ES2887409T3 - Proteína de Dermatophagoides farinae novedosa - Google Patents
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Abstract
Una proteína de Dermatophagoides farinae seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c): (a) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2; (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que se ha(n) sustituido, suprimido o añadido 1 a 10 aminoácido(s) con relación a la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2 y que tiene reactividad con la IgE sérica de un paciente de una enfermedad alérgica causada por Dermatophagoides farinae; y (c) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 % o superior de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2 y que tiene reactividad con la IgE sérica de un paciente de una enfermedad alérgica causada por Dermatophagoides farinae.
Description
DESCRIPCIÓN
Proteína de Dermatophagoides farinae novedosa
Campo técnico
La presente invención se refiere a una proteína novedosa derivada de Dermatophagoides farinae y a la utilización de la proteína.
Técnica anterior
Ejemplos típicos de enfermedades alérgicas incluyen rinitis alérgica, tales como polinosis, conjuntivitis alérgica, asma bronquial de tipo atópica y dermatitis atópica y en los años recientes, las tasas de morbilidad de estas enfermedades alérgicas en Japón continúan aumentando. Se sabe que un número significativo de las causas de aparición para el asma bronquial de tipo atópica o para la dermatitis atópica implican el polvo doméstico, que incluye cuerpos de ácaros, heces de ácaros, hongos, pelos de animales, tales como mascotas. Particularmente, se sabe que los alérgenos derivados de los ácaros del polvo doméstico que viven en las casas desempeñan un papel importante (Bibliografía no de patente 1).
La mayoría de los ácaros del polvo doméstico típicos consisten en Dermatophagoides farinae (a continuación en el presente documento, abreviado como "Der f") y Dermatophagoides pteronyssinus (a continuación en el presente documento, abreviado como "Der p"). Se sabe que estos ácaros del polvo doméstico se propagan más eficazmente en condiciones cálidas y húmedas; sin embargo, en la actualidad, con un número aumentado de edificios altamente herméticos y altamente aislados térmicamente, hay más posibilidades que se mantenga el entorno interior en condiciones adecuadas para los ácaros del polvo doméstico todo el año y por tanto, la población de ácaros de polvo doméstico todavía está aumentando. Se cree que esto es un factor causante del aumento en las enfermedades alérgicas.
Para el tratamiento de estas enfermedades alérgicas, por ejemplo, se utilizan un fármaco antihistamínico, un fármaco antiinflamatorio esteroideo, un fármaco leucotrieno, un inhibidor de la desgranulación y un inhibidor de citocinas Th2; sin embargo, todos estos son meramente para tratamientos sintomáticos. Al mismo tiempo, la inmunoterapia alergénica que incluye la inmunoterapia alergénica subcutánea (SCIT; del inglés, subcutaneous allergen immunotherapy) y la inmunoterapia alergénica sublingual (SLIT; del inglés, sublingual allergen immunotherapy) se han desarrollado satisfactoriamente en los últimos años. La inmunoterapia alergénica es un método de tratamiento por el que las respuestas inmunitarias a un alérgeno se controlan mediante la administración del alérgeno al cuerpo en pequeñas cantidades y en el momento actual, se considera que la inmunoterapia alergénica es el único método capaz de cura completa de enfermedades alérgicas.
El desarrollo de la inmunoterapia alergénica debe acompañarse de investigación y comprensión de los alérgenos causantes. Por ejemplo, se ha notificado que los alérgenos antigénicos denominados Der f 1, Der f 2 y Der f 3 se encuentran en el cuerpo o en las heces de Dermatophagoides farinae, del que se dice que tiene una gran población en Japón y estos alérgenos ya se han clonado (Bibliografía no de patente 2 y 3). De acuerdo con los informes pasados, se sabe que un 80 % o más de los pacientes que padecen alergia a los ácaros tienen IgE específica para uno cualquiera o más de estos alérgenos (Bibliografía no de patente 4). Además, la investigación exploratoria para los alérgenos de Dermatophagoides farinae se está llevando a cabo activamente y por tanto, hay una demanda de proteínas alergénicas novedosas que sean más útiles para la prevención y el tratamiento de enfermedades alérgicas causadas por ácaros (Bibliografía no de patente 5).
Listado de citas
Bibliografía no de patentes
Bibliografía no de patente 1: Korsgaard J, et al., Allergy, 53:77-83, 1998
Bibliografía no de patente 2: Dilworth RJ, et al., Clinical and Experimental Allergy, 21:25-32, 1991
Bibliografía no de patente 3: Yuuki T, et al., Jpn. J. Allegol. , 39(6):557-561, 1990
Bibliografía no de patente 4: Heymann PW, et al., J. Allergy Clin. Immunol., 83:1055-1067, 1989
Bibliografía no de patente 5: Thomas WR, et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 129:1-18, 2002
El documento EP 0498124 A1; J.A. ASTURIAS ET AL., CLINICAL & EXPERIMENTAL ALLERGY, vol. 39, n.° 7, 2009, páginas 1088 - 1098; K.-W. CHEN ET AL., ALLERGY, vol. 67, n.° 5, 2012, páginas 609 -621; y FUJIKAWA A ET AL., MOLECULAR IMMUNOLOGY, PERGAMON, Reino Unido, vol. 33, n.° 3, 1996, páginas 311 - 319, desvelan los alérgenos de Dermatophagoides farinae.
Problema técnico
La presente invención se refiere a una proteína novedosa de Dermatophagoides farinae y a la provisión de, por ejemplo, un fármaco de diagnóstico para enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae utilizando la proteína.
Solución al problema
Los inventores de la presente invención realizaron investigaciones con el fin de resolver los problemas descritos anteriormente y los presentes inventores tuvieron éxito al obtener una nueva proteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 110 kDa y que presenta una reactividad elevada con la IgE sérica derivada de pacientes con enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae, a partir de heces de Dermatophagoides farinae y encontraron que este problema es útil como un fármaco de diagnóstico para enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae.
