CN101022829A - 用抗cd20抗体治疗多软骨炎和多发性单神经炎 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用有效量的结合CD20的抗体，任选与有效量的治疗所述紊乱的另一种试剂一起，治疗哺乳动物中的多软骨炎或多发性单神经炎。

Description

用抗CD20抗体治疗多软骨炎和多发性单神经炎

相关申请

本申请要求2004年4月16日提交的美国临时申请60/563,227和2004年4月22日提交的60/565,098的优先权，本申请根据35U.S.C.§119要求这些美国临时申请的优先权，将其内容加入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及用结合B细胞表面标记诸如CD19或CD20的拮抗剂，如结合CD20的抗体来治疗疾病。

发明背景

淋巴细胞是造血作用过程中于骨髓中产生的许多种白细胞之一。有两种主要的淋巴细胞群：B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞)。本文特别感兴趣的淋巴细胞是B细胞。

B细胞在骨髓中成熟并离开骨髓在其细胞表面表达结合抗原的抗体。当幼稚B细胞首次遭遇其膜结合抗体对之特异的抗原时，细胞开始快速分裂，其后代分化为记忆B细胞和称为“浆细胞”的效应细胞。记忆B细胞具有更长的寿命，继续表达与原始亲本细胞具有相同特异性的膜结合抗体。浆细胞不生成膜结合抗体，但转而生成可分泌形式的抗体。分泌型抗体是体液免疫的主要效应分子。

CD20抗原(也称为人B淋巴细胞限制性分化抗原，Bp35)为疏水性跨膜蛋白，分子量约35kD，位于前B淋巴细胞和成熟B淋巴细胞上(Valentine等，J.Biol.Chem.264(19)：11282-11287(1989)；和Einfeld等，EMBO J.7(3)：711-717(1988))。该抗原也表达于超过90％的B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)上(Anderson等，Blood63(6)：1424-1433(1984))，但在造血干细胞、原B细胞、正常浆细胞或其他正常组织上没有发现(Tedder等，J.Immunol.135(2)：973-979(1985))。CD20调节细胞周期起始和分化的激活进程的早期步骤(Tedder等，同上)，可能作为钙离子通道起作用(Tedder等，J.Cell.Biochem.14D：195(1990))。

考虑到CD20在B细胞淋巴瘤中表达，此抗原可以作为这些淋巴瘤靶向的候选物。本质上，这样的靶向可以概括如下：将特异于B细胞的CD20表面抗原的抗体施用于患者。这些抗CD20抗体特异地结合正常和恶性B细胞的CD20抗原(表面上)；结合于CD20表面抗原的抗体可导致赘生性B细胞的破坏和损耗。另外，可以将具有破坏肿瘤潜力的化学试剂或放射性标记物缀合于抗CD20抗体以将试剂特异性地“递送”到赘生性B细胞。不考虑方法，首要目标是破坏肿瘤；可以由所使用的特定抗CD20抗体决定特定方法，这样，可获得的靶向CD20抗原的方法可以有相当大的变化。

CD19是表达于B系细胞表面的另一抗原。象CD20一样，CD19发现于该系所有分化细胞，自干细胞阶段直至刚要最终分化为浆细胞前的那一点(Nadler，L.，Lymphocyte Typing II2：3-37和Appendix，Renling等编(1986)，Springer Verlag)。然而，与CD20不同，结合CD19的抗体使CD19抗原内在化。CD19抗原由HD237-CD19抗体(也称为″AB4″抗体)等鉴定(Kiesel等，Leukemia Research II，12：1119(1987))。CD19抗原存在于4-8％的外周血单核细胞和分离自外周血、脾、淋巴结或扁桃体的90％以上的B细胞上。在外周血T细胞、单核细胞、或粒细胞上没有检测到CD19。事实上，所有非T细胞急性成淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)和B细胞淋巴瘤都表达可用抗体B4检测的CD19(Nadler等，J.Immunol.131：244(1983)；和Nadler等，Progress in Hematology，Vol.XII，pp.187-206，Brown，E.编(1981)，Grune&Stratton，Inc.)。

已经鉴定了识别由B细胞系细胞表达的分化阶段特异性抗原的其他抗体。这些当中有针对CD21抗原的B2抗体；针对CD22抗原的B3抗体；和针对CD10抗原(也称为CALLA)的J5抗体。参见例如公布于1997年1月21日的美国专利5,595,721(Kaminski等)。

rituximab(RITUXAN)抗体是针对CD20抗原的遗传工程化嵌合鼠/人单克隆抗体。Rituximab是公布于1998年4月7日的美国专利5,736,137(Anderson等)中称为“AC2B8”的抗体。RITUXAN指定用于复发或难治的低级或滤泡性CD20阳性B细胞非何杰金氏淋巴瘤患者的治疗(Maloney等，Blood82(Suppl1)：445a(1993)；Maloney等，Proc Am Soc Clin Oncol13：993(1994))。体外作用机理研究已证明RITUXAN通过补体依赖性细胞毒性(CDC)结合人补体并裂解淋巴样B细胞系(Reff等，Blood83(2)：435-445(1994))。另外，它在抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)试验中具有显著的活性。近来，已证明RITUXAN在氚标记胸苷掺入试验中具有抗增殖效果，并直接诱导凋亡，而其他的抗CD19和CD20抗体不能(Maloney等，Blood88(10)：637a(1996))。也已通过试验观察到RITUXAN与化疗和毒素之间的协同作用。特别地，RITUXAN使抗药性人B细胞淋巴瘤细胞系对多柔比星、CDDP、VP-16、白喉毒素和蓖麻毒素的细胞毒性作用敏感(Demidem等，Cancer Chemotherrapy & Radiopharrmaceuticals12(3)：177-186(1997)；DemidemA等，FASEB J9：A206(1995))。体内临床前研究已证明RITUXAN损耗来自猕猴外周血、淋巴结、和骨髓的B细胞，可能是通过补体和细胞介导的进程(Reff等，同上)。

也已在B细胞和自身抗体看起来在疾病病理生理学中起作用的多种非恶性自身免疫紊乱中研究了Rituximab。Edwards等，Biochem Soc.Trans.30：824-828(2002)。已报导Rituximab潜在地减轻例如类风湿性关节炎(RA)(Leandro等，Ann.Rheum.Dis.61：883-888(2002)；Edwards等，ArthritisRheum.，46(Suppl.9)：S46(2002)；Stahl等，Ann.Rheum.Dis.，62(Suppl.1)：OP004(2003)；Emery等，Arthritis Rheum.48(9)：S439(2003))、狼疮(Eisenberg，Arthritis.Res.Ther.5：157-159(2003)；Leandro等，Arthritis Rheum.46：2673-2677(2002)；Gorman等，Lupus，13：312-316(2004))、免疫性血小板减少性紫癜(D′Arena等，Leuk.Lymphoma44：561-562(2003)；Stasi等，Blood，98：952-957(2001)；Saleh等，Semin.Oncol.，27(Supp12)：99-103(2000)；Zaia等，Haematolgica，87：189-195(2002)；Ratanatharathorn等，Ann.Int.Med.，133：275-279(2000))、单纯红细胞发育不全(Auner等，Br.J.Haematol.，116：725-728(2002))；自身免疫性贫血(Zaja等，Haematologica87：189-195(2002)(在Haematologica87：336(2002)中出现勘误)、冷凝集素疾病(Layios等，Leukemia，15：187-8(2001)；Berentsen等，Blood，103：2925-2928(2004)；Berentsen等，Br.J.Haematol.，115：79-83(2001)；Bauduer，Br.J.Haematol.，112：1083-1090(2001)；Damiani等，Br.J.Haematol.，114：229-234(2001))、严重胰岛素抗性B型综合征(Coll等，N.Engl.J.Med.，350：310-311(2004))、混合冷球蛋白血症(DeVita等，Arthritis Rheum.46Suppl.9：S206/S469(2002))、重症肌无力(Zaja等，Neurrology，55：1062-63(2000)；Wylam等，J.pediatr，143：674-677(2003))、瓦格纳氏肉芽肿(Specks等，Arthritis &Rheumatism44：2836-2840(2001))、难治性寻常天疱疮(Dupuy等，ArchDermatol.，140：91-96(2004))、皮肌炎(Levine，Arthritis Rheum.，46(Suppl.9)：S1299(2002))、斯耶格伦氏综合征(Somer等，Arthritis & Rheumatism，49：394-398(2003))、活性II型混合冷球蛋白血症(Zaja等，Blood，101：3827-3834(2003))、寻常天疱疮(Dupay等，Arch.Dermatol.，140：91-95(2004))、自身免疫性神经病(Pestronk等，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry74：485-489(2003))、副肿瘤性视性眼阵挛-肌阵挛综合征(Pranzatelli等，Neurology60(Suppl.1)PO5.128：A395(2003))、以及复发-缓和型多发性硬化(RRMS)的征候和症状。Cross等，(摘要)″Preliminary Results from a Phase II Trial ofRituximab in MS″，美国多发性硬化研究与治疗委员会第八次年会，20-21(2003)。

已在类风湿性关节炎(RA)患者中进行了II期研究(WA16291)，提供了有关Rituximab的安全性和功效的48周跟踪数据。Emery等，Arthritis Rheum48(9)：S439(2003)；Szczepanski等，Arthritis Rheum48(9)：S121(2003)。将总共161名患者随机地平均分为四个治疗组：甲氨蝶呤、仅rituximab、rituximab联合甲氨蝶呤、rituximab联合环磷酰胺(CTX)。rituximab治疗方案为第1天和第15天静脉内施用一克。大多数RA患者对输注rituximab都很好地耐受，其中36％的患者在其首次输注期间经历至少一种不良后果(与30％接受安慰剂的患者相比)。总的说来，认为大多数不良后果在严重程度上都是温和至中度的，所有处理组之间都很平衡。48周中所有四个组共有19件严重的不良事件，其中rituximab/CTX组中稍多一些。所有组之间的感染发生率都很平衡。该RA患者群体中严重感染的平均比率为每100患者-年4.66，低于基于社会的流行病学研究所报导的需要住院的RA患者感染比率(每100患者-年为9.57)。Doran等，Arthritis Rheum.46：2287-2293(2002)。

所报导的rituximab在少数神经病学紊乱患者中的安全谱，包括自身免疫性神经病(Pestronk等，同上)、视性眼阵挛-肌阵挛综合征(Pranzatelli等，同上)、和RRMS(Cross等，同上)，与在肿瘤学或RA中所报导的类似。正在RRMS患者中进行的rituximab与干扰素-β(IFN-β)或醋酸格拉默联合的研究者发起试验(IST)(Cross等，同上)中，10名受治疗患者中有1个在首次rituximab输注后经历了中度发烧和打寒战，之后入院彻夜观察，而其他9名患者完成了四次输注方案，没有报导任何不良事件。

关注CD20抗体和CD20结合分子的专利和专利出版物包括美国专利5,776,456，5,736,137，5,843,439，6,399,061，和6,682,734，以及US2002/0197255，US2003/0021781，US2003/0082172，US2003/0095963，US2003/0147885(Anderson等)；美国专利6,455,043和WO2000/09160(Grillo-Lopez，A.)；WO2000/27428(Grillo-Lopez和White)；WO2000/27433(Grillo-Lopez和Leonard)；WO2000/44788(Braslawsky等)；WO2001/10462(Rastetter，W.)；WO01/10461(Rastetter和White)；WO2001/10460(White和Grillo-Lopez)；US2001/0018041，US2003/0180292，WO2001/34194(Hanna和Hariharan)；US2002/0006404和WO2002/04021(Hanna和Hariharan)；US2002/0012665和WO2001/74388(Hanna，N.)；US2002/0058029(Hanna，N.)；US2003/0103971(Hariharan和Hanna)；US2002/0009444和WO2001/80884(Grillo-Lopez，A.)；WO2001/97858(White，C.)；US2002/0128488和WO2002/34790(Reff，M.)；WO2002/060955(Braslawsky等)；WO2002/096948(Braslawsky等)；WO2002/079255(Reff和Davies)；美国专利6,171,586和WO1998/56418(Lam等)；WO1998/58964(Raju，S.)；WO1999/22764(Raju，S.)；WO1999/51642，美国专利6,194,551，美国专利6,242,195，美国专利6,528,624和美国专利6,538,124(Idusogie等)；WO2000/42072(Presta，L.)；WO2000/67796(Curd等)；WO2001/03734(Grillo-Lopez等)；US2002/0004587和WO2001/77342(Miller和Presta)；US2002/0197256(Grewal，I.)；US2003/0157108(Presta，L.)；美国专利6,565,827，6,090,365，6,287,537，6,015,542，5,843,398，和5,595,721(Kaminski等)；美国专利5,500,362，5,677,180，5,721,108，6,120,767，和6,652,852(Robinson等)；美国专利6,410,391(Raubitschek等)；美国专利6,224,866和WO00/20864(Barbera-Guillem，E.)；WO2001/13945(Barbera-Guillem，E.)；WO2000/67795(Goldenberg)；US2003/0133930和WO2000/74718(Goldenberg和Hansen)；US2003/0219433和WO2003/68821(Hansen等)；WO2004/058298(Goldenberg和Hansen)；WO2000/76542(Golay等)；WO2001/72333(Wolin和Rosenblatt)；美国专利6,368,596(Ghetie等)；美国专利6,306,393和US2002/0041847(Goldenberg，D.)；US2003/0026801(Weiner和Hartmann)；WO2002/102312(Engleman，E.)；US2003/0068664(Albitar等)；WO2003/002607(Leung，S.)；WO2003/049694，US2002/0009427，和US2003/0185796(Wolin等)；WO2003/061694(Sing和Siegall)；US2003/0219818(Bohen等)；US2003/0219433和WO2003/068821(Hansen等)；US2003/0219818(Bohen等)；US2002/0136719(Shenoy等)；WO2004/032828(Wahl等)；以及WO2002/56910(Hayden-Ledbetter)。也可参见美国专利5,849,898和EP330,191(Seed等)；EP332,865A2(Meyer和Weiss)；美国专利4,861,579(Meyer等)；US2001/0056066(Bugelski等)；WO1995/03770(Bhat等)；US2003/0219433A1(Hansen等)；WO2004/035607(Teeling等)；WO2004/056312(Lowman等)；US2004/0093621(Shitara等)；WO2004/103404(Watkins等)；WO2005/000901(Tedder等)；US2005/0025764(Watkins等)；WO2005/016969(Carr等)；以及US2005/0069545(Carr等)。WO2004/032828述及复发性多软骨炎作为将用抗CD20抗体治疗的一系列免疫紊乱中的一种。

关注用rituximab治疗的出版物包括：Perotta和Abuel，“Response ofchronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab”摘要#3360Blood10(1)(part 1-2)：p.88B(1998)；Perotta等，″Rituxan in the treatment of chronicidiopathic thrombocytopaenic purpura(ITP)″，Blood，94：49(摘要)(1999)；Matthews，R.，“Medical Heretics”New Scientist(7April，2001)；Leandro等，“Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with Blymphocyte depletion”Ann Rheum Dis，同上；Leandro等，“Lymphocytedepletion in rheumatoid arthritis：early evidence for safety，efficacy and doseresponse″Arthritis and Rheumatism44(9)：S370(2001)；Leandro等，“An openstudy of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus”，Arthritis andRheumatism，46：2673-2677(2002)，其中在2周期间，每名患者接受两次500mgrituximab输注、两次750mg环磷酰胺输注、和高剂量口服皮质类固醇，其中两名受治疗的患者分别在第7和8个月时复发，且已用不同方案再次治疗；″Successful long-term treatment of systemic lupus erythematosus withrituximab maintenance therapy″Weide等，Lupus，12：779-782(2003)，其中用rituximab治疗的患者(375mg/m²x4，每周重复一次)，并且每5-6个月应用更多的rituximab，然后每三个月用375mg/m²的rituximab进行维持治疗，且成功地用rituximab治疗第二名难治的SLE患者且每三个月接受维持治疗，两名患者对rituximab治疗都有较好的响应；Edwards和Cambridge，“Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed todeplete B lymphocytes”Rheumatology40：205-211(2001)；Cambridge等，″Blymphocyte depletion in patients with rheumatoid arthritis：serial studies ofimmunological parameters″Arthritis Rheum.，46(Suppl.9)：S1350(2002)；Edwards等，“B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and otherautoimmune disorders”Biochem Soc.Trans.，同上；Edwards等，“Efficacy andsafety of rituximab，a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody：Arandomized，placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis.Arthritis and Rheumatism46(9)：S197(2002)；Edwards等，″ 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B cells in patient withrheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus″Arthritis Rheum.，48(Suppl9)：S1160(2003)。

Sarwal等，N.Eng.J. Med.349(2)：125-138(July10，2003)报导了急性肾同种异体移植物排斥中由DNA微阵列分布所鉴定的分子异质性。

复发性多软骨炎是罕见的、慢性软骨疾病，其特征在于身体多种组织软骨炎症的再发性发作。会发炎的含软骨组织包括耳、鼻、关节、脊柱、以及气管。具有的生物化学组成与软骨类似的眼睛、心脏、和血管也可能受到影响。

复发性多软骨炎的病因不明。怀疑该疾患由免疫系统紊乱(自身免疫)引发，其中机体免疫系统(其在正常情况下抗击身体的入侵者，尤其是感染)受到误导。这导致针对多种机体组织的炎症。发现可通过抗炎药和多种类固醇缓解。

多发性单神经炎是痛苦的不对称不同步感觉和运动周围神经病，涉及至少两个分开的神经区域的隔离损害。身体任意区域的多种神经都能受到影响。状况恶化时，其多灶性变得更少且更加对称，类似于多神经病。多发性单神经病综合征可以双侧、远端、和近端分布遍及全身。对神经的损伤包括轴突的破坏(即神经细胞中类似于电线之铜部分的部分)，因此在损伤部位干扰神经传导。常见病因包括糖尿病和多发性神经压迫，以及由血流减少或血管炎症引起的缺氧。约三分之一的病例没有鉴定病因。多发性特异性紊乱与多发性单神经炎相关，包括(但不限于)血管疾病诸如结节性多动脉炎和其他血管炎性疾病、糖尿病、以及结缔组织疾病诸如类风湿性关节炎或系统性红斑狼疮。结缔组织疾病是儿童中最常见的病因。不太常见的病因包括：斯耶格伦氏综合征(Sjgren′s syndrome)、韦格纳氏肉芽肿(Wegener′s granulomatosis)、引起血管炎症的超敏反应(变态反应)、麻风病、结节病、淀粉样变性、多灶形式的糖尿病性神经病、以及血液紊乱(诸如嗜曙红细胞增多症和冷球蛋白血症)。参见例如Hattori等，Brain122(3)：427-439(1999)，其中评估了28名与丘-施二氏综合征相关的周围神经病患者的临床病理学特征，感觉和运动关联在初期主要表现为多发性单神经炎样式，发展为不对称多神经病，限于四肢。CD20阳性B淋巴细胞只是偶尔见到。

