JP5783589B2 - 新規ダニアレルゲンおよびその利用 - Google Patents
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(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アレルゲン活性を有するタンパク質。
(c)配列番号3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(d)以下の(i)または(ii)とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド:
(i)配列番号3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(ii)配列番号3に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
本発明者らは、ダニに含まれるアレルゲンの網羅的解析を目指して、コナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)虫体抽出物(適宜「Dfb」と表記する)を2次元電気泳動により展開した後、ウェスタンブロット法によってダニアレルギー患者血清IgEと特異的かつ高頻度に反応するスポットを検索した。その結果、ダニアレルギー患者血清中IgEとの反応頻度が67.5%、62.5%と、主要アレルゲンであるDer f 1やDer f 2などと同様に高い反応頻度を示したSpot66およびSpot67を見出した。これらのスポットを質量分析にかけて得られたアミノ酸配列から、これらは互いにisoformであることが示唆された。
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アレルゲン活性を有するタンパク質。
(i)M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
(ii)SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
(iii)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) (1975年)
(iv)矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
(v)矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて所望の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドまたは部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
本発明にかかるポリペプチドは、上記本発明にかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチドのことである。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド(A、G、CおよびTと省略される)の配列として示される。
(c)配列番号3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(d)以下の(i)または(ii)とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド:
(i)配列番号3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(ii)配列番号3に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
本発明は、本発明にかかるタンパク質と特異的に結合する抗体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン(IgA、IgD、IgE、IgY、IgG、IgMおよびこれらのFabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fcフラグメント)を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明にかかる抗体は、本発明にかかるタンパク質を発現する生物材料を選択する際に有用である。また本発明にかかるタンパク質を含む粗溶液から、当該タンパク質を精製する際にも有用である。
(4−1)ベクター
本発明は、本発明にかかるタンパク質を生成するために使用されるベクターを提供する。本発明にかかるベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。
本発明は、上述した本発明にかかるタンパク質(または部分ペプチド)をコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体または細胞を提供する。ここで「形質転換体」とは、組織または器官だけでなく、生物個体を含むことを意味する。
本発明は、本発明にかかるタンパク質を生産する方法を包含する。一実施形態において、本発明にかかるタンパク質の生産方法は、本発明にかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いることを特徴とする。
本発明は、種々の検出器具をも包含する。本発明にかかる検出器具は、本発明にかかるポリヌクレオチドもしくはそのフラグメントが基板上に固定化されたもの、または、本発明にかかるタンパク質もしくは抗体が基板上に固定化されたものであり、種々の条件下において、本発明にかかるポリヌクレオチドおよびタンパク質の発現パターンの検出または測定などに利用することができる。
本発明で精製される抗体としては、動物に抗原を免疫することにより得られた抗血清、動物に抗原を免疫し免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌するモノクローナル抗体、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などいかなるものでもよい。また、抗体のFc領域を融合させた融合タンパク質なども本発明では抗体として含まれる。また上記抗体はモノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。その抗体については、「(3)抗体」の記載を適宜参照できる。
本発明にかかるタンパク質は、アレルゲン活性を有するので、当該タンパク質の活性を阻害する化合物は、例えば、ダニアレルギー性疾患の予防または治療薬として使用できる。したがって、本発明にかかるタンパク質は、本発明にかかるタンパク質の活性を阻害する化合物のスクリーニングのための試薬として有用である。すなわち、本発明は、本発明にかかるタンパク質を用いることによって、本発明のタンパク質と特異的に結合し且つ当該タンパク質のアレルゲン活性を阻害する化合物(以下、適宜「阻害剤」と称する)のスクリーニング方法や、本発明にかかるタンパク質とIgEとの結合を阻害する抗体のスクリーニング方法などを包含する。
