr;ser Phe
Val(V) ile;leu;met;phe;ala;正亮氨酸 Leu
可以通过选择在其效应上差别明显的取代来实现对抗体生物学性能的基本修饰，所述效应为维持(a)取代区域中多肽骨架的结构，例如片层或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链体积的效应。天然存在的残基基于共同的侧链特性被分成下列几组：
(1)疏水的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性亲水的：cys、ser、thr；
(3)酸性的：asp、glu；
(4)碱性的：asn、gln、his、lys、arg；
(5)影响链取向的残基：gly、pro；和
(6)芳族的：trp、tyr、phe。
非保守性取代需要用这些类别的一类中的成员替换另一类的成员。
不涉及维持抗体的适当构象的任何半胱氨酸残基也可被取代，一般是用丝氨酸取代，以改进分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反地，可以在抗体中添加半胱氨酸键以改进其稳定性（特别是在抗体是抗体片段，如Fv片段的情况下）。
特别优选类型的取代变体涉及取代亲本抗体（例如人源化抗体或人抗体）的一个或多个高变区残基。一般地，选择用于进一步开发的所得变体与产生它们的亲本抗体相比具有改进的生物学性质。用于产生此类取代变体的便利方法涉及使用噬菌体展示法进行的亲和力成熟。简言之，对几个高变区位点（例如6-7个位点）进行突变，以在每个位点上产生所有可能的氨基酸取代。因此产生的抗体变体以单价形式在丝状噬菌体颗粒上作为与在每个颗粒中包装的M13的基因III产物的融合体展示。然后如本文所公开的，筛选噬菌体展示的变体的生物学活性（例如结合亲和力）。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变，以鉴定对抗原结合有重大贡献的高变区残基。或者或额外地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体和抗原CD83之间的接触点可能是有利的。根据本文详细说明的技术，这些接触残基和相邻残基是用于取代的候选残基。一旦产生了此类变体，那么可如本文所述对一组变体进行筛选，并选择在一个或多个相关测定中有优异性能的抗体用于进一步的开发。
抗体另一类型的氨基酸变体改变了抗体的初始糖基化方式。改变指缺失在抗体中发现的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加在抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。
抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接指碳水化合物部分附着在天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是将碳水化合物酶促附着到天冬酰胺侧链的识别序列，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，在多肽中任何一种这些三肽序列的存在产生了一个潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种附着到羟基氨基酸上，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
在抗体中添加糖基化位点通常可通过改变氨基酸序列从而使其含有一个或多个上述三肽序列（对于N-连接的糖基化位点而言）而实现。还可以通过在初始抗体序列中添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基而进行改变（对于O-连接的糖基化位点而言）。
可通过本领域已知的多种方法制备编码抗-IgE抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括，但并不限于，从天然来源分离（在天然存在的氨基酸序列变体的情况下），或通过对早先制备的变体或非变体形式的抗体或抗体片段进行寡核苷酸介导的(或定点）诱变、PCR诱变、和盒式诱变而制备。
(10)其他抗体修饰
可以进一步修饰本发明的抗体或抗体片段，以含有本领域已知并且容易获得的额外的非蛋白质部分。优选地，适合于衍生抗体的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸（均聚物或随机共聚物），和葡聚糖或聚（n-乙烯吡咯烷酮）聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/乙烯氧化物共聚物、聚氧乙烯化多元醇（例如甘油）、聚乙烯醇，及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性可以在制备过程中具有优势。聚合物可以是任何分子量，并且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物的数量可以变化，并且如果附着多于一个聚合物，那么它们可以是相同的或不同的分子。一般而言，可以基于以下考虑确定用于衍生的聚合物的数量和/或类型，包括但不限于待改进的抗体的特定性质或功能，无论所述抗体衍生物是否在确定条件下用于治疗等。在Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第20版,Alfonso Gennaro,编辑,Philadelphia College ofPharmacy and Science(2000)中公开了此类技术和其他合适的制剂。
D.药物组合物和制剂
可以将具有想要程度纯度的活性成分与任选药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备本文描述的抗CD83激动剂抗体的治疗组合物和制剂(Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,第20版,(Gennaro,A.R.,编辑,LippincottWilliams&Wilkins,Publishers,Philadelphia,PA2000)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度上对受体无毒，并且包括缓冲剂、抗氧化剂包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、焦亚硫酸钠；防腐剂、等渗剂、稳定剂、金属复合体（例如，Zn-蛋白质复合体）、螯合剂如EDTA和/或非离子型表面活性剂等。
缓冲剂用于将pH控制在这样的范围内，在所述范围内使治疗效果最优化，尤其如果稳定性依赖于pH时。缓冲液优选以约50mM–约250mM的浓度范围存在。本发明使用的合适的缓冲剂包括无机酸和有机酸及其盐，如柠檬酸钠、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、葡萄糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。此外，缓冲液可以包含组氨酸和三甲胺盐，如Tris。
加入防腐剂，以延迟微生物生长，并且所述防腐剂通常以0.2%-1.0%(w/v)的范围存在。本发明使用的合适的防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；苯扎卤铵（例如，氯化物、溴化物、碘化物）、苄索氯铵；硫柳汞、苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇、3-戊醇和间甲酚。
存在张度剂（有时候称为“稳定剂”），以调节或维持组合物中液体的张度。当使用大的带电生物分子，如蛋白质和抗生素时，它们经常被称为“稳定剂”，因为它们可以与氨基酸侧链的带电基团相互作用，由此降低分子间和分子内相互作用的可能性。张度剂可以以0.1重量%-25重量%，或更优选1重量%-5重量%之间的任何量存在，考虑到相对量的其他成分。优选的张度剂包括多羟基糖醇，优选三腔糖醇或高等糖醇，如甘油、赤藻醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露糖醇。
额外的赋形剂包括可以作为以下试剂中的一种或多种起作用的试剂：(1)填充剂，(2)溶解度增强剂，(3)稳定剂和(4)防止变性或附着到容器壁上的试剂。此类赋形剂包括：多羟基糖醇（上文所列）；氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，如蔗糖、乳糖、拉克替醇、海藻糖、木苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、myoinisitose、肌醇（myoinisitol）、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环多醇(例如，肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；单糖（例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖（例如，乳糖、麦芽糖、蔗糖））；三糖，如棉子糖；和多糖，如糊精或葡聚糖。
存在非离子型表面活性剂或去污剂（还称为“湿润剂”），以帮助稳定治疗剂以及保护治疗蛋白质免于搅拌诱导的聚合，其还允许制剂暴露于剪切表面应力而不引起活性治疗蛋白质或抗体的变性。非离子型表面活性剂以约0.05mg/ml-约1.0mg/ml，优选约0.07mg/ml-约0.2mg/ml的范围存在。
合适的非离子型表面活性剂包括聚山梨酯(20、40、60、65、80等)、polyoxamers(184、188等)、多元醇、、聚氧乙烯去水山梨糖醇单醚(-20、-80等)、聚桂醇400、聚氧乙烯(40)单硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可以使用的阴离子去污剂包括十二烷基硫酸钠、磺基丁二酸二辛基钠（dioctyle sodiumsulfosuccinate）和二辛基磺酸钠。阳离子去污剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
为了使包含抗CD83激动剂抗体的药物制剂用于体内施用，它们必须无菌。可以通过无菌滤膜过滤使所述制剂无菌。一般将本文中的治疗组合物置于具有无菌入口的容器中，例如具有可被皮下注射针头穿透的塞子的静脉溶液袋或小瓶。
施用途径根据已知且公认的方法，如通过在长期内以合适的方式单次快速浓注或多次快速浓注或输注，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、损伤内或关节内途径的注射或输注、局部施用、吸入或通过持续释放或延长释放方式。
对于所治疗的特定适应症，必要时，本文的抗CD83激动剂抗体组合物和制剂还含有多于一种活性化合物，优选具有彼此不负面影响的互补活性的那些活性化合物。或者，或额外地，组合物可以包含细胞毒性剂、细胞因子或生长抑制剂。此类分子适当地以对预期目的有效的量组合存在。
例如还分别通过coascervation技术或通过界面聚合法，例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚（甲基甲基丙烯酸酯）微胶囊，在胶体药物递送系统（例如脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊）在所制备的微胶囊中或在大乳剂中封装活性成分。此类技术公开于Remington'sPharmaceutical Sciences，第20版，上文中。
可以通过使用无毒“水溶性多价金属盐”增强本文中描述的蛋白质和抗体的稳定性。实例包括Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Sn2+、Sn4+、Al2+和Al3+。可以形成水溶性盐（具有上文中的多价金属阳离子）的示例性阴离子包括从无机酸和/或有机酸形成的那些阴离子。此类水溶性盐在水（20℃）中可溶到至少约20mg/ml，或者至少约100mg/ml，或者至少约200mg/ml。
可以用于形成“水溶性多价金属盐”的合适的无机酸包括盐酸、乙酸、硫酸、硝酸、硫氰酸和磷酸。可以使用的合适的有机酸包括脂肪族羧酸和芳族酸。该定义中的脂肪族酸可以定义为饱和的或不饱和的C2-9羧酸（例如，脂肪族单、二和三羧酸）。例如，该定义中的示例性单羧酸包括饱和的C2-9单羧酸乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸和capryonic酸，和不饱和的C2-9单羧酸丙烯酸、propriolic酸、甲基丙烯酸、巴豆酸和异巴豆酸。示例性二羧酸包括饱和的C2-9二羧酸丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸和庚二酸，而不饱和C2-9二羧酸包括马来酸、富马酸、柠康酸和甲基反丁烯二酸。示例性三羧酸包括饱和的C2-9三羧酸丙三酸和1,2,3-丁烷三羧酸。额外地，该定义的羧酸还可以含有一个或多个羟基，以形成羟基羧酸。示例性羟基羧酸包括乙醇酸、乳酸、甘油酸、丙醇二酸、苹果酸、酒石酸和柠檬酸。该定义中的芳族酸包括苯甲酸和水杨酸。
可以用于帮助稳定本发明的胶囊化多肽的常用水溶性多价金属盐包括例如：(1)卤化物的无机酸金属盐（例如，氯化锌、氯化钙）、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐和硫氰酸盐；(2)脂肪族羧酸金属盐（例如，醋酸钙、醋酸锌、丙酸钙（calcium proprionate）、乙醇酸锌、乳酸钙、乳酸锌和酒石酸锌）；和(3)苯甲酸的芳族羧酸金属盐（例如苯甲酸锌）和水杨酸盐。
可以设计抗CD83激动剂抗体的药物制剂，以立即释放抗CD83激动剂抗体（“立即释放”制剂），以在延长期内逐渐释放抗体（“持续释放”、“控制释放”或“延长释放”制剂），或具有备选释放模式。用于制备药物制剂的额外材料根据制剂的治疗形式可以变化（例如，所述系统是设计用于立即释放或持续释放、控制释放或延长释放）。在某些变型中，持续释放制剂还可以包含立即释放组分，以根据药物递送来快速递送引发剂量，还包含持续释放组分。因此，持续释放制剂可以与立即释放制剂组合，以向系统中提供快速“爆裂”的药物以及更长久的逐渐释放。例如，可以用掺入了药物的高度可溶层包衣核心持续释放制剂。或者，持续释放制剂和立即释放制剂可以作为交替层包括在片剂或作为单独颗粒类型包括在胶囊中。不同类型药物制剂的其他组合可用于实现想要的治疗血浆谱。