神经病的治疗取决于其病因，许多神经病可以通过解决其根本病因(诸如维生素缺乏)来治疗。其它的可以预防其发生。例如，控制糖尿病可以预防糖尿病性神经病。如果病因是肿瘤或椎间盘破裂，则治疗可能涉及去除肿瘤或修复破裂椎间盘的外科手术。在卡陷性或压迫性神经病中，治疗可能由尺神经或正中神经的夹板或手术减压组成。腓侧和径向压迫性神经病可能需要避免压力。物理疗法和/或夹板可能有助于预防挛缩(其中关节周围缩短的肌肉引起异常且有时是关节的疼痛位置)。可以通过针对免疫系统的异常特征的治疗来改善与免疫性疾病相关的神经病。这样的治疗包括静脉内免疫球蛋白、血浆交换和免疫抑制疗法(Cook等，Neurology40：212-214(1990)；Dyck等，N.Engl.J.Med325：1482-1486(1991)；Emerudh等，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry55：930-934(1992)；Blume等，Neurology45：1577-1580(1995)；Pestronk等，Neurology44：2027-2031(1994))。这些可能产生最小的功能改善。此外，所述治疗可能是昂贵且费时的。

有关针对B细胞表面膜标志物的抗体定向治疗的文献非常有限。Levine和Pestronk描述了具有神经病和针对GM1或MAG的免疫球蛋白M抗体的五名患者，其用rituximab来治疗。在3-6个月的治疗中，所有五名患者的机能都得到改善，且血清抗体滴度降低(Levine和Pestomk，Am.J.Neurol.52：1701-1704(1999))。

即使没有特效疗法，神经病的疼痛通常也是可以控制的，诸如借助于镇痛药、疼痛药疗、三环抗抑郁药、抗癫痫药疗、或神经阻断剂。

Sutton和Winer，Current Opinion in Pharmacology2/3：291-295(June1，2002)指出血浆交换、静脉内免疫球蛋白和皮质类固醇仍然是炎性神经病治疗的支柱。近来的试验表明将这些疗法联合起来与单一试剂治疗相比并非显著更为有效。由于开放式研究(open-label study)中的少数患者的治疗，新的免疫疗法和胞毒剂的有效性很难确定。

Lee等，Bone Marrow Transplantation30/1：53-56(2002)提示高剂量化疗和自体外周血干细胞(PBSC)移植可能在因严重进行性且治疗抗性的未定性单克隆丙种球蛋白病(MGUS)继发的周围神经病的治疗中具有一定作用。Latov等，Neurology52：A551(1999)披露RITUXAN在两名与IgM单克隆丙种球蛋白病和抗MAG抗体活性相关的神经病患者的治疗中看起来是安全有效的。Canavan等，Neurology58/7(Suppl.3)：A233(April2002)公开了RITUXAN与大多数接受治疗的显示与IgM自身抗体相关的多神经病的患者持续的临床改善相关。

关于用抗CD20抗体对干扰素-α抗性混合冷球蛋白血症的单克隆抗体治疗，Sansonno等，Blood101(10)：3818-3826(May15 2003)披露了用RITUXAN治疗周围神经病。

Hattori等，Brain122/3：427-439(1999)评估了与丘-施二氏综合征相关的周围神经病患者的临床病理学特征，认为CD20阳性B淋巴细胞只是偶尔见到。

Zaja等，Blood101(10)：3827-3834(May15 2003)披露了在II型混合冷球蛋白血症(MC)中RITUXAN可能是标准免疫抑制的安全有效的替代方案。证实RITUXAN对皮肤血管炎表现(溃疡、紫癜、或荨麻疹)、周围神经病的主观症状、低级B细胞淋巴瘤、关节痛、和发烧是有效的。Zaidi等，Leukemia and Lymphoma45/4：777-780(2004)公开了用RITUXAN成功治疗了淋巴瘤样肉芽肿(LYG)，它是罕见的淋巴增生性紊乱，第一年的死亡率接近60％，涉及肺、肝、中枢和周围神经系统。然而，Trojan等，Annals ofOncology13/5：802-805(2002)披露了RITUXAN对于因神经淋巴瘤病而患有周围神经病的患者看起来是无效的。在嵌入式PET-CT系统上实施的融合PET-CT成像显示，多发性小结节病变沿着相应于转化B细胞非何杰金氏淋巴瘤早期复发的周围神经蔓延。

Binstadt等，Journal of pediatrics143/5：598-604(November2003)断定RITUXAN在难以用传统免疫抑制药疗治疗的多系统自身免疫性疾病的四名小儿患者中是安全有效的，其中每个都与中枢神经系统(CNS)有关。一名自身免疫性血细胞减少症和自身免疫性CNS和周围神经系统疾病患者其血细胞减少症已经解决，神经学症状有了显著改善；报道说该患者目前不再接受免疫抑制药疗。两名具有淋巴浆细胞性结肠炎、肺结节和CNS疾病的半同胞其症状已经改善。第四名患因原发性抗磷脂抗体综合征而继发舞蹈病和癫痫的患者在精巧性和总运动机能上已得到改善并且癫痫发作频率降低。Saito等，Lupus12/10：798-800(2003)披露RITUXAN可用于与高活性B淋巴细胞相关的系统性红斑狼疮(SLE)牵涉的难治性狼疮肾炎和CNS患者的治疗。

本领域需要更多的药物以治疗各种病症，诸如多软骨炎(polychondritis)和多发性单神经炎(mononeuritis multiplex)。

发明概述

因此，本发明正如所要求的。具体而言，本发明在第一个方面提供了治疗哺乳动物中的多软骨炎或多发性单神经炎的方法，包括对所述哺乳动物施用有效量的结合CD20的抗体。

在该方法的一个实施方案中，所述抗体未与另一分子偶联。在另一个实施方案中，所述抗体已与另一分子偶联，例如胞毒剂，诸如放射性化合物，如Y2B8或¹³¹I-B1。在另一个实施方案中，所述抗体包括rituximab或人源化2H7。在一个实施方案中，所述人源化2H7包括SEQ ID NO：2和8中的可变区序列。在另一个实施方案中，人源化2H7包括具有改变N100A或D56A、N100A的SEQ ID NO：8中的重链可变区和具有改变M32L、S92A、或M32L、S92A的SEQ ID NO：2中的轻链可变区。在又一个实施方案中，所述人源化2H7包括SEQ ID NO：30的轻链可变区(V_L)序列和SEQ ID NO：8的重链可变区(V_H)序列，其中所述抗体进一步包含V_H-CDR2中的氨基酸替代D56A，且V_H-CDR3中的N100用Y或W替代，更优选所述抗体包括SEQID NO：31的v511轻链序列和SEQ ID NO：32的重链序列。

优选以约20mg/m²至约250mg/m²所述抗体的剂量的哺乳动物施用所述抗体，更优选约50mg/m²至约200mg/m²。在另一个优选实施方案中，所述方法包括施用初始剂量的抗体，然后施用后续剂量，其中后续剂量中抗体的mg/m²剂量大于初始剂量中抗体的mg/m²剂量。

在又一个优选实施方案中，所述哺乳动物是人。优选静脉内或皮下施用所述抗体。

在一个优选实施方案中，所述方法本质上由对哺乳动物施用所述抗体组成。

在另一个优选方面，所述方法进一步包括对所述哺乳动物施用有效量的免疫抑制剂、止痛剂、或化疗剂。

在更多实施方案中，如果是治疗多软骨炎，所述方法进一步包括对所述哺乳动物施用有效量的非类固醇抗炎药、类固醇、或免疫抑制剂诸如甲氨蝶呤(methotrexate)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、氨苯砜(dapsone)、硫唑嘌呤(azathioprine)、青霉胺(penicillamine)或环孢霉素(cyclosporine)。如果是治疗多发性单神经炎，所述方法进一步包括对所述哺乳动物施用有效量的止痛剂、类固醇、甲氨蝶呤、环磷酰胺、血浆交换、静脉内免疫球蛋白、环孢霉素、或霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)。

在又一个方面，本发明涉及包括容器和装在容器中的组合物的制品，其中所述组合物包含结合CD20的抗体，且还包括指导用户使用所述组合物以治疗哺乳动物中的多软骨炎或多发性单神经炎的包装插页。在一个优选实施方案中，所述制品还包括装有除所述抗体之外用于治疗的药剂的容器，且还包括有关用该药剂治疗哺乳动物的说明书。

附图简述

图1A为比较鼠2H7(SEQ ID NO：1)、人源化2H7.v16变体(SEQ IDNO：2)、和人κ轻链亚组I(SEQ ID NO：3)每种的轻链可变区(V_L)氨基酸序列的序列对比。2H7和hu2H7.v16的V_L的CDR如下：CDR1(SEQ ID NO：4)、CDR2(SEQ ID NO：5)、及CDR3(SEQ ID NO：6)。

图1B为比较鼠2H7(SEQ ID NO：7)、人源化2H7.v16变体(SEQ IDNO：8)、和人重链亚组III共有序列(SEQ ID NO：9)每种的重链可变区(V_H)氨基酸序列的序列对比。2H7和hu2H7.v16的V_H的CDR如下：CDR1(SEQ IDNO：10)、CDR2(SEQ ID NO：11)、及CDR3(SEQ IDNO：12)。

图1A和图1B中，每条链中的CDR1、CDR2和CDR3都包括在括号内，侧翼为框架区FR1-FR4，如图所示。2H7指鼠2H7抗体。两行序列之间的星号指示两种序列之间不同的位置。按照Kabat等，《Sequences ofImmunological Interest》，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1991)为残基编号，插入显示为a、b、c、d、和e。

图2显示了用于构建2H7Fab质粒的噬菌粒pVX4(SEQ ID NO：13{5′序列}和SEQ ID NO：14{3′互补序列})的核苷酸序列(参见实施例1)，以及用于CDR移植的抗IFN-α人源化抗体的Fab的轻链(SEQ ID NO：15)和重链(SEQID NO：16)氨基酸序列。

图3显示了编码嵌合2H7.v6.8Fab的表达质粒的核苷酸序列(SEQ IDNO：17{5′序列}和SEQ ID NO：18{3′互补序列})。显示了轻链(SEQ ID NO：19)和重链(SEQ ID NO：20)的氨基酸序列。

图4显示了质粒pDR1的核苷酸序列(SEQ ID NO：21；5391bp)，该质粒用于如实施例1所述免疫球蛋白轻链的表达。pDR1包含编码无关抗体，人源化抗CD3抗体轻链的序列(Shalaby等，J.Exp.Med.175：217-225(1992))，其起始和终止密码子以粗体和下划线表示。

图5显示了质粒pDR2的核苷酸序列(SEQ ID NO：22；6135bp)，该质粒用于如实施例1所述免疫球蛋白重链的表达。pDR2包含编码无关抗体，人源化抗CD3抗体重链的序列(Shalaby等，同上)，其起始和终止密码子以粗体和下划线表示。

图6A和6B显示了2H7.v16的轻链氨基酸序列，其中图6A显示包含DIQ前最初19个氨基酸的完整轻链(SEQ NO：23)，所述最初19个氨基酸为成熟多肽链中所没有的分泌信号序列，图6B显示成熟多肽轻链(SEQ IDNO：24)。

图7A和7B显示了2H7.v16的重链氨基酸序列，其中图7A显示包含EVQ前最初19个氨基酸的完整重链(SEQ ID NO：25)，所述最初19个氨基酸为成熟多肽链中所没有的分泌信号序列，图7B显示成熟多肽重链(SEQ IDNO：26)。将图1B中的V_H序列(SEQ ID NO：8)与完整重链序列进行比对，人γ1恒定区来自SEQ ID NO：25的氨基酸位置114-471。

图8A和8B显示了2H7.v31的重链氨基酸序列，其中图8A显示包含EVQ前最初19个氨基酸的完整重链(SEQ ID NO：27)，所述最初19个氨基酸为成熟多肽链中不存在的分泌信号序列，图8B显示成熟多肽重链(SEQ IDNO：28)。L链与2H7.v16的(参见图6)相同。

图9为概括从鼠2H7到直至v75的人源化型式亚组的氨基酸变化的流程图。

图10为比较人源化2H7.v16变体(SEQ ID NO：2)和人源化2H7.v138变体(SEQ ID NO：29)的轻链氨基酸序列的序列对比。

图11为比较人源化2H7.v16变体(SEQ ID NO：8)和人源化2H7.v138变体(SEQ ID NO：30)的重链氨基酸序列的序列对比。

优选实施方案的详细描述

I.定义

“B细胞表面标志”或“B细胞表面抗原”在本文中指在B细胞表面上表达、可用与其结合的拮抗剂靶向它的抗原。例示性B细胞表面标志包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86白细胞表面标志。(关于介绍参见《The Leukocyte Antigen Facts Book》，第2版，1997，Barclay等编，Academic Press，Harcourt Brace & Co.，New York)。其它B细胞表面标志包括RP105、FcRH2、CD79A、C79B、B细胞CR2、CCR6、CD72、P2X5、HLA-DOB、CXCR5、FCER2、BR3、Btig、NAG14、SLGC16270、FcRH1、IRTA2、ATWD578、FcRH3、IRTA1、FcRH6、BCMA和239287_at。特别感兴趣的B细胞表面标志是与哺乳动物的其它非B细胞组织相比，优先在B细胞上表达，且可以在前体B细胞和成熟B细胞上表达。

“CD20”抗原或“CD20”是在超过90％来自外周血或淋巴样器官的B细胞表面上发现的约35kDa非糖基化磷蛋白。CD20存在于正常B细胞及恶性B细胞上，但在干细胞上不表达。文献中CD20的其它名称包括“B淋巴细胞限制型抗原”和“Bp35”。例如，Clark等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，82：1766(1985)中介绍了CD20抗原。

“CD22”抗原或“CD22”，也称为BL-CAM或Lyb8，是1型整合膜糖蛋白，分子量约130(减少的)至140kD(未减少的)。它表达于B淋巴细胞的细胞质和细胞膜。CD22抗原在B细胞淋巴细胞分化的早期出现，大约在与CD19抗原相同的阶段。不像其他的B细胞标志，CD22膜表达限于成熟B细胞(CD22+)和浆细胞(CD22-)之间所包含的晚期分化阶段。例如，Wilson等，J.Exp.Med.173：137(1991)和Wilson等，J.Immunol.150：5013(1993)中描述了CD22抗原。

“非恶性疾患”在本文中指多软骨炎或多发性单神经炎，优选多发性单神经炎。另外，它可以是脊髓-视神经(spino-optical)多发性硬化；寻常天疱疮；丘-施二氏血管炎或综合征(Churg-Strauss vasculitis or syndrome，CSS)；狼疮脑炎(cerebritis)；狼疮肾炎；皮肤系统性红斑狼疮(SLE)；除哮喘外IgE介导的疾病，具体是变应性鼻炎、过敏性、或特应性皮炎；慢性神经病；视性眼阵挛-肌阵挛综合征(opsoclonus-myoclonus syndrome)；肺泡蛋白沉积；巩膜炎；微观多脉管炎(microscopic polyangiitis)；瘤外综合征(paraneoplasticsyndrome)，它是肿瘤产生的远程效应，诸如高血钙症，但不包括朗-伊二氏(Lambert-Eaton)、贫血、或低血糖症；Rasmussen氏脑炎；中枢神经系统(CNS)血管炎；离子通道病，它是具有与离子通道机能障碍相关的多种性质的疾病，诸如癫痫、偏头痛、心律不齐、肌肉疾患、耳聋、失明、周期性麻痹、以及CNS离子通道病，但不包括CNS炎性疾患；孤独症；或神经病性、肌病性、或CNS结节病。

“多软骨炎”在用于本文时意指任何多软骨炎，包括复发性多软骨炎、Von Meyenburg氏病、Meyenburg氏病或综合征、Meyenburg Altherr Uehlinger综合征、多软骨病、Askenazy、Jaksch Wartenhorst、Meyenburg、或Von JakschWartenhorst综合征、软骨溶解性(chondrolytic)、弥漫性或复发性软骨膜炎、软骨软化性关节炎、或全软骨炎。

“多发性单神经炎”在用于本文时描述以身体无关部分的几种神经所引起的炎症为特征的疾患，即该神经损伤涉及对至少两个分开的神经区域的隔离损伤。恶化时，它可变得更为分散且更不集中于特定区域，类似于多神经病。此类疾病的症状可包括麻木、虚弱、灼痛(尤其是在晚上)、以及反射丧失。所述疼痛可能很严重并致残。

“拮抗剂”指在结合B细胞表面标志后破坏或消减哺乳动物B细胞和/或干扰一种或多种B细胞功能(例如通过减少或阻止由B细胞引发的体液反应)的分子。优选的是，拮抗剂能够在用其治疗的哺乳动物中消减B细胞(即降低循环B细胞水平)。这种消减可通过各种机制来实现，诸如ADCC和/或CDC、抑制B细胞增殖和/或诱导B细胞死亡(如通过凋亡)。本发明范围内的拮抗剂包括抗体、合成或天然序列肽、以及与B细胞标志结合的小分子拮抗剂，任选与胞毒剂缀合或融合。优选的拮抗剂包括抗体，即结合B细胞表面标志的抗体。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指由细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，随后促使靶细胞溶解。介导ADCC的初级细胞NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9：457-92，1991中第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利5,500,362或5,821,337中所描述的。可用于这类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等，PNAS(USA)，95：652-656，1998中所公开的。

“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应子功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括PBMC、NK细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。

术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。而且，优选的FcR是与IgG抗体结合的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于它们的胞质域。激活受体FcγRIIA在其胞质域中包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(见Daёron，Annu.Rev.Immunol.，15：203-234，1997)。FcR的综述见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9：457-492，1991；Capel等，Immunomethods，4：25-34，1994；和de Haas等，J.Lab.Clin.Med.，126：330-341，1995。本文中术语“FcR”涵盖其它FcR，包括未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体FcRn，它负责将母体的IgG转移给胎儿(Guyer等，J.Immunol.，117：587，1976和Kim等，J.Immunol.，24：249，1994)。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在存在补体时分子溶解靶的能力。补体激活途径是由补体系统第一组分(Clq)结合与关联抗原复合的分子(如抗体)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods，202：163，1996中所描述的。

“生长抑制性”拮抗剂指那些阻止或减少表达拮抗剂所结合抗原的细胞增殖的拮抗剂。例如，拮抗剂可在体外和/或在体内阻止或减少B细胞增殖。

“诱导凋亡”的拮抗剂指根据标准凋亡测定法诸如膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、内质网膨胀、细胞破裂和/或膜囊形成(称作凋亡小体)的测定，诱导例如B细胞的程序性细胞死亡的拮抗剂。

术语“抗体”在本文中使用其最广泛的含义，具体覆盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(如双特异性抗体)、以及抗体片段，只要它们展示所需生物学活性。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

为了本文的目的，“完整抗体”指包含重链和轻链可变区以及Fc区的抗体。

 “天然抗体”通常是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的约150,000道尔顿的异型四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在具有不同免疫球蛋白同种型的重链中有所变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变区(V_H)，接着是多个恒定区。每条轻链在一端具有一个可变区(V_L)，而另一端是一个恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区排列在一起，而轻链的可变区与重链的可变区排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成了界面。

术语“可变”指可变区中的某些部分在不同抗体的序列中差异广泛且用于每种特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变区。它集中于轻链和重链可变区中称作高变区的三个区段。可变区中更加高度保守的部分称作构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区都包含四个FR，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成部分β-折叠结构的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近地保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(见Kabat等，《Sequences of Proteins ofImmunological Interest)》，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991)。恒定区不直接涉及抗体与抗原的结合，但显示出多种效应子功能，诸如ADCC中抗体的参与。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，和残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab′)₂片段，它具有两个抗原结合位点，并且仍能使抗原交联。