Es decir, la presente invención se refiere a los siguientes artículos 1) a 6).
1) Una proteína de Dermatophagoides farinae seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c): (a) una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2;
(b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que se ha(n) sustituido, suprimido o añadido 1 a 10 aminoácido(s) relativo(s) a la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2 y que tiene reactividad con la IgE sérica de un paciente de una enfermedad alérgica causada por Dermatophagoides farinae; y
(c) una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 % o superior de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2 y que tiene reactividad con la IgE sérica de un paciente de una enfermedad alérgica causada por Dermatophagoides farinae.
2) Un polinucleótido que codifica una proteína de Dermatophagoides farinae seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c):
(a) una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2;
(b) una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos en la que se ha(n) sustituido, suprimido o añadido 1 a 10 aminoácido(s) relativo(s) a la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2 y que tiene reactividad con la IgE sérica de un paciente de una enfermedad alérgica causada por Dermatophagoides farinae; y
(c) una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 % o superior de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2 y que tiene reactividad con la IgE sérica de un paciente de una enfermedad alérgica causada por Dermatophagoides farinae.
3) Un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los siguientes (d) y (e):
(d) un polinucleótido que incluye la secuencia de bases expuesta en el SEQ ID NO: 1; y
(e) un polinucleótido que incluye una secuencia de bases que tiene un 90 % o superior de identidad con la secuencia de bases expuesta en el SEQ ID NO: 1 y que es capaz de codificar una proteína que tiene alergenicidad de Dermatophagoides farinae.
4) Una proteína de unión que se une a la proteína de Dermatophagoides farinae definida en la reivindicación 4, en donde la proteína de unión es una molécula de anticuerpo.
5) La proteína de unión de acuerdo con 4) descrita anteriormente, en donde la proteína de unión es un anticuerpo monoclonal.
6) La proteína de Dermatophagoides farinae de acuerdo con 1) descrita anteriormente, para usar en el diagnóstico de una enfermedad alérgica causada por Dermatophagoides farinae.
Efectos ventajosos de la invención
La proteína de Dermatophagoides farinae de la presente invención presenta una reactividad elevada con la IgE sérica derivada de un paciente de una enfermedad alérgica causada por Dermatophagoides farinae y por tanto, la proteína puede utilizarse para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae. Dado que la proteína de Dermatophagoides farinae es una proteína diferente de los alérgenos conocidos de Dermatophagoides farinae, concretamente Der f 1 (peso molecular aproximadamente 27 kDa), Der f 2 (peso molecular aproximadamente 15 kDa) y Der f 3 (peso molecular aproximadamente 29 kDa), se activa una inmunoterapia alergénica más útil mediante la combinación de esta proteína con estos alérgenos.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un diagrama que ilustra los resultados de analizar un extracto bruto y un producto de purificación parcial (fraccionada por la cromatografía de intercambio aniónico utilizando FPLC) de Dermatophagoides farinae
mediante SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
La Figura 2 es un diagrama que ilustra los resultados de un análisis de la titulación de anticuerpos de IgE específicos del alérgeno purificado utilizando los sueros de cinco pacientes (puntuación de RAST > 2) que tienen enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae.
La Figura 3 es un diagrama que ilustra los resultados de una evaluación respecto a la alergenicidad (regulación positiva de Cd203c en basófilos) utilizando sangre periférica de pacientes (dos personas) de enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae. El porcentaje en el diagrama representa la población de la ventana de análisis P4 en las células como objetos de análisis.
Descripción de realizaciones
Proteína de Dermatophagoides farinae
La proteína de Dermatophagoides farinae de la presente invención es una proteína seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c):
(a) una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2;
(b) una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos en la que se ha(n) sustituido, suprimido o añadido 1 a 10 aminoácido(s) relativo(s) a la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2 y que tiene alergenicidad de Dermatophagoides farinae; y
(c) una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 % o superior de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2 y que tiene alergenicidad de Dermatophagoides farinae. La proteína de (a) que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2 es una proteína que se ha separado y purificado a partir de Dermatophagoides farinae realizando un fraccionamiento mediante cromatografía de intercambio aniónico usando FPLC y a continuación, eliminando las proteínas que tienen pesos moleculares de 100 kDa o menos mediante un método de ultrafiltración. Esta proteína tiene las siguientes propiedades.
i) La proteína presenta una reacción de unión con la IgE sérica de un paciente de una enfermedad alérgica causada por Dermatophagoides farinae.
ii) La proteína activa basófilos en un paciente de una enfermedad alérgica causada por Dermatophagoides farinae.
iii) La proteína tiene un peso molecular de aproximadamente 110 kDa, como se midió mediante SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
Por tanto, esta proteína es una proteína de Dermatophagoides farinae novedosa que es diferente de los alérgenos de Dermatophagoides farinae conocidos, incluyendo Der f 1 (peso molecular aproximadamente 27kDa), Der f 2 (peso molecular aproximadamente 15kDa) y Der f 3 (peso molecular aproximadamente 29kDa) (Bibliografía no de patente 5).
La proteína de Dermatophagoides farinae de la presente invención incluye una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos en la que se ha(n) sustituido, suprimido o añadido 1 a 10 aminoácido(s) relativo(s) a la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2 (artículo (b) descrito anteriormente), siempre que la proteína tenga alergenicidad de Dermatophagoides farinae. La proteína de Dermatophagoides farinae que incluye tal secuencia de aminoácidos puede ser, por ejemplo, una isoforma de una proteína de Dermatophagoides farinae que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2. En este caso, 1 a 10 aminoácidos que se suprimen, sustituyen o añaden indican, preferentemente 1 a 5 aminoácidos. La adición como se ha descrito anteriormente incluye la adición de uno a varios aminoácidos para ambos terminales.