示例性持续释放剂量制剂（在Remington's Pharmaceutical Sciences第20版，上文中讨论的）可以包括多种药物递送系统，包括使用以下系统的那些：(a)容器系统，其中药物包被在聚合物膜中，允许水分通过膜扩散，以溶解药物，所述药物然后扩散到装置以外；(b)基质系统（梯度的或整体的），其中药物悬浮在聚合基质中并随着基质溶解或分裂而逐渐扩散出去；(c)微胶囊化和包被的颗粒系统，其中直径小至1微米(“μm”;10-6m)的药物颗粒（或药物和聚合物的颗粒）包被在高分子膜中，包括这样的实施方案，其中具有不同释放特征的聚合物（例如，pH依赖的或非pH依赖的聚合物、具有不同程度水溶性的化合物等）所包被的颗粒在单个胶囊中一起递送；(d)溶剂激活系统，包括(i)渗透控制装置（例如，,Alza Corp.,Mountain View,CA），其中渗透剂和药物包被在半透性膜中，由此渗透梯度将水牵引至装置中，并且增加的压力驱动药物通过膜中的孔到达装置之外；(ii)水凝胶膨胀系统，其中药物分散在聚合物中和/或聚合物包被到药物颗粒上，其中所述聚合物与水接触后膨胀（在某些实施方案中，膨胀可以是pH依赖性的、pH不依赖性的，或依赖于其他物理或化学特性的），允许药物扩散出装置；(iii)微孔膜系统，其中药物包被在具有与水接触后溶解（在某些实施方案中，膨胀可以是pH依赖性的、pH不依赖性的，或依赖于其他物理或化学特性的）的组分的膜中，在膜中产生孔，药物通过所述孔扩散；和(iv)蜡模系统，其中药物和额外的可溶性组分在蜡中分散，由此当水溶解所述可溶性组分时，允许药物从系统中扩散；和(e)聚合降解系统，包括(i)本体降解，其中药物在聚合基质中分散，并且降解通过聚合结构以随机方式发生，允许药物释放；和(ii)表面溶蚀，其中药物在聚合基质中分散并随聚合物表面侵蚀进行递送。
E.治疗方法
本发明提供用于在个体中治疗或预防自身免疫疾病（如炎性肠病（IBD））的方法，其包括向个体施用有效量的本文所述的抗CD83激动剂抗体。在一些实施方案中，所述个体是人。在一些实施方案中，所述自身免疫疾病选自类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮（SLE）、狼疮性肾炎、溃疡性结肠炎、韦格纳病、炎性肠病、特发性血小板减少性紫癜（ITP）、血栓性血小板减少性紫癜（TTP）、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化症、牛皮癣、IgA肾病、IgM多神经病、重症肌无力、血管炎、糖尿病、雷诺氏综合征、舍格伦综合征和肾小球肾炎。在一些实施方案中，所述个体具有发生在疾病发病机理上与髓样细胞激活（树突细胞和巨噬细胞）相关的自身免疫疾病的危险。在一些实施方案中，所述个体患有IBD或具有发生IBD的危险。
IBD可以是溃疡性结肠炎(UC)、克隆病或不确定性结肠炎。在一些实施方案中，患有IBD的个体是正在经受或已经经受IBD的一种或多种病征、症状或其他IBD指征或已经诊断患有IBD的个体。患有IBD的个体具有类固醇顽固性和/或类固醇依赖性IBD、类固醇顽固性和/或类固醇依赖性UC或类固醇顽固性和/或类固醇依赖性克隆病。“类固醇顽固性”IBD是发展或恶化的IBD，即使向患有IBD的受试者施用类固醇。患有“类固醇依赖性IBD”的个体依赖于使用类固醇，并且不能逐渐减少或撤除类固醇施用而无临床症状的急性加重。
施用抗CD83抗体可以导致临床应答和/或疾病缓解。如本文所用，“临床应答”指疾病症状的改善。“疾病缓解”表示基本上没有证据表明有疾病症状。可以在某一时帧内，例如在从利用拮抗剂开始治疗或从初始剂量的拮抗剂开始治疗约8周内或约8周实现临床应答或疾病缓解。临床应答还可以维持一段时间；如≥24周，或≥48周。在一些实施方案中，可以通过抗CD83激动剂抗体治疗而减少和/或消除与IBD相关的体重减轻。在一些实施方案中，利用如本文所述的抗CD83激动剂抗体治疗在患有IBD的患者中防止粘膜损伤和/或帮助胃肠组织的上皮修复。
与IBD相关的症状包括腹痛、呕吐、腹泻、便血（粪便中鲜红血液）和体重减轻。为了诊断IBD，可以进行进一步的测试。例如，可以使用全部血细胞计数、电解质面板、肝功能测试(LFT)、大便潜血测试、X射线（包括钡餐灌肠和上胃肠系）、乙状结肠镜检查、结肠镜检查和胃肠内视镜检查。本领域已知的多种评分系统可用于定量评估疾病的严重性。
为了预防或治疗疾病，活性剂（即，抗CD83激动剂抗体）的适当剂量将取决于待治疗的疾病类型、疾病的严重性和过程、试剂是为预防目的还是治疗目的施用、先前的治疗、患者的临床历史和对治疗剂的应答和主治医生的判断。特定剂量方案，即剂量、时间选择和重复将取决于特定个体和医师评价的所述个体的医疗史。通常，临床医师将施用抗CD83激动剂抗体，直至达到实现想要的结果的剂量。
本发明的方法用于在个体中治疗、改善或减轻自身免疫疾病（如IBD）的症状，或用于改善个体遭受自身免疫疾病的预后。可以改善遭受所述疾病的个体的生活质量，并且可以在利用抗CD83激动剂抗体治疗后减轻或消除症状。本发明的方法还可用于在处于发生疾病的个体中延迟自身免疫疾病（如IBD）的发展或预防该疾病。可以向个体施用本文中描述的任何抗CD83激动剂抗体。
F.组合治疗
本发明的方法可以与自身免疫疾病（如IBD）的已知治疗方法组合，作为组合的或额外的治疗步骤或作为治疗制剂的额外组分。或者，可以组合施用不同的抗CD83激动剂抗体。所选组合治疗的类型取决于疾病的临床表现。
例如，可以通过包含施用抗CD83激动剂抗体与用于IBD的第二种药物结合的组合治疗来治疗IBD（如溃疡性结肠炎、克隆病或不确定性结肠炎）。此类第二种药物的类型取决于多种因素，包括IBD的类型、IBD的严重性、受试者的状况和年龄、所用第一种药物的类型和剂量等。在一些实施方案中，第二种药物包括一种或多种氨基水杨酸、皮质类固醇，和免疫抑制剂。在一些实施方案中，氨基水杨酸是柳氮磺吡啶、奥沙拉秦、氨基水杨酸、巴柳氮和美沙拉秦之一。在一些实施方案中，共同施用多种氨基水杨酸，如柳氮磺吡啶和奥沙拉秦的组合。在一些实施方案中，皮质类固醇是布地奈德、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、6-巯基嘌呤(6-MP)、硫唑嘌呤、氨甲喋呤或环孢霉素。在一些实施方案中，第二种药物是抗生素，如环丙沙星和/或甲硝唑；或基于抗体的试剂，如英夫利昔单抗。
所有这些第二种药物可以彼此组合使用或本身与第一种药物组合使用，由此如本文所用的表述“第二种药物”不表示其分别是除第一种药物以外的仅有的药物。因此，第二种药物不需要是一种药物，但可以由多于一种这种药物组成或包含多于一种这种药物。
一般以上文使用的相同剂量和施用途径或约1-99%此前使用剂量使用本文中阐明的这些第二种药物。如果确实使用此类第二种药物，任选地以比若不存在第一种药物时低的量使用，尤其以超过第一种药物初始剂量的后续剂量使用，以消除或减少治疗引起的副作用。
本文的组合施用包括使用不同制剂或单个药物制剂的共同施用，和以任一顺序的连续施用，其中优选存在两种（或全部）活性剂同时发挥其生物学活性的时期。
G.药物剂量
本发明药物组合物的剂量和想要的药物浓度可以根据设想的特定用途而变化。适当剂量或施用途径的确定为本领域普通技术人员所熟知。动物实验为确定用于人治疗的有效剂量提供了可靠的指导。可以根据Mordenti,J.和Chappell,W.“The Use ofInterspecies Scaling inToxicokinetics,”在Toxicokinetics and New DrugDevelopment,Yacobi等,编辑,Pergamon Press,New York1989,第42-46页中制定的原则进行有效剂量的种间缩放。
对于体内施用本文描述的多肽或抗体，根据施用途径，正常剂量可以在每天约10ng/kg高至约100mg/kg个体体重或更高，优选约1mg/kg/天至10mg/kg/天范围内变化。对于在几天或更长时间内重复施用，根据待治疗的疾病或病症的严重性，维持治疗直至实现想要的症状抑制。
示例性剂量方案包含施用约2mg/kg初始剂量的抗CD83激动剂抗体，然后每隔一周约1mg/kg每周维持剂量。根据医师希望实现的药代动力学衰减模式，其他剂量方案可以是有用的。例如，本文中考虑一周一次至21次向个体给药。在某些实施方案中，可以使用约3μg/kg至约2mg/kg(如约3μg/kg、约10μg/kg、约30μg/kg、约100μg/kg、约300μg/kg、约1mg/kg和约2/mg/kg)的剂量。在某些实施方案中，给药频率是每天三次、每天两次、每天一次、每隔一天一次、每周一次、每两周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、或每月一次、每两个月一次、每三个月一次，或更长时间。通过常规技术和测定监测治疗的进程。剂量方案，包括所施用的抗CD83激动剂抗体可以独立于所用的剂量随时间而变化。
可以根据经验在已经给予了一次或多次抗CD83激动剂抗体施用的个体中确定特定抗CD83激动剂抗体的剂量。给予个体增加剂量的抗CD83激动剂抗体。为了评价抗CD83激动剂抗体的效果，可以监测自身免疫疾病（如IBD）的临床症状。
施用本发明方法的抗CD83激动剂抗体可以是连续的或间断的，这例如取决于受体的生理状况、施用目的是治疗性的还是预防性的，和技术人员已知的其他因素。抗CD83激动剂抗体的施用在预选时期内基本上连续或可以是一系列间隔剂量，例如在自身免疫疾病（如溃疡性结肠炎和克隆病）的发展过程中或在其后。
在文献中提供了关于特定剂量和递送方法的指导；参见例如美国专利号4,657,760；5,206,344；或5,225,212。在本发明范围内的是，不同制剂会对不同的治疗和不同的病症有效，并且旨在治疗具体器官或组织的施用可能需要以不同于向另一器官或组织的施用方式递送。此外，可以通过一次或多次单独施用，或通过连续输注施用剂量。对于几天或更长时间内的重复施用，根据状况，维持治疗直至出现疾病症状的预期抑制。然而，其他剂量方案可以是有用的。通过常规技术和测定容易地监测该治疗的进程。
H.制剂的施用
根据已知方法，如作为快速浓注或通过在一段时间内连续输注的静脉施用、通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口腔、局部或吸入途径向需要利用抗CD83激动剂抗体治疗的个体，优选人施用本发明的制剂，包括，但不限于重构的制剂（例如，抗CD83激动剂抗体的制剂）。
在优选的实施方案中，通过皮下（即皮肤下面）施用向个体施用制剂。为此目的，可以使用注射器注射制剂。然而，用于施用制剂的其他装置可以获得为注射装置（例如INJECT-EASETM和GENJECTTM装置）；注射笔（如GENPENTM）；自动注射器装置、无针装置（例如MEDIJECTORTM和BIOJECTORTM）；和皮下贴片递送系统。
抗CD83激动剂抗体的适当剂量（“有效量”）例如取决于待治疗的状况、所述状况的严重性和过程、施用抗CD83激动剂抗体是为预防目的还是治疗目的、先前的治疗、患者的临床历史和对抗CD83激动剂抗体的应答、所用抗CD83激动剂抗体的类型，和主治医生的判断。可以以一次或一系列治疗向患者适当施用抗CD83激动剂抗体，并且所述抗CD83激动剂抗体可以在诊断之前任何时间向患者施用。抗CD83激动剂抗体可以作为唯一的治疗或作为与其他药物或在治疗自身免疫疾病（如IBD）中有用的治疗结合的组合治疗的部分来施用。
对于抗CD83激动剂抗体，约0.1mg/kg-约20mg/kg可以是用于向个体施用的初始候选剂量，例如无论是通过一次或多次单独的施用。然而，其他剂量方案也是有用的。通过常规技术容易地监测该治疗的进程。
抗CD83激动剂抗体制剂的用途包括治疗或预防自身免疫疾病（如IBD）。根据待治疗的疾病的严重性，向个体施用治疗有效量（例如，约1mg/kg–约15mg/kg）的抗CD83激动剂抗体。
I.制成品和药盒
另一方面，提供含有抗CD83激动剂抗体制剂的制成品或药盒，并优选提供其在本发明方法中用途的说明书。因此，在某些实施方案中，制成品或药盒包含抗CD83激动剂抗体在用于在个体中治疗或预防自身免疫疾病，如IBD（包括溃疡性结肠炎和克隆病）的方法中的用途的说明书，所述方法包括向个体施用有效量的抗CD83激动剂抗体。在某些实施方案中，所述个体是人。
制成品或药盒还可以包含容器。合适的容器包括例如，瓶子、小瓶（例如，双室瓶）、注射器（如单室或双室注射器）和试管。容器可由多种材料如玻璃或塑料形成。容器含有制剂。制成品或药盒还可以包含标签或包装插页，其在容器上面或与容器结合，可以标明重构的指示和/或制剂的用途。标签或包装插页还可以标明，所述制剂用于或旨在用于皮下施用或其他方式施用，用于在个体中治疗或预防自身免疫疾病（如IBD）。含有制剂的容器可以是一次性使用的小瓶或多次使用的小瓶，其允许重复施用（例如2-6次施用）重构的制剂。制成品或药盒还可以包含含有合适的稀释剂（例如，BWFI）的第二种容器。将稀释剂与冻干的制剂混合时，重构的制剂中的最终蛋白质、多肽或小分子的浓度一般为至少50mg/ml。制成品或药盒还可以包括从商业、治疗和使用者观点上想要的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有使用说明的包装插页。
本文中的制成品或药盒任选地还包含含有第二种药物的容器，其中抗CD83激动剂抗体是第一种药物，并且所述制成品还包含利用有效量的第二种药物治疗受试者的包装插页上的说明。第二种药物可以是上文阐明的那些药物中的任何药物，其中示例性的第二种药物是氨基水杨酸、口服皮质类固醇、6-巯基嘌呤(6-MP)，和硫唑嘌呤（如果抗CD83抗体用于治疗IBD）。
在另一实施方案中，本文提供的是制成品或药盒，其包含本文所述的用于在自动注射器装置中施用的制剂。可以将自动注射器描述为这样的注射装置，其在激活后会在患者或施用者不进行额外必要活动的情况下递送其内含物。当递送速率必须恒定且递送时间长于片刻时，它们特别适合于治疗制剂的自我给药。
将参考以下实施例更完全地了解本发明。然而，它们不应解释为限制本发明的范围。公开内容的所有引用由此通过参考明确引入。
实施例
