JP2005065536A - スギ花粉由来の新規アレルゲン - Google Patents
スギ花粉由来の新規アレルゲン Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005065536A JP2005065536A JP2003297444A JP2003297444A JP2005065536A JP 2005065536 A JP2005065536 A JP 2005065536A JP 2003297444 A JP2003297444 A JP 2003297444A JP 2003297444 A JP2003297444 A JP 2003297444A JP 2005065536 A JP2005065536 A JP 2005065536A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cedar pollen
- protein
- cjp
- amino acid
- cedar
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000013566 allergen Substances 0.000 title abstract description 32
- 240000005109 Cryptomeria japonica Species 0.000 title 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 30
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 239000013573 pollen allergen Substances 0.000 claims abstract description 21
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 241000218645 Cedrus Species 0.000 claims description 72
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 66
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 58
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 25
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 17
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 241000218692 Cryptomeria Species 0.000 abstract description 12
- 206010048908 Seasonal allergy Diseases 0.000 abstract description 12
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 abstract description 10
- 230000007815 allergy Effects 0.000 abstract description 10
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 abstract description 9
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 abstract 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 22
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 22
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 12
- 208000007811 Latex Hypersensitivity Diseases 0.000 description 11
- 206010039251 Rubber sensitivity Diseases 0.000 description 11
- 201000005391 latex allergy Diseases 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 3
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000001437 electrospray ionisation time-of-flight quadrupole detection Methods 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- BTKMJKKKZATLBU-UHFFFAOYSA-N [2-(1,3-benzothiazol-2-yl)-1,3-benzothiazol-6-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound C1=CC=C2SC(C3=NC4=CC=C(C=C4S3)OP(O)(=O)O)=NC2=C1 BTKMJKKKZATLBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000251557 Ascidiacea Species 0.000 description 1
- 240000001151 Bauhinia glauca Species 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 101710175243 Major antigen Proteins 0.000 description 1
- 206010068355 Oral allergy syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 244000025272 Persea americana Species 0.000 description 1