En la presente memoria descriptiva, un "alérgeno" se refiere a una sustancias causante que induce una enfermedad alérgica. La "alergenicidad de Dermatophagoides farinae" puede ser una actividad de unión con IgE en mastocitos y de inducción de una reacción alérgica inmediata en una persona atópica (De Week, AL, et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 146:177-189, 2008) o de actividad de simplemente unión con IgE en el suero (véase el Ejemplo 2(i)). La proteína de Dermatophagoides farinae de la presente invención incluye una proteína que incluye una proteína que tiene un 90 % o mayor de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID: 2 cuando las secuencias de aminoácidos que corresponden a la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2 están alineadas adecuadamente (artículo (c) descrito anteriormente), siempre que la proteína tenga alergenicidad de Dermatophagoides farinae.
En este caso, la identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2 es preferentemente un 95 % o superior y más preferentemente un 98 % o superior. Respecto a la identidad con una secuencia de aminoácidos, por ejemplo, puede aplicarse un método para realizar el cálculo utilizando BLAST (herramienta de búsqueda de alineamiento local básica; del inglés, basic local alignment search tool; del National Center for Biological Information, NCBI) y ajustar los parámetros opcionales para los valores de conjunto iniciales.
La proteína de Dermatophagoides farinae de la presente invención puede ser una porción de una proteína más grande, tal como una proteína de fusión. En este caso, la secuencia a añadir a la proteína de fusión puede ser, por ejemplo, una secuencia que es útil para una purificación, tal como restos de histidina múltiples; o una secuencia de adición para asegurar la estabilidad en el momento de la producción recombinante.
La proteína de Dermatophagoides farinae descrita en el presente documento puede ser también un fragmento peptídico que tiene solo una región esencial para la alergenicidad. Por ejemplo, en particular, puede mencionarse adecuadamente un fragmento parcial que incluye un epítopo (epítopo de linfocitos T) que se reconoce específicamente por linfocitos T de pacientes con enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae. Se considera que la longitud del péptido que se une con una molécula HLA de clase II y a continuación, se presenta como un antígeno, incluye aproximadamente 10 a 34 restos de aminoácidos basándose en los resultados de un análisis peptídico (Chicz, R.M, et al., J. Exp. Med., 178:27-47, 1993) y por tanto, un fragmento que incluye al menos un epítopo de linfocitos T también incluye un péptido que tiene tal longitud.
Los epítopos de linfocitos T pueden identificarse mediante un examen utilizando péptidos solapantes que incluyen aproximadamente 10-meros a 20-meros, por ejemplo, el método descrito en Jahn-Schmid B. J., et al., Allergy Clin Immunol. 126(5):1068-71, 2010, or in Sone, T, et al., J. Immunol., 161:448-457, 1998.
Polinucleótido que codifica la proteína de Dermatophagoides farinae
El polinucleótido de la presente invención es un polinucleótido que codifica la proteína de Dermatophagoides farinae y los ejemplos adecuados del mismo incluyen: (d) un polinucleótido que incluye la secuencia de bases expuesta en el SEQ ID NO: 1; y (e) un polinucleótido que incluye una secuencia de bases que tiene un 90% o superior de identidad con la secuencia de bases expuesta en el SEQ ID NO: 1 y que codifica una proteína que tiene alergenicidad de Dermatophagoides farinae.
El polinucleótido de (e) incluye variantes del polinucleótido de (d). Estas variantes incluyen variantes alélicas de origen natural y variantes de origen no natural que pueden producirse utilizando técnicas mutagénicas que son bien conocidas en el campo pertinente.
Los polinucleótidos de la presente invención incluyen no solo ADN bicatenarios, sino diversos ADN o ARN monocatenarios denominados cadenas codificantes y cadenas no codificantes que constituyen los ADN bicatenarios. Una cadena no codificante puede utilizarse como, por ejemplo, una sonda. Los ADN incluyen, por ejemplo, ADNc y ADN genómicos obtenibles mediante clonación, tecnologías de síntesis química o combinaciones de las mismas. Los polinucleótidos de acuerdo con la invención pueden incluir también secuencias de bases, tales como secuencias en regiones no traducidas (UTR) y secuencias de vectores (incluyendo las secuencias de vectores de expresión), además de secuencias de bases que codifican los polipéptidos de acuerdo con la invención.
En el presente documento, las condiciones rigurosas pueden ser, por ejemplo, las condiciones descritas en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition, J. Sambrook et al., 1989). Concretamente, las condiciones rigurosas pueden ser condiciones en las que un polinucleótido se mantiene a temperatura constante de 65 °C durante 8 a 16 horas junto con una sonda en una solución que contiene 6x SSC (composición de 1x SSC: cloruro de sodio 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M, pH 7,0), SDS al 0,5 %, 5x Denhardt y 100 mg/ml de ADN de esperma de arenque y se somete a hibridación.
La identidad con la secuencia de bases expuesta en el SEQ ID NO: 1 es preferentemente un 95 % o superior y más preferentemente un 98 % o superior. Respecto a la identidad con la secuencia de bases relevantes, por ejemplo, puede aplicarse un método para realizar el cálculo usando BLAST y ajustando los parámetros opcionales para los valores de conjunto iniciales.
Adquisición del polinucleótido que codifica la proteína de Dermatophaaoides farinae
Puede clonarse un polinucleótido que codifica la proteína de Dermatophagoides farinae de la presente invención a partir de Dermatophagoides farinae y entre los ejemplos del método de clonación se incluyen los métodos para realizar una clonación utilizando los medios existentes, por ejemplo, un método de secuenciación aleatoria y un método de PCR.