本発明にかかる薬学的組成物(ダニアレルギー性疾患用治療薬または予防薬)の一実施形態としては、本発明にかかるタンパク質が有効成分として含まれているものが挙げられる。上記薬学的組成物をダニアレルギー性疾患の減感作治療へ適用することによって、ダニアレルギー性疾患の症状を治療または予防することができる。
本発明にかかるダニアレルギー性疾患の診断キット(検出キット)は、本発明にかかるタンパク質を含むことを特徴としている。本発明にかかるタンパク質と被験者の血清との結合性(反応性)をELISA法等で検討することによって、被験者血清中にダニアレルゲンに対するIgE抗体が存在するか否かを判断することができ、被験者がダニアレルギー性疾患である(またはダニアレルギー性疾患を発症する可能性がある)か否かを検出(診断)することができる。
本発明はダニアレルギー性疾患の発症又は発症の可能性を検出する方法(以下「本発明にかかる検出方法」という)をも包含する。本発明にかかる検出方法は、本発明にかかるタンパク質と生体から採取された試料(たとえば被験者の血清、被験動物の血清等)と反応させる工程(反応工程)を含むことを特徴としている。本発明にかかるタンパク質と試料(被験者の血清等)との結合性(反応性)をELISA法等で検討することによって、試料(被験者の血清等)中にダニアレルゲンに対するIgE抗体が存在するか否かを判断することができ、被験者がダニアレルギー性疾患を発症している(またはその可能性)を検出(診断)することができる。
特に記述されていない試薬は、タカラバイオ株式会社、ナカライテスク株式会社、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社、東洋紡株式会社、和光純薬工業株式会社、または片山化学工業株式会社から購入された特級試薬が用いられた。また各種制限酵素はタカラバイオ株式会社から購入されたものを使用した。オリゴDNAはシグマ アルドリッチ ジャパン株式会社で合成されたものが使用された。
クローニング用大腸菌としてはcompetent high DH5α(東洋紡社製)が用いられ、組換えDFA67(以下「rDFA67」)の発現用大腸菌株としてはRosetta-gamiTM(DE3) pLysS Competent Cells(Novagen社製)が用いられた。
bacto tryptone 1%、bacto yeast extract 0.5%、NaCl 1%、(Ager 2%)
<2×YT培地>
bacto tryptone 1.6%、bacto yeast extract 1%、NaCl 0.5%、NaOHでpH7.2に調整
<SOB培地>
bacto tryptone 2%、bacto yeast extract 0.5%、NaCl 0.05%、250mM KCl 0.01%、2M Mg2+溶液(1M MgSO4・7H2O,1M MgCl2・6H2O) 1%(ポアサイズ0.20μmのフィルターでろ過滅菌し、使用直前に添加した)。上記の各培地はオートクレーブ滅菌し、必要に応じて以下の濃度になるように抗生物質を添加した(Ampicilin 50μg/ml、Kanamycin 15μ/ml、Chloramphenicol 34μg/ml、Tetracycline 12.5μg/ml、またはStreptomycin 50μg/ml)。
(2−1)コナヒョウヒダニ(D. farinae)
マウス・ラット・ハムスター用粉末飼料(オリエンタル酵母工業株式会社、Tokyo, Japan)と襖の混合培地(7:3)中で相対湿度75%、25℃において30日間培養したものを用いた。ダニ培養物を飽和食塩水に懸濁して遠心分離(4℃、3500rpm、15分間)し、その上清を含む浮遊物を濾過した。濾紙(Tokyo Roshi Kaisha, Ltd. 110 mm)上に回収されたダニ虫体を、使用するまで−80℃で保存した。
180℃、12時間乾熱滅菌した乳鉢にダニ虫体2g(−80℃凍結保存状態)、適量の液体窒素、TRIZOL(Invitorogen社製)20mlを加え、石英砂(ナカライテスク社製)により粉状になるまで破砕した。そこへ60℃に保温しておいた5mlのTRIZOLを加え、ボルテックスミキサーで30秒間攪拌した。60℃、15分間インキュベートした後、遠心分離(14,000rpm、1分間、4℃)した。その上清を1.5mlマイクロチューブに1mlずつ分注し、5分間、室温でインキュベートした。その後、各チューブに200μlずつクロロホルムを加え、ボルテックスミキサーでエマルジョンになるまで激しく攪拌した。3分間、室温でインキュベートし、遠心分離(14,000rpm、15分間、4℃)して、2層に分離した上層部分を別のマイクロチューブにとり、それに500μlのイソプロパノールを加え10分間、室温で静置した。遠心分離(14,000rpm、10分間、4℃)後、上清を除き、残存した沈殿に300μlの氷冷した4M LiClを加え、ピペッティングにより溶解し、遠心分離(6,500rpm、5分間、室温)した。その上清を除き、沈殿物に200μlの0.5% SDS-TE bufferと200μlのクロロホルムを加え、ボルテックスミキサーで攪拌した後、遠心分離(6,500rpm、10分間、室温)して、上層の水層部分を別のマイクロチューブにとった。その水層部分に1/10量の3M 酢酸ナトリウムと、2倍量のエタノールとを加え、5分間 −80℃で静置した。遠心分離(14,000rpm、10分間、4℃)して、上清を除いた沈殿(RNA)を75%エタノールでリンスし、遠心分離(14,000rpm、2分間)した。沈殿を風乾後、DEPC処理水に溶解し、total RNAサンプルとした。このサンプルからOligotex-dt30<super>mRNA Purification Kit(タカラバイオ株式会社製)を用いてmRNAを精製した。さらに、BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(BD Biosciences 社)を用いてRACE用cDNAを合成した。
D. frainae ESTの結合配列の中で、他の生物種のタンパク質との相同性が比較的高い部分を選びRACE PCR用プライマーをForward、Reverse各2本ずつ設計した。
Forward primer 1:5’-GAT TTC ACG TTC GTA TGT CCA ACC G-3’(配列番号5)
Forward primer 2:5’-CAT TAG ATT TCA CGT TCG TAT GTC C-3’(配列番号6)
Reverse primer 1:5’-TTC ATC TAC GCT ACG TCC AAC TGG C-3’(配列番号7)
Reverse primer 2:5’-GGT TTC ATC TAC GCT ACG TCC-3’(配列番号8)
また、上記のプライマーを用いたRACE PCRで得られた配列を元に、以下のプライマーを設計した。