CD83是主要发现于成熟树突细胞(DCs)表面的Ig超家族的非常保守的1型膜蛋白。可溶性CD83具有免疫抑制活性，然而，CD83在DCs上的功能及其假定的配体仍不知晓。我们已经鉴定了引发DCs上抗炎作用的CD83同型相互作用。在DC成熟过程中用可溶性CD83或抗CD83抗体治疗导致表面激活标志物的表达降低和促炎细胞因子如IL-12p40的分泌。表面CD83表达的敲倒、或胞质区的截短消除了对CD83治疗的应答，表明CD83同型相互作用介导了炎症的抑制。因为CD83治疗的这种抑制下游的MAPK和mTOR信号传导功能抑制了mTOR和p38α的磷酸化，mTOR和p38α对于表面激活标志物表达和IL-12p40产生是必需的。CD83免疫抑制在维持耐受性和免疫性之间的平衡中是关键的，这是由于在粘膜表面过表达CD83的小鼠对于结肠炎更有抗性，导致体重保持和降低的血清细胞因子水平。因此，CD83同型相互作用调节DC免疫应答，预防不合适的炎症并促进耐受性。
实施例1.CD83参与在细胞表面上的同型结合
为了确定可溶性CD83是否结合在细胞表面上表达的CD83，产生包含氨基酸序列
TPEVKVACSEDVDLPCTAPWDPQVPYTVSWVKLLEGGEERMETPQEDHLRGQHYHQKGQNGSFDAPNERPYSLKIRNTTSCNSGTYRCTLQDPDGQRNLSGKVILRVTGCPAQRKEETFKKYGRAQVTDKAAHYTLCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO:3)
的CD83.fc并测定它结合稳定表达于CHO细胞上的人
CD83(CHO-hCD83)或表达于来自MUTZ-3的成熟树突细胞(mDCs)上的内源CD83的能力。为了生成用于产生稳定的CHO-hCD83细胞系的表达载体，将编码N末端HIS标记的人CD83(hCD83)的DNA片段在XbaI和XhoI位点处克隆入新霉素抗性的质粒pRKneo(Crowley等,ProcNatlAcad Sci USA.,90(11):5021-5025,1993)中，以产生hCD83.pRKneo。使用Fugene(Roche)用hCD83.pRKneo转染CHO细胞，并且通过FACS分选前10％的CD83阳性细胞，随后用G418(400ug/ml;GIBCO)选择以生成稳定的CHO-hCD83细胞系。为了从MUTZ-3细胞得到未成熟的DCs(iDCs)，将细胞在含有150ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml rhIL-4的MEMα+glutamax/20%热失活的FBS中培养6天。用含有25ng/ml rhIL-1β、100ng/ml rhIL-6、50ng/ml rhTNFα和1μg/ml PGE-2的细胞因子混合物使DCs成熟来表面表达CD83。
通过用缀合有荧光染料的针对CD83的抗体染色细胞并在LSR II流式细胞仪上使用FACSDiva软件(Becton Dickinson)通过流式细胞术分析细胞来证实在CHO-hCD83细胞和来自MUTZ-3的mDCs上CD83的表达。使用被标记的同种型匹配的抗体来确定非特异性染色的水平。数据分析和使用FlowJo v.8.4.5进行的显示总的结合的柱状图的构建证明，CD83在稳定转染的CHO-hCD83细胞（黑线）的表面上表达，但不在对照CHO细胞（虚线）上表达（图1A）。CD83在来自MUTZ-3的mDC（黑线）上表达，但在iDC（灰线）上以非常低的水平表达（图1B）。实心柱状图代表同种型对照。随着细胞表面CD83表达的证实，将CHO细胞和CHO-hCD83细胞固定于4%PFA中5分钟，随后用冷的1XPBS洗涤。将细胞在含有PBS/2%BSA/2mM EDTA的FACS缓冲液中重悬并在黑暗中在冰上与1μg PE-标记的CD83.Fc或标记的IgG.Fc对照蛋白质温育30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞并通过流式细胞术分析。对于iDCs和mDCs，在固定和流式细胞术之前，将细胞用10μg/ml PE-标记的CD83.Fc或标记的IgG.Fc对照蛋白质进行标记。数据分析证明，CD83.fc结合CHO-hCD83（黑线），但不结合对照CHO细胞（虚线）（图1C）。此外，CD83.fc结合成熟DC（黑线）但不结合未成熟的DC（灰线）（图1D）。这些结果证明可溶性CD83.fc特异性结合在细胞表面表达CD83的细胞。
为了证实细胞表面的CD83对于CD83.fc结合是必需的，将CHO-hCD83细胞与1μg/ml抗-CD83抗体(HB15e;Santa CruzBiotechnology)温育以确定它是否阻断了CD83.fc结合。数据分析证明，CD83.fc结合CHO-hCD83细胞（黑线），但结合被HB15e（虚线）而非同种型对照（灰线）所阻断（图2A）。在不表达CD83的来自MUTZ-3的DCs中进一步测定为了Cd83.fc结合而对CD83表达的需要。在含有150ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml rhIL-4的MEMα+glutamax/20%热失活的FBS中培养后4天，用靶向CD83的Accell siRNA(目录号E-012680;Dharmacon)或非靶向对照(目录号D-001910;Dharmacon)转染MUTZ-3iDC。将MUTZ-3iDCs在含有10uM siRNAs并添加有3%热失活FBS、150ng/ml GM-CSF和50ng/ml IL-4的Accell递送培养基(目录号B-005000;Dharmacon)中在37℃和5%CO2下温育72小时。在第7天，用成熟刺激处理DCs以产生如上所述的mDCs。siRNA介导的CD83RNA和蛋白表达的敲倒功效分别通过taqman qPCR以及总细胞裂解产物的western印迹来评价。对18S归一化的总RNA分析证明，用CD83siRNA转染的DCs展示出CD83RNA水平的显著下调（图2B），所述总RNA来自用非靶向对照(siNTC)siRNA或对CD83特异性的siRNA(siCD83)处理的MUTZ-3mDCs。通过用缀合有荧光染料的针对CD83的抗体染色细胞并通过流式细胞术分析细胞来证实MUTZ-3mDCs中CD83的敲倒。数据分析和显示总结合的柱状图的构建证明，CD83在用siNTC处理的mDC（黑线）的表面上表达，但不在用siDC83处理的iDC（灰线）或成熟DCs（虚线）上表达（图2C）。实心柱状图代表同种型对照。证实CD83表达的敲倒后，将iDC、siNTC mDC和siCD83mDC如上所述与PE标记的CD83.fc或标记的IgG.Fc对照蛋白质温育，并进行流式细胞术。数据分析证明CD83.fc结合siNTC mDC而非iDC或siCD83mDC，表明CD83.fc结合成熟的DCs需要CD83表达（图2D）。CD83的敲倒还导致MHCII的表达降低，但在其他激活标志物如CD86中则没有变化（图2E和F）。
为了确定CD83是否经同型结合介导细胞与细胞的黏着，在表达hCD83的CHO细胞中测定细胞聚集。将CHO细胞和CHO-hCD83细胞用2mM EDTA从烧瓶上分离下，洗涤并在含有2%FBS/10mMEDTA但缺少Ca2+或Mg2+的HBSS培养基中重悬。将细胞随后以106/ml重悬并经过70μm滤器以获得单细胞悬浮液用于在低黏着10cm培养皿上进行平板培养。在轨道平台振荡器中在37℃下温育90分钟后，将细胞用4％PFA固定以评价细胞聚集。细胞的显微成像证明缺少CD83表达的对照CHO细胞并不聚集，但表达hCD83的CHO-hCD83细胞则在悬浮培养中形成簇（图3A和B），用1μg CD83.fc蛋白质预处理CHO-hCD83细胞阻断了聚集，而用Ig对照处理则不会（图3C和D）。这些结果证明CD83的表面表达对于细胞足以形成细胞黏着，并且由于同型结合的竞争，这种相互作用可以通过加入可溶性CD83被阻断。
实施例2.通过抑制DC成熟和促炎细胞因子释放，DCs的可溶性CD83处理产生抗炎 表型
为了表征通过可溶性CD83处理在DCs中诱导的免疫应答，评价CD83处理对mDC表面激活标志物的作用。为了从MUTZ-3细胞衍生iDCs，将细胞在含有150ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml rhIL-4的MEMα+glutamax/20%热失活的FBS中培养6天。用含有25ng/ml rhIL-1β、100ng/ml rhIL-6、50ng/ml rhTNFα和1μg/ml PGE-2的成熟刺激细胞因子混合物处理iDCs。在成熟刺激的同时，用10μg/ml CD83.fc、1μg/ml HB15e或对照IgG.fc处理mDCs。通过用缀合有荧光染料的针对CD83或MHCII的抗体染色细胞并通过流式细胞术分析细胞来检查细胞表面激活标志物CD83和HLA-DR(MHCII)在MUTZ-3来源的mDCs上的表达。使用被标记的同种型匹配的抗体来确定非特异性染色的水平。数据分析和显示总结合的柱状图的构建证明CD83和MHCII在MUTZ-3来源的mDC（黑线）上表达，但在iDC（实线柱状图）上为低水平（图4）。实心无线的柱状图代表同种型对照。用CD83.fc(灰线)或HB15e(虚线)处理，CD83和MHCII的表达均降低，表明CD83处理降低了mDCs中的表面激活标志物的表达。
由于已知DCs通过产生细胞因子调节免疫应答，可溶性CD83处理对DCs的作用通过检测来自处理后的人单核细胞来源的DCs(MDDCs)的细胞因子分泌来评价。将MDDCs从多个供体的全血中分离，并在CD83.Fc或HB15e存在或不存在的情况下用细胞因子刺激以驱动成熟。为了分离和处理，将人全血用PBS稀释，在Ficoll histopaque(GE healthcare)上分层，并以1500rpm离心30分钟。去除白细胞层，并用PBS洗涤。将单核细胞用人单核细胞分离试剂盒II(Miltenyi)分离并在含有125ng/ml rhIL-4和50ng/ml rhGM-CSF的RPMI/10%FBS/1X青霉素/链霉素(R&D systems)中培养6天。每隔一天更换培养基以获得未成熟的DC。给予用10μg/mlCD83.Fc或1μg/ml抗-CD83抗体(HB15e;Santa Cruz)的所有处理，同时进行成熟刺激。在DCs成熟后48小时收集细胞培养上清液，并且通过ELISA使用用于MCP-1、IL-12p40和IL-8(Invitrogen)以及IL-1ra(Cell Sciences)检测的试剂盒根据标准生产商说明书来分析分泌的细胞因子。由DCs分泌的细胞因子的分析证明用CD83.Fc与成熟刺激物一同处理改变了DC细胞因子分泌，伴随白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)的增加（图5B），所述拮抗剂结合IL-1受体并且阻断下游炎症信号传导，以及促炎细胞因子单核细胞趋化蛋白质-1(MCP-1)和白细胞介素-12的亚基β(IL-12p40)的产生的降低（图5A和C）。用CD83.Fc或HB15e处理对于炎症细胞因子IL-8的产生没有作用（图5D）。
为了进一步表征通过可溶性CD83处理在DCs中诱导的免疫应答，评价CD83处理对由mDCs的促炎细胞因子分泌的作用。为了从MUTZ-3细胞获得未成熟的DCs，将细胞在含有150ng/ml rhGM-CSF和50ng/mlrhIL-4的MEMα+glutamax/20%热失活的FBS中培养6天。用含有25ng/ml rhIL-1β、100ng/ml rhIL-6、50ng/ml rhTNFα和1μg/ml PGE-2的细胞因子混合物使DCs成熟来表面表达CD83。用10μg/ml CD83.fc、1μg/mlHB15e或对照IgG.fc处理mDCs，同时进行成熟刺激。在DCs成熟后48小时收集细胞培养上清液，并且通过ELISA使用MCP-1、IL-12p40和IL-8试剂盒(Invitrogen)以及IL-1ra(Cell Sciences)根据标准生产商说明书来分析分泌的细胞因子。由DCs分泌的细胞因子的分析证明在CD83.fc或HB15e处理时，mDCs中促炎细胞因子MCP-1(图6A)和IL-12p40(图6C)降低。相反，抗炎细胞因子IL-1ra在CD83处理的mDCs中明显增加（图6B）。释放的IL-8的水平证明在CD83处理的或对照处理的mDCs中没有差异（图6D）。来自每一孔的上清液以一式三份运行，并且*表示值显著不同，*p<0.01,**p<0.001。每一点代表单独孔的平均值。图为至少三个独立实验的代表。
为了进一步表征表达，即用CD83.fc或HB15e处理的DCs的抗炎表型，在处理后从DCs分离的RNA上进行微阵列分析。使用来自R计划(http://r-project.org)和Bioconductor计划(http://bioconductor.org)的软件完成微阵列的统计分析。将减去背景的微阵列数据在阵列内LOESS归一化并且在阵列间分位数归一化。随后将归一化的数据进行log2转换，并且使用Bioconductor‘基因过滤程序’程序包将探针过滤，从而使只有定位到Entrez基因上的探针得以保留。随后应用去除50％最少可变探针的非特异性过滤程序(Bourgon等,Proc Natl Acad Sci USA.,107(21):9546-51,2010)。为了鉴定差异表达的基因，使用limma软件包(Smyth.,Stat Appl GenetMol Biol.,3:Article3,2004)，以计算减弱的t统计学。线性模型检测未成熟和成熟DCs之间的差异表达、以及CD83连接的样品(CD83fc-和HB15e-处理的成熟DCs)与对照样品（IgG-和未处理的成熟DCs）之间的差异。使用Benjamini-Hochberg方法计算错误发现率（FDR）。如果基因具有小于0.01的FDR，则认为它们差异表达。来自5种不同供体的DCs的所有基因表达变化的分析表明CD83.fc或HB15e处理产生抗炎表型。总之，CD83.fc或HB15e处理后DC细胞因子释放和基因表达的测量证明可溶性CD83处理抑制促炎细胞因子的分泌并且诱导抗炎应答。
实施例3.可溶性CD83处理导致参与创伤愈合的基因上调