Por ejemplo, es deseable que las sondas que hibridan específicamente con una parte de la secuencia de bases del polinucleótido de la presente invención y el cribado de una biblioteca de ADN genómico o de una biblioteca de ADNc se realicen utilizando la sonda. Con respecto a tal sonda, puede utilizarse una sonda que tenga cualquier secuencia o cualquier longitud, siempre que la sonda sea una sonda que hibride específicamente con al menos una porción del polinucleótido de acuerdo con la presente invención o una hebra complementaria del mismo.
El polinucleótido de la presente invención puede obtenerse también mediante la adquisición de una secuencia que hibride con un polinucleótido que incluya una porción o la totalidad del polinucleótido de la presente invención, usando un principio adecuado. Por ejemplo, puede emplearse un método de PCR para realizar la hibridación
utilizando un polinucleótido que incluya una porción del polinucleótido de la presente invención como un cebador y un método para usar el polinucleótido anteriormente mencionado que incluya una porción del polinucleótido de la presente invención como una sonda.
Por ejemplo, en un método para usar los medios de amplificación tal como PCR, los cebadores se producen respectivamente a partir de secuencias del lado 5' y del lado 3' del polinucleótido de la presente invención (o secuencias complementarias), se realiza una reacción de amplificación, tal como PCR, utilizando estos cebadores y utilizando un ADN genómico (o ADNc) como un molde, de manera que se amplifica la región de ADN que se inserta entre los dos cebadores y de este modo puede adquirirse un fragmento de ADN que incluye el polinucleótido en una gran cantidad.
El polinucleótido proporcionado por la presente invención puede producirse también mediante, por ejemplo, la modificación de un polinucleótido que incluya la secuencia de bases expuesta en el SEQ ID NO: 1 mediante un método tal como un método de introducción de mutaciones deliberadas o aleatorias.
En este caso, la planificación de la mutación en el momento de introducir sistemáticamente una mutación puede llevarse a cabo, por ejemplo, considerando una secuencia característica en la secuencia polinucleotídica. Entre los ejemplos de un método para introducir aleatoriamente una mutación se incluye un método de PCR y un método basado en un tratamiento mutagénico. Un método para introducir sistemáticamente una mutación puede ser un método de mutagénesis dirigida al sitio y específicamente, el método puede llevarse a cabo utilizando, por ejemplo, un kit del sistema de mutagénesis dirigida al sitio Mutan-Super Express Km (Takara Bio, Inc.). Puede utilizarse también un método de PCR recombinante (PCR protocols, Academic Press, Nueva York, 1990).
Producción de la proteína de Dermatophagoides farinae
La proteína de Dermatophagoides farinae de la presente invención puede obtenerse a través de la separación y purificación de Dermatophagoides farinae. El método para la separación y purificación no está particularmente limitado; sin embargo, por ejemplo, es deseable someter un extracto de Dermatophagoides farinae a separación y purificación utilizando técnicas conocidas convencionalmente, tales como filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad.
La proteína de Dermatophagoides farinae puede recogerse introduciendo un vector recombinante producido mediante la incorporación del polinucleótido de la presente invención en un vector adecuado, en células hospedadoras y de este modo expresar la proteína de Dermatophagoides farinae intracelular o extracelularmente. El vector para insertar el polinucleótido de la presente invención no está particularmente limitado, siempre que el vector sea capaz de replicarse en hospedadores, tales como bacterias tales como Escherichia coli y Bacillus subtilis, levaduras o células animales. Entre los ejemplos del vector se incluyen un ADN plasmídico o un ADN de fago. Respecto al ADN del vector utilizado para la construcción de un vector de expresión, se utiliza un ADN del vector que está fácilmente disponible y ampliamente distribuido. Entre los ejemplos del mismo se incluyen pUC19 (Takara Bio, Inc.), pTV118N (Takara Bio, Inc.), pMAMneo (Clontech Laboratories, Inc.), pGEX (GE Health care Corp.), pET160 (Invitrogen, Inc.) y pDEST (Invitrogen, Inc.).
Con el fin de transformar un hospedador utilizando el vector recombinante, la transformación puede llevarse a cabo utilizando, por ejemplo, un método de protoplastos, un método de células competentes o un método de electroporación. El hospedador no está particularmente limitado y se puede usar cualquier hospedador. Por ejemplo, puede utilizarse un animal, células derivadas de animales, una planta, células derivadas de plantas y microorganismos.
Un transformante obtenido de este modo puede cultivarse en condiciones adecuadas utilizando un medio que contiene, por ejemplo, una fuente de carbono que se pueda asimilar, una fuente de nitrógeno, una sal metálica y vitaminas. Las proteínas se recogen y purifican mediante métodos generales a partir del medio obtenido de este modo y puede obtenerse la proteína de Dermatophagoides farinae de la presente invención.
Prevención o tratamiento de enfermedades alérgicas causadas por Dermatophaaoides farinae
Dado que la proteína de Dermatophagoides farinae de la presente invención presenta una reactividad elevada con la IgE sérica derivada de pacientes con enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae, la proteína puede servir como un agente profiláctico o terapéutico para enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae y puede usarse para la prevención o el tratamiento de enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae cuando se administra a los pacientes.
En este caso, la prevención o el tratamiento de enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae se refiere específicamente a la prevención o tratamiento de todas las enfermedades alérgicas causadas por antígenos específicos Dermatophagoides farinae y entre los ejemplos de enfermedades alérgicas se incluyen asma bronquial de tipo atópica, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica y dermatitis atópica.
La prevención o el tratamiento de enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae puede ser, por ejemplo, inmunoterapia alergénica para enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae.
Dado que la proteína de Dermatophagoides farinae de la presente invención es diferente de los alérgenos conocidos convencionalmente que incluyen Der f 1 y Der f 2, cuando la proteína se combina con estos, puede lograrse una inmunoterapia alergénica más útil.