Forward primer 3:5’-TGC TGA TAC TAT TAA ACC GGC ACC A-3’(配列番号9)
Reverse primer 3:5’-TCA TCG GCA CGT TCA CTG AAT GCA A-3’(配列番号10)
(2−4)5’-RACE PCR
DNA polymeraseとしてTaKaRa Ex Taq(タカラバイオ株式会社製、登録商標)を使用した。また、SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(タカラバイオ株式会社製)付属の10×Universal Primer A Mix(適宜「UPM」という)をForward Primerとして用いた。PCR反応にはGeneAmp(登録商標) PCR System 9600(Applied Biosystems社製)を使用した。以下に反応液組成および反応条件を示す。
テンプレートDNA(100ng/μl) 2.5μl、10×UPM 5μl、Reverse primer 3(5μM) 2μl、TaKaRa Ex Taq(5 units/μl) 0.25μl、dNTP mixture(各2.5mM)4μl、10×Ex Taq buffer(20mM Mg2+ 添加)5μl、滅菌超純水 31.25μl、(合計50μl)。
94℃×5分間の後、94℃×30秒間→67℃×30秒間→72℃×1分間を30サイクル行った後、72℃×7分間とし、その後4℃一定とした。
DNA polymeraseとしてKOD-plus-(東洋紡社製)を用いた。Reverse primerとして10×UPM(タカラバイオ株式会社製)を用いた。以下に反応液組成および反応条件を示す。
テンプレートDNA(100ng/μl) 2μl、Forward primer 3(5μM) 2μl、10×UPM 5μl、KOD ‐plus-(1 unit/μl) 1μl、dNTPs(2mM) 5μl、MgSO4(25mM) 2μl、10×Buffer for KOD -plus- 5μl、滅菌超純水 28μl、(合計50μl)。
96℃×2分間の後、98℃×10秒間→72℃×1分間→68℃×1分間を30サイクル行った後、4℃一定とした。
アガロースをTAE buffer(20mM Tris/10mM 酢酸/1mM EDTA)中で完全融解させ、ゲル製作板上で固化させて電気泳動用ゲルを作製した。PCR産物に1/10容量の10×Loading buffer(タカラバイオ株式会社製)を加え、アガロースゲル中で電気泳動を行った(100V、約1時間)。マーカーは1Kb plus DNA ladder(Invitrogen社製)を使用した。泳動終了後、エチジウムブロマイドを1μl/mlとなるようにTAE bufferに加えた溶液にゲルを浸して10分間振とうした後、UVトランスイルミネーター上でバンドを確認した。
DNA断片をカッターナイフでアガロースゲルから切り出し、Rapid Gel Extraction System(MARLIGEN BIOSCIENCES社製)を用いてDNAを抽出した。実験操作はメーカー指定の方法で行われた。
KOD -plus- DNA polymeraseは、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性が強いため、PCR産物の末端は平滑化されており、直接TAクローニングに使用することができない。そこで、以下の反応液組成、反応条件で3’-RACE PCR産物の3’末端にdAを付加した。反応終了後、反応液全量をRapid PCR Purification Systems(MARLIGEN BIOSCIENCES社製)で精製した。実験操作はメーカー指定の方法で行われた。
TaKaRa Ex Taq(5units/μl) 0.25μl、10×Ex Taq buffer(20mM Mg2+ 添加)5μl、dNTP mixture(各2.5mM) 4μl、ゲル抽出産物 40μl、(合計49.25μl)。
72℃で2時間ヒートブロックにて加熱した。
pGEM(登録商標)-T Easy Vector Systems(Promega社製)を用いて、PCR産物をpGEM(登録商標)-T Easy Vectorにライゲーションした。反応液組成、反応条件を以下に示した。
pGEM(登録商標)-T Easy Vector 1μl、2×Rapid Ligation Buffer 10μl、PCR産物 8μl、T4 DNA Ligase 1μl、(合計20μl)。
ピペッティングによって撹拌した後、室温で1〜2時間静置した。
E. coli DH5αのグリセロールストックをLBプレート培地に播き、37℃で一晩培養した。シングルコロニーをピックアップしLB液体培地5mlに植菌し、37℃で12時間振とう培養を行った。バッフルつきの培養器に入ったSOB培地 50mlに前培養液を100μl植菌し、18℃で振とう培養を行った。OD600=0.5になったところで培養を終了し、氷上で5分間冷却した。遠心分離(4℃、3000rpm、5分間)により菌体を回収し、上清を除いた。氷冷したTransformation buffer(10mM PIPES、15mM CaCl2、250mM KCl)17mlを加え氷上で懸濁し、さらに5分間氷冷した。遠心分離(4℃、3000rpm、5分間)し、上清を除去した。Transformation buffer 4mlを加え氷上で懸濁し、室温のDMSOを300μl加え、懸濁後5分間氷冷した。100μlずつ遠心チューブに分注し、液体窒素に入れ凍結した。使用するまで、−80℃で保存した。E.coli Rosetta-gamiも同様にしてコンピテントセルを作製した。
作製したE. coli DH5αコンピテントセル100μlにライゲーション反応液20μl(全量)を加え、15分間氷冷した。その後、42℃の恒温水槽で60秒間ヒートショックを行い、直ちに5分間氷冷した。全量をLBプレート培地(アンピシリン添加)に播き、37℃で約12時間培養した。
コロニーのマスタープレートを作製した後、Taqポリメラーゼ(タカラバイオ株式会社製)を用いたコロニーダイレクトPCRでPCR産物が宿主細胞に挿入されているか確認を行った。以下に1コロニーあたりの反応液の組成および反応条件を示す。なおPCR終了後、反応液全量(10μl)に10×Loading buffer(タカラバイオ株式会社製)を1μl混合し、1.2%(w/v)アガロースゲルで電気泳動し、バンドを確認した。
TaKaRa Ex Taq(5units/μl) 0.1μl、10×Ex Taq buffer(20mM Mg2+ plus) 1μl、dNTP mixture(各2.5mM) 0.8μl、T7 promoter -1(5μM) 1μl、SP6 promoter -1(5μM) 1μl、(合計10μl)。
94℃×5分間の後、94℃×30秒間→50℃×30秒間→72℃×1分間を30サイクル行った後、72℃×7分間とし、その後4℃一定とした。