为了进一步表征用CD83.fc或HB15e处理的DCs中诱导的基因表达的变化，在处理后对从DCs分离的RNA进行微阵列分析。使用来自R计划(http://r-project.org)和Bioconductor计划(http://bioconductor.org)的软件完成微阵列的统计分析。将减去背景的微阵列数据在阵列内LOESS归一化并且在阵列间分数位归一化。随后将归一化的数据进行log2转换，并且使用Bioconductor‘基因过滤’程序包将探针过滤，从而使只有定位到Entrez基因上的探针得以保留。随后应用去除50％最少可变探针的非特异性过滤程序(Bourgon等,Proc Natl Acad Sci USA.,107(21):9546-51,2010)。为了鉴定差异表达的基因，使用limma软件包(Smyth.,Stat Appl GenetMol Biol.,3:Article3,2004)，以计算减弱的t统计学。线性模型检测未成熟和成熟DCs之间的差异表达、以及CD83连接的样品(CD83fc-和HB15e-处理的成熟DCs)与对照样品（IgG-和未处理的成熟DCs）之间的差异。使用Benjamini-Hochberg方法计算错误发现率（FDR）。如果基因具有小于0.01的FDR，则认为它们差异表达。来自5种不同供体的DCs的分析显示CD83.fc和HB15e处理的细胞分离并且与未处理的mDCs以及iDCs独立成簇，并且表明处理导致参与创伤愈合的基因上调。通过从用CD83.fc或HB15e处理的mDCs分离的总RNA的taqman qPCR分析证实了微阵列数据（图7）。对gapdh归一化后的基因表达分析证明参与创伤愈合的基因vcan、spock2和fbn2被上调。表明的平均相关表达为2^ΔCT+平均值的标准差（SEM）。这些体外结果表明可溶性CD83处理可以促进健康细胞的增殖并且对于由炎症疾病导致的组织损伤愈合的体内迁移。
实施例4.CD83同型相互作用介导抗炎应答
为了进一步表征调节抗炎应答的CD83相互作用，当与过表达hCD83的CHO细胞共培养时，监测DCs的抗炎应答。为了从MUTZ-3细胞衍生iDCs，将细胞在含有150ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml rhIL-4的MEMα+glutamax/20%热失活的FBS中培养6天。将产生的iDCs与对照CHO细胞系或与稳定表达人CD83的CHO细胞共培养。随后将混合细胞的培养物不处理或者用含有25ng/ml rhIL-1β、100ng/ml rhIL-6、50ng/mlrhTNFα和1μg/ml PGE-2的细胞因子混合物处理以产生mDCs。在DCs成熟后48小时收集细胞培养物上清液，并通过ELISA(Invitrogen)根据标准制造商说明书分析所分泌的细胞因子IL12-p40和MCP-1。分泌的IL12-p40和MCP-1水平的分析显示相比于缺乏CD83表达的CHO细胞，与表达hCD83的CHO细胞共培养的mDCs中促炎细胞因子的释放显著降低（图8A和B）。该数据证明CD83可以参与反式同型相互作用以介导抗炎应答。使用从多种供体的全血中分离的人单核细胞来源的DCs（MDDCs）来证实这些结果。刺激后，用CHO-hCD83细胞培养的DCs比用缺少CD83表达的CHO细胞培养的那些产生明显更低的IL-12p40。
研究未成熟BMDCs与来自野生型或CD83缺陷动物的成熟BMDCs的共培养并测定IL-12p40的产生。使用与Fujimoto,Y.等,Cell108,755-767,2002（其通过参考引入本文）中使用的类似的同源重组策略来产生CD83敲除小鼠(CD83-/-)，这导致CD83的免疫球蛋白结构域和跨膜及胞质结构域的一半损失。CD83-/-小鼠缺乏CD4T细胞，但其他方面正常，其以预期的孟德尔频率（Mendelian frequencies）产生并且与它们的野生型同窝出生仔畜繁殖地一样好。用LPS刺激后，产生自CD83-/-小鼠的BMDCs能够上调表面成熟标志物CD86，并且以与从野生型同窝出生仔畜产生的那些相似的水平产生细胞因子（图8C）。用LPS刺激后还见到MHCII的上调，然而来自CD83-/-小鼠的BMDCs比从野生型小鼠产生的那些表达更低的MHCII。随后将新鲜的未成熟BMDCs与来自野生型或CD83-/-动物的成熟细胞共培养，同时用LPS刺激。24小时后，收集培养上清液并通过ELISA评价IL-12p40的产生。与表达高水平CD83的成熟DCs共培养的未成熟的DCs比与CD83缺陷的成熟DCs培养的那些产生显著更低的IL-12p40（图8D）。
为了验证由CD83处理介导的抗炎应答需要与细胞表面CD83的相互作用，在不表达CD83的DCs中测定处理。在含有150ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml rhIL-4的MEMα+glutamax/20%热失活的FBS中培养后4天，用Accell siRNA靶向CD83(目录号E-012680;Dharmacon)或非靶向对照(目录号D-001910;Dharmacon)转染MUTZ-3iDC。将MUTZ-3iDCs在含有10uMsiRNAs并添加有3%热失活FBS、150ng/ml GM-CSF和50ng/mlIL-4的Accell递送培养基(目录号B-005000;Dharmacon)中在37℃和5%CO2下温育72小时。在第7天，用含有25ng/ml rhIL-1β、100ng/ml rhIL-6、50ng/ml rhTNFα和1μg/ml PGE-2的细胞因子混合物处理iDCs以产生mDCs。在成熟刺激的同时，用10μg/ml CD83.fc、1μg/ml HB15e或对照IgG.fc处理mDCs。在DCs成熟后48小时收集细胞培养物上清液，并使用MCP-1试剂盒(Invitrogen)根据标准制造商说明书通过ELISA分析所分泌的细胞因子。由mDCs释放的MCP-1的分析表明CD83的siRNA敲倒(siCD83)消除了对CD83.fc和HB15e抗体的应答（图9A）。因此，该数据显示在细胞表面上需要CD83介导由CD83处理的抗炎应答。通过检测所分泌的IL-12p40证实这些结果。由mDCs释放的IL-12p40的分析表明CD83的siRNA敲倒(siCD83)消除了对CD83.fc和HB15e抗体的应答。
为了确定CD83处理期间的抗炎应答是否需要经细胞表面CD83的同型结合和下游的信号传导，在表达胞质截短的CD83构建体的DCs中测定处理。CD83慢病毒表达构建体来自pGCMV.IRES.eGFP(pGIPZ衍生物;Openbiosystems)，并且如下制备：通过PCR扩增全长hCD83基因(CD83FL)或扩增被截短胞质区(Δ172-205)的hCD83基因区段，并将这些区段插入到XhoI/EcoRI克隆位点中（图9B）。为了产生用于感染DCs的慢病毒，将293T细胞以1X107接种于凝胶化10cm培养皿上，并允许生长～20小时以达到80-90%汇合。用5ml DMEM、10%FBS、2mML-谷氨酰胺补充培养基，并且用含有1:2.3:0.2的摩尔比的5μg表达质粒、δ8.9和VSVG的DNA混合物在37℃下使用Lipofectamine2000(Invitrogen)6小时转染细胞。用6ml正常生长培养基补充转染培养基，并将细胞在37℃下温育额外40小时。收获上清液，经0.45μm管顶滤器(Corning)通过过滤来澄清，并且根据制造商说明书使用Lenti-X-浓缩器(Clonetech)浓缩。将MUTZ-3细胞以0.5x106/ml接种于24孔培养板中的含有MEMα+Glutamax/20%热失活的FBS/15%HTB-9条件培养基的维持培养基中。将1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物（Polybrene）和浓缩的慢病毒上清液分别以
4μg/ml的终浓度和10的MOI加入到细胞中。将细胞在Allegra X-12R台式离心机中室温下以1800rpm离心30分钟，随后在37℃下温育过夜。
去除含有慢病毒的培养基并用新鲜的维持培养基替换。2-3天培养后，分选前10％的GFP阳性细胞并在添加有150ng/ml rhGM-CSF和50ng/mlrhIL-4的MEMα+Glutamax/20%热失活的FBS中培养6天，并用作iDC。将细胞用成熟刺激物以及CD83.Fc、HB15e或同种型对照处理48小时。
随后收集上清液，并通过ELISA分析MCP-1释放。分泌的MCP-1的分析证明全长CD83的慢病毒过表达并不抑制对CD83.fc或HB15e的mDC应答，然而胞质截短的CD83的表达阻断CD83处理的抗炎作用（图9C）。通过检测分泌的IL-12p40证实这些结果。分泌的Il-12p40的分析证明全长CD83的慢病毒过表达并不抑制对CD83.fc或HB15e的mDC应答，然而胞质截短的CD83的表达阻断CD83处理的抗炎作用。
为了确定单独的交联是否足以驱动经CD83胞质结构域的抗炎应答，
产生CD83嵌合慢病毒表达构建体，其含有与CD83跨膜和全长或截短的胞质结构域融合的CD79a的胞外区（图10A）。用如上文所述的所示慢病毒构建体感染iDCs，并且随后用成熟刺激物和用1μg CD79a抗体(SantaCruz)或同种型对照处理48小时。收集上清液，并通过ELISA分析
IL12-p40释放。分泌的IL12-p40的分析证明全长CD83嵌合体的慢病毒过表达并不抑制对抗CD79a抗体的mDC应答，然而胞质截短的CD83嵌合体的表达阻断用抗CD79a处理的抗炎作用（图10B）。总之，这些结果证明了这一新发现，即由于CD83处理，CD83同型相互作用介导抗炎作用。
实施例5.CD83同型相互作用通过抑制MAPK和mTOR信号传导途径而抑制炎症
由于CD83同型相互作用在DCs中引发抗炎作用这一新发现，因此研究了由CD83胞质结构域调节的下游信号传导途径。CD83胞质域的最后15个氨基酸的比对表明C末端III类PDZ配体基序在CD83中是保守的（图11A）。为了确定该基序在CD83处理中是否介导抗炎应答，产生CD83慢病毒表达构建体，其含有全长CD83,在位置205处具有缬氨酸至丙氨酸突变（V205A）以破坏III类PDZ配体基序（图11B）。用如上文所述的所示慢病毒构建体感染iDCs。将细胞用成熟刺激物以及CD83.Fc、HB15e或同型对照处理48小时。随后收集上清液，并通过ELISA分析IL12-p40释放。分泌的IL12-p40的分析证明全长CD83的慢病毒过表达并不抑制对CD83.fc或HB15e的mDC应答，然而CD83V205A突变体的表达阻断CD83处理的抗炎作用（图11C）。这些结果提示CD83胞质结构域上的III类PDZ配体基序与介导抗炎应答的蛋白质相互作用。
为了确定CD83同型相互作用的免疫抑制作用是否由额外的信号传导途径所介导，对来自用CD83.fc或HB15e处理5分钟的mDCs的细胞裂解物进行磷酸激酶阵列。根据制造商说明书进行人磷酸激酶阵列(R&Dsystems)。简言之，将MUTZ-3DCs用冷的PBS洗涤，并溶于裂解缓冲液6中，并在4℃下摇动30分钟。将裂解产物以14,000X g离心5分钟，并将上清液转移至新管中，用于通过Bradford(Bio-Rad)分析总蛋白质。一式两份点样的含46种抗体的阵列膜在室温下封闭1小时，随后与稀释的细胞裂解产物在4℃下温育过夜。将膜洗涤并随后与检测抗体在室温下温育2小时。洗涤后，将膜在链霉抗生物素蛋白-HRP中室温下温育30分钟并在用ECL Plus试剂(Amersham)检测前再次洗涤。将膜在FUJI FILMImage Reader LAS-3000上曝光，并通过Multi Gauge v3.1(FUJI FILM)分析平均强度。HB15e处理导致mTOR,p=0.046(图12A)、p38,p=0.008(图12B)以及CREB,p=0.0104(图12C)的磷酸化明显降低。相反，HB15e抗体处理并未抑制STAT3的磷酸化，其由成熟刺激物中的组分TNFα的TNF受体结合所激活（图12D）。来自用CD83.Fc或αCD83(HB15e)处理的人单核细胞来源的DCs(MDDCs)的全细胞裂解产物的western印迹分析证实磷酸-p38MAPK中的降低（图12E），而对STAT3磷酸化并无显著作用（图12F）。这些新的发现表明CD83同型相互作用的抗炎作用由p38MAPK以及mTOR蛋白质信号传导所介导。
实施例6.CD83过表达导致结肠固有层DCs上的表面激活标志物的表达降低
CD83同型相互作用在体外在DCs中引发抗炎作用这一新发现提示，它可以在体内引发类似作用。为了研究体内CD83介导的免疫抑制的作用，产生在粘膜表面过表达CD83的转基因小鼠品系(CD83Tg)。为了产生FABP.CD83靶向载体，使用Picomax PCR系统来从结肠组织中扩增全长小鼠CD83(mCD83)，用于使用SpeI/SacII位点克隆入FABP.sup.LacZ载体中（图13A）。用于PCR的引物为CD83SPE-正向引物：
5’-GATCAAACTAGTCCACCATGTCGCAAGGCCTCCAGCTCCT-3’和CD83SACII-反向引物:5’-CATCATCCGCGGTCATACCGTTTCTGTCTTAGGAAG-3’。显微注射后，筛选72只建立者小鼠在结肠中的高表达及在肾中的低表达。1只小鼠满足这些标准并用于通过与FVB小鼠(JacksonLabs)回交产生转基因品系。将小鼠饲养在无特定病原体的屏障设施中。所有程序均经过Genentech Animal Care and Use Committee许可。
对CD83的结肠免疫组织化学染色显示野生型动物中CD83的表达限于肠相关的淋巴组织，但CD83Tg在结肠上皮中过表达CD83（图13B）。为了确定CD83过表达是否对DC亚群、T细胞群和表面标志物具有影响，收集结肠并用冷的HBSS/2%FBS/10mM HEPES冲洗。去除脂肪及其他伴随结肠的组织，并用HBSS/2%FBS冲洗结肠。用剪刀纵向切结肠，并转移到冰上装有30-40ml HBSS/2%FBS的50-ml锥形管中。随后将结肠碎片转移到装有10-15ml预热的HBSS/2%FBS/10mM HEPES/1mMEDTA的无菌带挡板烧瓶（baffled flask）(Corning)中。将烧瓶在37℃下以200rpm振动45分钟。倒出培养基并将结肠在新鲜的HBSS/2%FBS/10mM HEPES中洗涤，并用刀片刮去残留的上皮。将结肠在含有10%FCS、20mM HEPES、0.5mg/ml胶原蛋白酶/分散酶、青霉素和链霉素的RPMI中切为1-2-mm碎片，然后在37℃下以200rmp振动温育45-90分钟。将悬浮液用移液器吹打4-5次，并经100μm过滤器过滤，随后在4℃下1800rpm离心10分钟。将细胞用含有5%FBS、20mM HEPES和0.1mg/mlDNA酶的RPMI洗涤并经70μm过滤器过滤。然后将细胞用FACS缓冲液洗涤并用抗体染色，用于分析免疫细胞以及用于RNA分离和qPCR的DCs的分选。
