JP6813359B2 - 新規コナヒョウヒダニタンパク質 - Google Patents

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Description

本発明は、コナヒョウヒダニに由来する新規なタンパク質、及び該タンパク質の利用に関する。
アレルギー疾患の代表的なものとして、花粉症等のアレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性気管支喘息、アトピー性皮膚炎等が挙げられるが、近年、日本におけるこれらアレルギー疾患の罹患率は増加の一途を辿っている。アトピー性気管支喘息やアトピー性皮膚炎の発症原因の多くはダニの虫体、ダニの排泄物、カビ、ペット等動物の毛などを含むハウスダストによるものが知られているが、特に屋内に生息するチリダニ由来のアレルゲンが重要な役割を果たしていることが知られている。（非特許文献１）。
屋内に生息する代表的なチリダニの殆どはコナヒョウヒダニ（Dermatophagoides Farinae、以下「Der f」と略す））およびヤケヒョウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus、以下「Der p」と略す） ）で構成されている。これらのチリダニは温暖かつ湿潤条件で最もよく繁殖することが知られているが、高気密化、高断熱化された建物が増えた現代、一年中室内がチリダニに適した条件に保たれる機会が増え、その生息数は増大している。これが、アレルギー疾患の増加の原因の一因と考えられている。
これらアレルギー疾患の治療には、抗ヒスタミン薬、ステロイド系抗炎症薬、抗ロイコトリエン薬、脱顆粒阻害薬、Ｔｈ２サイトカイン阻害薬等が用いられるが、いずれも対症療法に留まる。しかしながら近年、皮下アレルゲン免疫療法（ＳＣＩＴ）や、舌下アレルゲン免疫療法（ＳＬＩＴ）をはじめとするアレルゲン免疫療法が相次いで開発されている。アレルゲン免疫療法は、アレルゲンを少量ずつ体内に投与することにより、アレルゲンに対する免疫応答を制御する治療法であり、現時点でアレルギー疾患を根治可能な唯一の方法と考えられている。
アレルゲン免疫療法の開発には、原因であるアレルゲンに関する研究と理解が欠かせない。たとえば日本で生息数が多いと言われているコナヒョウヒダニ虫体や排泄物からはDer f 1, Der f 2, Der f 3と呼ばれる抗原性の高いアレルゲンが報告され、既にクローニングされている（非特許文献２、３）。また過去の報告によれば、ダニアレルギーの患者８０％以上で、これらの抗原いずれか１種以上に特異的なIgEを有していることが知られている（非特許文献４）。その他にもコナヒョウヒダニアレルゲンの探索研究は活発に行われており、ダニを原因とするアレルギー疾患の予防や治療に対してより有用な新規アレルゲンタンパク質が求められている（非特許文献５）。
Korsgaard J, et al., Allergy, 53: 77-83, 1998 Dilworth RJ, et al., Clinical and Experimental Allergy, 21： 25-32, 1991 Yuuki T. et al., Jpn. J. Allegol., 39(6)：557-561, 1990 Heymann PW, et al., J. Allergy Clin. Immunol., 83：1055-1067, 1989 Thomas WR, et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 129： 1-18, 2002
本発明は、新規なコナヒョウヒダニタンパク質、及びそれを用いたコナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の診断薬、予防薬、及び治療薬等を提供することに関する。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく検討したところ、コナヒョウヒダニ排泄物中から、コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患患者由来の血清中IgEと高い反応性を示す、分子量110 kDa付近の新たなタンパク質を取得することに成功し、これがコナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の診断薬、予防薬、治療薬として有用であることを見出した。
すなわち、本発明は、以下の１）〜１４）に係るものである。
１）以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるコナヒョウヒダニタンパク質又はその断片ペプチド。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つコナヒョウヒダニアレルゲン活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つコナヒョウヒダニアレルゲン活性を有するタンパク質。
２）以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるコナヒョウヒダニタンパク質又はその断片ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つコナヒョウヒダニアレルゲン活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つコナヒョウヒダニアレルゲン活性を有するタンパク質。
