KR20150016622A - 클라도스포리움 펩티드 - Google Patents

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파스칼 히키
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Abstract

클라도스포리움 및/또는 알터나리아 속의 곰팡이에 대한 알레르기를 예방 또는 치료하기 위해 이용될 수 있고, 30개 이하의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고 하기를 포함하는 폴리펩티드: (a) GGYKAAVRPTMLE (서열번호 35; Cla35), (b) AE V YQKLK SLTKK (서열번호 31; Clal6), (c) VAITYASRAQGAE (서열번호 32; Cla25), (d) GHHFKERGTGSLVIT (서열번호 33; Cla26), 또는 (e) ANYTQTKTVSIRL (서열번호 34; Cla29); 또는 (Ⅱ) 6개 이하의 아미노산 변형을 갖는 상기 아미노산 서열 (I)로서, 각 변형은 독립적으로 결실, 치환 또는 삽입인 것인, T 세포 에피토프-포함 변이체 서열.

Description

클라도스포리움 펩티드{Cladosporium peptides}
본 발명은 클라도스포리움(Cladosporium) 및/또는 알터나리아(Alternaria) 속의 곰팡이에 대한 알레르기를 예방 또는 치료하기 위해 이용될 수 있는 폴리펩티드 및 약제학적 제제에 관한 것이다.
곰팡이 알레르겐은 인간 및 동물에서 천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염 및 알레르기성 피부염을 포함하는, 알레르기성 질환의 주요 원인으로 인식된다. 추운 기후에서, 곰팡이는 늦겨울부터 실외 공기에서 발견될 수 있고, 늦여름 내지 초가을 달(7월 내지 10월)에 절정을 이룬다. 따뜻한 기후에서, 곰팡이 포자는 일년 내내 발견될 수 있고, 늦여름 내지 초가을 달에 가장 높은 수준으로 발견될 수 있다. 실내 곰팡이는 일 년 내내 존재할 수 있고, 집 안의 수분 수준에 의존하나, 실내 곰팡이 수준은 실외 곰팡이 수준이 높을 때 더 높다. 따라서, 실내 곰팡이의 일반적인 공급원은, 실내 곰팡이 오염으로부터도 유래될 수 있지만, 실외 환경으로부터 유래된다.
수천 가지 종류의 곰팡이가 존재한다; 그러나, 일반적으로 이들 중 소수만이 알레르기와 연관된다. 하기는 공기에서 수거된 곰팡이 포자의 유형에 기반한 알레르기성 질환의 가장 유력한 원인이다: 알터나리아(Alternaria), 클라도스포리움(Cladosporium), 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리움(Penicillium), 헬민쏘스포룸(Helminthosporum), 에피코쿰(Epicoccum), 푸사리움(Fusarium), 오레오바시디움(Aureobasidium), 포마(Phoma), 리조퍼스(Rhizopus), 무코르(Mucor), 스무트(Smut) 및 효모. 알터나리아 속, 특히 알터나리아 알터나타(Alternaria Alternata), 및 클라도스포리움 속의 곰팡이는 가장 중요한 알레르기 유발성 균류(allergenic fungi)에 속하는 것으로 여겨진다.
클라도스포리움은 공기로 운반되는 가장 일반적인 실외 곰팡이다. 알터나리아는 아이들에 영향을 미치는 주요 알레르겐 중 하나이다. 온난한 기후에서, 공기로 운반되는 알터나리아 포자는 연중 대부분 검출되고 (통상적으로 북반구에서 5월 내지 11월), 늦여름 및 가을에 절정을 이룬다. 알터나리아 포자의 확산은 건기 동안 발생한다. 이는 더 높은 바람 속도 및 낮은 상대습도를 특징으로 하고, 맑은 오후 시기 동안 최대 확산을 초래한다.
실외 곰팡이인 것으로 고려되더라도, 알터나리아는 충분한 수분 및 적합한 성장 기판이 제공되는 어느 곳에서나 자랄 것이다. 따라서, 알터나리아는 일반적으로 실내, 특히 지하실, 부엌 또는 욕실과 같은 습한 지역에서 발견된다. 알터나리아는 일반적으로 냉장고 드립 트레이, 에어컨, 쓰레기 용기(waste container), 매트리스, 폼 고무 베개(foam rubber pillow)에서, 또는 창문 위 결로(condensation)에서도 발견된다. 그것은 북아메리카 및 유럽의 집 먼지에서 발견되는 가장 흔한 곰팡이 포자 중 하나이다. 알터나리아 알레르겐을 피하는 것은 실질적으로 불가능하다.
발명의 요약
본 발명은, 30개 이하의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고 하기를 포함하는, 클라도스포리움(Cladosporium) 및/또는 알터나리아(Alternaria)에 대한 알레르기를 치료 또는 예방하는데 이용하기에 적합한 폴리펩티드, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
(I) 아미노산 서열:
(a) GGYKAAVRPTMLE (서열번호 35; Cla35),
(b) AEVYQKLKSLTKK (서열번호 31; Cla16),
(c) VAITYASRAQGAE (서열번호 32; Cla25),
(d) GHHFKERGTGSLVIT (서열번호 33; Cla26), 또는
(e) ANYTQTKTVSIRL (서열번호 34; Cla29); 또는
(Ⅱ) 6개 이하의 아미노산 변형을 갖는 상기 아미노산 서열 (I)로서, 각 변형은 독립적으로 결실, 치환 또는 삽입인 것인, T 세포 에피토프-포함 변이체(variant) 서열.
본 발명은 또한, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 및 본 발명의 폴리펩티드, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약제학적 제제를 제공한다.
본 발명은 추가로, 클라도스포리움 및/또는 알터나리아에 대한 알레르기를 치료 또는 예방하는 방법에서 이용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드, 염 또는 약제학적 제제를 제공한다.
본 발명은 또한, 클라도스포리움 및/또는 알터나리아에 대한 알레르기에 대해 개체를 치료하는 방법 또는, 개체에서 클라도스포리움 및/또는 알터나리아에 대한 알레르기를 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 개체에게 치료적 또는 예방적 유효량의 본 발명의 폴리펩티드, 염 또는 약제학적 제제를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 클라도스포리움 및/또는 알터나리아에 대한 알레르기의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한, 본 발명의 폴리펩티드 또는 염의 용도를 제공한다.
본 발명은 추가로, T 세포가 본 발명의 폴리펩티드 또는 염을 인식하는지 여부를 결정하는 인 비트로 방법으로서, 상기 방법은 상기 T 세포를 상기 폴리펩티드 또는 염과 접촉시키는 단계 및 상기 T 세포가 상기 폴리펩티드 또는 염에 의해 자극되는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 명세서에 기술된 하나 이상의 폴리펩티드 또는 염을 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 혼합하는 단계를 포함하는, 본 발명의 약제학적 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
서열의 기술
서열번호 1 내지 57은 실시예 1 내지 7에 기재된 아미노산 서열을 제공한다. 보다 상세하게는:
서열번호 1 내지 9 및 31은 단백질 Cla h6으로부터 유래된 아미노산 서열에 대응한다.
서열번호 37은 단백질 Cla h7로부터 유래된 아미노산 서열에 대응한다.
서열번호 10 내지 20, 30, 32, 33 및 51은 단백질 Cla h8로부터 유래된 아미노산 서열에 대응한다.
서열번호 21 내지 29 및 34는 단백질 Cla h10으로부터 유래된 아미노산 서열에 대응한다.
서열번호 35, 36 및 53은 단백질 Cla c9로부터 유래된 아미노산 서열에 대응한다.
서열번호 38 내지 42 및 52는 단백질 Alt a6으로부터 유래된 아미노산 서열에 대응한다.
서열번호 43 내지 49 및 54는 단백질 Alt a8로부터 유래된 아미노산 서열에 대응한다.
서열번호 50은 단백질 Alt a10으로부터 유래된 아미노산 서열에 대응한다.
서열번호 55 내지 57은 실시예 6에서 이용된 대조군 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대응한다.
상기 언급된 단백질에 대한 NCBI 또는 Uniprot accession number가 실시예 1 내지 7에서 제공된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 클라도스포리움 및/또는 알터나리아에 대한 알레르기를 예방 또는 치료하는 것에 관한 것이고, 이 용도에 적합한 폴리펩티드, 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다. 상기 폴리펩티드 또는 염은 약제학적 제제로 제공될 수 있다.
아미노산 서열 및 변이체 아미노산 서열
본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 31 내지 35 중 어느 하나에서 표시된 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 서열로 이루어지거나, 또는 상기 서열로 필수적으로 이루어질 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드는, 6개 이하의 아미노산 변형을 갖는 서열번호 31 내지 35 중 어느 하나에서 표시된 아미노산 서열로서, 각 변형은 독립적으로 결실, 치환 또는 삽입인 것인, T 세포 에피토프-포함 변이체 서열을 포함하거나, 상기 변이체 서열로 이루어지거나, 또는 상기 변이체 서열로 필수적으로 이루어질 수 있다.
변이체 서열에서의 변형은 대응하는 원(original) 아미노산 서열에 존재하는 T 세포 에피토프의 기능적 특성을 변경시키지 않는 것이 바람직하다. T 세포 에피토프의 기능적 특성은 아래에서 더 논의된다.
바람직한 변이체 서열에서, 대응하는 원 아미노산 서열 중 충분한 연속된(contiguous) 아미노산이 T 세포 에피토프를 포함하도록 유지된다. 통상적으로, 그와 같은 변이체 서열은 원 아미노산 서열 중 8개 이상, 바람직하게는 9개 이상의 연속된 아미노산을 유지한다. 변이체 서열은 원 아미노산 서열 중 8 내지 12개의 아미노산 또는 9 내지 12개의 아미노산을 유지할 수 있다.
변이체 서열은 6개 미만의 아미노산 변형을 가질 수 있다. 예를 들면, 상기 변이체 서열은 5개 이하의 아미노산 변형, 바람직하게는 4개 이하의 상기 아미노산 변형, 보다 바람직하게는 3개 이하의 아미노산 변형, 및 가장 바람직하게는 1 또는 2개의 아미노산 변형만을 가질 수 있다. 모든 상기 변형은 독립적으로 결실, 치환 또는 삽입이다.
특히 바람직한 구체예에서, 상기 변이체 서열은 1 또는 2개의 아미노산 변형을 갖고, 그 또는 각 변형은 독립적으로 결실 또는 치환이다.
결실(deletion)
T 세포 에피토프-포함 변이체 서열이 결실인 아미노산 변형을 가질 경우, 결실된 아미노산은 바람직하게는 대응하는 원 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단으로부터 제거된다. 즉, 상기 변이체 서열은 원 서열의 N- 및/또는 C-말단으로부터 1개 이상의 연속된 아미노산을 제거하는 것에 의해 형성되는 원 아미노산 서열의 절단(truncation)이다. 선택적으로 그와 같은 변이체 서열은 기타 결실 또는 기타 변형을 갖지 않을 수 있다.
결실된 아미노산은 덜 바람직하게는, 대응하는 원 아미노산 서열의 내부 위치로부터 제거될 수 있다. 내부 위치로부터의 제거는, 결실된 아미노산 그 자체가 원 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에 존재하지 않고, 원 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단을 포함하는 연속된 아미노산 서열의 부분으로서 제거되지 않는다는 것을 의미한다. 즉, 내부 위치로부터의 결실되는 것이 고려될 경우, 상기 결실은 원 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단으로부터의 결실과 독립적으로 일어나야 한다.
예를 들면, 원 서열 ABCDEFGH가 주어진 경우, 2개 아미노산의 내부 결실을 갖는 예시 변이체 서열은 ADEFGH일 수 있으며, B 및 C는 내부 위치로부터 제거되고 원 말단 잔기 A 및 H는 유지된다. 대조적으로, 동일한 원 서열의 N-말단으로부터 2개의 연속된 아미노산의 결실은, A 및 B가 제거되고 C가 이제 N-말단에 존재하는 변이체 서열 CDEFGH을 가져올 것이다. 이 경우 B의 결실은, B가 원 서열의 N-말단을 포함하는 2개의 연속된 아미노산 중 하나로 제거되므로 내부 위치로부터의 제거가 아니다.
변이체 서열에서 1개를 초과하는 결실이 일어날 경우, 결실된 아미노산은 N-말단 및/또는 C-말단 및/또는 내부 위치의 임의의 조합으로부터 제거될 수 있다. 바람직한 변이체 서열은 내부 위치로부터 1개를 초과하지 않는 결실을 갖는다. 특히 바람직한 변이체 서열에서, 내부 위치로부터의 결실은 존재하지 않고, 결실된 아미노산은 원 서열의 N- 및/또는 C-말단의 임의의 조합으로부터 제거된다. 즉, 결실된 아미노산은 모두 원 서열의 N-말단으로부터 제거되거나, 모두 원 서열의 C-말단으로부터 제거되거나, 또는 일부 아미노산이 원 서열의 각 말단으로부터 제거될 수 있다.
따라서, 일 구체예에서, 변이체 서열은 상기 서열번호 31 내지 35의 서열의 N-말단으로부터 제거된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산을 갖는 서열번호 31 내지 35 중 어느 하나의 아미노산 서열이다.
다른 구체예에서, 변이체 서열은 상기 서열번호 31 내지 35의 서열의 C-말단으로부터 제거된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산을 갖는 서열번호 31 내지 35 중 어느 하나의 아미노산 서열이다.
다른 구체예에서, 변이체 아미노산 서열이 총 6개를 초과하지 않는 변형을 갖는다면, 변이체 아미노산 서열은 상기 서열의 N- 및 C-말단으로부터 제거된 수 개의 아미노산을 갖는 서열번호 31 내지 35 중 어느 하나의 아미노산 서열이다. 그와 같은 변이체 서열의 바람직한 구체예는 상기 서열번호 31 내지 35의 서열의 N- 및/또는 C-말단으로부터 제거된 1, 2 또는 3개의 아미노산을 갖고, 선택적으로 기타 변형을 갖지 않는 서열번호 31 내지 35 중 어느 하나의 아미노산 서열이다.
하나 이상의 결실을 갖는 변이체 아미노산 서열의 특정한 예는 하기를 포함한다:
- N-말단으로부터 제거된 3개 아미노산 및 C 말단으로부터 제거된 1개의 아미노산을 갖는 AEVYQKLKSLTKK (서열번호 31)의 아미노산 서열인 변이체 서열 YQKLKSLTK (서열번호 6);
- N-말단 및 C-말단으로부터 제거된 2개의 아미노산을 갖는 VAITYASRAQGAE (서열번호 32)의 아미노산 서열인 변이체 서열 ITYASRAQG (서열번호 13);
- N-말단으로부터 제거된 5개 아미노산 및 C 말단으로부터 제거된 1개 아미노산을 갖는 GHHFKERGTGSLVIT (서열번호 33)의 아미노산 서열인 변이체 서열 ERGTGSLVI (서열번호 14); 및
- N-말단으로부터 제거된 2개 아미노산 및 C 말단으로부터 제거된 2개 아미노산을 갖는 ANYTQTKTVSIRL (서열번호 34)의 아미노산 서열인 변이체 서열 YTQTKTVSI (서열번호 29).
치환
T 세포 에피토프-포함 변이체 서열이 치환인 아미노산 변형을 갖는 경우, 그 치환은 원 아미노산 서열 중 임의의 위치에서 발생할 수 있다. 상기 치환은 프롤린 또는 시스테인을 도입하지 않는 것이 바람직하다. 또한, 상기 치환은 보존적 치환인 것이 바람직하다.
보존적 치환은, 아미노산이 유사한 특성을 갖는 대체 아미노산으로 치환될 수 있다는 것을 의미한다. 하기는 완전하지 않은 예시의 목록이다:
염기성 곁사슬을 갖는 아미노산, 예를 들면, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘은 각각 상호 간에 독립적으로 치환될 수 있다.
산성 곁사슬을 갖는 아미노산, 예를 들면, 아스파테이트 및 글루타메이트는 각각 상호 간에, 또는 그의 아미드 유도체인 아스파라긴 및 글루타민에 대해 각각 독립적으로 치환될 수 있다. 또한 바람직하게는, 글루타메이트 또는 글루타민은 파이로글루타메이트(pyroglutamate)에 의해 대체될 수 있다. 글루타메이트 또는 글루타민이 치환된 파이로글루타메이트를 갖는 변이체 서열은, 상기 파이로글루타메이트가 그 변이체 서열을 포함하거나, 그 변이체 서열로 이루어지거나, 또는 필수적으로 그 변이체 서열로 이루어지는 본 발명의 폴리펩티드의 N-말단에 대응할 경우 특히 바람직하다. 통상적으로, N-말단에 파이로글루타메이트를 갖는 폴리펩티드는 제조시 개선된 안정성을 갖는다.