Cuando el agente profiláctico o terapéutico para las enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae se utiliza como un agente inmunoterapéutico alergénico, la proteína de Dermatophagoides farinae se utiliza directamente o en una forma de polvo después de haberse desecado o es preferible que el agente profiláctico o terapéutico se produzca como una preparación mezclada en la que generalmente se utilizan diversos aditivos, por ejemplo, se han añadido un estabilizante, un excipiente, un adyuvante de disolución, un agente de suspensión emulsionante, un agente tamponante, un agente calmante, un conservante y un colorante, mediante métodos convencionales según sea necesario.
Por ejemplo, una proteína de Dermatophagoides farinae que se ha purificado en una forma de polvo se disuelve en solución salina fisiológica que contiene fenol añadido a la misma y esta solución puede utilizarse como una solución madre de un antígeno para inmunoterapia alergénica.
Cuando el agente profiláctico o terapéutico para las enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae se utiliza como un agente inmunoterapéutico alergénico, el agente profiláctico o terapéutico puede incluir un adyuvante que tiene acción inmunopotenciadora en el momento de administración. Entre los ejemplos de adyuvantes se incluyen el adyuvante completo de Freund (CFA), adyuvante incompleto de Freund (IFA), sulfato de aluminio y potasio, lípido A, monofosforil lípido A; una formulación bacteriana, tal como BCG (Bacillus-Calmette-Guerrin); un ácido nucleico tal como CpG-ADN o ARNbc; una preparación de componente bacteriano, tal como tuberculina; un material polimérico natural, tal como hemocianina de lapa de ojo de cerradura o manano de levadura; muramil tripéptido y muramil tripéptido o un derivado de los mismos; alumbre, un copolímero de bloques no iónicos; y una citocina tal como la interleucina 2 (IL-2), factor estimulante de colonias de granulocitos (GM-CSF), interferón-a (iFN-a) or interferón-p (IFN-p). Puede utilizarse una clase o una combinación de dos o más clases de los mismos. El adyuvante puede utilizarse mediante la administración junto con la proteína de Dermatophagoides farinae de la presente invención simultáneamente, en un estado mezclado o como una emulsión.
Un agente profiláctico o terapéutico para enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae puede administrarse mediante un método de administración que implique una vía de administración convencional, por ejemplo, administración percutánea, transmucosa, por vía oral, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o instilación nasal. El agente profiláctico o terapéutico puede producirse como formulaciones de diversas formas de dosificación, tales como un comprimido, una cápsula, una preparación granular, una preparación de polvo, un trocisco, un comprimido sublingual, un jarabe, una preparación inyectable, un supositorio, un inhalante, una preparación absorbible por vía cutánea, una gota ocular, una gota nasal, un atomizador intranasal, un apósito, una preparación PAP, una pomada, una loción y una crema, de acuerdo con la forma de administración.
La dosis y la frecuencia de administración para el agente profiláctico o terapéutico para enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae puede variar dependiendo de, por ejemplo, la vía de administración y los síntomas; sin embargo, por ejemplo, la cantidad de administración puede seleccionarse adecuadamente para estar en el intervalo de 0,1 |jg a 100 mg por dosis y el agente profiláctico o terapéutico puede administrarse de una a varias veces por semana.
Diagnóstico de enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae
La proteína de Dermatophagoides farinae de la presente invención puede servir como un fármaco de diagnóstico para enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae, específicamente un fármaco de diagnóstico de reacciones intradérmicas para enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae. Mediante la inyección intradérmica con una pequeña cantidad de la proteína en un sujeto de prueba, puede entenderse el estado alérgico o el estado inmunitario de un cuerpo vivo contra Dermatophagoides farinae y esto puede usarse para la confirmación de un antígeno o el diagnóstico de una enfermedad.
Cuando la proteína se utiliza como un reactivo de diagnóstico de reacciones intradérmicas, la proteína de Dermatophagoides farinae de la presente invención obtenida mediante el presente método como se ha descrito anteriormente se utiliza después, por ejemplo, secándola en una forma en polvo, disolviendo este en suero salino fisiológico que contiene fenol y diluyendo la solución.
Proteína de unión capaz de unirse a la proteína de Dermatophaaoides farinae o a un fragmento peptídico de la misma
Una proteína de unión que se une a la proteína de Dermatophagoides farinae de la presente invención es una
proteína que puede unirse específicamente a la proteína de Dermatophagoides farinae de la presente invención. La proteína de unión es una molécula de anticuerpo, tal como inmunoglobulinas (por ejemplo, IgA, IgD, IgG, IgM e IgY), fragmento Fab, fragmento F(ab')2, un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) y un anticuerpo de dominio individual (Carter, PJ, Nat. Rev. Immunol., 6:343-357, 2006); y moléculas similares a anticuerpos, tales como Affibody, DARPins y Avimer. Entre los ejemplos de moléculas de anticuerpo se incluyen los anticuerpos policlonales y los anticuerpos monoclonales (por ejemplo, un anticuerpo de ratón, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano); sin embargo, las moléculas de anticuerpo no se limitan a estas.
La proteína de unión puede producirse utilizando diversos métodos conocidos y el método de producción no está particularmente limitado.
La proteína de unión puede utilizarse para, por ejemplo, la identificación de un organismo que expresa el Dermatophagoides farinae de la presente invención, un tejido o células del mismo. Por ejemplo, la proteína de unión puede utilizarse con el fin de medir la presencia o ausencia de una proteína de Dermatophagoides farinae en la atmósfera, en un espacio interior o en moco humano. La medición puede llevarse a cabo mediante un método inmunológico conocido y por ejemplo, la medición puede llevarse a cabo mediante ELISA.
La proteína de unión puede utilizarse también para el tratamiento de enfermedades alérgicas causadas por Dermatophagoides farinae.