３）以下の（ｄ）〜（ｆ）から選択されるポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、コナヒョウヒダニアレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｆ）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つコナヒョウヒダニアレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
４）上記１）のコナヒョウヒダニタンパク質又はその断片ペプチドを有効成分とするコナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤。
５）上記１）のコナヒョウヒダニタンパク質又はその断片ペプチドを有効成分とするコナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の診断薬。
６）上記１）のコナヒョウヒダニタンパク質又はその断片ペプチドに結合する結合タンパク質。
７）抗体分子である上記６）の結合タンパク質。
８）モノクローナル抗体である上記６）の結合タンパク質
９）コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤を製造するための、上記１）のコナヒョウヒダニタンパク質又はその断片ペプチドの使用。
１０）コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の診断薬を製造するための、上記１）のコナヒョウヒダニタンパク質又はその断片ペプチドの使用。
１１）コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の予防又は治療に使用するための、上記１）のコナヒョウヒダニタンパク質又はその断片ペプチド。
１２）コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の診断に使用するための、上記１）のコナヒョウヒダニタンパク質又はその断片ペプチド。
１３）上記１）のコナヒョウヒダニタンパク質又はその断片ペプチドを患者に投与する、コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の予防又は治療方法。
１４）上記１）のコナヒョウヒダニタンパク質又はその断片ペプチドを、被験者に投与する、コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の診断方法。
本発明のコナヒョウヒダニタンパク質は、コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患患者由来の血清中IgEと高い反応性を示すことから、コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の診断、予防、及び治療に利用することができる。当該コナヒョウヒダニタンパク質は、公知のコナヒョウヒダニアレルゲン、特にDer f 1(分子量 約27kDa)、Der f 2(分子量 約15kDa)、Der f 3(分子量 約29kDa)とは異なるタンパク質であることから、これらと組み合わせることによって、より有用なアレルゲン免疫療法が可能となる。
コナヒョウヒダニ粗抽出液及び粗精製物（FPLCを用いた陰イオン交換クロマトで分画）をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で解析した図である。 コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患患者(RAST Score≧2)５名の血清を用いた精製アレルゲン特異的IgE抗体価の分析結果を示す図である。 コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー患者疾患（２名）の末梢血を用いたアレルゲン活性評価（好塩基球上のCD203c発現増強）の結果を示す図である。図中パーセンテージは、解析対象細胞中のP4ゲート内ポピュレーションを示す。
コナヒョウヒダニタンパク質
本発明のコナヒョウヒダニタンパク質は、以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるタンパク質、又はその断片ペプチドである。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つコナヒョウヒダニアレルゲン活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つコナヒョウヒダニアレルゲン活性を有するタンパク質。
（ａ）の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、コナヒョウヒダニから、FPLCを用いた陰イオン交換クロマトにて分画後、限外濾過法により、100kDa以下の蛋白を除去することによりを行うことにより分離・精製されたタンパク質で、以下の性質を有する。
i）コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患患者の血清中IgEと結合反応を示す。
ii）コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患患者の好塩基球を活性化する。
iii）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で測定した分子量は、約110kDaである。
従って、当該タンパク質は、Der f 1(分子量 約27kDa)、Der f 2(分子量 約15kDa)、Der f 3(分子量 約29kDa)をはじめとした公知のコナヒョウヒダニアレルゲンとは異なる（非特許文献５）、新規なコナヒョウヒダニタンパク質である。