지방족 곁사슬을 갖는 아미노산, 예를 들면, 글리신, 알라닌, 발린, 루신 및 이소루신은 각각 상호 간에 독립적으로 치환될 수 있다. 이 범주에서 특히 바람직한 치환은 보다 작은 지방족 곁사슬을 갖는 아미노산, 즉 글리신, 알라닌, 발린으로 한정되고, 바람직하게는 각각 상호 간에 독립적으로 대체될 수 있다.
기타 바람직한 치환은 메티오닌의 노르루신(norleucine: Nle)에 의한 치환을 포함한다.
추가적으로, 보다 일반적인 측면에서, 중성 아미노산은 또 다른 중성 아미노산으로 치환될 수 있고, 전하를 띤 아미노산은 또 다른 전하를 띤 아미노산으로 치환될 수 있으며, 친수성 아미노산은 또 다른 친수성 아미노산으로 치환될 수 있고, 소수성 아미노산은 또 다른 소수성 아미노산으로 치환될 수 있고, 극성 아미노산은 또 다른 극성 아미노산으로 치환될 수 있으며, 방향족 아미노산은 또 다른 방향족 아미노산으로 치환될 수 있다. 적합한 치환체(substituent)를 선택하는데 이용될 수 있는 20개의 주요 아미노산의 일부 특징은 하기와 같다:
Figure pct00001
하나 이상의 치환을 갖는 변이체 아미노산 서열의 특정한 예는 하기를 포함한다:
- 변이체 서열 AEVYQKLKALAKK (서열번호 52)는 2개의 치환을 갖는 AEVYQKLKSLTKK (서열번호 31)의 아미노산 서열이다. 서열번호 31 중 위치 9에 있는 아미노산 S는 A로 치환되고, 서열번호 31 중 위치 11에 있는 아미노산 T는 A로 치환된다. 서열번호 31의 기타 바람직한 변이체 서열은 위치 9 및 11에서 대체의, 바람직하게는 유사한 치환을 갖는 서열을 포함한다. 예를 들면, A로 치환되는 대신, 위치 9 및 11의 S 및 T 아미노산은 독립적으로 G 또는 V로 대체될 수 있다.
- 변이체 서열 LAITYNSRAEGAE (서열번호 54)는 3개의 치환을 갖는 VAITYASRAQGAE (서열번호 32)의 아미노산 서열이다. 서열번호 32 중 위치 1에 있는 아미노산 V는 L로 치환되고, 서열번호 32 중 위치 6에 있는 아미노산 A는 N으로 치환되며, 서열번호 32 중 위치 10에 있는 아미노산 Q는 E로 치환된다. 서열번호 32의 기타 바람직한 변이체 서열은 위치 1, 6, 및 10에서 대체의, 바람직하게는 유사한 치환을 갖는 서열을 포함한다. 예를 들면, L을 V로 치환하는 대신, 위치 1의 아미노산은 G 또는 A로 대체될 수 있고; A를 N으로 치환하는 대신, 위치 6의 아미노산은 Q, E 또는 D로 대체될 수 있으며; Q를 E으로 치환하는 대신, 위치 10의 아미노산은 N 또는 D로 대체될 수 있다;
- 변이체 서열 GLHFRERKTGSLVIT (서열번호 44)는 3개의 치환을 갖는 GHHFKERGTGSLVIT (서열번호 33)의 아미노산 서열이다. 서열번호 33 중 위치 2에 있는 아미노산 H는 L로 치환되고, 서열번호 33 중 위치 5에 있는 아미노산 K는 R로 치환되며, 서열번호 33 중 위치 8에 있는 아미노산 G는 K로 치환된다. 서열번호 33의 기타 바람직한 변이체 서열은 위치 2, 5, 및 8에서 대체의, 바람직하게는 유사한 치환을 갖는 서열을 포함한다. 예를 들면, H를 L로 치환하는 대신, 위치 1의 아미노산은 V, G 또는 A로 대체될 수 있고; K를 R로 치환하는 대신, 위치 6의 아미노산은 H로 대체될 수 있으며; G를 K로 치환하는 대신, 위치 10의 아미노산은 H 또는 R로 대체될 수 있다; 및
- 변이체 서열 GGYKAAVRPT-Nle-LE (서열번호 36)는 1개의 치환을 갖는 GGYKAAVRPTMLE (서열번호 35)의 아미노산 서열이다. 서열번호 35 중 위치 11에 있는 아미노산 M은 노르루신으로 치환된다.
삽입
변이체 서열이 삽입인 아미노산 변형을 가질 경우, 첨가된 아미노산은 원 아미노산 서열 중 임의의 위치에 삽입될 수 있다. 삽입은 프롤린 또는 시스테인을 도입하지 않는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 아미노산은 원 서열의 N-말단 및/또는 C-말단에 삽입될 수 있다. 즉, 변이체 서열은 원 서열의 N- 및/또는 C-말단에 아미노산을 첨가하는 것에 의해 형성되는 원 아미노산 서열의 연장이다. 그와 같은 변이체 서열은 선택적으로 기타 삽입 또는 기타 변형을 갖지 않을 수 있다.
덜 바람직하게는, 아미노산은 내부 위치에 삽입될 수 있다. 내부 위치에의 삽입은, 아미노산이 원 서열의 N-말단에 있는 아미노산에 대해 C-말단인 임의의 위치에서 삽입되거나, 또는 아미노산이 원 서열의 C-말단에 있는 아미노산에 대해 N-말단인 임의의 위치에서 삽입되는 것을 의미한다.
1개를 초과하는 삽입이 변이체 서열 내에 일어나는 경우, 첨가되는 아미노산은 N-말단 및/또는 C-말단 및/또는 내부 위치의 임의의 조합에 삽입될 수 있다. 바람직한 변이체 서열은 내부 위치에 1개를 초과하지 않는 삽입을 갖는다. 특히 바람직한 변이체 서열에서, 내부 위치에는 삽입이 존재하지 않고, 첨가되는 아미노산은 원 서열의 N- 및/또는 C-말단의 임의의 조합에 삽입된다. 즉, 첨가되는 아미노산은 모두 원 서열의 N-말단에 삽입되거나, 모두 원 서열의 C-말단에 삽입되거나, 또는 일부 아미노산은 원 서열의 양 말단에 삽입될 수 있다. 즉, 첨가되는 아미노산은 N- 및/또는 C-말단에서 원 서열을 연장하는 것으로 고려될 수 있다.
따라서, 일 구체예에서, 변이체 서열은 상기 서열번호 31 내지 35의 서열의 N-말단에 삽입된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산을 갖는 서열번호 31 내지 35 중 어느 하나의 아미노산 서열이다.
다른 구체예에서, 변이체 서열은 상기 서열번호 31 내지 35의 서열의 C-말단에 삽입된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산을 갖는 서열번호 31 내지 35 중 어느 하나의 아미노산 서열이다.
다른 구체예에서, 변이체 서열이 총 6개를 초과하지 않는 변형을 갖는다면, 상기 서열은 상기 서열번호 31 내지 35의 서열의 N- 및 C-말단 모두에 삽입되는 수 개의 아미노산을 갖는 서열번호 31 내지 35 중 어느 하나의 아미노산 서열이다. 그와 같은 변이체 서열의 바람직한 구체예는 상기 서열번호 31 내지 35의 서열의 N- 및/또는 C-말단에 삽입되는 1, 2 또는 3개의 아미노산을 갖고, 선택적으로 기타 변형을 갖지 않는, 서열번호 31 내지 35 중 어느 하나의 아미노산 서열이다.
N- 및/또는 C- 말단에 삽입되는 전하를 띤 아미노산을 갖는 변이체 서열은, 변이체 서열을 포함하거나, 변이체 서열로 이루어지거나 또는 변이체 서열로 필수적으로 이루어지는 본 발명의 폴리펩티드의 N- 및/또는 C- 말단에 상기 전하를 띤 아미노산이 대응할 경우 특히 바람직하다. 폴리펩티드의 N- 및/또는 C- 말단에 있는 전하를 띤 잔기는 폴리펩티드의 용해도를 개선시킬 수 있다. 바람직한 전하를 띤 아미노산은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘을 포함한다. 라이신이 특히 바람직하다. 따라서, 특히 바람직한 변이체 서열은 상기 서열번호 31 내지 35의 서열의 N- 및/또는 C-말단에 삽입된, 하나 이상의 전하를 띤 아미노산, 바람직하게는 하나 이상의 라이신 잔기를 갖는 서열번호 31 내지 35 중 어느 하나의 아미노산 서열이다.
하나 이상의 삽입을 갖는 변이체 아미노산 서열의 특정한 예는:
- C-말단에 삽입된 라이신을 갖는 VAITYASRAQGAE (서열번호 32)의 아미노산 서열인 변이체 서열 VAITYASRAQGAEK (서열번호 30)이다.
일부 변이체 서열에서 치환 및 삽입이 존재할 수 있다. 예를 들면:
- LAITYNSRAEGAEK (서열번호 43)의 변이체 서열은 서열번호 54에 대해 전술된 바와 같은 3개의 치환 및 추가로 C-말단에 삽입된 라이신을 갖는 서열번호 32의 서열이다. 서열번호 43에 기초한 기타 변이체 서열은 대체의, 바람직하게는 서열번호 54에 대해 전술된 바와 같은 유사한 치환, 및 C-말단에 삽입된 라이신을 가질 수 있다.
폴리펩티드
본 발명의 폴리펩티드는 30개 이하의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고 상기 정의된 아미노산 서열 또는 변이체 서열을 포함하거나, 상기 아미노산 서열 또는 변이체 서열로 이루어지거나, 또는 상기 아미노산 서열 또는 변이체 서열로 필수적으로 이루어진다.
상기 폴리펩티드는 바람직하게는, 25개 이하의 아미노산으로 이루어진 길이, 보다 바람직하게는, 20개 이하의 아미노산으로 이루어진 길이 또는 17개 이하의 아미노산으로 이루어진 길이, 및 가장 바람직하게는 15개 이하의 아미노산으로 이루어진 길이를 가질 수 있다. 다르게 말하자면, 이 폴리펩티드는 최대 30개, 25개, 20개, 17개 또는 15개의 아미노산으로 이루어진 길이를 가질 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는, 8개 이상의 아미노산으로 이루어진 길이, 보다 바람직하게는 9개 이상의 아미노산으로 이루어진 길이, 가장 바람직하게는 12개 이상의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다. 다르게 말하자면, 이 폴리펩티드는 최소 8개, 9개, 또는 12개의 아미노산으로 이루어진 길이를 가질 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 상기 최소 및 상기 최대 길이의 임의의 조합에 의해 정의된 길이를 가질 수 있다. 예를 들면, 이 폴리펩티드는 8 내지 30개, 8 내지 25개, 8 내지 20개, 8 내지 17개 또는 8 내지 15개의 아미노산으로 이루어진 길이를 가질 수 있다. 이 폴리펩티드는 9 내지 30개, 9 내지 25개, 9 내지 20개, 9 내지 17개 또는 9 내지 15개의 아미노산으로 이루어진 길이를 가질 수 있다. 이 폴리펩티드는 12 내지 30개, 12 내지 25개, 12 내지 20개, 12 내지 17개 또는 12 내지 15개의 아미노산으로 이루어진 길이를 가질 수 있다. 바람직한 폴리펩티드는 9 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 길이, 보다 바람직하게는 9 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다. 특히 바람직한 폴리펩티드는 12 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다.
본 발명의 폴리펩티드는 상기 정의된 아미노산 서열 또는 변이체 서열을 포함할 수 있다. 그러므로, 상기 폴리펩티드는 상기 아미노산 서열 또는 변이체 서열에 의해 정의되지 않은 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 추가의 아미노산은 상기 아미노산 서열 또는 변이체 서열을 플랭킹하는(flanking) 것으로 기술될 수 있다. 즉, 추가의 아미노산 서열은 상기 아미노산 서열 또는 변이체 서열의 N-말단 및/또는 C-말단에 포함된다.
다르게 말하자면, 본 발명의 폴리펩티드는 수 개의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단 연장부(extension)를 갖는 상기 아미노산 서열 또는 변이체 서열로 이루어지는 서열을 가질 수 있다. N-말단 및/또는 C-말단 연장부의 최대 아미노산 개수는, 상기 정의된 바와 같은 폴리펩티드의 최대 길이에 의해 결정된다.
상기 아미노산 서열 또는 변이체 서열의 N-말단 연장부에서의 아미노산은 바람직하게는 그것이 유래한 단백질의 원형 서열 중 상기 아미노산 서열의 바로 N-말단에 있는 아미노산에 대응한다.
상기 아미노산 서열 또는 변이체 서열의 C-말단 연장부에서의 아미노산은 바람직하게는 그것이 유래한 단백질의 원형 서열 중 상기 아미노산 서열의 바로 C-말단에 있는 아미노산에 대응한다.
이 N-말단 및/또는 C-말단 연장부는 그것이 유래한 단백질의 서열 중 상기 아미노산 서열의 바로 N-말단 또는 C-말단에 있는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 연속된 아미노산에 각각 대응하는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산일 수 있다.
즉, 이 N-말단 및/또는 C-말단 연장부는 그것이 유래한 단백질의 원형 서열 중 상기 아미노산 서열의 바로 N-말단 또는 C-말단에 있는 1개 내지 10개의 연속된 아미노산에 각각 대응하는 1개 내지 10개의 아미노산을 갖는다.
바람직하게는, 이 N-말단 및/또는 C-말단 연장부는 상기 아미노의 바로 N-말단 또는 C-말단에 있는 1개 내지 6개의 연속된 아미노산에 각각 대응하는 1개 내지 6개의 아미노산을 갖는다.
보다 바람직하게는, 이 N-말단 및/또는 C-말단 연장부는 상기 아미노의 바로 N-말단 또는 C-말단에 있는 1개 내지 4개의 연속된 아미노산에 각각 대응하는 1개 내지 4개의 아미노산을 갖는다.
가장 바람직하게는, 이 N-말단 및/또는 C-말단 연장부는 상기 아미노산 서열의 바로 N-말단 또는 C-말단에 있는 1개 내지 2개의 연속된 아미노산에 각각 대응하는 1개 내지 2개의 아미노산을 갖는다.
아미노산 서열 또는 변이체 서열의 N-말단 및/또는 C-말단 연장부를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 특정한 예는 하기를 포함한다:
- AEVYQKLKSLTKK (서열번호 31)는 Cla h 6의 원형 서열 중 AEVYQKLKSLTKK의 바로 C-말단에 있는 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 연속된 아미노산, 즉, 아미노산 R, Y, G, Q 및 S에 대응하는 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 아미노산의 C-말단 연장부를 가질 수 있다. 예를 들면, 모두 5개인 상기 연속된 아미노산이 존재할 경우, 본 발명의 폴리펩티드는 AEVYQKLKSLTKKRYGQS (서열번호 1; C-말단 연장부에 밑줄 그어짐)의 아미노산 서열을 갖는다.
- AEVYQKLKALAKK (서열번호 52)는 Alt a 6의 원형 서열 중 AEVYQKLKALAKK의 바로 C-말단에 있는 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 연속된 아미노산, 즉, 아미노산 T, Y, G 및 Q에 대응하는 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 아미노산의 C-말단 연장부를 가질 수 있다. 예를 들면, 모두 4개인 상기 연속된 아미노산이 존재할 경우, 본 발명의 폴리펩티드는 AEVYQKLKALAKKTYGQ (서열번호 38: C-말단 연장부에 밑줄 그어짐)의 아미노산 서열을 갖는다.