“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。这个区域由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变区的二聚体组成。正是在这种构造中，各个可变区的三个高变区相互作用而在V_H-V_L二聚体表面确定了抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。

Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CHl)。Fab’片段因在重链CHl结构域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是其中恒定区的半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab′)₂抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。还知道抗体片段的其它化学偶联。

来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，根据其恒定区的氨基酸序列，可归入两种截然不同类型中的一种，称作κ和λ。

根据其重链恒定区的氨基酸序列，可将抗体归入不同的类别。完整抗体有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。将与不同抗体类别对应的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。各种类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选的是，该Fv多肽在V_H和V_L结构域之间还包含多肽接头，使得scFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述参见Plückthun，《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，269-315，1994。

术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(V_H-V_L)中包含相连的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)。

通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的描述于例如EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448，1993。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指由基本上同质的抗体群获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极少量存在的可能的天然存在变体之外。单克隆抗体是高度特异的，即针对单一抗原性位点。另外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体的优越性体现在可以通过杂交瘤培养合成它们而不受其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示抗体由基本上同质的抗体群获得的特征，并不解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler等， Nature，256：495(1975)描述的杂交瘤法来制备，或者可通过重组DNA法来制备(参见例如美国专利4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson等， Nature，352：624-628(1991)和Marks等， J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)中描述的技术由噬菌体抗体库分离。

单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这类抗体的片段，只要它们展示所需生物学活性(美国专利4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855，1984)。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类(如旧大陆猴类(Old World Monkey)，诸如狒狒、恒河猴或猕猴)的可变区抗原结合序列以及人恒定区序列的“灵长类化(primatized)”抗体(美国专利5,693,780)。

非人(如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。而且，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体将包含基本上不少于至少一个、通常两个这样的可变区，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。任选的是，人源化抗体还将包含至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等，Nature，321：522-525，1986；Riechmann等，Nature，332：323-329，1988；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596，1992。

术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(如轻链可变区中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变区中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)和/或来自“高变环”的残基(如轻链可变区中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变区中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917，1987)。“框架”或“FR”残基指本文定义的高变区残基以外的可变区残基。

“结合”目的抗原例如B细胞表面标志的拮抗剂指以足够亲和力和/或亲合力结合该抗原从而可作为治疗剂用于靶向表达该抗原的细胞的抗体。

结合CD19抗原的抗体的例子包括Hekman等，Cancer Immunol.Immunother.32：364-372(1991)和Vlasveld等，Cancer Immunol.Immunother.40：37-47(1995)中的抗CD19抗体；和Kiesel等，Leukemia Research II，12：1119(1987)中的B4抗体。

“结合CD20的抗体”指以足够亲和力和/或亲合力结合CD20抗原从而可作为治疗剂用于靶向表达或过表达CD20抗原的细胞的抗体。这类抗体的例子包括：现在称作“rituximab”(“RITUXAN”)的“C2B8”(美国专利5,736,137)；称作“Y2B8”或“Ibritumomab Tiuxetan”ZEVALIN的钇[90]标记2B8鼠抗体(美国专利5,736,137)；鼠IgG2a“B1”，也称作“Tositumomab”，任选用¹³¹I标记以产生“¹³¹I-B1”抗体(碘I131Tositumomab，BEXXAR^TM)(美国专利5,595,721)；鼠单克隆抗体“1F5″(Press等，Blood，69(2)：584-591，1987和“框架修补”或人源化1F5(WO03/002607，Leung，S.)；ATCC保藏物HB-96450)；鼠2H7和嵌合2H7抗体(美国专利5,677,180)；人源化2H7；huMax-CD20(Genmab，丹麦)；AME-133(Applied Molecular Evolution)；和可从国际白细胞分类研究组(International Leukocyte Typing Workshop)获得的单克隆抗体L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2(Valentine等，《Leukocyte Typing III》，McMichael编，第440页，牛津大学出版社，1987)。

术语“rituximab”或“RITUXAN”在本文中指针对CD20抗原的基因工程嵌合鼠/人单克隆抗体，在美国专利5,736,137中称作“C2B8”，包括其保持结合CD20能力的片段。

纯粹为了本文的目的，“人源化2H7”指结合人CD20的人源化抗体，或其抗原结合片段，其中所述抗体在体内有效损耗灵长类B细胞，所述抗体在重链可变区(V_H)中至少包含来自抗人CD20抗体的CDR3序列SEQ IDNO：12(图1B)和基本上人重链亚组III(V_HIII)的人共有框架(FR)残基。在一个优选的实施方案中，这种抗体还包含重链CDR1序列SEQ ID NO：10和CDR2序列SEQ ID NO：11，更优选还包含轻链CDR1序列SEQ ID NO：4、CDR2序列SEQ ID NO：5、CDR3序列SEQ ID NO：6和基本上人轻链κ亚组I(VκI)的人共有框架(FR)残基，其中V_H区可连接人IgG链恒定区，其中该区可以是例如IgG1或IgG3。在一个优选的实施方案中，这类抗体包含V_H序列SEQ ID NO：8(v16，如图1B所示)，任选还包含VL序列SEQ ID NO：2(v16，如图1A所示)，它可在重链中具有氨基酸替代D56A和N100A以及在轻链中具有S92A(v.96)。一种更优选的这类抗体是2H7.v16，其分别具有轻链和重链氨基酸序列SEQ ID NO：24和26，如图6B和7B所示。另一种优选的实施方案是所述抗体为分别具有轻链和重链氨基酸序列SEQ IDNO：24和28的2H7.v31，如图6B和8B所示。本文的抗体还可在Fc区中包含至少一个提高ADCC和/或CDC活性的氨基酸替代，诸如其中氨基酸替代是S298A/E333A/K334A的抗体，更优选具有重链氨基酸序列SEQ IDNO：28的2H7.v31(如图8B所示)。任何这些抗体都还可在Fc区中包含至少一个降低CDC活性的氨基酸替代，例如至少包含替代K322A。优选的是，这类抗体为与RITUXAN相比具有ADCC活性提高至少10倍的2H7.v114或2H7.v115。

优选的人源化2H7为这样的完整抗体或抗体片段，其包含轻链可变区序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：2)；

和重链可变区序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLILSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：8)。

当人源化2H7抗体是完整抗体时，优选地是它包含轻链氨基酸序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTHLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：24)；

和重链氨基酸序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：26)

或重链氨基酸序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGIAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：28)。

“分离的”拮抗剂指已经由其天然环境的一种成分鉴别和分离和/或回收的拮抗剂。其天然环境的污染成分指将会干扰拮抗剂的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将拮抗剂纯化至(1)根据Lowry方法的测定，拮抗剂重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式蛋白质测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)通过使用考马斯亮蓝或优选银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE达到同质。既然拮抗剂的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的拮抗剂包括重组细胞内的原位拮抗剂。然而，通常，分离的拮抗剂将通过至少一个纯化步骤来制备。

对于治疗目的来说，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人、家畜和农场动物，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛等。优选的是，哺乳动物是人。

“治疗”指治疗性处理和预防性措施二者。需要治疗的受试者包括已经患有疾病或紊乱的受试者以及要预防疾病或紊乱的受试者。因此，哺乳动物可能已经诊断为患有疾病或紊乱或者可能有患上疾病或紊乱的倾向或易感性。

表述“有效量”指有效预防、改善或治疗所讨论自身免疫病的拮抗剂数量。

术语“免疫抑制剂”在本文中用于辅助治疗时指承担抑制或掩盖本文所治疗哺乳动物的免疫系统的物质。这将包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达、或掩盖MHC抗原的物质。这类试剂的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(见美国专利4,665,077)；霉酚酸酯诸如CELLCEPT；硫唑嘌呤(IMURAN，AZASAN/6-巯基嘌呤；溴隐亭(bromocryptine)；达扎唑(danazol)；氨苯砜；戊二醛(如美国专利4,120,649中所述，它掩盖MHC抗原)；针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素(cyclosporin)A；类固醇，诸如皮质类固醇和糖皮质类固醇，如强的松(prednisone)、强的松龙(prednisolone)诸如PEDIAPRED(强的松龙磷酸钠)或ORAPRED(强的松龙磷酸钠口服液)、甲基强的松龙(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone)；甲氨蝶呤(口服或皮下)(RHEUMATREX，TREXALL^TM)；羟氯喹(hydroxycloroquine)/氯喹(chloroquine)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；来氟米特(leflunomide)；细胞因子或细胞因子受体拮抗体包括抗干扰素-γ、-β、或-α抗体、抗肿瘤坏死因子-α抗体(infliximab或adalimumab)、抗TNFα免疫粘附素(ENBREL依那西普(etanercept))、抗肿瘤坏死因子-β抗体、抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；多克隆或泛T抗体(pan-T antibodies)、或单克隆抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合结构域的可溶性肽(90年7月26日出版的WO90/08187)；链激酶；TGF-β；链道酶(streptodornase)；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；T细胞受体(Cohen等，美国专利5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等，Science，251：430-432(1991)；WO1990/11294；Ianeway，Nature341：482(1989)；和WO1991/01133)；T细胞受体抗体(EP340,109)诸如T10B9；环磷酰胺(CYTOXAN)；氨苯砜；青霉胺(CUPRIMINE)；血浆交换；或静脉内免疫球蛋白(IVIG)。这些可以单独使用，或者彼此组合，特别是类固醇与另一种免疫抑制剂的组合，或者在这种组合之后使用非类固醇试剂的维持剂量以减少对类固醇的需求。

“止痛剂”指发挥抑制或遏制疼痛作用的药物，诸如非处方镇痛药或控制神经痛的处方疼痛药物，诸如非类固醇抗炎药(NSAID)，包括布洛芬(ibuprofen)(MOTRIN)、萘普生(naproxen)(NAPROSYN)、以及用于减少可能发生的刺痛的其他多种药物，包括抗惊厥药(加巴喷丁(gabapentin)、苯妥英(phenytoin)、卡马西平(carbamazepine))或三环抗抑郁药。具体的例子包括醋氨酚(acetaminophen)、阿斯匹林、阿米替林(amitriptyline)(ELAVIL)、卡马西平(TEGRETOL)、苯妥英(phenyltoin)(DILANTIN)、加巴喷丁(NEURONTIN)、(E)-N-香草基-8-甲基6-壬酰胺(noneamid)(CAPSAICIN)、或神经阻断剂。

术语“胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或促使细胞破坏的物质。该术语意欲包括放射性同位素(如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素诸如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素或其片段。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂，诸如噻替哌(thiotepa)和CYTOXAN环膦酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸酯，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，诸如苯佐替哌、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替哌；乙撑亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，诸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；硝基脲类，诸如卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，诸如烯二炔类(enediyne)抗生素(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186，1994))；蒽环类(dynemicin)抗生素，包括dynemicin A；二碳磷酸盐(bisphosphonate)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素、氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素诸如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培来霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、羟甲雄酮丙酸酯、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和美坦西醇(ansamitocin))；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替哌(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)，如TAXOL紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibb Oncology，Princeton，NJ)、ABRAXANE^TM紫杉醇不含克列莫佛(Cremophor)的清蛋白改造纳米颗粒剂型(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)、和TAXOTERE多西他塞(doxetaxel)(Rhne-PoulencRorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；Gemzar吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)；Navelbine长春瑞宾(vinorelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊拜膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸，诸如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；以及上述任何物质的制药学可接受的盐、酸或衍生物。

该定义还包括起调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素药，诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲奥昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那斯酮(onapristone)、和FARESTON托瑞米芬(toremifene)；抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR伏罗唑(vorozole)、FEMARA来曲唑(letrozole)、和ARIMIDEX阿纳托唑(anastrozole)；及抗雄激素，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉粘附(abherant)细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf和H-Ras；核酶，诸如VEGF表达抑制剂(如ANGIOZYME核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗、和VAXID疫苗；PROLEUKINrIL-2；LURTOTECAN拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIXrmRH；及任何上述药剂的制药学可接受盐、酸或衍生物。

术语“细胞因子”指由一种细胞群释放的、作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。这类细胞因子的例子是淋巴因子；单核因子；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物学活性等效物。

术语“激素”指多肽激素，通常由具有导管的腺器官分泌。激素包括例如生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；促乳素；胎盘催乳激素；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；Mullerian氏抑制性物质；及血小板生成素。

术语“生长因子”指促进生长的蛋白质，包括例如肝生长因子；成纤维细胞生长因子；血管内皮生长因子；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板衍生生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factor)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；及集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)、和粒细胞CSF(G-CSF)。

术语“整联蛋白”指容许细胞结合和应答胞外基质且牵涉多种细胞功能诸如伤口愈合、细胞分化、肿瘤细胞归巢和凋亡的受体蛋白质。它们是牵涉细胞-胞外基质和细胞-细胞相互作用的细胞黏附受体大家族的一部分。功能性整联蛋白由非共价结合的两个跨膜糖蛋白亚基组成，称为α和β。α亚基彼此都享有一定同源性，β亚基也是如此。受体总是含有一条α链和一条β链。例子包括α6β1、α3β1和α7β1。

术语“前体药物”在用于本申请时指与母药(parent drug)相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的前体和衍生物形式药用活性物质。参见如Wilman，“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”，Biochemical Society Transactions 14，375-382，615th Meeting Belfast，1986和Stella等，“Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”，Directed Drug Delivery，Borchardt等编，247-267，Humana Press，1985。本发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐(酯)前体药物、含硫代磷酸盐(酯)前体药物、含硫酸盐(酯)前体药物、含肽前体药物、D-氨基酸修饰前体药物、糖基化前体药物、含β-内酰胺前体药物、含任选取代苯氧基乙酰胺的前体药或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转化为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿甘前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。

“脂质体”为由各种类型脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于给哺乳动物投递药物(诸如本文中披露的拮抗剂和任选的化疗剂)的小囊泡。与生物膜的脂质排列相似，脂质体的成分通常排列成双层形式。

术语“包装插页”用于指通常包括在治疗产品的商品包装中的说明书，它们包含有关涉及这类治疗产品应用的适应征、用途、剂量、施药、禁忌症和/或警告的信息。

II.拮抗剂的生产

本发明的方法和产品使用或掺入了结合B细胞表面标志的拮抗剂。因此，本文将描述用于生成这类拮抗剂的方法。

用于生成或筛选拮抗剂的B细胞表面标志可以是例如包含所需表位的抗原或其部分的可溶形式。或者/另外，在其细胞表面表达B细胞表面标志的细胞也可用于生成或筛选拮抗剂。可用于生成拮抗剂的其它形式的B细胞表面标志对本领域熟练技术人员是显而易见的。优选的是，B细胞表面标志是CD19或CD20抗原。

虽然优选的拮抗剂是抗体，本文还设想了除抗体外的拮抗剂。例如，拮抗剂可包括任选融合或缀合有胞毒剂(诸如本文中描述的那些)的小分子拮抗剂。可针对本文感兴趣的B细胞表面标志筛选小分子文库，以鉴定结合该抗原的小分子。还可对小分子筛选其拮抗特性和/或与胞毒剂缀合。

拮抗剂还可以是通过理性设计或通过噬菌体展示产生的肽(参见如1998年8月13日出版的WO1998/35036)。在一个实施方案中，选择的分子可以是根据抗体的CDR设计的“CDR模拟物”或抗体类似物。虽然这类肽自身可具有拮抗性，但任选可将该肽与胞毒剂融合，以增加或增强肽的拮抗特性。

下面的描述例示了用于生产依照本发明使用的抗体拮抗剂的技术。

(i)多克隆抗体

多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。使用双功能剂或衍生剂，例如马来酰亚胺苯甲酰硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl₂、或R¹N＝C＝NR，其中R和R¹是不同的烃基，将相关抗原与在待免疫物种中具有免疫原性的蛋白质缀合可能是有用的，如匙孔血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。

通过将例如100μg或5μg蛋白质或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和，并将溶液皮内注射于多个部位，由此将动物针对抗原、免疫原性缀合物、或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中肽或缀合物初始量的1/5-1/10对动物进行强化。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体效价。对动物进行强化直到效价达到稳定。优选的是，将动物用相同抗原的但与不同蛋白质和/或通过不同交联剂缀合得到的缀合物进行强化。缀合物还可在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物来制备。此外，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫反应。

(ii)单克隆抗体

单克隆抗体是由基本上同质的抗体群获得的，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以很少量存在的可能的天然存在突变之外。如此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征即不是分立抗体的混合物。

例如，单克隆抗体可通过最初由Kohler等，Nature256：495，1975描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(美国专利4,816,567)。

在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成特异结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。或者，可在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding，《MonoclonalAntibodies：Principles and Practice》，59-103，Academic Press，1986)。

将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，该培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么杂交瘤培养基通常将含有阻止缺乏HGPRT的细胞生长的次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)。

优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持选择的抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的骨髓瘤细胞。在这些细胞中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠源骨髓瘤系，诸如可从Salk Institute CellDistribution Center(San Diege，California USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的衍生系，及可从American Type Culture Collection(Manassas，Virginia USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。用于生成人源单克隆抗体的人源骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor，J.Immunol.133：3001，1984；Brodeur等，《Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications》，pp.51-63，Marcel Dekker Inc.，New York，1987)。

可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。

单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等，Anal.Biochem.107：220，1980的Scatchard分析来测定。

在鉴定得到生成具有所需特异性、亲和力、和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并使用标准方法进行培养(Goding，《Monoclonal Antibodies：Principles and Practice》，pp.59-103，Academic Press，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。

可通过常规免疫球蛋白纯化流程，诸如例如蛋白A-SEPHAROSETM琼脂糖层析、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分离。

也可重组生产单克隆抗体。编码单克隆抗体的DNA易于通过常规流程分离并测序(例如通过使用能够特异结合编码鼠源抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。以杂交瘤细胞用作这类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到宿主细胞中，诸如不另外产生免疫球蛋白蛋白质的大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性文章包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.5：256-262，1993和Plückthun，Immunol.Revs.130：151-188，1992。

在另一个实施方案中，可从使用McCafferty等，Nature348：552-554，1990中描述的技术构建的噬菌体抗体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson等，Nature352：624-628，1991和Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597，1991分别描述了使用噬菌体文库分离鼠源和人源抗体。后续出版物描述了通过链改组(Marks等，Bio/Technology10：779-783，1992)，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.21：2265-2266，1993)，生成高亲和力(nM范围)的人源抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的常规单克隆抗体杂交瘤技术的可行替换方法。

还可以修饰DNA，例如通过替代即用人源重链和轻链恒定区的编码序列代替同源鼠源序列(美国专利4,816,567；Morrison等，Proc.Natl Acad.Sci.USA81：6851，1984)，或通过共价接合免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。

通常，用这类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定区，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变区，产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点及对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。

(iii)人源化抗体

本领域已经描述了用于将非人源抗体人源化的方法。优选的是，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人源氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。人源化可本质上依照Winter及其同事的方法进行(Jones等，Nature321：522-525，1986；Riechmann等，Nature332：323-327，1988；Verhoeyen等，Science239：1534-1536，1988)，通过用高变区序列替代相应的人源抗体序列。因此，这类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中基本上少于整个人源可变区用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些高变区残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基所替代的人源抗体。