A continuación en el presente documento, la presente invención se describirá específicamente mediante Ejemplos. Sin embargo, la presente invención no se limita a estos Ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1 Purificación de la proteína de Dermatophagoides farinae
Un medio en el que los ácaros se habían criado durante un período prolongado de tiempo se desecó en condiciones de humidificación y el medio desecado se pasó a través de un tamiz de luz de malla de 180 pm y a continuación, se suspendió en solución salina tamponada con fosfato (PBS). La suspensión se pasó inmediatamente a través de un tamiz de luz de malla de 53 pm y se eliminaron los componentes insolubles. La suspensión de PBS de heces de la misma se dejó reposar a 37 °C durante 2 horas y se extrajeron los componentes solubles. El extracto se centrifugó a 5.000 rpm a 4 °C durante 30 minutos y el sobrenadante se dializó durante 2 días utilizando una membrana de diálisis de un peso molecular de fraccionamiento de 12.000 a 14.000. Por tanto, se eliminaron los componentes de bajo peso molecular. El sobrenadante dializado se concentró utilizando un concentrador centrífugo (VIVASPIN 20, MWCO 10 kDa) y se obtuvo un extracto bruto.
Se añadieron 10 volúmenes de Tris-HCl 20 mM (pH 9,0) al extracto bruto y a continuación, la mezcla se aplicó a una columna de cationes (VIVAPURE S Maxi M) y se centrifugó (500 g, 5 minutos). Posteriormente, se recogió la fracción de elución. La fracción de elución se aplicó a una cromatografía aniónica (UNO Q 1 ml, Bio-Rad Laboratories, Inc.) y se eluyó con un gradiente de NaCl de 0 a 1 M. Se recogieron las fracciones que contenían una proteína diana y las fracciones de bajo peso molecular se eliminaron utilizando un concentrador centrífugo (VIVASPIN 6, MWCO 100 kDa). Por tanto, se obtuvo una proteína purificada. Los resultados de analizar la proteína purificada mediante SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) se muestran en la Figura 1.
Ejemplo 2 Conformación de la alergenicidad del antígeno purificado
(i) Confirmación de la reactividad con IgE sérica de un paciente de enfermedad alérgica causada por Dermatophagoides farinae
Se preparó una solución de 20 pg/ml de la proteína de la presente invención o de un antígeno de ácaros conocido (Der f 1) y se añadió la solución a una placa de 96 pocillos de MAXISORP (Nunc A/S) en una cantidad de 1 pg/50 pl/pocillo. Posteriormente, la placa se dejó reposar durante la noche a 4 °C y de este modo se inmovilizó el antígeno. Al día siguiente, se lavó la placa y a continuación, se añadió PBS que contiene albúmina de suero bovino al 1 %. La placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante una hora y de este modo, se realizó el bloqueo. El lavado de placa, posteriormente se añadió un suero de paciente que se había diluido cinco veces y la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Como control negativo, se utilizó un suero AB humano disponibles comercialmente (CELLECT (R) Human AB serum; MP Biomedicals, LLC). Después del lavado de la placa, se añadió un anticuerpo secundario (anticuerpo anti-IgE humana de cabra marcado con HRP; HRP-labeled goat anti-human IgE antibody, Novus Biologicals, LLC) diluido 7000 veces con un PBS que contiene albúmina de suero bovino al 1 % y a continuación, la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 40 minutos. Después del lavado de la placa, el desarrollo del color de TMB se realizó utilizando un conjunto de reactivos de sustrato TMB (BD Biosciences Co.) dejando que la placa reposara a temperatura ambiente en oscuridad. A continuación, el desarrollo del color se detuvo añadiendo ácido sulfúrico 1 N a la placa y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm utilizando un lector de microplacas. Los resultados se muestran en la Figura 2.
(ii) Activación de basófilos de un paciente de una enfermedad alérgica causada por Dermatophagoides farinae
Se sabe que, la expresión de CD203c está aumentada en basófilos que se estimularon mediante alérgenos (De Weck, AL, et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 146:177-189, 2008). Basándose de este principio, se analizaron las activaciones de basófilos en sangre de pacientes utilizando un kit de alergenicidad (Beckman Coulter, Inc.). se añadieron 20 pl de una solución del alérgeno de la proteína de la presente invención (concentración final: 1 a 100 ng/ml) y 20 pl de un cóctel de anticuerpos que contiene CD3-PC7, CRTH2-FITC y CD203c-PE a 100 pl de sangre completa heparinizada y se incubó la mezcla a 37 °C durante 15 minutos. Se añadieron 100 pl de una solución de parada y 2 ml de una solución de fijación y de lisis y se permitió que la mezcla reaccionara a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de que la mezcla se centrifugara (200*g, 5 minutos), se eliminó el sobrenadante y se añadieron 3 ml de una solución tampón fosfato (PBS) a las células. La mezcla se centrifugó de nuevo. Después de eliminar el sobrenadante, las células se suspendieron en PBS que contiene formaldehído al 0,1 % y se analizó la suspensión utilizando un citómetro de flujo (FACSCanto, BD Biosciences Co.). Basándose en los datos adquiridos, se analizaron los basófilos dentro de las células sanguíneas utilizando que la expresión de CD3-PC7 fue negativa, al tiempo que la expresión de CRTH2-FITC fue positiva como un marcador de selección y se evaluó la intensidad de expresión de CD203c. Los resultados se muestran en la Figura 3. La expresión de Cd203c en los basófilos tratados con alérgeno fue mayor que la expresión en los basófilos tratados con p Bs solo.