- VAITYASRAQGAE (서열번호 32)는 Cla h 8의 원형 서열 중 VAITYASRAQGAE의 바로 N-말단에 있는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 7개의 연속된 아미노산, 즉, 아미노산 C, A, E, M, G, A 및 A에 대응하는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 7개의 아미노산의 N-말단 연장부를 가질 수 있다. 그것은 또한, Cla h 8의 원형 서열 중 VAITYASRAQGAE의 바로 C-말단에 있는 1개, 2개, 또는 3개의 연속된 아미노산, 즉, 아미노산 E, N 및 V에 대응하는 1개, 2개, 또는 3개의 아미노산의 C-말단 연장부를 가질 수 있다. 예를 들면, 모두 7개인 연속된 아미노산이 N-말단 연장부에 존재하고, 모두 3개인 연속된 아미노산이 C-말단 연장부에 존재할 경우, 본 발명의 폴리펩티드는 CAEMGAAVAITYASRAQGAEENV (서열번호 10; N 및 C-말단 연장부에 밑줄 그어짐)의 아미노산 서열을 갖는다.
- GHHFKERGTGSLVIT (서열번호 33)는 Cla h 8의 원형 서열 중 GHHFKERGTGSLVIT의 바로 C-말단에 있는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 연속된 아미노산, 즉, 아미노산 A, S, M, S, G, H, I, A, N 및 F에 대응하는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 아미노산의 C-말단 연장부를 가질 수 있다. 예를 들면, 모두 10개인 상기 연속된 아미노산이 존재할 경우, 본 발명의 폴리펩티드는 아미노산 GHHFKERGTGSLVITASMSGHIANF (서열번호 11, C-말단 연장부에 밑줄 그어짐)을 갖는다.
- ANYTQTKTVSIRL (서열번호 34)은 Cla h 10의 원형 서열 중 ANYTQTKTVSIRL의 바로 N-말단에 있는 1개의 아미노산, 즉, 아미노산 L에 대응하는 1개의 아미노산의 N-말단 연장부를 가질 수 있다. 그것은 또한, Cla h 10의 원형 서열 중 ANYTQTKTVSIRL의 바로 C-말단에 있는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 연속된 아미노산, 즉, 아미노산 G, D, A, L, F 및 G에 대응하는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 아미노산의 C-말단 연장부를 가질 수 있다. 예를 들면, 이 1개의 아미노산이 N-말단 연장부에 존재하고 모두 6개인 연속된 아미노산이 C-말단 연장부에 존재할 경우, 본 발명의 폴리펩티드는 LANYTQTKTVSIRLGDALFG (서열번호 27, N- 및 C-말단 연장부에 밑줄 그어짐)의 아미노산 서열을 갖는다.
- GGYKAAVRPTMLE (서열번호 35)는 Cla h 9의 원형 서열 중 GGYKAAVRPTMLE의 바로 N-말단에 있는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 연속된 아미노산, 즉, 아미노산 E, S, N, Y, S, A, I, V, E 및 K에 대응하는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 아미노산의 N-말단 연장부를 가질 수 있다. 그것은 또한, Cla h 9의 원형 서열 중 GGYKAAVRPTMLE의 바로 C-말단에 있는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 연속된 아미노산, 즉, 아미노산 E, I, E, S, E, A, K, V, A 및 S에 대응하는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 아미노산의 C-말단 연장부를 가질 수 있다. 예를 들면, 모두 10개인 연속된 아미노산이 N-말단 연장부에 존재하고 모두 10개인 연속된 아미노산이 C-말단 연장부에 존재할 경우, 본 발명의 폴리펩티드는 ESNYSAIVEKGGYKAAVRPTMLEEIESEAKVAS (서열번호 53, N- 및 C-말단 연장부에 밑줄 그어짐)의 아미노산 서열을 갖는다.
N-말단 및/또는 C-말단 연장부에서의 아미노산은 아미노산 서열 또는 변이체 서열이 유래한 단백질의 원형 서열의 아미노산에 정확하게 일치하지 않을 수 있다. N-말단 및/또는 C-말단 연장부는, 예를 들면 폴리펩티드의 안정성, 용해도 및 제조가능성(manufacturability)을 개선시키기 위하여, 변형된 상기 원형 서열로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 원형 서열의 메티오닌은 노르-루신으로 치환될 수 있고, 및/또는 하나 이상의 전하를 띤 잔기가 N-말단 연장부의 N-말단 및/또는 C-말단 연장부의 C-말단에 추가될 수 있다. 바람직하게는 양의 전하를 띤 잔기, 예를 들면, 아르기닌 및 라이신이 추가된다. 히스티딘, 글루타메이트 및 아스파테이트로부터 선택되는 아미노산이 추가될 수 있다.
대안적으로, N-말단 및/또는 C-말단 연장부에서의 아미노산은 아미노산 서열 또는 변이체 서열이 유래한 단백질의 원형 서열의 아미노산에 일치하지 않을 수 있다. 대신에 그것은, 바람직하게는 폴리펩티드의 안정성, 용해도 및 제조가능성을 개선시키기 위하여 선택되는 적합한 아미노산일 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 전하를 띤 잔기는 서열번호 31 내지 35 중 어느 것의 N 및/또는 C 말단에 추가될 수 있다. 바람직하게는, 양의 전하를 띤 잔기, 예를 들면, 아르기닌 및 라이신이 추가된다. 히스티딘, 글루타메이트 및 아스파테이트로부터 선택되는 아미노산이 추가될 수 있다.
본 명세서에 개시된 추가의 폴리펩티드는, 예를 들면, 서열번호 2 내지 5, 7 내지 9, 12, 15 내지 26, 28, 37, 39 내지 42 및 45 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 그로부터 유래된 변이체 서열을 포함하거나, 상기 서열로 이루어지거나, 또는 상기 서열로 필수적으로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 이 단락에서 언급된 변이체 서열은 서열번호 31 내지 35로부터 유래된 변이체 서열에 대하여 전술된 바와 동일한 방식으로 각각 대응하는 원 아미노산 서열로부터 유래된다.
T 세포 에피토프
본 발명의 폴리펩티드는 30개 이하의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 상기 정의된 아미노산 서열 또는 변이체 서열을 포함하거나, 상기 아미노산 서열 또는 변이체 서열로 이루어지거나, 또는 상기 아미노산 서열 또는 변이체 서열로 필수적으로 이루어진다. 상기 아미노산 서열 및 상기 변이체 서열은 각각 T 세포 에피토프를 포함한다. T 세포 에피토프는 바람직하게는 MHC 클래스 II-결합 T 세포 에피토프이다. 변이체 서열 내 변형은 대응하는 원 아미노산 서열에 존재하는 T 세포 에피토프의 기능적 특성을 변경하지 않는 것이 바람직하다.
바람직한 변이체 서열에서, 대응하는 원 아미노산 서열의 충분한 연속된 아미노산이 T 세포 에피토프를 포함하도록 유지된다. 통상적으로, 그와 같은 변이체 서열은 8개 이상, 바람직하게는 9개 이상의, 원 아미노산 서열의 연속된 아미노산 서열을 유지한다.
T 세포 에피토프의 존재는 바람직하게는 인 실리코에서 수행되는 분석에 의해, 예를 들면 실시예 1 내지 5에 기술된 생물정보학 소프트웨어를 이용하여 확인될 수 있다. 대안적으로, T 세포 에피토프의 존재는 그의 기능적 특성에 대한 직접 평가에 의해 확인될 수 있다. T 세포 에피토프의 특정한 기능적 특성은 MHC 분자, 바람직하게는 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 에피토프를 포함하는 폴리펩티드의 능력, 및/또는 바람직하게는 MHC 클래스 II 분자에 결합될 경우 T 세포를 활성화시키는 에피토프를 포함하는 폴리펩티드의 능력을 포함한다.
MHC 분자에 결합하는 폴리펩티드의 능력은 경쟁 분석(competition assay)과 같은 적합한 방법을 이용하여 평가될 수 있다. 바람직한 인 비트로 분석은 실시예 6에서 기술된다.
T 세포를 활성화시키는 폴리펩티드의 능력은 또한 임의의 적합한 방법을 이용하여 평가될 수 있다. 바람직한 방법은 증식 또는 사이토카인 방출과 같은, T 세포 활성화와 연관된 하나 이상의 파라미터의 측정을 포함한다. 이들 파라미터에 대한 바람직한 분석은 실시예 7에서 기술된다. 관련 사이토카인은 IFN-감마, IL-13 및 IL-10을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 폴리펩티드는 통상적으로 IFN-감마, IL-13 및 IL-10 중 1개, 2개, 또는 모두의 방출을 유도할 경우, T 세포를 활성화시킨 것으로 고려된다. 폴리펩티드는 바람직하게는 50 pg/ml을 초과하는 소정의 사이토카인(들)의 방출을 유도한다.
전술된 바와 같이, 변이체 서열 내 변형은 대응하는 원 아미노산 서열에 존재하는 T 세포 에피토프의 기능적 특성을 변경시키지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 변이체 아미노산 서열을 포함하거나, 변이체 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 변이체 아미노산 서열로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드는, 대응하는 원 아미노산 서열을 포함하거나, 원 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 원 아미노산 서열로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 MHC 클래스 II 결합 특성 및 실질적으로 동일한 T 세포 활성화 특성을 가져야 한다.
통상적으로, 두 폴리펩티드 모두 동일한 MHC 클래스 II 대립유전자 수퍼타입(allele supertype) 패밀리에 속하는 하나 이상의 MHC 클래스 II 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 경우, 폴리펩티드는 또 다른 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 MHC 클래스 II 결합 특징을 갖는다. MHC 클래스 II 대립유전자 수퍼타입 패밀리의 예는 HLA-DR1, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DR8, HLA-DR11, HLA-DR13, HLA-DR15 및 HLA-DR51을 포함한다. 가장 바람직하게는, 두 폴리펩티드 모두 동일한 MHC 클래스 II 분자, 즉, 동일한 대립유전자에 의해 코딩되는 MHC 클래스 II 분자에 특이적으로 결합할 것이다.
통상적으로, 두 폴리펩티드 모두 동일한 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포를 특이적으로 활성화시키는 경우, 폴리펩티드는 또 다른 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 T 세포 활성화 특성을 갖는다. 바람직하게는, 각 폴리펩티드에 의해 유도되는 활성화 수준에서 유의한 차이가 존재하지 않아야 한다. 활성화 수준은 전술된 바와 같이, 증식 및/또는 사이토카인 방출을 모니터링하는 것에 의해 평가될 수 있다.
변이체 서열을 포함하거나, 변이체 서열로 이루어지거나 또는 변이체 서열로 필수적으로 이루어지는 적합한 폴리펩티드는 경험적으로 도출되거나 알려진 기준에 따라 선택될 수 있다. 단일 폴리펩티드 내에, MHC 항원 결합 그루브(groove) 내의 결합에 기여하는 특정 잔기 및 T 세포 수용체의 초가변 영역(hypervariable region)과 상호작용하는 기타 잔기가 존재한다. (Allen et al (1987) Nature 327: 713-5). 유리하게는, 펩티드는 T-세포 증식 및 탈감작(desensitisation)의 유도에 알맞게 설계될 수 있다. Metzler 및 Wraith은, 폴리펩티드-MHC 친화도를 증가시키는 치환이 이루어진 폴리펩티드의 개선된 면역관용(tolerogenic) 능력을 입증하였다 (Metzler & Wraith(1993) Int Immunol: 1159-65). 변경된 폴리펩티드의 리간드가 복제된(cloned) T 세포에서 장기적이고 깊은(profound) 에너지를 초래할 수 있다는 것이 Sloan-Lancaster et al (1993) Nature 363: 156-9에 의해 입증되었다.
서열 동일성
본 발명의 T 세포 에피토프-포함 변이체 서열은 대응하는 원 아미노산 서열에 대한 그의 서열 동일성의 측면에서 대안적으로 기술될 수 있다. 예를 들면, 변이체 서열은 서열번호 31 내지 35 중 어느 하나의 아미노산 서열과 65% 이상의 동일성을 가질 수 있다. 보다 바람직하게는, 변이체 서열은 서열번호 31 내지 35 중 어느 하나의 아미노산 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 아미노산 동일성을 가질 수 있다.
서열 동일성은 통상적으로 원 아미노산 서열 중 수 개의 연속된 아미노산에 대해 평가된다. 예를 들면, 서열 동일성은 비교되는 펩티드의 크기에 따라, 원 아미노산 서열 중 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 이상의 연속된 아미노산에 대해 측정될 수 있다. 서열 동일성은 원 아미노산 서열 중 9개 이상의 연속된 아미노산에 대해 측정되는 것이 바람직하다. 서열 동일성은 대응하는 원 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 측정되는 것이 특히 바람직하다.
아미노산 서열과 관련하여, "서열 동일성(sequence identity)"은 하기의 파라미터를 갖고 ClustalW (Thompson et al., 1994, supra)를 이용하여 평가될 경우 표시된 값을 갖는 서열을 의미한다:
페어와이즈 정렬 파라미터(Pairwise alignment parameter) - 방법: 애큐레이트(accurate), 매트릭스(Matrix): PAM, 갭 오픈 페널티(Gap open penalty): 10.00, 갭 익스텐션 페널티(Gap extension penalty): 0.10; 다중 정렬 파라미터(Multiple alignment parameter) - 매트릭스: PAM, 갭 오픈 페널티: 10.00, 지연(delay)에 대한 % 동일성: 30, 페널라이즈 엔드 갭(Penalize end gap): on, 갭 새퍼레이션 디스턴스(Gap separation distance): 0, 네가티브 매트릭스(Negative matrix): no, 갭 익스텐션 페널티: 0.20, 잔기-특이적 갭 페널티: on, 친수성 갭 페널티: on, 친수성 잔기: G, P, S, N, D, Q, E, K, 및 R. 특정 잔기에서 서열 동일성은 단순하게 유도체화된(derivatized) 동일한 잔기를 포함하는 것으로 의도된다.
염
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드의 약제학적으로 허용가능한 염은 예를 들면, 클로라이드, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트, 설페이트 등과 같은 무기산 염; 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등과 같은 유기산의 염을 포함한다. 히드로클로라이드 염 또는 아세테이트 염이 바람직하다.
합성
본 발명의 폴리펩티드는 적합한 기법에 의해 제조될 수 있다. 고체-상 펩티드 합성(Solid-phase peptide synthesis: SPPS)은 바람직한 기법이다. 이것은 작은 고체 비드 상에 펩티드의 형성을 포함한다.
SPPS를 이용하여, 펩티드는 합성 중에 비드에 공유적으로 부착된 채 유지된다. 이 펩티드는 결합(coupling)-세척-탈보호-세척의 반복 사이클을 이용하여 합성된다. 특히, 고체-상 부착 펩티드의 유리 N-말단 아민은 단일 N-보호(N-protected) 아미노산 단위에 결합된다. 그 후 이 단위는 탈보호되고, 추가의 보호 아미노산이 부착되는 새로운 N-말단 아민을 노출시킨다. 이 단계는 펩티드가 완성될 때까지 반복된다. 그 후 이 펩티드는 적합한 시약을 이용하여 비드로부터 절단된다.
SPPS를 위한 적합한 보호기, 시약, 용매 및 반응 조건은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고 그와 같은 조건은 통상의 최적화 과정에 의해 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.
폴리펩티드의 약제학적으로 허용가능한 염은 적합한 기법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 선택된 약제학적으로 허용가능한 염을 수득하기 위하여, 염화(salification)는 폴리펩티드 또는 그의 염의 적합한 시약, 일반적으로 산과의 반응을 포함한다.
예를 들면, 폴리펩티드의 염화수소염은 트리플루오로아세트산을 이용하여 고체 상으로부터 폴리펩티드를 처음에 절단하는 것에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 이 폴리펩티드는 처음에 트리플루오로아세테이트 염일 것이다. 그 후 이 트리플루오로아세테이트 염은 알려진 기법, 예를 들면 염산을 용리액(eluent)으로 이용하는 적합한 컬럼 상의 이온 교환에 의해 염화수소염으로 전환될 수 있다.
폴리펩티드 또는 폴리펩티드 염 산물은, 요구될 경우, 적합한 기법에 의해 정제될 수 있다. 예를 들면, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)가 이용될 수 있다.