通过对MHCII和CD11c hi表达的流式细胞术分选从CD83Tg小鼠的结肠固有层或脾分离的DCs（图14A和B）。DC亚组的分析表明从结肠（图14D）或脾（图14E）中分离的类浆细胞(CD11b-/B220+)、髓样(CD11b+)或淋巴样(CD11b-/B220-/CD8a+)DCs的数目或百分比无明显差异，表明在CD83Tg小鼠中CD83过表达对DC亚组并无影响。表面激活标志物CD83、CD86和MHCII(I-A/E)的分析证明，它们在从结肠分离的DCs表面上显著降低*p<0.05,**p<0.01(图13C)，而来自脾的那些没有显示出显著差异（图13E）。每个点代表从三只动物中收集的细胞。此外，从CD83Tg小鼠的结肠固有层或脾分离并分选的T细胞的分析（图14C）表明，无论从结肠（图13D）或脾（图13F）中分离，指示T细胞激活的CD44表面标志物的表达无显著差异。有趣的是，从CD83Tg DCs分离的总RNA的taqman qPCR分析显示在结肠中增加的创伤愈合基因表达，但在野生型小鼠的结肠中是无法检测到的（ND）（图13G）。数据代表三次独立实验，每组n=6。总之，这些体内结果受利用CD83.fc或HB15e处理DCs观察到的体外结果的支持。
实施例7.CD83免疫抑制保护小鼠免于DSS诱导的结肠炎
为了评价CD83过表达在炎性肠疾病的小鼠模型中的作用，在之前实施例中通过用葡聚糖硫酸钠(DSS)处理在CD83Tg小鼠品系中诱导、产生并表征结肠炎。在饮用水中随意给予8-10周龄的CD83Tg小鼠6％DSS7天，并在第7天将其转换为正常饮用水直到第12天实验停止。将小鼠在第0天称重并从第4天起向前每天称重，并检查隐血、腹泻及任何其他异常病征。如果重量减轻超过第0天的初始重量的20％，则将小鼠安乐死。在第12天在麻醉下将小鼠眼眶放血以收集150-200μl血液，其产生～150μl血清。根据制造商说明书使用Bio-PlexPro Mouse23-Plex测定(目录号M60-009RDPD;Bio-Rad)评价血清细胞因子。随后将小鼠安乐死，并且将小肠和大肠切片并用H&E染色用于组织学分析。将切片随机化并进行双盲评分。用6%DSS处理的野生型小鼠损失～20%体重，而CD83Tg小鼠在第12天仍保留～89%的初始体重（图15A）。野生型小鼠具有严重的结肠炎，标志为与CD83Tg小鼠相比结肠结构的丧失和炎症浸润的增加（图15B）。来自野生型和CD83Tg小鼠的结肠切片的H&E染色的组织学得分证明，野生型小鼠具有8.2的平均组织学得分，而CD83Tg小鼠的组织学得分显著更低(**,P=0.0094)，为5.3（图15B和C）。此外，通过ELISA测量促炎细胞因子的血清水平，并且发现相比于野生型同窝出生仔畜，用6％DSS处理的CD83Tg小鼠中所述血清水平显著降低(*,P<0.05)（图15D）。这些结果证明，在粘膜表面上过表达CD83的小鼠对结肠炎更有抗性，导致体重保持和血清细胞因子水平降低。因此，CD83同型相互作用调节DC介导的免疫应答，预防不合适的炎症并促进耐受性。
为了确定在过表达CD83的小鼠中的DSS结肠炎过程中见到的保护是否是由于CD83对潜在的固有层DCs的作用，在来自患有DSS结肠炎的CD83Tg和WT小鼠的固有层DCs中测定IL-12p40表达。DSS处理7天后，在第9天将小鼠安乐死，此时CD83Tg和WT同胞之间重量减轻显著不同。随后从分离的固有层免疫细胞中分选DCs以通过qPCR评价促炎细胞因子的表达。DSS在CD83Tg和WT小鼠中均诱导炎症细胞因子的表达。然而，相比于野生型同窝出生仔畜，从CD83Tg小鼠分离的DCs具有显著降低的IL-12p40表达(*,p=0.0315)(图15E)，表明增加的粘膜CD83水平调节DC免疫应答以在结肠炎过程中进行保护。
实施例8：树突细胞中CD83的丧失恶化结肠炎
为了确定是否DCs中CD83的丧失将恶化结肠炎，产生在DCs中特异性缺乏CD83表达的小鼠并进行测定。通过同源重组产生CD83fl/fl小鼠。首先，使用合成的CD83挽回载体从BAC(目录号RPCI23.C,Invitrogen)中取回CD83基因组片段，所述合成的CD83挽回载体具有独特的限制位点：
GCGGCCGCGAGCAACTGATATTATATATGCCTTGAACATGAAACCAGGGGCAGGCTGTGGAATATTTCCAGGCACGCTGTCTCGAGGCACAGTAGATCCTCAACCCAAGTGGATAAGAGATGACAATAGCTTTCCAAGAGAGACAGTTATGAGGGACC(Blue Heron)。将纯化的取回的片段与第一个靶向盒：
ACAGGTCTCCCAGCCAGTGTTTCTCTCACCCCTGCAGGGTGAAGGCTGTGTTGGTTCCTGGTGCTACAATCACAGCATTGCAGTCTTATCTTGTTTCAAAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGCAAACACAGTCTCAAGAGTTTTTATAGATTCTCTTCTTCTCCCCTGGAATCCTCATTTACAGGGATAGGGGGTGGGGGAGCACCCTGTCTTGCTTTAAA(Blue Heron)共转化，其将loxP侧翼卡那霉素选择盒插入所述取回的基因组片段中。然后将纯化的靶向质粒转化入阿拉伯糖诱导的且电感受态SW106细胞中，以允许Cre介导的选择盒的弹出（pop-out），以在后面留下单一loxP位点。然后将纯化的片段与合成的第二个靶向盒：
CTCAGTGACACATTACACACTTGTGGTGCAATGTATGGATTACCTGAATACCCACCTTCCCCAGGGAGCAAGCATTTCTCCGTTTTGTGCTTTCTTCAGTGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCGGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCAGCCAAGCTAGCTTGGCTGCAGGTCGTCGAAATTCTACCGGGTAGGGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGACTAGAGCTTGCGGAACCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGCACAGTAGATCCTCAACCCAAGTGGATAAGAGATGACAATAGCTTTCCAAGAGAGACAGTTATGAGGGACCACGCAGAAATGAACAAAGCACAGTTGGT(Blue Heron)共转化，用于将侧翼为两个Frt位点和单个loxP位点的PGK-em7-Neo-pA抗性基因插入，以产生条件靶向载体。该选择盒保留在用于在ES细胞中阳性选择的条件靶向载体中，并随后通过编码Flp的cDNA在ES细胞中瞬时转染来去除，以产生条件CD83fl等位基因（图16A）。然后将携带CD83fl等位基因的ES细胞注射入小鼠胚泡中以产生嵌合小鼠，其然后用于产生纯合CD83fl/fl小鼠。使用与Fujimoto,Y.等,Cell108,755-767,2002（其并入本文作为参考）中使用的类似的策略来产生CD83敲除小鼠。将CD83fl/fl小鼠繁殖成小鼠，其具有在CD11c启动子控制下的Cre重组酶的转基因表达，以产生特异地在DCs中缺失CD83的小鼠(CD83fl/fl CD11c-Cre)。CD83fl/fl CD11c-Cre小鼠没有显示出整体形态异常，并且与全局CD83敲除小鼠不同，当与CD83wt/wt CD11c-Cre同窝出生仔畜比较时，其在脾中具有正常数目的CD4T细胞，这是由于胸腺上皮细胞中CD83表达在这些小鼠中大概没有受到影响（图16B）。脾和结肠中的DC数目也类似，但CD83的表达在CD83fl/fl CD11c-Cre小鼠中的大部分DCs中缺失（图16C）。DCs中CD83表达的缺失导致DSS结肠炎的存活降低（图16D）。CD83fl/fl CD11c-CreDSS处理的小鼠具有严重的重量减轻，到第8天时，与CD83wt/wt CD11c-Cre同窝出生仔畜(84.9%)比较，保留显著更低的其初始体重(77.7%)（图16E）。此外，DSS处理到第8天时在100％的CD83fl/fl CD11c-Cre小鼠中在肛门周围及在粪便中产生明血，这在CD83wt/wtCD11c-Cre同窝出生仔畜中并未观察到（图16F），因此出于人道原因需要安乐死。这些结果表明DC CD83表达对于耐受DSS诱导的结肠炎是必需的。
实施例9.激动剂抗CD83抗体的产生和表征
可以通过筛选抗体文库如噬菌体展示文库来产生特异性结合人CD83胞外区内的表位的激动剂抗体。文库中的抗体可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。文库中的抗体还可以是单链抗体或单结构域抗体。或者，可以使用来自人CD83胞外区的肽用于免疫小鼠，并且如下文说明来鉴定抗CD83抗体的CD83激动剂活性。
激动剂抗CD83抗体对细胞表面CD83的结合：
为了鉴定结合在树突细胞上的细胞表面CD83的抗体，通过流式细胞术分析筛选产生的抗体的结合能力。简言之，用细胞因子混合物处理未成熟的树突细胞(iDCs)以诱导DC成熟和CD83的表面表达。在固定和流式细胞术之前，用产生的抗体同时用DC成熟刺激物来处理mDCs。通过分析流式细胞术数据来鉴定特异地结合表达于mDCs表面的CD83的抗体。或者，使用细胞聚集测定法筛选产生的抗CD83抗体。简言之，将表达hCD83的CHO细胞(CHO-hCD83)用2mM EDTA从烧瓶上分离下，洗涤并在含有2%FBS/10mMEDTA但缺少Ca2+或Mg2+的HBSS培养基中重悬。将细胞随后以106/ml重悬并经过70μm过滤器以获得单细胞悬浮液用于在低黏着10cm培养皿上进行平板培养。随后用产生的抗体处理CHO-hCD83细胞，并在用4％PFA固定前在轨道平台振荡器中在37℃下温育90分钟。通过细胞的显微术成像鉴定由于竞争CD83同型结合而阻断CHO-hCD83细胞的细胞聚集的抗体。可以对这些抗体进一步表征它们与人CD83的结合和激动剂活性。
来自用激动剂抗CD83抗体处理的mDCs的细胞因子释放中的改变：
为了鉴定具有CD83激动剂活性的抗CD83抗体，评价CD83处理对mDCs的促炎及抗炎细胞因子分泌的影响。简言之，用细胞因子混合物处理iDCs以诱导DC成熟和CD83的表面表达。用产生的抗体处理mDCs，同时给予DC成熟刺激物。在DCs成熟后48小时收集细胞培养上清液，并且通过ELISA分析促炎细胞因子MCP-1和IL-12p40以及抗炎细胞因子IL-1ra的分泌。将抑制促炎细胞因子MCP-1和IL-12p40的释放和/或诱导抗炎细胞因子IL-1ra的释放的抗CD83抗体鉴定为具有激动剂活性的抗体。
用激动剂抗CD83抗体处理的mDC细胞表面激活标志物的降低的表达：
为了鉴定抑制mDCs激活的激动剂抗CD83抗体，筛选产生的抗体降低细胞表面激活标志物表达的能力。简言之，用细胞因子混合物处理未成熟的树突细胞(iDCs)以诱导DC成熟。用产生的抗体同时用DC成熟刺激物处理mDCs。通过用缀合有荧光染料的针对CD83或MHCII的抗体染色细胞并通过流式细胞术分析细胞来检查细胞表面激活标志物CD83和HLA-DR(MHCII)在mDCs上的表达。将降低mDC上的CD83和/或HLA-DR的细胞表面表达的抗CD83抗体鉴定为具有激动剂活性的抗体。
用激动剂抗CD83抗体处理抑制MAPK和mTOR信号传导途径：
为了鉴定抑制mDCs中MAPK和mTOR（雷帕霉素的哺乳动物靶标）信号传导的激活的激动剂抗CD83抗体，筛选产生的抗体抑制下游信号传导蛋白质的磷酸化的能力。简言之，用细胞因子混合物处理未成熟的树突细胞(iDCs)以诱导DC成熟。用产生的抗体同时用DC成熟刺激物处理mDCs。将来自处理的mDCs的细胞裂解产物进行SDS-PAGE，随后用特异性的磷酸抗体进行western印迹分析。将如下抗CD83抗体鉴定为具有激动剂活性的抗体，所述抗CD83抗体在mDCs中通过p38和CREG蛋白质降低的磷酸化抑制MAPK信号传导途径和/或通过mTOR蛋白质降低的磷酸化抑制mTOR信号传导途径。
将从上文概述的抗体筛选方法中鉴定的候选激动剂抗CD83抗体以多种剂量用于治疗动物模型如结肠炎的IL-10敲除小鼠模型(Scheinin等,Clin Exp Immunol.,133:38-43,2003)和多发性硬化症的实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型(Miller等,Curr ProtocImmunol.,第15章:Unit15.1,2007)中的自身免疫疾病。
实施例10.抗CD83抗体的产生
材料和方法
培养基和抗体
ClonaCell-HY Medium B(Cat#03802)、Medium C(Cat#03803)、Medium D(Cat#03804)和Medium E(Cat#03805)来自StemCellTechnologies。用于电融合的CytofusionMedium C(Cat#LCM-C)来自Cyto Pulse Sciences。山羊抗仓鼠IgG(H+L)-HRP缀合抗体(Cat#127-035-160)来自Jackson ImmunoResearch Laboratories。TMB单组分HRP微孔底物(Cat#TMBW-1000-01)和TMB终止试剂(Cat#BSTP-1000-01)来自BioFx Laboratories。
体内免疫
通过腹膜内注射用每只仓鼠每次注射重悬于单磷酰脂质A/海藻糖dicorynomycolate佐剂中的2μg重组鼠和人CD83以3-4天间隔免疫亚美尼亚仓鼠，总计18次加强。最后的预融合加强后三天，收集来自免疫的仓鼠脾的淋巴细胞。
杂交瘤产生和抗体筛选