Ejemplo 3 Determinación de la secuencia de bases y de la secuencia de aminoácidos
<Determinación de la secuencia de aminoácidos interna parcial>
Con el fin de definir claramente la secuencia de aminoácidos parcial en la proteína de la presente invención, se realizó un análisis de fragmentos obtenibles mediante proteolisis limitada utilizando una proteasa. 50 pg de la proteína purificada se sometieron a SDS-PAGE y a continuación, se trituró el gel cerca de la banda del peso molecular de 110 kDa. Posteriormente, el gel triturado se agitó y lavó (20 minutos x 2 veces) en 1 ml de agua purificada. Tras las adiciones de 300 pl de guanina 7 mol/l/Tris-HCl 0,5 mol/l /EDTA 0,01 mol/l (pH 8,5) y 10 pl de 2-mercaptoetanol, la mezcla se sometió a purga de nitrógeno y a un tratamiento ultrasónico y a continuación, se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas y de este modo, la mezcla se redujo. A continuación, se añadieron 10 pl de 4-vinilpiridina y la mezcla se sometió a purga de nitrógeno y a un tratamiento ultrasónico (1 minuto). Posteriormente, la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos y de este modo, se realizó la alquilación. La solución de reacción se descartó, posteriormente, se añadió además 1 ml de 0,1 % en vol de ácido trifluoroacético al gel y se comprobó que el gel fue ácido. Posteriormente, la mezcla se agitó durante una hora. La solución se descartó y el gel se agitó (20 minutos x 2 veces) en 1 ml de hidrogenocarbonato de amonio 0,025 mol/l/50 % en vol de acetonitrilo. La solución se descartó y el gel se agitó en 1 ml de acetonitrilo durante 5 minutos. Posteriormente, se descartó la solución y el gel se secó a presión reducida en un evaporador centrífugo. La lisil endopeptidasa disuelta en una solución de hidrogenocarbonato de amonio 0,025 mol/l se añadió al gel en una proporción enzima/sustrato de 1/20 y la mezcla se dejó reposar en hielo, de manera que el gel se hinchara durante una hora. Se añadió una solución de hidrogenocarbonato de amonio 0,025 mol/l, la solución penetró completamente en el gel y a continuación, el gel se dejó reaccionar a 37 °C durante 17 horas. La solución de reacción se recogió (Solución [1]). Con el fin de extraer péptidos, se añadieron 100 pl de 0,1 % en vol de ácido trifluoroacético/50 % en vol de acetonitrilo al gel restante, la mezcla se agitó durante 20 minutos y a continuación, se recogió una solución de extracto (Solución [2]). El gel se agitó además en 100 pl de acetonitrilo durante 20 minutos y a continuación, se recogió una solución de extracto (Solución [3]). Se mezclaron la solución [1] a [3], la mezcla se concentró a presión reducida y a continuación, el concentrado se aplicó a cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (XBRIDGE C18) y se sometió a elución y a fraccionamiento en un gradiente de 0 a 80 % en peso de acetonitrilo. Se recogieron dos péptidos principales y se analizaron secuencias de aminoácidos N-terminales utilizando un secuenciador de proteínas (PROCISE 492cLC; Applied Biosystems, Inc.). Como resultado, se obtuvieron Thr-Asp-Asp-Phe-Phe-Pro-Tyr-Ala-Ser-Asp-Glu-His-Ala-Tyr-Trp -Thr-Gly-Tyr-Phe-Thr [secuencia de aminoácidos parcial 1 (s Eq ID NO: 3)] y Gln-Gly-Asp-Tyr-Val-Glu-Phe-Asp-Phe-Val-Val-Gly-Pro-Ile-X-Val [secuencia de aminoácidos parcial 2 (SEQ ID NO: 4)].
<Extracción de ARN de Dermatophagoides farinae>
Se extrajo el ARN de Dermatophagoides farinae que se había congelado en nitrógeno líquido, mediante el siguiente procedimiento utilizando un kit de RNeasy Mini (Qiagen N.V.). Se añadieron 600 pl de tampón RLT a 10 mg de Dermatophagoides farinae y los ácaros se homogeneizaron mediante el paso a través de una aguja de inyección de 18G. La suspensión de Dermatophagoides farinae se añadió a una columna de centrifugación QIAshredder (Qiagen N.V.) y se centrifugó (15.000 rpm, 2 minutos) y se recogió el flujo continuo. Se añadieron 600 pl de una solución acuosa de etanol al 70 % a la solución de ARN recogido y a continuación, la mezcla se añadió a una columna de RNeasy Mini y se centrifugó (10.000 rpm, 15 segundos). La columna se lavó además con 350 pl de tampón RW1 y a continuación, el tratamiento con ADNasa se realizó utilizando un conjunto de ADNasa sin ARNasa (RNase-Free Dnase, Qiagen N.V.). La columna se lavó con 350 pl de tampón RW1 y a continuación, se realizó la purificación de ARN de acuerdo con el protocolo del kit de RNeasy Mini. Después de la purificación, se añadieron 30 pl de H2O sin ARNasa y se recogió de este modo el ARN total.
<Producción de ADNc de Dermatophagoides farinae>
Se sintetizó ADNc a partir del ARN total obtenido de este modo, utilizando un sistema de síntesis de primera cadena Superscript III para RT-PCR (Invitrogen, Inc.). Se suspendieron 3 |jg del ARN total en 8 |jl de agua purificada, se añadieron 1 j l de oligo (dT) 20 y 1 j l de dNTP 10 mM y a continuación, la mezcla se incubó a 65 °C durante 5 minutos. La mezcla se enfrió en hielo durante 2 minutos y a continuación, se añadieron 2 j l de 10x tampón RT, 1 j l de MgCl2 25 mM, 2 j l de DTT 0,1 M, 1 j l de RNaseOUT (40 U/jl) y 1 j l de transciptasa inversa de SuperScript III. La mezcla se mezcló a fondo. La mezcla se incubó a 50 °C durante 50 minutos y a continuación, la mezcla se trató a 85 °C durante 5 minutos para terminar la reacción.