コロニーダイレクトPCRによりDNA断片が挿入されていることが確認できたコロニーを、LB液体培地5ml(アンピシリン添加)に植菌して培養し、Rapid plasmid miniprep system(MARLIGEN BIOSCIENCES社製)を用いてプラスミドを抽出した。実験操作はメーカー指定の方法で行われた。
プラスミド 150ng、T7 promoter -1 またはSP6 promoter -1(3.2μM) 1μl、5×BigDye Sequencing Buffer 1μl、Ready Reaction Premix 2μl、滅菌超純水で10μlにメスアップした。
96℃×1分間の後、96℃×10秒間→50℃×5秒間→60℃×4分間を25サイクル行った後、4℃一定とした。
(3−1)5’-RACE PCR用プライマーの設計
上述Forward Primer 2で3’-RACE PCRを行った際に得られたDFA67のisoformと考えられる塩基配列を元に下記の5’-RACE PCR用プライマーを作製した。
Reverse primer 5:5’-AGG TGA ATC AAC GGA ACA TGC GAC A-3’(配列番号11)
(3−2)5’-RACE PCR
下記の反応液組成で5’-RACE PCRを行った。DNA polymerase としてKOD - plus-(東洋紡社製)を用いた。Forward primerにはUPM(タカラバイオ株式会社製)を用いた。
KOD -plus-(5 units/μl) 1μl、10×Buffer for KOD -plus- 5μl、dNTPs(2mM) 5μl、MgSO4(25mM) 2μl、UPM 5μl、Reverse primer 5(5μM) 3μl、cDNA(5’) 200ng、滅菌超純水で50μlにメスアップした。
94℃×2分間の後、98℃×10秒間→68℃×2分間を30サイクル行った後、68℃×1分間とし、その後4℃一定とした。
前述の通り、DFA67のアレルゲン活性にジスルフィド結合が重要な役割を果たしている可能性があるため、本研究で発現ベクターとしてpCold TF DNA(タカラバイオ株式会社製)を用いることにした。pCold TF DNAは、大腸菌シャペロンの一種であるtrigger factor(「TF」と略記する場合がある)を可溶化タグとする融合型のコールドショックベクターであり、発現精製用に6×His tagがついており、容易に精製することが可能である。
rDFA67発現用のプライマーとして以下のものを作製した。forward primer、reverse primerにはそれぞれNdeI、XbaIの制限酵素サイトを付加した(NdeIサイト:CAT ATG、XbaIサイト:TCT AGA)。
Forward primer 6:5’- CGC CAT ATG GCC GAA TAT AAT TAT CCA-3’(配列番号12)
Reverse primer 6:5’- GGC TCT AGA TCA ATT ATT TTT GCT GAA ATA TTC-3’(配列番号13)
(4−2)挿入DNAのPCR増幅
DNA polymeraseとしてKOD -Plus-(東洋紡社製)を用いた。反応液組成および反応条件を以下に示す。PCR産物から5μl取り、アガロースゲル電気泳動してバンドを確認した。その後、残りの45μlをRapid PCR Purification Systems(MARLIGEN BIOSCIENCES社製)を用いて精製した。
KOD -plus-(1.0U/μl) 1μl、10×Buffer for KOD -plus- 5μl、2mM dNTPs 5μl、25mM MgSO4 2μl、Forward primer 6(5μM) 3μl、Reverse primer 6(5μM) 3μl、D.farinae cDNA(100ng/μl) 2.5μl、滅菌超純水 28.5μl、(合計50μl)。
94℃×2分間の後、98℃×10秒間→57℃×30秒間→68℃×1分間を35サイクル行った後、4℃一定とした。
下記反応液をそれぞれ37℃で7時間反応させた。反応液を全量アガロースゲル電気泳動し、MinElute Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いてDNAをゲルから抽出した。実験操作はメーカー指定の方法で行われた。ただし最終溶出は、滅菌超純水10μlで行われた。
精製産物 50μl、NdeI(4〜12 U/μl) 1μl、XbaI(8〜20 U/μl) 1μl、10×T buffer 6.5μl、BSA 6.5μl、(合計65μl)。
pCold TF DNA(30ng/μl) 10μl、NdeI(4〜12 U/μl) 1μl、XbaI(8〜20 U/μl) 1μl、10×T buffer 3μl、BSA 3μl、滅菌超純水 12μl、(合計30μl)。
上記のゲル抽出産物を用いて挿入DNAを、pCold TF DNAにライゲーションした。下記反応液を15℃で一晩インキュベートした。その後、反応液全量にE. coli DH5αコンピテントセルを100μl混和し、上述の方法で形質転換を行った。
pCold TF DNA 5μl、挿入DNA 10μl、10×ligation buffer(Promega社製)1.78μl、T4 DNA ligase(Promega社製) 1μl、(合計17.8μl)。
生育したコロニー15個をピックアップし、コロニーダイレクトPCRを行い挿入DNAの有無を確認した。反応液組成および反応条件を以下に示す。
TaKaRa Ex Taq(5units/μl) 0.1μl、10×Ex Taq buffer(20mM Mg2+ 添加)1μl、dNTP mixture(各2.5mM) 0.8μl、pCold-TF-F1(5μM) 1μl、pCold-TF-R(5μM) 1μl、滅菌超純水 6.1μl、(合計 10μl)。
94℃×5分間の後、94℃×30秒間→55℃×30秒間→72℃×1分間を30サイクル行った後、72℃×7分間とし、その後4℃一定とした。
プラスミド(30ng/μl) 5μlと、発現宿主 E.coli Rosetta-gamiコンピテントセル100μlとを混和し、上述の方法で形質転換を行った。LBプレート培地にはクロラムフェニコール、カナマイシン、テトラサイクリン、およびアンピシリンを添加した。シングルコロニーを2×YT培地5mlに植菌し、37℃で約18時間、280〜290rpmの条件で振とう培養を行った。この前培養液を本培養の2×YT培地に植菌し、37℃、140rpmで培養し、OD600=0.5になったところでIPTGを終濃度0.1〜1.0mMになるように加え、15℃で24時間発現誘導を行った。遠心分離(13,000rpm、10分間、4℃)により菌体を回収し、リン酸緩衝液(PBS)に懸濁後、超音波で菌体を破砕した。得られタンパク質を遠心分離(13,000rpm、10分間、4℃)により可溶性画分(上清)と不溶性画分(沈殿)とに分けた。これらを使用するまで−30℃で保存した。