용어 "폴리펩티드(polypeptide)"는 아미노산 잔기가 펩티드 (-CO-NH-) 결합에 의해 연결된(joined) 분자 뿐 아니라 펩티드 결합이 역전된(reversed) 분자도 포함한다. 그와 같은 레트로-인베르소(retro-inverso) 펩티도미메틱(peptidomimetic)은 예를 들면, Meziere et al (1997) J. Immunol.159, 3230-3237에 기술된 것과 같은 당업계에 알려진 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 이 접근법은 골격(backbone)을 포함하나, 곁사슬의 방향을 포함하지 않는 변화를 포함한 슈도폴리펩티드(pseudopolypeptide)를 제조하는 것을 포함한다. Meziere 등 (1997)은, 적어도 MHC 클래스 II 및 T 보조 세포 반응에 있어서, 이 슈도폴리펩티드가 유용하다는 것을 나타낸다. CO-NH 펩티드 결합 대신 NH-CO 결합을 포함하는 레트로-인버스(retro-inverse) 폴리펩티드는 단백질 분해(proteolysis)에 훨씬 더 큰 내성을 갖는다.
유사하게, 아미노산 잔기 중 탄소 원자 간 공간을 유지하는 적절한 링커 모이어티가 이용될 경우 이 펩티드 결합은 모두 생략될 수 있다; 이것은 링커 모이어티가 펩티드 결합과 실질적으로 동일한 전하 분포 및 실질적으로 동일한 평면성(planarity)을 갖는 경우 특히 바람직하다. 또한, 외부 단백질 가수분해적 분해(exoproteolytic digestion)에 대한 민감성을 감소시키는데 도움을 주기 위하여 이 펩티드가 그의 N- 또는 C-말단에서 알맞게(conveniently) 차단되는 것이 고려될 것이다. 예를 들면, 이 폴리펩티드의 N-말단 아미노기는 카르복실산과 반응함으로써 보호될 수 있고 이 펩티드의 C-말단 카르복실기는 아민과 반응함으로써 보호될 수 있다. 변형의 기타 예는 글리코실화 및 인산화를 포함한다. 또 다른 가능한 변형은 R 또는 K의 곁사슬 아민 상의 수소가 메틸렌 기(-NH2 → -NH(Me) 또는 -N(Me)2)로 대체될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 유사체는 인 비보에서 폴리펩티드의 반감기를 증가 또는 감소시키는 펩티드 변이체를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 이용되는 폴리펩티드의 반감기를 증가시킬 수 있는 유사체의 예는 펩티드의 펩토이드(peptoid) 유사체, 펩티드의 D-아미노산 유도체, 및 펩티드-펩토이드 하이브리드를 포함한다. 본 발명에 따라 이용되는 변이체 폴리펩티드의 추가의 구체예는 폴리펩티드의 D-아미노산 형태를 포함한다. L-아미노산 대신 D-아미노산을 이용한 폴리펩티드의 제조는 정상적인 대사 과정에 의해 그와 같은 제제의 원치 않는 분해(breakdown)을 크게 감소시켜, 투여될 필요 있는 제제의 양 및 그의 투여 빈도를 감소시킨다.
본 발명에 의해 제공되는 폴리펩티드는 모(parent) 단백질 사슬을 코딩하는 1차 전사체의 대체 스플라이싱에 의해 생성된 mRNA에 의해 코딩되는 모 단백질의 스플라이스 변이체로부터 유래될 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 모 알레르겐 단백질의 아미노산 돌연변이체, 글리코실화 변이체 및 기타 공유 유도체(covalent derivative)로부터 유래될 수 있다. 예시적인 유도체는, 본 발명의 폴리펩티드가 자연적으로 발생한 아미노산 이외의 모이어티에 의한 치환, 화학적, 효소적, 또는 기타 적절한 수단에 의해 공유적으로 변형된 분자를 포함한다. 또한, 모 단백질의 자연적으로 발생한 변이체 아미노산 서열이 포함된다. 그와 같은 변이체 아미노산 서열은 대립유전자 변이체(allelic variant)에 의해 코딩되거나 대체 스플라이싱 변이체를 대표할 수 있다.
전술된 변형은 펩티드의 합성 중에 또는 생성 후 변형에 의해, 또는 폴리펩티드가 부위-지향 돌연변이생성, 무작위 돌연변이생성, 또는 핵산의 효소 절단 및/또는 라이게이션(ligation)의 알려진 기법을 이용하여 재조합 형태로 존재할 경우 제조될 수 있다.
또한, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 물리화학적 특성을 개선시기 위해 변형될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 원 아미노산 서열이 그의 용해도를 개선시키기 위해 변경될 수 있고, 따라서 변이체 서열을 갖는 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 동등한 조건 하에서 대응하는 원 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드보다 더 높은 용해도를 가질 것이다. 폴리펩티드의 용해도를 평가하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
불량한 용해성 제제의 개체에의 투여는 바람직하지 않은, 비-내성의(non-tolerising) 염증 반응을 유발하므로, 개선된 용해도는 본 발명의 폴리펩티드가 유래한 알레르겐에 대한 개체의 내성(tolerisation)에 있어서 유리하다. 이 폴리펩티드의 용해도는 T-세포 에피토프를 포함하는 영역을 플랭킹하는 잔기를 변경함으로써 개선될 수 있다. 예를 들면, T 세포 에피토프를 플랭킹하는 폴리펩티드의 잔기의 N 및 C 말단, 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 글루타메이트 및 아스파테이트로부터 선택된 1개 이상의 아미노산이 추가될 수 있다. 기타 예에서:
i) T 세포 에피토프에 포함되지 않는, 이 폴리펩티드의 원형 서열의 N 또는 C 말단의 3개 이하의 아미노산에서 소수성 잔기가 결실되고; 및/또는
ii) T 세포 에피토프에 포함되지 않는, 이 폴리펩티드의 원형 서열의 N 또는 C 말단의 4개 이하의 아미노산에서 서열 Asp-Gly를 포함하는 2개의 연이은 아미노산이 결실되며; 및/또는
iii) 이 폴리펩티드의 원형 서열의 N 및/또는 C 말단에 하나 이상의 양전하를 띤 잔기가 추가된다.
선택적으로, 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩티드는 이량체 형성을 방지하도록 조작되어 시스테인 잔기가 세린 또는 2-아미노부티르산으로 대체될 수 있다.
폴리펩티드 조합
본 발명의 폴리펩티드, 또는 그의 염은 본 발명의 하나 이상의 추가의 폴리펩티드, 또는 그의 염과 조합으로 제공될 수 있다. 따라서, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 폴리펩티드 또는 그의 염이 조합으로 함께 제공될 수 있다. 예를 들면, 적합한 조합은 하기로부터 선택되는 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 상이한 폴리펩티드를 포함할 수 있다:
i) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는, 상기 서열로 이루어지는 또는 상기 서열로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그로부터 유래된 상기 변이체 서열, 또는 그의 염;
ii) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는, 상기 서열로 이루어지는 또는 상기 서열로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그로부터 유래된 상기 변이체 서열, 또는 그의 염;
iii) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는, 상기 서열로 이루어지는 또는 상기 서열로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그로부터 유래된 상기 변이체 서열, 또는 그의 염;
iv) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는, 상기 서열로 이루어지는 또는 상기 서열로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그로부터 유래된 상기 변이체 서열, 또는 그의 염; 및
v) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는, 상기 서열로 이루어지는 또는 상기 서열로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그로부터 유래된 상기 변이체 서열, 또는 그의 염.
이 조합은 각각의 i) 내지 v)로부터 선택되는 1개를 초과하지 않는 폴리펩티드, 또는 그의 염을 포함하는 것이 바람직하다. 이 조합은 i)로부터 선택되는 1개 이상의 폴리펩티드, 또는 그의 염을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
상기 정의된 조합은 하나 이상의 추가의 폴리펩티드를 더 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 추가의 폴리펩티드는 예를 들면, 서열번호 2 내지 5, 7 내지 9, 12, 15 내지 26, 28, 37, 39 내지 42 및 45 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 그로부터 유래된 변이체 서열을 포함하거나, 상기 서열로 이루어지거나, 상기 서열로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 조합에서의 추가의 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 29, 37, 51 및 53 (클라도스포리움 알레르겐으로부터 직접 유래) 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 그로부터 유래된 변이체 서열을 포함하거나, 상기 서열로 이루어지거나, 또는 상기 서열로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드만으로부터 선택된다. 기타 구체예에서, 추가의 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 29 및 37 내지 54 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 그로부터 유래된 변이체 서열을 포함하거나, 상기 서열로 이루어지거나, 또는 상기 서열로 필수적으로 이루어질 수 있다. 이 단락에서 언급된 변이체 서열은 서열번호 31 내지 35로부터 유래된 변이체 서열에 대하여 전술된 바와 동일한 방식으로 각각 대응하는 원 아미노산 서열로부터 유래된다.
바람직하게는, 조합은 제1 아미노산 서열 (또는 그로부터 유래된 변이체)을 포함하거나, 상기 서열로 이루어지거나, 또는 상기 서열로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드 및 제2 아미노산 서열 (또는 그로부터 유래된 변이체)을 포함하거나, 상기 서열로 이루어지거나, 또는 상기 서열로 필수적으로 이루어지는 하나 이상의 추가의 폴리펩티드로서, 상기 제2 아미노산 서열은 상기 제1 아미노산 서열에 대해 상이한 알레르겐으로부터 유래한 것인 폴리펩티드를 포함할 것이다. 본 명세서에 개시된 각 아미노산 서열이 유래한 알레르겐이 상기 표제 "서열의 기술" 섹션에 기재되어 있다. 1개를 초과하는 Cla (및/또는 Alt)로부터 유래한 서열을 포함함으로써, 조합은 1개를 초과하는 곰팡이 알레르겐으로부터의 T-세포 에피토프를 제공함으로써 일반적인 집단에서 관찰되는 넓은 범위(coverage)의 곰팡이 알레르기를 고려할 수 있다.
특히 바람직한 조합은 하기로부터 선택되는 1개, 2개, 또는 3개의 추가의 폴리펩티드를 포함한다:
(f) GWGVMVSHRSGET (서열번호 39; Alt14);
(g) GYTGKIKIAMDVASSE (서열번호 41; Alt15), 및
(h) WSWKIGPAIATGNT (서열번호 50; Alt28).
전술된 폴리펩티드 조합은 선택적으로 추가의 폴리펩티드, 또는 알터나리아 및/또는 클라도스포리움 알레르겐으로부터 유래된 추가의 폴리펩티드를 포함하지 않을 수 있다. 전술된 폴리펩티드 조합은 보다 상세하게 기술된 하기 본 발명의 약제학적 제제 중에 포함될 수 있다.
의약 용도 및 방법
본 발명의 바람직한 양태는 알레르기의 예방 또는 치료이다. 이 양태에서 본 발명은, 본 발명의 폴리펩티드 또는 염 또는 클라도스포리움 및/또는 알터나리아에 대한 알레르기를 치료 또는 예방하는 방법에 이용하기 위한 본 발명의 약제학적 제제를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드, 염 또는 약제학적 제제는 면역관용화(tolerisation)에 의해 알레르기를 예방 또는 치료할 수 있다. 면역관용화는 클라도스포리움 및/또는 알터나리아 속의 하나 이상의 단백질 알레르겐에 대한 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 클라도스포리움 및/또는 알터나리아에 대한 알레르기를 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 본 발명의 폴리펩티드 또는 염의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 클라도스포리움 및/또는 알터나리아에 대한 알레르기에 대해 개체를 치료하거나 또는 개체에서 클라도스포리움 및/또는 알터나리아에 대한 알레르기를 예방하는 방법으로, 상기 방법은 본 발명의 폴리펩티드 또는 염 또는 본 발명의 약제학적 제제의 치료적 또는 예방적 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다. 상기 방법은 따라서 알레르기로부터 고통받는 개체에서 알레르기 증상을 감소시키거나 또는 완화시킬 수 있다. 상기 방법은 알레르기로부터 고통받는 개체의 상태를 개선시킬 수 있다. 상기 방법은 개체에서 알레르기 증상의 출현을 예방하거나 또는 지연시킬 수 있다. 곰팡이에 대한 알레르기의 증상은 하기에서 논의된다.
이 절(section)에서 언급된 각각의 방법 및 용도에서, 폴리펩티드 또는 염은 이전 절에서 정의된 폴리펩티드 또는 염의 조합으로 대체될 수 있다. 그와 같이, 본 발명은 폴리펩티드 또는 염의 조합이 클라도스포리움 및/또는 알터나리아에 대한 알레르기를 치료 또는 예방하는 방법에서 이용되는 시나리오를 포함한다. 상기 시나리오에서, 조합의 폴리펩티드는 함께 투여되지 않아도 되고, 및/또는 동일한 약제학적 제제의 부분이 아니어도 된다.
따라서 본 발명은, 전술된 클라도스포리움 및/또는 알터나리아에 대한 알레르기를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 1개 이상의, 바람직하게는 2개 이상의 본 발명의 추가의 폴리펩티드를 투여하는 단계를 더 포함하는 것인 방법에서 이용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드 또는 염을 제공한다. 이 방법의 다수의 펩티드들은 각각 동시에(simultaneously), 순차로 또는 함께(concurrently) 투여될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드, 염 또는 약제학적 제제는 클라도스포리움 및/또는 알터나리아 알레르겐에 대해 탈감작 또는 관용화하는 것에 의해 알레르기를 치료하거나 또는 예방할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 그것이 유래된 알레르겐에 대해 개체를 관용화하거나 탈감작하는 데 이용될 수 있다. 알레르겐에 대해 개체를 탈감작하는 것은 적절하게 감작된(sensitised) 개체에서 알레르겐에 의해 유도된 알레르기성 조직 반응의 억제 또는 약화(dampening)를 의미한다. 용어 "면역관용화(tolerisation)"는 단백질 알레르겐에 대한 알레르기성 반응과 같이, 항원에 대한 반응을 억제 또는 파괴하는(abolish) 능력을 의미한다. 면역관용화는 또한 원하지 않는 면역 반응을 감소 또는 파괴하는 능력, 또는 단백질 알레르겐에 대해 개체를 탈감작시키는 능력이다. 면역관용화는 T 세포 반응의 인 비트로 분석에 의해, 또는 개체에서 증상의 감소를 관찰함으로써 결정될 수 있다.
보다 구체적으로, T 세포는 선택적으로 활성화된 후, 무반응적으로 될 수 있다. 게다가, 이들 T 세포의 구동(anergising) 또는 제거가 특정 알레르겐에 대한 환자의 탈감작을 초래한다. 탈감작은 알레르겐 또는 알레르겐-유래 펩티드의 2차 및 추가 투여에서, 알레르겐 또는 알레르겐-유래 펩티드에 대한 반응의 감소 또는 바람직하게는 그러한 반응의 제거로서 그 자체를 나타낸다. 이러한 2차 투여는 탈감작의 발생을 허용하는 적합한 시간 간격이 경과한 후에 이루어질 수 있다; 이것은 바람직하게는 1일 및 수 주 사이의 임의의 간격이다. 약 4주의 간격이 바람직하다.
폴리펩티드, 염 또는 약제학적 제제가 투여되는 개체는 무증상일 수 있다. 폴리펩티드 또는 약제학적 제제의 예방적 유효량이 그와 같은 개체에 투여된다. 예방적 유효량은 알레르기의 하나 이상의 증상의 발병을 예방하는 양이다.
대안적으로, 폴리펩티드, 염 또는 약제학적 제제가 투여되는 개체는 그것을 필요로 할 수 있다. 즉, 개체는 하나 이상의 알레르기 증상을 보일 수 있다. 폴리펩티드 또는 약제학적 제제의 치료적 유효량은 그와 같은 개체에 투여된다. 치료적 유효량은 알레르기의 하나 이상의 증상을 개선하는 데 유효한 양이다.
폴리펩티드, 염 또는 약제학적 제제가 투여되는 개체는 바람직하게는 인간이다. 개체는 곰팡이 알레르겐에 대해 감작화되거나, 감작화될 위험이 있거나, 또는 감작화의 의심이 있는 것으로 알려질 수 있다. 개체는 당해 분야에서 잘 알려지고 본 명세서에서 기술된 기법을 이용하여 감작화에 대해 시험될 수 있다. 대안적으로, 개체는 곰팡이에 대한 알레르기의 가족력을 가질 수 있다.