用于制备人源化抗体的人源可变区的选择，包括轻链和重链，对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体可变区序列对已知的人源可变区序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人源序列作为人源化抗体的人源框架区(FR)(Sims等，J.Immunol.151：2296，1993；Chothia等，J.Mol.Biol.196：901，1987)。另一种方法使用由特定轻链或重链可变区亚组的所有人源抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：4285，1992；Presta等，J.Immunol.151：2623，1993)。

更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力以及其它有利的生物学特性。为了实现这一目的，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。通常可获得三维免疫球蛋白模型，且为本领域熟练技术人员所熟悉。还可获得图解和显示选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得所需抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。通常，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。

(iv)人源抗体

作为人源化的替代方法，可生成人源抗体。例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况中能够在免疫后生成人源抗体完整全集的转基因动物(如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在这类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人源抗体。参见例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2551，1993；Jakobovits等，Nature362：255-258，1993；Bruggermann等，Year in Immuno.7：33，1993；和美国专利5,591,669、5,589,369和5,545,807。

或者，噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature348：552-553，1990)可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因全集生成人源抗体和抗体片段。根据这一技术，将抗体V区基因克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因的读码框中，并在噬菌体颗粒表面展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行；有关综述参见例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology3：564-571，1993。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson等，Nature352：624-628，1991从衍生自免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗噁唑酮抗体。可本质上依照Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597，1991或Griffith等，EMBOJ.12：725-734，1993描述的技术，由未免疫人供体构建V基因全集，并分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利5,565,332和5,573,905。

还可通过体外激活B细胞(参见美国专利5,567,610和5,229,275)来生成人源抗体。

(v)抗体片段

已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等，Journal of Biochemicaland Biophysical Methods24：107-117，1992和Brennan等，Science229：81，1985)。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可从上文讨论的噬菌体抗体文库分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段，并通过化学偶联形成F(ab′)₂片段(Carter等，Bio/Technology10：163-167，1992)。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)₂片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练技术人员是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO1993/16185；美国专利5,571,894；和美国专利5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如美国专利5,641,870中描述的抗体。这类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。

(vi)双特异性抗体

双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可结合B细胞表面标志的两种不同表位。其它这类抗体可结合第一B细胞表面标志并进一步结合第二B细胞表面标志。或者，抗B细胞表面标志结合臂可与结合白细胞上引发分子诸如T细胞受体分子(如CD2或CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)，诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合，使得细胞防御机制集中于B细胞。双特异性抗体还可用于将胞毒剂定位于B细胞。这些抗体拥有B细胞表面标志结合臂及结合胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒素A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(如F(ab′)₂双特异性抗体)。

用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的常规生成是基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein等，Nature305：537-539，1983)。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadromas))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化非常麻烦，且产量低。WO1993/08829和Traunecker等，EMBO J.10：3655-3659，1991中公开了类似的流程。

根据一种不同的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。融合优选使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区。优选的是，在至少一种融合物中具有包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物及，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一表达载体。

在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构促进所需双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法公开于WO1994/04690。关于制备双特异性抗体的其它细节参见例如Suresh等，Methodsin Enzymology 121：210，1986。

根据美国专利5,731,168中描述的另一种方法，可改造抗体分子对之间的界面，将从重组细胞培养物中回收的异型二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分C_H3抗体恒定区。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生针对大侧链的相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同型二聚体提高异型二聚体产量的机制。

双特异性抗体包括交联或“异源缀合”抗体。例如，异源缀合物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，这类抗体建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO1991/00360、WO1992/200373和EP03089)。可使用任何便利的交联方法制备异源缀合抗体。合适的交联剂是本领域所熟知的，且连同许多交联技术一起公开于例如美国专利4,676,980。

文献中还描述了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学键合制备双特异性抗体。Brennan等，Science 229：81，1985描述了通过蛋白水解切割完整抗体生成F(ab′)₂片段的流程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠时还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。

近来的发展推动了从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，可对其进行化学偶联而形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.175：217-225，1992描述了完全人源化双特异性抗体F(ab′)₂分子的生成。各Fab′片段分别从大肠杆菌分泌并进行体外定向化学偶联而形成双特异性抗体。由此形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，以及引发人细胞毒性淋巴细胞对人乳瘤靶的溶解活性。

还描述了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生产出双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.148(5)：1547-1553，1992。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同型二聚体在铰链区还原，形成单体，然后重新氧化，形成抗体异型二聚体。该方法还可用于生产抗体同型二聚体。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448，1993描述的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替换机制。该片段包含通过接头相连的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)，该接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的V_H和V_L结构域不得不与另一个片段上的互补V_L和V_H结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，J.Immunol.152：5368，1994。

设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.147：60，1991。

III.拮抗剂的缀合物和其他修饰

任选将本文方法中所使用的或本文产品中所包含的拮抗剂与胞毒剂缀合。

上文已经描述了可用于生成这类拮抗剂-胞毒剂缀合物的化疗剂。

本文还设想了拮抗剂与一种或多种小分子毒素形成的缀合物，诸如加利车霉素、美登素(美国专利5,208,020)、单端孢菌素和CC1065。在本发明的一个实施方案中，将拮抗剂与一个和多个美登素分子缀合(例如每个拮抗剂分子缀合约1个至约10个美登素分子)。例如可将美登素转化为May-SS-Me，后者可还原为May-SH3并与经修饰拮抗剂反应(Chari等，Cancer Research52：127-131，1992)产生美登木素生物碱-拮抗剂缀合物。

或者，将拮抗剂与一个或多个加利车霉素分子缀合。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。可使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ₁ ^I、α₂ ^I、α₃ ^I、N-乙酰基-γ₁ ^I、PSAG和θ^I ₁(Hinman等，Cancer Research53：3336-3342，1993和Lode等，Cancer Research58：2925-2928，1998)。

可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲毒素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹毒蛋白(dianthinprotein)、美洲商陆(Phytolaca Americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(neomycin)和单端孢菌毒素类(tricothecenes)。参见例如1993年10月28日出版的WO1993/21232。

本发明还设想了与具有核酸水解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)缀合的拮抗剂。

有多种放射性同位素可用于生成放射性缀合拮抗剂。例子包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、p³²和Lu的放射性同位素。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备拮抗剂和胞毒剂的缀合物，诸如3-(2-吡啶基二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己胺-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如盐酸二甲基己二酰亚胺酯、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可如Vitetta等，Science238：1098，1987中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与拮抗剂缀合的例示性螯合剂。

参见WO1994/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Research52：127-131，1992)。

或者，可通过例如重组技术或肽合成法来制备包含拮抗剂和胞毒剂的融合蛋白。

在另一个实施方案中，可以将拮抗剂与“受体”(诸如链霉亲合素)缀合，用于肿瘤的预定位，其中对患者施用拮抗剂-受体缀合物，随后使用清除剂从循环中除去未结合的缀合物，然后施用与胞毒剂(如放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如亲合素)。

还可将本发明的拮抗剂与前体药物活化酶缀合，后者将前体药物(如肽基化疗剂，参见WO1981/01145)转化为活性抗癌药。参见例如WO1988/07378和美国专利4,975,278。

这类缀合物的酶成分包括能够以这样一种方式作用于前体药物从而将其转化为更具活性的细胞毒性形式的任何酶。

可用于本发明方法的酶包括但不限于可将含磷酸盐的前体药物转化为游离药物的碱性磷酸酶；可将含硫酸盐的前体药物转化为游离药物的芳基硫酸酯酶；可将无毒5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；可将含肽的前体药物转化为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；可转化含D-氨基酸替代的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；可将糖基化前体药物转化为游离药物的碳水化合物切割酶类，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可将β-内酰胺衍生的药物转化为游离药物的β-内酰胺酶；及可将在其氨基氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转化为游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可使用具有酶活性的抗体，本领域也称作“抗体酶”，将本发明的前体药物转化为游离的活性药物(参见例如Massey，Nature328：457-458，1987)。可如本文所述制备拮抗剂-抗体酶缀合物，用于将抗体酶投递至肿瘤细胞群。

可通过本领域众所周知的技术将本发明的酶与拮抗剂共价结合，诸如使用上文讨论的异双功能交联剂。或者，可使用本领域众所周知的重组DNA技术构建包含与本发明酶的至少功能活性部分连接的本发明拮抗剂的至少抗原结合区的融合蛋白(参见例如Neuberger等，Nature312：604-608，1984)。

本文还设想了拮抗剂的其它修饰。例如，可将拮抗剂与多种非蛋白质聚合物中的一种连接，如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。

本文公开的拮抗剂还可配制成脂质体。可通过本领域已知的方法制备包含拮抗剂的脂质体，诸如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：3688，1985；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4030，1980；美国专利4,485,045和4,544,545；及1997年10月23日出版的WO1997/38731中所述。美国专利5,013,556中公开了具有延长的循环时间的脂质体。

特别有用的脂质体可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法生成。将脂质体挤过具有设定孔径的滤器，产生具有所需直径的脂质体。可如Martin等，J.Biol.Chem.257：286-288，1982中所述，将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体缀合。任选在脂质体中包含化疗剂。参见Gabizon等，J.NationalCancerInst.81(19)：1484，1989。

设想了本文描述的蛋白质或肽拮抗剂的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进拮抗剂的结合亲和力和/或其它生物学特性。拮抗剂的氨基酸序列变体可通过将适当的核苷酸改变引入拮抗剂核酸或通过肽合成法来制备。这类修饰包括例如拮抗剂氨基酸序列中的残基删除、和/或插入和/或替代。只要最终的构建物具有所需特性，可进行删除、插入和替代的任何组合以获得最终的构建物。氨基酸变化还可能改变拮抗剂的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。

可用于鉴定拮抗剂中作为优选突变位置的某些残基或区域的一种方法称作“丙氨酸扫描诱变”，由Cunningham和Wells，Science244：1081-1085，1989描述。这里鉴定了一个残基或一组靶残基(如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选的是丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲对替代显示功能敏感性的氨基酸位置。如此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。例如，为了分析在指定位点处的突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对表达的拮抗剂变体筛选所需活性。

氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端的融合，长度范围从一个残基至包含一百个或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰残基的拮抗剂或与细胞毒性多肽融合的拮抗剂。拮抗剂分子的其它插入变体包括在拮抗剂N-或C-末端融合酶或提高拮抗剂的血清半衰期的多肽。

这些变体在拮抗剂分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替代。最感兴趣在抗体拮抗剂中进行替代诱变的位点包括高变区，但也设想了FR改变。保守替代在表1中显示为“优选替代”。如果这类替代导致生物学活性的改变，那么可以引入表1中称为“例示替代”的更多实质性改变，或如下文中关于氨基酸类别的进一步描述，并筛选产物。

表1

原始残基	例示替代	优选替代
			Ala(A)	val；leu；ile	val
Arg(R)	lys；gln；asn	lys
			Asn(N)	gln；his；asp，lys；arg	gln
Asp(D)	glu；asn	glu
			Cys(C)	ser；ala	ser
Gln(Q)	asn；glu	asn
			Glu(E)	asp；gln	asp
Gly(G)	ala	ala
			His(H)	asn；gln；lys；arg	arg
Ile(I)	leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸	leu
			Leu(L)	正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe	ile
Lys(K)	arg；gln；asn	arg
			Met(M)	leu；phe；ile	leu
Phe(F)	leu；val；ile；ala；tyr	tyr
			Pro(P)	ala	ala
Ser(S)	thr	thr
			Thr(T)	ser	ser
Trp(W)	tyr；phe	tyr
			Tyr(Y)	trp；phe；thr；ser	phe
Val(V)	ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸	leu

对拮抗剂生物学特性的实质性修饰可通过选择在保持以下几个方面的效果上显著不同的替代来完成：(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据共有的侧链特性，将天然存在的残基分为以下各组：

(1)疏水性的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；

(2)中性亲水性的：cys、ser、thr；

(3)酸性的：asp、glu；

(4)碱性的：asn、gln、his、lys、arg；

(5)影响链取向的残基：gly、pro；和

(6)芳香族的：trp、tyr、phe。

非保守替代必然用这些类别之一中的一个成员交换另一个类别的。

任何不涉及保持拮抗剂正确构象的半胱氨酸残基也可替代，通常用丝氨酸，以改进分子的氧化稳定性和预防异常交联。相反的，可向拮抗剂中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当拮抗剂是抗体片段诸如Fv片段时)。

特别优选的一类替代变体牵涉替代亲本抗体的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。产生这类替代变体的一种便利方法是使用噬菌体展示进行的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(如6-7个位点)突变，在每个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的M13的基因III产物的融合体。然后如本文所公开的对噬菌体展示变体筛选其生物学活性(如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变来鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。这类接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生这类变体，如本文所述筛选该组变体，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。

拮抗剂的另一类氨基酸变体改变拮抗剂的原始糖基化样式。改变意味着删除在拮抗剂中发现的一个或多个碳水化合物模块，和/或添加拮抗剂中不存在的一个或多个糖基化位点。

多肽的糖基化典型的是N-连接的或O-连接的。N-连接是指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这两种三肽序列其中任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。

向拮抗剂中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上文描述的三肽序列便利的完成(用于N-连接的糖基化位点)。这种改变还可通过向原始拮抗剂序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。

编码拮抗剂氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对早期制备的变体或非变体形式拮抗剂进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变、和盒式诱变来制备。

可能希望在效应物功能方面修饰本发明的拮抗剂，例如增强拮抗剂的ADCC和/或CDC。这可通过在抗体拮抗剂的Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而使得在该区域中形成链间二硫键。如此产生的同型二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和ADCC。参见Caron等，J.Exp.Med.176：1191-1195，1992和Shopes，B.，J.Immunol.148：2918-2922，1992。具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚体抗体还可使用如Wolff等，CancerResearch53：2560-2565，1993中描述的异双功能交联剂制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，并因此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design3：219-230，1989。

为了提高拮抗剂的血清半衰期，可如例如美国专利5,739,277中所述将补救受体结合表位掺入拮抗剂(尤其是抗体片段)。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(如IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄)Fc区中负责提高IgG分子体内血清半衰期的表位。

IV.药用制剂

制备依照本发明使用的拮抗剂的治疗用制剂，即将具有所需纯度的拮抗剂与任选的制药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(《Remington′sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980)，以冻干制剂或水溶液的形式贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，还包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇(PEG)。

例示性抗CD20抗体制剂描述于WO1998/56418。该出版物描述了一种液体多剂量制剂，其中包含40mg/mL rituximab、25mM醋酸盐、150mM海藻糖、0.9％苯甲醇、和0.02％POLYSORBATE^TM20(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)pH5.0，它在2-8℃具有最少2年的保存期。另一种感兴趣的抗CD20制剂在9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL二水合柠檬酸钠、0.7mg/mLPOLYSORBATE^TM80(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)、和注射用无菌水pH6.5中包含10mg/mL rituximab。

适于皮下施用的冻干制剂描述于WO1997/04801。这类冻干制剂可用合适的稀释剂复水成高蛋白质浓度，且复水后的制剂可皮下施用于本文中待治疗的哺乳动物。

本文中的制剂还可包含所治疗具体适应症所需的超过一种活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的化合物。例如，可能还希望提供胞毒剂、化疗剂、细胞因子或免疫抑制剂(例如作用于T细胞的免疫抑制剂，诸如环孢菌素或结合T细胞的抗体，例如结合LFA-1的抗体)。这类其它试剂的有效量取决于制剂中存在的拮抗剂的数量、疾病或紊乱或治疗的类型、及上文讨论的其它因素。这些通常以与上文所用相同的剂量和施药路径使用，或是迄今所用剂量的约1-99％。

活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊、在胶状药物传递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。这类技术公开于《Remington′s PharmaceuticalSciences》，第16版，Osol，A.编，1980。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。

用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。

V.用拮抗剂治疗

将配制包含结合B细胞表面抗原的拮抗剂的组合物并配药，以符合充分医疗实践的形式施用。该上下文中所要考虑的因素包括正在治疗的特定疾病或紊乱、正在治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床症状、疾病或紊乱的病因、试剂的递送位点、给药方法、给药计划、以及医学从业者所知的其它因素。所要施用的拮抗剂的治疗学有效量将取决于这些考虑。包含结合B细胞表面抗原的拮抗剂的组合物将以与优良医学实践相一致的形式进行配制、服用和施用。在此内容中考虑的因素包括治疗的具体疾病或紊乱、治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、疾病或紊乱的起因、药剂的投递部位、施药方法、施药计划以及医学从业人员知道的其它因素。施用拮抗剂的有效量将由这类考虑事项决定。

作为一般性建议，肠胃外施用拮抗剂的每剂有效量范围为约0.1至20mg/kg患者体重每天，所用拮抗剂的典型起始范围在约2至10mg/kg范围内。

优选的拮抗剂为抗体，例如诸如RITUXAN的抗体，没有缀合胞毒剂。未缀合抗体的合适剂量为例如在约20mg/m²至约1000mg/m²范围内。在一个实施方案中，抗体的剂量不同于目前对RITUXAN推荐的剂量。例如，可对患者施用一个或多个基本上小于375mg/m²抗体的剂量，例如所述剂量在约20mg/m²至约250mg/m²的范围内，例如约50mg/m²至200mg/m²。

另外，可施用一个或多个初始剂量的抗体，接下来施用一个或多个后续剂量，其中后续剂量中抗体的mg/m²剂量大于初始剂量中抗体的mg/m²剂量。例如，初始剂量可以在约20mg/m²至约250mg/m²的范围内(例如约50mg/m²至约200mg/m²)，后续剂量可以在约250mg/m²至约1000mg/m²的茫围内。

如上所述，然而，拮抗剂的这些建议量受制于大量治疗学判断。在选择适当剂量和计划中的关键因素是如上所示获得的结果。例如，对于治疗发展中的和急性的疾病最初可能需要相对较高的剂量。为了获得最有效的结果，根据疾病或紊乱，应尽可能地在接近疾病或紊乱的最初征兆、诊断、表现、或发生时，或者在疾病或紊乱的消除过程中施用拮抗剂。

可以任何合适的手段施用拮抗剂，包括肠胃外、皮下、腹膜内、吸入、鞘内、关节内、和鼻内以及，如果需要局部免疫抑制治疗的话，损伤内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。此外，拮抗剂可合适的通过脉冲输注来施用，例如用递减剂量的拮抗剂。优选通过注射给予剂量给药，最优选静脉内或皮下注射，这部分取决于所述施用是短暂的还是长期的。

可以与本文的拮抗剂一起施用一种或多种其它化合物，诸如胞毒剂、化疗剂、免疫抑制剂、止痛剂、激素、整联蛋白、生长因子、和/或细胞因子，或者施行本领域技术人员已知的多种其它疗法。优选的是，根据例如适应症的类型、适应症的程度或严重性、以及拮抗剂的类型，所施用的其它化合物是免疫抑制剂、止痛剂、或化疗剂。

假如是治疗多软骨炎，诸如复发性多软骨炎，如果症状不严重，则优选所述其它化合物是非类固醇抗炎药(NSAID)，包括布洛芬(MOTRIN)、萘普生(NAPROSYN)、或舒林酸(CLINORIL)，以控制炎症。然而，通常需要可的松相关药物，例如类固醇，诸如泼尼松和泼尼松龙。开始时高剂量的类固醇经常是必需的，尤其是涉及眼睛或呼吸道时。另外，多数患者需要长期使用类固醇。