5ml分の菌体超音波破砕物(可溶性画分) 1mlをHisTrap HP(GE Healthcare社製) 1mlカラムにアプライし、イミダゾール濃度20〜500mMのLinear gradientで溶出した。実験操作はメーカー指定の方法により行われた。
Binding buffer:20mM imidazole in phosphate buffer
Elution buffer:500mM imidazole in phosphate buffer
溶出画分をプールし、PD−10カラム(GE Healthcare社製)を用いてthrombin cleavage buffer(Novagen社製)に置換した。実験操作はメーカーの指定の方法により行われた。Buffer交換後のサンプル3.5mlにThrombin Cleavage Capture Kit(Novagen社製)に添付されているThrombinを1μl添加し、4℃で一晩反応させた。反応液全量を再びHisTrap HP 1mlカラムにアプライし、上述と同様にimidazole gradientで溶出させた。溶出画分をプールし、PD−10カラムを用いてPBSにバッファー交換した。100μlずつに分注し、使用するまで−30℃で凍結保存した。
Bio-Rad Protein Assay(Bio-Rad社製)を用い、タンパク質の定量を行った。標準として既知のタンパク濃度のBSAを用いた。実験操作はメーカー指定の方法により行われた。
(5−1)DFA67のisoform発現用プライマーの作製
取得したisoformの全長遺伝子配列により得られた推定アミノ酸配列から、N末端にシグナル配列を有していることが分かった。そこで、シグナル配列を含むタイプのものと、シグナル配列を含まないタイプのものの二種類を作製するため、以下のプライマーを設計した。forward primerにはNdeI制限酵素サイト(CAT ATG)を、reverse primerにはEcoRI制限酵素サイト(GAA TTC)を付加した。
ISOexpF1:5’-GTT CAT ATG GCC AAT ACA ATG ATG AT-3’(配列番号14)
ISOexpF2:5’-GGA CAT ATG GCT GAA CAA TGT CAA A-3’(配列番号15)
ISOexpR:5’-TTT GAA TTC TCA AAG TTC TGA TTT AGC-3’(配列番号16)
(5−2)挿入DNAのPCR増幅
下記の反応液組成および反応条件で挿入DNAの増幅を行った。PCR後の反応液をRapid PCR Purification Systems(MARLIGEN BIOSCIENCES社製)を用いて精製した。
KOD-plus-(1.0U/μl) 1μl、10×buffer for KOD-plus- 5μl、2mM dNTPs 5μl、25mM MgSO4 2μl、ISOexpF1またはISOexpF2(5μM)3μl、ISOexpR(5μM) 3μl、cDNA(3’)(100ng/μl) 2.5μl、滅菌超純水 28.5μl、合計50μl。
94℃×2分間の後、98℃×10秒間→57℃×30秒間→68℃×1.5分間を35サイクル行った後、68℃×1分間とし、その後4℃一定とした。
下記の反応液組成で反応溶液を調製し、37℃で3時間インキュベートした。その後は、上述と同様にして、ライゲーション、E.coli DH5αへの形質転換、コロニーダイレクトPCR、液体培養、プラスミド抽出、およびDNAシークエンシングを行った。
精製産物 50μl、NdeI(4〜12 U/μl) 1μl、XbaI(8〜20 U/μl) 1μl、10×H buffer 5.77μl、(合計57.77μl)
<ベクターDNA>
pCold TF DNA(30ng/μl) 10μl、NdeI(4〜12 U/μl) 1μl、XbaI(8〜20 U/μl) 1μl、10×H buffer 3μl、滅菌超純水 15μl、(合計30μl)
(5−4)DFA67のisoformの発現および精製
上述と同様の方法で二種類のDFA67のisoformを発現させた。菌体破砕後の可溶性画分をHisTrapカラムでアフィニティー精製を行い、Thrombinでトリガーファクターを切り離した粗精製標品を取得した。
(6−1)SDS-PAGE
<試薬>
・A液(30%アクリルアミド溶液):アクリルアミドHQ 29.2g、ビスアクリルアミド 0.8g、蒸留水で100mlにメスアップ
・B液(1.5M Tris-HCl、pH8.8):Tris(hydroxymethyl aminometyhane) 18.2g、Sodium dodecylsulfate(SDS) 0.4g、HClにてpH8.8に調整後、蒸留水で100mlにメスアップ
・C液(0.5M Tris-HCl、pH6.8):Tris(hydoroxymethyl aminomethane) 6.1g、Sodium dodecylsufate(SDS) 0.4g、HClにてpH6.8に調整後、蒸留水で100mlにメスアップ
・D液(10% 過硫酸アンモニウム)
・TEMED
・染色液(エタノール:酢酸:水=9:2:9に、0.25% クマシーブリリアントブルーR−250(CBB溶液)を添加)
・脱色液(エタノール:酢酸:水=25:8:25)
・泳動用buffer(25mM Tris、192mM グリシン、0.1%SDS)
・2×sample buffer:0.5M Tris-HCl(pH6.8) 2ml、10% SDS 4ml、2-mercaptethanol 1.2ml、グリセロール 2ml、Bromo Phenol Blue 数滴、蒸留水で10mlにメスアップ。
・SDS−PAGE電気泳動装置(Dual Mini Slub)
・パワーサプライ(ATTO CROSS POWER 1000、アトー株式会社、Tokyo Japan)
・分子量マーカー:Amersham Biosciences社製LMW(Phosphorylase b 97,000、Bovine Serum Albumin 66,000、Ovalbumin 45,000、Carbonic Anhydrase 30,000、Soybean Trypsin inhibitor 20,100、α-Lactalbumin 14,400)。
SDS−PAGEは、Laemmliの不連続緩衝液系における電気泳動法に従って行われた。以下は、12.5%ミニスラブゲル2枚分の作製方法である。
(i)A液 7.5ml、B液 4.5ml、および蒸留水 6.0mlを混合し、アスピレーターで脱気した。その後、TEMED 10μl、およびD液 80μlを加えゲルが重合する前に速やかにスラブに8分目までいれた。
(ii)空気と分離ゲル溶液との接触を遮断し、良好な重合度と均一なゲル上端を得るため、水飽和ブタノールを分離ゲル溶液上に重層した。
(iii)重合が完了した後、重層した水飽和ブタノールを蒸留水で洗い流した。A液 0.9ml、C液 1.5ml、および蒸留水 3.6mlを混合し、アスピレーターで脱気して4.5%濃縮ゲル溶液を作製した。
(iv)濃縮ゲル溶液にTEMED 10μl、およびD液 20μlを加え、ゲルが重合する前に速やかにスラブにいれ空気が入らないようにコームを差し込んだ。