本発明のコナヒョウヒダニタンパク質には、コナヒョウヒダニアレルゲン活性を有する限り、当該配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質（上記（ｂ））が包含される。このようなアミノ酸配列からなるコナヒョウヒダニタンパク質としては、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するコナヒョウヒダニタンパク質のアイソフォーム等が挙げられる。ここで、欠失、置換又は付加される数個のアミノ酸とは、例えば１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸を意味する。また、上記の付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
本明細書中、「アレルゲン」とはアレルギー疾患を引き起こす原因物質のことをいう。また、「コナヒョウヒダニアレルゲン活性」とは、肥満細胞上のIgEと結合し、アトピー性のヒトに即時型アレルギー反応を引き起こす活性（De Weck, AL. et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 146:177-189, 2008）のみならず、単に血清中のIgEと結合する活性が包含される（実施例２(i)参照）。
また、本発明のコナヒョウヒダニタンパク質には、コナヒョウヒダニアレルゲン活性を有する限り、配列番号２で示されるアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するタンパク質からなるタンパク質（（上記（ｃ））が包含される。
ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性は、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上である。当該アミノ酸配列の同一性は、例えばBLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information）を使用し、オプションパラメータを初期設定値で計算する方法が適用できる。
また、本発明のコナヒョウヒダニタンパク質は、融合タンパク質のような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。ここで、融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組み換え生産の際の安定性を確保する付加配列等が挙げられる。
本発明のコナヒョウヒダニタンパク質は、アレルゲン活性に必須な領域のみの断片ペプチドであってもよい。例えば、特にコナヒョウヒダニを原因とするアレルギー患者疾患のＴ細胞によって特異的に認識されるエピトープ（Ｔ細胞エピトープ）を含む部分断片が好適に挙げられる。ＨＬＡクラスＩＩ分子と結合して抗原に提示されるペプチドの長さは、ペプチド解析の結果（Chicz, R.M. et al., J. Exp. Med., 178: 27-47, 1993）から、およそ１０〜３４のアミノ酸残基からなるものと考えられるため、少なくともＴ細胞エピトープを１つ含む断片は、このような長さのペプチドも含まれる。
Ｔ細胞エピトープは10mer〜20mer程度のオーバーラッピングペプチドを用いた検討、例えばJahn-Schmid B.J. et al., Allergy Clin Immunol. 126(5):1068-71, 2010や， Sone, T, et al., J. Immunol., 161: 448-457, 1998等に記載の方法で同定可能である。
コナヒョウヒダニタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、上記コナヒョウヒダニタンパク質又はその断片ペプチドをコードするものであり、好適には、（ｄ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ｅ）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つコナヒョウヒダニアレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（ｆ）配列番号１に示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つコナヒョウヒダニアレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
（ｅ）及び（ｆ）のポリヌクレオチドには、（ｄ）のポリヌクレオチドの変異体が含まれる。当該変異体には、天然の対立遺伝子変異体や、当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る天然に存在しない変異体が包含される。
本発明のポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各種１本鎖ＤＮＡやＲＮＡをも包含する。アンチセンス鎖は、プローブ等として利用可能である。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明にかかるポリヌクレオチドは、本発明にかかるポリペプチドをコードする塩基配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの塩基配列を含むものであってもよい。
ここで、ストリンジエントな条件とは、例えばMolecular Cloning:A Laboratory Manual (Second Edition, J.Sambrook et.al, 1989)に記載の条件等が挙げられる。すなわち、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。
また、配列番号１で示される塩基配列との同一性は、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上である。当該塩基配列の同一性は、例えばBLASTを使用し、オプションパラメータを初期設定値で計算する方法が適用できる。