可与拮抗剂联合用于治疗多软骨炎的另一种优选化合物是甲氨蝶呤(RHEUMATREX，TREXALL^TM)，它已显示出与类固醇联合作为复发性多软骨炎治疗以及维持治疗的前景。研究证明甲氨蝶呤能帮助降低类固醇需求。其它优选化合物包括环磷酰胺(CYTOXAN)、氨苯砜、硫唑嘌呤(IMURAN，AZASAN)、青霉胺(CUPRIMINE)、环孢霉素(NEORAL，SANDIMMUNE)、以及这些药物与类固醇的组合。

关于用另一种试剂治疗多发性单神经炎，如果不能获得特效疗法，通常可控制神经病的疼痛。最简单的治疗是非处方镇痛药，诸如醋氨酚(TYLENOL)、NSAID，诸如上文所述布洛芬、或阿斯匹林，接下来使用处方疼痛药物。三环抗抑郁药，诸如阿米替林(ELAVIL)和抗癫痫药物，诸如卡马西平(TEGRETOL)、苯妥英(DILANTIN)、或加巴喷丁(NEURONTIN)已用于减轻神经病疼痛。负责红辣椒发热的化学药品CAPSAICIN((E)-N-香草基-8-甲基-6-壬酰胺(noneamid))作为乳膏用于帮助减轻周围神经病疼痛。此外，神经阻断剂在减轻疼痛方面可能是有效的。用于治疗周围神经病的其它优选化合物包括自体PBSC移植、类固醇诸如皮质类固醇包括其脉冲疗法和泼尼松、泼尼松龙、以及甲基泼尼松龙包括其脉冲疗法、甲氨蝶呤、环磷酰胺(例如CYTOXAN)包括静脉内环磷酰胺脉冲疗法、血浆交换或血浆去除术、静脉内免疫球蛋白、环孢霉素诸如环孢菌素A、霉酚酸酯(例如CELLCEPT)、或化疗剂(包括其高剂量)包括那些降低IgM浓度的，诸如FLUDARA(磷酸氟达拉滨)或LEUKERAN(苯丁酸氮芥)。用于该适应症的特别优选的其它化合物为止痛剂、类固醇、甲氨蝶呤、环磷酰胺、血浆交换、静脉内免疫球蛋白、环孢霉素、或霉酚酸酯。

联合施用包括使用分开的制剂或单一的药用制剂的共施用，以及以任一次序依序施用，其中优选的是有一段时间所有两种(或多种)活性剂同时发挥它们的生物学活性。

除对患者施用蛋白质拮抗剂外，本申请设想通过基因疗法来施用拮抗剂。这类编码拮抗剂的核酸的施用涵盖在表述“施用有效量的拮抗剂”中。关于使用基因疗法产生细胞内抗体参见例如1996年3月14日出版的WO1996/07321。

有两种主要方法使核酸(任选包含在载体中)进入患者细胞，即体内和回体(ex vivo)。对于体内投递，通常在需要拮抗剂的部位将核酸直接注射到患者体内。对于回体治疗，采集患者细胞，将核酸导入这些分离的细胞，并将经过修饰的细胞或是直接施用于患者，或是例如装入多孔膜内并植入患者体内(参见例如美国专利4,892,538和5,283,187)。有多种技术可用于将核酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸转移至目的宿主的体外培养细胞还是体内细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。

目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(可用于脂质介导的基因转移的脂质有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行的转染。在有些情况中，需要与核酸源一起提供靶向靶细胞的试剂，诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异的抗体、靶细胞上受体的配体等。在采用脂质体时，与胞吞作用相关细胞表面膜蛋白结合的蛋白质可用于靶向和/或促进摄入，例如对特定细胞类型具有向性的衣壳蛋白或其片段、在循环中进行内在化的蛋白质的抗体、和靶向细胞内定位和增加细胞内半衰期的蛋白质。例如，Wu等，J.Biol.Chem.，262：4429-4432，1987和Wagner等，Proc.Natl.Acad Sci.USA，87：3410-3414，1990中描述了受体介导的胞吞技术。关于目前已知的基因标记和基因治疗方案的综述参见Anderson等，Science，256：808-813，1992。还可参见WO1993/25673及其引用的参考文献。

VI.产品

在本发明的另一个实施方案中，提供了装有可用于治疗上文所述疾病或紊乱的物质的产品。该产品包含一种容器及该容器上或与该容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。所述容器可以用各种材料诸如玻璃或塑料制成。该容器装有有效治疗选择的疾病或紊乱的组合物，且可具有无菌存取口(例如该容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液包或小管)。所述组合物中的至少一种活性剂是结合B细胞表面标志的拮抗剂。所述标签或包装插页表明该组合物用于治疗患有或易患自身免疫病的患者，诸如本文中所列举的。所述产品还可包括第二容器，其中装有制药学可接受的稀释缓冲剂，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer氏溶液和右旋糖溶液。它还可包括商业和使用者观点来看所需的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。

下面的非限制性实施例阐明了本发明的更多细节。将说明书中所有引用的公开内容明确收入本文作为参考。

实施例1

2H7抗CD20鼠单克隆抗体的人源化

鼠抗人CD20抗体2H7(在本文中也称为m2H7，m指鼠)的人源化是在一系列定点诱变步骤中实施的。已经描述了鼠2H7抗体可变区序列和具有小鼠V和人C的嵌合2H7；参见例如美国专利5,846,818和6,204,023。通过将鼠2H7可变区的氨基酸序列(公开于美国专利5,846,818)与已知抗体的序列(Kabat等，《Sequences of proteins of immunological interest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))相比较，鉴定了2H7的CDR残基。基于序列高变性(Kabat等，同上)确定了轻链和重链的CDR区，并分别显示于图1A和图1B。利用合成的寡核苷酸(表2)，通过定点诱变(Kunkel，proc.Natl.Acad.Sci.82：488-492(1985))将所有六个鼠2H7CDR区导入完整的人Fab框架中，所述框架对应于质粒pVX4(图2)中所包含的共有序列V_κI、V_HIII(V_Lκ亚组I、V_H亚组III)。

将噬菌粒pVX4(图2)用于诱变以及在大肠杆菌中表达F(ab)。以pB0475(Cunningham等，Science243：1330-1336(1989))的衍生物，噬菌粒pb0720为基础，pVX4包含编码人源化共有κ亚组I轻链(V_LκI-C_L)和人源化共有亚组III重链(V_HIII-C_Hl)抗IFN-α(干扰素-α)抗体的DNA片段。pVX4还具有碱性磷酸酶启动子和Shine-Dalgamo序列，二者均衍生自先前描述的基于pUC119的质粒，pAK2(Carter等，proc.Natl.Acad.Sci.USA89：4285(1992))。在编码F(ab)轻链和重链的DNA之间导入唯一的Spel限制性位点。抗IFN-α重链和轻链二者的前23个氨基酸都是STII分泌信号序列(Chang等，Gene55：189-196(1987))。

为了构建2H7的CDR交换型(2H7.v2)，对pVX4的含脱氧尿苷模板实施定点诱变；将抗IFN-α的所有六个CDR都换成鼠2H7CDR。将所得分子称为人源化2H7 2型(2H7.v2)，或2H7的“CDR交换型”；它具有m2H7CDR残基，及图1A和1B所示共有人FR残基。将人源化2H7.v2用于进一步人源化。

表2显示了用于在重链和轻链中构建每种鼠2H7(m2H7)CDR的寡核苷酸序列。例如，CDR-H1寡核苷酸用于重建m2H7重链CDR1。CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分别指重链CDR1、CDR2和CDR3；类似的，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3指每种轻链CDR。用两种寡核苷酸CDR-H2A和CDR-H2B分两步进行CDR-H2中的替代。

表2

用于在pVX4中将鼠2H7CDR的CDR交换体构建到人框架中的寡核苷酸序列。用每个寡核苷酸改变的残基标有下划线。

替代	寡核苷酸序列
		CDR-H1	C TAC ACC TTC ACG  AGC TAT AAC  ATG CACTGG GTC CG(SEQ ID NO：31)
CDR-H2A	G ATT AAT CCT GAC  AAC  GGC  GAC ACG  AGCTAT AAC CAG  AAG TTC AAG GGC CG(SEQ IDNO：32)
		CDR-H2B	GAA TGG GTT GCA  GCG ATC  TAT CCT  GGC AAC

	GGC GAC AC(SEQ ID NO：33)
		CDR-H3	AT TAT TGT GCT CGA GTG  GTC  TAC TAT  AGC AAC  AGC  TAC  TGG  TAC  TTC GAC  GTC TGG GGTCAA GGA(SEQ ID NO：34)
CDR-L1	C TGC ACA GCC AGC  TCT TCT  GTC AGC TAT ATGCAT TG(SEQ ID NO：35)
		CDR-L2	AA CTA CTG ATT TAC  GCT  CCA  TCG AAC CTCGCG TCT GGA GTC C(SEQ ID NO：36)
CDR-L3	TAT TAC TGT CAA CAG  TGG  AGC  TTC  AAT CCGCCC ACA TTT GGA CAG(SEQ ID NO：37)

为了与人源化构建体相比较，构建了表达嵌合2H7Fab(包含鼠V_L和V_H结构域，及人C_L和CH₁结构域)的质粒，即使用合成的寡核苷酸通过定点诱变(Kunkel，同上)将鼠框架残基导入2H7.v2。所得质粒构建体的序列如图3所示，用于表达称为2H7.v6.8的嵌合Fab。所编码的每条Fab链具有23个氨基酸的STII分泌信号序列，如上文对pVX4(图2)的描述。

基于鼠2H7框架残基与人V_κI、V_HIII共有框架(图1A和1B)及先前的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：4285-4289(1992))的序列比较，通过定点诱变向2H7.v2Fab构建体中导入了几个框架突变。这些突变导致某些人共有框架残基变成鼠2H7框架中发现的那些残基，所述改变处于可能影响CDR构象或抗原接触的位点。3型包含V_H(R71V、N73K)，4型包含V_H(R71V)，5型包含V_H(R71V、N73K)和V_L(L46P)，而6型包含V_H(R71V、N73K)和V_L(L46P、L47W)。

如下在大肠杆菌中表达人源化和嵌合Fab型m2H7抗体并纯化。将质粒转化到大肠杆菌菌株XL-1 Blue(Stratagene，San Diego，CA)中，用于制备双链和单链DNA。对于每种变体，用双脱氧核苷酸法(SEQUENASE标记引物循环测序，U.S.Biochemical Corp.)对轻链和重链二者完全测序。将质粒转化到MM294的衍生物，大肠杆菌菌株16C9中，在含5μg/ml羧苄青霉素的LB板上划平板，并选择单菌落用于蛋白质表达。将所述单菌落在5ml LB-100μg/ml羧苄青霉素中于37℃培养5-8小时。将5ml培养物加到500ml AP5-100μg/ml羧苄青霉素中，使之在4L带挡板摇瓶中于37℃生长16小时。AP5培养基的组成为：1.5g葡萄糖、11.0g HYCASE SF^TM(酪蛋白水解产物)、0.6g酵母提取物(经过验证的)、0.19g无水MgSO4、1.07g NH4Cl、3.73g KCl、1.2g NaCl、120ml 1M三乙醇胺，pH7.4，至1L水，然后经由0.1μm SEAKLEEN抗生滤器无菌过滤。

通过在1L离心瓶(Nalgene)中以3000xg离心收获细胞，移去上清。冷冻1小时后，将沉淀重悬于25ml冷的10mM MES-10mM EDTA，pH5.0(缓冲液A)中。添加250μl 0.1M苯甲基磺酰氟(PMSF)(Sigma)以抑制蛋白水解作用，并添加3.5ml储液10mg/ml母鸡卵白溶菌酶(Sigma)以帮助裂解细菌细胞壁。在冰上轻摇1小时后，将样品以40,000xg离心15分钟。用缓冲液A将上清液调至50ml，上样到用缓冲液A平衡过的2ml DEAE柱上。然后将流出液施加到用缓冲液A平衡过的蛋白质G-SEPHAROSECL-4B^TM琼脂糖(Pharmacia)层析柱(0.5ml柱床体积)上。用10ml缓冲液A冲洗柱子，并用3ml 0.3M甘氨酸，pH3.0将其洗脱到1.25ml 1M TRIS，pH8.0中。然后用CENTRICON-30离心过滤装置(Amicon)将F(ab)缓冲液交换到磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并浓缩至0.5ml终体积。所有F(ab)都进行SDS-PAGE以确定纯度，通过电喷雾质谱分析证实每种变体的分子量。

在基于细胞的ELISA结合测定中(如下所述)，难以检测到Fab，包括嵌合2H7Fab与CD20的结合。因此，将2H7Fab型重定格式为全长IgG1抗体，以用于测试和进一步诱变。

通过将嵌合2H7(v6.8)Fab以及人源化Fab2至6型的V_L和V_H结构域亚克隆到先前描述的用于哺乳动物细胞表达的pRK载体(Gorman等，DNAProt.Eng.Tech.2：3-10(1990))中，构建了用于表达全长IgG的质粒。简单地说，用EcoRV和BlpI消化每种Fab构建体以切下V_L片段，将其克隆到质粒pDR1(图4)的EcoRV/BlpI位点中，用于表达完整轻链(V_L-C_L结构域)。此外，用PvuII和ApaI消化每种Fab构建体以切下V_H片段，将其克隆到质粒pDR2(图5)的PvuII/ApaI位点中，用于表达完整重链(VH-CH1-铰链-CH₂-CH₃结构域)。对于每种IgG变体，通过将轻链表达质粒和重链表达质粒共转染到经腺病毒转化的人胚肾细胞系293(Graham等，J.Gen.Virol.36：59-74(1977))中来实施瞬时转染。简单地说，在转染前那天打散293细胞，涂布到含血清培养基中。第二天，添加制备成磷酸钙沉淀物的双链DNA，然后是PADVANTAGE^TM DNA(Promega，Madison，WI)，将细胞在37℃保温过夜。将细胞在无血清培养基中培养，4天后收获。利用蛋白质A-SEPHAROSE CL-4B^TM琼脂糖层析从培养物上清液纯化抗体，然后缓冲液交换到10mM琥珀酸钠、140mM NaCl，pH6.0中，并用CENTRICON-10离心过滤装置(Amicon)浓缩。通过定量氨基酸分析测定蛋白质浓度。

为了测量对CD20抗原的相对结合亲和力，开发了基于细胞的ELISA测定法。将人B类淋巴母细胞WIL2-S细胞(ATCC CRL8885，美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)在补充有2mM L-谷氨酰胺、20mM HEPES，pH7.2及10％热灭活胎牛血清的RPMI1640中在潮湿的5％CO₂温箱中培养。用含1％胎牛血清(FBS)的PBS(测定缓冲液)冲洗细胞，将其以250-300,000细胞/孔接种96孔圆底平板(Nunc，Roskilde，丹麦)。将测定缓冲液中标准品的两倍连续稀释液(15.6-1000ng/ml的2H7v6.8嵌合IgG)和样品的三倍连续稀释液(2.7-2000ng/ml)加到所述平板中。将平板埋在冰里保温45分钟。为了去除未结合的抗体，将0.1ml测定缓冲液加到孔中。将平板离心并去除上清。再用0.2ml测定缓冲液冲洗细胞两次。通过将过氧化物酶缀合的羊抗人Fc抗体(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)加到所述平板中来检测结合到平板上的抗体。保温45分钟后，如前所述冲洗细胞。向平板中添加TMB底物(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺；Kirkegaard & PerryLaboratories，Gaithersburg，MD)。添加1M磷酸以终止反应。用四参数非线性回归拟合曲线程序(KALEIDAGRAPH^TM，Synergy software，Reading，PA)拟合滴定曲线。测定滴定曲线中点处的吸光度(mid-OD)及其对应的标准品浓度。然后测定在此mid-OD处每种变体的浓度，并用每种变体的浓度除以标准品的浓度。因此，这些值是每种变体相对于标准品的结合比率。试验之间相对亲和力的标准偏差(当量浓度)通常为+/-10％。

如表3所示，与嵌合2H7(v.6.8)相比，CDR交换变体(v.2)的结合急剧降低。然而，3至6型显示结合提高。为了测定将结合亲和力恢复至嵌合2H7的水平可能需要的最小突变数，通过定点诱变构建额外的突变和突变组合，产生表4所示变体7至17。具体而言，这些包括V_H突变A49G、F67A、I69L、N73K、和L78A；以及V_L突变M4L、M33I、和F71Y。16和17型显示最好的相对结合亲和力，在嵌合型水平的2倍范围内，这两者之间没有显著差异(s.d.＝+/-10％)。因此，为了最小化突变数，挑选只具有4个人框架残基至鼠框架残基突变的16型(表4)作为人源化形式，用于额外鉴定。

表3

使用基于细胞的ELISA将人源化2H7IgG变体对CD20的相对结合亲和力与嵌合2H7相比较。相对结合表示为嵌合2H7的浓度相对于等价结合所需的变体浓度；因此比率＜1显示变体的亲和力较弱。相对亲和力测定中的标准偏差平均为+/-10％。可变区中的框架替代是相对于根据Kabat编号系统(Kabat等，同上)的CDR交换型。

2H7型	重链(VH)替代	轻链(VL)替代	相对结合
				6.8	(嵌合体)	(嵌合体)	-1-
2	(CDR交换体)	(CDR交换体)	0.01
				3	R71V，N73K	(CDR交换体)	0.21
4	R71V	(CDR交换体)	0.21
				5	R71V，N73K	L46P	0.50
6	R71V，N73K	L46P，L47W	0.58
				7	R71V	L46P	0.33
8	R71V，L78A	L46P	0.19
				9	R71V，F67A	L46P	0.07
10	R71V，F67A，169L	L46P	0.12
				11	R71V，F67A，L78A	L46P	0.19
12	R71V	L46P，M4L	0.32
				13	R71V	L46P，M33I	0.31
14	R71V	L46P，F71Y	0.25
				15	R71V	L46P，M4L，M33I	0.26
16	R71V，N73K，A49G	L46P	0.65
				17	R71V，N73K，A49G	L46P，L47W	0.67

表4

用于在人源化2H7 16型(2H7.v16)中构建突变V_H(A49G、R71V、N73K)和V_L(L46P)的寡核苷酸序列。加下划线的密码子编码指定氨基酸替代。对于V_H(R71V、N73K)和V_L(L46P)，这些寡核苷酸显示为有义链，因为这些用于在Fab模板上诱变，而对于V_H(A49G)，这些寡核苷酸显示为反义链，因为它与pRK(IgG重链)模板一起使用。16型的蛋白质序列显示于图6和图7。

替代	寡核苷酸序列
		VH(R71V，N73K)	GT TTC ACT ATA AGT  GTC GAC  AAG TCCAAA AAC ACA TT(SEQ ID NO：38)
VH(A49G)	GCCAGGATAGATGGCGCCAACCCATTCCAGGCC(SEQ ID NO：39)
		VL(L46P)	AAGCTCCGAAACCACTGATTTACGCT(SEQID NO：40)

实施例2

2H7的抗原结合决定簇(互补位)

在2H7.v16或2H7.v17中进行丙氨酸替代(Cunningham & Wells，Science244：1081-1085(1989))以便测试抗体的个别侧链在结合CD20中的贡献。在293细胞中从pDR1和pDR2载体表达IgG变体，纯化，并如上所述测定相对结合亲和力。在WIL-2S细胞上，几种丙氨酸替代导致对CD20的相对结合显著降低(表5)。