<Determinación de la secuencia de ADNc>
Se designaron cebadores degenerados a partir de las secuencias de aminoácidos parciales 3 y 4. Se diseñaron el Cebador 1 como un cebador codificante que corresponde a la secuencia de aminoácidos parcial 3 y el Cebador 2 como un cebador en dirección 3'. De forma similar, se diseñaron el Cebador 3 como un cebador codificante que corresponde a la secuencia de aminoácidos parcial 4 y el Cebador 4 como un cebador en dirección 5'. Se sometió el ADNc del ácaro como molde a una PCR anidada utilizando KOD FX Neo (Toyobo Co., Ltd.) y estos cebadores. El producto de la PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 2 % (Nacalai Tesque, Inc.) y a continuación, un corte del gel que contenía una banda amplificada se purificó con un gel de Wizard SV y un sistema de PCR Clean-Up (Promega Corp.). Utilizando los cebadores Cebador 2 y Cebador 4, se sometió el producto de la PCR purificado a PCR con KOD Fx neo y a continuación, el producto de PCR se purificó con un gel de Wizard SV y un sistema de PCR Clean-Up (Promega Corp.). Después de la purificación, la secuencia de ADN se analizó utilizando un kit de BigDye Xterminator (Applied Biosystems, Inc.) y un secuenciador de ADN (3130xl; Applied Biosystems, Inc.) y se obtuvo de este modo la secuencia intermedia.
A continuación, para un análisis de la secuencia 3'-terminal, se sintetizó un ADNc de Dermatophagoides farinae que contiene una secuencia de anclaje en el extremo 3' utilizando un kit de 5'/3' RACE de 2a generación (Roche Holding AG). Se realizó una PCR anidada con KOD Fx neo usando dos cebadores anidados, concretamente, el Cebador 5 y el Cebador 6 diseñados basándose en las secuencias obtenidas a partir de la secuencia intermedia. La secuencia de ADN del producto de la PCR obtenido de este modo se analizó y se obtuvo por tanto la secuencia 3'-terminal.
Se obtuvo una secuencia parcial de 1850 pb mediante un análisis de la secuencia intermedia y de la secuencia 3'-terminal. Las proteínas que tienen homología con estas secuencias parciales se obtuvieron de la base de datos del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y la secuencia parcial tuvo una homología de un 37 % con la proteína hipotética CAPTEDRAFT_151096 (GenBank: ELT89240.1) de Capitella teleta, un 40 % de homología con la proteína hipotética LOTGIDRAFT_207233 (GenBank: ESO84761.1) con Lottia gigantean y un 47% de homología con PREDICTED: similar a la manosidasa alfa lisosómica (secuencia de referencia NCBI: XP_003383866.1) de Amphimedon queenslandica. Por tanto, las secuencias homólogas entre ELT89240.1, ESO84761.1 y x P_003383866.1 se analizaron y se diseñaron los cebadores degenerados Cebador 7 y Cebador 8 de acuerdo con las secuencias idénticas de aminoácidos en la proximidad del N-terminal. El Cebador 9 y el Cebador 10 se diseñaron a partir de la secuencia intermedia. El Cebador 9, Cebador 10, Cebador 7 y Cebador 8 se utilizaron para la PCR anidada con KOD Fx neo y ADNc de Dermatophagoides farinae. Se analizó la secuencia de ADN del producto de PCR amplificado y se obtuvo una secuencia parcial del 5'-terminal.
Con el fin de analizar la secuencia 5'-terminal, se realizó un 5' RACE utilizando un kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc.). El ARN total de Dermatophagoides farinae se purificó utilizando un NucleoTrap mRNA mini (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG) para obtener ARN poliA de Dermatophagoides farinae purificado. El ADNc que contiene la secuencia adaptadora en el extremo 5' se sintetizó a partir del ARNm poliA utilizando un kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE.
Este ADNc se sometió a PCR con rampa decreciente (en inglés, touchdown PCR) utilizando el Cebador 11 diseñado a partir de la secuencia parcial 5'-terminal y la ADN polimerasa PrimeStar HS (Takara Bio, Inc.). Respecto a las condiciones de reacción, se siguió el protocolo del kit de amplificación de ADNc de SMARTer RACE. La secuencia de ADN del producto de la PCR obtenido de este modo se analizó y se obtuvo la secuencia hasta el extremo 5'.
Claims (6)
1. Una proteína de Dermatophagoides farinae seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c):
(a) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2;
(b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que se ha(n) sustituido, suprimido o añadido 1 a 10 aminoácido(s) con relación a la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2 y que tiene reactividad con la IgE sérica de un paciente de una enfermedad alérgica causada por Dermatophagoides farinae; y
(c) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 % o superior de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2 y que tiene reactividad con la IgE sérica de un paciente de una enfermedad alérgica causada por Dermatophagoides farinae.
2. Un polinucleótido que codifica una proteína de Dermatophagoides farinae seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c):
(a) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2;
(b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que se ha(n) sustituido, suprimido o añadido 1 a 10 aminoácido(s) con relación a la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2 y que tiene reactividad con la IgE sérica de un paciente de una enfermedad alérgica causada por Dermatophagoides farinae; y
(c) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 % o superior de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2 y que tiene reactividad con la IgE sérica de un paciente de una enfermedad alérgica causada por Dermatophagoides farinae.
3. Un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los siguientes (d) y (e):
(d) un polinucleótido que comprende la secuencia de bases expuesta en el SEQ ID NO: 1; y
(e) un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que tiene un 90 % o superior de identidad con la secuencia de bases expuesta en el SEQ ID NO: 1 y que es capaz de codificar una proteína que tiene reactividad con la IgE sérica de un paciente afectado de una enfermedad alérgica causada por Dermatophagoides farinae.
4. Una proteína de unión que se une a la proteína de Dermatophagoides farinae que consiste en una secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 2; en donde la proteína de unión es una molécula de anticuerpo.
5. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la proteína de unión es un anticuerpo monoclonal.
6. La proteína de Dermatophagoides farinae de acuerdo con la reivindicación 1, para usar en el diagnóstico de una enfermedad alérgica causada por Dermatophagoides farinae.
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