コナヒョウヒダニタンパク質をコードするポリヌクレオチドの取得
本発明のコナヒョウヒダニタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、コナヒョウヒダニからクローン化することができ、クローニング方法としては、既知の手段、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いて行う方法が挙げられる。
例えば、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、当該プローブを用いてゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーに対してスクリーニングを行えばよい。このようなプローブとしては、本発明にかかるポリヌクレオチドまたはその相補鎖の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いかなる配列および長さのものを用いてもよい。
また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの一部又は全部を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列を適当な原理を用いて取得することにより得ることもできる。例えば、上記の本発明のポリヌクレオチドの一部を含むポリヌクレオチドをプライマーとして用いて行うＰＣＲ法、上記の本発明のポリヌクレオチドの一部を含むポリヌクレオチドをプローブとして用いる方法が挙げられる。
例えば、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法は、本発明のポリヌクレオチドの５'側および３'側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等の増幅反応を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、当該ポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。
また、本発明で提供するポリヌクレオチドは、例えば、計画的な若しくはランダムな変異導入法等の方法により、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを改変することにより作製することもできる。
ここで、計画的に変異を導入する際の変異の計画は、例えば、ポリヌクレオチド配列上の特徴的な配列を参酌することにより行うことができる。また、ランダムに変異を導入する方法としては、例えば、ＰＣＲ法、変異原処理による方法が挙げられる。計画的に変異を導入する方法としては、部位特異的突然変異誘発法が挙げられ、より具体的には、例えばSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット（タカラバイオ）等を用いて行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ法(PCR protocols, Academic Press, New York,1990)を用いることもできる。
コナヒョウヒダニタンパク質の製造
本発明のコナヒョウヒダニタンパク質は、コナヒョウヒダニから分離精製することにより得ることができる。分離精製方法は特に限定されるものではないが、例えば、コナヒョウヒダニ抽出液をゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、等の従来公知の手法を用いて分離・精製すればよい。
また、適当なベクターに本発明のポリヌクレオチドを組み込むことにより作製された組換えベクターを宿主細胞に導入して、コナヒョウヒダニタンパク質を細胞内或いは細胞外に発現させて、採取することが可能である。
本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、大腸菌、枯草菌等の細菌、酵母又は動物細胞等の宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。発現ベクターの構築に用いられるベクターDNAは、広く普及した入手の容易なものが用いられる。例えば、pUC19（タカラバイオ）、pTV118N（タカラバイオ）、pMAMneo（クロンテック）、pGEX（GEヘルスケア）、pET160（Invitrogen）、pDEST（Invitrogen）等が挙げられる。
当該組換えベクターを用いて宿主を形質転換するには、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。宿主としては特に制限されず、あらゆるものを用いることができ、例えば、動物、動物由来の細胞、植物、植物由来の細胞、微生物等を用いることができる。
得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。斯くして得られた培養液から、一般的な方法によってタンパク質の採取、精製を行い、本発明のコナヒョウヒダニタンパク質を得ることができる。
コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の予防又は治療
本発明のコナヒョウヒダニタンパク質又はその断片ペプチドは、コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患患者由来の血清中IgEと高い反応性を示すことから、コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤となり得、患者に投与してコナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の予防又は治療に使用することができる。