表5

利用基于细胞的ELISA(WIL2-S细胞)测量的人源化2H7.v16的CDR区中丙氨酸替代的影响。相对结合表示为2H7.v16亲本的浓度相对于等价结合所需的变体浓度；因此比率＜1显示变体的亲和力较弱；比率＞1显示变体的亲和力较高。相对亲和力测定中的标准偏差平均为+/-10％。可变区中的框架替代是相对于根据Kabat编号系统(Kabat等，同上)的2H7.v16。NBD意思是没有可探测的结合。45型的两个数值来自分开的试验。

2H7型	CDR位置	重链替代	轻链替代	相对结合
16	-	-	-	-1-
					140	H1	G26A	-	0.63
141	H1	Y27A	-	0.47
					34	H1	T28A	-	0.86
35	H1	F29A	-	0.07
					36	H1	T30A	-	0.81
37	H1	S31A	-	0.97
					142	H1	Y32A	-	0.63
143	H1	N33A	-	NDB
					144	H1	M34A	-	1.2
145	H1	H35A	-	＜0.25
146	H2	A50G	-	0.31
					147	H2	I51A	-	0.65
38	H2	Y52A	-	0.01
					148	H2	P52aA	-	0.66
39	H2	G53A	-	0.89
					67	H2	N54A	-	1.4
40	H2	G55A	-	0.79
					41	H2	D56A	-	2.0
89	H2	T57A	-	0.61
					90	H2	S58A	-	0.92
91	H2	Y59A	-	0.74
					92	H2	N60A	-	0.80
93	H2	Q61A	-	0.83
					94	H2	K62A	-	0.44

95	H2	F63A	-	0.51
					83	H2	V71A	-	0.96
149	H2	K64A	-	0.82
					150	H2	G65A	-	1.2
					153	H3	V95A	-	0.89
42	H3	V96A	-	0.98
					43	H3	Y97A	-	0.63
44	H3	Y98A	-	0.40
					45	H3	S99A	-	0.84；0.92
46	H3	N100A	-	0.81
					47	H3	S100aA	-	0.85
48	H3	Y100bA	-	0.78
					49	H3	W100cA	-	0.02
59	H3	Y100dA	-	0.98
					60	H3	F100eA	-	NDB
61	H3	D101A	-	0.31
					151	H3	V102A	-	1.1
					117	L1	-	R24A	0.85
118	L1	-	A25G	0.86
					119	L1	-	S26A	0.98
120	L1	-	S27A	0.98
					121	L1	-	S28A	1.0
122	L1	-	V29A	0.41
					50	L1	-	S30A	0.96
51	L1	-	Y32A	1.0
					123	L1	-	M33A	1.0
124	L1	-	H34A	0.21
							-
125	L2	-	A50G	0.92
					126	L2	-	P51A	0.88
52	L2	-	S52A	0.80
					53	L2	-	N53A	0.76
54	L2	-	L54A	0.60
					127	L2	-	A55G	1.1
128	L2	-	S56A	1.1
							-
129	L3	-	Q89A	0.46
					130	L3	-	Q90A	＜0.22

55	L2	-	W91A	0.88
					56	L3	-	S92A	1.1
57	L3	-	F93A	0.36
					58	L3	-	N94A	0.61
131	L3	-	P95A	NDB
					132	L3	-	P96A	0.18
133	L3	-	T97A	＜0.22

实施例3

2H7CDR区内的其他突变

还测试了经A1a扫描鉴定是重要的CDR位置的其他残基替代和替代组合。几种组合变体，特别是v.96，其结合看起来比v.16更牢固。

表6

利用基于细胞的ELISA(WIL2-S细胞)测量的人源化2H7.v16的CDR区中突变组合和非丙氨酸替代的影响。对CD20的相对结合表示为2H7.v16亲本浓度相对于等价结合所需的变体浓度；因此比率＜1显示变体的亲和力较弱；比率＞1显示变体的亲和力较高。相对亲和力测定中的标准偏差平均为+/-10％。可变区中的框架替代是相对于根据Kabat编号系统(Kabat等，同上)的2H7.v16。

2H7型	重链替代	轻链替代	相对结合
16	-	-	-1-
				96	D56A，N100A	S92A	3.5
97	S99T，N100G，Y100bI	-	0.99
				98	S99G，N100S，Y100bI	-	1.6
99	N100G，Y100bI	-	0.80
				101	N54S，D56A	-	1.7
102	N54K，D56A	-	0.48
				103	D56A，N100A	-	2.1
104	S99T.N100G	-	0.81
				105	S99G，N100S	-	1.1
106	N100G	-	～1
				167	S100aG，Y100bS	-
136	D56A，N100A	S56A，S92A	2.6
				137	D56A，N100A	A55G，S92A	2.1
156	D56A，N100A	S26A，S56A，S92A	2.1
				107	D56A，N100A，Y100bI	S92A	未表达

182	Y27W	-
				183	Y27F	-
184	F29Y	-
				185	F29W	-
186	Y32F	-
				187	Y32W	-
188	N33Q	-
				189	N33D	-
190	N33Y	-
				191	N33S	-
208	H35S	-
209	A50S	-
				210	A50R	-
211	A50V	-
				212	A50L	-
168	Y52W	-
				169	Y52F	-	0.75
170	N54D	-	0.25
				171	N54S	-	1.2
172	D56K	-	1
				173	D56R	-
174	D56H	-	1.5
				175	D56E	-	1.2
213	D56S	-
				214	D56G	-
215	D56N	-
				216	D56Y	-
176	Y59W	-
				177	Y59F	-
180	K62R	-
				181	K62D	-
178	F63W	-
				179	F63Y	-
				157	Y97W	-	0.64
158	Y97F	-	1.2
				159	Y98W	-	0.64
160	Y98F	-	0.88
				106	N100G	-
161	W100cY	-	0.05
				162	W100cF	-	0.27

163	F100eY	-	0.59
				164	F100eW	-	0.71
165	D101N	-	0.64
				166	S99G，N100G，S100aD，Y100b删除	-	0.99
217	V102Y	-	1.0
207	-	H34Y
192	-	Q89E
				193	-	Q89N
194	-	Q90E
				195	-	Q90N
196	-	W91Y
				197	-	W91F
205	-	S92N
				206	-	S92G
198	-	F93Y
				199	-	F93W
204	-	F93S，N94Y
				200	-	P96L
201	-	P96Y
				202	-	P96W
203	-	P96R

实施例4

框架人源化替代位点的突变

还在2H7.v16背景中测试了在人源化期间改变的框架位置的其他残基替代。具体而言，在V_L(P46)和V_H(G49、V71、和K73)处进行了在鼠2H7亲本和人共有框架中均未发现的替代性框架替代。

这些替代通常引起很小的相对结合改变(表7)，表明这些位置的框架残基有一定的灵活性。

表7

框架替代在基于细胞(WIL2-S)的测定中的相对结合。显示了相对于2H7.v16背景具有突变的IgG变体。相对结合表示为2H7.v6.8嵌合体的浓度相对于等价结合所需的变体浓度；因此，比率＜1显示变体的亲和力较弱；比率＞1显示变体的亲和力较高。相对亲和力测定中的标准偏差平均为+/-10％。可变区中的框架替代是相对于根据Kabat编号系统(Kabat等，同上)的2H7.v16。

2H7型	重链替代	轻链替代	相对结合
6.8	(嵌合体)	(嵌合体)	-1-
				16	-	-	0.64
78	K73R	-	0.72
				79	K73H	-	0.49
80	K73Q	-	0.58
				81	V71I	-	0.42
82	V71T	-	0.58
				83	V71A	-
84	G49S	-	0.32
				85	G49L	-
86	-	P46E	0.22
				87	-	P46V	0.51
88	-	P46T
				108	G49A，V71T，K73R	S92A，M32L，P46T	0.026*
109	G49A，A49G，V71T，K73R	S92A，M32L，P46T	0.026*
				110	K73R，D56A，N100A	S92A，M32L	未表达
111	G49A，V71T，K73R	-	0.46*
				112	G49A，A50G，V71T，K73R	-	0.12*

(^*)以2H7.v16作为标准比较物测定的变体；

相对值相对于嵌合体进行标准化。

实施例5

具有增强的效应物功能的人源化2H7变体

由于2H7能经由CDC和ADCC二者介导B细胞的裂解，因而要寻找具有改善的CDC和ADCC活性的人源化2H7.v16变体。已经描述了其它抗体Fc区内经由增强对补体成分Clq的结合来改善CDC的某些残基的突变(Idusogie等，J.Immunol.166：2571-2575(2001))。也已描述了经由增强IgG对活化Fcγ受体的结合和削弱IgG对抑制性Fcγ受体的结合来改善ADCC的突变(Shields等，J.Biol.Chem.276：6591-6604(2001)；Presta等，Biochem.Soc.Trans.30：487-490(2002))。具体而言，已经鉴定了改善CDC和ADCC活性的三个突变：S298A/E333A/K334A(在本文中也称为三重Ala突变体或变体；Fc区的编号依据EU编号系统；Kabat等，同上)，如所描述的(Idusogie等，同上(2001)；Shields等，同上)。

为增强2H7的CDC和ADCC活性，构建了2H7Fc的三重Ala突变体。已生成了抗HER2抗体4D5的人源化变体，其具有突变S298A/E333A/K334A，称为4D5Fc110(即抗p¹⁸⁵HER2IgG1(S298A/E333A/K334A)；Shields等，同上)。用ApaI和HindIII消化编码抗体4D5Fc110的质粒p4D5Fc110(Shields等，同上)，将Fc片段(含突变S298A/E333A/K334A)连接到2H7重链载体pDR2-v16的ApaI/HindIII位点中，生成pDR2-v31。31型完整重链的氨基酸序列如图8所示。轻链与v16的轻链相同。

尽管IgG1抗体Fc区的恒定区在给定物种中是相对保守的，但存在等位基因变异(Lefranc和Lefranc的综述，在The Human IgG Subclasses：molecular analysis of structure，function，and regulation中，pp.43-78，F.Shakib编，Pergamon Press，Oxford(1990))。

表8

Fc区中的替代对CD20结合的影响。在基于细胞(WIL2-S)的测定法中测量框架替代对CD20的相对结合。以EU编号(Kabat，同上)显示Fc突变(^*)，相对于2H7.v16亲本。v.31Fc区中的三个Ala改变的组合描述为“Fc110”。显示了相对于2H7.v16背景具有突变的IgG变体。相对结合表示为2H7.v6.8嵌合体的浓度相对于等价结合所需的变体浓度；因此，比率＜1显示变体的亲和力较弱。相对亲和力测定中的标准偏差平均为+/-10％。

2H7型	Fc替代*	相对结合
			6.8	-	-1-
16	-	0.65
			31	S298A，E333A，K334A	0.62

实施例6

稳定性增强的人源化2H7变体

为了开发为治疗用蛋白质，希望选择在合适的制剂缓冲剂中对氧化、脱酰胺、或可能影响产品质量的其它进程保持稳定的变体。在2H7.v16中，几个残基鉴定为可能的不稳定源：VL(M32)和VH(M34、N100)。因此，在这些位点引入突变以同v16比较。

表9

所设计的稳定性和/或效应物功能增强的2H7变体在基于细胞(WIL2-S)的测定法中对CD20的相对结合。显示了相对于2H7.v16背景具有突变的IgG变体。相对结合表示为2H7.v6.8嵌合体的浓度相对于等价结合所需的变体浓度；因此，比率＜1显示变体的亲和力较弱。相对亲和力测定中的标准偏差平均为+/-10％。可变区中的框架替代是相对于根据Kabat编号系统的2H7.v16，Fc突变(^*)以EU编号(Kabat等，同上)显示。

2H7型	重链(VH)改变	轻链(VL)改变	Fc改变*	相对结合
6.8	(嵌合体)	(嵌合体)	-	-1-
					16	-	-	-	0.65
62	-	M32I	-	0.46
					63	M34I	-	-	0.49
64	N100A	-	-
					65	N100A	L47W	-	0.74
66	S99A	L47W	-	0.62
					67	N54A	-	-
68	-	M32I	-	0.48
					69	-	M32L	-	0.52
70	N100A	-	S298A，E333A，K334A	0.80
					71	N100D	-	S298A，E333A，K334A	0.44
72	N100A	M32I	-	0.58
					73	N100A	M32L	-	0.53
74	N100A	M32I	S298A，E333A，K334A	0.61
					75	N100A	M32L	S298A，E333A，K334A	0.60
113	-	-	E356D，M358L	0.60**
					114	D56A，N100A	M32L，S92A	S298A，E333A，K334A	1.2**
115	D56A，N100A	M32L，S92A	S298A，E333A，K334A，E356D，M358L	1.4**
					116	D56A，N100A	M32L，S92A	S298A，K334A，K322A	1.2**
134	D56A，N100A	M32L，S92A	E356D，M358L，D265A	1.5**
					135	D56A，N100A	M32L，S92A	E356D，M358L，D265A，K326W	0.95**
138	D56A，N100A	M32L，S92A	S298A，E333A，K334A，K326A	1.2**
					139	D56A，N100A	M32L，S92A	S298A，E333A，K334A，K326A，E356N，M358L	1.1**
154	-	-	D265A	0.70**
					155	-	-	S298A，K322A，K334A	0.70**

(^**)以2H7.v16作为比较物测量的变体；

相对结合值相对于嵌合体进行标准化。

基于先前报导的突变(Idusogie等，J.Immunol.164：4178-4184(2000)；Idusogie等，J.Immunol.166：2571-2575(2001)；Shields等，J.Biol.Chem.276：6591-6604(2001))，将其他Fc突变与增强稳定性或亲和力的突变组合以改变或增强效应物功能。这些改变包括实施例5中所述的S298、E333A、K334A；降低CDC活性的K322A；降低ADCC活性的D265A；增强CDC活性的K326A或K326W；以及测试Fc区中同种异型改变的影响的E356D/M358L。这些突变中没有一个导致CD20结合亲和力显著不同。

为了测试稳定性突变对蛋白质降解速率的影响，将2H7.v16和2H7.v73以12-14mg/ml配制在10mM组氨酸、6％蔗糖、0.02％POLYSORBATE20^TM乳化剂，pH5.8中，于40℃保温16天。然后通过离子交换层析、聚集、和大小排阻层析片段化对保温后的样品测试负荷变体的变化，并在基于细胞(WIL2-S)的测定法中测试相对结合。

结果显示，根据加速稳定性条件下离子交换层析主峰部分的损耗，与2H7v.16相比，2H7v.73具有更高稳定性。根据聚集、片段化、或结合亲和力，没有看到显著区别。

实施例7

WIL2-S细胞上抗体结合CD20的Scatchard分析

用放射性标记的2H7IgG测定了2H7IgG变体结合WIL2-S细胞的平衡解离常数(K_d)。在CHO细胞中生成IgG变体。用RITUXAN(对于所有试验来源都是Genentech，S.San Francisco，CA)和鼠2H7(BD PharMingen，SanDiego，CA)与人源化变体相比较。也可由其他来源获得鼠2H7抗体，例如eBioscience和Caibiochem(两者都位于San Diego，CA)、Accurate Chemical&Scientific Corp.(Westbury，NY)、Ancell(Bayport，MN)、和Vinci-Biochem(Vinci，意大利)。所有稀释都在结合测定缓冲液(含1％牛血清清蛋白、25mM HEPESpH7.2、和0.01％叠氮钠的DMEM培养基)中进行。将浓度为0.8nM的¹²⁵I-2H7.v16(用乳过氧化物酶碘化)等分试样(0.025ml)分配到V形底96孔微量测定板的孔中，加入冷的抗体连续稀释液(0.05ml)并混合。然后添加WIL2-S细胞(0.025ml中60,000个细胞)。密封平板并在室温保温24小时，然后以3,500RPM离心15分钟。然后吸出上清液，冲洗细胞丸状沉淀并离心。再次吸出上清液，将丸状沉淀溶于1N NaOH，转移到用于伽马计数的试管中。数据用于利用Ligand程序(McPherson，Comput.Programs Biomed.17：107-114(1983))进行Scatchard分析(Munson和Rodbard，Anal.Biochem.107：220-239(1980))。结果如表10所示，表明人源化2H7变体具有与鼠2H7相比相似的CD20结合亲和力，和与RITUXAN相似的结合亲和力。根据以上表8所示的结合，预期2H7.v31会具有与v.16非常相似的K_d。

表10

来自Scatchard分析的2H7变体的平衡结合亲和力

抗体变体	Kd(nM)	n
			RITUXAN	0.99±0.49	3
2H7(鼠)	1.23±0.29	3
			2H7.v16	0.84±0.37	4
2H7.v73	1.22±0.39	4
			2H7.v75	1.09±0.17	4

实施例8

补体依赖性细胞毒性(CDC)测定

本质上如已描述的(Idusogie等，J.Immunol.164：4178-4184(2000)；Idusogie等，J.Immunol.166：2571-2575(2001))，对2H7IgG变体测定其介导补体依赖性WIL2-S细胞裂解的能力，WIL2-S细胞为表达CD20的类淋巴母细胞B细胞系。从0.1mg/ml储液1∶3连续稀释抗体。将每个稀释度的0.05ml等分试样加至96孔组培板，其中包含0.05ml正常人补体溶液(Quidel，SanDiego，CA)。将50,000个WIL2-S细胞以0.05ml体积加到该混合物中。37℃保温2小时后，添加0.05ml ALAMAR BLUE^TM刃天青溶液(AccumedInternational，Westlake，OH)，37℃继续再保温18小时。从板上移走盖子，于室温在轨道摇床上摇动15分钟。用530nm激发滤光片(excitation filter)和590nm发射滤光片(emission filter)读取相对荧光单位(RFU)。用KALEIDAGRAPH^TM软件通过将RFU拟合为浓度的函数来计算每种抗体的EC₅₀。

结果(表11)显示了人源化2H7抗体在CDC中具有令人惊讶的改善，对于v.73其相对功效类似于RITUXAN，对于v.75比RITUXAN功效大3倍，而对于v.16比RITUXAN弱3倍。

表11

2H7抗体相对于RITUXAN的CDC活性。数值＞1表明CDC活性比RITUXAN弱，数值＜1表明活性比RITUXAN强。除了用(^*)表示的瞬时生产以外，抗体由稳定的CHO系所生产。

抗体变体	n	EC50(变体)/EC50(RITUXAN)
RITUXAN	4	-1-
			2H7.v16	4	3.72；4.08
2H7.v31*	4	2.21
			2H7.v73	4	1.05
2H7.v75	4	0.33
			2H7.v96*	4	0.956
2H7.v114*	4	0.378
			2H7.v115*	4	0.475
2H7.v116*	1	＞100
			2H7.v135*	2	0.42