개체가 곰팡이에 노출될 경우 알레르기의 증상을 보일 수 있으므로, 곰팡이에 대한 감작화에 대해 개체를 시험하는 것은 필수적이지 않을 수 있다. 노출은 예를 들면, 곰팡이 또는 곰팡이로부터 유래된 물질 또는 산물에의 근접을 의미한다. 근접은 전술된 아이템으로부터 10미터 이하, 5미터 이하, 2미터 이하, 1미터 이하 또는 0미터에 있음을 의미한다. 알레르기의 증상은 코 가려움, 재채기, 안구 눈물, 목 가려움, 입천장(palate) 가려움 안구 가려움, 콧물, 호흡곤란, 기관지경련, 천식, 붉어지는 가려운 피부 또는 발진을 포함할 수 있다.
개체는 임의의 연령일 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 개체는 1 내지 90세, 5 내지 60세, 10 내지 40세 또는 더욱 바람직하게는 18 내지 35세의 연령군에 있을 수 있다.
바람직하게는, 개체는 코카시안 집단(Caucasian population)을 대표하는 빈도의 범위 내에 있는 MHC 대립유전자 빈도를 갖는 집단 유래이다. 11개의 공통 DRB1 대립유전자 패밀리에 대한 기준 집단 대립유전자 빈도가 표 1에 표시된다 (HLA Facts Book, Parham 및 Barber 유래 데이터).
DRB1 1 3 4 7 8 11 12 13 14 15 16
% 6.4 14.7 15.7 8.8 3.4 8.3 3.9 14.7 2.9 17.6 2.5
기준 집단 % 9.4 11.1 12.8 13.2 3.7 13.4 2.3 10.2 3.2 10.7 3.6
기준 빈도는 빈도를 보고하는 다수 연구의 분석에 의해 수득되었고, 표시된 숫자는 평균값이다. 그러므로, 바람직하게는 치료받는 개체는 표 1 (1, 2, 3, 4, 5 이상 또는 모든 대립유전자에 대해서와 같은)에 언급된 대립유전자에 대한 기준 집단으로서 동등한(equivalent) MHC 대립유전자 빈도를 갖는, 예를 들면 그 숫자 + 또는 - 1, 2, 3, 5, 10, 15 또는 20%의 범위 내인, 집단 유래이다.
바람직하게는 개체는 하기 DRB1 대립유전자의 빈도가 다음과 같은 집단 유래이다:
4 - 9% 이상
7 - 10% 이상
11 - 8% 이상.
개체는 2주, 1개월, 6개월, 1년, 5년 또는 5년보다 장기간 동안 곰팡이에 대한 알레르기를 가졌을 수 있다. 개체는 알레르기에 의해 유발되는 발진, 코막힘, 콧물 및/또는 기침으로 고통받았을 수 있다. 개체는 곰팡이 알레르기를 치료하는 기타 조성물/화합물을 투여받았거나 또는 투여받지 않았을 수 있다. 개체는 온대, 아열대, 열대 또는 북극(arctic) 기후를 갖는 지리적 지역에서 거주할 수 있다. 개체는 통상적으로 특정한 계절에 곰팡이에 대한 알레르기로부터 고통받지만, 상기 알레르기는 지속적(perennial)일 수 있다. 곰팡이에 대한 계절적 알레르기는 흔히 북반구에서 가을에 발생할 수 있다.
알레르기성 개체는 통상적으로 클라도스포리움 속 곰팡이, 특히 클라도스포리움 허바리움(Cladosporium herbarium) 및/또는 클라도스포리움 클라도스포로이데스(Cladosporium cladosporoides)에 대해 알레르기성일 수 있다. 알레르기성 개체는 알터나리아 속 곰팡이, 특히 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata)에 대해 알레르기성일 수 있다. 알레르기성 개체는 클라도스포리움 및 알터나타 속의 곰팡이 모두에 대해 알레르기성일 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드, 염 또는 약제학적 제제는 곰팡이 알레르기성 개체의 패널에서 사용을 위한 그들의 적합성을 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다. 곰팡이 알레르기성 개체의 패널은 알터나리아 및 클라도스포리움 속의 곰팡이에 대한 알레르기성으로 알려지거나 또는 알려지지 않은 개체를 포함할 수 있다. 특히 다수의 폴리펩티드가 약제학적 제제에 조합으로 제공되는 경우, 그것은 T 세포의 시료 중 20% 이상에서 T 세포 증식을 유발하는 그의 능력에 대해 스크리닝될 수 있으며, 여기서 각 시료는 집단에서 상이한 곰팡이 알레르기성 개체로부터 수득된다. 바람직하게는, 약제학적 제제는 곰팡이 알레르기성 개체의 패널로부터 수득된 T 세포의 시료 중 30% 이상에서 T 세포 증식을 유도할 것이다. 보다 바람직하게는, 약제학적 제제는 패널에서 시료의 35% 이상, 40 % 이상, 50 % 이상, 60 % 이상, 70% 이상, 80 % 이상, 또는 90 % 이상에서 T 세포 증식을 유도할 것이다. 곰팡이 알레르기성 개체의 패널에서 다수의 개체는 1을 초과하는 임의의 수, 예를 들면 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 80 이상, 또는 100 이상의 개체일 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드, 염 또는 약제학적 제제는 T 세포 증식을 유발하나, 감작화된 개체에서 유래한 백혈구 시료로부터 히스타민의 방출을 초래하지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 폴리펩티드, 염 또는 약제학적 제제의 히스타민 방출 프로파일이 확인될 수 있다. 적합한 백혈구 시료는 강화된 호염구(basophil) 또는 비만 세포(mast cell) 제제를 포함한다. 일부 히스타민 방출이 존재할 수 있으나, 바람직하게는 방출된 양이 유의하지 않다. 유의성 있는 히스타민 방출은, 개체로부터의 백혈구 시료가 인 비트로에서 약제학적 제제에 의해 자극될 경우, 총 가용 백혈구 히스타민의 20% 이상의 방출인 것으로 고려될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드, 염 또는 약제학적 제제는, 개체로부터의 백혈구 시료가 인 비트로에서 조성물에 의해 자극될 경우 바람직하게는, 총 가용 백혈구 히스타민의 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만의 방출을 유발한다. 정상적인 개체는 통상적으로 대략 150 ng/107 세포의 백혈구 히스타민 함량을 갖는다.
약제학적 제제
본 발명의 각 폴리펩티드 또는 염은 단리된, 실질적으로 단리된, 정제된, 또는 실질적으로 정제된 형태로 개체에게 제공될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드 또는 염은 그의 기타 폴리펩티드 또는 염이 실질적으로 없는 개체에게 제공될 수 있다. 폴리펩티드 또는 염이 가공되지 않은 형태(raw form)로 존재하는 것이 가능할 수 있지만, 그것이 약제학적 제제로서 존재하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 추가의 양태에 따라, 본 발명은 본 발명의, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 및 폴리펩티드, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약제학적 제제를 추가로 제공한다. 이 약제학적 제제는 전술된 본 발명의 폴리펩티드 또는 염의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
약제학적 제제에 존재하는 담체(들) 또는 희석제(들)은 제제의 기타 성분과 양립할 수 있는 의미에서 "허용가능(acceptable)" 해야 하고 그의 수용자에게 유해하지 않아야 한다. 통상적으로, 주사용 및 최종 제제를 위한 담체는 멸균되어 있고, 무발열원이다. 바람직하게는, 담체 또는 희석제는 물이다. 담체 또는 희석제는 티오글리세롤, 티오아니솔 또는 메티오닌을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드 또는 염을 포함하는 조성물은 약제학적 제제를 생산하기 위해 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 비히클과 조합될 수 있다. 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질이 부형제 또는 비히클에 존재할 수 있다. 이들 부형제, 비히클 및 보조 물질은 일반적으로 조성물을 수용하는 개체에서 면역 반응을 유도하지 않고, 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 약학적 작용제이다. 약제학적으로 허용가능한 부형제는 물, 염수(saline), 폴리에틸렌글리콜, 히알루론산, 글리세롤, 티오글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용가능한 염은 또한 예를 들면, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트, 설페이트 등과 같은 무기산 염; 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등과 같은 유기산의 염이 포함될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 부형제, 비히클 및 보조 물질의 완전한 논의는 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub.Co.,N.J.1991)에서 이용가능하다.
폴리펩티드 또는 염은 통상적으로 약제학적 제제의 중량 기준 0.1% 내지 50%, 보다 바람직하게는 0.1% 내지 5%로 존재한다. 폴리펩티드 또는 염은 약제학적 제제의 중량 기준 0.1% 미만으로 존재할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 통상적으로 약제학적 제제의 중량 기준 50% 내지 99.9 %, 보다 바람직하게는 95% 내지 99.9 %로 존재한다. 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 약제학적 제제에 중량 기준 99.9%를 초과하여 존재할 수 있다.
약제학적 제제는, 약제학적으로 허용가능한 용액, 동결 건조물, 현탁액, 유성 또는 수성 비히클 중 에멀전, 페이스트, 및 이식형 지속-방출 또는 생분해 제제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 그와 같은 약제학적 제제는 현탁제, 안정화제, 또는 분산제를 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 추가 성분을 더 포함할 수 있다. 동결 건조물은 하나 이상의 트레할로스, 티오글리세롤, 메티오닌 및 티오아니솔을 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 약제학적 제제의 일 구체예에서, 활성 성분은 재구성된(reconstituted) 약제학적 제제의 비경구 투여 이전에 적합한 비히클 (예를 들면, 멸균 발열성 물질 제거수(sterile pyrogen-free water))에 의한 재구성을 위해 건조 형태 (예를 들면, 동결 건조물, 분말 또는 과립)으로 제공된다.
본 발명은, 전술된 폴리펩티드 또는 염, 또는 전술된 폴리펩티드 및 염의 조합을, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 혼합하는 단계를 포함하는, 본 발명의 약제학적 제제를 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 비경구 투여를 위한 약제학적 제제를 제조하고, 상기 폴리펩티드(들), 또는 염(들)을 건조 형태로 제공하는 단계 및 상기 폴리펩티드(들), 또는 염(들)을 상기 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제에 의해 재구성하는 단계를 포함한다.
이 약제학적 제제는 멸균의 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액의 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 이 현탁액 또는 용액은 알려진 기술에 따라 제제화될 수 있고, 활성 성분 이외에, 추가 성분, 예를 들면, 본 명세서에 기술된 분산제, 습윤제, 또는 현탁제를 포함할 수 있다. 그와 같은 멸균의 주사가능한 제제는 무-독성의 비경구적으로-허용가능한 희석제 또는 용매, 예를 들면, 물 또는 1,3-부탄디올을 이용하여 제조될 수 있다. 기타 허용가능한 희석제 및 용매는 링거액, 등장성 염화나트륨 용액, 및 합성 모노- 또는 디-글리세리드와 같은 고정유를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
기타 유용한 비경구적으로-투여가능한 약제학적 제제는 활성 성분을 미정질(microcrystalline) 형태로, 리포좀 제제로, 또는 생분해 폴리머 시스템의 구성요소로 포함하는 제제를 포함한다. 지속된 방출 또는 이식을 위한 약제학적 제제는 약제학적으로 허용가능한 폴리머성 또는 소수성 물질 예를 들면, 에멀전, 이온 교환 레진, 제한적인 용해성(sparingly soluble) 폴리머, 또는 제한적인 용해성 염을 포함할 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 입자상(particulate) 담체로 캡슐화되거나, 흡착되거나, 또는 연관될 수 있다. 적합한 입자상 담체는 폴리메틸 메타크릴레이트 폴리머로부터 유래한 것, 및 폴리(락티드) 및 폴리(락티드-코-글리콜라이드)로부터 유래된 PLG 미립자를 포함한다. 예를 들면, Jeffery et al. (1993) Pharm. Res. 10:362-368을 참조한다. 또한, 기타 입자상 시스템 및 폴리머, 예를 들면, 폴리라이신, 폴리아르기닌, 폴리오르니틴, 스페르민(spermine), 스페르미딘과 같은 폴리머, 및 이들 분자의 컨쥬게이트가 이용될 수 있다.
본 명세서에 언급된 폴리펩티드의 제제는 폴리펩티드의 성질 및 전달 방법과 같은 요인들에 의존할 것이다. 이 약제학적 제제는 여러 투여 형태로 투여될 수 있다. 그것은 경구로 (예를 들면, 정제, 트로키(troche), 로렌지(lozenge), 수성 또는 유성 현탁액, 분산가능한 분말 또는 과립으로), 국소적으로, 비경구적으로, 피하로, 흡입에 의해, 정맥으로, 근육 내로, 림프 내로(intralymphatically) (예를 들면, 사타구니(groin) 중 림프절로), 흉골 내로(intrasternally), 경피로, 피내로, 표피로, 설하로, 비강으로, 구강으로 또는 투입(infusion) 기법에 의해 투여될 수 있다. 투여는 편도선 내로(intratonsillar) 투여될 수 있다. 투여는 좌약(suppository)일 수 있다. 투여는 이온토포레시스(iontophoresis)에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 투여는 피내, 표피 또는 경피 투여이다. 투여는 패치(patch), 예를 들면 마이크로틴(microtine) 패치에 의해 수행될 수 있다.
임상가는 각 특정 개체에 대하여 요구되는 투여 경로 및 수단을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 약제학적 제제는 바람직하게는 용기 중에 밀봉된 채 제공된다. 이 약제학적 제제가 약제학적으로 허용가능한 용액인 경우, 그 용액은 앰플, 밀봉 바이알, 주사기, 카트리지, 가요백 또는 유리병으로 제공될 수 있다. 이 약제학적 제제가 동결 건조물인 경우, 그것은 바람직하게는 밀봉 바이알 중에 제공된다.
본 발명의 약제학적 제제는 역(adverse) 반응을 유발하지 않고 효과적일 수 있는 각 폴리펩티드의 적합한 농도를 포함할 것이다. 이 약제학적 제제가 예를 들면 동결 건조물인 경우, 관련 농도는 재구성 후 각 폴리펩티드의 농도일 것이다. 일반적으로, 용액 중에 있을 경우 이 약제학적 제제에서 각 폴리펩티드의 농도는 0.03 내지 200 nmol/ml의 범위 내에 존재할 것이다. 각 폴리펩티드의 농도는 보다 바람직하게는 0.3 내지 200 nmol/ml, 3 내지 180 nmol/ml, 10 내지 150 nmol/ml, 50 내지 200 nmol/ml 또는 30 내지 120 nmol/ml의 범위 내에 존재할 수 있다. 이 약제학적 제제는 95% 또는 98%을 초과하는 순도 또는 99% 이상의 순도를 가져야한다.
보조제(adjuvant) 또는 추가의 치료제가 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드와 조합으로 이용될 수 있다. 보조제는 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드(들)의 효과를 증가시키는데 충분한 양으로 투여되거나 또는 그 반대이다. 보조제 또는 추가의 치료제는 본 발명의 폴리펩티드의 효과를 증가시키는 제제일 수 있다. 예를 들면, 추가의 치료제는 본 발명의 폴리펩티드에 대한 반응을 향상시키는 면역조절(immunomodulatory) 분자일 수 있다. 보조제의 비-제한적인 예는 비타민 D, 라파마이신 및 글루코코르티코이드 스테로이드 예를 들면, 덱사메타손, 플루티카손, 부데소니드, 모메타손, 베클로메타손, 하이드로코르티손, 코르티손 아세테이트, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 베타메타손 및 트리암시놀론을 포함한다. 바람직한 글루코코르티코이드는 덱사메타손이다.
일 구체에에서 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드가 치료를 위해 하나 이상의 기타 치료제 또는 보조제와 조합으로 이용될 경우, 그 기타 치료제 또는 보조제는 별개로, 동시에 또는 순차로 투여될 수 있다. 그들은 동일한 또는 상이한 약제학적 제제로 투여될 수 있다. 그러므로 본 발명의 폴리펩티드 및 또한 하나 이상의 기타 치료제 또는 보조제를 포함하는 약제학적 제제가 제조될 수 있다. 본 발명의 약제학적 제제는 대안적으로 하나 이상의 기타 치료용 조성물과 동시에, 순차로 또는 별개로 조합 치료의 부분으로 이용될 수 있다. 따라서, 하기 기술된 본 발명에 따른 알레르기를 예방 또는 치료하는 방법에서, 개체는 또한 추가의 치료제에 의해 치료될 수 있다.
투여 경로
본 발명의 폴리펩티드 또는 염이 약제학적 제제로 개체에 투여될 경우, 그 제제는 이 폴리펩티드 또는 염이 적합한 항원 제시 세포에 접촉할 능력을 갖고, 그것 또는 그들이 개체의 T 세포에 접촉할 기회를 갖게 될 개체의 체내 부위로 제제를 투여하는 것이 바람직하다.