ここで、コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の予防又は治療とは、具体的には、コナヒョウヒダニの特異抗原が原因となるあらゆるアレルギー疾患に対する予防又は治療をいい、当該アレルギー疾患としては、例えばアトピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎等が挙げられる。
当該コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の予防又は治療は、例えば、コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患に対するアレルゲン免疫療法が挙げられる。
また、本発明のコナヒョウヒダニタンパク質は、従来公知のDer f 1、Der f 2をはじめとしたアレルゲンとは異なるタンパク質であることから、これらと組み合わせることによって、より有用なアレルゲン免疫療法が可能となる。
本発明のコナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤をアレルゲン免疫療法剤として用いる場合、コナヒョウヒダニタンパク質、又はその断片ペプチドをそのまま、或いは乾燥して粉末状とし、又は必要に応じて一般的に用いられる各種の添加剤、例えば安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を常法により添加した配合剤として調製されるのが好ましい。
例えば、粉末状の精製されたコナヒョウヒダニタンパク質を、フェノールを添加した生理食塩水に溶解し、アレルゲン免疫療法用抗原の原液として用いることができる。
本発明のコナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤をアレルゲン免疫療法剤として用いる場合、投与に際しては免疫賦活作用を持つアジュバントを含むことができる。アジュバントとしては例えば、Complete Freund's adjuvant（CFA）、Incomplete Freund's adjuvant（IFA）、ミョウバン、Lipid Ａ 、モノホスホリルリピドＡ 、BCG（Bacillus-Calmette-Guerrin）等の細菌製剤、CpG-DNA、dsRNA等の核酸、ツベルクリン等の細菌成分製剤、キーホールリンペットヘモシアニンや酵母マンナン等の天然高分子物質、ムラミルトリペプチドまたムラミルジペプチドまたはそれらの誘導体、アラム（alum）、非イオン性ブロックコポリマー、インターロイキン2（IL-2）やGranulocyte Macrophage colony stimulating Factor（GM-CSF）、インターフェロン−α（IFN-α）、インターフェロン−β（IFN-β）等のサイトカイン、等を挙げることができ、これらの１種又は２種以上を組合せて用いることができる。アジュバントは本発明のコナヒョウヒダニタンパク質、又はその断片ペプチドと混和状態、またはエマルジョンとして同時に投与して用いてもよい。
本発明のコナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤は、通常の投与経路例えば経皮、経粘膜、経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、点鼻等の投与方法により行うことができる。投与形態に合わせて、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ、舌下錠、シロップ剤、注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤、鼻腔内噴霧剤、湿布剤、パップ剤、軟膏、ローション、クリーム等の各種剤形の製剤として調製され得る。
本発明のコナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤の投与量及び投与回数は、投与経路、症状などに応じて異なるが、例えば、１投与量あたり約0.1μg〜100ｍgの範囲となるように適宜選択し、毎週１回から数回程度投与することができる。
コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の診断
本発明のコナヒョウヒダニタンパク質又はその断片ペプチドは、コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患診断薬、具体的にはコナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患に対する皮内反応診断薬となり得、その少量を被験者の皮内に注射することにより、生体のコナヒョウヒダニに対するアレルギー状態や免疫状態を把握し、抗原の確定や疾患の診断に用いることができる。
皮内反応診断試薬として用いる場合、前記の方法により取得された本発明のコナヒョウヒダニタンパク質又はその断片ペプチドを、例えば乾燥して粉末状とし、これを、フェノールを含む生理食塩水に溶解し、希釈して用いられる。
コナヒョウヒダニタンパク質又はその断片ペプチドに結合する結合タンパク質
本発明のコナヒョウヒダニタンパク質又はその断片ペプチドに結合する結合タンパク質は、本発明のコナヒョウヒダニタンパク質又はその断片ペプチドと特異的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質としては、例えば免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹなど）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体など（Carter, PJ., Nat. Rev. Immunol., 6： 343-357, 2006）の抗体分子、Ａｆｆｉｂｏｄｙ、ＤＡＲＰｉｎｓ、Ａｖｉｍｅｒなどの抗体様分子が挙げられ、抗体分子としてはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体など）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