- 235000008673 Persea americana Nutrition 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940125715 antihistaminic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 108010050949 chitinase C Proteins 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- LQEATNFJCMVKAC-UHFFFAOYSA-N n-[2-(1h-indol-3-yl)ethyl]-n-prop-2-enylprop-2-en-1-amine Chemical compound C1=CC=C2C(CCN(CC=C)CC=C)=CNC2=C1 LQEATNFJCMVKAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 201000004338 pollen allergy Diseases 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002636 symptomatic treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046241 vestitone reductase Proteins 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
【解決手段】 スギ花粉中に含まれ、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定すると分子量約25,000〜40,000ダルトンを示し、等電点電気泳動法により測定すると4.0〜5.0付近に等電点を示すことを特徴とし、スギ花粉粗抗原を陽イオン交換クロマトグラフィーに供した画分から、コロイダルキチンを用いたアフィニティー精製で得られる。
【選択図】 なし
Description
(1)スギ花粉中に含まれるタンパク質で、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定すると分子量約25,000〜40,000ダルトンを示し、等電点電気泳動法により測定すると4.0〜5.0付近に等電点を示すことを特徴とする、スギ花粉アレルゲン。
(2)部分アミノ酸配列として
-X-Y-Cys-Asp-Gly-Gly-Asn-Ala-Ala-Thr-Val-Ala-Ser-Z-(但し、Xは、PheまたはMet、Yは、GluまたはGln、 Zは、ArgまたはThr)の配列を有する前記(1)のスギ花粉アレルゲン。
(3)配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する前記(1)または(2)のスギ花粉アレルゲン。
(4)スギ花粉粗抗原から、キチンを用いたアフィニティー精製、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、遠心分離、濃縮、透析から選ばれる2種以上の方法によって得られたことを特徴とする前記(1)〜(3)のいずれかのスギ花粉アレルゲン。
(7)配列番号1に記載の塩基配列を有する前記(6)のDNA。
(8)スギ花粉またはスギ雄花に由来する前記(6)または(7)のDNA。
(10)無細胞発現系によって調製された前記(1)〜(4)のいずれかのスギ花粉タンパク質または少なくともその1部のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(11)アレルゲン性を有する前記(5)または(9)〜(10)のタンパク質。
(12)スギ花粉で感作された患者のT細胞を増殖させることが可能な前記(1)〜(5)、(9)〜(11)のいずれかに記載のスギ花粉タンパク質のT細胞エピトープペプチド。
(13)前記(1)〜(5)、(9)〜(12)のいずれかのスギ花粉タンパク質またはその少なくとも1つのタンパク質断片に特異的に反応するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体。
(15)前記(1)〜(4)、(9)〜(12)に記載のスギ花粉タンパク質を用いた減感作用の治療薬。
スギ花粉アレルギーにおいては、Cry j1とCry j2の主要抗原が同定され詳細に研究されているが、その他のアレルゲンに関しては、未だ充分なされていない。そこで、本発明者らは、スギ花粉中に含まれるアレルゲンの網羅的解析を目指して、スギ花粉粗抗原を2次元電気泳動により展開した後、イムノブロッティング法によって患者血清IgEと特異的に反応するスポットを検索した。その結果、塩基性域のCry j1およびCry j2以外に、IgEと反応するアレルゲンが酸性域にも存在することを見出した。その後、得られた陽性スポットのアミノ酸シークエンスをESI Q−TOF MSを用いて行い、ホモロジー検索をしたところ、A. thaliana由来のclassI chitinaseと高
い相同性を示すことが明らかになった。これらと共通のアミノ酸構造を持つclassI chi
tinaseは、ラテックスアレルギーなどの原因抗原の1つとして知られている。しかしながら、スギ花粉症においてchitinaseが重要なアレルゲンであるという報告はないことからも、本タンパク質が新規のスギ花粉アレルゲン(CJP−16)であると考えられた。
<実施例1> スギ花粉粗抗原のプロテオーム解析
スギ花粉粗抗原の調製
日本スギ花粉(広島県豊田郡豊町にて採取)80 gに抽出バッファー(20 mM PBS+3 mM EDTA pH 7.6)を3.0 L加えた後、4℃で4時間攪拌した。その後、遠心分離(7,000 rpm, 30 min)によって得た上清に対して、終濃度80%飽和になるよう硫酸アンモニウムを加え、4℃で一晩攪拌した。次に、遠心分離(7,000 rpm, 30 min)によって沈殿を採取し、ミリQ水で一晩透析を行った。その後、遠心分離(10,000 rpm, 30 min)をすることで得られた上清の凍結乾燥を行い、スギ花粉粗抗原(CJP)を得た。
スギ花粉粗抗原(CJP)200 mgに4 mlのPBS+ジチオトレイトール(DTT)60 mgを加えて懸濁し、PBSで60%に調製したトリクロロ酢酸2 mlを加えた後、氷上で90分間静置した。その後、遠心分離(3,500 rpm, 15 min)を行い、沈殿を回収した。この沈殿に冷アセトン10 mlを加えて懸濁し、洗浄した。さらに、遠心分離(3,500 rpm,20 min)を行った後、スピードバックで沈殿を乾燥させた。その沈殿にLysis Buffer(8 M 尿素,2 Mチオ尿素,2% CHAPS, 2% SB3-10, 1% DTT, 0.8% Ampholine)1mlを加えて懸濁し、超音波破砕によって完全に溶解させた。その後、遠心分離(18,000 rpm, 20 min)を行い、その上清を2次元電気泳動用のサンプルに用いた。