일단 제제화되면, 본 발명의 약제학적 제제는 여러 알려진 경로 및 기법을 이용하여 인 비보에서 개체에 전달될 수 있다. 예를 들면, 약제학적 제제는 주사가능한 용액, 현탁액 또는 에멀전으로 제공될 수 있고 통상의 바늘 및 주사기, 마이크로니들 및 주사기를 이용하는 또는 엑체 제트 분사(liquid jet injection) 시스템을 이용하여 비경구의, 피하의, 표피의, 피내의, 근육 내의, 림프 내의, 동맥 내의, 복강 내의, 또는 정맥 내의 주사를 통해 투여될 수 있다. 투여는 패치, 예를 들면 마이크로틴 패치를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 조성물은 피부 또는 점막 조직에, 예를 들면, 비강으로(nasally), 편도선 내로(intratonsillarly), 기관 내로(intratracheally), 창자의, 직장으로 또는 질 내로 국소적으로 투여될 수 있거나, 호흡기 또는 폐의 투여에 적합한 미세 스프레이(finely divided spray)로 제공될 수 있다. 기타 투여 방식은 경구 투여, 좌약, 설하 투여, 및 능동 또는 수동 경피 전달 기법을 포함한다.
투여량
본 발명의 폴리펩티드, 염 또는 약제학적 제제의 투여는 전술된 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 투여되는 적합한 양의 폴리펩티드 또는 염은 경험에 의해 결정될 수 있으나, 일반적으로 하기 주어진 범위 내이다. 각 폴리펩티드 또는 염의 단일 투여가 환자에 있어서 이로운 효과를 갖기에 충분할 수 있으나, 이 폴리펩티드 또는 염이 1회를 초과하여 투여될 경우 이로울 수 있다는 것이 고려될 것이고, 이 경우 일반적인 투여 요법은 예를 들면, 6개월마다 2 내지 4주 동안 1주 1회 또는 2회, 또는 4 내지 6개월마다 1주 동안 1일 1회일 수 있다. 고려될 바와 같이, 폴리펩티드 또는 염과 조합된 각 폴리펩티드 또는 염이 개별적으로 또는 조합으로 환자에게 투여될 수 있다.
투여를 위한 투여량은 약제학적 제제의 성질, 투여 경로 및 투여 요법의 스케줄과 타이밍을 포함한 다수의 요인들에 의존할 것이다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 염의 적합한 투여량은 투여 당 대략 10 μg 이하, 15 μg 이하, 20 μg 이하, 25 μg 이하, 30 μg 이하, 50 μg 이하, 100 μg 이하, 500 μg 이하 또는 그보다 많을 수 있다. 적합한 투여량은 15 μg 미만일 수 있고, 1 ng 이상, 2 ng 이상, 5 ng 이상, 50 ng 이상, 100 ng 이상, 500 ng 이상, 1 μg 이상, 10 μg 이상일 수 있다. 본 발명의 일부 폴리펩티드에 있어서, 이용되는 투여량은 보다 높아서, 예를 들면 1 mg 이하, 2 mg 이하, 3 mg 이하, 4 mg 이하, 5 mg 이하 또는 그보다 많을 수 있다. 그와 같은 투여량은 선택된 경로에 의한 투여에 적절한 부피를 허용하는 적합한 농도에서 액체 제제로 제공될 수 있다. 상기 투여량은 펩티드 또는 염의 조합의 경우의 총 투여량을 의미한다는 것이 이해될 것이다. 예를 들면, "35μg 이하"는 조합 또는 그보다 많은 펩티드 또는 염을 포함하는 조성물 중에 35μg 이하의 총 펩티드 또는 염 농도를 의미한다.
핵산 및 벡터
본 발명의 폴리펩티드는 직접 투여될 수 있거나, 코딩 서열로부터의 발현에 의해 간접적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공될 수 있다. 따라서 본 발명의 폴리펩티드는 그것을 코딩하고 발현할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 형태로부터 생성되거나 전달될 수 있다. 본 발명의 펩티드의 이용, 전달 또는 투여에 대한 본 명세서에서의 참조는 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터의 발현을 통한 그와 같은 펩티드의 간접적인 이용, 전달 또는 투여를 포함하는 것으로 의도된다.
이 양태에서, 본 발명은 서열번호 31 내지 35 중 어느 하나 또는 그로부터 유래된 변이체의 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 서열로 이루어지거나, 또는 상기 서열로 필수적으로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
용어 "핵산 분자(nucleic acid molecule)" 및 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 본 명세서 내에서 상호 교환적으로 이용되고 임의의 길이의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드인 뉴클레오티드, 또는 그의 유사체의 폴리머 형태를 의미한다. 폴리뉴클레오티드의 비-제한적 예는 유전자, 유전자 단편, 전령 RNA (mRNA), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 단리된 또는 정제된 형태로 제공될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는, 당해 분야에 잘 알려진, 예시로서 Sambrook et al (1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press)에 기술된 방법에 따라 합성될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드의 생성에서 인 비트로, 엑스 비보 또는 인 비보에서 이용될 수 있다. 그와 같은 폴리뉴클레오티드는 클라도스포리움 및/또는 알터나리아에 대한 알레르기의 예방 또는 치료에서 투여 또는 이용될 수 있다.
유전자 전달 방법이 당해 분야에 알려져 있다. 미국 특허 제5,399,346호, 제5,580,859호 및 제5,589,466호를 참조한다. 핵산 분자는 수여 대상에게 직접, 예를 들면, 표준의 근육 내 또는 피내 주사에 의해 도입될 수 있다; 경피 입자 전달; 흡입; 국소의, 또는 경구에 의한, 투여의 비강 내 또는 점막의 방식. 대안적으로, 이 분자는 대상으로부터 제거된 세포 내로 엑스 비보로 도입될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트 또는 벡터는 개체의 APC 내로 엑스 비보로 도입될 수 있다. 관심 있는 핵산 분자를 포함하는 세포가 대상에게 재-도입되어, 이 핵산 분자에 의해 코딩되는 펩티드에 대한 면역 반응이 증가될(mounted) 수 있다. 그와 같은 면역화(immunization)에서 이용된 핵산 분자가 본 명세서에서 통상적으로 "핵산 백신(nucleic acid vaccine)"으로 지칭된다.
항원 제시 세포 (APC)
본 발명은 APC의 표면 상에 본 발명의 펩티드를 제시하는 APC의 집단을 생산하는 방법의 인 비트로 용도를 수반한다. 상기 APC의 집단은 치료에서 후속으로 이용될 수 있다. 상기 생산 방법은 환자로부터 수득된 세포의 시료 상에서 엑스 비보로 수행될 수 있다. 그러므로 이 방식으로 생산된 APC는 클라도스포리움 및/또는 알터나리아에 대한 알레르기의 치료 또는 예방에서 이용될 수 있는 약제학적 제제를 형성한다. 세포는 개체로부터 유래되므로 그 개체의 면역 시스템에 의해 수용될 것이다. 이 방식으로 생산된 세포의, 그것이 원래 수득된 개체로의 전달은, 따라서 본 발명의 치료적 구체예를 형성한다.
APC가 투여될 경우, 개체의 적합한 T 세포에 접촉하고 그 T 세포를 활성화시킬 능력을 갖게 될 체내 부위로 APC를 투여하는 것이 바람직하다.
인 비트로 방법
본 발명은 추가로, T 세포가 본 발명의 폴리펩티드 또는 염을 인식하는 지 여부를 결정하는 인 비트로 방법으로서, 상기 방법은 상기 T 세포를 상기 폴리펩티드 또는 염과 접촉시키는 단계 및 상기 T 세포가 상기 폴리펩티드 또는 염에 의해 자극되는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 이 방법은, 서열번호 31 내지 35 중 어느 하나 또는 그로부터 유래된 변이체의 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 서열로 이루어지거나, 또는 상기 서열로 필수적으로 이루어진 폴리펩티드 또는 그의 염의 용도를 포함한다.
상기 방법은 개체가 클라도스포리움 및/또는 알터나리아에 대한 알레르기를 갖거나, 가질 위험이 있는지 여부를 결정하기 위해 수행될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 설명된다:
실시예 1
MHC 클래스 Ⅱ 결합 조사
이 연구의 목적은 7개의 가장 흔한 인간 MHC 클래스 Ⅱ HLA-DRB1* 동종이형(allotype) (평균 코카시안 집단에서 발견되는 동종이형의 전체 약 63%를 커버링함)에 대해 강한 친화도를 갖는 서열을 갖는 구별되는(distinct) 일련의(panel) 폴리펩티드를 확인하는 것이다. 클라도스포리움 허바륨(Cladosporium herbarium) 유래의 주요 클라도스포리움 알레르겐 Cla h 6, Cla h 8 및 Cla h 10 및 클라도스포리움 클라도스포로이데스(Cladosporium cladosporoides) 유래의 Cla c 9에서 상기 폴리펩티드를 확인하기 위하여, 상업적으로 입수가능한 EpiMatrix 알고리즘 (EpiVax Inc.)을 이용하여 "펩티드 쓰레딩(peptide threading)"으로 알려진 인 실리코 접근법(in silico approach)을 수행하였다. 이것은 MHC 클래스 Ⅱ HLA-DR 분자의 결합 그루브(groove) 내에 수용될 가능성에 대해 주어진 서열을 갖는 폴리펩티드를 분석하는 생물정보학적 방법이다.
EpiMatrix는 선택된 각 MHC 분자에의 결합에 대한 추정 확률에 의하여, 임의의 폴리펩티드 서열로부터, 9개의 아미노산이 중첩되는 10개의 아미노산 길이의 세그먼트(segment)의 순위를 정하는(rank) 매트릭스-기반 알고리즘이다. (De Groot et al., AIDS Research and Human Retroviruses 13:539-41 (1997)). 매트릭스 모티프를 개발하는 과정은 Schafer et al, 16 Vaccine 1998 (1998)에 게재되었다. 이 실시예에서, HLA DR1, DR2, DR3, DR4, DR7, DR8, DR11, DR13 및 DR15에 대한 결합 가능성이 평가된다. 추정되는(putative) MHC 리간드는 폴리펩티드 서열 중 각 10-머(mer) 프레임을 점수화하는(score) 것에 의해 선택된다. 이 점수는 각 MHC 대립유전자에 결합하는 것으로 알려진 10개의 아미노산 서열의 매트릭스와 10-머의 서열을 비교하는 것에 의해 도출된다. 후향성 연구(retrospective study)는 EpiMatrix가 공개된 MHC 리간드를 정확히 예측한다는 것을 입증하였다 (Jesdale et al., in Vaccines '97 (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997)). 또한, 다수의 MHC 분자에 결합하는 폴리펩티드의 성공적인 예측이 확인되었다.
선택된 MHC 분자에의 결합에 대한 추정 확률은 다음과 같이 EpiMatrix에 의해 계산된다. 주어진 서열을 갖는 폴리펩티드를, 주어진 MHC 대립유전자에 대한 알려진 MHC 결합자와 비교하여, 각 아미노산에 대한 결합의 상대적 촉진 또는 억제를 추정하는 것에 의해 점수화한다. 이 정보는 폴리펩티드에 대해(across) 합산되고 및 요약 점수(summary score) (EMX 점수)가 전체 폴리펩티드에 할당된다. 알려진 MHC 리간드의 점수와 EMX 점수를 비교한 후, EpiMatrix는 "추정 결합 확률(estimated binding probability)"에 도달한다 (EBP로 축약되지만, 엄격하게는 확률은 아님). EBP는 소정의 MHC 분자에 결합할 만큼 높거나 그보다 더 높은 EpiMatrix 점수를 갖는 폴리펩티드의 비율을 기술한다. EBP는 100% (결합할 가능성이 매우 높음) 내지 1% 미만 (거의 결합할 것 같지 않음)의 범위이다.
EpiMatrix 분석을 Cla h 6 (NCBI accession no: P42040)의 알려진 동형(isoform)의 전체 서열에 대해 수행하였다. 이 분석은 우수한 MHC 클래스-Ⅱ 결합을 갖는 것으로 예측되는 상기 서열로부터 유래된 핵심 폴리펩티드 (및 그의 플랭킹 서열)를 확인하였다. 이 서열은 하기 표 2에 표시된다.
표 2에서: "서열 내 잔기(residue in sequence)"는 분석된 폴리펩티드의 서열 내에서 서열의 위치를 제공한다. 핵심 서열 (볼드체의 중간 아미노산)은 분석 동안 확인된 실제 결합 서열을 정의한다. 안정화시키는 플랭킹 서열(flank) (N-말단 및 C-말단, 볼드체 아님)은 핵심 서열과 함께 이용되기 위해 포함되고, 통상적으로 폴리펩티드의 제조를 돕는데 요구된다. "히트 수(number of hit)"는 서열 내에서 시험된 모든 MHC 유형에 대한 높게 예측된 결합 친화도의 수를 의미한다. "EpiMatrix 클러스터 점수(EpiMatrix Cluster Score)"는 클러스터의 길이에 대해 표준화된 히트의 수로부터 도출된다. 따라서, 클러스터 점수는 무작위 폴리펩티드 표준에 관하여 예측되는 총(aggregate) MHC 결합 특성에서의 초과량 또는 부족분이다. 10을 초과하는 점수는 광범위한 MHC 특성을 나타내는 것으로 고려된다.
입력
서열		 서열 내 잔기
(Incl.
FLANKS)		 서열 소수성
 EpiMatrix
HITS
(Excl FLANKS)		 Epi
Matrix
클러스터 점수
(Excl
FLANKS)		 펩티드
번호		 서열번호
P42040 187 - 204 AEVYQKLKSLTKKRYGQS -1.24 7 11.66 P49 1
P42040 234 - 254 EAGYTGQIKIAMDVASSEFYK -0.20 10 15.17 P50 2
P42040 364 - 385 KDSFAAGWGVMVSHRSGETEDV -0.45 9 13.37 P51 3
P42040 387 - 402 IADIVVGLRAGQIKTG 0.75 7 13.05 P52 4
Epimatrix 데이터의 추가 분석에 기초하고, Alt a 6 유래의 MHC-결합 폴리펩티드와의 상동성에 기초하여, 하기 Cla h 6 유래의 추가 서열이 또한 적합한 MHC-결합 특성을 갖는 것으로 확인되었다: MAVAKAAAA (서열번호 5), YQKLKSLTK (서열번호 6), WGVMVSHRS (서열번호 7), YTGQIKIAM (서열번호 8), IKIAMDVAS (서열번호 9).
Cla h 6과의 상동성 및 추가의 설계 및 탐색에 기초하여, 하기 Alt a 6으로부터 유래된 서열이 또한 적합한 MHC-결합 특성을 갖는 것으로 확인되었다:
서열번호 38 (Alt13A; AEVYQKLKALAKKTYGQ), 서열번호 39 (Alt14; GWGVMVSHRSGET), 서열번호 40 (Alt14A; GWGV-Nle-VSHRSGET), 서열번호 41 (Alt15; GYTGKIKIAMDVASSE), 서열번호 42 (Alt15A; GYTGKIKIA-Nle-DVASSE). Nle: 노르루신.
실시예 2
상기와 같은 Epimatrix 분석을 Cla h 8의 알려진 동형의 전체 서열 (NCBI accession no: P0C0Y5)에 대해 수행하였다. 이 분석은 우수한 MHC 클래스-Ⅱ 결합 특성을 갖는 것으로 예측된 상기 Cla h 8 동형으로부터 유래된 핵심 서열 (및 그의 플랭킹 서열)을 확인하였다. 이들 서열이 하기 표 3에 표시된다. 표 3의 호(heading) 및 주(note)는 상기 표 2에서와 같다.
입력
서열		 서열 내 잔기
(Incl.