上記結合タンパク質は、種々の公知の方法を用いて作製することができ、作製方法は特に限定されるものではない。
上記結合タンパク質は、本発明のコナヒョウヒダニタンパク質を発現する生物体またはその組織もしくは細胞の同定などに利用することができる。例えば、大気中や屋内の空間またはヒトの粘膜におけるコナヒョウヒダニタンパク質の有無等を測定するために利用することができる。該測定は公知の免疫学的方法により行うことができ、例えばELISA法により行うことができる。
また、コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の治療にも使用することができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１ コナヒョウヒダニからのタンパク質の精製
長期間ダニを飼育した培地を加湿乾燥し、180μmのふるいを通した後、phosphate buffered saline（PBS）に分散させ、直ちに53μmの篩を通し、不溶物を除去した。排泄物を分散したPBSを37℃に2時間静置し、可溶性成分を抽出した。4℃、5,000rpmで30分間遠心して上清を分離し、分画分子量12,000-14,000の透析膜で2日間透析して低分子成分を除去した。これを、遠心濃縮器（ビバスピン20、MWCO 10kDa）を用いて濃縮し、粗抽出物を得た。
粗抽出物に10倍量の20mM Tris-HCl（pH9.0）を加えた後、陽イオンカラム（Vivapure S Maxi M）にアプライし、遠心（500g、5分）後、溶出画分を回収した。溶出画分を陰イオンクロマト（Uno Q 1mL、Bio-Rad）にアプライし、0〜1 MのNaClグラジエントで溶出させた。目的蛋白質を含む分画を回収し、遠心濃縮器（ビバスピン6、MWCO 100kDa）を用いて低分子画分を除去し、精製蛋白質を得た。精製蛋白質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で解析した結果を図１に示す。
実施例２ 精製抗原のアレルゲン活性確認
(i)コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患患者血清IgEとの反応性の確認
本発明タンパク質ないしは既知のダニ抗原（Der f1）20μg/mL溶液を調製し、Maxisorp 96 穴プレート（ヌンク）に1μg/50μL/wellとなるように添加後、一晩4℃で静置することにより抗原を固相化した。翌日プレートを洗浄後、1%牛血清アルブミン含有PBSを添加、1時間室温静置することでブロッキングを実施した。プレート洗浄後、5倍希釈した患者血清を添加し2時間室温静置させた。陰性対照として、市販のヒトAB型血清（CELLect(R) Human AB serum; MP Biomedicals）を用いた。プレート洗浄後、1%牛血清アルブミン含有PBSで7000倍希釈した2次抗体(HRP標識ヤギ抗ヒトIgE抗体、Novus)を添加して、40分間室温静置した。プレートを洗浄後、TMB Substrate Reagent Set (BD Biosciences)にてTMB発色を室温静置、遮光状態で20分間実施した。終了後、1N 硫酸を添加することで発色を停止させ、マイクロプレートリーダーにて波長450nmの吸光度を測定した。その結果を図２に示す。
(ii) コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患患者好塩基球の活性化
アレルゲンで刺激された好塩基球では、CD203cの発現が増強することが知られている（De Weck, AL. et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 146:177-189, 2008）。この原理に基づくAllergenicityキット(ベックマン・コールター)を用いて、患者血液中の好塩基球活性化を解析した。ヘパリン採血した全血100μLに本発明タンパク質アレルゲン溶液(最終濃度 1〜100ng/ml)20μLとCD3-PC7，CRTH2-FITC及びCD203c-PEを含む抗体カクテル20μLを加え、37℃で15分間インキュベートした。反応停止液100μLと溶血固定液2mLを加え、室温で10分間反応した。遠心(200 x g、5分)の後、上清を除去し、リン酸緩衝液(PBS) 3mLを加えて再び遠心した。上清を除去後、細胞を0.1%ホルムアルデヒド加PBSに懸濁し、フローサイトメーター(FACScanto、BD Biosciences)により測定した。得られたデータについて、CD3-PC7陰性かつCRTH2-FITC陽性であることを指標として血球の中の好塩基球を選別し、CD203cの発現強度を解析した。その結果を図３に示す。PBSのみの添加時に比べて、アレルゲン添加時におけるCD203cの発現増強が認められた。
実施例３ 塩基配列及びアミノ酸配列の決定
＜部分内部アミノ酸配列の決定＞