(v)重合が完了した後、装置に取り付け、ゲルとbufferとの間に空気が入らないように泳動bufferを満たした。各サンプルにsample bufferを加え、3分間煮沸し、分子量マーカーとサンプルとを泳動した。ゲル1枚当たり電圧1000V、電流30mAで泳動し、色素がゲルの先端まで達したところで泳動を終了した。
<ダニ虫体抽出物(Dfb)の取得>
ダニ虫体をPBS(pH7.2)、0.1mM PMSF(フェニルメチルスルフォンフルオライド)、5mM EDTA、1mM monoiodoacetic acid、5mM EPNP(1,2-epoxy-3-(p-nitrophenoxy)-propane)中で乳鉢を用いてすり潰した後、−80℃で一晩凍結させた。その後凍結乾燥を行ったものをダニ虫体抽出物(Dfb)とし、使用するまで−80℃で保存した。
Dfb 3.6gをlysis buffer(5M urea、2M thiourea、2% CHAPS、2% SB 3−10、1% DTT、2% AmpholineTM)36mlに溶解し、40000gで10分間遠心分離し不溶性成分を除去した。その後、60% TCA(トリクロロ酢酸)を終濃度20%となるように加え、氷上で1.5時間 静置した。静置後、3,500rpm、0℃で30分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿を氷冷アセトン 10mlで洗浄した。洗浄後、3,500rpm、0℃で20分間遠心分離し、遠心後上清を捨て、沈殿に氷冷ジエチルエーテルを加え十分懸濁した。再度3,500rpm、0℃で20分間遠心分離し、上清を捨て、デシケーター内で減圧乾固させた。得られたタンパクをlysis bufferに十分懸濁し、タンパク濃度を測定後、使用するまで−80℃で保存した。
標準として既知のタンパク濃度のBSAを用い、TCA沈殿後のDfbをBio-Rad Protein Assayを用いて発色させ、595nmの吸光度を測定することによってタンパク量をBSA換算タンパク濃度で算出した。
・Rehydration:
TCA沈殿処理後、lysis bufferに溶解した試料を25μg/200μl-lysis bufferに調整し、rehydration trayに供した後、Immobiline DryStrip gel 7 cm(GE healthcare社製)の膨潤と試料の吸着とを同時に行った。また、試料の乾燥防止のために、DryStrip Cover Fluidを適量重層した。なお、rehydrationは、室温で一晩行われた。
rehydration後のImmobiline DryStrip gelをMultiphorII水平型電気泳動装置上にゲル面が上、電極のマイナス側に塩基性、プラス側に酸性となるようにセットした。ゲルの上をDryStrip Cover Fluidで満たし、高温循環槽で温度を20℃に保ち、約12時間 電気泳動を行った。電気泳動後、Immobiline DryStrip gelはピペットに入れ、使用するまで−30℃で保存した。
・一次元電気泳動後のImmobiline DryStrip gelの平衡化:
Immobiline DryStrip gelをゲル面が上になるようにrehydration trayに並べ、equilibration buffer(A)(urea 7.2g、glycerol 7.5625g、10% SDS 2ml、0.5M Tris- HCl(pH6.8) 2ml、DTT 100mg/20ml−超純水)を1本当たり3〜4ml 加え、15分間 振盪してImmobiline DryStrip gelの電荷をキャンセルし、またジスルフィド結合を還元して開裂した。
Acrylamide gel(15%)上に等電点電気泳動を行った後のDryStrip gelをゲル面が手前、酸性が左、塩基性が右にくるように乗せ、酸性側の左にLMW markerを2μl しみ込ませた濾紙を乗せてその上にBPBで着色した低融点アガロース(1%)を重層し固化した。アガロースが固化したら泳動槽electrophoresis bufferを入れ、ゲル1枚当たり20mAで約70分間電気泳動を行った。
2D-銀染色試薬・II「第一」(第一化学薬品株式会社、Tokyo、Japan)キットを用い、タンパク質を染色した。操作はメーカー指定の方法により行われた。
<anti-His抗体>
PVDFメンブレン(MILLIPORE社製)を100%メタノールに浸した後、転写buffer(メタノール 20%、泳動用buffer 10%)に浸し、ろ紙6枚を転写bufferに浸した。セミドライ式転写装置(ATTO社製)に、ろ紙3枚、メンブレン、SDS−PAGE後のゲル、ろ紙3枚の順にのせ、ゲルからPVDFメンブレンにタンパク質を転写した(1000V、58.5mA/1枚、1時間)。マーカー部分はCBB染色し、残りはBlocking buffer(3% スキムミルク、1% BSA in PBST)に浸し、1時間室温で振とうした。
上記の方法と同様の手順で行った。ただし、1次抗体はanti-Dfb Abをblocking bufferで4万倍希釈し、2次抗体はanti-rabbit IgGをblocking bufferで2万倍希釈した溶液を用いた。
上記の方法と同様の手順で行った。ただし、1次抗体はanti-rDFA67抗血清をblocking bufferで2万倍希釈し、2次抗体はanti-mouse IgG HRPをblocking bufferで2万倍希釈した溶液を用いた。
上記の方法でSDS-PAGEおよびメンブレンへの転写を行った後、メンブレンをblocking buffer(5% スキムミルク、1% BSA in PBST)に浸し、室温で4時間 振とうさせた。PBSTで5分間×5回洗浄した。
(7−1)BALB/cマウスの免疫化
精製標品rDFA67を抗原として用いた。抗原溶液(200μg/ml in PBS) 50μlと等量のTiterMax Gold(フナコシ社製)をルアーロック式シリンジで混合して乳化し、抗原・アジュバント溶液(100μg/ml)を作製した。これをBALB/c マウス(6週齢、メス)の腹腔へ注射した。注射は2週間毎に同量の抗原量で行い、充分な抗体価が得られるまで繰り返し行われた。
抗体価の測定は、96穴プレート(NUNC, Rochester, NY, USA)を使用し、ELISA法により行われた。rDFA67を1μg/mlとなるように100mM Sodium bicarbonate buffer(pH9.6)で希釈し、50μl/wellとなるようにプレートにアプライし、室温で2時間静置することで抗原コートを行った。コート後のプレートをWashing bufferで3回洗浄した。
(8−1)銀染色法