FLANKS)		 서열 소수성 Epi
Matrix
HITS
(Excl FLANKS)		 Epi
Matrix 클러스터 점수
(Excl
FLANKS)		 펩티드
번호		 서열번호
P0C0Y5 42 - 64 CAEMGAAVAITYASRAQGAEENV 0.19 9 12.14 P53 10
P0C0Y5 144 - 168 GHHFKERGTGSLVITASMSGHIANF -0.09 11 14.86 P54 11
P0C0Y5 190 - 204 ANEWRDFARVNSISP -0.80 5 10.04 P55 51
P0C0Y5 235 - 256 AKELKGAYVYFASDASTYTTGA -0.15 11 14.42 P56 12
Epimatrix 데이터의 추가 분석에 기초하고, Alt a 8 유래의 MHC-결합 폴리펩티드와의 상동성에 기초하여, 하기 Cla h 8 유래의 추가 서열이 또한 적합한 MHC-결합 특성을 갖는 것으로 확인되었다: ITYASRAQG (서열번호 13), ERGTGSLVI (서열번호 14), YNVAKAGCI (서열번호 15), WRDFARVNS (서열번호 16), FVPKETQQL (서열번호 17), WHSMIPMGR (서열번호 18), LKGAYVYFA (서열번호 19), YVYFASDAS (서열번호 20). 서열번호 19 및 20은 서열번호 12의 변이체이다.
Cla h 8과의 상동성 및 추가의 설계 및 탐색에 기초하여, 하기 Alt a 8로부터 유래된 서열이 또한 적합한 MHC-결합 특성을 갖는 것으로 확인되었다:
서열번호 43 (Alt20; LAITYNSRAEGAEK), 서열번호 44 (Alt21; GLHFRERKTGSLVIT), 서열번호 45 (Alt23; NEWRDFARVNSISP), 서열번호 46 (Alt 24; KLWHSMIPMGRDAK), 서열번호 47 (Alt24A; KLWHS-Nle-IP-Nle-GRDAK), 서열번호 48 (Alt24B KLWHS-Nle-IPMGRDAK), 서열번호 49 (Alt 24C; KLWHSMIP-Nle-GRDAK).
실시예 3
상기와 같은 Epimatrix 분석을 Cla h 10의 알려진 동형의 전체 서열 (NCBI accession nos: P42041.2; P40108)에 대해 수행하였다. 이 분석은 우수한 MHC 클래스-Ⅱ 결합 특성을 갖는 것으로 예측된 상기 Cla h 10 동형으로부터 유래된 핵심 서열 (및 그의 플랭킹 서열)을 확인하였다. 이들 서열이 하기 표 4에 표시된다. 표 4의 호 및 주는 상기 표 2에서와 같다.
입력
서열		 서열 내 잔기
(Incl.
FLANKS)		 서열 소수성 EpiMatrix
HITS
(Excl FLANKS)		 EpiMatrix
클러스터 점수
(Excl
FLANKS)		 펩티드
번호		 서열번호
P40108 65 - 83 RQAFEGSWRLETPENRGKL -1.45 7 10.13 P57 21
P40108 143 - 159 PDTFNYVKKEPIGVCRS -0.65 7 12.06 P58 22
P40108 240 - 260 GSTVVGRTILKAAASSNLKKV 0.28 11 16.69 P59 23
P40108 281 - 300 AISWVNFGIFFNHGQCCCAG 0.81 9 12.74 P60 24
P40108 310 - 330 YDKFVQKFKERAQKNVVGDPF -1.03 11 16.8 P61 25
P40108 409 - 431 EDAIKLGNASTYGLAAAVHTKNL -0.01 10 15.4 P62 26
P40108 477 - 496 LANYTQTKTVSIRLGDALFG 0.13 9 14.28 P63 27
Epimatrix 데이터의 추가 분석에 기초하고, Alt a 10 MHC-결합 펩티드와의 상동성에 기초하여, 하기 Cla h 10 유래의 추가 서열이 또한 적합한 MHC-결합 특성을 갖는 것으로 확인되었다: WKIGPAIAT (서열번호 28), YTQTKTVSI (서열번호 29).
Cla h 10과의 상동성 및 추가의 설계 및 탐색에 기초하여, 하기 Alt a 10으로부터 유래된 서열이 또한 적합한 MHC-결합 특성을 갖는 것으로 확인되었다:
서열번호 50 (Alt28; WSWKIGPAIATGNT).
실시예 4
상기와 같은 Epimatrix 분석을 클라도스포리움 클라도스포로이데스의 액포 세린 프로테아제(vacuolar serine protease)의 알려진 동형의 전체 서열 (Cla c 9; Uniprot accession no: B0L807)에 대해 수행하였다. 이 분석은 우수한 MHC 클래스-Ⅱ 결합 특성을 갖는 것으로 예측된 상기 액포 세린 프로테아제로부터 유래된 핵심 서열 (및 그의 플랭킹 서열)을 확인하였다. 이들 서열이 하기 표 5에 표시된다. 표 5의 호 및 주는 상기 표 2에서와 같다.
입력
서열		 서열 내 잔기
(Incl.
FLANKS)		 서열 소수성 Epi
Matrix
HITS
(Excl FLANKS)		 Epi
Matrix 클러스터 점수
(Excl
FLANKS)		 펩티드
번호		 서열번호
B0L807 337-349 GGYKAAVRPTMLE
 -0.215 11 15.77 P64 35
또한, Cla h 7로부터 유래된 서열 GLFISTGTQGGGQ (서열번호 37)이 Alt a 7 유래의 MHC-결합 폴리펩티드와의 상동성에 기초하여 확인되었다.
실시예 5
실시예 1 내지 4에서 수행된 분석 및 용해도 및 기타 물리화학 특성의 고려에 기초하여, 본 발명자에 의해 표 6에 기재된 서열이 원하는 특징을 갖는 것으로 선택되었다. 서열번호 30 및 36의 서열은 각각 서열번호 32 및 35로부터 유래된 바람직한 변이체 서열이다. 원 아미노산 서열에 대하여 개선된 용해도 및/또는 제조가능성을 위해 이들 변이체 서열이 선택되었다. 표 6의 서열로 이루어진 폴리펩티드가 제조되었고 후속 분석에서의 탐색에 있어서 특히 바람직하였다. 통상적으로 상기 분석에서 서열번호 30의 폴리펩티드 (Cla25A)는 서열번호 32의 폴리펩티드 (Cla25) 대신 이용된다.
펩티드 서열 모체( parent ) 내
잔기 		서열번호
Cla16 AEVYQKLKSLTKK 187-199 (Cla h 6) 31
Cla25 VAITYASRAQGAE 49-61 (Cla h 8) 32
Cla25A VAITYASRAQGAEK 49-61+K (Cla h 8) 30
Cla26 GHHFKERGTGSLVIT 144-158 (Cla h 8) 33
Cla29 ANYTQTKTVSIRL 478-490 (Cla h 10) 34
Cla35 GGYKAAVRPTMLE 337-349 (Cla c 9) 35
Cla35A GGYKAAVRPT-Nle-LE 337-349 36
실시예 6
인 비트로 결합 분석
실시예 1 내지 5에서 확인된 서열을 갖는 폴리펩티드를 수성, 산성 환경(milieu) 중 용해도에 대해 미리-탐색하고 이 펩티드를 인 비트로 MHC 클래스 Ⅱ 결합 분석에서 시험한다.
방법
이용되는 분석은 경쟁적 MHC 클래스 Ⅱ 결합 분석으로서, 각 폴리펩티드를 조사된 각 사람 MHC 클래스 Ⅱ 동종이형(allotype)으로부터 알려진 대조군 결합자(binder)를 대체할 능력에 대해 분석한다. 이 연구에서 이용되는 동종이형 및 대조 폴리펩티드는 하기에 나타낸 것과 같다:
Figure pct00002
각 폴리펩티드를 경쟁 분석에서 분석하고 대조 폴리펩티드 대비 상대적인 결합에 대해 탐색한다. 경쟁 분석의 성질로 인해 각 폴리펩티드에 대한 데이터를 대조 폴리펩티드의 IC50에 대한 그의 IC50의 비율로 결정한다. 따라서, 대조 폴리펩티드에 동등한 IC50 값을 갖는 폴리펩티드는 동일한 결합 친화도를 갖는 반면, 1 미만의 비율을 갖는 펩티드는 더 높은 친화도를 갖고 1을 초과하는 비율을 갖는 펩티드는 더 낮은 친화도를 갖는다.
수용액에서의 용해도는 폴리펩티드가 유효한 치료제가 되기 위한 필수적인 기준이다. 그러므로, 용해도 탐색의 결과 다수의 결합 레지스터(binding register)에서 높은 빈도의 거대 소수성 아미노산 잔기를 갖는 매우 소수성인 폴리펩티드는 제거될 것이다. 이것은 불규칙한(promiscuous) HLA-DRB1* 결합자의 특징이다. 하나 이상의 MHC 클래스 Ⅱ 동종이형에 결합하는 폴리펩티드를 확인한다. 그와 같은 폴리펩티드는 MHC 구조의 상동성을 통해 시험되지 않았던 유사한 동종이형에 결합하는 능력을 가질 것으로 예상될 것이다.
실시예 7
하기 방법이 실시예 1 내지 5에서 확인된 서열을 갖는 폴리펩티드의 T 세포 활성화 특성을 평가하게 위해 이용된다.
세포 증식 분석
세포 증식 분석을 PBMC's (시험될 모든 파라미터에 대하여 140x106 개의 세포가 요구됨) 상에서 수행한다. 방사성 표지된 화합물 3H-티미딘의 포함에 의해 증식을 측정한다. 보다 구체적으로, 100 ㎕의 적절한 항원 또는 폴리펩티드의 농축물(concentration)을 96 웰 플레이트의 적절한 웰로 분배한다. 그 후 이 플레이트를 37℃로 설정된 가습된 5% CO2 인큐베이터 내에 최대 4시간 동안 둔다. 전술된 바와 같이 분리된 PBMC's 를 실온에서 완전 배지 중 2x106 cells/ml의 농도로 제조한다. 그 후, 100 ㎕의 세포 용액을 항원/폴리펩티드를 포함하는 96 웰 플레이트의 각 웰로 분배한다. 그 후 플레이트를 6 내지 8일 동안 인큐베이션한다. 배양물을 3중수소 티미딘 스톡 용액 10㎕을 (무혈청 RPMI 배지 중 1.85MBq/ml) 각 웰에 첨가함으로써 3중수소 티미딘 용액에 의해 펄스를 가한다(pulse with). 그 후 플레이트를 8 내지 16시간 동안 인큐베이터로 되돌린다. 그 후 Canberra Packard FilterMate 196 세포 수확기를 이용하여 배양물을 수확한다. 적절한 베타 신틸레이션 계수기를 이용하여 건조된 필터 매트(filter mat)를 계수한다.
폴리펩티드를 포함하는 웰로부터의 수치(count)를 배지만 포함한 웰과 통계적으로 비교한다 (그룹 당 12 웰). 비-모수(non-parametric) Mann-Whitney 검정을 이용한다. 동일한 통계 검정을 모든 대상에 대해 이용한다. 배지만 포함하는 웰과 폴리펩티드-자극된 웰 간의 통계적으로 유의한 차이를 폴리펩티드에 의한 PBMC's의 양성 자극으로 고려한다.
사이토카인 방출 분석
이 분석에서 이용되는 폴리펩티드는 소규모로 제조되었다 (대략 10mg 배치 크기(batch size), non-GMP). HPLC에 의해 각 폴리펩티드의 순도는 95% 이상이었다. 폴리펩티드 및 대조군 (음성 대조군은 배양 배지이고 양성 대조군은 포도상구균 장독소 B (staphylococcal enterotoxin B: SEB) 25 ng/ml 및 총 알터나리아 알레르겐 추출물 100 ㎍/ml이었음)을 포함하는 96 웰 배양 플레이트를 미리 준비하고 분석일 전에 -20℃에 저장하였다. 폴리펩티드를 200 ㎍/ml의 농도로 폴리펩티드를 포함하는 100 ㎕의 부피로 웰에 첨가하여, 후속의 100 ㎕의 세포 첨가가 100 ㎍/ml의 최종 분석 농도를 만들도록 하였다.
Ficoll 밀도 구배 원심분리에 의해 헤파린 처리된(heparinised) 혈액으로부터 말초 혈액 단핵 세포 (Peripheral blood mononuclear: PBMC)를 분리하였다. 그 후, 5x106 cell/ml PBMC 현탁액 중 100 ㎕의 분취액을 각 웰에 첨가하고 이 플레이트를 가습된 5% CO2 인큐베이터에 37℃에서 5일 동안 두었다. 자극 후, 멀티플렉스 비드 분석(multiplex bead assay)에 의한 시험을 위하여 배양 상층액 (100 ㎕)을 수집하였다.
멀티플렉스 사이토카인 비드 분석 (IL-10, IL-13, 인터페론 감마 (IFN-g))을 제조사의 지시에 따라 해동된 배양 상층액에서 수행하였다. 각 배양 상층액 시료에 대해 단일 측정(single measurement)을 수행하였다. 멀티플렉스 분석의 완료 후, 이 분석에서 생성된 표준 곡선으로부터 개별 사이토카인 수준을 보간법(interpolation)에 의해 결정하였다. IL-13, IL-10 및 IFN-g 분석 중 하나 이상에서 50 pg/ml를 초과하는 사이토카인 방출로 긍정적인 결과를 얻었다. 3개의 사이토카인에 대해 각 폴리펩티드별로 시험된 50명의 알레르기성 대상자 중 응답자의 수를 계산하였다.
표 6의 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 결과가 표 8에 요약되어 있다.
폴리펩티드 응답자 % 폴리펩티드 응답자 %
Cla16 36 Cla29 48
Cla25A 44 Cla35 34
Cla26 44 Cla35A 48
또한, 각 폴리펩티드에 대하여 100 pg/ml을 초과하는 IFN-g 방출을 나타내는, 시험된 50명의 곰팡이 알레르기성 대상자 중 응답자의 수를 계산하였다. 표 6의 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 결과가 표 9에 요약되어 있다.
폴리펩티드 응답자 % 폴리펩티드 응답자 %
Cla16 16 Cla29 28
Cla25A 22 Cla35 28
Cla26 28 Cla35A 42
클라도스포리움으로부터 유래된 서열을 포함하는 5개의 모든 폴리펩티드 (Cla16, Cla25A, Cla26, Cla29, 및 Cla35의 서열)이 이 집단에서 반응을 나타내었다. Cla35A의 서열을 갖는 폴리펩티드는 Cla35의 서열을 갖는 폴리펩티드에 비해 증가된 반응을 제공하였고 최고-성능(top-performing)의 클라도스포리움-유래 폴리펩티드였으며, 또한 IFN-g (방출 >100 pg/ml) 응답자의 가장 높은 비율을 가졌다. Cla35 또는 Cla35A의 서열을 갖는 폴리펩티드는 클라스도포리움 알레르기의 치료 또는 예방을 위해 바람직하다. 기타의 최고 성능 클라도스포리움-유래 폴리펩티드는 Cla26 및 Cla25A의 서열을 갖는 것을 포함하였다. 그러므로, 이들 서열 중 어느 하나를 갖는 폴리펩티드는 또한 클라도스포리움 알레르기의 치료 또는 예방을 위해 바람직하다.
또한, 클라스도포리움 알레르겐의 대응 영역과 상동성을 갖는 서열인, 알터나리아 알레르겐으로부터 유래된 서열을 갖는 수 개의 폴리펩티드가 이 집단에서 시험되고 반응을 나타내었다. IL-13, IL-10 및 IFN-g 분석 중 하나 이상에서 50 pg/ml을 초과하는 사이토카인 방출로 긍정적인 결과를 얻었다. 3개의 사이토카인에 대해 각 폴리펩티드별로 시험된 50명의 곰팡이 알레르기성 대상자 중 응답자의 수를 계산하였다. 결과가 하기 표 10에 표시된다.
폴리펩티드 응답자 % 폴리펩티드 응답자 %
Alt13A 86 Alt24 34
Alt14 44 Alt24A 40
Alt14A 56 Alt24B 30
Alt15 56 Alt24C 36
Alt15A 42 Alt28 52
Alt20 38
Alt21 38
Alt23 40
표시된 바와 같이, 최고 성능의 알터나리아-유래 폴리펩티드는 Alt13A의 서열을 갖는다. 기타의 최고 성능 알터나리아-유래 폴리펩티드는 Alt14, Alt14A, Alt15, Alt15A 및 Alt28의 서열을 갖는 것을 포함한다. 이들 폴리펩티드는 대상자 중 높은 비율에서 긍정적인 반응을 유도하고 따라서, 집단 커버리지(coverage)의 측면에서 유리하다. 클라스도포리움 및/또는 알터나리아 알레르기의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 폴리펩티드 조합에서, 하나 이상의 이들 폴리펩티드는 바람직하게는 전술된 클라도스포리움-유래 펩티드와의 조합으로 포함될 수 있다.