通过使用Cyto Pulse CEEF-50装置(Cyto Pulse Sciences)将分离的仓鼠脾细胞与PU-1骨髓瘤细胞(American Type Culture Collection)融合。简言之，在用CytofusionMedium C洗涤两次后，将分离的皮细胞和PU-1细胞以1:1混合，然后以一千万细胞/ml重悬于Cytofusion Medium C中。根据制造商说明书进行电融合。将融合的细胞在ClonaCell-HYMedium C中在37℃下在7%CO2培养箱中培养过夜。第二天，将融合的细胞离心，然后在10mlClonaCell-HY Medium C中重悬，随后与含有HAT组分的90ml基于甲基纤维素的ClonaCell-HY Medium D温和混合。将细胞铺于100mm培养皿上(Cat#351029,Becton Dickinson)并允许在37℃下在7%CO2培养箱中生长。10天温育后，通过ClonePix(Genetix,United Kingdom)挑取单个杂交瘤克隆，并转移入每孔含有200μL的ClonaCell-HY MediumE的96孔细胞培养板(#353075,Becton Dickinson)中。在ELISA筛选前更换杂交瘤培养基。培养基更换后三天，通过针对人CD83或小鼠CD83的ELISA筛选杂交瘤上清液用于鉴定ELISA阳性克隆。
仓鼠Abs纯化
将杂交瘤上清液通过A蛋白亲和层析纯化，然后进行无菌过滤(0.2μm孔径,NalgeNunc International,NY,USA)并在4℃下储存在PBS中。在使用功能测定进一步测试前，通过ELISA证实纯化的mAbs。
ELISA测定
根据标准方案进行ELISA测定。用每孔100μL的0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)中每ml2μg浓度的人或小鼠CD83包被ELISA96孔微量滴定板(Greiner,Germany)，并在4℃下温育过夜。用洗涤缓冲液(PBS中0.05%Tween20,Sigma)将孔洗涤三次后，用100μL含有BSA的ELISA测定稀释液将板封闭。加入约100μL的培养上清液或稀释的纯化mAbs并在室温下温育1小时。将板洗涤三次并与HRP缀合的山羊抗仓鼠IgG(H+L)温育1小时。洗涤孔三次后，通过加入每孔100μL的TMB底物(BioFXLaboratories,MD,USA)检测结合的HRP缀合抗体，并将板温育5分钟。通过加入每孔100μL的终止试剂(BioFX,Laboratories,MD,USA)终止反应，并且在A630nm处检测颜色以鉴定或证实结合人或小鼠CD83的抗体。
FACS结合测定
测定产生的抗体的结合稳定表达于CHO细胞上的人CD83或小鼠CD83的能力。为了生成用于产生稳定细胞系的表达载体，将编码N末端HIS标记的人CD83(hCD83)或N末端HIS标记的小鼠CD83(mCD83)的DNA片段在XbaI和XhoI位点处克隆入新霉素抗性质粒pRKneo(Crowley等,Proc Natl Acad Sci USA.,90(11):5021-5025,1993)中，以分别产生hCD83.pRKneo或mCD83.pRKneo。使用Fugene(Roche)用hCD83.pRKneo或mCD83.pRKneo转染CHO细胞，并且通过FACS分选前10％的CD83阳性细胞，然后用G418(400μg/ml;GIBCO)选择以分别生成稳定的CHO-hCD83或CHO-mCD83细胞系。将CHO-hCD83和CHO-mCD83细胞重悬于含有PBS/2%BSA/2mM EDTA的FACS缓冲液中，并与抗人CD83抗体或抗小鼠CD83抗体在冰上温育30分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤，然后与缀合有荧光染料的抗仓鼠IgG二级抗体在黑暗中冰上温育30分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤并在LSR II流式细胞仪上用FACSDiva软件(Becton Dickinson)通过流式细胞术分析。使用FlowJo v.9.4.11进行数据分析和图的构建。
亚克隆
将产生能够结合小鼠或人CD83的抗体的杂交瘤克隆进行至少1轮单细胞亚克隆，用于产生含有野生型小鼠IgG2a恒定区与仓鼠可变区的嵌合抗体。随后对该抗体测序。
结果
FACS结合测定的数据分析鉴定了产生具有结合CD83的能力的抗体的9个杂交瘤克隆。抗CD83抗体35G10、40A11、54D11、59G10、75A1和7C7结合表达人CD83的CHO细胞（黑线），但不结合表达小鼠CD83的细胞（虚线）或缺乏CD83表达的亲代CHO细胞（实心柱状图）（图17A-F）。抗CD83抗体60B10结合表达人CD83的CHO细胞，但还显示与表达小鼠CD83的CHO细胞的交叉反应性（图17G）。抗CD83抗体42C6和39A2特异性结合表达小鼠CD83的CHO细胞（虚线），但不结合表达人CD83的CHO细胞（黑线）或缺乏CD83表达的亲代CHO细胞系（图18A和B）。
从杂交瘤克隆中分离的抗体的测序产生了以下序列（将可变区加下划线表示，并且HVRs为粗体）：
39A2抗小鼠CD83重链DNA序列
CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTAGTGAAGCCCTCACAGTCAATGTCCCTCACTTGCTCT GTCAATGGTTTCTCCATCACCAGTCGTTACTGGTGGACCTGGATCAGGCAGTTCCCAGGGAAGAACCTGGAGTGGAT GGGTTACATAAGTTATAGTGGTGGCACCAGCTACAACCCCTCCCTCAAGAGCCGCATCTCCATCACCCGAGACACAT CCAAGAACCAGTTCTTCCTGCACCTGAACTCTGTGACCACTGCTGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGAGATCTC TACGGTACCTACTTTGATTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTATCCACTGGCTCCTGTGTGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGGTTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTCAGCAGCTCAGTGACTGTAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCACCTGCAATGTGGCCCACCCGGCAAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGAGCCCAGAGGACCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTACGCGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAA(SEQ ID NO:4)
39A2抗小鼠CD83重链氨基酸序列
QVQLKESGPGLVKPSQSMSLTCSVNGFSITSRYWWTWIRQFPGKNLEWMGYISYSGGTSYNPSLKSRIS ITRDTSKNQFFLHLNSVTTADTATYYCARDLYGTYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQID NO:5)
39A2抗小鼠CD83重链可变区氨基酸序列
QVQLKESGPGLVKPSQSMSLTCSVNGFSITSRYWWTWIRQFPGKNLEWMGYISYSGGTSYNPSLKSRIS ITRDTSKNQFFLHLNSVTTADTATYYCARDLYGTYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:6)
39A2HVR-H1氨基酸序列
GFSITSRYWWT(SEQ ID NO:7)
39A2HVR-H2氨基酸序列
GYISYSGGTSYNPSLKS(SEQ ID NO:8)
39A2HVR-H3氨基酸序列
ARDLYGTYFDY(SEQ ID NO:9)
39A2抗小鼠CD83轻链DNA序列
CAGTATGAGCTAATTCAGCCAAAGTCTGTGTCAGAGTCTCTAGGGAGAACAGTCACCATCTCCTGCAAA CGCAGCAGTGGCAACATTGGAAATAACTATGTACACTGGTACCAACAGCACTTTGGAAGCTCACCCAAAACTGTGAT CTATGATGACAATAAAAGACCATCTGGGGTTCCTCATAGGTTCTCTGGCTCCATTGACAGCTCCTCAAACTCAGCTT CCCTGACTATCACTGATCTGCAGATTGAAGATGAAGCTGAATACTACTGTCAATCTGCTTGGGTGTTCGGTTCAGGC ACCAAAGTGACTGTCCTACGCGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT(SEQ ID NO:10)
39A2抗小鼠CD83轻链氨基酸序列
QYELIQPKSVSESLGRTVTISCKRSSGNIGNNYVHWYQQHFGSSPKTVIYDDNKRPSGVPHRFSGSIDS SSNSASLTITDLQIEDEAEYYCQSAWVFGSGTKVTVLRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ IDNO:11)
39A2抗小鼠CD83轻链可变区氨基酸序列
QYELIQPKSVSESLGRTVTISCKRSSGNIGNNYVHWYQQHFGSSPKTVIYDDNKRPSGVPHRFSGSIDS SSNSASLTITDLQIEDEAEYYCQSAWVFGSGTKVTVL(SEQ ID NO:12)
39A2HVR-L1氨基酸序列
KRSSGNIGNNYVH(SEQ ID NO:13)
39A2HVR-L2氨基酸序列
DDNKRPS(SEQ ID NO:14)
39A2HVR-L3氨基酸序列
QSAWV(SEQ ID NO:15)
42C6抗小鼠CD83重链DNA序列
CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTAGTGAAGCCCTCACAGTCAATGTCCCTCACTTGCTCT GTCAATGGTTTCTCCATCACCAGTCGTTACTGGTGGACCTGGATCAGGCAGTTCCCAGGGAAGAACCTGGAGTGGAT GGGTTACATAAGTTATAGTGGTGGCACCAGCTACAACCCCTCCCTCAAGAGCCGCATCTCCATCACCCGAGACACAT CCAAGAACCAGTTCTTCCTGCACCTGAACTCTGTGACCACTGCTGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGAGATCTC TACGGTACCTACTTTGATTACTGGGGCCAAGGAACCATGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTATCCACTGGCTCCTGTGTGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGGTTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTCAGCAGCTCAGTGACTGTAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCACCTGCAATGTGGCCCACCCGGCAAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGAGCCCAGAGGACCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTACGCGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAA(SEQ ID NO:16)
42C6抗小鼠CD83重链氨基酸序列
QVQLKESGPGLVKPSQSMSLTCSVNGFSITSRYWWTWIRQFPGKNLEWMGYISYSGGTSYNPSLKSRIS ITRDTSKNQFFLHLNSVTTADTATYYCARDLYGTYFDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQID NO:17)
42C6抗小鼠CD83重链可变区氨基酸序列
QVQLKESGPGLVKPSQSMSLTCSVNGFSITSRYWWTWIRQFPGKNLEWMGYISYSGGTSYNPSLKSRIS ITRDTSKNQFFLHLNSVTTADTATYYCARDLYGTYFDYWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:18)
42C6HVR-H1氨基酸序列
GFSITSRYWWT(SEQ ID NO:19)
42C6HVR-H2氨基酸序列
GYISYSGGTSYNPSLKS(SEQ ID NO:20)
42C6HVR-H3氨基酸序列
ARDLYGTYFDY(SEQ ID NO:21)
42C6抗小鼠CD83轻链DNA序列
CAGTATGAGCTAATTCAGCCAAAGTCTGTGTCAGAGTCTCTAGGGAGAACAGTCACCATCTCCTGCAAA CGCAGCAGTGGCAACATTGGAAATAACTATGTACACTGGTACCAACAGCACTTTGGAAGCTCACCCAAAACTGTGAT CTATGATGACAATAAAAGACCATCTGGGGTTCCTCATAGGTTCTCTGGCTCCATTGACAGCTCCTCAAACTCAGCTT CCCTGACTATCACTGATCTGCAGATTGAAGATGAAGCTGAATACTACTGTCAATCTGCTTGGGTGTTCGGTTCAGGC ACCAAAGTGACTGTCCTACGCGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT(SEQ ID NO:22)
42C6抗小鼠CD83轻链氨基酸序列
QYELIQPKSVSESLGRTVTISCKRSSGNIGNNYVHWYQQHFGSSPKTVIYDDNKRPSGVPHRFSGSIDS SSNSASLTITDLQIEDEAEYYCQSAWVFGSGTKVTVLRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ IDNO:23)
42C6抗小鼠CD83轻链可变区氨基酸序列