本発明タンパク質内部の部分アミノ酸配列を明らかにするために、プロテアーゼにより限定分解して得られる断片の解析を行った。精製タンパク50μgをSDS-PAGE後、分子量110kDaバンド付近のゲルを細断して、1mLの精製水中で攪拌・洗浄（20分×2回）した。300μLの7mol/Lグアニジン/ 0.5mol/L Tris-HCl / 0.01mol/L EDTA（pH8.5）及び10μLの2-メルカプトエタノールを添加し、窒素置換と超音波処理を行ってから、2時間室温静置することにより還元した。次に10μLの4-ビニルピリジンを添加し、窒素置換と超音波処理（1分）の後に、30分室温静置することによりアルキル化を行った。反応液を廃棄後、新たに1mLの0.1vol%トリフルオロ酢酸を加え、酸性であることを確認後、1時間攪拌した。溶液を廃棄し、1mLの0.025mol/L炭酸水素アンモニウム / 50vol%アセトニトリル中で攪拌（20分×2回）した。溶液を廃棄し、1mLのアセトニトリル中で5分間攪拌した後に溶液を廃棄し、遠心エバポレーターでゲルを減圧乾固した。0.025mol/L炭酸水素アンモニウムに溶解したリシルエンドペプチダーゼを酵素/基質比1/20で添加して、氷上で静置しゲルを１時間膨潤させた。0.025mol/L炭酸水素アンモニウムを追加してゲルに完全に溶液を浸透させてから、さらに37℃で17時間反応し、反応液を回収した（［1］液）。ペプチドを抽出するために、残ったゲルに100μLの0.1vol% トリフルオロ酢酸 / 50vol% アセトニトリルを添加して20分間攪拌後、抽出液を回収した（［2］液）。さらに100μLのアセトニトリル中で20分間攪拌後、抽出液を回収した（［3］液）。［1］〜［3］液を混合して減圧濃縮した後、逆相の高速液体クロマトグラフィー（XBridge C18）にかけ、アセトニトリル0〜80重量%のグラジエントで溶出・分画した。メジャーなペプチド2つを分取し、Ｎ末端アミノ酸配列解析をプロテインシーケンサー（Procise 492cLC; Applied Biosystems）により行った結果、Thr-Asp-Asp-Phe-Phe-Pro-Tyr-Ala-Ser-Asp-Glu-His-Ala-Tyr-Trp-Thr-Gly-Tyr-Phe-Thr〔部分アミノ酸配列１（配列番号３）〕とGln-Gly-Asp-Tyr-Val-Glu-Phe-Asp-Phe-Val-Val-Gly-Pro-Ile-X-Val〔部分アミノ酸配列２（配列番号４）〕が得られた。
＜コナヒョウヒダニRNAの抽出＞
液体窒素中で凍結したコナヒョウヒダニより、RNeasy Mini kit(Qiagen)を用いて以下の操作でRNAを抽出した。コナヒョウヒダニ10mgに対し、Buffer RLTを600μL加え、18G注射針を通して破砕した。コナヒョウヒダニ懸濁液をQIAshredderスピンカラム(Qiagen)に加え遠心し(15000rpm 2分)、フロースルーを回収した。回収したRNA溶液に70%エタノール水溶液600μLを添加後、RNeasy Miniカラムに添加し、遠心した(10000rpm 15秒)。さらにカラムをBuffer RW1 350μLにて洗浄後、RNase-Free DNase set (Qiagen)にてDNase処理を行った。 カラムをBuffer RW1 350μLにて洗浄後、RNeasy Mini Kitのプロトコールに従ってRNAの精製を行った。 精製後、RNase Free H2O 30μLを添加し、Total RNAを回収した。
＜コナヒョウヒダニcDNAの作製＞
得られたtotal RNAから、Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)を用いてcDNAを合成した。Total RNA 3μgを8μLの精製水に懸濁し、oligo(dT)20を1μL、10mM dNTPを1μL加えてから、65℃で5分間インキュベートした。氷上で2分間冷却した後、10X RT bufferを2μL、25mM MgCl2を1μL、0.1M DTTを2μL、RNaseOUT(40U/μl)を1μL、SuperScript III Reverse Transcriptaseを1μL加えて混和した。50℃で50分間インキュベートした後、85℃で5分間処理して反応を停止した。
＜cDNA配列の決定＞
得られた部分アミノ酸配列３、４より縮重プライマーを設計した。部分アミノ酸配列３に相当するセンスプライマーとして、Primer 1及びその下流のPrimer 2を設計した。同様に部分アミノ酸配列４に相当するアンチセンスプライマーとして、Primer 3及びその上流のPrimer 4を設計した。これらのプライマーを用いて、ダニcDNAをテンプレートとして、KOD Fx neo(TOYOBO)によるnested PCRを行った。PCR産物を2%アガロースゲル(ナカライテスク)に泳動後、増幅したバンドを含むゲル断片をWizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)にて精製した。精製したPCR産物はPrimer 2、Primer 4のプライマーを用いてKOD Fx neoによるPCRを行い、PCR産物をWizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)にて精製した。精製後、BigDye Xterminator Kit(Applied Biosystems)とDNAシークエンサー(3130xl; Applied Biosystems)を用いて塩基配列を解析し、中間配列を取得した。
次に、3'側配列の解析のために5'/3' RACE kit 2nd generation (Roche)を用いて3'末端にアンカー配列を付加したコナヒョウヒダニcDNAを作製した。中間配列から得られた配列をもとに設計したPrimer 5、Primer 6 の2段階のプライマーを用いてKOD Fx neoによるnested PCRを行った。得られたPCR産物の塩基配列を解析し、3'末端配列を取得した。