2次元電気泳動後のタンパク質を、ブロッティングキット(Hoefer DALT)を用いて約6時間、60Vの条件でメンブレンに転写した。その後、メンブレンをPBST(0.1% Tween20/PBS)で洗浄し、ブロッキング液(5% skim milk,1% BSA/PBST)で一晩振とうした。その後、PBSTで洗浄し、ブロッキング液で10倍希釈した患者血清中で4時間振とうしながらインキュベートした。洗浄後、ブロッキング液で2,500倍希釈した抗ヒトIgE−ビオチン標識(Biosource)を加え、2時間振とうしながらインキュベートした。PBSTで洗浄した後、ブロッキング液で2,500倍希釈したストレプトアビジン−HRP標識(ZYMED)と共に、1時間インキュベートした。その後、PBSTで洗浄した後、ECL Westernblotting detection reagents(Amersham Pharmacia Biotech)と共に5分間インキュベートを行い、X線フィルムに感光させて陽性スポットを検出した。
スギtotal RNAの精製
スギ葯(2g)を液体窒素中で粉砕し、10倍量(W/V)の2× CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)溶液に溶かした後、65℃で10分間インキュベートした。等量のクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)を加え攪拌し、室温で遠心分離(15,000 rpm,10 min)した後、水層を採取した。再度、等量のクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)を加え攪拌し、室温で遠心分離(15,000 rpm,10 min)の後、水層を採取し、3/4倍量のイソプロパノールを加え室温で10分間静置した。4℃で遠心分離(15,000 rpm,10 min)後、沈殿をTE bufferに溶解し、1/4倍量の10M塩化リチウム液を加え、2時間氷上でインキュベートした。4℃で遠心分離(15,000 rpm,10 min)後、沈殿をTE bufferに溶解し、等量のTE飽和フェノール(pH 9.0)を加えて攪拌した。室温で遠心分離(15,000 rpm,10 min)後、水層を採取し、フェノール/クロロホルムを加えて攪拌し、室温で遠心分離(15,000 rpm,10 min)した。遠心分離後の上清に1/10倍量の3M酢酸ナトリウムを加え、更に2倍量の冷エタノール(-20℃)を加え、-80℃に10分間静置した。4℃で遠心分離(15,000 rpm,10 min)し、RNAを沈殿させ、沈殿を70% エタノールで洗浄した。沈殿を真空乾燥した後、適量のTE bufferに溶解した。
得られたtotal RNAからcDNAを3' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(#18373-019 Invitrogen)を用いて合成した。
Total RNA(5μg)溶液を5μl、アダプタープライマー 1μl、DEPC処理水 6μlを加え、インキュベート(70℃,10 min)した後、氷上に1分間静置した。反応液に10 × PCR Buffer 2 μl、MgCl2(25 mM)溶液 2 μl、dNTP MI×(2.5 mM each) 1 μl、DTT(0.1 M) 2 μlを加え42℃で5分間プレインキュベートし、SUPERSCRIPT II (Life Technologies, Inc.Rockville, MD) を1μl加えた。インキュベート(42℃、50 min)の後、反応を停止(70℃,15 min)させた。氷上で静置後、遠心し反応液を集めRNase H 1μlを加えインキュベート(37℃,20 min)した後、−80℃で保存した。
数種のchitinaseで高度に保存されているアミノ酸配列(EIAAFFAHV)をもとに縮重primer「5'- GARATHGCNGCNTTYTTYGC −3'」を設計し、作製したcDNAを鋳型としてPCR反応を行った。増幅した配列に対してシークエンス解析を行ったところ、配列表の配列番号2に示す結果が得られた。得られた塩基配列(QGFGATI)を基に、再度primer「5'- ATNGTNGCNCCRAANCCYTG −3'」の設計を行い、PCR反応を行った。その結果、配列表の配列番号3に示す結果が得られた。これら2つの結果においては、261番目(配列番号2:A,配列番号3:T),および322番目の塩基配列(配列番号2:G,配列番号3:C)において差がみられた。また326塩基以降の塩基配列にも差異が見られるが、326番目に1塩基挿入することにより他の植物chitinaseの塩基配列との相同性が高まり、配列番号2のアミノ酸配列とも一致する。これらのことから326番目の塩基はPCRの増幅反応により欠損したと考えられた。また、これを考慮した場合、スギ花粉粗抗原のプロテオーム解析から明らかにされたCJP−16の部分アミノ酸配列[FECDGGNAA]と相同性を示す配列がC末端の[MQCDGGNA]に存在する。これらのことからスギcDNA中には少なくとも2種類のCJP−16のisoformが存在することが示唆された。
また、配列番号2および配列番号3における保存配列からプライマーを設計し5'-RACEを行った。得られた5‘側の塩基配列をもとに、さらにプライマーを設計し3'-RACEを行いCJP−16の全長遺伝子の取得を試みた。その結果、配列番号1に示すCJP−16の塩基配列が得られた。得られた配列は開始コドンおよび終止コドンを含みそのORFは846塩基であった。また、TOF MS解析より得られた[FECDGGNAATVASR]と相同性を示す配列が[247 MECDGGNAATVAST 260]に存在することからも、得られた配列がCJP−16の全長遺伝子配列であることが示された。
GenBankデータベースを用いたFASTA及びBLAST検索によって、得られたCJP−16の遺伝子およびタンパク質の相同性を検索した。CJP−16のアミノ酸配列と他の植物由来chitinaseとの相同性について調査した結果を、図2に示す。*は一致したアミノ酸配列を示す。CJP−16は、P.glauca chitinase proteinとアミノ酸レベルで65.2%、DNAレベルで62.4%,V.venifera class IV endochitinaseとアミノ酸レベルで59.1%、DNAレベルで60.1%の相同性を示した。また、A.thaliana class IV chitinaseとアミノ酸レベルで54.4%,DNAレベルで57.5%, D.carota class IV chitinaseとアミノ酸レベルで49.3%、DNAレベルで61.7%の相同性を示した。以上のようにCJP−16が他種のchitinaseと高い相同性を保持していることが確認された。それらの全てのchitinaseがclass IV chitinaseであった事から、当CJP−16もclass IV chitinaseであると考えられた。