QYELIQPKSVSESLGRTVTISCKRSSGNIGNNYVHWYQQHFGSSPKTVIYDDNKRPSGVPHRFSGSIDSSSNSASLTITDLQIEDEAEYYCQSAWVFGSGTKVTVL(SEQ ID NO:24)
42C6HVR-L1氨基酸序列
KRSSGNIGNNYVH(SEQ ID NO:25)
42C6HVR-L2氨基酸序列
DDNKRPS(SEQ ID NO:26)
42C6HVR-L3氨基酸序列
QSAWV(SEQ ID NO:27)
60B10抗人CD83重链DNA序列
CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAGCCCTCACAGTCACTGTCCCTCACTTGCTCT GTCACTGGTTTCTCCATCACCACCGGTGGTTACTGGTGGACCTGGATCAGGCAGTTCCCAGGGCAGAAGCTGGAGTG GATGGGGTACATATTTAGTAGTGGTAACACCAACTACAACCCATCCATCAAGAGCCGCATCTCCATAACCAGAGACA CATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTACTGAGGGGGACACAGCCAGATATTATTGTGCAAGG GCCTACGGTAAGCTAGGCTTTGATTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTATCCACTGGCTCCTGTGTGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGGTTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTCAGCAGCTCAGTGACTGTAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCACCTGCAATGTGGCCCACCCGGCAAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGAGCCCAGAGGACCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTACGCGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAA(SEQ ID NO:28)
60B10抗人CD83重链氨基酸序列
QVQLKESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGFSITTGGYWWTWIRQFPGQKLEWMGYIFSSGNTNYNPSIKSRI SITRDTSKNQFFLQLNSVTTEGDTARYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQID NO:29)
60B10抗人CD83重链可变区氨基酸序列
QVQLKESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGFSITTGGYWWTWIRQFPGQKLEWMGYIFSSGNTNYNPSIKSRI SITRDTSKNQFFLQLNSVTTEGDTARYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:30)
60B10HVR-H1氨基酸序列
GFSITTGGYWWT(SEQ ID NO:31)
60B10HVR-H2氨基酸序列
GYIFSSGNTNYNPSIKS(SEQ ID NO:32)
60B10HVR-H3氨基酸序列
CARAYGKLGFDY(SEQ ID NO:33)
60B10抗人CD83轻链DNA序列
CAACCTGTGCTGACTCAGTCACCCTCTGCCTCTGCCTCCCTGGGAAACTCAGTCAAAATCACCTGTACC CTGAGTAGTCAGCACAGCACCTATACCATTGGTTGGTACCAGCAACATCCAGACAAGGCTCCTAAGTATGTGATGTA TGTTAATAGTGATGGAAGCCACAGCAAGGGGGATGGGATCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAGCTCTGGGGCTCATC GTTACTTAAGCATCTCCAACATTCAGCCTGAAGATGAAGCTGACTATTTCTGTGGTTCTTCTGATAGCAGTGGGTAT GTTTTTGGCAGCGGAACCCAGCTCACCGTCCTACGCGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT(SEQ ID NO:34)
60B10抗人CD83轻链氨基酸序列
QPVLTQSPSASASLGNSVKITCTLSSQHSTYTIGWYQQHPDKAPKYVMYVNSDGSHSKGDGIPDRFSGS SSGAHRYLSISNIQPEDEADYFCGSSDSSGYVFGSGTQLTVLRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQID NO:35)
60B10抗人CD83轻链可变区氨基酸序列
QPVLTQSPSASASLGNSVKITCTLSSQHSTYTIGWYQQHPDKAPKYVMYVNSDGSHSKGDGIPDRFSGS SSGAHRYLSISNIQPEDEADYFCGSSDSSGYVFGSGTQLTVL(SEQ ID NO:36)
60B10HVR-L1氨基酸序列
TLSSQHSTYTIG(SEQ ID NO:37)
60B10HVR-L2氨基酸序列
VNSDGSHSKGD(SEQ ID NO:38)
60B10HVR-L3氨基酸序列
GSSDSSGYV(SEQ ID NO:39)
实施例11.抗CD83抗体降低了促炎细胞因子从mDCs的释放
当用抗CD83抗体60B10、35G10、40A11、54D1、59G10、75A1或7C7处理时，监测树突细胞（DCs）的抗炎应答。对于测定，将单核细胞来源的树突细胞留作未成熟DCs（iDCs）或者用含有25ng/ml rhIL-1β、100ng/ml rhIL-6、50ng/ml rhTNFα和1μg/ml PGE-2的细胞因子混合物处理以产生成熟DCs（mDCs）。将成熟的DCs用10μg/ml的所示抗CD83抗体处理并温育48小时。温育后，收集细胞培养上清液并通过ELISA(Invitrogen)根据标准制造商说明书分析所分泌的促炎细胞因子。分泌的细胞因子水平的分析显示在用抗CD83抗体60B10、35G10、40A11或7C7处理的mDCs中促炎细胞因子MCP-1的释放显著降低（图19A）。用抗CD83抗体54D1、59G10或75A1处理没有显著降低MCP-1从mDCs的产生（图19A）。
当用抗小鼠CD83抗体39A2或42C6处理时，监测DCs的抗炎应答。对于测定，将小鼠骨髓来源的DCs(BMDCs)留作未成熟DCs(iDCs)或用LPS来成熟。用39A2、42C6或可溶性小鼠CD83.Fc蛋白质处理成熟的DCs，并随后收获用于分离RNA以确定促炎细胞因子IL-12p40的表达。IL-12p40RNA水平的定量PCR分析显示用抗小鼠CD83抗体39A2或42C6与LPS刺激物一同处理DCs显著降低IL-12p40表达至与用可溶性小鼠CD83.Fc蛋白质处理的DCs中观察到的相似的水平（图19B）。
实施例12.抗CD83抗体保护小鼠免于DSS诱导的结肠炎的用途
为了评价抗CD83抗体处理在炎性肠疾病的小鼠模型中的作用，通过用葡聚糖硫酸钠(DSS)处理在小鼠中诱导结肠炎。在研究的第-1天、第1天、第3天和第5天，通过腹膜内注射每天一次给予8-10周龄的FVB小鼠200μg的抗CD83抗体39A2、42C6或60B10、或者对照抗gD抗体。在研究的第0天开始在饮用水中给予小鼠6％DSS7天。在第7天，将小鼠换为正常饮用水，直至第12天实验停止。随后将小鼠安乐死，并且将小肠和大肠切片并用H&E染色用于组织学分析。将切片随机化并进行双盲评分。用单独DSS处理的小鼠的结肠切片具有8.4的平均组织学得分（图20）。相比较而言，给予抗CD83抗体的小鼠具有显著降低的组织学得分。39A2、42C6或60B10抗体的使用分别产生5.3、5.5或5.4的平均组织学得分。

Claims (24)

1.分离的抗CD83抗体，其包含六个高变区(HVR)，所述高变区是：
(a)由SEQ ID NO:31的氨基酸序列组成的HVR-H1；
(b)由SEQ ID NO:32的氨基酸序列组成的HVR-H2；
(c)由SEQ ID NO:33的氨基酸序列组成的HVR-H3；
(d)由SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成的HVR-L1；
(e)由SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成的HVR-L2；
(f)由SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成的HVR-L3。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
3.分离的抗CD83抗体，其包含由SEQ ID NO:30的氨基酸序列组成的重链可变域，和由SEQ ID NO:36的氨基酸序列组成的轻链可变域。
4.权利要求3的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体。
5.药物组合物，其包含权利要求1-4任一项的抗体和药学上可接受的载体。
6.分离的核酸，其包含编码权利要求1-4任一项的抗CD83抗体的核苷酸序列。
7.载体，其包含权利要求6的核酸。
8.权利要求7的载体，其中所述载体是表达载体。
9.宿主细胞，其包含权利要求7或8的载体。
10.权利要求9的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核的或真核的。
11.用于制备抗CD83抗体的方法，所述方法包括在适合于表达编码抗CD83抗体的核酸的条件下培养权利要求9的宿主细胞。
12.权利要求11的方法，其还包括回收所述宿主细胞产生的抗CD83抗体。
13.抗CD83激动剂抗体在制备治疗或预防自身免疫疾病的药物中的用途，其中所述抗CD83激动剂抗体包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变区包含(a)由SEQ ID NO:31的氨基酸序列组成的HVR-H1；(b)由SEQ ID NO:32的氨基酸序列组成的HVR-H2；和(c)由SEQID NO:33的氨基酸序列组成的HVR-H3；所述轻链可变区包含(a)由SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成的HVR-L1；(b)由SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成的HVR-L2；和(c)由SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成的HVR-L3。
14.抗CD83激动剂抗体在制备治疗或预防自身免疫疾病的药物中的用途，其中所述抗体包含由SEQ ID NO:30的氨基酸序列组成的重链可变域和由SEQ ID NO:36的氨基酸序列组成的轻链可变域。
15.权利要求13或14的用途，其中所述抗CD83激动剂抗体是单克隆抗体。
16.权利要求13或14的用途，其中所述抗CD83激动剂抗体是选自Fab、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)2片段的抗体片段。
17.权利要求13或14的用途，其中所述抗CD83激动剂抗体是人源化抗体或嵌合抗体。
18.权利要求13或14的用途，其中所述自身免疫疾病选自类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、溃疡性结肠炎、韦格纳病、炎性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化症、牛皮癣、IgA肾病、IgM多发性神经病、重症肌无力、血管炎、糖尿病、雷诺氏综合征、舍格伦综合征和肾小球肾炎。
19.权利要求13或14的用途，其中所述自身免疫疾病与髓样细胞激活相关。
20.权利要求13或14的用途，其中所述自身免疫疾病是克隆病。
21.权利要求13或14的用途，其中所述自身免疫疾病是溃疡性结肠炎。
22.权利要求13或14的用途，其中所述抗CD83激动剂抗体是人抗体。
23.权利要求13或14的用途，其中所述抗CD83激动剂抗体通过静脉内、肌内、皮下、局部、经口、经皮，腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。
24.制成品，其包含权利要求13到22任一项中定义的抗CD83激动剂抗体和包装插页，所述包装插页包含使用抗CD83激动剂抗体在个体中治疗或预防自身免疫疾病的说明。
CN201280042210.6A 2011-07-01 2012-06-29 抗cd83激动剂抗体用于治疗自身免疫疾病的用途 Expired - Fee Related CN103906766B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161504127P 2011-07-01 2011-07-01
US61/504,127 2011-07-01
JP2011285585A JP2013040160A (ja) 2011-07-01 2011-12-27 自己免疫疾患を治療するための抗ｃｄ８３アゴニスト抗体の使用
JP2011-285585 2011-12-27
PCT/US2012/045142 WO2013006505A1 (en) 2011-07-01 2012-06-29 Use of anti-cd83 agonist antibodies for treating autoimmune diseases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103906766A CN103906766A (zh) 2014-07-02