실시예 8 - 펩티드, 염 및 약제학적 제제의 제조
펩티드는 하기와 같이 제조된다. 합성은 고체상 펩티드 합성 (SPPS) 반응기에서 수행되고 N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 중 치환된 레진을 현탁함으로써 시작한다. 이 레진을 DMF로 세척한 후, 각 결합 과정은 DMF 중 N-[(1H-벤조트리아졸-1-일)(디메틸아미노)메틸렌]-N-메틸메탄아미늄 테트라플루오로보레이트 N-옥사이드 (TBTU) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA) 또는 메틸렌 클로라이드 (DCM) 및 DMF의 혼합물 중 디이소프로필카르보디이미드 (DIC) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt)의 존재하에 선행하는 아미노산에의 N-α-보호된 아미노산 유도체 또는 N-α-보호된 디펩티드의 첨가에 의해 수행된다. 각 단일 단계에 있어서, 용매 및/또는 시약을 첨가하고 반응 혼합물을 교반한 후 여과하여 레진으로부터 용매 및/또는 시약을 제거한다.
각각의 성공적인 결합 또는 캡핑(capping) 과정 후, Fmoc-탈보호 과정이 수행된다. 그것은 DMF에 의한 레진의 세척, DMF 또는 1-메틸-2-피롤리돈 (NMP) 중 20% (V/V) 피페리딘에 의한 Fmoc-그룹의 절단, 및 뒤이은 DMF 및 이소프로판올 (IPA)에 의한 세척으로 이루어진다. 각 단일 단계에 있어서, 용매 및/또는 시약을 첨가하고 반응 혼합물을 교반한 후 여과하여 레진으로부터 용매 및/또는 시약을 제거한다.
레진이 요구되는 펩티드의 완전한 펩티드 서열을 운반할 때까지, Fmoc-탈보호 및 결합 과정을 반복한다. SPPS는 최종 Fmoc-탈보호 및 감압하에서의 펩티드 레진의 건조에 의해 완료된다.
명시된 펩티드의 아세테이트 또는 히드로클로라이드 염을 하기 방법에 의해 제조한다. 펩티드 레진을 실온에서 1.5 내지 3시간 동안 1,2-에탄디티올 (EDT), 트리이소프로필실란 (TIS), 및 물의 존재하에 냉(cold) 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 처리한다. 여과(filtering off) 및 TFA에 의한 레진의 세척 후, 생성물을 냉 디이소프로필 에테르 (IPE) 중에 침전시킨다. 그 후, 여과하고, IPE에 의해 세척하고, 감압하에서 건조시킨다. 그 후 생성물을 제구성하고 고-성능 액체 크로마토그래프 (HPLC)에 의해 정제한다.
아세테이트 염의 제조에 있어서, 트리플루오로아세테이트 염을 5% (V/V) 아세트산 수용액 중에 재구성하고 이온 교환 레진 상으로 로딩한다. 5% (V/V) 아세트산 수용액에 의해 용리 과정(elution)을 수행한다. 아세테이트를 0.2 ㎛ 멤브레인 필터를 통해 여과하고 동결 건조하여 최종 생성물을 백색 내지 오프-화이트(off-white) 분말로 수득한다.
히드로클로라이드 염의 제조에 있어서, 트리플루오로아세테이트 염을 정제 수 중 0.01 M HCl에서 재구성하고 필요한 경우 여과한다. 히드로클로라이드 염으로의 이온 교환을 위해 용액을 예비 HPLC 컬럼 상으로 로딩한다. 이 컬럼을 0.1 M 암모늄 클로라이드 용액 및 그 후 0.01 M HCl에 의해 세척함으로써 이온 교환을 수행한다. 그 후, 히드로클로라이드를 0.2 ㎛ 멤브레인 필터를 통해 여과하고 동결 건조하여 최종 생성물을 백색 내지 오프-화이트 분말로 수득한다.
본 발명의 예시적인 약제학적 제제는 폴리펩티드 Cla35, Cla16, Cla25, Cla26 및 Cla29 중 하나 이상, 예를 들면, 2개, 3개, 4개 또는 전부를 염 형태로 포함한다. 폴리펩티드 Cla35A는 Cla35를 대신하여 이용될 수 있다. 폴리펩티드 Cla25A는 Cla25를 대신하여 이용될 수 있다. 통상적으로 펩티드 염은 아세테이트 또는 히드로클로라이드 염이다. 펩티드 염(들)은 통상적으로 40 내지 220 μM의 이론상(nominal) 농도로 각각 존재한다. 선택적으로, 이 약제학적 제제는 하나 이상의 L-메티오닌을 항산화제로 더 포함한다 (선택적으로 1 내지 15 mM의 이론상 농도로, 통상적으로 5 mM); pH 조정을 위하여 인산, 염산 또는 암모니아 수용액 (요구될 경우); 및 긴장성 제제(tonicity agent)로 트레할로스 디히드레이트 (선택적으로 260 mM의 이론상 농도로). 이 약제학적 제제는 동결 건조물을 제조하기 위하여 동결-건조가 수행되기 전 용액 중에서 제조된다.
<110> Circassia Ltd <120> CLADOSPORIUM PEPTIDES FOR VACCINE <130> PM031214 <150> GB 1209862.0 <151> 2012-06-01 <160> 57 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 1 Ala Glu Val Tyr Gln Lys Leu Lys Ser Leu Thr Lys Lys Arg Tyr Gly 1 5 10 15 Gln Ser <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 2 Glu Ala Gly Tyr Thr Gly Gln Ile Lys Ile Ala Met Asp Val Ala Ser 1 5 10 15 Ser Glu Phe Tyr Lys 20 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 3 Lys Asp Ser Phe Ala Ala Gly Trp Gly Val Met Val Ser His Arg Ser 1 5 10 15 Gly Glu Thr Glu Asp Val 20 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 4 Ile Ala Asp Ile Val Val Gly Leu Arg Ala Gly Gln Ile Lys Thr Gly 1 5 10 15 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 5 Met Ala Val Ala Lys Ala Ala Ala Ala 1 5 <210> 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Val Tyr Gln Lys Leu Lys Ser Leu Thr Lys Lys 1 5 10 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 32 Val Ala Ile Thr Tyr Ala Ser Arg Ala Gln Gly Ala Glu 1 5 10 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 33 Gly His His Phe Lys Glu Arg Gly Thr Gly Ser Leu Val Ile Thr 1 5 10 15 <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 34 Ala Asn Tyr Thr Gln Thr Lys Thr Val Ser Ile Arg Leu 1 5 10 <210> 35 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 35 Gly Gly Tyr Lys Ala Ala Val Arg Pro Thr Met Leu Glu 1 5 10 <210> 36 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (11) <223> Xaa = Nle <400> 36 Gly Gly Tyr Lys Ala Ala Val Arg Pro Thr Xaa Leu Glu 1 5 10 <210> 37 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 37 Gly Leu Phe Ile Ser Thr Gly Thr Gln 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peptide <400> 43 Leu Ala Ile Thr Tyr Asn Ser Arg Ala Glu Gly Ala Glu Lys 1 5 10 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 44 Gly Leu His Phe Arg Glu Arg Lys Thr Gly Ser Leu Val Ile Thr 1 5 10 15 <210> 45 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 45 Asn Glu Trp Arg Asp Phe Ala Arg Val Asn Ser Ile Ser Pro 1 5 10 <210> 46 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 46 Lys Leu Trp His Ser Met Ile Pro Met Gly Arg Asp Ala Lys 1 5 10 <210> 47 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> Xaa = Nle <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> Xaa = Nle <400> 47 Lys Leu Trp His Ser Xaa Ile Pro Xaa Gly Arg Asp Ala Lys 1 5 10 <210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> Xaa = Nle <400> 48 Lys Leu Trp His Ser Xaa Ile Pro Met Gly Arg Asp Ala Lys 1 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peptide <400> 54 Leu Ala Ile Thr Tyr Asn Ser Arg Ala Glu Gly Ala Glu 1 5 10 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 55 Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu 1 5 10 15 <210> 56 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 56 Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 1 5 10 <210> 57 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 57 Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg 1 5 10 15

Claims (28)

  1. 30개 이하의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고 하기를 포함하는 폴리펩티드, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염:
    (I) 아미노산 서열:
    (a) GGYKAAVRPTMLE (서열번호 35; Cla35),
    (b) AEVYQKLKSLTKK (서열번호 31; Cla16),
    (c) VAITYASRAQGAE (서열번호 32; Cla25),
    (d) GHHFKERGTGSLVIT (서열번호 33; Cla26), 또는
    (e) ANYTQTKTVSIRL (서열번호 34; Cla29); 또는
    (Ⅱ) 6개 이하의 아미노산 변형을 갖는 상기 아미노산 서열 (I)로서, 각 변형은 독립적으로 결실, 치환 또는 삽입인 것인, T 세포 에피토프-포함 변이체(variant) 서열.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드는 1개 또는 2개의 아미노산 변형을 갖는 상기 변이체 서열 (Ⅱ)을 포함하고, 상기 변형 또는 각 변형은 독립적으로 결실 또는 치환인 것인 폴리펩티드 또는 염.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 치환 또는 각 치환은 보존적 치환(conservative substitution)인 것인 폴리펩티드 또는 염.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드는 N-말단으로부터 2개 이하의 아미노산이 결실되고 및/또는 C-말단으로부터 2개 이하의 아미노산이 결실된 상기 변이체 서열 (Ⅱ)을 포함하는 것인 폴리펩티드 또는 염.
  5. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 20개 이하의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는 것인 폴리펩티드 또는 염.
  6. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는, 상기 서열 (I)이 유래된 단백질의 원형(native) 서열 중 상기 서열 (I)의 바로 N-말단 또는 C-말단에 있는 1개 내지 6개의 아미노산에 각각 대응하는 1개 내지 6개 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단 연장부(extension)를 갖는 상기 서열 (I) 또는 (Ⅱ)로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 것인 폴리펩티드 또는 염.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 서열 (I), VAITYASRAQGAEK (서열번호 30; Cla25A) 및 GGYKAAVRPT-Nle-LE (서열번호 36; Cla35A)로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인 폴리펩티드 또는 염.
  8. 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 및 30개 이하의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고 하기를 포함하는 폴리펩티드, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약제학적 제제:
    (I) 아미노산 서열:
    (a) GGYKAAVRPTMLE (서열번호 35; Cla35),
    (b) AEVYQKLKSLTKK (서열번호 31; Cla16),
    (c) VAITYASRAQGAE (서열번호 32; Cla25),
    (d) GHHFKERGTGSLVIT (서열번호 33; Cla26), 또는
    (e) ANYTQTKTVSIRL (서열번호 34; Cla29); 또는
    (Ⅱ) 6개 이하의 아미노산 변형을 갖는 상기 아미노산 서열 (I)로서, 각 변형은 독립적으로 결실, 치환 또는 삽입인 것인, T 세포 에피토프-포함 변이체 서열.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 폴리펩티드는 1개 또는 2개의 아미노산 변형을 갖는 상기 변이체 서열 (Ⅱ)을 포함하고, 상기 변헝 또는 각 변형은 독립적으로 결실 또는 치환인 것인 약제학적 제제.
  10. 청구항 8 또는 9에 있어서, 상기 치환 또는 각 치환은 보존적 치환인 것인 약제학적 제제.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 폴리펩티드는 N-말단으로부터 2개 이하의 아미노산이 결실되고 및/또는 C-말단으로부터 2개 이하의 아미노산이 결실된 상기 변이체 서열 (Ⅱ)을 포함하는 것인 약제학적 제제.
  12. 청구항 8 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 20개 이하의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는 것인 약제학적 제제.
  13. 청구항 8 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는, 상기 서열 (I)이 유래된 단백질의 원형 서열 중 상기 서열 (I)의 바로 N-말단 또는 C-말단에 있는 1개 내지 6개의 아미노산에 각각 대응하는 1개 내지 6개 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단 연장부를 갖는 상기 서열 (I) 또는 (Ⅱ)로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 것인 약제학적 제제.
  14. 청구항 8에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 서열 (I), VAITYASRAQGAEK (서열번호 30; Cla25A) 및 GGYKAAVRPT-Nle-LE (서열번호 36; Cla35A)로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인 약제학적 제제.
  15. 청구항 8 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 상기 폴리펩티드 또는 그의 염을 포함하는 것인 약제학적 제제.
  16. 청구항 15에 있어서,
    아미노산 서열 (I)(a) 또는 그로부터 유래된 상기 변이체 서열 (Ⅱ)를 갖는 폴리펩티드, 또는 그의 염;
    아미노산 서열 (I)(b) 또는 그로부터 유래된 상기 변이체 서열 (Ⅱ)를 갖는 폴리펩티드, 또는 그의 염;
    아미노산 서열 (I)(c) 또는 그로부터 유래된 상기 변이체 서열 (Ⅱ)를 갖는 폴리펩티드, 또는 그의 염;
    아미노산 서열 (I)(d) 또는 그로부터 유래된 상기 변이체 서열 (Ⅱ)를 갖는 폴리펩티드, 또는 그의 염; 및
    아미노산 서열 (I)(e) 또는 그로부터 유래된 상기 변이체 서열 (Ⅱ)를 갖는 폴리펩티드, 또는 그의 염을 포함하는 것인 약제학적 제제.
  17. 청구항 8 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 30개 이하의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고 하기를 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 더 포함하는 것인 약제학적 제제:
    (Ⅲ) 아미노산 서열:
    (f) GWGVMVSHRSGET (서열번호 39; Alt14);
    (g) GYTGKIKIAMDVASSE (서열번호 41; Alt15), 또는
    (h) WSWKIGPAIATGNT (서열번호 50; Alt28); 또는
    (Ⅳ) 5개 이하의 아미노산 변형을 갖는 상기 아미노산 서열 (Ⅲ)로서, 각 변형은 독립적으로 결실, 치환 또는 삽입인 것인, T 세포 에피토프-포함 변이체 서열.
  18. 청구항 8 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 용기 내에 밀봉되어 있는 것인 약제학적 제제.
  19. 청구항 8 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 용액 또는 동결 건조물(lyophilisate)인 것인 약제학적 제제.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 용액은 피내 투여, 피하 투여, 경구 투여, 비강 투여, 국소 투여, 설하 투여, 구강(buccal) 투여 또는 표피(epidermal) 투여를 위해 제제화되는 것인 약제학적 제제.
  21. 청구항 19 또는 20에 있어서, 상기 용액은 앰플(ampoule), 밀봉 바이알(sealed vial), 주사기, 카트리지, 가요성 백(flexible bag) 또는 유리병 중에 제공되는 것인 약제학적 제제.
  22. 청구항 19에 있어서, 상기 동결 건조물은 밀봉 바이알 중에 제공되는 것인 약제학적 제제.
  23. 클라도스포리움(Cladosporium) 및/또는 알터나리아(Alternaria)에 대한 알레르기를 치료 또는 예방하는 방법에서 이용하기 위한, 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 염, 또는 청구항 8 내지 22 중 어느 한 항에 따른 약제학적 제제.
  24. T 세포가 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에서 정의된 폴리펩티드 또는 염을 인식하는지 여부를 결정하는 인 비트로 방법으로서, 상기 방법은 상기 T 세포를 상기 폴리펩티드 또는 염과 접촉시키는 단계 및 상기 T 세포가 상기 폴리펩티드 또는 염에 의해 자극되는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, 개체가 클라도스포리움 및/또는 알터나리아에 대한 알레르기를 갖거나, 또는 가질 위험이 존재하는지 여부를 결정하기 위해 수행되는 것인 방법.
  26. 개체에서 클라도스포리움 및/또는 알터나리아에 대한 알레르기를 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 개체에 치료적 또는 예방적 유효량의 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에서 정의된 폴리펩티드 또는 염, 또는 청구항 8 내지 22 중 어느 한 항에서 정의된 약제학적 제제를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  27. 클라도스포리움 및/또는 알터나리아에 대한 알레르기의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한, 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에서 정의된 폴리펩티드 또는 염의 용도.
  28. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에서 정의된 하나 이상의 폴리펩티드 또는 염을 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 혼합하는 단계를 포함하는, 약제학적 제제를 제조하는 방법.
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