コロイダルキチンの作製
粉末キチン2gを蒸留水50mlに懸濁したものと濃硫酸50mlを氷上で3時間、冷却した。その後、濃硫酸を氷上にて1滴づつキチン/蒸留水に全量滴下した。滴下後、グラスウールで濾過し氷上で蒸留水90mlに加えた。混合液を遠心分離(2000 g,20 min,4℃)した後、沈殿したコロイダルキチンをMilliQ水及びPBSで遠心洗浄(2000 g,20 min,4℃)した。沈殿のpHを中性とした後、4℃で使用時まで保存した。
スギ花粉80gをPBS(pH 7.6 + EDTA)3 Lに溶解し、4℃で一晩攪拌した。攪拌後、遠心分離(7000 rpm,35 min,4℃)を行い、上清をプールし80%飽和となるように硫酸アンモニウムを加えて一晩4℃で攪拌した。その後、遠心分離(7000 rpm,35 min,4℃)によって沈殿を集め、酢酸Buffer(pH 5.0)に溶解させたものを同酢酸Buffer(pH 5.0)に対して透析を行った。透析の後、遠心分離(10000 rpm,15 min,4℃)を行い、上清を0.8 μm pore-sizeで濾過した後、陽イオン交換クロマトグラフィー(SP-Sepharose)に供して素通り画分を回収した。素通り画分をエヴァポレーターにて100〜200mlにまで減圧濃縮し、コロイダルキチン5g wet-weightを加えて4℃ で一晩攪拌した。その後、更に氷上でインキュベートを1時間行い、遠心分離(2000 g,30 min,4℃)によって沈殿を回収した。回収した沈殿を0.1% Tween-20/PBSで洗浄し、得られた沈殿に3mlのPBSを加え60℃湯浴中でインキュベートした。その後、遠心分離(2000 g,30 min,25℃)を行って得られた上清を凍結乾燥し、それを1mlのPBSに溶解させ精製CJP-16タンパク質(キチナーゼ)とした。
天然型CJP−16タンパク質のIgE結合能をELISA法により測定した。まず、マイクロタイタープレートのウェルに100 mM bicarbonate buffer(pH 9.3)で希釈した抗原溶液(250 ng/ml)を50 μlアプライした。また、human IgE standardをまず1000 ng/mlになるように希釈し、倍希釈系列をそれぞれのウェルに50 μl ずつ加え、室温で2時間静置した。PBSTにて洗浄した後、blocking buffer(PBS, 3 % skim milk, 1 % BSA)を300 μlアプライし、4℃で一晩静置した。洗浄後、同bufferで200倍希釈したスギアレルギー患者及び健常者血清を50 μlをアプライし、4℃で4時間静置した。洗浄後、同bufferで1,000倍に希釈したanti-human IgE EPSILON CHAIN BIOTIN CONJUGATE (Biosource International,Inc.)50 μlをアプライし、室温で2時間静置した。洗浄後、同bufferで1,000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識Streptavidinを50 μlアプライし、室温で1時間静置した。充分洗浄した後、50 μlのAttoPhosTMを加えCytoFluorTMII(PerSeptive Biosyatems)にて蛍光強度を測定した。
その結果、18検体中9検体(No.2,4,5,7,8,9,12,13,14)(50%)の患者血清で当CJP−16に対してIgE反応陽性であった。これらの結果は、2次元電気泳動のimmuno blottingによってアレルゲン反応頻度を評価した結果(反応頻度40検体中21検体(52.5%))とも良く一致しており、精製CJP−16タンパク質が強いアレルゲン性を有していることが示された。
CJP中のCJP−16含量の調査を目的としてELISA inhibition assayを行った。100 mM bicarbonate bufferで希釈したCJP溶液(1μg/ml)を50μlアプライし、室温で2時間静置した。洗浄後、blocking buffer(3% skim milk,1% BSA,0.1% Tween 20 / PBS)を300 μlアプライし、4℃で一晩静置した。またblocking bufferで希釈した様々な濃度(10μg-0.001μg/mlの1/10希釈系列)となるよう抗原(CJP−16, CJP, RNase)をblocking bufferで終濃度40倍希釈した患者プール血清(11検体,RAST値≧2)と4℃で一晩プレインキュベートした。プレートを洗浄後、抗原とプレインキュベートした患者血清溶液を50 μl/wellアプライし、4℃で4時間静置した。洗浄後、Blocking bufferで1,000倍に希釈したanti-human IgE EPSILON CHAIN BIOTIN CONJUGATE 50 μlをアプライし、室温で2時間静置した。洗浄後、同bufferで1,000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識Streptavidinを50 μlアプライし、室温で1時間静置した。充分洗浄した後、50 μlのAttoPhosTMを加えCytoFluorTMIIによって蛍光強度を測定した。
CJP−16タンパク質がラテックスアレルギーの主要抗原であるHev b 11と高い相同性を有していた事から、該CJP−16がラテックスアレルギー患者血清IgEと交差反応を示すかELISAによって調査した。それらの結果を、図7に示す。健常者3人の平均値に標準偏差の3倍を足した値の合計値を破線で示し、破線以上の値を有意な値とした。その結果、分析したラテックスアレルギー患者血清3検体において全て該CJP−16に対し陽性を示した。これらの結果から、該CJP−16がラテックスアレルギー患者と交差反応性を有する事が明らかになった。
配列番号3−人工配列の説明:chitinaseのアミノ酸配列をもとに作製したcDNA
Claims (15)