CN103906766B true CN103906766B (zh) 2017-03-08

Family

ID=47888898

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280042210.6A Expired - Fee Related CN103906766B (zh) 2011-07-01 2012-06-29 抗cd83激动剂抗体用于治疗自身免疫疾病的用途

Country Status (12)

Country Link
US (1) US9562097B2 (zh)
EP (1) EP2726509B1 (zh)
JP (2) JP2013040160A (zh)
KR (1) KR20140051272A (zh)
CN (1) CN103906766B (zh)
AU (1) AU2012279175B2 (zh)
BR (1) BR112013033968A2 (zh)
CA (1) CA2840426A1 (zh)
HK (1) HK1199271A1 (zh)
MX (1) MX2014000142A (zh)
RU (1) RU2014103498A (zh)
WO (1) WO2013006505A1 (zh)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013150592A (ja) * 2011-07-01 2013-08-08 Genentech Inc 自己免疫疾患を治療するための抗ｃｄ８３アゴニスト抗体の使用
JP2013040160A (ja) 2011-07-01 2013-02-28 Genentech Inc 自己免疫疾患を治療するための抗ｃｄ８３アゴニスト抗体の使用
MX2015010023A (es) * 2013-02-01 2017-11-17 Transbio Ltd Anticuerpos anti-cd83 y su uso.
NZ731491A (en) 2014-10-23 2021-12-24 Kira Biotech Pty Ltd Cd83 binding proteins and uses thereof
WO2016081455A1 (en) * 2014-11-17 2016-05-26 Pelican Therapeutics, Inc. Human tnfrsf25 antibody
CN109369807B (zh) * 2015-01-27 2021-07-27 中国科学技术大学先进技术研究院 抗人cd83单克隆抗体及其制备、鉴定和应用
DK3468998T3 (en) 2016-06-09 2022-03-07 Pelican Therapeutics Inc Anti-tnfrsf25-antistoffer
CN111148759B (zh) * 2017-09-30 2023-09-19 合肥立方制药股份有限公司 结合至纤维连接蛋白b结构域的蛋白
JP7358369B2 (ja) * 2018-02-23 2023-10-10 エイチ リー モフィット キャンサー センター アンド リサーチ インスティテュート インコーポレイテッド Ｃｄ８３結合キメラ抗原受容体
CN114615992A (zh) * 2019-08-16 2022-06-10 H.李.莫菲特癌症中心和研究所股份有限公司 表达t调节性细胞的抗cd83嵌合抗原受体
CA3147835A1 (en) * 2019-08-16 2021-02-25 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Chimeric antigen receptors for treating myeloid malignancies
US20230051885A1 (en) * 2019-12-18 2023-02-16 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Systems and Methods for Producing Efficacious Regulatory T Cells
EP3895723A1 (en) * 2020-04-16 2021-10-20 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Scd83 for wound healing, hair growth, and skin and hair care
WO2024077052A1 (en) * 2022-10-04 2024-04-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Novel vsv virus formulations

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4657760A (en) 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
ATE108068T1 (de) 1987-09-23 1994-07-15 Bristol Myers Squibb Co Antikörper-heterokonjugate zur töting von hiv- infizierten zellen.
EP0435911B1 (en) 1988-09-23 1996-03-13 Cetus Oncology Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
DE69029036T2 (de) 1989-06-29 1997-05-22 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
JP3068180B2 (ja) 1990-01-12 2000-07-24 アブジェニックス インコーポレイテッド 異種抗体の生成
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
JPH06507398A (ja) 1991-05-14 1994-08-25 リプリジェン　コーポレーション Ｈｉｖ感染治療のための異種複合抗体
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
WO1994004690A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
DE69329503T2 (de) 1992-11-13 2001-05-03 Idec Pharma Corp Therapeutische Verwendung von chimerischen und markierten Antikörpern, die gegen ein Differenzierung-Antigen gerichtet sind, dessen Expression auf menschliche B Lymphozyt beschränkt ist, für die Behandlung von B-Zell-Lymphoma
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE19544393A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide Mischungen
KR20080059467A (ko) 1996-12-03 2008-06-27 아브게닉스, 인크. 복수의 ｖｈ 및 ｖｋ 부위를 함유하는 사람 면역글로불린유전자좌를 갖는 형질전환된 포유류 및 이로부터 생성된항체
WO1999029888A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US20040185040A1 (en) * 2001-11-21 2004-09-23 Celltech R & D Limited Modulating immune responses
WO2003045318A2 (en) 2001-11-21 2003-06-05 Celltech R & D, Inc. Manipulation of cytokine levels using cd83 gene products
AU2002950779A0 (en) 2002-08-15 2002-09-12 The Corporation Of The Trustees Of The Order Of The Sisters Of Mercy In Queensland A method of immunomodulation
EP1572976B1 (en) 2002-11-21 2010-09-15 Celltech R & D, Inc. Modulating immune responses
US7169898B2 (en) * 2002-12-04 2007-01-30 Alexander Steinkasserer Soluble CD83 proteins and use thereof for the treatment or prevention of a disease or medical condition caused by dysfunction or undesired function of a cellular immune response involving T cells
CA2587143C (en) * 2004-12-08 2017-12-05 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for immunotherapy and detection of inflammatory and immune-dysregulatory disease, infectious disease, pathologic angiogenesis and cancer
JP2013040160A (ja) 2011-07-01 2013-02-28 Genentech Inc 自己免疫疾患を治療するための抗ｃｄ８３アゴニスト抗体の使用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Two Novel Monoclonal Antibodies Produced Against Human CD83 Molecule;LIWEN CHEN ET AL.;《HYBRIDOMA》;20110601;297-302 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2840426A1 (en) 2013-01-10
EP2726509A4 (en) 2015-01-28
JP2013040160A (ja) 2013-02-28
US9562097B2 (en) 2017-02-07
HK1199271A1 (zh) 2015-06-26
US20140286950A1 (en) 2014-09-25
CN103906766A (zh) 2014-07-02
EP2726509B1 (en) 2018-05-02
EP2726509A1 (en) 2014-05-07
KR20140051272A (ko) 2014-04-30
MX2014000142A (es) 2014-04-25
WO2013006505A1 (en) 2013-01-10
BR112013033968A2 (pt) 2017-12-12
RU2014103498A (ru) 2015-08-10
AU2012279175B2 (en) 2017-02-02
JP6198730B2 (ja) 2017-09-20
JP2015511931A (ja) 2015-04-23
AU2012279175A1 (en) 2013-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103906766B (zh) 抗cd83激动剂抗体用于治疗自身免疫疾病的用途
US11084875B2 (en) Anti-TREM2 antibodies and methods of use thereof
US8968739B2 (en) Antibody and methods for selective inhibition of T-cell responses
CN103709249B (zh) 抗体及其制备和使用方法
CN105793288A (zh) 抗pdl1抗体配制剂
US20220241330A1 (en) Immune cell receptors comprising cd4 binding moieties
CN105143876B (zh) 生物标志物用于评估用β7整联蛋白拮抗剂治疗胃肠炎性病症的用途
CN105899535A (zh) 用pd-1轴结合拮抗剂和抗cd20抗体治疗癌症的方法
CN106279401A (zh) Cd40片段及其用途
CN105209643A (zh) 用于诊断和治疗炎性肠病的方法
KR20210031898A (ko) 전염병을 치료하기 위한 공동수용체 시스템
WO2010118243A2 (en) Use of il-27 antagonists to treat lupus
US8722049B2 (en) Antibody and methods for selective inhibition of T-cell responses
JP2013150592A (ja) 自己免疫疾患を治療するための抗ｃｄ８３アゴニスト抗体の使用
KR20150084831A (ko) 항원-특이적 형질모세포의 풍부화

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1199271

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1199271

Country of ref document: HK

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20170308

Termination date: 20210629