2次元電気泳動後のゲルをfixing solution(50%メタノール、10%酢酸)中で20分以上振盪し、固定化した。固定後、ゲル1枚当たり、50% メタノールで10分間振盪後、超純水で10分間 振盪し親水処理を行った。次にenhancing solution(0.005% Na2S2O3・5H2O)で1分間 振盪後、超純水で2回洗浄した。洗浄後staining solution(0.1% AgNO3)で20分間振盪後、超純水で2回洗浄した。洗浄後developing solution(HCHO 80μl、Na2CO3 4g/ 超純水 200ml)で発色させた。適度に発色したら、酢酸を適量入れ発色を停止させた。すぐに使用しないゲルはstock solution(5% グリセロール / 50% メタノール)に入れ、4℃で保存した。
銀染色の後、保存液に保存しておいたゲルからメスでスポットを切り出し、ゲルを1mm3程度にカットし、100mM ammonium bicarbonateで膨潤させた。working solution(30mM potassium ferricyanide:100mM sodium thiosulfate=1:1)を加えゲルの色が溶液の色(黄色)になるまでボルテックスミキサーに供した。
ZipTip(登録商標) C18(millipore社製)を、マニュアルに従って使用した。前処理液(50%CH3CN)を5分間ピペッティングして樹脂中の気泡を除去し、平衡化液(20% HCOOH)を5分間ピペッティングして樹脂を平衡化した。濃縮したサンプルをピペッティングにより樹脂に吸着させ、洗浄液(20% HCOOH)を5分間ピペッティングして塩を除去した。溶出液(50%CH3CN、5% HCOOH)15μlをシリコンで被覆した遠心チューブに分注しておき、5分間ピペッティングすることによりサンプルを溶出させた。真空エバポレーターで3分間濃縮し、最終サンプルとした。
高濃度に濃縮し脱塩したサンプルをGELoader Tip(Eppendorff社製)を用いてNano Tip(HUMANIX社製)にアプライし、先端にサンプルを集めた。装置(QSTAR(登録商標) Applied Biosystems社製)にセット後、適切な電圧でMS スペクトルを得た。強度の強く綺麗なスペクトルをさらにMS/MS解析を行った。得られたMS/MSスペクトルをBioAnalyst(Software)によって解析し、アミノ酸配列を得た。
(9−1)DTTシステム
700μlスケールで150mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.4)、50mM dithiothreitol(DTT)、30mM tert-Butyl hydroperoxide、200ng rDFA67(またはBSA(negative control))を含む反応溶液を調製し、DTTを添加した時間を0分として310nmの吸光度を測定し、酸化型DTTの産生量を測定した(参考文献:Beckmann P. et al. Mite allergen. Clin. Allergy Immunol.(2008)21: 161-82.)。コントロールとしてblank溶液も調製した。
rDFA67、Der f 2(positive control)を0.5μg/mlになるようにbicarbonate buffer(0.1M NaHCO3、pH9.2〜9.5)で希釈し、96 well ELISAプレート(NUNC社製)に50μlずつアプライし、室温で2時間静置して抗原をコートした。
(11−1)プライマーの設計
下記のような変異用プライマーを設計した。変異導入部位(TCT)の両側には約15塩基ずつの正常なDFA67塩基配列を付加した。ただし、M-primer 3に限っては二重変異部位がプライマーの5’末端部分と重複するため、M-primer 2で変異を導入した後のプラスミドをテンプレートとできるよう、変異後の配列を付加した。
M-primer 1:5’-GAT TTT ACT TTT GTA TCT CCA ACG GAA ATT ATT GCA T-3’(配列番号17)
M-primer 2:5’-TTC CGT AAA ATG AAC TCT GAA GTA ATC GCT TGT-3’(配列番号18)
M-primer 3:5’-TCT GAA GTA ATC GCT TCT TCA ACT GAT AGT AAA T-3’(配列番号19)
M-primer 4:5’-GTA CAT GGT GAA GTT TCT CCA GTT AAT TGG AAA CCA GG-3’(配列番号20)
(11−2)プライマーの5’リン酸化
購入した上記プライマーは、5’末端がリン酸化されていないため、T4 Polynucleotide Kinase(タカラバイオ株式会社製)を用いて5’末端にリン酸基を付加した。下記の組成の反応液を37℃のwater bathで1時間インキュベートした。
10×T4 Polynucleotide Kinase Buffer 1μl、100mM ATP 1μl、T4 Polynucleotide Kinase(10U/μl) 1μl、滅菌超純水 3μl、Primer(50μM) 4μl、(合計10μl)
(11−3)Polymerase、Ligase反応
AMAPTMMulti Site-Directed Mutagenesis Kit(MBL(登録商標) International Corporation製)を用いてPCRを行い、DFA67に変異を導入した。反応液組成、反応条件を以下に示す。PCR終了後、反応溶液全量にDpnI 0.5μlを加え、室温で10分間インキュベートした。
リン酸化プライマー(20mM) 2μl、10×PCR Buffer with MgSO4 1.25μl、pfu DNA polymerase(Fermentas社製) 0.5μl、10×Ligase Buffer 1.25μl、dNTPs 0.5μl、DNA ligase 0.5μl、Template DNA(30ng/μl) 3μl、滅菌超純水 16μl、(合計25μl)。
65℃×5分の後、95℃×2分間とし、その後95℃×20秒間→55℃×20秒間→65℃×10分間を25サイクル行った後、75℃×7分間とし、その後4℃一定とした。
反応後の溶液全量にE.coli DH5αコンピテントセル100μl)を加え、前述の方法で形質転換した。シングルコロニー約10個をピックアップし、5ml LB液体培養を行い、前述の方法でプラスミドを抽出した。これらをT7 promoter -1またはSP6 promoter -1を用いて前述の方法でDNAシークエンシングを行った。
変異導入を確認したプラスミドを用いて、前述の方法でE.coli rosetta-gamiに形質転換し、変異型rDFA67を発現および精製した。
前述の方法でSDS-PAGEを行い、銀染色および患者血清を用いた免疫染色を行った。
(1.DFA67およびDFA67のisoformの全長遺伝子配列取得と一次構造解析)
取得されたDFA67の全長塩基配列を図1に示す。DFA67の全長塩基配列長は1079bp、ORFは594bpであった。図1に示されたDFA67の全長塩基配列を配列番号23に示す。DFA67の塩基配列から推定されるアミノ酸数は198アミノ酸で、その理論分子量は22.4kDa、理論等電点は5.76であった。