实施例9

抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)测定

本质上如所描述的(Shields等，J.Biol.Chem.276：6591-6604(2001))，用乳酸脱氢酶(LDH)读出，对2H7IgG变体测定了其介导NK细胞裂解WIL2-S细胞的能力，WIL2-S细胞为表达CD20的类淋巴母细胞B细胞系。NK细胞由100ml肝素化血液制得，所述肝素化血液用100ml PBS稀释，由已归为FcγRIII同种型，也称为CD16(Koene等，Blood 90：1109-1114(1997))的正常人供体获得。在该试验中，NK细胞来自CD16杂合的(F158/V158)人供体。将稀释血液在15ml淋巴细胞分离培养基(ICN Biochemical，Aurora，Ohio)上分层并以2000RPM离心20分钟。将位于层间接触面的白细胞分配到4个干净的50ml试管中，试管中装有含15％胎牛血清的RPMI培养基。将试管以1400RPM离心5分钟，弃去上清液。将丸状沉淀重悬于MACS缓冲液(0.5％BSA，2mM EDTA)，按照厂商的方案(Miltenyi Biotech.)用珠子(NK细胞分离试剂盒，130-046-502)纯化NK细胞。将NK细胞在MACS缓冲液中稀释到2×10⁶个细胞/ml。

将抗体在测定培养基(F12/DMEM 50∶50，无甘氨酸，1mM HEPES缓冲液pH7.2、青霉素/链霉素(100个单位/ml；Gibco)、谷氨酰胺、和1％热灭活胎牛血清)中的连续稀释液(0.05ml)加到96孔圆底组培板中。将WIL2-S细胞在测定缓冲液中稀释到4×10⁵个/ml的浓度。将WIL2-S细胞(每个孔0.05ml)在96孔板中与稀释抗体混合，室温保温30分钟以允许抗体结合CD20(调理作用)。

向每个孔添加0.1ml NK细胞以启动ADCC反应。在对照孔中加入2％TRITONX-100烷基芳基聚醚醇。然后将所述平板在37℃保温4小时。按照厂商的说明，用细胞毒性(LDH)检测试剂盒(Kit#_1644793，RocheDiagnostics，Indianapolis，Indiana)测量释放的LDH水平。向每个孔添加0.1mlLDH显影剂，接下来混合10秒。然后用铝箔覆盖平板，于室温暗处保温15分钟。然后读取490nm处的光密度，用对照孔中测得的总LDH去除该光密度，用于计算％裂解。将所述裂解作为抗体浓度的函数来绘图，使用4参数曲线拟合(KALEIDAGRAPH^TM软件)来测定EC₅₀浓度。

结果显示人源化2H7抗体在ADCC中有活性，对于v.31和v.75，它们的相对功效比RITUXAN高20倍，对于v.16，比RITUXAN强5倍，对于v.73，比RITUXAN高差不多4倍。

表12

根据n次试验，与2H7.v16相比较的2H7抗体对WIL2-S细胞的ADCC活性。(数值＞1表示效力比2H7.v16低，数值＜1表示效力更强)。

抗体变体	n	EC50(变体)/EC50(2H7.v 16)
			RITUXAN	4	5.3
2H7.v16	5	1
			2H7.v31	1	0.24
2H7.v73	5	1.4
			2H7.v75	4	0.25

进行其他ADCC测定以将2H7的组合变体与RITUXAN相比较。这些测定的结果表明与RITUXAN相比，2H7.v114和2H7.v115具有＞10倍改善的ADCC效力(表13)。

表13

根据n次试验，与RITUXAN相比，2H7抗体对WIL2-S细胞的ADCC活性(数值＞1表明效力低于RITUXAN，数值＜1表明效力更强)。

抗体变体		EC50(变体)/EC50(RITUXAN)
RITUXAN	2	-1-
			2H7v.16	2	0.52
2H7v.96	2	0.58
			2H7.v114	2	0.093
2H7.v115	2	0.083
			2H7.v116	2	0.30

实施例10

2H7变体在猕猴初步研究中的体内影响

在正常雄性猕猴(Macaca fascicularis)中测试由CHO细胞瞬时转染产生的2H7变体，以评价其体内活性。其它抗CD20抗体，诸如C2B8(RITUXAN)已证明有能力在正常灵长类中损耗B细胞(Reff等，Blood83：435-445(1994))。

在一项研究中，比较了人源化2H7变体。在平行研究中，也在猕猴中测试了RITUXAN。五个剂量组中每个组使用四只猴子：(1)媒介、(2)0.05mg/kg hu2H7.v16、(3)10mg/kg hu2H7.v16、(4)0.05mg/kg hu2H7.v31、和(5)10mg/kghu2H7.v31。以0、0.2、或20mg/ml的浓度静脉内施用抗体，共计两个剂量，一次在研究的第1天，另一次在第8天。剂量给药的第一天定为第1天，前一天定为-1天；康复的第一天(每个组中2只动物)定为第11天。在第-19、-12、1(剂量给药前)天、和第一次服药后6小时、24小时、和72小时收集血样。在第8天(剂量给药前)、第10天(处死2只动物/组前)、以及在第36和67天(对于康复的动物)取更多样品。

通过对CD3-/CD40+细胞计数的FACS方法测定外周B细胞浓度。用下述开启策略获得猴子样品中CD3-CD40+B细胞占总淋巴细胞的百分数。在前向散射/侧向散射散点图上标记淋巴细胞群以确定区域1(R1)。用R1中的结果，显示了CD40和CD3标记的荧光强度点图。荧光标记的同种型对照用于测定各自的CD40和CD3阳性的截止点。

结果表明，2H7.v16和2H7.v31在10mg/kg剂量都能够产生完全的外周B细胞损耗，在0.05mg/kg剂量都能产生部分的外周B细胞损耗。在剂量给药的前72小时期间测量的B细胞损耗时程和程度对于两种抗体来说是相似的。随后对康复动物的分析表明，与服用2H7.v16的相比，用2H7.v31治疗的动物显示出延长的B细胞损耗。具体而言，对于用10mg/kg 2H7.v16治疗的康复动物来说，在第10天和第36天取样之间的某个时间，B细胞显示出实质性的B细胞恢复。然而，对于用10mg/kg 2H7.v31治疗的康复动物来说，B细胞直到第36天和第67天之间的某个时间才显示出恢复。这说明，与2H7.v16相比，2H7.v31的完全损耗持续时间长了约一个月。

在低或高剂量的猴子研究中没有观察到毒性，总体病理学是正常的。在其它研究中，相隔两周为这些猴子i.v.施用2个剂量，直至所评估的最高剂量(100mg/kg×2＝1200mg/m²×2)，v16都被很好地耐受。

猕猴中2H7.v16对比RITUXAN的数据说明，CDC活性减小5倍并未对效力造成不利影响。对于首次输注反应，具有强烈ADCC活性但CDC活性减小的抗体与具有更强CDC活性的抗体相比，可能具有更有利的安全谱。

实施例11

具有增强的效应物功能的岩藻糖缺陷型2H7变体抗体

正常CHO和HEK293细胞向IgG寡糖添加岩藻糖至很高程度(97-98％)。来自血清的IgG也是高度岩藻糖基化的。

使用具有岩藻糖基化能力的二羟叶酸还原酶阴性(DHFR-)CHO细胞系DP12和蛋白质岩藻糖基化缺陷的细胞系Lec13来生产抗体，以进行该研究。CHO细胞系Pro-Lec13.6a(Lec13)从Yeshiva大学的Albert Einstein医学院的Pamela Stanley教授处获得。亲本系为Pro-(脯氨酸营养缺陷型)和Gat-(甘氨酸、腺苷、胸苷营养缺陷型)。CHO-DP12细胞系是CHO-K1细胞系(ATCC#_CCL-61)的衍生物，其为二氢叶酸还原酶缺陷的，具有降低的胰岛素需求。使用SUPERFECT^TM转染试剂法(Qiagen，Valencia，CA)用cDNA转染细胞系。表达转染抗体的Lec13细胞的选择在生长培养基中用10μg/ml二盐酸嘌呤霉素(Calbiochem，San Diego，CA)进行，所述生长培养基含：有L-谷氨酰胺、核糖核苷和脱氧核糖核苷的MEM Alpha培养基(GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD)，添加有10％灭活FBS(Gibco)、10mMHEPES、和1X青霉素/链霉素(Gibco)。CHO细胞类似的在含Ham氏F12不含GHT的生长培养基中选择，所述生长培养基为：不含甘氨酸含NaHCO₃的低葡萄糖DMEM，添加有5％FBS(Gibco)、10mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、1X GHT (甘氨酸、次黄嘌呤、胸苷)、和1X青霉素/链霉素。

菌落在二至三周内形成，合并菌落用于扩增和蛋白质表达。开始时以3×10⁶个细胞/10cm平板接种细胞合并物，用于小批量蛋白质表达。一旦细胞长到90-95％汇合，就将其转到无血清培养基中，3-5天后收集细胞上清液，在Fc IgG-和完整IgG-ELISA中测试以估计蛋白质表达水平。在转到PS24生产培养基中前一天，以约8×10⁶个细胞/15cm平板接种Lec13和CHO细胞，所述生产培养基添加有10mg/L重组人胰岛素和1mg/L微量元素。

将Lec13细胞和DP12细胞在无血清生产培养基中保持3-5天。收集上清液并在150ml锥形管中离心澄清，以去除细胞和碎片。添加蛋白酶抑制剂PMSF和抑酶肽(Sigma，St.Louis，MO)，在马上要用蛋白质G层析(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)纯化前，在搅拌细胞上用MWCO30^TM过滤器(Amicon，Beverly，MA)将上清液浓缩5倍。用CENTRIPREP-30^TM浓缩器(Amicon)将所有蛋白质缓冲交换到PBS中并进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。用A280吸光度数值测定蛋白质浓度并用氨基酸组成分析检验。

用表达人源化2H7v.16、2H7v.31的载体转染CHO细胞并如所述的方法选择。2H7v.16抗体保留野生型Fc区，而v.31(参见以上实施例5，表8)具有其中进行了3个氨基酸改变(S298A、E333A、K334A)的Fc区，导致对FcγRIIIa受体的亲和力更高(Shields等，J.Biol.Chem.276(9)：6591-6604(2001))。转染并选择后，分离细胞的个别集落并评估蛋白质表达水平，最强的生产细胞进行甲氨喋呤选择，以选择具有扩大的质粒拷贝数并因此产生更高抗体水平的细胞。培养细胞并将其转移到无血清培养基中达7天，然后收集所述培养基并加载到蛋白质A柱子上，用标准技术洗脱抗体。用测量完整抗体的ELISA测定抗体的终浓度。用CENTRIPREP-30^TM浓缩器(Amicon)将所有蛋白质缓冲交换到PBS中并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

天冬酰胺连接寡糖的基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析。

用Papac等，Glycobiology8：445-454(1998)的方法，将N连接寡糖从重组糖蛋白中释放。简单说，用100μl甲醇调节衬有聚偏二氟乙烯(PVDF)的96孔微量滴定板(Millipore，Bedford，MA)的孔，向MilliporeMULTISCREEN^TM真空歧管施加真空以使甲醇经PVDF膜汲出。用3X250μl水冲洗经调节的PVDF膜。在所有冲洗步骤之间，通过向多歧管稍微施加真空，将孔完全排干。用还原和羧甲基化缓冲液(RCM)冲洗所述膜，所述缓冲液由6M盐酸胍、360mM TRIS、2mM EDTA，pH8.6组成。将糖蛋白样品(50μg)加到各个孔中，再次通过稍微施加真空经由PVDF膜汲出，用2X50μl RCM缓冲液冲洗孔。向每个孔添加50μl 0.1M二硫苏糖醇(DTT)溶液并将微量滴定板于37℃保温1小时，以还原固定化样品。真空去除DTT并用4×250μl水冲洗孔。

添加50ul 0.1M碘乙酸(IAA)溶液以羧甲基化半胱氨酸残基，碘乙酸溶液是在1M NaOH中新制备的，并用RCM缓冲液稀释到0.1M。羧甲基化通过于周围温度在暗处保温30分钟来进行。向平板施加真空以去除IAA溶液，并用4×250μl纯化水冲洗孔。添加100μl 1％PVP-360(聚乙烯吡咯烷酮360,000MW)(Sigma)溶液并于周围温度保温1小时，以封闭PVDF膜。稍加真空去除PVP-360溶液并用4×250μl水冲洗孔。将25μl l0mM TRIS醋酸pH8.4中25个单位/ml的PNGASE F^TM酰胺酶(New England Biolabs，Beverly，MA)消化液添加到每个孔中，消化于37℃进行3小时。消化后，将样品转移到500μl Eppendorf管中，每个样品添加2.5μl 1.5M醋酸溶液。将酸化样品在周围温度保温3小时，将寡糖从糖基胺转变为羟基形式。MALDI-TOF质谱分析前，释放的寡糖用0.7ml柱床的阳离子交换树脂(氢形式的AG50W-X8^TM树脂)(Bio-Rad，Hercules，CA)脱盐，所述树脂浆化装入小型反应管(US Biochemical，Cleveland，OH)。

为了以阳性方式(positive mode)对样品进行MALDI-TOF质谱分析，用0.5μl 2，5-二羟基苯甲酸基质(sDHB)将脱盐的寡糖(0.5μl等分试样)加到不锈钢靶上，所述基质通过将2mg 2，5-二羟基苯甲酸与0.1mg 5-甲氧基水杨酸(5-methoxyslicylic acid)一起溶于1ml乙醇/10mM氯化钠1∶1(v/v)而制得。真空干燥样品/基质混合物。为了以阴性方式(negative mode)进行分析，将脱盐的N连接寡糖(0.5μl等分试样)与0.5μl 2’，4’，6’-三羟基苯乙酮基质(THAP)一起加到不锈钢靶上，所述基质在1∶3(v/v)的乙腈/13.3mM柠檬酸铵缓冲液中制得。真空干燥样品/基质混合物，然后在分析前使之吸收大气湿气。在PERSEPTIVE BIOSYSTEMS^TM VOYAGER-DE^TM质谱仪上以MALDI-TOF分析释放的寡糖。用线性图形(linear configuration)并利用延迟提取(delayedextraction)，以正或负模式(positive and negative mode)在20kV操作质谱仪。用1300的激光功率并以数据加和的方式(240次扫描)获得数据，以提高信噪比。用标准寡糖的混合物校准仪器，在质量赋值前用19点Savitsky-Golay算法平滑数据。用CAESAR7.0^TM数据分析软件包(SciBridge Software)完成质谱数据的集成。

NK细胞ADCC。

如实施例9所述实施ADCC测定法。NK对比靶细胞(WIL2-S)的比率为4比1，测定运行4小时，如前所述用乳糖脱氢酶测定法测量毒性。在添加NK细胞前用所显示的抗体浓度调理靶细胞30分钟。所用的RITUXAN抗体来自Genentech(S.San Francisco，CA)。

结果显示，岩藻糖基化不足的抗体比岩藻糖完全补足的抗体更有效的介导NK细胞靶细胞杀伤。岩藻糖基化不足的抗体2H7v.31最有效的介导靶细胞杀伤。该抗体在较低浓度即有效，在更高浓度时能够比其它抗体以更高百分比介导靶细胞杀伤。抗体的活性如下：Lec13衍生的2H7v31＞Lec13衍生的2H7v16＞Dp12衍生的2H7v31＞Dp12衍生的2H7v16＞或＝RITUXAN。蛋白质和碳水化合物的改造是累加的。比较来自Lec13生产的和CHO生产的IgG的天然IgG上发现的碳水化合物，在半乳糖苷化程度上没有显示出可觉察的差异，因此该结果只能归因于岩藻糖的存在与否。

实施例12

猕猴CD20的克隆和抗体结合

从猕猴脾cDNA文库分离编码CD20的cDNA后，测定猕猴(Macacafascicularis)的CD20DNA序列。使用用于cDNA合成和质粒克隆的SUPERSCRIPT^TM质粒系统(Cat#18248-013，Invitrogen，Carlsbad，CA)稍加改造来构建文库。用限制性位点XhoI和NotI将该cDNA文库连接到pRK5E载体中。从脾组织(California Regional Research Primate Center，Davis，CA)分离mRNA。根据人CD20的非编码序列设计用于扩增编码CD20的cDNA的引物。通过聚合酶链式反应(PCR)，用N端区引物5′-AGTTTTGAGAGCAAAATG-3′(SEQ ID NO：41)和C端区引物5′-AAGCTATGAACACTAATG-3′(SEQ ID NO：42)克隆编码猕猴CD20的cDNA。按照厂商的推荐方案(Gibco，Rockville，MD)用PLATINUM TAQ DNAPOLYMERASE HIGH FIDELITY^TM系统实施PCR反应。将PCR产物亚克隆到PCR^2.1-TOPO^载体(Invitrogen)中并转化到XL-1 blue大肠杆菌(Stratagene，La Jolla，CA)中。从个别克隆分离含所连接PCR产物的质粒DNA并测序。

猕猴CD20的氨基酸序列如图19所示。图20显示了猕猴和人CD20的对比。猕猴CD20与人CD20的相似度在97.3％，有8处不同。胞外域包含一处改变V157A，而其余7个残基可在胞质或跨膜区中找到。

对针对人CD20的抗体测定结合和置换FITC缀合的鼠2H7结合表达CD20的猕猴细胞的能力。从2只猕猴(California Regional Research PrimateCenter，Davis，CA)抽二十毫升血液置于肝素钠中，直接运到Genentech公司。同一天合并血样并通过添加40ml PBS稀释。在50ml锥形管(Cat#_352098，Falcon，Franklin Lakes，NJ)中，将20ml稀释血液在4×20mlFICOLL-PAQUE^TMPLUS(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)上分层，在SORVAL^TM7离心机(Dupont，Newtown，CT)中于室温以1300rpm离心30分钟。分离PBMC层并在PBS中冲洗。在0.2％NaCl溶液中裂解红细胞，用等体积的1.6％NaCl溶液恢复到等渗，以1000RPM离心10分钟。将PBMC丸状沉淀重悬于含5％FBS的RPMI1640(Gibco，Rockville，MD)，分到10cm组培盘中，于37℃保温1个小时。通过吸取除去未贴壁的B和T细胞群，离心，并计数。共计回收了2.4×10⁷个细胞。将重悬的PBMC分到二十个12×75mm培养管(Cat#_352053，Falcon)中，每个管在0.25ml体积中含1×10⁶个细胞。将管分为四组，每组五个管。向每个组添加培养基(RPMI1640，5％FBS)、滴定量的对照人IgG₁抗体、RITUXAN、2H7.v16、或2H7.v31。每种抗体的终浓度为30、10、3.3和1.1nM。此外，还向每个管添加20μl异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗人CD20(Cat#555622，BD Biosciences，SanDiego，CA)。轻轻混合细胞，在冰上保温1小时，然后在冷的PBS中冲洗两次。在EPIC XL-MCL^TM流式细胞仪(Coulter，Miami，FL)上分析细胞表面染色，得出几何平均数，并对抗体浓度绘图(KALEIDAGRAPH^TM，SynergySoftware，Reading，PA)。

数据显示2H7v.16和2H7v.31竞争性地置换FITC-鼠2H7结合猕猴细胞。此外，RITUXAN也置换FITC-鼠2H7结合，因此证明2H7和RITUXAN结合CD20上的交叠表位。另外，数据显示2H7v.16、2H7v.31和RITUXAN的IC₅₀值相似，落在4-6nM范围内。

实施例13

中度至严重类风湿性关节炎中rhuMAb2H7(2H7.v16)的I/II期研究

方案概要

在患中度至严重类风湿性关节炎的受试者中进行PRO70769(rhuMAb2H7)剂量逐步扩大的随机、安慰剂对照、多通道、盲试I/II期安全性研究，所述受试者接受稳定剂量的伴药甲氨蝶呤(MTX)。