- スギ花粉中に含まれるタンパク質で、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定すると分子量約25,000〜40,000ダルトンを示し、等電点電気泳動法により測定すると4.0〜5.0付近に等電点を示すことを特徴とする、スギ花粉アレルゲン。
- 部分アミノ酸配列として
-X-Y-Cys-Asp-Gly-Gly-Asn-Ala-Ala-Thr-Val-Ala-Ser-Z-(但し、Xは、PheまたはMet、Yは、GluまたはGln、 Zは、ArgまたはThr)の配列を有する請求項1に記載のスギ花粉アレルゲン。 - 配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する請求項1または2に記載のスギ花粉アレルゲン。
- スギ花粉粗抗原から、キチンを用いたアフィニティー精製、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、遠心分離、濃縮、透析から選ばれる2種以上の方法によって得られたことを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載のスギ花粉アレルゲン。
- 化学的な合成によって調製された請求項1〜4のいずれかに記載のタンパク質または少なくともその1部のアミノ酸配列を含むタンパク質。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のスギ花粉タンパク質の全部またはその少なくとも1部のアミノ酸配列をコードするDNA。
- 配列番号1に記載の塩基配列を有する請求項6に記載のDNA。
- スギ花粉またはスギ雄花に由来する請求項6または7に記載のDNA。
- 請求項6または7に記載のDNAで形質転換された宿主細胞において産生された請求項1〜4のいずれかに記載のスギ花粉タンパク質またはその少なくとも1部のアミノ酸配列を含むタンパク質。
- 無細胞発現系によって調製された請求項1〜4のいずれかに記載のスギ花粉タンパク質または少なくともその1部のアミノ酸配列を含むタンパク質。
- アレルゲン性を有する請求項5または9〜10に記載のタンパク質。
- スギ花粉で感作された患者のT細胞を増殖させることが可能な請求項1〜5、9〜11のいずれかに記載のスギ花粉タンパク質のT細胞エピトープペプチド。
- 請求項1〜5、9〜12のいずれかに記載のスギ花粉タンパク質またはその少なくとも1つのタンパク質断片に特異的に反応するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体。
- 請求項1〜4、9〜11に記載のスギ花粉アレルゲンを用いた花粉症患者用の診断薬。
- 請求項1〜4、9〜12に記載のスギ花粉タンパク質を用いた減感作用の治療薬。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003297444A JP4437389B2 (ja) | 2003-08-21 | 2003-08-21 | スギ花粉由来の新規アレルゲン |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003297444A JP4437389B2 (ja) | 2003-08-21 | 2003-08-21 | スギ花粉由来の新規アレルゲン |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005065536A true JP2005065536A (ja) | 2005-03-17 |
JP4437389B2 JP4437389B2 (ja) | 2010-03-24 |
Family
ID=34403298
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003297444A Expired - Lifetime JP4437389B2 (ja) | 2003-08-21 | 2003-08-21 | スギ花粉由来の新規アレルゲン |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4437389B2 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007014311A (ja) * | 2005-07-11 | 2007-01-25 | Japan Science & Technology Agency | スギ花粉由来の新規アレルゲン |
JP2008143893A (ja) * | 2006-11-16 | 2008-06-26 | Morikawa Kenkoudou Kk | 血圧降下作用を有する花粉の製造方法 |
JP2011033547A (ja) * | 2009-08-04 | 2011-02-17 | Hoyu Co Ltd | 2次元電気泳動方法 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4852738B2 (ja) * | 2005-02-08 | 2012-01-11 | 国立大学法人広島大学 | スギ花粉由来の新規タンパク質およびそのタンパク質をコードする遺伝子並びにそれらの利用 |
-
2003
- 2003-08-21 JP JP2003297444A patent/JP4437389B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007014311A (ja) * | 2005-07-11 | 2007-01-25 | Japan Science & Technology Agency | スギ花粉由来の新規アレルゲン |
JP4732040B2 (ja) * | 2005-07-11 | 2011-07-27 | 独立行政法人科学技術振興機構 | スギ花粉由来の新規アレルゲン |
JP2008143893A (ja) * | 2006-11-16 | 2008-06-26 | Morikawa Kenkoudou Kk | 血圧降下作用を有する花粉の製造方法 |
JP2011033547A (ja) * | 2009-08-04 | 2011-02-17 | Hoyu Co Ltd | 2次元電気泳動方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4437389B2 (ja) | 2010-03-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Cortegano et al. | Cloning and expression of a major allergen from Cupressus arizonica pollen, Cup a 3, a PR‐5 protein expressed under polluted environment | |