(2−1)rDFA67の発現および精製、並びにrDFA67と患者血清中IgEとの反応性
DFA67の免疫化学的特性を調べるにあたって、発現ベクターとしてTF融合タンパク質として低温発現が可能なpCold TF DNAを、宿主としてジスルフィド結合形成能が強化されたE.coli Rosetta-gamiを用いてrDFA67の可溶性発現を試みた。図7にその結果を示す。図7(a)はSDS−PAGE後にゲルを銀染色した結果を示し、レーン1は分子量マーカーであり、レーン2はpCold TFで形質転換が行われた大腸菌の可溶性画分であり、レーン3はpCold TF-rDFA67で形質転換が行われた大腸菌の可溶性画分であり、レーン4はレーン3の可溶性画分についてHis-tagアフィニティー精製を行った後のサンプル、レーン5はレーン4のサンプルをthrombin消化した後のサンプル、レーン6はレーン5のサンプルをHis-tagアフィニティー精製した後のサンプルの結果である。また図7(b)は、最終精製標品を患者血清IgEで免疫染色した結果である。
図8(a)に発現させたDFA67のisoformをSDS−PAGE後に銀染色した結果を示す。図8(a)のレーン1は分子量マーカーであり、レーン2はpCold TFで形質転換が行われた大腸菌の可溶性画分であり、レーン3はpCold TF-isoform(+signal)で形質転換が行われた大腸菌の可溶性画分であり、レーン4はpCold TF-isoformで形質転換が行われた大腸菌の可溶性画分であり、レーン5はレーン3の可溶性画分についてHis-tagアフィニティー精製を行った後、thrombin消化した後のサンプル(isoform(+signal)の粗精製標品)、レーン6はレーン4の可溶性画分についてHis-tagアフィニティー精製を行った後、thrombin消化した後のサンプル(isoformの粗精製標品)の結果である。また図8(b)はisoform(+signal)の粗精製標品(レーン1)、およびisoformの粗精製標品(レーン2)について患者血清IgEで免疫染色した結果を示す。
(3−1)anti-rDFA67抗血清を用いた二次元免疫染色
作製したrDFA67と天然型DFA67(「nDFA67」という)との同等性を確認するため、BALB/cマウスを免疫化し、rDFA67に対する特異抗血清を取得した。それを用いてDfbの二次元免疫染色を行った。
rDFA67のアミノ酸配列を確かめるため、Q-TOF型nano ESI MS/MSにより解析を行った結果を図10に示す。図10(a)はnDFA67の結果であり、(b)はrDFA67の結果である。rDFA67からはnDFA67と同様のMSピークが確認された。またrDFA67についてスペクトル中の3つのピークを選択し、MS/MS解析を行ったところ、DFA67の塩基配列から推定されるアミノ酸配列と完全に一致した(図10(c))。図10(c)に表示されたアミノ酸配列を配列番号35〜40に示す。
(4−1)DTTシステムによるperoxidase活性測定
DTTを用いたperoxidase活性測定システムでrDFA67の酵素活性について調べた結果を図11に示す。rDFA67またはBSAによって酸化されたDTTの量を310nmの吸光度から測定したところ、blankにおいてDTTが自然酸化されるのと比較して、rDFA67では酸化型DTTの量が有意に増加していたため、rDFA67はperoxidase活性を有していることが示唆された。
(5−1)患者血清IgEに対する反応性
ダニに対するRAST値が3〜6の患者29検体について血清中のrDFA67特異IgE量をELISA法により測定した結果を図12に示す。健常者の血清7検体の平均値に標準偏差の3倍を加えた値を図12中に破線で示しており、これよりも高い場合を陽性と判断した。その結果、29検体中14検体が陽性、すなわちrDFA67のダニアレルギー患者との反応頻度は48.3%であるということが分かった。
還元状態(「還元型」ともいう)のrDFA67と非還元状態(「非還元型」ともいう)のrDFA67とを用いて、ダニアレルギー患者血清を用いた免疫染色を行い、IgE反応性を調べた結果を図13に示す。図13(a)は銀染色の結果であり、レーン1はLMW marker、レーン2は還元状態のrDFA67、レーン3は非還元状態のrDFA67をそれぞれ示す。また図13(b)はダニアレルギー患者血清IgEで免疫染色を行った結果であり、レーン1は還元状態のrDFA67、レーン2は非還元状態のrDFA67をそれぞれ示す。
rDFA67がジスルフィド結合を介してどのような立体構造を取っているのかを確認するため、還元(カルバミドメチル化)状態および非還元状態のrDFA67をSDS−PAGEにより分離し、得られたバンドをゲルから切り出し、Asp Nでゲル内消化してQ-TOF型nano ESI MSによりピークを解析した。還元状態のrDFA67のMSスペクトルを図14に示し、非還元状態のrDFA67のMSスペクトルを図15に示す。
システイン残基とIgE結合性との関係を明らかにするため、Cys 52/172 Ser変異体、Cys 71/76 Ser変異体、Cys 52/71/76/172 Ser変異体を作製し、非還元状態および還元状態におけるIgE結合性を免疫染色によって解析した。その結果を図17に示す。
本発明では、二次元電気泳動によるIgE免疫染色でダニアレルギー患者の血清と67.5%の反応頻度を示したDFA67を新規アレルゲンとして見出した。そしてこのDFA67の免疫化学的な特性を調査した。DFA67は二次元電気泳動で等電点5〜5.5、分子量25kDaに分離される分子で、存在量は少ないものの、IgE反応頻度の高さから重要なアレルゲンであると考えられる。
Claims (7)
- 以下の(b)のタンパク質であって、単量体であるタンパク質:
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、4つのシステイン残基がセリン残基に置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、アレルゲン活性を有するタンパク質。 - 請求項1に記載のタンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
- 下記の(d)であることを特徴とする請求項2に記載のポリヌクレオチド:
(d)配列番号3に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。 - 請求項2または3に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
- 請求項4に記載のベクターで形質転換されてなる形質転換体。
- 請求項1に記載のタンパク質を含有することを特徴とするダニアレルギー性疾患治療薬。
- 請求項1に記載のタンパク質を含有することを特徴とするダニアレルギー性疾患の診断キット。
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