目的

该研究的主要目的是评估在患中度至严重类风湿性关节炎(RA)的受试者中逐步扩大PRO70769(rhuMAb2H7)的静脉内(IV)剂量的安全性和耐受性。

研究设计

这是在患中度至严重RA受试者中进行的与MTX联合施用的PRO70769剂量逐步扩大的随机、安慰剂对照、多通道、盲试I/II期、研究者和受试者盲试安全性研究。该研究由剂量扩大期和有大量受试者加入的第二期组成。主办者将保持不参与治疗分派。

加入的患中度至严重RA的受试者如下，一至五种缓和疾病的抗风湿药物或生物制剂无效，目前对MTX治疗具有不令人满意的临床响应。

在进入研究前受试者需要接受至少12周的每周10-25mg范围的MTX，且在接受他们的初始剂量的研究药物(PRO70769或安慰剂)前要接受至少4周的稳定剂量。受试者也可接受稳定剂量的口服皮质类固醇(可达每天10mg，或者同等的强的松)和稳定剂量的非类固醇抗炎药(NSAID)。按照下面的剂量扩大计划，受试者将在第1天和第15天以指定剂量接受两次IV输注PRO70769或等量安慰剂。

将按照特定标准并在内部安全性数据评审委员会对安全性数据进行评审和评估急性毒性后扩大剂量，所述急性毒性评估在对每个组最后一名受试者的第二次输注后72小时进行。剂量扩大期之后，如果已经证明在剂量扩大期期间所述剂量水平是可耐受的，则另外40名受试者(32名活性药和8名安慰剂)将随机接受以下每个剂量水平：2×50mg、2×200mg、2×500mg、和2×1000mg。将有大约205名受试者加入到该项研究中。

将获得并记录B细胞计数。在6个月功效评估之后，将在48周跟踪期内用流式细胞术评估B细胞计数。不会认为B细胞损耗是剂量限制毒性(DLC)，反而认为是所期待的PRO70769治疗的药效结果。

在可选的子研究中，将在多个时间点从受试者获得用于血清和RNA分析的血液以及尿样。这些样品可用于鉴定这样的生物标志物，所述生物标志物可预测中度至严重RA受试者对PRO70769治疗的响应。

结果测量

该研究的主要结果测量是PRO70769在中度至严重RA受试者中的安全性和耐受性。

研究治疗

按照下面的扩大计划，受试组将在第1天和第15天以指定剂量接受两次PRO70769或等量安慰剂的IV输注：

-10mg PRO70769或等量安慰剂：4名受试者活性药物，1名对照

-50mg PRO70769或等量安慰剂：8名受试者活性药物，2名对照

-200mg PRO70769或等量安慰剂：8名受试者活性药物，2名对照

-500mg PRO70769或等量安慰剂：8名受试者活性药物，2名对照

-1000mg PRO70769或等量安慰剂：8名受试者活性药物，2名对照

功效

将通过ACR响应来测量PRO70769的功效。将由处理组概括获得ACR20、ACR50、和ACR70响应的受试者的百分比，每个组将产生95％的置信区间。将通过治疗和访问概括这些响应的成分及其从基线的变化。

实施例1-13的结论

以上数据证明了生产人源化CD20结合抗体，特别是人源化2H7抗体变体的成功，它们保持甚至增强了它们的生物学特性。本发明的人源化2H7抗体以近似于鼠供体和嵌合2H7抗体的亲和力结合CD20，在灵长类中有效杀伤B细胞，导致B细胞损耗。相对于目前用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的一种嵌合抗CD20抗体，某些变体显示出增强的ADCC，有利于在患者中使用更低剂量的治疗用抗体。另外，尽管对于以有效实现完全B细胞损耗的剂量施用的具有鼠FR残基的嵌合抗体可能必需避免针对它的抗体反应，但根据具体疾病和患者的需要，可以以获得部分或完全B细胞损耗的剂量、以不同的持续时间施用本发明的人源化抗体。另外，这些抗体在溶液中显示出稳定性。人源化2H7抗体的这些特性使得它们理想的用作CD20阳性自身免疫病治疗中的免疫治疗剂；预期这些抗体在人类患者中没有免疫原性，或者至少免疫原性低于完全鼠源的或嵌合的抗CD20抗体。

实施例14

更多人源化抗体的制备

分别包含SEQ ID NO：24和28的轻链和重链氨基酸序列的抗体2H7.v31可以在Fc区中进一步包含至少一个增强ADCC和/或CDC活性的氨基酸替代，诸如氨基酸替代S298A/E333A/K334A中的一个，更优选2H7.v31具有SEQ ID NO：28的重链氨基酸序列。所述抗体可以是2H7.v138，其分别包含SEQ ID NO：29和30的轻链和重链氨基酸序列，分别如图10和11所示，图10和11是这些序列与2H7.v16的相应轻链和重链氨基酸序列的比对。或者，这类优选的完整人源化2H7抗体是2H7.v477，其具有2H7.v138的轻链和重链序列，除氨基酸替代N434W外。任何这些抗体可以在Fc区中进一步包含至少一个降低CDC活性的氨基酸替代，例如至少包含替代K322A。参见美国专利6,528,624B1(Idusogie等)。

一些优选的人源化2H7变体是那些具有SEQ ID NO：2的轻链可变区和SEQ ID NO：8的重链可变区的变体，即那些在Fc区中具有或没有替代的变体，和那些具有SEQ ID NO：8中含改变N100A或D56A和N100A的重链可变区和SEQ ID NO：2中含改变M32L、或S92A、或M32L和S92A的轻链可变区的变体，即那些在Fc区中具有或没有替代的变体。如果在Fc区中进行替代，则优选它们是下表中所列出的其中一个。

在本发明的一些各种优选实施方案的概括中，基于2H7 16型的变体V区将具有v16的氨基酸序列，除下表指出的氨基酸替代位置之外。除非另有说明，2H7变体将具有与v16相同的L链。

2H7型	重链(VH)改变	轻链(VL)改变	Fc改变
				16			-
31	-	-	S298A，E333A，K334A
				73	N100A	M32L
75	N100A	M32L	S298A，E333A，K334A
				96	D56A，N100A	S92A
114	D56A，N100A	M32L，S92A	S298A，E333A，K334A
				115	D56A，N100A	M32L，S92A	S298A，E333A，K334A，E356D，M358L
116	D56A，N100A	M32L，S92A	S298A，K334A，K322A
				138	D56A，N100A	M32L，S92A	S298A，E333A，K334A，K326A
477	D56A，N100A	M32L，S92A	S298A，E333A，K334A，K326A，N434W
				375	-	-	K334L

除上述变体之外，完整人源化2H7抗体可以是138型，其包括轻链氨基酸序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：29)

和重链氨基酸序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：30)。

在另一个实施方案中，人源化2H7抗体可以包含SEQ ID NO：43的轻链可变区(V_L)序列和SEQ ID NO：8的重链可变区(V_H)序列，其中所述抗体进一步包含VH-CDR2中的氨基酸替代D56A，且VH-CDR3中的N100用Y或W替代，其中SEQ ID NO：43具有序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：43)。

在这最后一种人源化2H7抗体的实施方案中，N100用Y替代。在另一实施方案中，N100用W替代。另外，在另一个实施方案中，所述抗体在VH-CDR3中包含替代S100aR，优选在Fc区中进一步包含至少一个增强ADCC和/或CDC活性的氨基酸替代，诸如包含IgG1 Fc的抗体，其中包含氨基酸替代S298A、E333A、K334A、K326A。或者，所述抗体在VH-CDR3中包含替代S100aR，优选在Fc区中进一步包含至少一个增强ADCC但降低CDC活性的氨基酸替代，诸如至少包含氨基酸替代K322A的抗体，以及进一步包含氨基酸替代S298A、E333A、K334A的抗体。

在一个特别优选的实施方案中，所述抗体是511型，它包含2H7.v511轻链序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：44)

和2H7.v511重链序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：45)。

实施例15

Rituximab在多软骨炎中的临床研究

用RITUXAN抗体治疗经诊断患多软骨炎的患者。所治疗的患者不会有B细胞恶性肿瘤。

按照下面的任何剂量给药计划为患者静脉内(IV)施用RITUXAN：

(A)第1天IV50mg/m²

   第8、15和22天IV150mg/m²

(B)第1天IV150mg/m²

   第8、15和22天IV375mg/m²

(C)第1、8、15和22天IV375mg/m²

可以将更多的辅助疗法(诸如上文所述的免疫抑制剂)与RITUXAN疗法联合，但优选在整个治疗过程中用RITUXAN作为单一试剂治疗患者。

根据由标准化学参数测定的软骨组织炎症减轻为基础测定总响应率。施用RITUXAN将在如上所述治疗的患者中改善任何一种或多种多软骨炎症状。

实施例16

Rituximab在多发性单神经炎中的临床研究

用rituximab(RITUXAN)抗体治疗临床诊断为本文定义的多发性单神经炎的患者，任选与类固醇疗法联合。所治疗的患者不会有B细胞恶性肿瘤。详细且完整的病史在确定可能的紊乱基本病因中是非常重要的。疼痛通常在腰部或臀部开始，并蔓延到一侧的大腿和膝盖。疼痛通常以深层的伴随叠加刺痛的疼痛为特征，晚上最为严重。患有糖尿病的个体典型地存在一侧严重大腿疼痛的急性发作，很快接下来是前部大腿肌肉虚弱无力和萎缩，并且膝跳反射丧失。患者反映的其它可能的症状包括：麻木、刺痛感、感觉异常、灼痛-感觉迟钝、身体部分移动困难-麻痹、身体部分受控运动缺乏。感觉和运动丧失可能与特定神经机能障碍有关。检查显示除受影响更深刻的区域之外，仍然保留反射和充足的力量。多发性单神经炎的一些常见发现可能包括(未按频度顺序排列)：坐骨神经机能障碍、股神经机能障碍、腓总神经机能障碍、辅助神经机能障碍、桡神经机能障碍、正中神经机能障碍、尺神经机能障碍、和自主神经系统机能障碍，即控制不随意身体机能例如腺体和心脏的部分神经系统。

对治疗显示积极响应表现为在下面列出的导致该差异的四个参数中，有两个发生改善，同时还以先前的糖尿病性神经病治疗研究(Jaradeh等，Journal of Neurology，Neurosurgery and Psychiatry67：607-612(1999))为基础。患者必须患有用电生理学测试可测量的神经病。排除患已知的糖尿病或遗传性神经病的患者。

根据以下标准(数值应当在登记前2个月内获得)的测量，患者必须具有足够的器官机能：肝：AST＜实验室正常值上限的3倍且胆红素＜2.0mg/dl。肾：肌酐＜3.0mg/dl。

将在门诊(out-patient)环境中静脉内施用rituximab。不需要管线过滤器。前一个小时的初始速率是50mg/小时。如果看不到毒性，可以将所述速率以50mg/小时的增量30分钟的间隔逐渐提高到400mg/小时的最大速率。如果第一个剂量被很好地耐受，则后续剂量的初始速率为100mg/小时，以100mg/小时的增量30分钟的间隔逐渐提高，不超过400mg/小时。如果患者发烧且打寒战，则停止抗体输注。应当评估副作用的严重性。如果症状改善，则输注继续，开始时以先前速率的一般进行。抗体输注之后，静脉针应当留置以便需要时加药。如果观测1个小时后没有并发症，可以停止静脉针。

本研究中登记的所有患者将每周接受rituximab，连续4周。剂量以实际表面积为基础。施药计划为在第1、8、15和22天静脉内输注rituximab，每周四次375mg/m²。所有患者应当在治疗前30-60分钟IV或PO给予650mgTYLENOL疼痛缓解药和50mg BENADRYL过敏药进行前驱用药以减少不良后果。施药期间如果发生反应，应当能够获得治疗过敏性反应的药物例如肾上腺素、抗组胺剂和皮质类固醇以立即使用。另外，可以与rituximab一起联合使用止痛剂诸如醋氨酚、阿斯匹林、阿米替林(ELAVIL)、卡马西平(TEGRETOL)、苯妥英(DILANTIN)、加巴喷丁(NEURONTIN)、(E)-N-香草基-8-甲基6-壬酰胺(noneamid)(CAPSAICIN)、或神经阻断剂。

将用几个不同的参数评估神经病：1)EMG/NCS2)定量感官测试3)神经病损伤评分4)神经病症状和变化调查表。

EMG/NCS：由同一肌电图描记器和同一技师在rituximab输注后三、六和十二个月时进行肌电描记和神经传导速率测量。用来自每项研究的概括数据与初始值比较，所述初始值包括平均感觉神经动作电位(腓神经、正中神经和尺神经)、平均复合(compound)运动神经动作电位(前胫骨的腓神经、胫神经、尺神经和正中神经)、和运动神经的平均传导速率。也将计算平均F波反应时间和近侧至远侧运动振幅比率。目的响应将需要自基线起改善≥10％。稳定的疾病不会显示出神经病中的显著变化(+/-≥10)。进行性疾病会显示出神经病恶化(＞自基线起10％)。

定量感官测试：除了末梢脚和手的排汗轴突反射测试(sudomotor axonreflex test，QSART)之外，还将由同一技师于rituximab输注后三、六和十二个月时在脚和手背上进行具有振动检测阈(VDT)、平息检测阈(CDT)、和热痛觉阈(HPT)的定量感官测试。可以以相对于标准偏差的百分比分数为基础将这些测试中的异常转变为点数。自研究前测量值改变两个百分点将认为是显著的。

神经病损伤评分(NIS)：该测试测量反射、感觉和肌力。进行了有关以脚趾、脚后跟行走和由下跪姿势起立的下肢功能评估。整个研究中由同一神经病学家于rituximab输注后三、六和十二个月时进行评分。改善将定义为NIS减少5个点或更多(Dyck″Quantitating severity ofneuropathy″In：Dyck等编，Peripheral Neuropathy.Philadelphia：WB Saunders，686-697(1993))。

神经病症状和改变调查表(NSC)：该调查表由38个以正确或错误方式回答的项目组成。它评估神经病症状存在与否、其严重程度和随时间的变化。它在整个研究中对于每名患者将由同一神经病学家进行。自基线分数10％的改变将认为是显著的。

所述研究的主要结果测量是患者的改善。如果患者对于以上列出的4个参数中的2个显示出明显的改善，而对于任何其它的测量没有下降，则将他/她归入为改善。基于这种响应分类，以二项式计算为基础为响应率计算了精确的95％置信区间。对于14名患者，如果正确的反应率在30-70％之间，则该区间的宽度将小于约50％，如果所述速率在70-90％或10-30％之间，则为约40％，如果所述速率＞90％或＜10％，则为约30％。

将使用精确的二项式区间对患者中每个参数都具有成功结果的部分计算点估计值和95％置信区间。对于每个连续或计序测量，将通过Hodges-Lehmann统计学和Tukey区间(参见Hollender和Wolfe，Nonparametric Statistical Methods，第二版，Wiley，New York，1999，p51-56)对自基线的改变计算精确的95％置信区间。计算将使用STATEXACT^TM(Cytel)统计软件包完成。

神经病损伤评分测试将提供神经病性缺陷的单一分数和与颅神经机能、肌肉虚弱无力、反射、和感觉有关的子集分数。在与年龄和性别相关患者比较时，将考虑身高、体重和体格健康状况由检查人对所述缺陷评分。如果正常则肌肉虚弱无力记分为0，如果25％虚弱无力则为1，如果50％虚弱无力则为2，如果75％虚弱无力则为3，如果肌肉相对重力移动则为3.25，如果重力消除时有运动则为3.5，当不运动时有颤动则为3.75，如果有完全麻痹则为4。这将应用到颅神经III、VI、VII、X和XII。测试其力量的个别肌肉组包括呼吸、颈弯曲、肩外展、肘弯曲、肱桡肌(brachial radialis)、肘伸展、腕屈伸、手指弯曲和张开、拇指外展、臀部屈伸运动、膝盖屈伸运动、踝背屈、踝跖面弯屈趾伸肌和屈肌，共计24个项目。每个组将在右侧和左侧测试。

反射记分为0＝正常，1＝降低，2＝缺失。将在每一侧检查纤维腱反射，包括二头肌、三头肌、肱桡肌(brachial radialis)、四头肌、和小腿三头肌。对于60岁或更年长的患者，踝反射降低将评分为0，缺失将评分为1。

将在手指和拇趾背上进行感觉检查。将通过使用长棉絮测量触压。将借助直针评估针刺。用165Hz音叉测试振动感觉，将通过活动食指和拇趾的末端指/趾骨来测试关节位置。将对每个极端进行所述检查，评分将为0＝正常，1＝降低，以及2＝缺失。

预期rituximab或人源化2H7相对于对照(无此抗体)将显示出上文定义的患者改善，并因此治疗多发性单神经炎。

Claims (21)

1.治疗哺乳动物中的多软骨炎或多发性单神经炎的方法，包括对所述哺乳动物施用有效量的结合CD20的抗体。

2.权利要求1的方法，其中所述抗体未与另一种分子偶联。

3.权利要求1的方法，其中所述抗体已与另一种分子偶联。

4.权利要求3的方法，其中所述其它分子是胞毒剂。

5.权利要求4的方法，其中所述胞毒剂是放射性化合物。

6.权利要求4或5的方法，其中所述胞毒剂包括Y2B8或¹³¹I-B1。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述抗体包括rituximab。

8.权利要求1-6任一项的方法，其中所述抗体包括人源化2H7。

9.权利要求1-8任一项的方法，其包括对所述哺乳动物施用约20mg/m²至约250mg/m²剂量的所述抗体。

10.权利要求9的方法，其中所述剂量为约50mg/m²至约200mg/m²。

11.权利要求1-10任一项的方法，其包括施用初始剂量的所述抗体，然后施用后续剂量，其中后续剂量中抗体的mg/m²剂量大于初始剂量中抗体的mg/m²剂量。

12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述哺乳动物为人。

13.权利要求1-12任一项的方法，其中静脉内施用所述抗体。

14.权利要求1-12任一项的方法，其中皮下施用所述抗体。

15.权利要求1-14任一项的方法，其进一步包括对所述哺乳动物施用有效量的免疫抑制剂、止痛剂、或化疗剂。

16.权利要求1-15任一项的方法，其中治疗多软骨炎。

17.权利要求16的方法，其进一步包括对所述哺乳动物施用有效量的非类固醇抗炎药、类固醇、甲氨蝶呤、环磷酰胺、氨苯砜、硫唑嘌呤、青霉胺、或环孢霉素。

18.权利要求1-15任一项的方法，其中治疗多发性单神经炎。

19.权利要求18的方法，其进一步包括对所述哺乳动物施用有效量的止痛剂、类固醇、甲氨蝶呤、环磷酰胺、血浆交换、静脉内免疫球蛋白、环孢霉素、或霉酚酸酯。

20.一种制品，其包括容器和装在容器中的组合物，其中所述组合物包含结合CD20的抗体，且还包括指导用户使用所述组合物以治疗哺乳动物中的多软骨炎或多发性单神经炎的包装插页。

21.权利要求20的制品，其还包括装有除所述抗体以外用于治疗的药剂的容器，还包括有关用该药剂治疗哺乳动物的说明书。

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