中間配列と3'末端配列の解析によって1850bpの部分配列を取得した。この部分配列と相同性をもつタンパク質をNCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)データベースより検索したところ、Capitella teleta(イトゴカイ)のhypothetical protein CAPTEDRAFT_151096 (GenBank: ELT89240.1)との相同性が37%、Lottia gigantean(ナスビカサガイ)のhypothetical protein LOTGIDRAFT_207233 (GenBank: ESO84761.1) との相同性が40%、 Amphimedon queenslandica (カイメン)のPREDICTED: lysosomal alpha-mannosidase-like (NCBI Reference Sequence: XP_003383866.1) との相同性が47%であった。そこで、ELT89240.1、ESO84761.1、XP_003383866.1間の相同配列を解析し、N末端付近にてアミノ酸配列が一致する領域に対する縮重プライマーPrimer 7、 Primer 8を設計した。中間配列より設計したPrimer 9、 Primer 10とPrimer 7、 Primer 8にてコナヒョウヒダニcDNAよりKOD Fx neoを用いてnested PCRを実施した。得られたPCR産物の塩基配列を分析して5'側の部分配列を取得した。
更に5'側配列を解析するためにSMARTer RACE cDNA Amplification Kit (clontech社)を用いた5'RACE法を実施した。コナヒョウヒダニtotal RNAをNucleoTrap mRNA mini(マッハライ・ナーゲル)を用いてコナヒョウヒダニpolyA mRNAを精製した。精製したpolyA mRNAを用いてSMARTer RACE cDNA Amplification Kitにて5'末端にアダプター配列を含むcDNAを取得した。
このcDNAを5'側部分配列より設計したPrimer 11にてPrimeStar HS DNA polymerase(タカラバイオ)にてタッチダウンPCRを行った。反応条件についてはSMARTer RACE cDNA Amplification Kitのプロトコールに従った。得られたPCR産物の塩基配列を分析することで5'側末端までの配列を取得した。
本発明のコナヒョウヒダニタンパク質をコードするcDNAは、3006bpのORFから構成されていた。塩基配列から推定されるアミノ酸数は1002aaである。シグナル配列予測ソフトウェア(SignalP 4.1、 http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) の解析によれば、最初の27アミノ酸はシグナルペプチドである。したがって天然物としての本発明のコナヒョウヒダニタンパク質のアミノ酸数は975aa、このアミノ酸配列から予想される本発明のコナヒョウヒダニタンパク質の分子量は113.5kDaである。この予測分子量はSDS-PAGEにおける分子量は約110kDaであることと一致する。
決定された塩基配列より推定されるアミノ酸配列の相同性検索を、NCBIのBLAST検索を用いて行ったところ、Der f 1やDer f 2をはじめとした既知のDer f由来アレルゲンとの相同性は無く、新規の蛋白質であることが示された。

Claims (8)

  1. 以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるコナヒョウヒダニの排泄物由来タンパク質。
    （ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に結合するＩｇＥが認識するタンパク質。
    （ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に結合するＩｇＥが認識するタンパク質。
  2. 以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるコナヒョウヒダニの排泄物由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
    （ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列らなるタンパク質に結合するＩｇＥが認識するタンパク質。
    （ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に結合するＩｇＥ認識するタンパク質。
  3. 以下の（ｄ）及び（ｆ）から選択されるポリヌクレオチド。
    （ｄ）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
    （ｆ）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に結合するＩｇＥが認識するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  4. 請求項１記載のコナヒョウヒダニの排泄物由来タンパク質を有効成分とするコナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の診断薬。
  5. 請求項１記載のコナヒョウヒダニの排泄物由来タンパク質に結合する抗体分子。
  6. モノクローナル抗体である請求項５記載の抗体分子。
  7. コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の診断薬を製造するための、請求項１記載のコナヒョウヒダニの排泄物由来タンパク質の使用。
  8. コナヒョウヒダニを原因とするアレルギー疾患の診断に使用するための、請求項１記載のコナヒョウヒダニの排泄物由来タンパク質。
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