Lopez‐Torrejon et al. | Allergenic reactivity of the melon profilin Cuc m 2 and its identification as major allergen | |
Asturias et al. | Engineering of major house dust mite allergens Der p 1 and Der p 2 for allergen‐specific immunotherapy | |
US9274114B2 (en) | Prostate kallikrein allergen | |
Asturias et al. | The major Platanus acerifolia pollen allergen Pla a 1 has sequence homology to invertase inhibitors | |
Aleksic et al. | Molecular and immunological characterization of Mus a 5 allergen from banana fruit | |
JP4919486B2 (ja) | スギ花粉由来の新規アレルゲン | |
US8945574B2 (en) | Hypoallergenic variants of the major allergen from Betula verrucosa pollen | |
JP4437389B2 (ja) | スギ花粉由来の新規アレルゲン | |
JP4730764B2 (ja) | スギ花粉由来の新規アレルゲン | |
JP5542685B2 (ja) | 新規な小麦アレルゲン | |
Jiao et al. | Purification and characterization of enolase as a novel allergen in Platanus acerifolia pollen | |
JP4732040B2 (ja) | スギ花粉由来の新規アレルゲン | |
WO2016088765A1 (ja) | 新規コナヒョウヒダニタンパク質 | |
Wang et al. | Identification and characterization of natural PR-1 protein as major allergen from Humulus japonicus pollen | |
JP4686710B2 (ja) | スギ花粉由来の新規アレルゲンおよびその利用 | |
JP2005503113A (ja) | ブタクサアレルゲン | |
WO2012105541A1 (ja) | 新規ヒノキ花粉アレルゲン | |
Tiwari et al. | Mapping of IgE-binding regions on recombinant Cyn d 1, a major allergen from Bermuda Grass Pollen (BGP) | |
EP1509606B1 (en) | Allergen from mugwort pollen | |
ES2592956T3 (es) | Nuevo Alérgeno | |
JP4580651B2 (ja) | 新規なアレルゲン | |
TWI467177B (zh) | Investigation kit and detection method of | |
Jeong KyoungYong et al. | Allergenic characterization of a novel allergen, homologous to chymotrypsin, from German cockroach. | |
JPWO2017221910A1 (ja) | 新規スギ花粉タンパク質 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20060424 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20060706 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060803 |
|
A072 | Dismissal of procedure [no reply to invitation to correct request for examination] |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A073 Effective date: 20060815 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060825 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20060825 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20060825 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090722 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090916 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091215 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20091222 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130115 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4437389 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130115 Year of fee payment: 3 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130115 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140115 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |